JPH09504427A - 抗微生物タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アミノ酸配列：ＡＡ₁−ＡＡ₂−ＡＡ₃−Ｃys−ＡＡ₅−ＡＡ₆−ＡＡ₇−ＡＡ₈−ＡＡ₉−Ｃys−ＡＡ₁₁−ＡＡ₁₂−ＡＡ₁₃−ＡＡ₁₄−Ｃys−Ｃys−ＡＡ₁₇−ＡＡ₁₈−ＡＡ₁₉−ＡＡ₂₀−ＡＡ₂₁−Ｃys−ＡＡ₂₃−ＡＡ₂₄−ＡＡ₂₅−ＡＡ₂₆−ＡＡ₂₇−ＡＡ₂₈−Ｃys−ＡＡ₃₀を有するペプチドを含む、抗微生物タンパク質。配列番号１−３のいずれか１つに記載の配列を有する抗微生物タンパク質。このようなタンパク質をコードする組換えＤＮＡ。植物内で発現可能であり、植物作動可能プロモーターおよびターミネーターに結合している上記ＤＮＡを含むベクター。このようなＤＮＡで形質転換された植物；安定に包含されたＤＮＡを含み、メンデルの法則に従って遺伝できるこのような植物の子孫および／またはこのような植物およびこのような子孫の種子。

Description

【発明の詳細な説明】 抗微生物タンパク質 本発明はサトウダイコンから単離可能な抗微生物タンパク質に関する。 本発明により、アミノ酸配列：ＡＡ₁−ＡＡ₂−ＡＡ₃−Ｃys−ＡＡ₅−ＡＡ₆− ＡＡ₇−ＡＡ₈−ＡＡ₉−Ｃys−ＡＡ₁₁−ＡＡ₁₂−ＡＡ₁₃−ＡＡ₁₄−Ｃys−Ｃys− ＡＡ₁₇−ＡＡ₁₈−ＡＡ₁₉−ＡＡ₂₀−ＡＡ₂₁−Ｃys−ＡＡ₂₃−ＡＡ₂₄−ＡＡ₂₅−Ａ Ａ₂₆−ＡＡ₂₇−ＡＡ₂₈−Ｃys−ＡＡ₃₀(式中、ＡＡは一般に見られる任意のアミ ノ酸を意味する)を有するペプチドを含む、抗微生物タンパク質が提供される。 ＡＡ₇がtyr；ＡＡ₁₄がtyr；およびＡＡ₁₈がlysであるのが好ましい。加えて、Ａ Ａ₂₄がVal；ＡＡ₂₆がarg；およびＡＡ₂₇がalaであるのが更に好ましい。 抗微生物タンパク質は、細菌(最も具体的にはグラム陽性細菌)、ウイルスおよ び特に真菌を含む任意の微生物に対して任意の環境下で毒素であるかまたは成長 阻害剤であるタンパク質(単独または他の物質と組み合わせて)を含む。このよう な抗微生物タンパク質は、微生物と接触して抗微生物活性を示すものおよびその 吸収または呼吸の結果抗微生物であるものを含む。 本発明はまた配列番号１−３のいずれか１つに記載の配列を有する抗微生物タ ンパク質も含む。 本発明は、更に上記タンパク質のいずれか１つと実質的に類似な純粋タンパク 質をまた含む。 “実質的に類似”は、本発明のタンパク質の配列に少なくとも８５％相同なア ミノ酸配列を有する純粋タンパク質を意味する。相同性が少なくとも９０％が好 ましく、相同性が少なくとも９５％が更に好ましい。 本発明の内容において、少なくとも８５％、９０％または９５％違いに類似で ある２個のアミノ酸配列は、配列した場合、少なくとも８５％、９０％または９ ５％同一かまたは類似の位置のアミノ酸残基が同類で置換されており、所望によ り、２個までのギャップが可能である(ただし、各々のギャップに関連して、全 部で３個以上のアミノ酸残基が影響を受けない)。配列番号１および２で具体的 に記載のタンパク質の場合、ギャップの数は４まで増加し得る(ただし、各々の ギャップに関連して、全部で５個以上のアミノ酸残基が影響を受けない)。 本発明の目的において、同類置換は以下のグループ内のアミノ酸間でなされ得 る： (ｉ) セリンとスレオニン； (ii) グルタミン酸とアスパラギン酸； (iii)アルギニンとリジン； (iv) アスパラギンとグルタミン； (ｖ) イソロイシン、ロイシン、バリンとメチオニン； (vi) フェニルアラニン、チロシンとトリプトファン； (vii)アラニンとグリシン。 本発明は、更に本発明の抗微生物タンパク質と少なくとも９０％同一な純粋タ ンパク質および少なくとも９０％のその特異的活性を有する純粋タンパク質をま た含む。