CN116287264A - 精氨酸代谢及dna去甲基化相关基因作为标志物及治疗靶标在肿瘤诊断及治疗中的应用 - Google Patents

精氨酸代谢及dna去甲基化相关基因作为标志物及治疗靶标在肿瘤诊断及治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种精氨酸代谢及DNA去甲基化相关基因作为标志物及治疗靶标在肿瘤诊断及治疗中的应用，提供肿瘤中新的标志物和治疗靶标。发现了肿瘤细胞来源精氨酸与肿瘤相关巨噬细胞精氨酸代谢、DNA去甲基化之间的关系，不仅提供了多个与肿瘤预后、肿瘤相关细胞巨噬细胞相关的标志物，更基于该类标志物提供了治疗靶点。具体涉及精氨酸代谢相关基因ASS1、ARG1、糖苷酶TDG以及精氨酸代谢产物精胺等作为标志物诊断肿瘤不良进展以及在筛选和/或制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，为恶性肿瘤治疗提供新的有效策略。

Description

精氨酸代谢及DNA去甲基化相关基因作为标志物及治疗靶标 在肿瘤诊断及治疗中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地，涉及一种精氨酸代谢及DNA去甲基化相关基因作为标志物及治疗靶标在肿瘤诊断及治疗中的应用。
背景技术
肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是肿瘤微环境中主要的炎症细胞，大量研究显示TAMs在肿瘤的免疫逃逸及复发转移等恶性进展中发挥了重要的促进作用。目前，已有研究揭示了TAMs促肿瘤表型产生、维持的部分分子机制，但依旧有部分分子机制未得到深入研究或阐明。其中，就包括精氨酸代谢与TAMs促肿瘤表型之间的关系。大量研究已表明精氨酸代谢与TAMs极化密切相关，但其中具体的分子机制仍不清楚。为深入了解相关机制以获取新的治疗方式，进一步探索肿瘤微环境中精氨酸代谢及其与TAMs促肿瘤表型之间的分子机制显得尤为重要。有利于挖掘新的相关标志物，以用于检测TAMs或预测乳腺癌复发转移及恶性进展的可能性，提供新的肿瘤治疗靶标。对控制肿瘤的免疫逃逸及复发转移意义重大。
表观遗传学改变在巨噬细胞的极化及促肿瘤表型中也发挥着重要调控作用。DNA甲基化是关键的表观遗传学机制之一，作为基因表达的关键开关，广泛影响细胞的生理功能。DNA甲基化水平由甲基化和去甲基化动态平衡决定，DNA甲基转移酶(DNMT3a，DNMT3B和DNMT1)负责建立和维持DNA甲基化。DNA去甲基化有两种基本机制：依赖于DNA复制的被动DNA去甲基化和不依赖于DNA复制的主动DNA去甲基化。在被动DNA去甲基化过程中，甲基化DNA通过DNMT1的失活而在连续的复制周期中被稀释。在主动DNA去甲基化过程中，TETs将DNA中的5-甲基胞嘧啶(5mC)氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)，随后5hmC、5-fC和5caC被DNA糖苷酶TDG切除，DNA主动去甲基化完成。TET/TDG复合物介导的DNA主动去甲基化发生在不涉及DNA复制的细胞中。TAMs受到肿瘤微环境信号的趋化及刺激后，极化成无DNA复制能力的免疫细胞。尽管表观遗传学改变已被报道在巨噬细胞极化中起重要作用，但具体到TET/TDG复合物介导的DNA主动去甲基化对TAMs极化及促肿瘤表型的影响尚未被清晰揭示。
具体到，精氨酸代谢与表观遗传学改变之间是否有关联(尤其是精氨酸代谢与DNA去甲基化之间的关联)，以及其是否相互关联而影响TAMs、肿瘤进展，目前也尚未有研究揭示。精氨酸代谢通路中起关键调控作用的代谢分子尚不明确，以及精氨酸代谢物是否通过影响DNA去甲基化而发挥促肿瘤作用仍缺乏研究。
