CZ112296A3

CZ112296A3 - ANTIMICROBIAL PROTEINS, RECOMBINANT DNAs ENCODING THEREOF AND THEIR USE FOR TRANSFORMATION OF PLANTS AND FIGHTING FUNGI

Info

Publication number: CZ112296A3
Application number: CZ961122A
Authority: CZ
Inventors: Karsten Matthias Kragh; Jorn Dalgaard Mikkelsen; Klaus Kristian Nielsen
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1993-10-21
Filing date: 1994-10-20
Publication date: 1997-05-14
Also published as: PL313526A1; PL181851B1; WO1995011306A1; DK0724641T3; US6300103B1; DE69433407T2; AU683952B2; EP0724641B1; AU8058794A; RU2158762C2; HU9601040D0; ATE256193T1; DE69433407D1; JPH09504427A; EP0724641A1; HUT74395A; GB9321714D0; CA2170506A1; US6218508B1; HU223367B1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká antimikrobiálních proteinů, které lze izolovat z cukrové řepy.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje antimikrobiální protein obsahující peptid s aminokyselinovou sekvencí AA₁-AA₂-AA₃-Cys-AA₅-AA₆-AA₇-AA₃-AA₉-Cys-AA₁₁-AA₁₂-AA₁₃-AA₁₄-Cys-Cys-AA₁₇-AA₁₈-AA₁₉-AA₂₀-AA₂₁-Cys-AA₂₃-AA₂₄-AA_2S-AA-_S-AA₂₇-AA₂₈-Cys-AA_3OZ kde AA označuje libovolnou z běžné se vyskytujících 20 aminokyselin. S výhodou AA₇ znamená tyr; AA₁₄ znamená tyr; a AA₁₈ znamená lys. Kromě toho je ještě výhodnější pokud AA₂₄ znamená val; AA_2Sznamená arg; a AA₂₇ znamená ala.

Mezi antimikrobiální proteiny patří proteiny (samotné nebo v kombinaci s jiným materiálem), které jsou toxické nebo působí za libovolných podmínek inhibici růstu libovolného mikroorganismu, včetně bakterií (zejména Gram-pozitivních bakterií), virů a zejména hub. Mezi takové antimikrobiální proteiny patří proteiny, které vykazují antimikrobiální aktivitu při kontaktu s mikroorganismem a proteiny, které působí antimikrobiálně v důsledku jejich asimilace nebo respirace.

Vynález rovněž zahrnuje antimikrobiální protein, který má sekvenci uvedenou v kterékoli ze sekvencí SEQ ID č. 1-3.

Vynález ještě dále zahrnuje čistý protein, který je podstatně podobný libovolnému z výše zmíněných proteinů.

Termínem podstatně podobný se označují čisté proteiny mající aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z 85 % podobná sekvenci proteinů podle vynálezu. Výhodně činí stupeň podobnosti alespoň 90 % a ještě výhodněji činí stupeň podobnosti alespoň 95 %.

V kontextu vynálezu dvě sekvence aminokyselin, které vykazují podobnost alespoň 85 %, 90 % nebo 95 %, mají alespoň 85 %, 90 % nebo 95 % identických nebo konzervativně nahrazených aminokyselinových zbytků v odpovídající poloze při optimálním srovnání, při kterém se připouští až 4 mezery, s tou podmínkou, že každou mezerou nejsou celkově ovlivněny více než 3 aminokyselinové zbytky. V případě proteinů konkrétně uvedených v sekvencích SEQ ID č. 1 a 2 je možné počet mezer zvýšit na čtyři, s tou podmínkou, že každou mezerou není celkově ovlivněno více než 5 aminokyselinových zbytků.

Pro účely vynálezu lze konzervativní nahrazení provádět mezi aminokyselinami z následujících skupin:

(i) serin a threonin, (ii) kyselina glutamová a kyselina asparagová, (iii) arginin a lysin, (iv) asparagin a glutamin, (v) isoleucin, leucin, valin a methionin, (vi) fenylalanin, tyrosin a tryptofan, (vii) alanin a glycin.

Vynález dále zahrnuje čisté proteiny, které jsou alespoň z 90 % identické s antimikrobiálními proteiny podle vynálezu, jakož i čisté proteiny, které vykazují alespoň 90 % jejich specifické aktivity. Pro účely vynálezu je specifickou aktivitou měření rozsahu inhibice růstu nebo replikace vyvolané určitým množstvím proteinu na určitém množství určitých mikroorganismů.