本発明の目的において、特異的活性は、特定量の特定微生物における、 特定量のタンパク質により産生される成長または複製阻害の量の測定である。 本発明は、配列番号４−６に記載のものからなる群から選択された少なくとも 一つのタンパク質と組み合わせた上記純粋タンパク質を更にまた含む。このよう な組み合わせたタンパク質は、更に１種またはそれ以上の既知の“病原関連タン パク質”と組み合わせ得る。真菌またはウイルス病原体による植物の感染は、植 物性組織における、約１０群の相同病原体関連タンパク質(ＰＲタンパク質)の全 体的合成を誘導し得る。このようなＰＲタンパク質は、５群に分類されている。 ＰＲ−２、ＰＲ−３およびＰＲ−５タンパク質は、それぞれβ−１,３−グルカ ナーゼ、キチナーゼおよびタウマテイン様タンパク質である。特異的機能は、Ｐ Ｒ−１およびＰＲ−４群について選定されていない。ＰＲ−４タンパク質は、プ ロヘベインおよびジャガイモの推定傷誘発ＷＩＮタンパク質(putative wound-in duced WIN proteins)のＣ−末端ドメインと類似であり、従ってＮ−末端ヘベイ ンドメインを欠く。本発明のタンパク質を、１個またはそれ以上の、タンパク質 のＰＲ−４群のベーシックカウンターパート(basic counter part)であるタンパ ク質と組み合わせるのが特に好ましく、ベーシックカウンターパートは、プロヘ ベインおよびジャガイモの推定傷誘発ＷＩＮタンパク質のＣ−末端ドメインと類 似であることを意味する。上記病原体関連タンパク質のベーシックカウンターパ ートがキチン結合性ＷＩＮタンパク質、特に大麦穀粒または負荷大麦葉により産 生されるものであるのが特に好ましい。 本発明は、更に上記抗微生物タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質を コードする配列を含む組換えＤＮＡタンパク質も含む。特に、ＤＮＡは、その配 列が配列番号１−３に記載のものである少なくとも一つのタンパク質をコードし 得、所望によりその配列が配列番号４から６に記載のものである少なくとも１つ のタンパク質を加えてもよい。組換えＤＮＡは、更に除草剤耐性、植物生育促進 、抗真菌、抗細菌、抗ウイルスおよび／または抗線虫類特性を有するタンパク質 をコードし得る。ＤＮＡを異種生物中に導入する場合、既知のmＲＮＡ不安定モ チーフ(たとえばＡＴリッチな領域のような)およびポリアデニル化信号(存在す る場合)を取り除き、および／または組み換えＤＮＡを挿入すべき生物に好適な コドンを使用し、このように修飾されたＤＮＡが上記生物内で、本発明の抗微生 物タンパク質が内在性である生物において非修飾組み換えＤＮＡの発現により与 えられるものと実質的に類似のタンパク質を産生するように修飾し得る。 本発明は更に、上記と“類似”の組換えＤＮＡもまた含む。“類似のＤＮＡ” は、本発明の組換え配列とハイブリダイズできる試験配列に相補的な配列を意味 する。試験および発明配列が二本鎖である場合は試験配列を構成する核酸は発明 配列のそれの２０℃以内のＴＭを有するのが好ましい。試験および発明配列が混 合され同時に変性される場合には、配列のＴＭ値は相互に１０℃以内であること が好ましい。ハイブリッド形成はより好ましくはよりストリンジェントな条件下 で、試験または発明ＤＮＡのいずれも好ましくは支持して行う。このように変性 試験または発明配列の何れも最初に支持体と結合し、ハイブリッド形成が５０な いし７０℃の温度で、２強度の０.１％ＳＤＳ含有クエン酸緩衝化生理食塩水(Ｓ ＳＣ)中で特定時間かけ、次いで同温度ではあるが、ＳＳＣ濃度を減らした緩衝 液で支持体を洗浄して行われる。必要なストリンジェント度(degree of stringe ncy)、すなわち配列の類似度に依存して、希釈濃度緩衝液は典型的には０.１％ ＳＤＳを含む１(single)強度ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを含む１／２強度ＳＳＣ、 および０.