KR100538975B1 - 고추 유래의 리보뉴클레아제 활성을 갖는 병원관련 단백질 10 - Google Patents

고추 유래의 리보뉴클레아제 활성을 갖는 병원관련 단백질 10 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 병원균에 감염된 고추에서 식물방어메카니즘에 관련된 단백질인 PR-10을 코딩하는 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 분석하고 상기 유전자를 이 콜라이에서 발현시켜 재조합 단백질을 얻고 상기 재조합 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 조사하여 항바이러스제 및 항진균제로서의 용도를 제공하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 담배 모자이크 바이러스에 감염된 고추에서 발현되는 병원관련단백질 10을 코딩하는 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명 고추 유래의 병원관련단백질 10은 리보뉴클레아제 활성을 갖고 있는 항바이러스 단백질이며 항진균 활성도 가지고 있어 항바이러스제 및 항진균제로서 뛰어난 효과가 있다.

Description

고추 유래의 리보뉴클레아제 활성을 갖는 병원관련단백질 10{Pathogenesis-related protein 10 isolated from hot pepper functioning as a ribonuclease}
본 발명은 리보뉴클레아제 활성을 갖는 고추 유래의 PR-10 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 병원균에 감염된 고추에서 식물방어메카니즘에 관련된 단백질인 PR-10을 코딩하는 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 분석하고 상기 유전자를 이 콜라이에서 발현시켜 재조합 단백질을 얻고 상기 재조합 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 조사하여 항바이러스제 및 항진균제로서의 용도를 제공하는 것에 관한 것이다.
병원균에 감염된 식물은 다수의 유전자 발현이 증가함으로써 병원균의 감염에 반응하며, 발현된 유전자 중에는 질병에 대한 저항과 관련되는 것도 있다. 이들 유전자들 중에는 병원관련단백질(PR-protein)과 항생제 단백질을 코딩하는 것들이 포함되어 있다. PR 단백질이란 병원성 조건에서 혹은 관련 조건 하에서 유도되는 식물 단백질을 말하며, 활성식물방어의 구성성분으로서 보다 빠르게 발현되며 내성 식물이 독성이 없는 병원균에 의해 도전 받는 불화합성 반응에서 보다 큰 정도로 발현된다.
비록, 많은 PR 단백질의 생물학적 및/혹은 생화학적 기능이 수십년 간 연구되었지만, 키틴분해효소와 β-1,3-글루카네아제와 같은 단지 소수의 PR 단백질의 촉매적 활성만이 명확하게 밝혀져 있고, 식물방어반응에 관여하는 다른 PR 단백질의 역할에 대해서는 규명되어 있지 않다. PR 단백질은 현재 14군으로 분류되며, PR-10 군에 있어서 항미생물 활성을 포함한 생물학적 특징들에 대해서는 보고되어 있지 않다.
바이러스 병원균에 대한 식물방어반응을 보다 잘 이해하기 위해, 본 발명자는 차등 스크리닝을 통하여 고추(Capsicum annuum cv. Bugang)와 TMV-P0간의 불화합성 반응동안 특이하게 발현되는 몇몇 cDNA를 분리하였다. 상기 cDNA에는 병원관련단백질(PR-4, PR-6, PR-14), SAR8.2 단백질 및 많은 다른 방어관련예상단백질을 코딩하는 다수의 cDNA가 포함되어 있었다. 이 중 본 발명은 리보뉴클레아제와 구조적 상동성을 갖는 세포내 방어관련단백질에 속하는 병원관련단백질 10(PR-10)을 조사하였다.
대부분의 PR 단백질이 세포밖에 있는 것과는 달리, 세포에 내재하는 PR 단백질은 유도인자를 처리한 파아슬리 배양세포에서 처음으로 밝혀졌다. 이들 세포내재 단백질들은 PR-1 단백질과 유사한 분자량과 산성 특징을 갖지만, 담배의 PR-1 단백질과는 구조적으로 연관이 없었다. 파아슬리의 "PR1"은 세포내에 편재하는 방어관련단백질인 PR-10 군의 "유형구성원"으로 알려져 있었다. PR-10 단백질은 샐러리의 알레르겐 및 수목의 화분 알레르겐과 유사한 아미노산 서열을 가지고 있다.
한편, PR-10 단백질은 인이 결핍된 인삼세포에서 분리한 리보뉴클레아제와 상동관계임이 밝혀져 있어 PR-10 단백질 역시 그러한 활성을 가질 것임을 추측할 수 있다. 또한, 리보뉴클레아제 활성은 자작나무의 화분 알레르겐인 Bet v1에서도 입증되었는데 PR-10 단백질과 상동성을 갖는 것으로 알려져 있다. 최근에, 루피너스 알부스(Lupinus albus) 유래의 PR-10 유사단백질이 리보뉴클레아제 활성을 나타낸다는 보고가 있었다.
PR-10 단백질은 리보뉴클레아제와는 다른 활성을 가질 수 있다. Warner 등은(1994) 아스파라거스의 AoPR1 유전자가 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 생합성 장소 근처에서 발현됨을 지적하였다. 또한, Balsamo 등의 연구에서는 백합 꽃밥의 융단조직에서 동정된 PR-10 단백질이 스포로폴레닌(sporopollenin) 경로에서 어떠한 역할을 담당할 것임을 추측케 하였다.
상기와 같이 PR-10 단백질의 효소활성에 관한 결과들이 보고되긴 했지만, 단백질의 생물학적 활성들에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 병원균에 감염된 고추잎에서 병원관련단백질 10을 분리하고 상기 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 조사하여 항바이러스제로서의 용도를 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 담배 모자이크 바이러스의 병원형(TMV-P0 혹은 TMV-P1.2)을 고추잎에 감염시킨 후 감염된 고추잎에서 병원관련단백질 10을 코딩하는 고추의 cDNA(CaPR-10)를 라이브러리의 차등 스크리닝을 통해 분리하고 상기 CaPR-10을 이 콜라이(E. coli)에서 발현시켜 재조합 단백질 산물로 정제한 후 상기 단백질의 리보뉴클레아제 활성과 항진균 및 항바이러스 활성을 조사함으로써 달성하였다.
이하, 발명의 구체적인 구성을 상세히 설명을 한다.
