JPH09507388A

JPH09507388A - 抗微生物性タンパク質

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Publication number: JPH09507388A
Application number: JP51784395A
Authority: JP
Inventors: ブレケルト，ヴィレム・フラン; カミュ，ブルーノ・フィリップ・アンゲロ; オズボーン，ルパート・ウィリアム; リーズ，サラ・ブロンウェン
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1993-12-24
Filing date: 1994-12-19
Publication date: 1997-07-29
Anticipated expiration: 2020-03-23
Also published as: ATE279519T1; US5919918A; EP0736096B1; AU1276395A; CN1080303C; CA2177854A1; BR9408415A; JP3631492B2; DK0736096T3; WO1995018229A1; DE69434071T2; DE69434071D1; AU696550B2; US5750504A; GB9326424D0; CN1139454A; ES2225835T3; EP0736096A1

Abstract

(57)【要約】ＨｅｕｃｈｅｒａまたはＡｅｓｃｕｌｕｓの種子から単離しうる抗微生物性タンパク質は広範な抗真菌活性およびグラム陽性細菌に対する若干の活性を示す。これらのタンパク質をコードするＤＮＡを単離し、ベクターに取り込ませることができる。このＤＮＡで形質転換された植物を形成することができる。これらのタンパク質を抗真菌薬または抗菌薬として商業的に利用することができ；形質転換された植物は病害に対する抵抗性の増大を示すであろう。

Description

【発明の詳細な説明】抗微生物性タンパク質本発明は、抗微生物性タンパク質、それらの製造および使用方法、ならびにそれらをコードするＤＮＡ配列に関するものである。特に本発明は、ＨｅｕｃｈｅｒａまたはＡｅｓｃｕｌｕｓの種子から単離しうる抗微生物性タンパク質に関するものである。これに関して抗微生物性タンパク質は、以下の活性のうち少なくとも１つを備えたタンパク質であると定義される：抗真菌（antifungal）活性（抗酵母活性を含む）、抗菌（antibacterial）活性。活性には、広範な拮抗作用、たとえば部分的阻害または死が含まれる。それらのタンパク質はオリゴマーであってもよく、または単一ペプチドサブユニットであってもよい。Ｈｅｕｃｈｅｒａ属はユキノシタ科（Ｓａｘｉｆｒａｇａｃｅａｅ）植物の一部である。ユキノシタ科は主として多年生の草本および潅木を含む大きな広範な科であり、アカスグリ（ｃｕｒｒａｎｔｓ）およびスグリ（ｇｏｏｓｅｂｅｒｒｉｅｓ）ならびに多くの一般的な庭園の花がこれに含まれる。Ａｅｓｃｕｌｕｓ属はトチノキ科（Ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎａｃｅａｅ）植物の一部である。トチノキ科は２属を含む樹木の小さな科である。Ａｅｓｃｕｌｕｓ属はその観賞用樹木、特にその褐色の種子が子供たちの好む“トチの実”であるセイヨウトチノキ（Ａｅｓｃｕｌｕｓｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）によって最も良く知られている。植物は予想される侵入体と戦うために広範な一連の抗真菌性化合物を産生しており、ここ１０年にわたって、抗真菌活性をもつタンパク質がこれらの防御の重要な部分を構成することが明らかになった。チオニン類、β−１，３−グルカナーゼ類、リボソーム不活性化タンパク質、ゼーマチン類、キチン結合性レクチン類、およびキチナーゼ類を含めた幾つかの群のこのようなタンパク質が記載されている。これらのタンパク質は生物制御物質として利用しうる可能性があるので、かなりの関心がもたれている。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１５７０号明細書（１９９３年３月１８日に公開番号ＷＯ９３／０５１５３号として公開、その記載内容を参考として本明細書に引用する）には、抗真菌性タンパク質（ＡＦＰ）および抗微生物性タンパク質（ＡＭＰ）を含むタンパク質群が記載されている。この群には以下のタンパク質が含まれる：ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓｓａｔｉｖｕｓ）から単離しうるＲｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２（ＴｅｒｒａｓＦＲＧら，１９９２，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２６７：１５３０１−１３３０９）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）から単離しうるＢｎ−ＡＦＰ１およびＢｎ−ＡＦＰ２、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ）から単離しうるＢｒ−ＡＦＰ１およびＢｒ−ＡＦＰ２、Ｓｉｎａｐｓｉｓａｌｂａから単離しうるＳａ−ＡＦＰ１およびSａ−ＡＦＰ２、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）から単離しうるＡｔ−ＡＦＰ１、Ｄａｈｌｉａｍｅｒｃｋｉｉから単離しうるＤｍ−ＡＭＰ１およびＤｍ−ＡＭＰ２、Ｃｎｉｃｕｓｂｅｎｅｄｉｃｔｕｓから単離しうるＣｂ−ＡＭＰ１およびＣｂ−ＡＭＰ２、Ｌａｔｈｙｒｕｓｃｉｃｅｒａから単離しうるＬｃ−ＡＦＰ、Ｃｌｉｔｏｒｉａｔｅｒｎａｔｅａから単離しうるＣｔ−ＡＭＰ１およびＣｔ−ＡＭＰ２。このタンパク質群を以下において“Ｒｓ−ＡＦＰ−タイプタンパク質”とよぶ。これら、および他の、植物由来の抗微生物性タンパク質は、特に農業目的用の殺真菌薬または抗生物質として有用である。これらのタンパク質を植物もしくはその周囲に適用するか、または植物内において発現させることができる。本発明者らは今回２種類の新規かつ有効な抗微生物性タンパク質を精製した。本発明者らはＨｅｕｃｈｅｒａｓａｎｇｕｉｎｅａの種子から新規な抗微生物性タンパク質を精製した。以下、これをＨｓ−ＡＦＰ１（Ｈｅｕｃｈｅｒａｓａｎｇｕｉｎｅａ −抗真菌性タンパク質１）とよぶ。