１％ＳＤＳを含む１／１０強度ＳＳＣである。最大類似度を持つ配列 はそのハイブリッド形成が希釈濃度緩衝液の洗浄によって最小の影響にとどめら れているものである。試験および発明配列が、非常に類似し、それらの間のハイ ブリッド形成が０.１％ＳＤＳを含む１／１０強度クエン酸ナトリウム緩衝液の 洗浄またはインキュベーションによって実質的に影響を受けないのがとくに好ま しい。 本発明は、更にまた、本発明の組換えＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ イブリダイズできるものに相補的なＤＮＡ配列を含む。 本発明にまた含まれるものは：植物内で発現可能であり、植物作動可能プロモ ーターおよびターミネーターに結合している上記ＤＮＡを含むベクター；このよ うなＤＮＡで形質転換された植物；安定に包含されたＤＮＡを含み、メンデルの 法則に従って遺伝できるこのような植物の子孫および／またはこのような植物お よびこのような子孫の種子である。形質転換植物は、既知の方法で製造され、種 々の既知の方法(アグロバクテリウムＴｉおよびＲｉプラスミド、エレクトロポ レーション、マイクロインジェクション、微小発射銃(mibro-projectile gun)等 )で本発明のＤＮＡで形質転換された植物細胞または原形質の再生を含む。形質 転換細胞は、好適な場合、核材料が安定にゲノムに含まれる完全植物へ再生し得 る。単子葉および双子葉植物の両方がこの方法で得られ得る。本発明の形質転換 植物の例は：トマト、マンゴー、桃、リンゴ、梨、イチゴ、バナナおよびメロン を含む果実；キャノーラ、ひまわり、タバコ、サトウダイコンを含む畑作物、小 麦、大麦および込めを含む小穀粒穀物、トウモロコシおよび綿、およびジャガイ モ、ニンジン、レタス、キャベツおよび玉葱のような野菜を含む。好ましい植物 はサトウダイコンおよびトウモロコシである。 本発明は、更に、上記ＤＮＡの発現に由来するタンパク質およびこれで形質転 換された植物内の組換えＤＮＡの発現により産生される抗微生物タンパク質を含 む。 本発明は、更に、本発明のタンパク質を１個またはそれ以上含む抗微生物組成 物；このようなタンパク質に曝すことを含む真菌を退治する方法、および材料− 好ましくは微生物の形−を温浸し溶媒抽出することを含む、有機材料から抗微生 物タンパク質を得る抽出方法を含む。抗微生物タンパク質は、もしあるとすれば 、小さい抗微生物作用を、前文で述べた有機材料の源である微生物に対して示す ことは認められるであろう。 本発明は、以下の記載および添付の図面および配列表から、更に明白になるで あろう。 図１は、細胞内洗浄液のＣＭ−セファロースカラムからの典型的な溶出プロフ ィールを示す； 図２は、図１の０.３Ｍ ＮａＣｌフラクションのモノＳ ＦＰＬＣカラムか らの典型的な溶出プロフィールを示す； 図３は、図２のピーク３で示されるタンパク質のＲＰ−ＨＰＬＣカラムからの 典型的な溶出プロフィールを示す； 図４は、図３のピーク３.１および３.２(それぞれ配列番号１および２)で示さ れるタンパク質の１０μgの抗真菌活性を示す； 図５は、図１に記載の０.１ＭフラクションのセファデックスＧ７５ゲル濾過 を示す； 図６は、図５に記載のピーク(プール)ＶのモノＳ ＦＰＬＣカラムからの典型 的な溶出プロフィールを示す； 図７は、図６のピーク１および２（配列番号３）で示されるタンパク質の１０ μgの抗真菌活性を示す。 図８Ａは、配列番号２および３で示されるタンパク質それぞれ２μgを組み合 わせた抗真菌活性を示す；図８Ｂは、配列番号２および５で示されるタンパク質 それぞれ２μgを組み合わせた抗真菌活性を示す。 図９Ａおよび９Ｂは、本発明の抗微生物タンパク質非存在下で成育したセルコ スポラ・ベティコラ(C.beticola)の菌糸の形態を示す。