본 발명은 담배 모자이크 바이러스의 병원형(TMV-P0 혹은 TMV-P1.2)을 고추잎에 감염시키는 단계; 감염된 고추잎에서 병원관련단백질 10을 코딩하는 고추의 cDNA(CaPR-10)를 차등 스크리닝을 통해 분리하는 단계; 상기 CaPR-10을 이 콜라이에서 발현시켜 재조합 단백질 산물로 정제하는 단계; 상기 단백질의 리보뉴클레아제 활성과 항진균 및 항바이러스 활성을 조사하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1 : 담배 모자이크 바이러스의 병원균에 감염된 고추잎의 제조
본 발명의 고추 유래의 병원관련단백질 10을 분리하기 위해, 담배 모자이크 바이러스 P0 병원성 타입에는 내성이 있지만 P1,2 병원성 타입에는 민감한 고추(Capsicum annuum L.)의 부강품종(cultivar Bugang)을 사용하였다. 상기 고추를 25℃의 배양실이나 온실에서 16 h/8 h의 명암 광주기 사이클 하에서 재배하였다. 병원균 처리와 핵산 추출을 위해 두 달동안 키운 고추에서 건강하고 폭이 넓은 잎을 사용하였다. TMV-P0 및 TMV-P1.2가 감염된 담배잎(N. tabacum cv. Burley 21)을 CaCl2를 포함한 페트리 디쉬에 보관 후, 상기 감염된 담배잎에 5 mM EDTA (pH 7.4)를 포함한 0.25 M의 인산염 완충액을 넣고 마쇄하여 TMV-P0 혹은 TMV-P1.2를 포함하는 잎의 수액을 제조하였다. 병원 균주를 고추에 감염시키기 위해, 상기에서 얻은 바이러스를 포함한 수액을 4 또는 5개의 넓게 편 고추잎의 표면에 바르고 카보런덤(일본 하야시 케미칼사 제품)을 이용하여 문질러 주었다. 무처리 식물체들은 인산염 완충액과 카보런덤만을 가지고 문질러 주었다. 전신 반응을 관찰하기 위해, 아래쪽에 있는 잎 2개에 TMV-P0 수액을 처리한 후, 위쪽 잎을 0, 3, 6, 9, 15일째에 수확하였다.
비교예 1: 다른 병원균에 감염된 고추잎의 제조
식물에서 TMV-P0-유도성 CaPR-10 유전자가 다른 병원균에 대한 방어와 관련되는지를 조사하기 위해, 고추잎에 병원균인 크산토모나스 캠페스트리스 페쏘바 베지카노리아(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria(Xcv))를 감염시켰다. 크산토모나스 캠페스트리스 페쏘바 베지카노리아(Xcv; avrBs2)를 침투시키기 위해 2개의 고추 재배종, 어얼리 칼원더(Early Calwonder, ECW; bs1/bs1, bs2/bs2, bs3 /bs3) 및 어얼리 칼원더-20R(Early Calwonder-20R,ECW-20R; bs1/bs1, Bs2/Bs2, bs3 /bs3)를 사용하였다. Xcv를 효모 추출물, 덱스트로오스 및 칼슘 카보네이트를 포함하는 배지에서 배양하였다. 그리고, 세포 현탁액(1×108 cells/mL)을 고추잎에 침투시켰다.
저항성 재배종의 잎에 Xcv 이 침투한 경우, 감염후 24시간 이내에 잎은 짙은 자주색을 띠었으며 나중에는 괴사되었다. 대조적으로, 민감한 재배종 잎은 심각한 손상을 입고 침투후 48시간 후에는 백화현상을 나타내었다.
실시예 2 : 병원균에 감염된 고추잎에서 TMV-유도성 방어 유전자의 분리
고추에서 TMV-유도성 방어 유전자를 동정하기 위해, 상기 실시예 1에서 TMV-P0 감염 후 23시간 혹은 48시간 때에 과민성 반응을 나타내는 고추잎에서 RNA를 분리하고 분리한 poly(A)+ RNA로부터 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 상기 라이브러리를 TMV-P0가 감염된 poly(A)+ RNA 나 혹은 무처리 고추잎(mock-inoculated)에서 분리한 poly(A)+ RNA에서 합성된 단일가닥 cDNA 프로브를 사용하여 차등적으로 스크리닝하였다. 리버스 노던 슬랏-블랏 분석(Reverse northern slot-blot analysis)을 실시하고, 라이브러리에서 무작위로 선택된 생체내 절단성 파지미드(phagemid) DNA를 이중으로 나일론 멤브레인으로 옮기고, 각 프로브로 하이브리드(hybrid)를 제조하였다.
도 1a에 나타난 바와 같이, 많은 TMV-유도성 클론에 대한 시퀀스 분석을 통하여, 상기 클론들 중 하나가 식물성 PR-10 유전자와 상동함을 밝히고, 이 클론을 "CaPR-10" 이라 명명하였으며, 상기 클론은 159개의 아미노산을 갖는 단백질을 코딩하는 797 bp의 삽입체를 포함하고 있다. 상기 단백질의 예상분자량은 17.3 kDa이며, 등전점(isoelectric point)은 5.2 였다.
또한, 다른 식물의 PR-10과 CaPR-10의 아미노산 서열을 비교하였다. 비교 식물로써, 서양개암나무(Corylus avellana, GenBank Accession No. Z72440.1, Cor A1), 메디카고 트런카툴라(Medicago truncatula, GenBank Accession No. Y08641.1, PR10_medi), 루피너스 알부스(Lupinus albus, GenBank Accession No. AJ000108.1, PR10_lupi), 감자(GenBank Accession No. P17642, STH-2)의 아미노산 서열을 비교하였다. 상기 배열에서 빈 공간은 대쉬로 나타내었으며, 상기 배열은 Lasergene Megalign program(DNASTAR, USA)를 사용하여 비교하였다.
도 1b에 나타난 바와 같이, 고추잎 유래의 CaPR-10의 염기서열은 다양한 식물의 PR-10과 높은 정도의 상동성을 나타냈다. CaPR-10과 감자의 STH-2의 아미노산 서열과는 58.7%의 상동성을 가지는 반면, 서양개암나무와 루피너스 알부스 PR-10의 주 알레르겐인 Cor A1과는 약 42%의 상동성을 나타냈다. STH-2를 제외한 PR-10 단백질과 전반에 걸쳐 46-51개의 아미노산 잔기에는 GXG(아미노산 위치: 45-47)로 축소되는 GXGGXG 라는 두드러진 보존 서열 모티프가 있다. 상기 모티프는 다운스트림 쪽 19개의 아미노산뿐만 아니라 업스트림 쪽 13개의 아미노산의 보존된 라이신 잔기에 의해 측면에 위치하게 된다. 상기 모티프는 P-루프(인이 결합된 루프)로 알려져 있으며, 뉴클레오티드 결합단백질뿐만 아니라 단백질 키나아제에서 변이체로 발견되곤 한다. 따라서, 인결합 부위는 리보뉴클레아제 활성과 관련된 RNA의 인 그룹 결합 장소일 것이다.