因此，筛选精氨酸代谢通路中起关键作用的代谢物分子，并揭示相关代谢物分子是否通过影响DNA去甲基化而促进TAMs的促肿瘤功能非常必要。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种精氨酸代谢及DNA去甲基化相关基因作为标志物及治疗靶标在肿瘤诊断及治疗中的应用，提供肿瘤中新的标志物和治疗靶标。
本发明的一个目的在于提供特异性检测肿瘤细胞中精氨酸合成通路基因表达水平、肿瘤相关巨噬细胞中精氨酸代谢通路基因表达水平、精胺合成通路基因表达水平、DNA主动去甲基化通路基因表达水平、基因组去甲基化水平和/或精胺水平的检测产品在制备预后乳腺肿瘤患者的产品中的用途。
进一步地，精氨酸合成通路基因包括精氨酸合成限速酶基因ASS1；精氨酸代谢通路基因包括精氨酸代谢限速酶基因ARG1；精胺合成通路基因包括鸟氨酸脱羧酶1基因ODC1、亚精胺合酶基因SRM以及精胺合酶基因SMS；DNA主动去甲基化通路基因包括糖苷酶基因TDG和10-11易位酶基因TET。
更进一步地，精氨酸合成限速酶ASS1可作为预测乳腺癌不良预后的诊断标志物；精氨酸代谢限速酶ARG1可作为预测乳腺癌不良预后的诊断标志物；糖苷酶TDG可作为预测乳腺癌不良预后的诊断标志物；该标志物的诊断方式包括：基于以上三个基因的核酸水平及蛋白水平检测，检测方法包含qPCR、Fish以及western blot、IHC/IF、ELISA等至少其中一种。更进一步地，精氨酸代谢物精胺可作为预测乳腺癌不良预后的诊断标志物。巨噬细胞基因组去甲基化水平增加可作为预测乳腺癌不良预后的诊断标志物，且检测方式可基于差异甲基化杂交(DMH)DNA甲基化芯片技术。
在本发明的一个以上实施例中，发现前述通路基因表达水平与肿瘤相关巨噬细胞以及乳腺癌不良预后相关，其中通路基因可作为代表相应的标志物，通过检测标志物水平，有利于确认和诊断对应的细胞状态以及肿瘤进展、预后。具体地，分别利用western及免疫组化检测肿瘤细胞、TAMs体外模型细胞以及乳腺肿瘤组织中ASS1、ARG1及TDG的蛋白表达水平,western结果显示ASS1在肿瘤细胞中高表达，ARG1在TAMs中高表达；免疫组化结果显示ASS1、ARG1及TDG转移性乳腺癌患者组织高表达。利用网络已发表临床数据统计发现，ASS1、ARG1及TDG的高表达和乳腺癌不良预后显著相关。
提供多种用于预测乳腺癌恶性进展的诊断标志物，所述标志物为精氨酸合成限速酶ASS1、精氨酸酶ARG1、糖苷酶TDG、精氨酸代谢物精胺或肿瘤相关巨噬细胞基因组DNA甲基化水平。其中肿瘤细胞中ASS1升高、肿瘤相关巨噬细胞中ARG1或TDG高表达或精胺水平升高或肿瘤相关巨噬细胞基因组DNA甲基化水平降低可作为独立因素预测乳腺癌不良预后。
进一步地，检测产品通过qPCR、Fish、western blot、IHC/IF和/或ELISA方式特异性检测基因的表达水平；和/或，检测产品通过差异甲基化杂交(DMH)DNA甲基化芯片技术特异性检测基因组去甲基化水平。更进一步地，检测试剂特异性检测肿瘤细胞中精氨酸合成通路基因、肿瘤相关巨噬细胞中精氨酸代谢通路基因和DNA主动去甲基化通路基因表达水平，且精氨酸合成通路基因包括ASS1、精氨酸代谢通路基因包括ARG1、DNA主动去甲基化通路基因包括TDG。
前述标志物的检测方法包括基因的核酸水平及蛋白水平检测，检测方法包含qPCR、Fish以及western blot、IHC/IF、ELISA等至少其中一种；精氨酸代谢物检测方法主要指基于质谱的代谢物检测方式；DNA甲基化水平检测主要指基于差异甲基化杂交(DMH)的DNA甲基化芯片技术。
本发明的再一目的在于提供肿瘤细胞精氨酸合成抑制剂、肿瘤相关巨噬细胞精氨酸代谢抑制剂、精胺合成抑制剂、精胺抑制剂和/或DNA主动去甲基化抑制剂在制备抑制肿瘤相关巨噬细胞促肿瘤表型、减少肿瘤相关巨噬细胞免疫抑制性炎症因子和/或治疗肿瘤的药物中的用途。进一步地，肿瘤包括乳腺癌。
