KR100723293B1 - 발병기전 관련 단백질 및 그의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 캅시쿰 바카툼(Capsicum baccatum) 내의 발병기전-관련 단백질-10(CbPR-10) 유전자를 포함한 gDNA 및 상응하는 cDNA 서열에 관한 것이다. DNA에 의해 인코드된 폴리펩타이드는 효소가 진균성 병원균의 생장을 억제하는데 매우 효과적이게 하는 리보뉴클레아제 활성을 지닌다. 여기에 개시된 DNA 서열의 이용은 진균성 병원균에 대해 증가된 저항성을 지닌 gDNA, cDNA, 단백질 및 형질전환 식물의 생성을 위한 유전자 구조물 특히, 유전적으로 형질전환된 고추 식물을 포함한다.
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고추, 탄저병, 발병기전-관련 단백질-10, 유전자, 형질전환, 리보뉴클레아제

Description

발병기전 관련 단백질 및 그의 이용{Pathogenesis related protein and use thereof}
도 1은 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum)의 KSCa-1 분리체로의 접종 7일 후 각각 민감성 및 저항성 고추 열매인 Capsicum annuum cv. Yeo-ju 및 Capsicum baccatum cv. PBC80 상에서 발달된 탄저병 증상을 나타낸 것이다.
도 2는 캅시쿰 바카툼(Capsicum baccatum)으로부터 분리된 발병기전 관련 10 단백질(CbPR-10)의 gDNA의 서열번호 2의 추정된 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 서열번호 2의 CbPR-10 및 서열번호 4의 CaPR-10의 추정된 아미노산 서열의 정렬을 나타낸 것이다. CbPR-10 인코드된 폴리펩타이드는 캅시쿰 안눔(Capsicum annuum)(GenBank No. AF244121)으로부터의 발병기전 관련 10 단백질(CaPR-10)과 정렬된다. P-루프 모티프는 밑줄 쳐있고 추정 인산화는 사각형으로 둘러싸여 있다. 2 종 사이의 서열 변화가 정렬되고 표시된다.
도 4는 탄저병균으로 접종된 각각의 고추 종으로부터의 열매 내의 CaPR-10 및 CbPR-10의 유전자 발현(A) 및 단백질 축적(B)을 나타낸 것이다. A에서 총 RNA는 0, 24, 48 및 72 HAI에서 열매로부터 준비되었고, 100 ng의 총 RNA가 RT-PCR 분석의 주형으로서 사용되었다. B에서 PR-10 단백질(2 ㎍)의 면역블럿 분석이 감염된 고추 열매에서 수행되었다. 용해성 단백질은 0, 24, 48 및 72 HAI에서 탄저병균으로 감염된 열매로부터 추출되었다. 재조합 CaPR-10에 대해 증가된 폴리클론 항체가 1:1500로 희석되어 사용되었고 HRP-컨쥬게이트 항-래트 IgG 항체가 1:5000로 희석되어 2차 항체로 사용되었다.
도 5는 각각 민감성 및 저항성 종인 C. annuum 및 C. baccatum의 감염된 열매 내의 CPR-10 및 CbPR-10 단백질의 면역위치화(immunolocalization)를 나타낸 것이다. 고추 열매는 C. annuum로 접종되었고 0, 24, 48 및 72 HAI에서에서 접종 사이트로부터 표본을 제조하였다. 섹션은 재조합 CaPR-10에 대한 폴리클론 항체와 인큐베이트되었고 퍼옥시다제 표지된 2차 항체로 검출되었다. PR-10 단백질의 위치화는 적색으로 검출되었다. 전-면역(pre-immune) 혈청을 이용한 대조군 실험은 어떠한 반응도 나타내지 않았다(데이터는 나타나지 않음). 막대는 100 ㎛를 나타낸다.