CaPR-10의 생물학적 활성에 중요한 잔기를 동정하기 위해, CaPR-10 ORF를 사용하여 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화 사이트에 대한 NetPhos WWW 서버에 의한 예측법(NetPhos WWW server-produced predictions)을 실시하였다. 결과적으로, 몇몇 인산화 추정 사이트가 예견되었으며 도 1(a)에서 굵은 이탤릭체( S , T )로 표시하였다.
실시예 3 : CaPR-10 발현 경로의 측정
병원균 TMV-P0 감염동안 CaPR-10 전사체가 과민성 반응의 특이 경로에서 유도되는지를 알아보기 위해, 상기 실시예 1에 따라 TMV-P0 혹은 TMV-P1.2를 처리한 후 0, 12, 24, 36, 48, 60 시간째에 감염된 고추잎에서 총 RNA를 분리하고 노던 블랏 분석을 실시하였다. 대조군으로써 잎에 증류수를 처리하였다.
상기 노던 블랏은 Ausubel et al. (1999)의 방법에 따라 실시하였다. 병원균에 감염된 고추잎에서 총 RNA를 분리하고, 15 ㎍의 총 RNA를 MOPS 완충액(pH 7.0)에 녹인 6% 포름알데히드를 포함하는 1.0% 아가로오스 젤에서 전기영동을 실시하여 나이트란 플러스 멤브레인(nytran plus membrane)에 옮겼다. RNA의 분석은 3 ~ 4 차례 반복 실시하였으며, 각 시료를 제조하기 위해 화학물질을 처리한 군 당 2개의 식물체를 수확하였다. 32P로 표지된 CaPR-10 cDNA의 3'UTR를 프로브로 사용하여 공지되어 있는 방법들에 따라 노던 블랏 하이브리디제이션을 실시하였다. 상기 하이브리디제이션 후, 멤브레인은 실온에서 10분 동안 2×SSC 용액에서 두 번, 실온에서 0.1%의 SDS를 포함한 0.1×SSC 용액에서 10분 동안, 65℃에서 5분 동안 수세하였다. 상기 멤브레인을 건조시켜 X선 필름에 노출시키거나 BAS-2500 포스포이미저(phosphorimager, 일본 후지포토필름사 제품)에서 육안으로 확인하였다. 재 탐침이 필요할 경우, 필터를 0.1×SSC, 0.2% SDS로 80℃ 에서 20분간 벗겼다. 상기 실험은 4번 반복 실시한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 방사선 사진으로 판독한 결과 대략 0.8 kb 크기의 RNA 하이브리드 단편을 볼 수 있었다. 또한, EtBr로 염색한 젤에서 rRNA 밴드는 로딩 컨트롤(loading control)이며 CaPR-1(GenBank Accession No. AF053343) 유전자를 양성대조군으로 사용하였다. CaPR-10의 전사체는 TMV-P1.2로 감염된 후 내내 거의 검출되지 않았으나, TMV-P0로 감염된 후 48시간에 풍부하게 축적되기 시작하였다. 이들 결과는 PR-10 유전자 중 하나인 CaPR-10이 TMV 감염에 대한 과민성 반응을 나타내는 식물에서 특이하게 발현될 것이라는 사실을 뒷받침한다.
TMV-P0 감염에 대한 양성 대조군으로써, 고추에서 분리한 다른 PR 유전자인 CaPR-1 유전자의 발현 패턴을 체크한 결과, CaPR-1 유전자의 강한 유도는 감염 후 48시간부터 시작되었다.
CaPR-10 유전자가 전체조직에서 유도되는지를 조사하기 위해, TMV-P0를 고추잎에 감염시킨 후 0, 3, 6, 9, 15일째에 상단의 미처리 고추잎에서 총 RNA를 추출하였다. 상기 실험은 3번 반복 실시하였으며 매번 유사한 결과를 얻었다.
도 2b에 나타난 바와 같이, CaPR-10의 전사체는 감염 후 3일째에 멀리 떨어져 있는 잎에서 축적되기 시작하였고, 6일째에 최고로 발현되었다. 전반적인 유도에 대한 대조군으로써 CaPR-1을 다시 측정하였다.
비교예 1 : Xcv 감염에 의한 CaPR-10의 발현의 비교
식물에서 TMV-P0-유도성 CaPR-10 유전자가 다른 병원균에 대한 방어에도 관련되는지를 조사하기 위해, 상기 실시예 1의 비교예 1에 따라 일정시간대에서 크산토모나스 캠페스트리스 페쏘바 베지카노리아에 의해 감염된 고추잎의 총 RNA를 추출하여 노던 블랏을 실시하였다. 특이 프로브로써 CaPR-10 cDNA의 3' UTR 를 사용하였다.
민감한 고추품종인 어얼리 칼원더(pepper cv. Early Calwonder (ECW))는 bs2 유전자를 포함하고 있는 반면, 매우 가까운 동질유전자계열인 어얼리 칼원더-20R(ECW-20R)는 avrBs2 무독성 유전자를 발현하는 Xcv 균주에 대해 저항성이 있는 우성형질인 Bs2을 가지고 있다.
도 2c에 나타난 바와 같이, 고추의 CaPR-10의 전사체는 저항성 잎(ECW-20R)에서 우선적으로 축적되었다. 이는 세균 감염 시 과민성 반응 동안 특히 유도됨을 지적하는 것이다. CaPR-10의 전사체는 감염 후 4시간째에 축적되기 시작하여 36시간까지 증가하였다. 유사한 유전자 발현 패턴은 CaPR-1 유전자에서도 발견된다. 대조적으로, 민감한 재배종(ECW)의 잎에서, CaPR-10 전사체의 축적은 Xcv 감염 후 측정시간 내내 거의 측정되지 않았다.