Vynález dále zahrnuje uvedené čisté proteiny v kombinaci s alespoň jedním proteinem vybraným ze skupiny zahrnující proteiny uvedené v sekvencích SEQ ID č. 4 - 6. Takové kombinované proteiny lze dále kombinovat s jedním nebo několika známými proteiny souvisejícími s patogenezí (pathogenesis-related proteins, PR-proteins). Infekce rostlin houbovými nebo virovými patogeny může vyvolat ve vegetativních tkáních systémovou syntézu přibližně 10 rodin homologních proteinů souvisejících s patogenezí (PR-proteinů). Tyto PR-proteiny byly rozděleny do 5 skupin. Proteiny PR-2, PR-3 a PR-5 jsou beta-1,3-glukanasa, chitinasy, respektive proteiny podobné thaumatinu. Skupinám proteinů PR-1 a PR-4 nebyly přiřazeny specifické funkce. Proteiny PR-4 jsou podobné C-koncovým doménám proheveinu a předpokládaným zraněním indukovaným proteinům WIN bramboru, postrádají tedy N-koncovou heveinovou doménu. Je zejména výhodné, pokud jsou proteiny podle vynálezu zkombinovány s jedním nebo několika proteiny, které jsou bazickými doplňky skupiny proteinů PR-4 (basic counter parts of the PR-4 group of proteins), tedy bazickými doplňky proteinů podobných C-koncovým doménám proheveinu a předpokládaným zraněním indukovaným proteinům WIN bramboru. Je zejména výhodné, pokud je bazickým doplňkem uvedených proteinů souvisejících s patogenezí WIN-protein vázající chitin, zrejména takový, který je produkován zrnem ječmene nebo listy ječmene vystavenými stresu.

Vynález dále zahrnuje rekombinantní DNA obsahující sekvenci kódující protein, který má aminokyselinovou sekvenci výše popsaných anzimikrobiálních proteinů. DNA může zejména kódovat alespoň jeden z proteinů, jejichž sekvence jsou znázorněny v SEQ ID č. 1-3, popřípadě s alespoň jedním z proteinů jejichž sekvence jsou znázorněny v SEQ ID č. 4 - 6. Rekombinantní DNA může dále kódovat protein, který způsobuje rezistenci vůči herbicidům, podporuje růst rostlin, má antifungální, antibakteriální, antivirální nebo/a antinematodní vlastnosti. V případě, že má být tato DNA introdukována do heterologního organismu, může být modifikována pro odstranění známých motivů nestability mRNA (jako jsou oblasti bohaté na A a T) a polyadenylačních signálů (pokud jsou nějaké přítomny), nebo/a lze použít kodóny, které jsou upřednostňovány organismem, do kterého má být tato rekombinantní DNA inzertována, tak, že expresí takto modifikované DNA. v uvedeném organismu se získá protein podstatně podobný proteinu, který se získá expresí nemodifikované rekombinantní DNA v organismu, ve kterém je antimikrobiální protein podle vynálezu endogenní.

Vynález dále zahrnuje rekombinantní DNA, která je podobná rekombinantní DNA uvedené výše. Termínem podobná DNA se označuje sekvence, která je komplementární k testované sekvenci, která je schopná hybridizace s rekombinantní sekvencí podle vynálezu. Pokud jsou testovaná sekvence a sekvence podle vynálezu dvouřetězcové, má nukleová kyselina tvořící testovanou sekvenci poloviční teplotu denaturace (TM) výhodně v rozmezí 20 °C od poloviční teploty denaturace sekvence podle vynálezu. V případě, že testovaná sekvence a sekvence podle vynálezu jsou spolu smíchány a denaturovány současně, hodnoty poloviční teploty denaturace (TM) těchto sekvencí se od sebe výhodně liší v rozmezí do 10 ’C. Výhodněji se hydridizace provádí za přísných podmínek, přičemž buďto testovaná DNA nebo DNA podle vynálezu je výhodně na nosiči. Výhodně se tedy nejprve buďto denaturovaná testovaná sekvence nebo sekvence podle vynálezu naváže na nosič a hybridizace se provádí po určenou dobu při teplotě mezi 50 a 70 °C v 2x citrátovém pufru s chloridem sodným (SSC) obsahujícím 0,1 % dodecylsulfátu- sodného (SDS) s následným vymytím nosiče při stejné teplotě, ale pufrem se sníženou koncentrací SSC. V závislosti na požadovaném stupni přísnosti, a tedy na stupni podobnosti sekvencí, je takovou sníženou koncentrací pufru typicky lx SSC obsahující 0,1 %

SDS, 0,5x SSC obsahující 0,1 % SDS a 0, lx SSC obsahující

0,1 % SDS. Sekvencemi, které vykazují největší stupeň podobnosti jsou ty sekvence, jejichž hybridizace je nejméně ovlivněna promýváním v pufrech se sníženou koncentrací. Nejvýhodnější je, pokud testovaná sekvence a sekvence podle vynálezu jsou tak podobné, že hybridizace mezi nimi je podstatně neovlivněná promytím nebo inkubací v 0,lx SSC obsahujícím 0,1 % SDS.

Vynález dále zahrnuje komplementární k sekvenci, která podmínek s rekombinantní DNA podle která je za přísných

DNA-sekvenci, hybridizuj e vynálezu.