図９Ｃおよび９Ｄは、そ れぞれ配列番号２および３に示す配列を有するタンパク質２μgの存在下で４８ 時間成育させた場合の菌糸を示す。検定は、下記のようなマイクロタイタープレ ー ト中で行う；倍率 図９Ａ、７６×；図９Ｂから９Ｄ、２９４×。 配列番号１は、図３のピーク３.１で示されるタンパク質のアミノ酸配列を示 す；配列番号２は、図３のピーク３.２で示されるタンパク質のアミノ酸配列を 示す；配列番号３は、図６のピーク１および２で示されるタンパク質のアミノ酸 配列を示す；配列番号４−６は、３種の既知の抗真菌タンパク質のアミノ酸配列 を示す；配列番号７は、配列番号３に記載のタンパク質をコードするｃＤＮＡの ヌクレオチド配列を示す；および配列番号８は、配列番号７に記載のｃＤＮＡに よりコードされる転写物の翻訳産物を示し、その生産物は配列番号３に記載のタ ンパク質のＮおよびＣ末端伸張を含む。細胞内洗浄液の単離 ＩＷＦを、サトウダイコン葉５００−７００グラムから、それらを２０mＭＨ Ａｃ(ｐＨ４.５)に予備温浸することにより単離する。このように予備温浸した 葉を、次いでイクシケーター(exicator)に入れ、５分間、４トル(最大)で真空浸 透させる。葉表面の空気乾燥に続き、ＩＷＦを５００ml遠心管で５００ｇ、１５ 分の遠心により回収する。カチオン交換クロマトグラフィー このようにして得たＩＷＦを、出発緩衝液(２０mＭ ＨＡｃ(ｐＨ４.５))で前 平衡化した１０mlＣＭ−セファロースカラム(Pharmacia LKB)のカチオン交換ク ロマトグラフィーにより分画する。分画は、４℃で、流速２５ml／時間で行う。 ３mlのフラクションを回収する。カラムに結合しないタンパク質を大量の出発緩 衝液でのカラムの洗浄により除去する。結合タンパク質は、カラムに、段階的に 増加させた塩濃度：すなわち、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.３Ｍ ＮａＣｌおよび０ .５Ｍ ＮａＣｌを含む更なる出発緩衝液を適用することにより溶出する。溶出 液の２８０nmでの吸光度を測定し、タンパク質を含むと判定されたフラクション は、先に記載された(ＰＣＴ特許出願PCT/DK92/00108、公開WO92/17591、現在SAN DOZ LTD.に譲渡)マイクロタイタープレート生物検定を使用して、シー・ベティ コラに対する抗真菌活性を試験する。 典型的な溶出プロフィールを図１に示す。０.３Ｍ ＮａＣｌおよび０.１Ｍ ＮａＣｌを含む出発緩衝液のカラムへの適用により得られた溶出液は、下記のよ うに更に精製する。ＣＭ−セファロースの０.３Ｍ ＮａＣｌ溶出液中の抗真菌タンパク質の精製。 ＦＰＬＣクロマトグラフィー ０.３Ｍ ＮａＣｌタンパク質フラクションを、一晩２０mＭ ＨＡｃ(ｐＨ４. ５)に対して、４℃で透析する(ＭＷ分離：３kDa)ことにより脱塩する。このよう にして透析したタンパク質フラクションにベタインを５％(w/v)の濃度で加える 。得られる溶液の４mlを、次いで、５％(w/v)ベタイン含有２０mＭ ＨＡｃ(ｐ Ｈ４.５)(Ａ緩衝液)で平衡化したモノＳ ＨＲ５／５カラム(Pharmacia LKB)を 使用したカチオン交換急速タンパク質液体クロマトグラフィー(fast protein li quid chromatography)により分画する。結合タンパク質を、３０mlのＡ緩衝液中 の０から０.３Ｍ ＮａＣｌの直線塩勾配、続く同じ緩衝液中の１.０Ｍ ＮａＣ ｌの段階溶出により溶出する。流速は１ml／分である。 図２は、０.３Ｍ ＮａＣｌフラクションが多くのべつのタンパク質を含むこ とを示し、その中で最も量的に顕著なものをピーク１−５と呼ぶ。ファスト・シ ステム(Pharmacia LKB)、銀染色１０−１５％勾配ファスト・ゲルまたはハイ・ デンシティー・ゲル(Pharmacia LKB)を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した場 合、ピーク１−５それぞれが、２−５タンパク質バンドを含むことを明らかにす る。