进一步地，肿瘤细胞精氨酸合成抑制剂靶向精氨酸合成通路基因及基因对应蛋白中间体、蛋白；其中，精氨酸合成通路基因包括精氨酸合成限速酶基因ASS1；肿瘤相关巨噬细胞精氨酸代谢抑制剂靶向精氨酸代谢通路基因及基因对应蛋白中间体、蛋白；其中，精氨酸代谢通路基因包括精氨酸代谢限速酶基因ARG1；精胺合成抑制剂靶向精胺合成通路基因及基因对应蛋白中间体、蛋白；其中，精胺合成通路基因包括鸟氨酸脱羧酶1基因ODC1、亚精胺合酶基因SRM以及精胺合酶基因SMS；DNA主动去甲基化抑制剂靶向DNA主动去甲基化通路基因及基因对应蛋白中间体、蛋白；其中，DNA主动去甲基化通路基因包括糖苷酶基因TDG和10-11易位酶基因TET。
在本发明的一个以上实施例中，发现肿瘤细胞来源的精氨酸可促进TAMs极化，体内外研究发现通过抑制肿瘤细胞精氨酸合成限速酶ASS1抑制肿瘤细胞精氨酸合成后，可显著抑制TAMs的促肿瘤表型。
机制研究发现，精氨酸代谢产物精胺(spermine)是维持TAMs促肿瘤表型的关键代谢物分子，且精胺可通过上调DNA去甲基化关键基因糖苷酶TDG促进TAMs主动去甲基化的发生，进而维持TAMs的促肿瘤表型。通过抑制精氨酸代谢通路相关基因ARG1以及ODC1等基因功能抑制精胺合成或通过抑制DNA主动去甲基化关键基因TET及TDG功能后，可显著抑制TAMs的促肿瘤表型。
进一步地，肿瘤细胞精氨酸合成抑制剂、肿瘤相关巨噬细胞精氨酸代谢抑制剂、精胺合成抑制剂和/或DNA主动去甲基化抑制剂包括小分子干扰RNA；肿瘤细胞精氨酸合成抑制剂、肿瘤相关巨噬细胞精氨酸代谢抑制剂、精胺合成抑制剂、精胺抑制剂和/或DNA主动去甲基化抑制剂包括阻断对应通路功能的结合抗体。
本发明提供了多种可用于设计生产抗肿瘤药物的靶标，所述靶标包括ASS1、ARG1、ODC1、TETs及TDG等；所述药物包括以上基因的siRNA、抑制以上基因表达的小分子化合物、结合以上蛋白抑制其功能的小分子抑制剂或结合抗体等可以抑制基因功能的物质中的至少一种。在本申请的一个以上实施例中，通过ASS1、ARG1、TDG对应的siRNA沉默、敲低对应的基因表达。其中，至少包括ASS1 siRNA：5’-GCCTGAATTCTACAACCGGTT-3’；ARG1 siRNA：5’-GGGCGGAGACCACAGUUUG-3’；TDG siRNA：5’-CUCCAGUAAAGAAUUUCGUTT-3’。
进一步地，肿瘤细胞精氨酸合成抑制剂包括ASS1抑制剂；巨噬细胞精氨酸代谢抑制剂包括ARG1抑制剂、DFMO抑制剂；精胺合成抑制剂包括ARG1抑制剂；DNA主动去甲基化抑制剂包括TDG抑制剂。进一步地，ASS1抑制剂包括ASS1 siRNA；TDG抑制剂包括TDG siRNA；ARG1抑制剂包括ARG1 siRNA。
在本发明的一个以上实施例中，发明人利用DNA甲基化芯片技术检测了肿瘤相关巨噬细胞DNA甲基化状态改变、精氨酸代谢物精胺对DNA甲基化状态影响以及抑制ARG1介导的精氨酸代谢后DNA甲基化状态的改变，结果表明肿瘤相关巨噬细胞极化后更多的基因发生了去甲基化，精氨酸代谢物精胺处理巨噬细胞直接导致DNA去甲基化水平增加，利用siRNA干扰ARG1表达抑制精氨酸代谢后，TAMs去甲基化状态被显著抑制。
具体操作中，包括利用RNA干扰技术抑制肿瘤细胞中ASS1的表达，ASS1表达降低直接导致发现肿瘤细胞分泌的精氨酸水平降低，与未敲除ASS1肿瘤细胞培养上清相比，ASS1敲低的肿瘤细胞培养上清刺激的巨噬细胞，其促肿瘤表型比如炎症抑制因子的表达、M2型表面标志物显著被抑制，而在补充足量精氨酸后，敲除ASS1导致的抑制效果可部分被恢复。
本发明人还利用乳腺癌细胞系MDA-MB-231构建了敲低ASS1表达的稳转株细胞，将对照细胞与敲低了ASS1的稳转株细胞皮下植入重度免疫缺陷小鼠，通过鼠尾静脉给与人源PBMC细胞。结果显示，无论低精氨酸喂食或正常精氨酸水平喂食，敲低ASS1组小鼠移植瘤体积及重量明显低于对照组小鼠。利用免疫组化技术分析移植瘤标本发现，敲低ASS1组肿瘤组织中浸润的CD163及精氨酸代谢限速酶ARG1阳性免疫抑制型巨噬细胞明显减少。这说明肿瘤细胞来源的精氨酸通过维持巨噬细胞ARG1介导的精氨酸代谢促进肿瘤相关巨噬细胞的促肿瘤作用。