도 6은 재조합 CaPR-10 및 CbPR-10의 발현 및 정제를 나타낸 것이다. 다른 단계의 정제에서 E. coli 내에서 생성된 재조합 PR-10 단백질의 SDS-PAGE 분석. 레인 M, 단백질 분자량 마커(크기: kDa). 좌측으로부터 레인 1, GST 단백질에 대해 코드하는 pGEX6p-1 플라스미드를 운반하는 E. coli BL21 세포의 용해성 프랙션; 레인 2, IPTG 없이 생성된 GST-CaPR-10 단백질에 대해 코드하는 pGEX6P-1/CaPR-10를 지닌 E. coli의 용해성 프랙션; 레인 3, 레인 2와 동일하나 IPTG와 함께 인큐베이트됨; 레인 4, IPTG 없이 생성된 GST-CbPR-10 단백질에 대해 코드하는 pGEX6P-1/CbPR-10를 지닌 E. coli의 용해성 프랙션; 레인 7, 정제된 GST/CbPR-10 융합 단백질; 레인 8, 분열된 CaPR-10 단백질; 레인 9, 분열된 CbPR-10 단백질.
도 7은 고추 총 RNA에 대한 재조합 PR-10 단백질의 리보뉴클레아제용해 활성(ribonucleolytic activity)을 나타낸 것이다. 각각의 반응 혼합물은 고추 열매로부터의 5 ㎍의 총 RNA를 포함하였고 56℃에서 3시간 동안 인큐베이트되었다. 가수분해된 RNA는 1.0% 아가로스 겔 내에서 분리되었다. 레인 1, RNA + 증류수; 레인 2, RNA + 단백질 용출 용액; 레인 3, RNA + CaPR-10 단백질(2 ㎍); 레인 4, RNA + CbPR-10 단백질(2 ㎍); 레인 5, RNA + RNase A(SIGMA, 미국). RNA의 상대 수준은 하부의 바 그래프에 나타나 있다.
도 8은 고추 총 RNA에 대한 재조합 PR-10 단백질의 리보뉴클레아제용해 활성에 의한 RNA 분해의 시간 경과를 나타낸 것이다. 각각의 반응 혼합물은 고추 열매로부터의 5 ㎍의 총 RNA를 포함하였고 56℃에서 3시간 동안 인큐베이트되었다. 가수분해된 RNA는 1.0% 아가로스 겔 내에서 분리되었다. 상위 겔, RNA + CaPR-10(2 ㎍); 하위 겔, RNA + CbPR-10(2 ㎍). RNA의 상대 수준은 하부의 바 그래프에 나타나 있다.
도 9는 탄저병균의 포자로의 재조합 PR-10 단백질의 첨가 24시간 후 시험관 내의 진균 억제 에세이의 현미경 관찰을 나타낸 것이다. 진균의 생존력이 Live/Dead 박테리아 생존력 키트(Molecular probe, 미국)를 이용하여 측정되었다. 좌측 패널; 재조합 CaPR-10 단백질이 0. 0.05 및 0.5 mg/L에서 첨가되었다. 우측 패널; 재조합 CbPR-10 단백질이 0. 0.05 및 0.5 mg/L에서 첨가되었다.
본 발명은 고추(Capsicum baccatum)로부터의 발병기전 관련-10(CbPR-10) 단백질을 인코드하는 DNA 서열에 관한 것이다. CbPR-10의 폴리펩타이드는 약한 리보-뉴클레아제 활성을 나타내고, 이는 단백질의 진균 유도 인산화 후 강해진다. 또한 본 발명은 식물의 형질전환 또는 산업적 이용을 위해 유전자 구조물 내에 발명되거나 다른 적당한 프로모터 및 터미네이터와 융합된 cDNA 서열을 포함한 서열에 관한 것이다. 식물 내에서의 본 유전자 구조물의 발현은 식물병원성균 특히 탄저병균에 대한 증가된 저항성을 유발한다.