비교예 2 : 다양한 자극에 의해 유도되는 CaPR-10의 발현 패턴
CaPR-10 이 다른 자극에 의해 유도되는지를 시험하기 위해, 고추잎에 살리실산, 자스몬산 및 에틸렌 등의 다양한 유도인자를 처리하여 일정시간동안 RNA를 분리하여 CaPR-10의 발현 패턴을 조사하였다. 총 RNA을 블랏팅할 경우 특이 프로브로써 32P로 표지된 CaPR-10의 3'UTR을 사용하였다. 또한, EtBr로 염색한 젤에서 rRNA 밴드를 로딩 컨트롤로 사용하였다. CaPR-1, CaPR-4 (GenBank Accession No. AF244122), CaAPX1 (GenBank Accession No. AY078080), 혹은 AtP5CS (GenBank Accession No. D32138) 유전자를 양성 대조군으로 사용하였으며, 각 실험은 최소한 3번 실시하였다.
비교실험예 1 : 살리실산 처리에 의한 CaPR-10 발현
살리실산(Salicylic acid, SA)은 병원균의 공격에 대한 방어 반응을 활성화하는 신호전달단계(signal transduction cascades)의 중요한 요인으로 알려져 있으므로, 두달된 고추잎에 5 mM 살리실산 용액을 분사하여 CaPR-10의 발현을 조사하였다. 대조군으로, 증류수를 분사한 고추잎을 사용하였다.
도 3a에 나타난 바와 같이, 5 mM SA를 분사한 고추잎에서, CaPR-10 전사체의 발현은 SA 처리후 6시간 이내에 유도되었으며, 그 후 18 내지 24시간동안 감소하였다. SA 처리에 대한 양성 대조군으로서 쓴 CaPR-1의 발현 패턴은 CaPR-10 발현 패턴과 유사하였다.
비교실험예 2 : 자스몬산 처리에 의한 CaPR-10 발현
자스몬산(Jasmonic acid, JA), 에틸렌, 앱시스산(abscisic acid, ABA) 및 과산화수소와 같은 신호전달물질은 식물에서 방어 유전자 혹은 스트레스 관련 유전자를 유도한다고 알려져 있으며, 각각은 신호전달경로에 관여함이 알려져 있다. 따라서, 이들 저분자 신호물질이 CaPR-10 유전자 발현 조절과 관련이 있는지를 조사하였다.
비교실험예 1과 동일한 방법에 따라, 50 μM의 메틸 자스몬산(methyl jasmonate, MeJA)을 고추잎에 분사하였다. 대조군으로 증류수를 분사한 고추잎을 사용하였다. MeJA에 의해 유도되는 것으로 알려져 있는 CaPR-4 를 처리군에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.
도 3b에 나타난 바와 같이, CaPR-10 발현은 PR-10s에 대한 다른 보고들과 유사한 정도로 MeJA 처리 시 증가하였다.
비교실험예 3 : 에틸렌 처리에 의한 CaPR-10 발현
에틸렌 처리에 의한 CaPR-10의 발현을 조사하기 위해, 고추를 50 ㎕/L의 에틸렌 가스로 포화시킨 배양실에 놓아두었으며, 에틸렌의 농도는 가스 크로마토그래피에서 확인하였다. 대조군을 위해서는 에틸렌이 없는 동일한 배양실에서 실시하였다. 처리 후 다양한 시간대에 잎을 수확하고 액체질소에서 재빨리 냉동하여 -80℃에 저장하였다.
도 3c에 나타난 바와 같이, 양성대조군인 CaPR-1 은 에틸렌 처리 후 6시간째 강하게 유도되기 시작하였으며, 에틸렌의 처리로 CaPR-10 유전자의 발현은 크게 증가하였다.
비교실험예 4 : 메틸 비올로겐 처리에 의한 CaPR-10 발현
파라콰트(paraquat)로 알려져 있는 제초제 메틸 비올로겐은 광합성동안 광계 I과 II에 손상을 입히는 수퍼옥사이드 라디칼을 생성하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, CaPR-10 유전자가 메틸 비올로겐의 처리로 인해 유도되는지를 조사하기 위해, 침지시킨 뿌리를 제거한 고추 잎에서 총 RNA를 추출하기 전에 여러 시간대 동안 50 μM의 메틸 비올로겐(methyl viologen, MV) 용액으로 분사하였으며, 도 3(d)는 처리동안 CaPR-10 mRNA의 축적을 시간대별로 나타내고 있다. 아스코르베이트 페록시다아제(Ascorbate peroxidase, APX) 유전자는 과산화수소 처리시 유도된다고 보고되어 있으며, 고추에서 분리되는 APX (CaAPX1이라 함) 를 MV 처리 실험시 양성대조군으로 사용하였다. CaPR-10 유전자는 처리 후 6시간 이내에 발현되기 시작하여 24시간까지 유지되었다.
비교실험예 5 : 염화나트륨 처리에 의한 CaPR-10의 발현
병원균에 대한 식물 내성의 중요한 요소인 SA와 MeJA는 염 스트레스를 포함하여 환경조건을 극복하기 위한 식물 방어에 중요한 역할을 담당한다. 따라서, CaPR-10 유전자가 염화나트륨 처리로 인해 유도되는지를 조사하기 위해, 동일 시점에서 250 mM NaCl-처리 식물 혹은 무처리 식물의 잎에서 RNA를 추출하였다. 아기장대(Arabidopsis thaliana)의 피롤린-5-카르복실레이트 신타아제(pyrroline-5-carboxylate synthase)의 유전자(AtP5CS)는 염 스트레스에 대한 ABA 관련 저항반응에 관여한다고 알려져 있고, AtP5CS 프로브는 본 발명에서 처리군에 대한 양성 대조군으로써 사용되었다.
도 3e에 나타난 바와 같이, CaPR-10 mRNA는 높은 염처리 조건 하에서 30분 이내에 축적되었으며, 유전자는 6시간 후 강하게 발현되었다.
실시예 4 : 병원균에 감염된 고추잎에서 분리한 CaPR-10의 세균성 발현
상기 실시예들에서 병원균에 감염된 고추잎에서 분리한 병원관련단백질 10 (CaPR-10)의 생물학적 특성을 조사하기 위해, 상기 CaPR-10에 의해 형질전환된 이 콜라이(E. coli)에서 발현된 재조합 CaPR-10 단백질을 얻고, 근 동종에 대한 친화성크로마토그래피를 통해 분리 정제하고, 그것의 생물학적 활성을 분석하였다.