Ｈｓ−ＡＦＰ１は５ｋＤａのポリペプチドであり；それらのポリペプチドは二量体として結合する場合がある。Ｈｓ−ＡＦＰ１は広範な抗真菌活性を示す。本発明者らは、セイヨウトチノキ（Ａｅｓｃｕｌｕｓｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）の種子から新規な抗微生物性タンパク質を精製した。以下、これをＡｈ −ＡＭＰ１（Ａｅｓｃｕｌｕｓｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ−抗微生物性タンパク質１）とよぶ。Ｈｓ−ＡＦＰ１と同様にＡｈ−ＡＭＰ１も５ｋＤａのポリペプチドである。Ａｈ−ＡＭＰ１は広範な抗真菌活性を示す。本発明によれば、配列番号：１もしくは配列番号：２に示すアミノ酸配列をもつ抗微生物性タンパク質、または配列番号：１もしくは配列番号：２に示すアミノ酸配列と実質的に相同（好ましくは少なくとも６０％の配列同一性をもつ）であって、そのタンパク質が抗微生物活性をもつものが提供される。本発明による抗微生物性タンパク質はＨｅｕｃｈｅｒａもしくはＡｅｓｃｕｌｕｓの種子から単離することができ、関連種もしくは非関連種両方の種子から単離することもでき、またはいずれか適切な方法で製造もしくは合成することができる。本発明の抗微生物性タンパク質は植物材料から抽出および精製するか、その既知のアミノ酸配列から標準的なペプチド合成装置を用いる化学合成により製造するか、または適切な生物（たとえば微生物または植物）内で組換えＤＮＡの発現により産生させることができる。本発明の抗微生物性タンパク質は殺真菌薬または抗生物質として有用であり、農業用または薬剤用として用いられる。Ｈｓ−ＡＦＰ１およびＡｈ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列決定によれば、それらはＲｓ−ＡＦＰタイプのタンパク質と相同である（国際特許出願公開ＷＯ９３／０５１５３号明細書）ことが示される。Ｈｓ−ＡＦＰ１のアミノ酸配列を配列番号：１として示す；Ａｈ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列を配列番号：２として示す。図５はＨｓ−ＡＦＰ１（配列番号：１）およびＡｈ−ＡＭＰ１（配列番号：２）と、Ｒｓ−ＡＦＰタイプ抗真菌性／抗微生物性タンパク質であるＲｓ−ＡＦＰ１（配列番号：３）、Ｒｓ−ＡＦＰ２（配列番号：４）、Ｄｍ−ＡＭＰ１（配列番号：５）、Ｃｂ−ＡＭＰ１（配列番号：６）、Ｃｔ−ＡＭＰ１（配列番号：７）、Ｌｃ−ＡＦＰ（配列番号：８）（国際特許出願公開ＷＯ９３／０５１５３号明細書に記載）との配列並列（alignment）を示す。Ｓｏｒｇｈｕｍからのタンパク質Ｓｉα２（配列番号：９）およびＴｒｉｔｉｃｕｍからのｇ１−Ｐ（配列番号：１０）、ならびにｐＳＡＳ１０（Ｖｉｇｎａ）（配列番号：１１）、ｐＩ２３０（Ｐｉｓｕｍ）（配列番号：１２）およびｐ３２２（Ｓｏｌａｎｕｍ）（配列番号：１３）の推定遺伝子産物の配列の一部をも示す（後に議論する）。点線は最適な並列を得るために配列に挿入された。Ｒｓ−ＡＦＰタンパク質は共通の構造モチーフをもち、これがＨｓ−ＡＦＰ１およびＡｈ−ＡＭＰ１の配列中にも見られる。Ｈｓ−ＡＦＰ１およびＡｈ−ＡＭＰ１とＲｓ−ＡＦＰ１タイプのタンパク質との配列並列により、それらが図５に示すコンセンサス−システイン−グリシン−モチーフを共有することが示される。図５から、保存されたシステインとグリシン間のアミノ酸残基の数は示した異なる配列および部分配列においてわずかに異なることが明らかである：最適並列を得るために配列に点線を導入した。Ｈｓ−ＡＦＰ１の配列に対比して残基に番号を付けると、８個すべてのシステイン残基は残基番号６、１７、２３、２７、３９、４８、５０および５４の保存位置をもち、位置番号１５および３７に２個の保存グリシンがある。さらに保存芳香族残基が位置１３に、保存グルタミン酸残基が位置３１にある。Ｈｓ−ＡＦＰ１配列はＲｓ−ＡＦＰ１と４８％の配列同一性を示す。Ａｈ−ＡＭＰ１配列はＲｓ−ＡＦＰ１と５４％の配列同一性を示す。Ｈｓ−ＡＦＰ１はアミノ酸配列水準でＡｈ−ＡＭＰ１と５２％の配列同一性を示す。Ｈｅｕｃｈｅｒａタンパク質（Ｈｓ−ＡＦＰ１）、Ａｅｓｃｕｌｕｓタンパク質（Ａｈ−ＡＭＰ１）およびＲｓ−ＡＦＰタイプタンパク質間には類似性があるにもかかわらず、全体的なアミノ酸の含量および配列において相異がある。Ｈｓ−ＡＦＰ１の抗真菌活性は、特定の種の真菌菌糸を著しく分枝させる（高次分枝、ｈｙｐｅｒ−ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）。この形態学的作用はＲｓ−ＡＦＰ１またはＲｓ−ＡＦＰ２により生じるものと類似する。タンパク質Ａｈ−ＡＭＰ１は真菌増殖を阻害するが、菌糸の高次分枝は生じない。この活性はタンパク質Ｄｍ−ＡＭＰ１、Ｃｂ−ＡＭＰ１、Ｃｔ−ＡＭＰ１、およびＬｃ−ＡＦＰの活性の方により類似する。Ｈｓ−ＡＦＰ１、Ａｈ−ＡＭＰ１およびＲｓ−ＡＦＰタイプのタンパク質は、ＣｈｉａｎｇおよびＨａｄｗｉｇｅｒ（１９９１，ＭｏｌＰｌａｎｔＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔ，４：３２４−３３１）が記載する、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ−マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）の一員）のＦｕｓａｒｉｕｍ誘導遺伝子ｐＩ３９およびｐＩ２３０の推定タンパク質産物と部分的に相同である。この相同性は、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら（１９９０，ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，１５：５９−６４）が記載するササゲ（Ｖｉｇｎａｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ −他のマメ科）由来のｐＳＡＳ１０遺伝子の推定タンパク質産物とも共有される。これらのタンパク質はＳｔｉｅｋｅｍａら（１９８８，ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，１１：２５５−２６９）が記載するバレイショ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ−ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）の一員）の遺伝子ｐ３２２の推定タンパク質産物とも部分的に相同である。