Vynález rovněž zahrnuje: vektor obsahující výše popsanou DNA, která je exprimovatelná v rostlinách a je spojená s promotorem a terminátorem operabilním v rostlinách; rostliny transformované takovou DNA; potomstvo takových rostlin obsahující tuto DNA stabilině inkorporovanou a dědičnou Mendelovým způsobem, nebo/a semena takových rostlin a takového potomstva. Transformované rostliny lze vytvořit pomocí známých způsobů, které zahrnují regeneraci roslinných buněk nebo protoplastů transformovaných DNA podle vynálezu za pomoci řady známých postupů (Ti a Ri plazmidy Agrobacteria, elektroporace, mikroinjektáž, vstřelování mikroprojektilů (micro-projectile gun) atd.). Z tansformované buňky mohou být ve vhodných případech regenerovány celé rostliny, ve kterých je jaderný materiál stabilně inkorporován do genomu. Tímto způsobem lze získat jak jednoděložné tak dvouděložné rostliny. Mezi příklady geneticky transformovaných rostlin podle vynálezu patří: ovocné plodiny, včetně rajčete, mangovníku, broskvoně, jabloně, hrušně, jahodníku, banánovníku a melounu, polní plodiny jako je řepka a řepice typu canola, slunečnice, tabák, cukrová řepa, drobnozrnné obilniny jako je pšenice, ječmen a rýže, kukuřice a bavlník, a zeleniny jako je brambor, mrkev, salát, brukev zelná a cibule. Výhodnými rostlinami jsou cukrová řepa a kukuřice.

Vynález dále zahrnuje protein získaný expresí uvedené DNA a antimikrobiální protein produkovaný expresí rekombinantní DNA v rostlinách, který jí byly transformovány.

Vynález dále zahrnuje antimikrobiální prostředek obsahující jeden nebo několik proteinů podle vynálezu; způsob potírání hub který zahrnuje jejich vystavení působení takových proteinů, a způsob extrakce pro získání antimikrobiálních proteinů z organického materiálu, který je obsahuje, kterýžto způsob zahrnuje podrobení materiálu, výhodně ve formě mikroorganismu, maceraci a extrakci pomocí rozpouštědel. Je vhodné, aby antimikrobiální protein vykazoval malý, pokud vůbec nějaký, antimikrobiální účinek na mikroorganismus, který je zdrojem organického materiálu uvedeného v předchozí větě.

Vynález dále ilustrují následující příklady a znázorněné sekvence a obrázky.

Popis obrázků

Obrázek 1 znázorňuje typický eluční profil kapaliny z intercelulárního promývání na koloně CM-Sepharose. Symbol t znamená čas v minutách, p/e znamená předek / eluent.

Obrázek 2 znázorňuje typický eluční profil frakce vymyté 0,3M chloridem sodným uvedené na obrázku 1, z kolony pro rychlou kapalinovou chromatografií proteinů (FPLC) Mono S. Symbol t znamená čas v minutách.

Obrázek 3 zobrazuje typický eluční profil proteinů představovaných pikem 3 na obrázku 2, z kolony pro vysoceúčinnou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi (RP-HPLC).

Obrázek 4 ilustruje antifungální aktivitu 10 _zug proteinu představovaného píky 3.1 a 3.2 na obrázku 3 (SEQ ID

č. 1 respektive 2). Symbol t znamená čas v hodinách.

Obrázek 5 znázorňuje chromatogram získaný gelovou filtrací Ο,ΙΜ-frakce uvedené na obrázku 1, na koloně Sephadex G75. Symbol t znamená čas v minutách, Symboly sfl až sfVI znamenají spojenou frakci I až spojenou frakci VI.

Obrázek 6 znázorňuje typický eluční profil píku (spojené frakce) V uvedeného na obrázku 5, z kolony pro rychlou kapalinovou chromatografií proteinů (FPLC) Mono S. Symbol t znamená čas v minutách.

Obrázek 7 ilustruje antifungální aktivitu 10 _zug proteinu představovaného píky 1 a 2 na obrázku 6 (SEQ ID č. 3). Symbol t znamená čas v hodinách.

Obrázek 8A znázorňuje kombinovanou antifungální aktivitu vždy 2 _zug proteinů představovaných sekvencemi SEQ ID č. 2 a 3, obrázek 8B znázorňuje kombinovanou antimikrobiální aktivitu vždy 2 _zug proteinů představovaných sekvencemi SEQ ID č. 2 a 5. Symbol t znamená čas v hodinách.

Obrázky 9A a 9B ukazují morfologii hyf Cercospora beticola rostoucích za nepřítomnosti antimikrobiálních proteinů podle vynálezu. Obrázky 9C a 9D znázorňují hyfy, pokud houba roste po dobu 48 hodin za přítomnosti 2 _zug proteinů se sekvencemi znázorněnými jako SEQ ID č. 2 respektive 3. Test se provádí v mikrotitračních deskách, jak je uvedeno níže. Zvětšení na obrázku 9A je 76x, na obrázcích 9B - 9D 294x.

Popis sekvencí

Sekvence SEQ ID č. 1 zobrazuje aminokyselinovou sekvenci proteinu představovaného pikem 3.1 na obrázku 3.

Sekvence SEQ ID č. 2 zobrazuje aminokyselinovou sekvenci proteinu představovaného pikem 3.2 na obrázku 3.