在肿瘤相关巨噬细胞体外模型中分别利用ARG1 siRNA及ARG1介导的精氨酸代谢通路抑制剂DFMO抑制多胺合成后，肿瘤相关巨噬细胞炎症抑制因子的表达被显著抑制，抑制精氨酸代谢后的巨噬细胞对T细胞的激活抑制程度显著降低。
在肿瘤相关巨噬细胞体外模型中分别利用TDG siRNA降低TDG的表达以及利用DNA去甲基化抑制剂Bcat抑制肿瘤相关巨噬细胞去甲基化后，肿瘤相关巨噬细胞炎症抑制因子的表达被显著抑制，抑制DNA去甲基化后的巨噬细胞对T细胞的激活抑制程度显著降低。
发明人还将未处理人外周血巨噬细胞以及分别敲低了ARG1或TDG表达的巨噬细胞与乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-231经皮下共注射入重度免疫缺陷小鼠，后续分别分成两组，其中一组给予每周两次的精胺腹腔注射。结果显示，精胺单独处理组小鼠乳腺细胞移植瘤体积及质量明显高于对照组，敲低ARG1或TDG组小鼠移植瘤体积及重量明显低于对照组小鼠,给与精胺处理的ARG1敲低组小鼠移植瘤体积及重量有明显恢复，而精胺处理的TDG敲低组小鼠移植瘤体积及重量却未有明显改变。利用免疫组化技术分析移植瘤标本发现，敲低ARG1或TDG组肿瘤组织中浸润的CD163阳性免疫抑制型巨噬细胞明显减少及浸润CD3阳性的T淋巴细胞显著增加。这说明精氨酸代谢产物精胺通过上调TDG促进巨噬细胞去甲基化进而促进肿瘤相关巨噬细胞的促肿瘤作用。
本发明的再一目的在于提供精胺在制备上调基因TDG表达水平、增强DNA去甲基化的药物中的用途。进一步地，在制备上调肿瘤相关巨噬细胞中基因TDG表达水平、增强肿瘤相关巨噬细胞中DNA去甲基化的药物中的用途。在本发明的一个以上实施例中发现，精胺上调肿瘤相关巨噬细胞基因TDG表达水平，进而增强其基因组DNA去甲基化。
本发明的再一目的在于提供一种CD163阳性巨噬细胞标志物，包括表达水平特异性上调的ARG1和/或表达水平特异性下调的ASS1。在本发明的一个以上实施例中发现，在乳腺肿瘤组织中，精氨酸代谢关键酶ARG1特异性的在CD163阳性的巨噬细胞表达；精氨酸合成限速酶ASS1在CD163阳性的巨噬细胞中表达极低。
本发明的再一目的在于提供一种肿瘤相关巨噬细胞标志物，包括：
特异性下调的精氨酸和特异性上调的鸟氨酸；
激活的精氨酸代谢；
基因组甲基化水平、基因组去甲基化水平或基因组基因甲基化比例；
和/或，特异性上调的精胺。
在本发明的一个以上实施例中，发现肿瘤相关巨噬细胞中特异性的精氨酸下调、鸟氨酸上调；且ARG1介导的精氨酸被激活；基因组DNA去甲基化增强；精胺水平增多。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：发现了肿瘤细胞来源精氨酸与肿瘤相关巨噬细胞精氨酸代谢、DNA去甲基化之间的关系，不仅提供了多个与肿瘤预后、肿瘤相关细胞巨噬细胞相关的标志物，更基于该类标志物提供了治疗靶点。在本发明的一个以上实施例中，通过抑制精氨酸至DNA去甲基化中的相关通路，发现能有效抑制肿瘤相关巨噬细胞的促肿瘤表型，并能有效减小肿瘤体积，起到治疗作用。为包括乳腺癌在内的肿瘤提供新的预后标志物和治疗策略。更为具体地，涉及精氨酸代谢相关基因ASS1、ARG1、糖苷酶TDG以及精氨酸代谢产物精胺作为标志物诊断肿瘤不良进展以及在筛选和/或制备用于治疗和/或诊断肿瘤不良进展的药物中的用途。其中，本发明所述的基因ASS1在肿瘤细胞中特异性高表达，ARG1及TDG在肿瘤相关巨噬细胞中特异性高表达，精胺在巨噬细胞中特异性升高，以上四个因素可独立预测肿瘤的不良预后；抑制肿瘤细胞ASS1或抑制肿瘤相关巨噬细胞ARG1或TDG的表达或抑制巨噬细胞精胺合成后，均可显著抑制肿瘤细胞的增殖。通过不同方式抑制ASS1、TDG的表达或功能，以及抑制精胺合成可作为恶性肿瘤治疗的有效策略。