CaPR-10에 의해 형질전환된 이 콜라이에서 발현된 재조합 CaPR-10 단백질을 얻기 위해, PCR을 통해 CaPR-10 cDNA 단편을 얻고, pQE-30 벡터(QIAGEN, Germany)의 BamH1 사이트에 클로닝하였다. 증폭을 위해 다음의 프라이머 세트를 사용하였다:
CaPR-10-5′: 5′-GGGATCCATGGGTGCTTATACCTTT-3′
블루스크립트 SK- T7(pBluescript SK- T7) 유니버셜 프라이머 :
5′-AATACGACTCACTATAG-3′
상기로부터 얻은 인-프레임 퓨전 플라스미드(in-frame fusion plasmid)를 이 콜라이 균주 BL21 (DE3)에 주입하여 형질전환하였다. N-말단에 있는 6개의 히스티딘 잔기가 달린 CaPR-10의 과다발현은 30℃에서 3시간동안 0.4 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(isopropyl-β-D-thiogalactoside)에 의해 유도되었다. 재조합 단백질의 분리 정제를 위해, 유도 후 상기 이 콜라이를 침전시키고, 용해용액(50 mM Na2HPO4, pH 8.0, 300 mM NaCl)으로 현탁하고, 얼음 위에서 1분동안 비브라셀 소니케이터(Vibracell sonifier, 소닉스 앤드 머티리얼사 제품)를 사용하여 초음파분해를 실시하였다. 상기로부터 얻은 용해물질을 13,000 x g에서 10분동안 원심분리하고 상등액을 키아젠 키트(독일의 QIAGEN사 제품)의 설명서에 따라 Ni-NTA 어피니티 레진상에서 색층분석하였다. 재조합 단백질은 용출용액(50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤)으로 pH 6.0 에서 pH 4.0의 구배에 따라 용출하였다. 마지막으로, 샘플을 농축하기 위해 친화성크로마토그래피를 통해 분리정제된 단백질을 YM-10 멤브레인이 부착된 센트리콘 원심분리여과장치(Centricon Centrifugal Filter Devices with YM-10 membrane, 미국의 밀리포아사 제품)에 통과시켰다.
재조합 CaPR-10의 분자량은 SDS-PAGE 결과 약 18 kDa로 측정되었다(미 도시됨). 상기 값은 실시예 2에서 얻은 아미노산 서열로부터 계산된 예상 분자량과 거의 일치하였다.
실시예 5 : 재조합 CaPR-10 단백질의 항진균 활성의 조사
PR-10 군을 제외한 많은 PR 단백질은 항곰팡이 또는 항진균 활성을 갖는 것으로 알려져 있기 때문에, 실시예 4에 따라 제조된 재조합 CaPR-10 단백질의 항곰팡이 활성을 조사하였다.
진균 생장의 억제는 Schlumbaum의 방법에 따라 곰팡이 파이토프토라 캡시시(Phythophthora capsici)을 사용하여 분석하였다. 파이토프토라 캡시시를 2.4% w/v 포테이토 덱스트로스 브로스(Potato Dextrose Broth, 디프코사 제품)를 포함하는 페트리디쉬에서 28℃에 24시간 동안 배양하였다. 콜로니의 직경이 3-4 cm일 때, 6mm 직경의 살균한 필터 페이퍼 디스크를 성장면에서 1 cm의 아가표면에 놓고 10 혹은 20 ㎍의 CaPR-10, H2O, 혹은 용출 완충용액을 디스크에 처리하였다. 28℃에서 16시간 동안 배양기에서 배양한 후, 성장 억제 지대를 관찰 및 측정하였다.
도 4a에 나타난 바와 같이, 재조합 CaPR-10 단백질을 디스크에 적용하였을 때, 균사 생장이 억제된 2 내지 3 mm 지대가 측정되었다.
실시예 6 : 재조합 CaPR-10 단백질의 항바이러스 활성의 조사
상기 실시예 4에 따라 제조된 재조합 CaPR-10 단백질이 바이러스 감염을 억제할 수 있는지를 알아보기 위해, 분리 정제된 CaPR-10 재조합 단백질을 0.1 M 인산염 완충액(pH 7.2)에 최종농도 50 ㎍/mL에서 담배 모자이크 바이러스(TMV-P0)의 현탁액에 첨가하였다. 상기 혼합액을 각 처리를 위해 전반적으로 넓게 펴진 잎을 무작위로 5개를 선택하여 부강고추품종의 잎에 처리하였다. 국부 손상은 처리후 3일 후에 세고 손상 억제율은 다음의 식에 따라 계산하였다:
% 억제율 = (1- 샘플과 TMV-P 0 를 처리한 잎의 손상 갯수) × 100
TMV-P0를 단독 처리한 잎의 손상 갯수
TMV-P0에 감염된 고추 잎에서 재조합 CaPR-10의 효과
실험수a 국부 손상 갯수b TMV 항바이러스 활성(%)
TMV 단독처리 TMV + CaPR-10
12345 11.75±3.8616.25±47.3521.50±6.3519.50±3.1119.00±2.16 2.25±2.063.25±2.754.75±1.506.25±2.992.25±2.63 80.8580.0079.9167.9588.16
a : 각 수는 실험횟수를 나타낸다.
b : 국부 손상 갯수에 대한 각 수치는 4개의 잎의 평균값이다.
도 4b와 표 1에 나타난 바와 같이, 50 ㎍/mL의 재조합 CaPR-10을 포함한 TMV-P0를 고추에 처리할 경우, 감염된 잎은 국지적 손상이 67.95 내지 88.16% 정도로 현저하게 감소하였다. 따라서, TMV-P0 만을 감염시킨 경우와 비교하여, 단지 11.84% 내지 32.05% 의 손상만을 나타냈다.
비교예 1: 담배에서 재조합 CaPR-10 단백질의 항바이러스 활성의 조사
다른 식물에서 TMV-P0의 감염 억제도를 조사하기 위해, 담배(Nicotiana tabacum cv. Samsun NN)에 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 TMV-P0를 처리하였다. 재조합 CaPR-10을 적용한 경우, TMV-P0의 감염억제비율은 약 87.26% 였다(미 도시됨). 이는 재조합 단백질이 고추뿐만 아니라 담배 이종에서도 TMV-P0의 감염을 억제할 수 있음을 말하는 것이다. 이들 결과는 TMV에 대해 재조합 CaPR-10이 항바이러스 활성을 갖고 있음을 말하는 것이다.