- 8 Sekvence SEQ ID č. 3 zobrazuje aminokyselinovou sekvenci proteinu představovaného píky 1 a 2 na obrázku 6.

Sekvence SEQ ID č. 4 - 6 znázorňují aminokyselinové sekvence tří známých antifungálních proteinů.

Sekvence SEQ ID č. 7 znázorňuje nukleotidovou sekvenci cDNA kódující protein uvedený v SEQ ID č. 3.

Sekvence SEQ ID č. 8 znázorňuje produkt translace transkriptu kódovaného sekvencí cDNA uvedenou v SEQ ID č. 7, kterýžto produkt obsahuje N- a C-koncová prodloužení proteinu uvedeného v SEQ ID č. 3.

Příklady provedení vynálezu

Izolace kapaliny z intercelulárního promývání

Kapalina z intercelulárního promývání se izoluje z 500 až 700 g listů cukrové řepy jejich ponořením do 20mM HAc (pH 4,5) . Tyto ponořené listy se poté umístí v desikátoru a vakuově se infiltrují po dobu 5 minut při maximálním tlaku 533 Pa. Povrch listů se vysuší na vzduchu a poté se izoluje kapalina z intercelulárního promývání centrifugací při 500 g po dobu 15 minut v centrifugačních kyvetách o objemu 500 ml.

Katexová chromatografie

Takto získaná kapalina z intercelulárního promývání se frakcionuje katexovou chromatografií na koloně CM-Sepharosy o objemu 10 ml (Pharmacia LKB), preekvilibrované s výchozím pufrem (20mM HAc (pH 4,5)). Frakcionace se provádí pří teplotě 4 °C při rychlosti průtoku 25 ml / h. Izolují se frakce o objemu 3 ml. Proteiny nenavázané na kolonu se odstraní rozsáhlým promýváním kolony výchozím pufrem. Navázané proteiny se vymývají aplikací dalšího výchozího pufru, který obsahuje postupně se zvyšující koncentrace soli:

Ο,ΙΜ chlorid sodný, 0,3M chlorid sodný a 0,5M chlorid sodný, na kolonu. Měří se absorbance eluátu při 280 nm a u frakcí, o kterých se usoudí že obsahují protein, se testuje jejich antifungální aktivita proti Cercospora beticola za použití dříve popsaného biologického testu na mikrotitrační desce (patentová přihláška PCT č. PCT/DK92/00108, zveřejněná pod číslem WO 92/17591, nyní převedená na Sandoz LTD).

Typický eluční profil je znázorněn na obrázku 1. Eluáty získané aplikací výchozího pufru obsahujícího 0,3M chlorid sodný a Ο,ΙΜ chlorid sodný na kolonu se dále purifikují jak je popsáno níže.

Purifikace antifungálních proteinů z eluátu získaného 0,3M chloridem sodným z CM-Sepharosy

Rychlá kapalinová chromatografie proteinů (FPLC)

Proteinová frakce vymytá 0,3M chloridem sodným se odsolí dialýzou prováděnou přes noc (hraniční hodnota: 3 kDa) proti 20mM HAc (pH 4,5) při teplotě 4 °C. K takto dialyzované proteinové frakci se přidá betain v 5% (hmotnost / objem) koncentraci. 4 ml výsledného roztoku se poté frakcionují rychlou kapalinovou chromatografií proteinů (FPLC) na katexu za použití kolony Mono S HR 5/5 (Pharmacia LKB) ekvilibrované s 20mM HAc (pH 4,5) obsahujícím 5 % (hmotnost / objem) betainu (A-pufr). Navázané proteiny se eluují lineárním gradientem soli od 0 do 0,3M chloridu sodného ve 30 ml A-pufru s následující elucí l,0M chloridem sodným ve stejném pufru. Rychlost průtoku činí 1 ml / min.

Obrázek 2 ukazuje, že frakce vymytá 0,3M chloridem sodným obsahuje řadu odlišných proteinů, z nichž kvantitativně nej významnější jsou označeny jako píky 1-5. Při separaci pomocí elektroforesy v SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) za použití systému Phast System (Pharmacia

LKB) , stříbrem obarvených 10 - 15% gradientových nebo High Density gelů (Pharmacia LKB) se zjistí, píků 1-5 obsahuje 2-5 proteinových pásů.

Phast gelů že každý z

Vysoceúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) s obrácenými fázemi

Proteinový pík 3 (uvedený na obrázku 2) z kolony Mono S se dále purifikuje pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi (RP-HPLC) na koloně C₄-silikagelu Vydac (The Separations Group, CA, USA) . Rozpouštědlovým systémem je A: 0,1% kyselina trifluoroctová ve vodě a B: 0,1% kyselina trifluoroctová v acetonitrilu. Proteiny se eluují lineárním gradientem od 5 do 45 % B-pufru aplikovaného 18 minut po nanesení vzorku a poté 60 % B-pufru po dobu 2 minut. Rychlost průtoku činí 0,7 ml / minutu. Protein se detekuje sledováním absorbance eluátu při 214 a 280 nm. Jednotlivé proteinové píky se izolují a Ivofilizují. Takto lyofilizované proteiny se promyjí dvakrát vodou, znovu se iyofilizují a následně se před analýzou čistoty a antifungální aktivity rozpustí v lOmM Tris-HCl (pH 8,0).