最近、アミノ末端アミノ酸配列がｐ３２２によりコードされる成熟タンパク質のものとほとんど同一であるタンパク質がバレイショ塊茎から精製され、抗微生物活性をもつことが示された（Ｍｏｒｅｎｏら，１９９４，ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，２３３：１３５−１３９）。ｃＤＮＡが研究されたにすぎないので、遺伝子ｐＩ３９、ｐＩ２３０、ｐＳＡＳ１０またはｐ３２２によりコードされるタンパク質の生物学的特性については、全く知られていない。しかしｐＩ３９とｐＩ２３０遺伝子は、病害その他のストレスによる植物への攻撃の後にスイッチがオンになる。ｐＳＡＳ１０遺伝子は発芽に関与するタンパク質をコードすることが提唱されている。Ｈｓ−ＡＦＰ１、Ａｈ−ＡＭＰ１およびＲｓ−ＡＦＰタイプのタンパク質配列はイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）の下記メンバーに見られる一群の小型のα−アミラーゼ阻害物質の配列とは、より低度の部分的相同性を示す：モロコシ（ＢｌｏｃｈおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９９１，ＦＥＢＳＬｅｔｔ，２７９：１０１−１０４）、コムギ（Ｃｏｌｉｔｔａら，１９９０，ＦＥＢＳＬｅｔｔ，２７０：１９１−１９４）、およびオオムギ（Ｍｅｎｄｅｚら，１９９０，ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，１９４：５３３−５３９）。モロコシ由来のＳｉα ２およびコムギ由来のｇ−１−ピューロチオニン（ｇ−１Ｐ）を含めて、これらのタンパク質は昆虫α−アミラーゼを阻害することが知られており、また昆虫幼生に対しても有毒である可能性があるが、ただしこれは示されていない。これらのα−アミラーゼの阻害物質が抗真菌活性または他の抗微生物活性を示すか否かは知られていない：それらの生物学的活性については他のデータは報告されていない。抗微生物性タンパク質またはその一部の一次構造を知ることにより、標準的なペプチド合成装置を用いてそれを化学合成により製造することが可能となる。これにより、その抗微生物性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を製造することも可能である。本発明はさらに、本発明による抗微生物性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供する。ＤＮＡ配列はｃＤＮＡ配列またはゲノム配列であってもよく、またｃＤＮＡクローン、ゲノムＤＮＡクローン、または標準的な核酸合成装置を用いて製造されたＤＮＡに由来するものであってもよい。ＤＮＡ配列は既知のアミノ酸配列から推定することができ、そのタンパク質をコードするＤＮＡは標準的な核酸合成装置を用いて製造することができる。あるいはＤＮＡ配列は植物由来のＤＮＡライブラリーから単離することができる。適切なオリゴヌクレオチドプローブを既知のアミノ酸配列から誘導し、そのタンパク質の一部または全部をコードするｃＤＮＡクローンにつきｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。これらの同じオリゴヌクレオチドプローブまたはｃＤＮＡクローンを用いて、ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって実際の抗微生物性タンパク質遺伝子（単数または複数）を単離することができる。それらのゲノムクローンは、植物ゲノムにおいて作動する調節配列を含みうる。たとえば抗微生物性（その他の）タンパク質の発現を駆動するために用いうるプロモーター配列を単離することも可能である。これらのプロモーターは環境条件（たとえば真菌性病原体の存在）に対して特に応答性であり、任意の標的遺伝子の発現を駆動するために使用しうる。抗微生物性タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を適切な調節配列（プロモーター、ターミネーターなど）と組み合わせて、ＤＮＡ構築物またはベクター中へ取り込ませることができる。ＤＮＡを構成性または誘導性のプロモーター（たとえば環境条件、病原体の存在、化学物質の存在により刺激される）の制御下に置くことができる。このようなＤＮＡ構築物を、コードされたタンパク質またはそのタンパク質の活性部分の発現を可能にする生物系内へクローン化または形質転換することができる。適切な生物系には微生物（たとえば細菌、たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、および内部寄生性生物（ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ）、たとえばクラビバクター・キシリ亜種サイノドンチス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｓｕｂｓｐ．ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）（Ｃｘｃ）；酵母；ウイルス；バクテリオファージ；など）、培養細胞（たとえば昆虫細胞、哺乳動物細胞）、ならびに植物が含まれる。場合によっては、発現したタンパク質を使用するために、次いで抽出し、単離することができる。本発明による抗微生物性タンパク質（たとえばＨｓ−ＡＦＰ１またはＡｈ−ＡＭＰ１）は殺真菌薬または抗生物質として有用である。本発明はさらに、本発明による抗微生物性タンパク質に暴露することにより真菌または細菌を攻撃する方法を提供する。薬剤としての用途に関しては、本発明の抗微生物性タンパク質を哺乳動物感染症の治療のための（たとえばカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）などの酵母を攻撃するための）殺真菌薬または抗菌薬として使用しうる。本発明による抗微生物性タンパク質は、防腐薬として（たとえば食品添加物として）も使用しうる。農業用としては、本発明の抗微生物性タンパク質を、植物生育中の作物の病害抵抗性もしくは病害耐性を改良するために、または収穫後の作物の保護のために使用しうる。タンパク質に暴露された病原体は阻害される。本発明の抗微生物性タンパク質は植物において既に確立している病原体を根絶することができ、または将来の病原体の攻撃から植物を保護することができる。タンパク質の根絶作用は特に有利である。