식물은 조화되고 통합된 신진대사 변화 세트에 의해 식물-병원균의 침입에 반응한다. 병원균에 저항하기 위해 다양한 유전자가 각각 고감도 반응(hypersensitive reaction, HR) 및 전신성 획득 저항성(systemic acquired resistance, SAR)의 발달과 결합하여 식물의 감염 사이트와 식물 말단 부위에서 유도된다. 이들 유전자는 발병기전-관련(pathogenesis-related, PR) 및 항생 단백질 등을 포함한다.
PR 단백질은 병원균 감염에 반응하여 식물 내에서 합성된 단백질의 종류이다. 일반적으로 PR 단백질은 건강한 식물에서는 존재하지 않으나 병원성 또는 관련 스트레스에 반응하여 합성된다. 최근의 결의에서 PR 단백질은 그의 서열, 혈청학적 성질 및 생물학적 활성에 기반하여 14개 계통으로 분류된다. 대부분의 PR이 세포외 단백질인 반면 PR-10은 처음으로 기술된 유인제(elicitor) 처리시 배양된 파슬리 세포 내의 세포내 단백질이다. 세포내 PR-10은 식물 세포 내에서 바이러스 RNA 또는 다른 병원균의 RNA를 분열시킬 수 있는 것으로 추측되었다. Park et al., Plant Journal 37:186-198 (2004)에 따라 고추(Capsicum annuum)로부터 분리된 CaPR-10 단백질은 TMV-P0 접종시 인산화되고 바이러스 RNA를 분열시킬 수 있는 RNase의 종류와 같이 기능한다. 또한 재조합 CaPR-10은 바이러스 감염뿐만 아니 라 난균 생장을 억제하였다. 따라서 세포질성 인산화된 PR-10 단백질은 병원균 감염에 대한 유도성-방어 메카니즘의 활성 성분임이 제안되었다.
대부분의 재배된 고추 라인은 탄저병균에 매우 민감한 C. annuum 종으로부터 발달되었다. 탄저병의 병원성 작용제인 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum)은 널리 재배되는 고추 품종 내의 가장 파괴적인 질병이고 심각한 경제적 손실을 유발한다. 탄저병균에 의해 가장 심각한 손상이 고추 열매에서 발생한다. 이러한 병원균은 표피 세포 내로의 침투 후 네크로트로픽(necrotrophic)이 되어, 진균사가 열매의 큐티클 아래 조직 내에 세포내적으로 콜로나이즈(colonize)한다. PR-10이 식물 세포의 세포질 내에 위치하기 때문에 진균 감염 동안 PR-10 단백질의 억제 효과를 검사하는 것이 유용할 것이다. 따라서 탄저병균과의 부적합성 상호작용을 나타내는 C. baccatum으로부터의 PR-10 유전자를 분리하고 특성을 나타내었다. 또한 관련된 리보뉴클레아제 및 항균 활성이 이전에 보고된 민감성 종인 C. annuum의 CaPR-10 단백질과 비교되었다.
C. baccatum 및 C. chinense 종과 같은 일부의 고추속(Capsicum) 어세션(accession)이 있다. 저항성 종의 방어 관련 유전자가 유용한 경우 민감성 종 내로 본 유전자를 전이시키는 기회를 제공할 것이다. 최근, 유전공학기술이 진균 저항성 종으로부터 분리된 저항성 관련 유전자를 이용하여 진균 제어 시스템의 발달을 통해 재배되는 고추 라인 내의 파괴적인 질병의 경감을 제공하고 있다. 따 라서 CbPR-10 단백질의 생명공학적 적용이 유해한 부작용 없이 고추 재배에 농경적으로 적절한 수준의 질병 제어를 제공한다.
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 고추(Capsicum baccatum)로부터의 발병기전 관련-10(CbPR-10) 단백질을 인코드하는 DNA 서열을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 식물의 형질전환 또는 산업적 이용을 위해 유전자 구조물 내에 발명되거나 다른 적당한 프로모터 및 터미네이터와 융합된 cDNA 서열을 포함한 서열을 제공한다.