Obrázek 3 znázorňuje, že pík 3 z obrázku 2 se na koloně s obrácenými fázemi rozdělí na čtyři píky (označené na obrázku 3 jako 3.1 - 3.4). Elektroforesou píků 3.1 - 3.4 v SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) se zjistí, že každý z nich je tvořen čistými proteiny s molekulovou hmotností přibližně 7 kDa (píky 3.1, 3.2 a 3.3) a 2,5 - 3 kDa (pík

3.4) .

Purifikace antifungálních proteinů v eluátu získaném 0,lM chloridem sodným z CM-Sepharosy ml eluátu získaného 0,lM chloridem sodným z obrázku 1 se frakcionuje gelovou filtrací na koloně Sephadex G-75 o objemu 370 ml (Pharmacia LKB) ekvilibrované s 50mM MES (4-morfolinethansulfonovou kyselinou) (pH 6,0) při rychlosti průtoku 20 ml / hodinu. Izolují se frakce o objemu 10 ml. Tyto frakce se následně spojí do šesti větších frakcí, I až VI, z nichž každá má objem přibližně 50 ml (viz obrázek 5).

Katexová chromatografie (Mono S)

Spojená frakce V (znázorněná na obrázku 5) z kolony Sephadex G-75 se nanese na kolonu pro rychlou kapalinovou chromatografií proteinů Mono S ekvilibrovanou s pufrem A: 50mM MES (pH 6,0) obsahující 5 % betainu (hmotnost / objem). Po promytí A-pufrem se navázané proteiny eluují při rychlosti průtoku 1 ml / minutu s lineárním gradientem od 0 do 0,5M chloridu sodného ve 30 ml A-pufru (viz obrázek 6) . Při podrobení proteinu představovaného píky 1 a 2 elektroforéze v SDS-gelu za přítomnosti dithiothreitolu (DTT) se zjistí dva odlišné pásy. První pás má molekulovou hmotnost mezi 2,5 a 3 kDa a druhý pás, který představuje neredukovaný dimer proteinu z prvního pásu, má molekulovou hmotnosti přibližně 5 kDa.

Identifikace antifungálních proteinů

Antifungální aktivita

Obrázky 4 a 7 - 9 svědčí o tom, že proteiny představované píky 3.1 a 3.2 (SEQ ID č. 1 respektive 2) na obrázku 3 a píky 1 a 2 (seQ id č. 3) na obrázku 6 vykazují podstatnou antifungální aktivitu, mimo jiné proti Cercospora beticoia. Inhibice růstu houby se měří v mikrotitračních deskách s 96 jamkami při 620 nm, v podstatě jak je popsáno ve WO 92/17591. Obrázek 9 znázorňuje, že Cercospora beticoia ošetřená takovými proteiny má zakrnělé hyfy, které jsou zesílené a více rozvětvené (obrázky 9C, 9D) ve srovnání s hyfami houby rostoucí za nepřítomnosti antimikrobiálních proteinů, (obrázky 9A, 9B) .

Tyto proteiny, buďto samotné nebo v kombinaci s WIN N (purifi kovaným ze zrna ječmene nebo listu ječmene vystaveného stresu jak popsali Hejgaard a kol. (FEBS Letters, 307, 389 392 (1992)), nebo/a proteinem který má sekvenci odpovídající alespoň jedné ze sekvencí uvedených v SEQ ID č. 4 - 6, se inkubují se sporami Cercospora beticola. Testovaná směs, která má objem 240 _zul, obsahuje 100 _zul vývaru bramborové dextrosy (Difco), 40 _zul vzorku proteinu (nebo pufru jako kontroly) ve lOOmM Tris a 20mM chloridu sodném (pH 8,0), jakož i přibližně 400 spor ve 100 _zul vody. Mikrotitrační desky se uzavřou lepicí páskou pro zamezení odpařování a kontaminaci a následně se inkubují při teplotě místnosti na třepačce pracující při 200 otáčkách za minutu. Každý den po dobu 8 dnů se měří absorbance při 620 nm a vynese se do grafu pro každou koncentraci proteinu proti času.

Sekvencování aminokyselin

Purifikované antifungální proteiny odpovídající pikům 3.1 a 3.2 na obrázku 3 (sekvence SEQ ID č. 1 respektive 2), které pocházejí z eluátu získaného 0,3M chloridem sodným z kolony CM-Sepharosy (obrázek 1) a protein odpovídající pikům 1 a 2 na obrázku 6 (sekvence SEQ ID č. 3), který pochází z eluátu získaného O,1M chloridem sodným z uvedené kolony CM-Sepharosy se karboxymethylují a podrobí se vysoceúčinné kapalinové chromatografií s obrácenými fázemi (RP-HPLC) na koloně C₄-silikagelu Vydac . Rozpouštědlovým systémem je A: 0,1% kyselina trif luoroctová ve vodě a B: 0,1% kyselina trifluoroctová v acetonitrilu. Proteiny se eluují jako jediné píky s mírně odlišnými retenčními dobami. C-koncové sekvence proteinů se získají jejich štěpením endo-R-proteinasou a následnou purifikací pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografe s obrácenými fázemi (RP-HPLC) na koloně

C₁₃-silikagelu Vydac.