抗微生物性タンパク質への植物病原体の暴露は、以下のような種々の方法で行うことができる：例えば、（ａ）単離されたタンパク質を含む組成物を標準的な農業手法（たとえば噴霧）により植物の部分または周囲の土壌に付与することができる；タンパク質は植物組織から抽出したり、または化学的に合成したり、またはそのタンパク質を発現するように遺伝的に修飾された微生物から抽出することができる；（ｂ）抗微生物性タンパク質を発現するように遺伝的に修飾された微生物を含む組成物を植物に、または植物が生育している土壌に付与することができる；（ｃ）抗微生物性タンパク質を発現するように遺伝的に修飾された内部寄生性生物を植物組織に導入することができる（たとえば種子処理法により）；［内部寄生性生物とは、植物宿主との非病原性内部共生関係に入ることができる微生物であると定義される。内部寄生性生物による増強された植物保護の方法はクロップ・ジェネティックス・インターナショナル・コーポレーションにより一連の特許出願明細書に記載されている（たとえば国際特許出願公開ＷＯ９０／１３２２４号、欧州特許公告ＥＰ−１２５４６８−Ｂ１号、国際特許出願公開ＷＯ９１／１０３６３号、国際特許出願公開ＷＯ８７／０３３０３号）。農業用化学物質を産生するように内部寄生性生物を遺伝的に修飾することができる。国際特許出願公開ＷＯ９４／１６０７６号明細書（ゼネカ・リミテッド）には、植物由来の抗微生物性タンパク質を発現するように遺伝的に修飾された内部寄生性生物の使用が記載されている。］（ｄ）抗微生物性タンパク質をコードするＤＮＡを植物ゲノムに導入し、これにより植物体内でそのタンパク質を発現させることができる（ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または標準的な核酸合成装置により製造されたＤＮＡのいずれであってもよい）。植物細胞を既知の種々の方法（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔｉプラスミド、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルガンなど）に従って組換えＤＮＡ構築体により形質転換することができる。次いで適切な場合、形質転換細胞を新たな核物質がゲノム内へ安定に取り込まれた全植物体に再生することができる。形質転換した単子葉植物および双子葉植物の両方をこの方法で得ることができるが、通常は後者の方が再生しやすい。これらの一次形質転換体の子孫のうちあるものは抗微生物性タンパク質（単数または複数）をコードする組換えＤＮＡを受け継ぐであろう。本発明はさらに、本発明による抗微生物性タンパク質を発現する組換えＤＮＡを含む、真菌性または細菌性病原体に対する改良された抵抗性を有する植物を提供する。それらの植物を標準的な植物育種交配における親として用いて、改良された真菌または細菌抵抗性を備えた雑種または系統を開発することができる。組換えＤＮＡは、植物またはその祖先に形質転換により導入された異種ＤＮＡである。組換えＤＮＡは病原体攻撃部位（たとえば葉）へ付与するために発現される抗微生物性タンパク質をコードする。このＤＮＡは抗微生物性タンパク質の活性サブユニットをコードするものであってもよい。病原体は植物上、植物内またはその付近で増殖しているいかなる真菌または細菌であってもよい。これに関して改良された抵抗性は、野生型植物と比較して真菌性または細菌性病原体に対して増強された耐性であると定義される。抵抗性は、病原体の作用に対する耐性のわずかな増大（この場合は病原体が部分的に阻害される）から、植物が病原体の存在により影響されないほどの全体的な抵抗性（この場合は病原体は著しく阻害されるか、または死滅する）にまで及ぶものであってもよい。特定の病原体に対する抵抗性またはより広域スペクトルの病原体に対する抵抗性双方の水準の増大が抵抗性改良を構成しうる。改良された抵抗性を示すトランスジェニック植物（またはそれに由来する植物）は、植物形質転換法またはその後の交配により選択される。抗微生物性タンパク質がトランスジェニック植物またはその子孫において発現すると、真菌または細菌は植物に病原体が攻撃した部位においてそのタンパク質に暴露される。特に、適宜な遺伝子調節配列の採用により、タンパク質をインビボで、最も効果的な時点および部位において産生させることができる。たとえばタンパク質を、それが普通は多量に発現されない植物部分であるが、病害抵抗性が重要である部位（たとえば葉）内で産生させることができる。形成しうる遺伝的に修飾された植物の例には、栽培作物、穀物、果実および野菜、たとえばカノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、ワタ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、バレイショ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギが含まれる。例示にすぎないが、本発明を以下に図面を参照して説明する：図１は、Ｈｓ−ＡＦＰ１の精製に関するカチオン交換クロマトグラムおよびそれに付随する真菌増殖阻害のグラフを示す；図２は、精製Ｈｓ−ＡＦＰ１の逆相クロマトグラムを示す；図３は、Ａｈ−ＡＭＰ１の精製に関するカチオン交換クロマトグラムおよびそれに付随する真菌増殖阻害のグラフを示す；図４は、精製Ａｈ−ＡＭＰ１の逆相クロマトグラムを示す；図５は、Ｈｓ−ＡＦＰ１、Ａｈ−ＡＭＰ１その他のタンパク質のアミノ酸配列並列を示す；また配列表を参照する：配列番号：１はＨｓ−ＡＦＰ１のアミノ酸配列である；配列番号：２はＡｈ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列である；配列番号：３はＲｓ−ＡＦＰ１のアミノ酸配列である；配列番号：４はＲｓ−ＡＦＰ２のアミノ酸配列である；配列番号：５はＤｍ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列である；配列番号：６はＣｂ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列である；配列番号：７はＣｔ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列である；配列番号：８はＬｃ−ＡＦＰのアミノ酸配列である；配列番号：９はＳｉα２のアミノ酸配列の一部である；配列番号：１０はｇ１−Ｐのアミノ酸配列の一部である；配列番号：１１はｐＳＡＳ１０遺伝子産物の推定アミノ酸配列の一部である；配列番号：１２はｐＩ２３０遺伝子産物の推定アミノ酸配列の一部である；配列番号：１３はｐ３２２遺伝子産物の推定アミノ酸配列の一部である。