附图说明
图1：ARG1高表达和乳腺癌不良预后相关，ARG1介导的精氨酸代谢在TAMs中异常激活；(a)ARG1高表达、低表达三阴性乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存分析；(b)免疫组化分析表明，ARG1与CD163有共定位，ARG1主要表达于TAM细胞中(CD163)；(c)将M0、TAM进行代谢组学分析，精氨酸代谢通路中代谢物(Arginine、Ornithine)存在显著差异。
图2：抑制TAMs中ARG1的表达或抑制ARG1介导的精氨酸代谢，TAMs促肿瘤表型被显著抑制；(a)用MDA-MB-231诱导TAM，在TAM中敲低ARG1，qRT-PCR检测TAM标志物的表达；(b)用MDA-MB-231诱导TAM，在TAM中加入多胺生物合成酶抑制剂(DFMO)，qRT-PCR检测TAM标志物的表达；(c)用MDA-MB-231诱导TAM，在TAM中敲低ARG1，与PBMC共培养，流式细胞术检测活化T细胞(CD25+CD3+)的比例；(d)用MDA-MB-231诱导TAM，在TAM中加入多胺生物合成酶抑制剂(DFMO)，将M0、TAM细胞与PBMC共培养，流式细胞术检测活化T细胞(CD25+CD3+)的比例。
图3：降低肿瘤细胞ASS1表达抑制TAMs促肿瘤表型。(a)免疫组化分析CD163+细胞与ASS1+细胞在肿瘤微环境中的定位，ASS1表达于肿瘤细胞，不在CD163+TAM细胞中表达；(b)在三阴性乳腺癌患者中，进行ASS1高表达、ASS1低表达患者的Kaplan-Meier生存分析；(c-e)在MDA-MB-231细胞中敲低ASS1，收集上清诱导TAM细胞，诱导时进行剥夺精氨酸或者补充精氨酸处理，收集TAM细胞，qRT-PCR检测TAM标志物的表达；在诱导时缺乏精氨酸的条件下，MDA-MB-231敲低ASS1后，TAM的极化受到阻遏；在诱导时补充过量的精氨酸后，上述趋势有所回补。
图4：抑制肿瘤细胞ASS1表达，肿瘤体积及重量明显减小。(a)在NSG免疫缺陷小鼠中皮下种植MDA-MB-231对照株以及敲除ASS1稳转株，尾静脉T细胞与巨噬细胞共注射，进行低精氨酸饲料或对照饲料喂食，3-4周后解剖皮下肿瘤，拍照；(b)上述动物实验的肿瘤生长曲线：在限制精氨酸饲喂条件下，敲除ASS1的MDA-MB-231细胞生长缓慢；而充足精氨酸饲喂条件下，敲除ASS1的MDA-MB-231细胞生长速度与对照株相似；(c)上述动物实验的肿瘤瘤重。
图5：DNA去甲基化在TAMs的促肿瘤表型中发挥了重要调控作用。(a)TAM细胞中，发生甲基化与去甲基化的基因数目；(b)用MDA-MB-231细胞培养上清诱导TAM，在TAM诱导过程中加入DNA去甲基化抑制剂bcat，qRT-PCR检测TAM标志物的表达；(c)用MDA-MB-231细胞培养上清诱导TAM，在TAM诱导过程中加入DNA去甲基化抑制剂bcat，IHC检测CD163的表达。
图6：精氨酸代谢产物精胺SPM是维持TAMs促肿瘤表型的关键代谢物。(a)精氨酸代谢途径中各种代谢物在代谢组学中比例变化(TAM/M0)；(b)将TAM用精胺(spermine)处理后，qRT-PCR检测各种细胞因子的表达变化；(c)在TAM中，用精胺(spm)处理后、敲低ARG1后进行转录组学测序。
图7：精氨酸代谢物精胺上调DNA去甲基化关键酶TDG的表达；TDG高表达和乳腺癌预后不良显著相关；抑制TDG表达后，TAMs促肿瘤表型被显著抑制。(a)试剂盒检测TDG酶的活性；(b)在三阴性乳腺癌患者中，TDG高表达、低表达的Kaplan-Meier生存分析；(c)在TAM中敲低TDG，qRT-PCR检测TAM标志物的表达量；(d)在TAM中敲低ARG1基因，western blot检测TDG的表达量。