실시예 7 : 재조합 CaPR-10 단백질의 리보뉴클레아제 활성 조사
상기 실시예 4에서 제조된 재조합 CaPR-10 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 알아보기 위해, 고추에서 추출한 총 RNA에 재조합 CaPR-10를 넣거나 혹은 넣지 않고 1 내지 6시간동안 배양한 후 RNA가 분해되는지 분석하였다. 각 반응 혼합액은 고추잎에서 제조된 10 ㎍의 총 RNA를 포함한다. 단백질을 제거한 후, RNA 가수분해 산물을 1.0% 아가로오스 젤에서 분리하였다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 용출액(+buffer; 레인 2-5)을 넣고 함께 배양할 경우, 고추의 총 RNA의 분해는 관찰되지 않았다. CaPR-10 cDNA을 넣지 않은 이 콜라이 배양으로부터 Ni-NTA 레진을 이용하여 분리 정제한 대조군 단백질 샘플(+pQE30; 레인 6-8)은 분석기간 동안 고추의 RNA를 분해하지 않았다. 그러나, 재조합 CaPR-10 단백질과 함께 배양할 경우, 특이하고 의의있는 리보뉴클레아제 활성이 아가로오스 젤상에서 분해 산물의 이동상으로 나타났다(+PR-10; 레인 9- 11). 플라스미드 DNA 혹은 고추의 게놈 DNA의 핵산 분해는 없었다(미 도시됨).
실험예 1: 재조합 CaPR-10의 리보뉴클레아제 활성과 항바이러스 활성과의 연관성 조사
재조합 CaPR-10의 리보뉴클레아제 활성과 항바이러스 활성과의 연관성이 있는지를 알아보기 위해, 역전사효소-중합효소연쇄반응(reverse transciptase-ploymerase chain reaction, RT-PCR)을 사용하여 담배 모자이크 바이러스의 RNA에 대한 재조합 CaPR-10 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 조사하였다. 재조합 CaPR-10 단백질(0.01, 0.1, 0.5, 4 ㎍)이나 완충용액을 TMV 수액으로 3시간동안 배양하고, RNA가 가수분해되는 TMV의 바이러스 RNA를 RT-PCR의 주형으로써 사용하였다. RT-PCR에 대한 특이 프라이머는 TMV 게놈의 코트 단백질(CP)을 코딩하는 영역(GenBank Accession No. AF012917)에서 524 bp 산물을 증폭할 수 있도록 제작하였다:
TMV-업 프라이머; 5′-GATTGAAGATGAAGCCGAGACGTCA-3′
TMV-다운 프라이머; 5′-TGCAGGTGCAGCGGTCCAGACCAAC-3′
대략 3 ㎍ 의 총 RNA를 20 pmol의 TMV-다운 프라이머로 70℃에서 5분간 열처리하여 어닐링하였다. 역전사는 혼합 반응액(5×M-MLV 반응 용액, 200 units의 M-MLV RT (프로메가사 제품), 25 units의 RNasin(프로메가사 제품) 및 1.25 ㎕ 의 10 mM dNTP 혼합물)을 첨가하여 25 ㎕가 되게 하여 실시하였다. 역전사는 37℃에서 60분 동안 실시하였다. 역전사가 끝나면, PCR을 실시하며, 반응조건은 다음과 같다. 엑스 택 폴리머라아제(Ex Taq polymerase, 일본 다카라사 제품)를 사용하여 다음의 온도 사이클에 따라 25 사이클을 실시한다. 즉, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 45초간, 최종 연장 반응은 72℃에서 10분간 실시하였다. PCR 증폭 후, 10 ㎕의 혼합 반응액을 1% 아가로오스 젤(W/V)에서 전기영동을 실시하고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색한 후, 일차원 정량분석 소프트웨어에서 정량분석 하였다. TMV 코트단백질의 524 bp 단편의 증폭은 물이나 완충액과 함께 배양한 시료의 경우에서도 관찰될 수 있으므로, 상기 단편은 시퀀스 분석을 통해 TMV 코트단백질임을 확인하였다(미 도시됨).
도 5b에 나타난 바와 같이, TMV 수액은 1 ㎍의 재조합 CaPR-10과 함께 배양될 때, 대부분의 바이러스 RNA는 CaPR-10의 리보뉴클레아제 활성으로 인해 분해되었으며, 결과적으로, RT-PCR 결과 증폭된 밴드의 강도는 용출액(+buffer)으로 배양한 경우와 비교하여 5.3%로 감소되었다(도 5b의 아래쪽 막대 그래프). CaPR-10에 의한 바이러스 RNA의 분해 효과는 CaPR-10이 0.01 ㎍일 때에도 관찰되었다.
실시예 8 : 고추에 TMV-P 0 처리시 뿌리와 잎의 CaPR-10의 발현 조사
TMV-P0에 감염된 고추에서 CaPR-10 단백질의 축적을 조사하기 위해, CaPR-10 에 의해 형질전환된 이 콜라이에서 발현된 재조합 CaPR-10 단백질을 분리 정제하여 랫트에 주입한 후 6개의 히스티딘 잔기로 표지한 CaPR-10 항체를 제조하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다.
웨스턴 블랏 분석을 위해, TMV-P0를 처리한 후 지정 시간대에 잎이나 뿌리에서 추출한 2 ㎍의 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤(SDS-PAGE) 에서 Laemmli의 방법에 따라 분리하였다. 그 후 단백질을 세미포아 세미드라이 트랜스퍼 유니트(SemiPhor Semi-Dry Transfer Unit, 영국 아머샴사 제품)를 사용하여 하이본드-P-멤브레인(Hybond-P membrane, 영국의 아머샴사 제품)에 블랏시켰다. 웨스턴 블랏 분석은 공지의 설명서(Harlow and Lane, 1988) 에 따라 일차 항체(primary antibody)로서 1:1500으로 희석한 재조합 CaPR-10에 대한 다중클론성 항원을, 2차 항체로서 양고추냉이 페록시다아제 컨쥬게이티드 항-래트 IgG 항체(horseradish peroxidaseconjugated anti-rat IgG antibody, 영국의 아머샴사 제품)를 사용하여 실시하였다. 상기 블랏은 ECL 탐지시스템(ECL detection system, 아머샴사 제품)에 전개시켰다.