実施例１抗真菌活性および抗菌活性のアッセイ抗真菌活性は、先に記載された顕微分光測光法により測定された（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ，１９９０，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，６９：５５− ６０）。通常通り、２０μｌの（フィルター滅菌した）被験溶液、および８０μ ｌの真菌胞子の半濃度バレイショーデキストロースブロス（１／２ＰＤＢ）中の懸濁液（２×１０⁴胞子／ｍｌ）を用いて試験を実施した。合成増殖培地（ＳＭＦ）は以下のものからなっていた：Ｋ₂ＨＰＯ₄（２．５ｍＭ）、ＭｇＳＯ₄（５０μＭ）、ＣａＣｌ₂（５０μＭ）、ＦｅＳＯ₄（５μＭ）、ＣｏＣｌ₂（０．１μＭ）、ＣｕＳＯ₄（０．１μＭ）、Ｎａ₂ＭｏＯ₄（２μＭ）、Ｈ₃ＢＯ₃（０．５μＭ）、ＫＩ（０．１μＭ）、ＺｎＳＯ₄（０．５μＭ）、ＭｎＳＯ₄（０．１μＭ）、グルコース（１０ｇ／ｌ）、アスパラギン（１ｇ／ｌ）、メチオニン（２０ｍｇ／ｌ）、ミオイノシトール（２ｍｇ／ｌ）、ビオチン（０．２ｍｇ／ｌ）、チアミン−ＨＣｌ（１ｍｇ／ｌ）、およびピリドキシン−ＨＣｌ（０．２ｍｇ／ｌ）。対照ミクロ培養物は２０μｌの無菌蒸留水および８０μｌの真菌胞子懸濁液を含有していた。別途指示しない限り被験生物はフザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ）（株ＩＭＩ１８０４２０）であり、インキュベーションを２５℃で４８時間行った。増殖阻止率％は、５９５ｎｍにおける対照ミクロ培養物の補正済み吸収値に対する、対照ミクロ培養物の補正済み吸収値マイナス被験ミクロ培養物の補正済み吸収値の比の、１００倍として定義される。補正済み吸収値は、４８時間後に測定した５９５ｎｍにおける培養物の吸収値マイナス３０分後に測定した５９５ｎｍにおける吸収値である。抗微生物活性は以下の記載に従って顕微分光測光法により測定された。軟栄養アガロース（トリプトン，１０ｇ／ｌ；シープラーク（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ）アガロース（ＦＭＣ），５ｇ／ｌ）に接種することにより細菌懸濁液を調製した。アリコート（８０μｌ）の細菌懸濁液（１０⁵コロニー形成単位／ｍｌ）を平底９６ウェルミクロプレート中でフィルター滅菌試料（２０μｌ）に添加した。５９５ｎｍにおける培養物の吸収値を、ミクロプレート読み取り装置により、２８ ℃で３０分および２４時間のインキュベーション後に測定した。抗真菌活性アッセイにつき先に記載したものに従って増殖阻止率を計算した。実施例２Ｈｅｕｃｈｅｒａｓａｎｇｕｉｎｅａ種子からの抗真菌性タンパク質の精製２０ｇのＨｓａｎｇｕｉｎｅａ種子（Ｏｋｋｅｒｓｅ，ベルギー、Ｍｅｃｈｅｌｅｎから入手）をコーヒーミルで粉砕し、得られた粉を４℃で２時間、１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄，１５ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄，１００ｍＭのＫＣｌ，２ｍＭのＥＤＴＡ，２ｍＭのチオ尿素および１ｍＭのＰＭＳＦを含有する氷冷した抽出用緩衝液１００ｍｌで抽出した。ホモジネートをガーゼで絞り、遠心分離（７，０００×ｇで３０分）により清澄化した。分画分子量２，０００Ｄａのベンゾイル化セルロースチューブ（シグマ）を用いて、上清を蒸留水に対して十分に透析した。透析後に溶液を１０倍濃度の緩衝液の添加により５０ｍＭ（ＮＨ₄）Ａｃ（ｐＨ９）に調整し、次いで５０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ９）で平衡化したＱ− セファロース・ファスト・フロー（Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ）（スウェーデン、ウプサラ、ファルマシア）カラム（１２×５ｃｍ）に導通した。カラムを通過したタンパク質画分を凍結乾燥し、最後に５０ｍｌの２０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ（酢酸アンモニウム）ｐＨ６、に再溶解した。この画分を、予め２０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ緩衝液で平衡化したＳ−セファロース高性能（ファルマシア）カラム（１０×１．６ｃｍ）に付与した。カラムを１ｍｌ／分で１２０ｍｌの２０から５００ｍＭのＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ６）直線濃度勾配により溶離した。溶出液を２８０ｎｍにおける吸収のオンライン測定によりタンパク質につき監視し（結果を図１の下側パネルに示す）、７．５ｍｌの画分で採取した。画分を凍結乾燥し、蒸留水に再溶解した。これらの画分のうち５μｌを、実施例１に記載した顕微分光測光−抗真菌活性アッセイ法によって、１ｍＭのＣａＣｌ₂および５０ｍＭのＫＣｌを補充した合成増殖培地を用いて試験した（結果を図１の上側パネルにヒストグラムとして示す）。すべての抗真菌活性が、約３００ｍＭのＮＨ₄Ａｃで溶離した主ピーク（図１に矢印で示す）に含まれていた。最高の抗真菌活性を示す画分をさらに逆相クロマトグラフィーにより精製した。この画分を、０．１％ＴＦＡを含有する１０％アセトニトリルで平衡化したＰｅｐ−Ｓ（多孔質シリカＣ₂／Ｃ₁₈、ファルマシア）カラム（２５×０．９３ｃｍ）に装填した。カラムを４ｍｌ／分で２００ｍｌの１０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から９５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡまでの直線濃度勾配により溶離した。溶出液を２８０ｎｍにおける吸収のオンライン測定によりタンパク質につき監視した。２ｍｌ画分の溶出液を採取し、真空乾燥し、最後に０．５ｍｌの蒸留水に溶解し、そのうち１０μｌを、実施例１に記載した１ｍＭのＣａＣｌ₂および５０ｍＭのＫＣｌを補充した合成増殖培地を用いる顕微分光測光−抗真菌活性アッセイに使用した。図２は、カチオン交換クロマトグラフィーにより精製した活性画分の逆相クロマトグラムを示す。下側パネルは溶出液を２８０ｎｍにおける吸収の測定によりタンパク質につき監視したものを示す。上側パネルは顕微分光測光アッセイにより試験した抗真菌活性を示す。このクロマトグラムは３ピークを示し、それらのうち２５％アセトニトリルで溶出する第１のものがすべての抗真菌活性を含む。