图8：精胺通过上调TDG维持了TAMs的促肿瘤功能。(a)在NSG小鼠中皮下注射MDA-MB-231细胞，将人PBMC中的巨噬细胞分离出来，进行ARG或者TDG的敲低，与T细胞共同鼠尾静脉注射之后，进行腹腔SPM的给药处理；3-4周后，解剖肿瘤组织，进行拍照；(b)上述动物实验的肿瘤生长曲线；(c)上述动物实验的肿瘤瘤重；(d)将肿瘤进行IHC分析，CD163染色指示TAM细胞极化程度及数量；巨噬细胞敲低ARG1或者TDG之后，TAM极化受到显著抑制，补充SPM后，TAM的极化程度得到恢复。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
实施例1
一、材料和方法
本实施例至少使用包括以下材料和方法：
细胞和细胞培养：ATCC来源的MDA-MB-231细胞在含10％FBS的DMEM中培养，ATCC来源的单核细胞THP1在含10％FBS的RPMI1640培养基中培养。原代PBMC细胞来自孙逸仙纪念医院志愿者外周血，利用淋巴细胞分离液(TBD,LTS1077)，按照说明书操作步骤分离人外周血中单核细胞。
肿瘤相关巨噬细胞体外模型的建立：将人外周血单核细胞在含10％FBS,10ng/mlM-CSF的RPMI1640培养基中培养96h后，将细胞培养基更换为含30％MDA-MB-231培养上清的培养基，继续培养48h,即获得肿瘤相关巨噬细胞体外模型；此外，THP1细胞也可在PMA诱导24h后，将细胞培养基更换为含30％MDA-MB-231培养上清的培养基，继续培养48h,也可获得肿瘤相关巨噬细胞体外细胞系模型。
流式细胞术：抗体包括抗CD163(Biolegend，S15049F)、CD3(Biolegend，317307)、CD25(Biolegend，302603)，收集细胞，PBS洗涤1次后抗体孵育30min，最后PBS洗涤1次后进行检测。
免疫印迹：抗体包括抗ARG1(CST,93668)、ASS1(Invitrogen,PA5-82740)、TDG(Invitrogen,PA5-29340)、PPARγ(CST,2430)按照标准操作进行免疫印迹实验。
免疫组织化学检测：根据标准方案对福尔马林固定和石蜡包埋的肿瘤组织进行ARG1(CST,93668)、ASS1(Invitrogen,PA5-82740)、TDG(Invitrogen,PA5-29340)、PPARγ(CST,2430)、CD163(BOSTER,M00812)染色。DAB溶液(Vector Laboratories)混合物进行免疫标记，然后用苏木精复染。
凋亡实验：将乳腺癌细胞MDA-MB-231提前24h种入六孔板,利用siRNA敲除ASS1后48h,与外周血来源的PBMC共培养24h后，Annexin v/pi凋亡检测试剂盒(BD,559763)检测肿瘤细胞凋亡率。
动物实验1：利用MDA-MB-231细胞与敲低了ASS1的MDA-MB-231稳转株细胞在NSG重度免疫缺陷小鼠双侧背部皮下成瘤。肿瘤细胞与巨噬细胞共注射时，单侧注射量为肿瘤细胞2*106，巨噬细胞1*105，注射后，一周内注射PBMC(与注射巨噬细胞同来源),注射方式：鼠尾静脉注射，注射量：每只老鼠2*107；所有组别小鼠均分成两组，分别给与低精氨酸饲料喂食或正常喂食。每周两次测动物体重及肿瘤体积。待瘤体积达到约1000mm3时，处死小鼠取瘤，称瘤重，瘤体固定拍照后，取部分瘤体包埋做免疫组化。
动物实验2：利用MDA-MB-231细胞在NSG重度免疫缺陷小鼠双侧背部皮下成瘤。肿瘤细胞与巨噬细胞，以及敲低了ARG1或者TDG的巨噬细胞共注射，单侧注射量为肿瘤细胞2*106，巨噬细胞视1*105；注射后，争取一周内注射PBMC(与注射巨噬细胞同来源),注射方式：鼠尾静脉注射，注射量：每只老鼠2x107；精胺SPM给药方式：生理盐水稀释浓度为1mM,每只老鼠灌胃给予100ul,每周两次；每周两次测动物体重及肿瘤体积。待瘤体积达到约1000mm3时，处死小鼠取瘤，称瘤重，瘤体固定拍照后，取部分瘤体包埋做免疫组化。