본 발명은 서열번호 2의 발병기전 관련 단백질 10(CbPR-10)으로 명명된 고추(Capsicum baccatum)로부터의 서열번호 1의 cDNA 클론에 관한 것이다. C. baccatum의 열매는 탄저병균, 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum)에 저항성이다. 그러나 대부분의 통상적인 고추 품종은 캅시쿰 안눔(Capsicum annuum)으로부터 발달되고, 이는 본 진균에 매우 민감하다. 지금까지는 탄저병에 저항성인 어떠한 상업적 재배종이 개발되지 않았다. 본 발명에서는 탄저병균이 열매의 큐티클 세포 내에 콜로나이즈하기 때문에 세포내 발병기전 관련 단백질, PR-10이 저항성 고추 종으로부터 클론되어 진균과의 열매의 부적합성 반응에 대한 기능적 관계를 명백하게 설명하였다.
CbPR-10의 추정된 아미노산 서열은 C. annuum의 CaPR-10와 96% 동일성을 나타내었고, PR-10 단백질간에 보존된 P-루프(loof)를 포함하였다. 그러나 일부 추정 인산화 사이트가 CaPR-10와 다르다. 19 kDa의 예측 크기를 지닌 인산화된 CbPR-10 단백질은 C. baccatum의 감염된 열매 내의 8 kDa과 부합하여 뚜렷하게 검출되었고, 18 kDa만이 C. annuum 내에서 검출가능하다. 면역조직화학적 조사는 PR-10 축적이 미숙성 열매의 표피 세포 및 큐티클 아래 세포의 일부 층에 위치함을 나타내었다. 감염 후 단백질 축적은 양쪽 모두, 특히 C. baccatum의 열매 내의 세포층에서 현저하게 증가되었다. CbPR-10 유전자의 발현은 진균 감염에 의해 유도되었으나 발현 수준은 C. baccatum에서 훨씬 더 높았다. 효소적 성질의 특성화는 재조합 CbPR-10 단백질이 CaPR-10 단백질 보다 더 강한 리보뉴클레아제 활성을 나타내고 또한 탄저병균에 대한 더 좋은 항균 활성을 나타냄을 나타내었다.
조절 서열은 유전자의 시간적 및/또는 공간적 발현을 제어하는데 유용하다. 따라서 감염 사이트 내에서 활성인 프로모터의 확인이 목적이다. 병원균 유도성 프로모터의 잠재적 근원은 방어-관련 유전자의 발병기전-관련(PR) 계통이다. 일반적으로 PR 단백질은 병원균에 반응하여 식물 조직의 감염 사이트에서 발현된다. 본 실험에서 발병기전 관련 단백질 10의 조절 구역을 포함한 핵산 서열이 분리되었 고 CbPR-10 유전자의 발현을 조절할 수 있는 능력에 의해 특성화되었다.
본 발명은 C. acutatum과의 부적합성 상호작용을 나타내는 C. baccatum의 감염된 미숙성 열매로부터 분래된 CbPR-10로 명명된 cDNA 클론을 제공한다(도 1). 따라서 CbPR-10에 상응하는 gDNA 서열이 C. baccatum으로부터 클론되었다. 서열은 서열번호 3의 프로모터 및 CbPR-10 유전자의 코딩 서열로 구성되었다. 프로모터는 감염된 조직 내에서 전사의 개시를 조력하는 전사 개시 사이트를 포함한다(도 2). 이후 뉴클레오타이드 위치 1에서의 첫 번째 번역 시작(ATG)으로부터 위치 478에서 전사 종결(TGA)까지의 480 bp의 오픈 리딩 프레임을 포함한 전체 길이의 cDNA가 클론되었다. CaPR-10의 뉴클레오타이드 서열은 17.3 kDa의 추정 분자량을 지닌 159개 아미노산을 인코드한다. cDNA의 아미노산 서열은 다른 식물에서 발견된 발병기전 관련 단백질 10(PR-10)을 인코드하는 유전자와 매우 상동적이다. 특히 뉴클레오타이드 서열은 C. annuum으로부터의 CaPR-10과 거의 동일하다(도 3). 따라서 클론은 C. baccatum의 발병기전 관련 단백질 10에 대해 CbPR-10으로 명명되었다. 뉴클레오타이드 서열에 기반하여 CbPR-10 유전자는 PR-10 계통에 속한다. 서열 동일성은 각각 C. annuum, C. chinese 및 Solanum virginianum과 98%, 90% 및 83%로 가장 높다.