Produkce transformovaných rostlin

Geny kódující proteiny podle vynálezu se introdukují do rostlin. Na bázi genově specifických primerů se z odpovídající mRNA za použití polymerasové řetězové reakce (PCR) syntetizují kódující oblasti genů kódujících proteiny. Po přidání promotorových a terminátorových sekvencí se geny kódující uvedené proteiny introdukují do vektoru pro transformaci rostlin. Tento vektor může popřípadě obsahovat gen kódující WIN-protein, jako je tento protein získaný z listu ječmene vystaveného stresu nebo zrna ječmene, nebo/a gen kódující protein znázorněný v sekvenci SEQ ID č. 4, SEQ ID č. 5 neboúa SEQ ID č. 6, nebo/a gen kódující chitinasu nebo/a glukanasu. Výhodnou chitinasou je chitinasa 4 popsaná v patentové přihlášce PCT č. PCT/DK92/00103 (zveřejněné pod číslem WO/92/17591). Těmito vektory lze transformovat například Agrobacterium tumefaciens. Takto transformované Agrobacterium se poté nechá působit na rostlinné buňky, a z takto transformovaných rostlinných buněk se regenerací získají celé rostliny, ve kterých je nový jaderný materiál stabilně začleněn do genomu. Je však třeba vzít v úvahu, že DNA kódující protein podle vynálezu (nebo kombinaci takových proteinů), a popřípadě kódující dále jiné proteiny, lze introdukovat do rostlinných buněk pomocí jiných známých postupů, včetně použití vstřelování mikroprojektilů (micro-projectile gun), elektroporace, elektrotransformace, mikroinjektáže atd., a že regenerace transformovaných buněk se provádí včetně ošetření je to nutné nebo za použití postupů známých těchto buněk cytokininy v žádoucí z důvodů zlepšení rostlinných odborníkovi, případě, že regenerační frekvence

Kromě toho lze vhodné mikroorganismy (t.j. takové, ve kterých není produkce proteinů podle vynálezu podstatně toxická) transformovat vektorem obsahujícím gen (nebo geny) kódující tento protein tak, že transformované mikroorganismy produkují takový protein. Tyto mikroorganismy mohou dále obsahovat geny kódující jiné proteiny, jako je WIN-protein nebo/a protein jehož sekvence je uvedena v jedné nebo několika sekvencích SEQ ID č. 4 - 6. Dále mohou mezi takové jiné proteiny patřit různé chitinasy nebo/a glukanasy. Je zejména výhodné, pokud je takovýmto jiným proteinem chitinasa 4, jak je popsána v patentové přihlášce PCT č. PCT/DK92/00108 (zveřejněné pod číslem WO92/17591).

Tyto mikroorganismy lze poté použít k potírání rostlinných patogenů. Například lze transformované mikroorganismy vysušit a postřikovat jimi infikované rostliny nebo rostliny v nebezpečí infekce.

Zobrazení sekvencí

Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 91 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: protein (iii) hypotetická: není (iii) anti-sense: není (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Beta vulgaris (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 1:

Ile 1

Thr

Cys

Gly

Leu 5

Val

Ala

Ser

Lys

Leu 10

Ala

Pro

Cys

Ile

Gly 15

Tyr

Leu

Gin

*iy

Ala 20

Pro

Gly

Pro

Ser

Ala 25

Gly

Cys

Gly

Gly 30

Ile

Lys

Gly

Leu

Asn 35

Ser

Ala

Ser 40

Pro

Ala

Asp

Arg

Lys 45

Thr

Ala

cys

Thr

Cys 50

Leu

Lys

Ser

Ala

Ala 55

Thr

Ser

Ile

Lys

Gly 60

Ile

Asn

Tyr

Gly

Lys 65

Ala

Ser

Leu

Pro 70

Arg

Gin

Cys

Gly

Val 75

Ser

Val

Pro

Tyr

Ala 80

Ile

Ser

Pro

Asn

Thr 85

Asn

Cys

Asn

Ala

Ile 90

His

Informace o sekvenci SEQ ID č. 2:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) organismus: Beta vulgaris

	(xi)	znázornění	sekvence SEQ ID č. 2:
Ile	Thr	Cys Gly Leu Val	Ala Ser Lys Leu Ala Pro Cys Ile Gly Tyr
1		5	10 15'
Leu	Gin	Gly Ala Pro Gly	Pro Ser Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ile Lys
		20	25 30
Gly	Leu	Asn Ser Ala Ala	Ala Ser Pro Ala Asp Arg Lys Thr Ala Cys
		35	40 45
Thr	Cys	Leu Lys Ser Ala	Ala Thr Ser Met Lys Gly Ile Asn Tyr Gly
	50		55 60
Lys	Ala	Ala Ser Leu Pro	Arg Gin Cys Gly Val Ser Ile Pro Tyr Ala
65		70	75 80
Ile	Ser	Pro Asn Thr Asn	Cys Asn Ala Ile His
		85	90