도 6a에 나타난 바와 같이, 잎에서는 0시간 때에 18 kDa의 단백질이 약간 검출되지만 뿌리보다는 훨씬 작다. 상기 단백질은 전반적으로 뿌리에서 발현되는 것 같으며 단백질의 레벨은 TMV-P0 처리 후에도 거의 증가하지 않았다. 그러나, 잎에서 18 kDa의 단백질은 TMV-P0 처리 후 12시간 때부터 축적하기 시작했으며 처리 후 5일 째에 최고에 도달하였고, 처리 후 6일째에 감소하기 시작하였다. 아래쪽 밴드는 CaPR-10에 대한 예상분자량 17.3 kDa과 일치하였다. 그러나 항-CaPR-10 항체는 뿌리와 잎 추출물에서 보다 천천히 이동하는 19 kDa와 반응하였다. 뿌리에서, 상기 19 kDa의 추가 밴드가 전반적으로 탐지되었으며 이 단백질의 축적 레벨은 TMV-P0 처리 후와 유사하게 높았다. 그러나, 잎 추출물에서, 19 kDa의 단백질은 처리 후 2일째에 축적하기 시작하여, 처리 후 5일째에 최고에 도달하고 처리 후 6일째에 빠르게 감소하였다.
실험예 1: TMV-P 0 에 감염된 고추잎에서 분리한 천연 단백질의 RNA 분해 분석
TMV-P0로 감염된 고추의 잎에서 분리한 CaPR-10 단백질의 RNase 활성을 조사하기 위해, 기질로서 토룰라 효모 tRNA를 사용하여 RNase가 없는 조건하에서 폴리아크릴아마이드 젤을 제조하여 RNA의 분해를 분석하였다. TMV-P0를 고추에 처리한 후 0, 0.5, 1, 2, 3, 5일째에 잎에서 단백질 추출물을 분리하고 상기 추출물 중 10 ㎍을 RNase-포지티브 밴드를 탐지하기 위해 사용하였다.
2 mg/mL 토룰라 효모 tRNA (미국 시그마사제품)를 포함한 SDS-PAGE의 RNase 활성 젤은 Yen and Green (1991)의 방법에 따라 제조하였다. 상기 젤은 SDS를 제거하기 위해 0.01 M Tris-HCl에 녹인 25% 이소프로판올로 수세하고 0.1 M Tris-HCl에서 전배양하며, 0.1 M Tris-HCl에서 56℃에서 45분 동안 항온처리하고, 톨루이딘 블루(Toluidine blue, 0.01 M Tris-HCl에 0.2% 포함됨) (미국 시그마사제품)로 착색시키고 마지막으로 0.01 M Tris-HCl에서 탈색한 다음, 일차원 정량분석 소프트웨어(미국 바이오래드사 제품)를 사용하여 정량분석하였다. RNA 분해 분석은 Bantignies et al., (2000)의 방법에 따라 실시하였다. 웨스턴 블랏 분석과 상기 RNA 분해 분석은 3번 실시하였다.
도 6b에 나타난 바와 같이, TMV-P0로 처리된 고추잎에서 추출한 천연 단백질은 젤에서 효모의 tRNA를 분해하는 것으로 나타났다. 18 kDa의 단백질은 TMV-P0 처리 후 1일째에 효모의 tRNA를 분해하는 것으로 나타났으며, 19 kDa의 단백질은 2일째에 RNase 활성을 나타내기 시작하였다.
상기 웨스턴 블랏 분석과 SDS-PAGE 에서 얻은 결과로부터, 잎에서의 CaPR-10 축적에 대한 카이네틱스는 비교적 일관된 RNase 활성 레벨을 나타내고 있다. 그러나, 웨스턴 블랏 분석 결과와는 반대로, 인 젤 RNase 분석(in-gel RNase assay)에서 탐지된 18 kDa 타입은 19 kDa 타입과 비교하여 보다 낮은 활성을 갖고 있는 것으로 보였다.
실험예 2: TMV-P 0 에 감염된 고추 뿌리에서 분리한 천연 단백질의 RNA 분해 분석
RNase 활성과 면역학적 탐지 결과로부터 얻은 강도와의 상관관계를 이해하기 위해, 인 젤 RNase 분석을 뿌리에서 분리한 천연 단백질을 이용하여 효모의 tRNA에 대해 상기 실험에 1의 방법과 동일하게 3번 반복 실시하였다(도 7a, 레인 1). 2개 젤의 블랏된 멤브레인을 이용한 웨스턴 블랏 분석시, 항 CaRP-10 항체에 의해 18 및 19 kDa 단백질이 RNase 활성 젤에서 효모의 tRNA를 분해했던 것과 같은 위치에서 탐지되었다(도 7a, 레인 2). 상기 웨스턴 블랏 분석과 인 젤 RNase 활성 분석에 따라, 보다 소량인 듯한 19 kDa 단백질은 효모의 tRNA를 분해함에 있어 잎 추출물의 결과와 동일하게 18 kDa 단백질보다 보다 높은 활성을 나타냈다.
일차원 정량분석 소프트웨어를 사용하여 뿌리에 대한 자료를 정량한 결과, 도 7b에 나타난 바와 같이, 대략 0.39 배 적은 19 kDa 단백질은 18 kDa 단백질과 비교하여 4.85배 높은 리보뉴클레아제 활성을 갖고 있었다.
이상 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 식물 병원균에 감염된 고추에서 병원균에 대한 방어반응으로 발현되는 병원관련단백질 10(PR-10), 그것의 유전자 염기서열 및 아미노산 서열을 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명 고추 유래의 병원관련단백질 10은 리보뉴클레아제 활성을 갖고 있는 항바이러스 단백질이며 항진균 활성도 가지고 있으므로 이를 유효성분으로 포함하는 항바이러스제 및 항진균제를 제조할 수 있어 기능성제품제조산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 담배 모자이크 바이러스에 감염된 고추잎에서 분리한 병원관련단백질과 상동한 CaPR-10 유전자의 염기서열 및 추정 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 담배 모자이크 바이러스에 감염된 고추잎에서 분리한 CaPR-10의 발현패턴을 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 자극 하에서 CaPR-10의 발현 패턴을 나타낸 것이다.