CbPR-10 유전자의 발현 패턴은 탄저병균으로 감염된 C. baccatum 열매에서 조사되었고 민감성 반응을 나타내는 C. annuum 내의 CaPR-10 유전자와 비교되었다. RT-PCR 분석은 다양한 시점에서 두 종의 감염된 열매로부터 추출된 총 RNA로 수행되었다(도 4A). C. baccatum 내의 CbPR-10이 첫 번째 날에 진균 감염에 의해 유도되었고, 두 번째 날에 절정에 달한 후 접종 후 감소되었다. 그러나 C. annuum 내의 CaPR-10의 유도 수준은 훨씬 더 낮은 수준에서 첫 번째 날과 세 번째 날에 이중 발현 패턴을 나타내었다.
PR-10 축적의 시간 경과가 감염된 열매 상의 탄저병 증상 발달과 상호관련되는지 여부를 조사하였다. 웨스턴 블럿 분석이 두 종의 열매로부터 추출된 용해성 단백질로 수행되었다. 항-CaPR-10 항체를 이용하여 PR-10에 상응하는 18 kDa 단백질이 미숙성 열매에서 검출되었다(도 4B). C. baccatum의 저항성 반응에서 면역블럿 분석은 18 kDa의 수준이 다소 증가되었고, 19 kDa 밴드는 탄저병균으로의 감염 후 첫 번째 날에 나타났고, 이들 밴드는 열매 내에서 더욱 유지되었음을 나타내었다. 그러나 C. annuum의 민감성 반응에서 CaPR-10 단백질의 기저 수준은 첫 번째 날에 유의적으로 감소되었고 이후 다소 증가되었다. 흥미롭게도 19 kDa 밴드는 C. baccatum의 감염된 열매에서만 뚜렷하게 검출가능한 반면 C. annuum에서는 검출불가능하였다. 이들 데이터는 19 kDa의 CbPR-10 단백질의 인산화가 탄저병균에 대한 C. baccatum의 열매의 저항성 반응에 관련됨을 제안한다.
이전의 연구에서 플란타(planta) 접종시 C. baccatum의 저항성 열매에서 어떠한 손상도 형성되지 않았으나 일반적인 탄저병 증상이 탄저병균으로 감염된 C. annuum의 감염된 열매에서 발달되었다. 따라서 두 종의 감염된 열매 내의 PR-10 단백질의 축적 및 위치를 명백하게 하기 위해 면역조직화학적 연구가 수행되었다. PR-10 단백질은 서열 분석으로부터 예측된 바와 같이 세포질액 내에 위치하고, 이는 어떠한 신호 펩타이드도 나타내지 않는다(도 5). CbPR-10의 더 높은 축적은 C. baccatum의 열매 표피 내에서 검출되었고, 또한 진균 유도된 축적은 감연 단계 동안 C. baccatum 내의 표피층 및 표피하층에서 훨씬 더 높았다.
E. coli에서 발현된 재조합 PR-10 단백질은 고추 총 RNA를 분열시키는 것으로 나타났으나 CbPR-10의 상대 활성은 CaPR-10 보다 훨씬 더 강했다(도 7. 8). CbPR-10의 생물학적 특성을 명백히 위해 재조합 CbPR-10의 항균 활성이 조사되었다. 진균의 정상 발달은 단백질의 적용에 의해 심각하게 손상되어 진균사가 연장하는 경향이 있고, 분지 특히 아프레소리움(appressorium) 형성이 진균 발달 동안 차단되었다. CaPR-10와 CbPR-10 사이의 항균 활성상의 유의적인 차이는 없었으나 진균 생존력은 CaPR-10보다 CbPR-10에 의해 효과적으로 손상되었다(도 9).