このピーク（図２に矢印で指示する）から単離した活性因子をＨｓ−ＡＦＰ１（Ｈｅｕｃｈｅｒａｓａｎｇｕｉｎｅａ−抗真菌性タンパク質１）とよぶ。実施例３Ａｅｓｃｕｌｕｓｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ種子からの抗真菌性タンパク質の精製セイヨウトチノキ（Ａｅｓｃｕｌｕｓｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）の種子をセイヨウトチノキの樹木から採取した。種子の皮をむき、皮をむいた種子１００ｇを凍結乾燥した。凍結乾燥した種子をコーヒーミルで粉砕し、得られた粉を氷冷した抽出用緩衝液（実施例１参照）１００ｍｌで抽出した。ホモジネートをガーゼで絞り、遠心分離（７，０００×ｇで３０分）により清澄化した。ベンゾイル化セルロースチューブ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を用いて、上清を蒸留水に対して十分に透析した。透析後に溶液を１０倍濃度の緩衝液の添加により５０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ９）に調整し、５０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ９）で平衡化したＱ−セファロース・ファスト・フロー（スウェーデン、ウプサラ、ファルマシア）カラム（１２×５ｃｍ）に導通した。カラムを通過したタンパク質画分を凍結乾燥し、最後に５０ｍｌの２０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ６）に再溶解した。この画分を、５０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ、ｐＨ６．０、で平衡化したＳ−セファロース高性能（ファルマシア）カラム（１０×１．６ｃｍ）に付与した。カラムを１ｍｌ／分で２０から５００ｍＭのＮＨ₄Ａｃ、ｐＨ６、直線濃度勾配により２１０分間にわたって溶離した。溶出液を２８０ｎｍにおける吸収のオンライン測定によりタンパク質につき監視し（結果を図３の下側パネルに示す）、７．５ｍｌの画分で採取した。それぞれの画分からの試料を凍結乾燥し、７．５ｍｌの蒸留水に再溶解した。これらの画分のうち５μｌを、顕微分光測光−抗真菌活性アッセイ法により、１ｍＭのＣａＣｌ₂および５０ｍＭのＫＣｌを補充した合成増殖培地を用いて試験した（結果を図３の上側パネルに示す）。クロマトグラフィーにより、抗真菌活性は約３００ｍＭのＮＨ₄Ａｃで溶離した主ピーク（図３に矢印で示す）と共に溶出した。最高の抗真菌活性を示す画分をさらに逆相クロマトグラフィーにより精製した。この画分を、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で平衡化したＰＥＰ−Ｓ（多孔質シリカＣ₂／Ｃ₁₈、ファルマシア）カラム（２５×０．４ｃｍ）に装填した。カラムを１ｍｌ／分で０．１％ＴＦＡから５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡまでの直線濃度勾配により５０分間にわたって展開した。溶出液を２８０ｎｍにおける吸収のオンライン測定によりタンパク質につき監視した（結果を図４の下側パネルに示す）。１ｍｌ画分を採取し、真空乾燥し、０．５ｍｌの蒸留水に溶解した。それぞれの画分からの５μｌを抗真菌活性につきアッセイした（結果を図４の上側パネルに示す）。この物質は２５％アセトニトリルで溶出する単一の活性ピークを与えた。これは精製タンパク質Ａｈ−ＡＭＰ１（Ａｅｓｃｕｌｕｓｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ−抗真菌性タンパク質１）を表す。実施例４精製した真菌性タンパク質Ｈｓ−ＡＦＰ１およびＡｈ−ＡＭＰ１の分子構造精製した抗真菌性タンパク質の分子構造をさらにドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは市販のプレキャストゲル（ファルマシアからのファストゲル・ハイデンシティー（ＰｈａｓｔＧｅｌＨｉｇｈＤｅｎｓｉｔｙ））上でファストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ）（ファルマシア）電気泳動装置を用いて実施された。試料緩衝液は２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のブロモフェノールブルー、および別途指示しない限り１％（ｗ／ｖ）のジチオエリトリトール（ＤＴＥ）を含有していた。２００ｎｇのタンパク質をゲル上で分離した。以下の大きさのミオグロビンフラグメントを分子量マーカーとして用いた（ファルマシア）：１７ｋＤａ、１４．５ｋＤａ、８ｋＤａ、６ｋＤａ、および２．５ｋＤａ。１２．５％グルタルアルデヒド中での電気泳動後にタンパク質を固定し、銀染色した：ＨｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎおよびＤｅｒｎｉｃｋ（１９８５，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，６，１０３−１１２）に従う。システイン残基をＤＴＥで還元したのち、Ｈｓ−ＡＦＰ１は見掛け分子質量約５ｋＤａの単一バンドを示す。非還元Ｈｓ−ＡＦＰ１は約１０ｋＤａの単一バンドとして泳動する。これらの結果は、天然Ｈｓ−ＡＦＰ１がオリゴマータンパク質である可能性があり、５ｋＤａのポリペプチドの二量体からなる可能性が極めて高いことを示す。オリゴマー構造はジスルフィド結合によって安定化されると思われる。実施例５抗真菌性および抗菌性効力精製タンパク質の抗真菌効力を、実施例１に記載したアッセイ法により、種々の植物病原体につき評価した。真菌の増殖、真菌胞子の採集および収穫、ならびに菌糸フラグメントの調製は先の記載に従って行われた（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔら，１９９０，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，６９：５５−６０）。抗真菌性タンパク質の系列希釈液を、増殖培地ＳＭＦ−（実施例１の合成増殖培地）、培地ＳＭＦ＋（１ｍＭのＣａＣｌ₂および５０ｍＭのＫＣｌを補充した培地ＳＭＦ−）、増殖培地１／２ＰＤＢ−（実施例１に記載した半濃度バレイショ−デキストロースブロス）、または増殖培地１／２ＰＤＢ＋（１ｍＭのＣａＣｌ₂および５０ｍＭのＫＣｌを補充した培地１／２ＰＤＢ−）を用いて真菌に適用した。