도 4는 재조합 CaPR-10 단백질의 항진균 및 항바이러스 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 고추의 총 RNA 및 담배 모자이크 바이러스의 코트 단백질의 RNA에 대한 재조합 CaPR-10 단백질의 리보뉴클레아제 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 고추에 TMV-P0를 접종한 후 잎과 뿌리에서의 CaPR-10의 축적 패턴을 조사하고 고추의 뿌리에서 추출한 천연 CaPR-10에 대한 인-젤 RNase 분석한 것이다.
도 7은 이중 젤을 사용하여 고추의 뿌리에서 추출한 천연 CaPR-10에 대한 인-젤 RNase 분석 및 웨스턴 블랏 분석을 비교하여 나타낸 것이다.
<110> PAEK, Kyung-Hee <120> Pathogenesis-related protein 10 isolated from hot pepper functioning as a ribonuclease <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 796 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> CDS <222> (68)..(544) <400> 1 cggcacggca atcatcttat cctaagctct ttcttcttct tgtttaaggc aaattaatca 60 aaacatt atg ggt gct tat acc ttt act gac aag tcc aca gcc tca gtt 109 Met Gly Ala Tyr Thr Phe Thr Asp Lys Ser Thr Ala Ser Val 1 5 10 gcc cca tca agg cta ttc aaa gct ttg gtt att gat ttt aac aac ctt 157 Ala Pro Ser Arg Leu Phe Lys Ala Leu Val Ile Asp Phe Asn Asn Leu 15 20 25 30 gta tct aaa ttg gca cct gat gtt aag agt att gag aat gtt gaa ggt 205 Val Ser Lys Leu Ala Pro Asp Val Lys Ser Ile Glu Asn Val Glu Gly 35 40 45 gat ggt ggt gct gga acc atc aag aag atg acc ttt gtc gaa ggt ggt 253 Asp Gly Gly Ala Gly Thr Ile Lys Lys Met Thr Phe Val Glu Gly Gly 50 55 60 cca ata aag tac atg aag cac aag att cat gtg att gac gaa aag aat 301 Pro Ile Lys Tyr Met Lys His Lys Ile His Val Ile Asp Glu Lys Asn 65 70 75 tta gta aca aaa tat tca ctt atc gaa agt gat gtt act gaa aac aaa 349 Leu Val Thr Lys Tyr Ser Leu Ile Glu Ser Asp Val Thr Glu Asn Lys 80 85 90 gca gaa tca gtt gat tat gat ggc aaa ttt gaa gct tct gca gat gga 397 Ala Glu Ser Val Asp Tyr Asp Gly Lys Phe Glu Ala Ser Ala Asp Gly 95 100 105 110 gga agt gtt tgc acc aca gta act gtg tac aac aca aaa ggt gat tat 445 Gly Ser Val Cys Thr Thr Val Thr Val Tyr Asn Thr Lys Gly Asp Tyr 115 120 125 gtt gtt act gag gaa gaa cac aat gtg cac aaa gag aaa gcc aat gac 493 Val Val Thr Glu Glu Glu His Asn Val His Lys Glu Lys Ala Asn Asp 130 135 140 ctt ctc aag gcc atc gaa gca tac ctc ctc gcc aat cct tct gtc tat 541 Leu Leu Lys Ala Ile Glu Ala Tyr Leu Leu Ala Asn Pro Ser Val Tyr 145 150 155 gtt taagcc aatgaccttg ttgtgatgtt atatatttaa ataattataa gtgtgtcatg 600 Val tttaagaagt ttaaagtttt agatgagagg aaaaaatcag attgattatg tatgggttgt 660 atcagttctt ctaagggatt gagttttagg ttgttagtct tttgttgagt gtgtgttttt 720 tcccaattgg ttgtcatgga aagaactttc aataaagaat atnacaagtt tacttacaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaa 796 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 2 Met Gly Ala Tyr Thr Phe Thr Asp Lys Ser Thr Ala Ser Val Ala Pro 1 5 10 15 Ser Arg Leu Phe Lys Ala Leu Val Ile Asp Phe Asn Asn Leu Val Ser 20 25 30 Lys Leu Ala Pro Asp Val Lys Ser Ile Glu Asn Val Glu Gly Asp Gly 35 40 45 Gly Ala Gly Thr Ile Lys Lys Met Thr Phe Val Glu Gly Gly Pro Ile 50 55 60 Lys Tyr Met Lys His Lys Ile His Val Ile Asp Glu Lys Asn Leu Val 65 70 75 80 Thr Lys Tyr Ser Leu Ile Glu Ser Asp Val Thr Glu Asn Lys Ala Glu 85 90 95 Ser Val Asp Tyr Asp Gly Lys Phe Glu Ala Ser Ala Asp Gly Gly Ser 100 105 110 Val Cys Thr Thr Val Thr Val Tyr Asn Thr Lys Gly Asp Tyr Val Val 115 120 125 Thr Glu Glu Glu His Asn Val His Lys Glu Lys Ala Asn Asp Leu Leu 130 135 140 Lys Ala Ile Glu Ala Tyr Leu Leu Ala Asn Pro Ser Val Tyr Val 145 150 155 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Capsicum annuum <220> <221> CDS <222> (1)..(18) <223> P-loop <400> 3 ggt gat ggt ggt gct gga 18 Gly Asp Gly Gly Ala Gly 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 4 Gly Asp Gly Gly Ala Gly 1 5

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  4. 식물 병원균에 대한 항진균 활성을 가지며, 서열목록 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 고추 유래의 병원관련단백질 10을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항진균제용 조성물.
KR10-2002-0061132A 2002-10-08 2002-10-08 고추 유래의 리보뉴클레아제 활성을 갖는 병원관련 단백질 10 KR100538975B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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A cotton cDNA(GaPR-10) encoding a pathobenesis-related 10 pretein with in vitro ribonuclease activity. Plant Sci. 162(4), 629-639. 2002-04-18 *
A translation elongation fator 1A(CaEF1A) gene from hot pepper(capsium annuum L.) is induced by the tabacco mosaic virus and by wounding. Plant Biology. 44(4), 199-204. 2001-12 *
Isoation of pepper mRNAs differentially expressed during the hypersensitive response to tobacco mosaic virus and characterzation of a proteinase inhibitor gene. Plant Sci. 161(4),727-737.2001-04-21 *
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