본 발명은 숙주 세포 내에서 CbPR-10의 발현을 제어하는 조절 뉴클레오타이드 서열과 결합된 CbPR-10의 뉴클레오타이드 서열을 포함한 발현 벡터를 포함한다. 숙주 발현 벡터 시스템은 E. coli 또는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물을 포함한다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(실시예)
재료 및 방법
식물 재료
콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum)에 저항성인 것으로 확인된 Capsicum baccatum cv. PBC80이 사용되었다. 감염성 식물로서 Capsicum annuum cv. Yeo-ju가 사용되었다. 식물은 25℃에서 보호된 온실에서 생장되었다. 8개월령 고추 식물의 충분히 생장된 미숙성 녹색 열매가 핵산 추출 및 병원균 접종에 사용되었다.
진균 병원균 및 접종
접종물 제제 및 인공 접종 절차는 Kim et al., Phytopathology 94: 1295-1304 (2004)의 방법을 약간 변형시켜 수행되었다. 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum)의 한국 분리체, KSCa-1가 탄저병 병원균으로서 사용되 었다. 분리체는 16시간 형광 및 8시간 어둠의 교대 조건하의 25℃에서 감자 덱스트로스 한천(PDA) 배지(Sigma, 미국) 상에서 생장되었다. 7일령 PDA 플레이트가 증류수로 범람되었고 진균 콜로니가 플레이트로부터 부드럽게 스크레이프되었다. 이후 현탁액이 4겹의 치즈클로쓰(cheesecloth)를 통해 여과되어 균사체 잔사를 제거하였다. 접종물 농도는 혈구계로 5 × 105 분생자/mL로 조정되었다. 상처 접종 방법으로서 정확하게 조정가능한 상처 깊이의 바늘로 특수화된 현미주사가 이용되었다. 떼어낸 열매는 증류수로 1회 세척되었고 열매 표피의 일반적으로 3군데에 0.8 mm의 깊이로 분생자 현탁액 2 ㎕로 주입되었다. 접종된 열매는 4겹의 젖은 키친 타월로 적셔진 아크릴 박스에 놓였다. 아크릴 박스는 염화비닐 랩으로 단단히 밀봉되어 100% 가까이의 상대습도를 유지시켰고 25℃에서 인큐베이트되었다.
유전자 클로닝, 서열 및 유전자 발현 분석
총 RNA는 제조사의 지침에 따라 Rneasy Plant Kit(Quiagene, 독일)를 이용하여 감염된 미숙성 열매로부터 추출되었다. 전방 프라이머, 5'ATGGGTGCTTATACCT 3'(서열번호: 5) 및 역 프라이머 5'TTAAACATAGACAGAAGGAT3'(서열번호: 6)이 RT-PCR에 사용되었다. 전체 길이 cDNA의 PCR 생성물이 pGEMT-easy 벡터(Promega, 미국) 내로 클론되었고 시퀀스되었다. cDNA 시퀀싱은 ALFexpress 자동화 DNA 시퀀서 (Amersham, 영국)으로 수행되었다. 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열의 분석은 윈도우즈용 DNASIS 서열 분석 소프트웨어 버전 2.1(Hitach, 미국)으로 수행되었다. 상동성 검색을 위해 cDNA 서열은 BLAST 전자 서버를 이용하여 NCBI 비여유구동 데이터베이스 내의 서열과 비교되었다. PR-10 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 RT-PCR 분석이 주형으로서 감염된 열매로부터 추출된 총 RNA 100 ng을 이용하여 수행되었다.