増殖阻止率％を顕微分光測光法により測定した。４８時間のインキュベーション後に５０％の増殖阻止を得るために必要な濃度（ＩＣ₅₀値）を用量応答曲線から計算した。Ｈｓ−ＡＦＰ１およびＡｈ−ＡＭＰ１に関する結果を表１に示す。用いた略号は以下のとおりである：ＩＣ₅₀＝実施例１の記載に従って測定した、５０％の増殖阻止を得るために必要な濃度；ＮＤ＝測定しなかった；Ｓｐ＝胞子；ＰｒＳｐ＝培地中で予め２４時間発芽させた胞子；ＭＦ＝タンパク質の添加前に培地中で４８時間プレインキュベートした菌糸フラグメント；ＢＨＲ＝広い宿主範囲；ＳＦ＝腐生真菌；ＳＭＦ−＝実施例１に記載した合成増殖培地；ＳＭＦ＋＝１ｍＭのＣａＣｌ₂および５０ｍＭのＫＣｌを補充した培地ＳＭＦ−；１／２ＰＤＢ −＝実施例１に記載した半濃度バレイショ−デキストロースブロス；１／２ＰＤＢ＋＝１ｍＭのＣａＣｌ₂および５０ｍＭのＫＣｌを補充した培地１／２ＰＤＢ−。表１の結果は、Ａｈ−ＡＭＰ１およびＨｓ−ＡＦＰ１タンパク質が保有する広範な抗真菌活性を表す。表１の結果は、Ｈｓ−ＡＦＰ１とＡｈ−ＡＭＰ１が若干異なる活性スペクトルをもつことも示す。たとえばＡｈ−ＡＭＰ１は１／２ＰＤＢ＋中でレプトスペリア・マキュランス（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａｍａｃｕｌａｎｓ）に対して活性が高いが、Ｈｓ−ＡＦＰ１はそうでなく、一方Ｈｓ− ＡＦＰ１は１／２ＰＤＢ＋中でフザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ）に対して活性が高いが、Ａｈ−ＡＭＰ１はそうでない。したがってこれら２タンパク質は互いに補足するために組み合わせ抗微生物薬として使用することができ、これによってより広範な病害をより効果的に撲滅することができる。培地ＳＭＦ＋および１／２ＰＤＢ＋（植物組織中における生理学的条件のイオン濃度を反映するために塩類添加物を含有する）においては、両タンパク質の活性とも培地ＳＭＦ−および１／２ＰＤＢ−におけるそれらの活性と比較して低下する。塩類依存性の活性の低下は、明らかに被験生物により左右される。たとえばＡｈ−ＡＭＰ１に関して、培地ＳＭＦ＋に対比した培地ＳＭＦ−における活性低下はアルテルナリア・ブラシカ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｂｒａｓｓｉｃａｅ）については２倍、グレオスポリウム・ムザラム（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍｍｕｓａｒｕｍ）については１０倍以上である。Ｈｓ−ＡＦＰ１およびＡｈ−ＡＭＰ１は両方とも、菌糸の長さの低下により示されるように真菌の増殖過程を阻害する。Ｈｓ−ＡＦＰ１はフザリウム・カルモラムの菌糸の高次分枝をも生じる。同様な作用がダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓｓａｔｉｖｕｓ）種子由来の抗真菌性タンパク質Ｒｓ−ＡＦＰ１およびＲｓ−ＡＦＰ２によっても生じる（ＴｅｒｒａｓＦＲＧら，１９９２，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２６７：１５３０１−１５３０９）。Ａｈ−ＡＭＰ１はフザリウム・カルモラムの菌糸の高次分枝を生じない；それの菌糸成長阻害様式は、それぞれＤａｈｌｉａ、Ｃｎｉｃｕｓ、ＣｌｉｔｏｒｅａおよびＬａｔｈｙｒｕｓ由来の抗真菌性タンパク質Ｄｍ−ＡＭＰ１、Ｃｂ−ＡＭＰ１、Ｃｔ−ＡＭＰ１、およびＬｃ−ＡＦＰのものに極めて類似する（国際特許出願公開ＷＯ９３／０５１５３号明細書）。Ａｈ−ＡＭＰ１およびＨｓ−ＡＦＰ１の抗菌活性を、４種類のグラム陽性細菌（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＨＣＣ５５３３３１；マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ９３４１１；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２５９２３；大便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆｅａｃｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ２９２１２）、および２種類のグラム陰性細菌（大腸菌ＨＢ１０１および尋常変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）ＪＨＣＣ５５８７１１）につき測定した。Ｈｓ−ＡＦＰ１はこれらの被験細菌の増殖を２００μｇ／ｍｌの割合で阻害しなかったが、Ａｈ−ＡＭＰ１は枯草菌の増殖を１００μｇ／ｍｌで阻害した。実施例８ α−アミラーゼの阻害ゴキブリ（Ｂｌａｔｔａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）成体の切断した腸から、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＣａＣｌ₂中でホモジナイズし、細胞屑を遠心分離により除去することによって、粗製α−アミラーゼ抽出物を調製した。ヒトおよびブタのα−アミラーゼはシグマから購入された。コムギ由来のタイプ１−α−アミラーゼ阻害物質（シグマから購入）を陽性対照として用いた。アミラーゼ抽出物をペプチドと共に３０℃で２０分間インキュベートしたのち、デンプンを添加し、酵素活性をＢｅｒｎｆｅｌｄ法（１９５５，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ，ＣｏｌｗｉｃｋおよびＫａｐｌａｎ編，ｖｏｌ１：１４９−１５８）により検出した。Ｈｓ−ＡＦＰ１およびＡｈ−ＡＭＰ１のα−アミラーゼ阻害活性を、これら３種類の供給源から得たα−アミラーゼにつき、昆虫の腸α−アミラーゼを阻害することが以前に報告されたモロコシ（Ｓｏｒｇｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）相同体ＳＩα３（ＢｌｏｃｈおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９９１，ＦＥＢＳＬｅｔｔ，２７９：１０１−１０４）のものと比較した。ＳＩα３は昆虫の腸およびヒトの唾液由来の酵素の活性を５μｇ／ｍｌ程度の低い割合で７０％以上阻害した。コムギ由来のタイプ１−α−アミラーゼ阻害物質の市販製品１０Ｕ／ｍｌを用いて、匹敵する阻害が得られた。