实时荧光定量PCR法：细胞总RNA的提取采用柱式法Total RNA小量提取试剂盒(EZB-TZ1)，步骤根据试剂盒说明书进行。cDNA合成采用4×EZscript ReverseTranscriptionMix II(EZB-RT2GQ)，步骤根据试剂盒说明书进行。荧光定量PCR采用2×EZColor SYBRGreen qPCR Master Mix(CQ20)，步骤根据试剂盒说明书进行。
统计分析：体外实验数据按照平均值±标准差表示。所有统计分析均使用SPSS16.0统计软件包进行。不同治疗方法下的细胞活力，集落形成和肿瘤体积比较用t检验和单向方差分析。在所有情况下，*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
二实验结果
1、如图1b所示：在乳腺肿瘤组织中，精氨酸代谢关键酶ARG1特异性的在CD163阳性的巨噬细胞表达；利用公开发表的乳腺肿瘤病人组织测序数据分析发现ARG1高表达与乳腺肿瘤患者较低的无病生存率显著相关，如图1a所示；
如图1c所示，为了验证ARG1介导的精氨酸代谢在TAMs中异常激活，我们检测了TAMs氨基酸代谢物的变化，精氨酸在TAMs中显著下调，鸟氨酸在TAMs中显著升高，这说明ARG1介导的精氨酸代谢在TAMs中异常激活。
2、如图2a、2b所示：在TAMs细胞模型中,利用ARG1 siRNA或抑制剂DFMO抑制精氨酸代谢后，TAMs免疫抑制性炎症因子表达显著下调；
如图2c、2d所示，和T细胞共培养后，CD25阳性的激活状态的T细胞明显减少。
3、如图3a所示：精氨酸合成限速酶ASS1在肿瘤细胞中高表达，在CD163阳性的巨噬细胞中表达极低；
对大量乳腺癌患者预后数据进行分析发现ASS1高表达和乳腺癌患者不良预后显著相关，如图3b所示；
如图3c～3e所示，抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的ASS1表达后，免疫抑制型CD163阳性TAMs显著下降；
动物实验显示，抑制肿瘤细胞ASS1实验组，肿瘤体积及重量明显减小(图4)。其中，sgASS1代表使用干扰RNA抑制ASS1表达，sgASS1 low arginine代表低精氨酸喂养且抑制ASS1表达的对应组别。由图4a～图4c可看出，相比于正常精氨酸喂养，低水平精氨酸喂养或抑制ASS1或低水平精氨酸喂养同时抑制ASS1，肿瘤均明显减小，且低水平精氨酸喂养同时抑制ASS1最为显著。
以上结果说明ASS1可以作为肿瘤治疗的潜在靶点及预后诊断标志物。
4、进行基因组甲基化水平的检测，结果如图5a所示：甲基化芯片结果显示，TAMs细胞中更多的基因发生去甲基化，去甲基化基因数目远高于甲基化基因数目，
且利用去甲基化抑制剂处理TAMs，发现TAMs促肿瘤表型被显著抑制，如图5b、5c所示。其中，231CM bcat代表使用去甲基化抑制剂的组别。
5、如图6a、6b所示：精胺在TAMs中明显升高，且精胺可直接促进巨噬细胞多种免疫抑制因子的表达,并导致巨噬细胞基因组甲基化水平明显降低；如图6c所示，降低ARG1的表达抑制精胺合成后，TAMs促肿瘤表型被显著抑制。
以上说明精胺可以做为肿瘤预后指标提示乳腺癌患者预后不良。
6、如图7a、7d所示：精氨酸代谢物精胺可以显著上调DNA去甲基化关键酶TDG的表达；如图7b所示，预后分析发现TDG高表达和乳腺癌预后不良显著相关；如图7c抑制TDG表达后，TAMs促肿瘤表型被显著抑制。
以上数据说明TDG可以做为肿瘤预后标志物提示乳腺癌患者预后不良，且TDG可以作为肿瘤治疗的潜在靶标。
7、如图8a～8d(其中siARG1、siTDG即代表对应的ARG1干扰RNA、TDG干扰RNA)，动物实验结果显示，精胺可以显著促进乳腺癌细胞移植瘤的生长，通过敲低ARG1的表达抑制精胺合成后，移植瘤体积及重量明显减小，在此基础上添加精胺处理肿瘤体积及重量可部分恢复；抑制巨噬细胞TDG的表达后，移植瘤体积及重量明显减小，精胺处理后移植瘤体积及重量无明显改变。