PCR에 의한 gDNA의 클로닝
CbPR-10 유전자의 코딩 구역은 주형으로서 C. baccatum의 gDNA로부터 PCR에 의해 증폭되었다. 사용된 프라이머는 5'ATGGGTGCTTATACCT3'(서열번호: 7) 및 5'TTAAACATAGACAGAAGGAT3'(서열번호: 8)이었다. 이후, 역 PCR을 이용하여 CbPR-10 유전자의 업스트림 구역을 클론하기 위해 고추 게놈 DNA가 HindⅢ로 분해되었고 자가-라이게이트되어 환형 DNA 단편을 형성하였다. 이들은 PR-10 서열의 N-말단에 상응하는 프라이머 세트로 LA 또는 Ex Taq 중합효소(TaKaRa, 일본)을 이용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 온도 사이클은 하기와 같다: 1분간 94℃ 후, 1분간 94℃, 3분간 60℃ 및 1분간 70℃의 30 사이클. CbPR-10 서열의 일부를 포함한 1.2 kb PCR 생성물은 Topo 벡터(Invitrogen, 미국) 내로 서브-클론되었고 시퀀스되었다.
SDS-PAGE, 웨스턴 블럿 분석 및 면역조직화학
SDS-PAGE는 Laemmli UK, Nature 227: 680-685 (1970)에 따른 12% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리되고 플르오르화폴리비닐리덴(PVDF) 멤브레인 상에서 전기이동된 총 단백질로 수행되었다. 면역블럿 분석을 위해 1차 항체는 1:1500로 희석되어 사용되었다. 알칼리성 포스파타제에 결합된 염소 항-래트 항체가 1:5000로 희석되어 2차 항체로 사용되었다. 2차 항체는 루미놀(ECL, 미국)로 시각화되었다.
면역위치화 연구를 위해 고추 열매는 pH 7.0의 100 mM 인산나트륨 완충액 내의 1% 글루타르알데하이드/3% 파라포름알데하이드 내에서 고정되고, 에탄올 내에서 탈수되고 파라핀 내에 매몰되었다. 조직은 10 ㎛의 두께의 조각으로 가로-절단되었다. 면역표지를 위해 탈파라핀화된 섹션이 12℃에서 12시간 동안 1차 항체와 인큐베이트되었다. 재조합 CaPR-10 단백질에 대한 폴리클론 항체가 1:2000로 희석되어 사용되었다. 대조군 조직은 프리-이뮨(pre-immune) 혈청과 인큐베이트되었다. 이후 섹션은 비오틴화된 염소 항-래트(DAKO, 미국)의 2차 항체와 인큐베이트되었다. 검출을 위해 2차 항체는 제조사(DAKO, 미국)의 지침에 따라 3-아미노-9-에틸카르바졸(ethylcarbazole)로 착색되었다.
재조합 CaPR-10 및 CbPR-10 단백질
CaPR-10 또는 CbPR-10 cDNA의 오픈 리딩 프레임은 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭되었고 EcoRI와 XhoI 사이트 사이에서 발현 벡터 pGEX6p-1(Pharamcia Biotech, 스웨덴) 내의 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 코딩 서열과 함께 인-프레임(in-frame)으로 삽입되었다. 각각의 GST 융합 단백질은 E. coli 내에서 발현되었고 제조사의 지침에 따라 정제되었다. 단백질 농도는 Bradford 방법(Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976))에 의해 측정되었다. 프리시즌 프리테아제(PreScison Pretease) 분해 후 순수 CaPR-10 또는 CbPR-10 단백질이 리보뉴클레아제 및 항균 활성 분석에 사용되었다.
재조합 CbPR-10 단백질의 리보뉴클레아제 활성
RNA 분해 에세이는 Bantignies et al., Plant Mol biol. 42: 871-81 (2000)에 의해 기술된 방법에 따라 수행되었다.