ＳＩα３は、ＢｌｏｃｈおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９９１）が先に報告したようにブタ膵臓由来の酵素に対しては本質的に不活性であった。これに対し、前記３種類の酵素に関して試験したＨｓ−ＡＦＰ１またはＡｈ− ＡＭＰ１については、２００μｇ／ｍｌという高い割合で含有された場合ですら、α−アミラーゼ活性阻害は観察されなかった。実施例７Ｈｓ−ＡＦＰ１およびＡｈ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列決定抗真菌性タンパク質のシステイン残基をＦｕｌｌｍｅｒ法（１９８４，ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，１４２，３３６−３４１）でＳ−ピリジルエチル化することにより修飾した。試薬をＰｅｐ−Ｓ（多孔質シリカＣ₂／Ｃ₁₈、ファルマシア）カラム（２５×０．４ｃｍ）上でのＨＰＬＣにより除去した。カラムを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリルまでの直線濃度勾配で溶離することにより、Ｓ−ピリジルエチル化タンパク質が回収された。得られたタンパク質画分を、１２０Ａアナライザー（アプライド・バイオシステムズ）によるフェニルチオヒダントインアミノ酸のオンライン検出を用いて、４７７Ａプロテイン・シーケンス（４７７ＡＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅ）（アプライド・バイオシステムズ）によりアミノ酸配列分析した。Ｈｓ−ＡＦＰ１およびＡｈ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列をＮ−末端自動エドマン分解により決定した。Ｈｓ−ＡＦＰ１に関する完全アミノ酸配列を配列番号：１として、Ａｈ−ＡＭＰ１に関する完全アミノ酸配列を配列番号：２として提示する。Ｈｓ−ＡＦＰ１は長さ５４のアミノ酸であり、Ａｈ−ＡＭＰ１は長さ５０のアミノ酸である。両タンパク質とも８個のシステインを含有し、塩基性アミノ酸残基が比較的豊富である。Ｈｓ−ＡＦＰ１は位置４１にチロシン残基、位置４３にフェニルアラニン残基、および位置４４にプロリン残基を含む。Ｒｓ−ＡＦＰ１とＲｓ−ＡＦＰ２の対応する位置に同一アミノ酸が見られる（Ｙが位置３８、Ｆが位置４０、Ｐが位置４１に）が、Ａｈ−ＡＭＰ１および他のＲｓ−ＡＦＰタイプタンパク質においては非相同アミノ酸残基で置換されている。コムギ種子由来の関連タンパク質の三次元折りたたみの研究（Ｂｒｕｉｘら，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７１５−７２４）は、これらの保存アミノ酸が２つの逆平行β−シートを連結するタンパク質ループ上に位置することを示した。このループは真菌菌糸上の推定受容体との相互作用に関与する活性部位の一部である可能性がある。Ｒｓ−ＡＦＰ１、Ｒｓ−ＡＦＰ２およびＨｓ−ＡＦＰ１がすべて真菌の高次分枝を生じるのに対し、Ａｈ−ＡＭＰ１、Ｄｍ−ＡＭＰ１、Ｄｍ−ＡＭＰ２、Ｃｂ −ＡＭＰ１、およびＣｂ−ＡＭＰ２は生じないことは注目すべきである。これは各群のタンパク質が真菌内の異なる標的と、または同一標的と異なる様式で相互作用する可能性があることを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１２月１８日【補正内容】請求の範囲の全文を以下のとおり差し替える。請求の範囲１．配列番号：１に示したアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性をもつアミノ酸配列を有する抗微生物性タンパク質。２．配列番号：２に示したアミノ酸配列を有する抗微生物性タンパク質。３．請求項１または２に記載する少なくとも２種類の抗微生物性タンパク質を含む抗微生物剤。４．請求項１に記載のタンパク質および請求項２に記載のタンパク質を含む、請求項３に記載の抗微生物剤。５．請求項１または２に記載の抗微生物性タンパク質をコードするＤＮＡ。６．請求項５に記載のＤＮＡを含有する生物学的系。７．微生物である、請求項６に記載の生物学的系。８．植物である、請求項６に記載の生物学的系。９．請求項１または２に記載の抗微生物性タンパク質を発現する組換えＤＮＡを含有する、真菌性または細菌性病原体に対する改良された抵抗性を有する植物。１０．真菌または細菌を請求項１または２に記載の抗微生物性タンバク質に暴露することを含む、真菌または細菌の攻撃方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 9282−4ＢＣ１２Ｎ 1/21 // Ｃ１２Ｐ 21/02 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オズボーン，ルパート・ウィリアムイギリス国ミドルセックスティーダブリュー２６エスダブリュー，トゥイッケンハム，ウォーリック・ロード 36 (72)発明者リーズ，サラ・ブロンウェンイギリス国バークシャーアールジー12 ３エックスエックス，ブラックネル，フォレスト・パーク，マイケルデヴァー・ウェイ 32

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１および配列番号：２よりなる群から選ばれる配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を有する抗微生物性タンパク質。２．配列番号：１に示したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗微生物性タンパク質。３．配列番号：２に示したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗微生物性タンパク質。４．請求項１に記載する少なくとも２種類の抗微生物性タンパク質を含む抗微生物剤。５．請求項２に記載のタンパク質および請求項３に記載のタンパク質を含む、請求項４に記載の抗微生物剤。６．請求項１に記載の抗微生物性タンパク質をコードするＤＮＡ。７．請求項６に記載のＤＮＡを含有する生物学的系。８．微生物である、請求項７に記載の生物学的系。９．植物である、請求項７に記載の生物学的系。１０．請求項１に記載の抗微生物性タンパク質を発現する組換えＤＮＡを含有する、真菌性または細菌性病原体に対する改良された抵抗性を有する植物。１１．真菌または細菌を請求項１に記載の抗微生物性タンパク質に暴露することを含む、真菌または細菌の攻撃方法。