逆相ＨＰＬＣ モノＳカラムからのタンパク質ピーク３(図２に記載)を、ヴィダック(Vydac) Ｃ₄シリカカラム(The Separation Group，CA，USA)の逆相(ＲＰ)ＨＰＬＣにより 更に精製する。溶媒系はＡ：０.１ＴＦＡ水溶液およびＢ：０.１％ＴＦＡアセト ニトリル液である。タンパク質は、サンプルをかけた１８分後に適用した５から ４５％のＢ緩衝液直線勾配、続く２分の６０％Ｂ緩衝液で溶出する。流速は０. ７ml／分である。タンパク質は、溶出液の吸光度を２１４および２８０nmで追跡 することにより検出する。分離タンパク質ピークを回収し、凍結乾燥する。この ように凍結乾燥したタンパク質を２回水で洗浄し、再凍結乾燥し、続いて、純度 および抗真菌活性の分析の前に１０mＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)に溶解する。 図３は、図２のピーク３が、ＲＰカラムで４つのピーク(図３で３.１−３.４ と呼ぶ)に別れることを示す。ピーク３.１−３.４のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、それ ぞれが分子量約７kDa(ピーク３.１、３.２および３.３)および２.５−３kDa(３. ４)を有する純粋タンパク質からなることを明らかにする。ＣＭ−セファロースの０.１Ｍ ＮａＣｌ溶出液中の抗真菌タンパク質の精製 図１の０.１Ｍ ＮａＣｌ溶出液５mlを、５０mＭ ＭＥＳ(ｐＨ６.０)で平衡 化した３７０mlセファデックスＧ７５カラム(Pharmacia LKB)の流速２０ml／時 間でのゲル濾過により分画する。１０mlのフラクションを回収する。このような フラクションを、続いて、それぞれ約５０mlを含む６個の大フラクション、Ｉ− VIにプールする(図５)。カチオン交換（モノＳ） セファデックスＧ７５カラム由来のプールＶ(図５に示す)を、緩衝液Ａ：５％ ベタイン(w/v)含有５０mＭ ＭＥＳ(ｐＨ６.０)で平衡化したモノＳ ＦＰＬＣ カラムにかける。Ａ緩衝液で洗浄後、結合タンパク質を、流速１ml／分のＡ緩衝 液３０ml中の０から０.５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出する(図６)。ピーク１ および２により示されるタンパク質を、ＤＴＴ存在下ＳＤＳゲル電気泳動に付し た場合、２つの別のバンドが観察される。第１のバンドは２.５から３kDaの間の 分子量を有し、第１のバンドのタンパク質の非還元２量体を示す第２のバンドは 、約５kDaの分子量を有する。 抗真菌タンパク質の同定抗真菌活性 図４および７−９は、図３のピーク３.１および３.２(それぞれ配列番号１お よび２)ならびに図６のピーク１および２(配列番号３)により示されるタンパク 質が、とりわけ、シー・ベティコラに対して著しい抗真菌活性を有することを示 す。真菌成長の阻害は、本質的にWO92/17591に記載のように、９６ウェルマイク ロタイタープレート中で、６２０nmで測定した。図９は、このようなタンパク質 で処理したシー・ベティコラが、抗真菌タンパク質非存在下で成育させた真菌( 図 ９Ａおよび９Ｂ)と比較して、厚く、より枝別れした矮小菌糸を有することを示 す。 単独またはＷＩＮ Ｎ(ヘジャードら(FEBS Letters，307，389-392(1992))記 載のように大麦穀粒または負荷大麦葉から精製)および／または配列番号４−６ のいずれかに記載の少なくともひとつと対応する配列を有するタンパク質と組み 合わせて、シー・ベティコラの胞子とインキュベーションする。検定混合物(２ ４０μl)は、１００mＭトリスおよび２０mＭ ＮａＣｌ(ｐＨ８.