Informace o sekvenci SEQ ID č. 3:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 30 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: protein (iii) hypotetická: není (iii) anti-sense: není (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Beta vulgaris (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 3:

Ser Gly Glu Cys Asn Met Tyr Gly Arg Cys Pro Pro Gly Tyr Cys Cys 15 10 15

Ser Lys Phe Gly Tyr Cys Gly Val Gly Arg Ala Tyr Cys Gly 20 25 30

Informace o sekvenci SEQ ID č. 4:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 46 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: protein (iii) hypotetická: není (iii) anti-sense: není (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Beta vulgaris (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 4:

Ala

Ile

Cys

Lys

Pro

Ser

Lys

Phe

Lys

Gly

Ala

Cys

Gly

Arg

1

5

10

15

Asp

Ala

Asp

Cys

Glu

Lys

Ala

Cys

Asp

Gin

Glu

Asn

Trp

Pro

Gly

20

25

30

Val

Cys

Val

Pro

Phe

Leu

Arg

Cys

Glu

Cys

Gin

Arg

Ser

Cys

35

40

45

Informace o sekvenci SEQ ID č. 5:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) organismus: Beta vulgaris (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 5:

Ala Thr Cys Arg 1

Lys 5

Pro

Ser

Met Tyr

Phe Ser 10

Gly Ala Cys

Phe Ser 15

Asp

Thr

Asn

Cys

Gin

Lys

Ala

Cys

Asn

Arg

Glu

Asp

Trp

Pro

Asn Gly

20

25

30

Lys

Cys

Leu

Val

Gly

Phe

Lys

Cys

Glu

Cys

Gin

Arg

Pro

Cys

35

40

45

Informace o sekvenci SEQ ID č. 6:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 32 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: protein (iii) hypotetická: není (iii) anti-sense: není (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Beta vulgaris (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 6:

Arg Cys 1

Ile

Pro Cys 5

Gly Gin Asp

Cys

Ile Ser Ser Arg Asn Cys Cys

10

15

Ser

Pro

Cys

Lys

Cys

Asn Phe Gly

Pro

Val

Pro

Arg

Cys

Thr

Asn

20

25

30

Informace o sekvenci SEQ ID č. 7:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 550 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: dvouřetězcová (D) topologie: neznámá (iii) hypotetická: není (iii) anti-sense: není (vi) původní zdroj:

(A) organismus: Beta vulgaris (ix) vlastnosti:

(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 66..293 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 7:

ACTCAACAAA TTCAGAAAAA AACAGAAGCA AAAAAAGTTT ATTGAAAGAG TAAGTTGAGG

TGAAA ATG ATG AAA AGC TTT GTG ATA GTT ATG TTG GTC ATG TCC ATG Met Met Lys Ser Phe Val Ile Val Met Leu Val Met Ser Met

10

ATG GTG GCT ACA TCT ATG GCA AGT GGT GAA TGC AAT ATG TAT GGT CGA

Met Val Ala Thr Ser Met Ala Ser Gly Glu Cys Asn Met Tyr Gly Arg

20 25 30

107

155

TGC Cys

CCC Pro

CCA GGG

TAT TGT TGT

AGC AAG TTT GGC TAC TGT GGT GTC

GGA Gly

203

Pro

Gly

Tyr 35

Cys

Ser Lys

Phe Gly Tyr Cys Gly Val

40

45

CGC

GCC

TAT

TGT

GGC

GAT

GCT

GAG

CAG

AAG

GTT

GAA

GAT

CAT

CCA

TCT

251

Arg

Ala

Tyr

Cys

Gly

Asp

Ala

Glu

Gin

Lys

Val

Glu

Asp

His

Pro

Ser

50

55

60

AAT

GAT

GCT

GAT

GTT

CCT

GAG

TTT

GTT

GGA

GCT

GGT

GCC

CCA

293

Asn

Asp

Ala

Asp

Val

Pro

Glu

Phe

Val

Gly

Ala

Gly

Ala

Pro

65

70

75

TGATGCTCGA AGCCAGGTAA TCGTAATGGC ATGGGTTACC TAATAAGTAA ACTCATTGTG 353

CCTAGCTTGC TACATGCTTA TCCACTATAA ATAAGCTCCT ACAGGAGTTG TGTTTTTCTT '413

TTAATTTTGT AATCAAGGGT TTGACTTTAA TTAATGAGAC CAATGTATAC TTGCATGTCG 473

GATAAATATN TAACTAAGCC ACTCGTATTG GTTTATTATA AAACTACTAT AAAAAAAAAA 533

AAAAAAAAAA AAAAAAA S50

Informace o sekvenci SEQ ID č. 8:

(i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 76 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 8:

Met 1

Met

Lys

Ser

Phe 5

Val

Ile

Val

Met

Leu 10

Val

Met

Ser

Met

Met 15

Val

Ala

Thr

Ser

Met 20

Ala

Ser

Gly

Glu

Cys 25

Asn

Met

Tyr

Gly

Arg 30

Cys

Pro

Gly

Tyr 35

Cys

Ser

Lys

Phe 40

Gly

Tyr

Cys

Gly

Val 45

Gly

Arg

Ala

Tyr

Cys 50

Gly

Asp

Ala

Glu

Gin 55

Lys

Val

Glu

Asp

His 60

Pro

Ser

Asn

Asp

Ala Asp Val Pro Glu Phe Val Gly Ala Gly Ala Pro 65 70 75

- 21 mi- η

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Antimikrobiální protein obsahující peptid s aminokyselinovou sekvencí AA₁-AA₂-AA₃-Cys-AA₅-AA₆-AA.₇-AA₈-AA₉-Cys-AA₁₁-AA₁₂-AA₁₃-AA₁₄-Cys-Cys-AA₁₇-AA₁₈-AA₁₉-AA₂₀-AA₂₁-Cys-AA₂₃-AA₂₄-AA₂₅-AA_2S-AA₂₇-AA₂₈-Cys-AA₃₀.
2. Antimikrobiální protein podle nároku 1, ve kterém AA₇ znamená tyr, AA₁₄ znamená tyr a AA₁₈ znamená lys.
3. Antimikrobiální protein podle nároku 1 nebo 2, ve kterém AA^ znamená val, AA₂₆ znamená arg a AA₂₇ znamená ala.
4. Antimikrobiální protein, který má sekvenci uvedenou v libovolné ze sekvencí SEQ ID č. 1-3.
5. Čistý protein, který je alespoň z 90 % podobný proteinům podle libovolného z nároků 1 - 4.
6. Čisté proteiny podle libovolného z nároků 1-5, v kombinaci s alespoň jedním proteinem vybraným ze skupiny zahrnující proteiny znázorněné v sekvencích SEQ ID č. 4 - 6.
7. Čisté proteiny podle libovolného z nároků 1-6, v kombinaci s alespoň jedním dalším proteinem který způsobuje rezistenci vůči herbicidům, podporuje růst rostlin, má antifungální, antibakteriální, antivirální nebo/a antinematodní vlastnosti.
8. Rekombinantní DNA obsahující sekvenci kódující protein podle libovolného z nároků 1-5 nebo rekombinantní DNA mající sekvenci znázorněnou v SEQ ID č. 7.
9. Rekombinantní sekvence DNA podle nároku 8, která dále obsahuje sekvenci kódující alespoň jeden z proteinů znázorněných v sekvencích SEQ ID č. 4 - 6.
10. Rekombinantní DNA podle libovolného z nároků 8 nebo

9, která dále kóduje protein který způsobuje rezistenci vůči herbicidům, podporuje růst rostlin, má antifungální, antibakteriální, antivirální nebo/a antinematodní vlastnosti.
11. Rekombinantní DNA podle libovolného z nároků 8 až

10, která je modifikována tak, že jsou odstraněny známé motivy nestability mRNA nebo polyadenylační signály nebo/a jsou použity kodóny, které jsou preferovány organismem, do kterého má být tato rekombinantní DNA inzertována, takže se expresí takto modifikované DNA v shora uvedeném organismu získá podstatně podobný protein jako expresí nemodifikované rekombinantní DNA v organismu, ve kterém je protein endogenní.
12. Sekvence DNA, která je komplementární k sekvenci hybridizující za přísných podmínek s DNA podle libovolného z nároků 8 až 11.
13. Vektor obsahující sekvenci DNA podle libovolného z nároků 8 až 12, kterážto sekvence je exprimovatelná v rostlinách a je spojena s promotorem a terminátorem operabilním v rostlinách.
14. Biologický systém obsahující DNA podle libovolného z nároků 8 až 12 nebo vektor podle nároku 13.
15. Rostliny transformované rekombinantní DNA podle libovolného z nároků 8 až 12, potomstvo takových rostlin obsahující tuto DNA stabilně inkorporovanou a dědičnou Mendelovým způsobem, nebo/a semena takových rostlin nebo takového potomstva.
16. Protein získaný expresí DNA podle libovolného z nároků 8 až 12 a antimikrobiální protein produkovaný expresí rekombinantní DNA v rostlinách nebo jejich potomstvu nebo semenech podle nároku 15.
17. Antimikrobiální prostředek, vyznačuj ící se t i m , že obsahuje jeden nebo několik proteinů podle libovolného z nároků 1 až 7 a 16.
18. Způsob potírání hub, vyznačující se tím, že zahrnuje jejich vystavení působení proteinů nebo prostředků podle libovolného z nároků 1-7, 16 a 17.
19. Způsob extrakce pro získání antimikrobiálních proteinů podle libovolného z nároků 1-7 nebo nároku 16 z organického materiálu, který je obsahuje, kterýžto způsob zahrnuje podrobení tohoto materiálu maceraci a extrakci pomocí rozpouštědel·, vyznačující se že tímto materiálem je mikroorganismus nebo rostlina.

tím

1/9