以上数据说明精胺通过上调TDG维持了TAMs的促肿瘤功能，靶向精胺合成通路或TDG有望开辟出新的肿瘤治疗手段。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.特异性检测肿瘤细胞中精氨酸合成通路基因表达水平、肿瘤相关巨噬细胞中精氨酸代谢通路基因表达水平、精胺合成通路基因表达水平、DNA主动去甲基化通路基因表达水平、基因组去甲基化水平和/或精胺水平的检测产品在制备预后乳腺肿瘤患者的产品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，精氨酸合成通路基因包括精氨酸合成限速酶基因ASS1；精氨酸代谢通路基因包括精氨酸代谢限速酶基因ARG1；精胺合成通路基因包括鸟氨酸脱羧酶1基因ODC1、亚精胺合酶基因SRM以及精胺合酶基因SMS；DNA主动去甲基化通路基因包括糖苷酶基因TDG和10-11易位酶基因TET。
3.根据权利要求1～2任一项所述的用途，其特征在于，检测产品通过qPCR、Fish、western blot、IHC/IF和/或ELISA方式特异性检测基因的表达水平；和/或，检测产品通过差异甲基化杂交(DMH)DNA甲基化芯片技术特异性检测基因组去甲基化水平。
4.肿瘤细胞精氨酸合成抑制剂、肿瘤相关巨噬细胞精氨酸代谢抑制剂、精胺合成抑制剂、精胺抑制剂和/或DNA主动去甲基化抑制剂在制备抑制肿瘤相关巨噬细胞促肿瘤表型、减少肿瘤相关巨噬细胞免疫抑制性炎症因子和/或治疗肿瘤的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，肿瘤细胞精氨酸合成抑制剂靶向精氨酸合成通路基因及基因对应蛋白中间体、蛋白；肿瘤相关巨噬细胞精氨酸代谢抑制剂靶向精氨酸代谢通路基因及基因对应蛋白中间体、蛋白；精胺合成抑制剂靶向精胺合成通路基因及基因对应蛋白中间体、蛋白；DNA主动去甲基化抑制剂靶向DNA主动去甲基化通路基因及基因对应蛋白中间体、蛋白。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，肿瘤细胞精氨酸合成抑制剂、肿瘤相关巨噬细胞精氨酸代谢抑制剂、精胺合成抑制剂和/或DNA主动去甲基化抑制剂包括小分子干扰RNA；肿瘤细胞精氨酸合成抑制剂、肿瘤相关巨噬细胞精氨酸代谢抑制剂、精胺合成抑制剂、精胺抑制剂和/或DNA主动去甲基化抑制剂包括阻断对应通路功能的结合抗体。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，肿瘤细胞精氨酸合成抑制剂包括ASS1抑制剂；巨噬细胞精氨酸代谢抑制剂包括ARG1抑制剂、DFMO抑制剂；精胺合成抑制剂包括ARG1抑制剂；DNA主动去甲基化抑制剂包括TDG抑制剂；进一步地，ASS1抑制剂包括ASS1siRNA；TDG抑制剂包括TDG siRNA；ARG1抑制剂包括ARG1 siRNA；进一步地，其中ASS1 siRNA包括序列5’-GCCTGAATTCTACAACCGGTT-3’；ARG1 siRNA包括序列5’-GGGCGGAGACCACAGUUUG-3’；TDGsiRNA包括序列5’-CUCCAGUAAAGAAUUUCGUTT-3’。
8.精胺在制备上调基因TDG表达水平、增强DNA去甲基化的药物中的用途。
9.一种CD163阳性巨噬细胞标志物，其特征在于，包括表达水平特异性上调的ARG1和/或表达水平特异性下调的ASS1。
10.一种肿瘤相关巨噬细胞标志物，其特征在于，包括：
特异性下调的精氨酸和特异性上调的鸟氨酸；
激活的精氨酸代谢；
基因组甲基化水平、基因组去甲基化水平或基因组基因甲基化比例；
和/或，特异性上调的精胺。
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