０)中ジャガイ モ・デキストロース・ブロス(Difco)１００μl、タンパク質サンプル(または緩 衝液対照)４０μlおよび水１００μl中の約４００個の胞子を含む。マイクロタ イタープレートをテープで封印して蒸発および汚染を避け、続いて２００rpmの 撹拌機上で室温でインキュベーションする。６２０nmの吸光度を、毎日８日間測 定し、タンパク質の各濃度対時間でプロットする。アミノ酸配列 ＣＭ−セファロースカラムの０.３Ｍ ＮａＣｌ溶出液（図１）由来の図３の ピーク３.１および３.２(それぞれ配列番号１および２)に対応する精製抗真菌タ ンパク質；および上記ＣＭ−セファロースカラムの０.１Ｍ ＮａＣｌ溶出液由 来の図６のピーク１および２(配列番号３)に対応するタンパク質をカルボキシメ チル化し、ヴィダックＣ₄カラムのＲＰ−ＨＰＬＣに付する。溶媒系はＡ：０.１ ％ＴＦＡ水溶液およびＢ：０.１％ＴＦＡアセトニトリル溶液である。タンパク 質は、僅かに異なった保持時間を有する単一ピークとして溶出する。タンパク質 のＣ末端配列を、エンド−Ｒ−プロテイナーゼで開裂し、続いてヴィダックＣ₁₈ カラムのＲＰ−ＨＰＬＣで精製することにより得る。形質転換植物の製造 本発明のタンパク質をコードする遺伝子を植物に挿入する。遺伝子特異的プラ イマーを基本にして、タンパク質をコードする遺伝子のコード領域をＰＣＲを使 用して対応するｍＲＮＡから合成する。プロモーターおよびターミネーター配列 付加後、上記タンパク質コード遺伝子を植物形質転換ベクターに挿入する。ベク ターは、所望により、付加大麦葉または大麦穀物粒から得られるようなＷＩＮタ ンパク質をコードする遺伝子、および／または配列番号４、配列番号５および／ または配列番号６に記載のタンパク質をコードする遺伝子および／またはキチナ ーゼおよび／またはグルカナーゼをコードする遺伝子を含み得る。好ましいキチ ナーゼは、ＰＣＴ特許出願番号PCT/DK92/00108(公開WO92/17591)に記載のキチナ ーゼ４である。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、これらのベクターで形質転換できる。次いで、植物細胞をこ のような形質転換アグロバクテリウムで処置し、このように形質転換した植物細 胞を、新しい核材料がゲノム内に安定に含まれている、完全植物に再生する。し かしながら、本発明のタンパク質(またはこのようなタンパク質の組み合わせ)、 所望により更に別のタンパク質をコードするＤＮＡは、微小発射銃、エレクトロ ポレーション、電気形質転換およびマイクロインジェクション等を含む他の既知 の方法で植物細胞内に挿入し得、形質転換植物細胞の再生は、再生頻度を改善す るために必要または望ましい場合、細胞のサイトカインでの処置を含む当業者に 既知の方法で行うことは認識されよう。 更に、好適な微生物(即ち、本発明のタンパク質の産生が実質的に毒性でない もの)は、形質転換微生物が、このようなタンパク質を産生するように、タンパ ク質をコードする遺伝子(または遺伝子群)を含むベクターで形質転換し得る。微 生物は、ＷＩＮタンパク質および／または配列番号４−６に記載の１個またはそ れ以上のタンパク質のような他のタンパク質をコードする遺伝子を更に含み得る 。更に、このような他のタンパク質は種々のキチナーゼおよび／またはグルカナ ーゼを含み得る。特に好ましいこのような他のタンパク質は、ＰＣＴ特許出願番 号PCT/DK92/00108(公開WO92/17591)に記載のキチナーゼ４である。 微生物を、次いで、植物病原体を退治するのに使用し得る。例えば、形質転換 微生物を乾燥し、感染植物または感染の危険のある植物に噴霧し得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ニールセン、クラウス・クリスティアン デンマーク国デーコー―2400コペンハーゲ ン・エヌ・ヴェー、ネベゴーズバッケン９ 番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノ酸配列：ＡＡ₁−ＡＡ₂−ＡＡ₃−Ｃys−ＡＡ₅−ＡＡ₆−ＡＡ₇−ＡＡ₈ −ＡＡ₉−Ｃys−ＡＡ₁₁−ＡＡ₁₂−ＡＡ₁₃−ＡＡ₁₄−Ｃys−Ｃys−ＡＡ₁₇−ＡＡ₁₈ −ＡＡ₁₉−ＡＡ₂₀−ＡＡ₂₁−Ｃys−ＡＡ₂₃−ＡＡ₂₄−ＡＡ₂₅−ＡＡ₂₆−ＡＡ₂₇ −ＡＡ₂₈−Ｃys−ＡＡ₃₀を有するペプチドを含む、抗微生物タンパク質。 ２．ＡＡ₇がtyr；ＡＡ₁₄がtyr；およびＡＡ₁₈がlysである、請求項１記載の抗 微生物タンパク質。 ３．ＡＡ₂₄がval；ＡＡ₂₆がarg；およびＡＡ₂₇がalaである、請求項１または ２記載の抗微生物タンパク質。 ４．配列番号１−３のいずれかに記載の配列を有する、抗微生物タンパク質。 ５．請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質と少なくとも９０％相同な 純粋タンパク質。 ６．配列番号４−６に記載のものからなる群から選択された少なくともひとつ のタンパク質と組み合わせた、請求項１から５のいずれかに記載の純粋タンパク 質。 ７．除草剤耐性、植物生育促進、抗真菌、抗細菌、抗ウイルスおよび／または 抗線虫類特性を有するいずれかひとつのタンパク質と組み合わせた、請求項１か ら６のいずれかに記載の純粋タンパク質。 ８．請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質をコードする配列を含む組 換えＤＮＡ、または配列番号７に記載の配列を有する組換えＤＮＡ。 ９．配列番号４−６に記載のものからなる群から選択された少なくとも一つの タンパク質をコードする配列を更に含む、請求項８記載の組換えＤＮＡ。 １０．除草剤耐性、植物生育促進、抗真菌、抗細菌、抗ウイルスおよび／また は抗線虫類特性を有するタンパク質を更にコードする、請求項８または９記載の 組換えＤＮＡ。 １１．既知のｍＲＮＡ不安定モチーフまたはポリアデニル化信号を除き、およ び／または組み換えＤＮＡを挿入すべき生物に好適なコドンを使用し、修飾され たＤＮＡが上記生物内で発現して、タンパク質が内在性である生物において非修 飾組み換えＤＮＡの発現により得られるものと実質的に類似のタンパク質を産生 するように修飾された、請求項８から１０のいずれかに記載の組換えＤＮＡ。 １２．請求項８から１１のいずれかに記載のＤＮＡとストリンジェントな条件 下でハイブリダイズできるものに相補的なＤＮＡ配列。 １３．植物内で発現可能であり、植物作動可能プロモーターおよびターミネー ターに結合している、請求項８から１２のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクタ ー。 １４．請求項８から１２のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項１３に記載の ベクターを含む、生物系。 １５．請求項８から１２のいずれかに記載の組換えＤＮＡで形質転換された植 物、安定に包含されたＤＮＡを含み、メンデルの法則に従って遺伝できるこのよ うな植物の子孫および／またはこのような植物およびこのような子孫の種子。 １６．請求項８から１２のいずれかに記載のＤＮＡの発現に由来するタンパク 質および、請求項１５記載の植物または子孫またはそれらの種子内の組換えＤＮ Ａの発現により産生される抗微生物タンパク質。 １７．請求項１−７および１６のいずれかに記載のタンパク質を１個またはそ れ以上含む、抗微生物組成物。 １８．請求項１−７、１６および１７のいずれかに記載のタンパク質または組 成物に曝すことを含む、真菌を退治する方法。 １９．材料が微生物または植物であることを特徴とする、材料を温浸し溶媒抽 出することを含む、有機材料から請求項１−７および１６のいずれかに記載の抗 微生物タンパク質を得るための抽出方法。