CbPR-10 단백질의 항균 활성
C. acutatum의 단일클론 KSCa-1 분리체는 28℃에서 암조건으로 7일간 감자 덱스트로스 한천(Difco, 미국) 상에서 배양되었다. 포자가 채취되었고 멸균 증류 수 내에 현탁되었다. 포자 현탁액의 10 마이크로리터(밀리리터당 5×105 포자)가 10 ㎕의 재조합 단백질 또는 PBS 완충액으로 보정된 드롭(drop) 배양에 사용되었고 커버 글라스가 적용되었다. 커버 글라스는 24시간 동안 암조건으로 25℃에서 습윤 챔버 내에서 인큐베이트되었다. 진균 생존력을 관찰하기 위해 발아된 포자가 Live/Dead 박테리아 생존력 키트(Molecular probe, 미국)로 염색되었다.
CbPR-10 cDNA의 클로닝 및 서열 분석
RT-PCR을 이용하여 cDNA 단편이 탄저병균, 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum)으로 감염된 캅시쿰 바카툼(Capsicum baccatum)의 미숙성 열매로부터 클론되었다. 전체 길이 cDNA 클론은 CbPR-10( C apsicum b accatum phatogenesis related protein 10)으로서 명명되었다. CbPR-10 cDNA는 480개 염기쌍(bp) 길이이고 18 킬로달톤(kDa)의 추정 분자량을 지닌 159개 아미노산의 추정 단백질을 인코드한다(도 2). CbPR-10 단백질은 PR-10 단백질간에 보존된 'P-루프'를 포함하고 NetPhos WWW 서버에 의해 예측된 일부 추정 인산화 사이트를 보유한다(도 3). CbPR-10 단백질은 C. annuum으로부터의 CaPR-10과의 95% 동일성(Park et al., Plant Journal 37: 186-198 (2004) 및 감자로부터의 STH-10 단백질과의 61% 동일성(Matton and Brisson, Mol Plant Microbe Interact 2: 325-331 (1989))의 매우 높은 상동성을 공유한다.
CbPR-10 gDNA의 클로닝 및 서열 분석
CbPR-10 유전자의 내부 구역에서 PCR 방법에 의해 클론되었다. CbPR-10이 CaPR-10 유전자와 96%의 동일성을 나타내기 때문에 프라이머는 CaPR-10 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기반하여 고안되었다. 증폭 생성물의 1025 bp는 인트론 서열 및 3' UTR 구역에 사이에 있는 2개의 엑손으로 구성된다. 이후 역(inverse) PCR(iPCR)이 수행되어 유전자의 조절 구역을 클론하였다. 1.3 kb의 생성물은 HindⅢ으로 분해된 C. baccatum gDNA를 포함한 PCR 반응에 의해 증폭되었다. 프로모터 서열은 ATG 개시 코돈의 1154 bp 업스트림의 구역으로 측정되었다. SA-반응성 요소(TCA), 유인제-반응성 요소(ELI 박스), 열충격 요소(HSE), 상처 반응성 요소(WUN), TATA 박스 등과 같이 유도성 유전자 내의 앞서 특성화된 요소와 유의적인 유사성을 지닌 많은 서열이 확인되었다.
진균 감염에 의한 PR-10 유전자의 유도
진균 감염 동안 PR-10의 발현을 평가하기 위해 탄저병균의 포자 현탁액이 접종되어 각각 C. baccatum 및 C. annuum의 미숙성 열매 내의 저항성 및 민감성 반응을 유도하였다. 반-정량성 역중합효소 연쇄반응(RT-PCR)이 다른 질병 증상을 나타내는 두 열매에서 수행되었다(도 4A). 결과는 C. baccatum 내의 CbPR-10의 mRNA 수준이 접종 후 첫 번째 날에 유도되고, 두 번째 날에 절정에 달한 후 감소됨을 나타내었다. 그러나 C. annuum의 CaPR-10의 유도된 수준은 훨씬 더 낮은 수준으로 첫 번째 및 세 번째 날에 이중 발현 패턴을 나타내었다.
진균 감염에 의한 PR-10 단백질의 유도 및 인산화
항-PR-10 항체를 이용하여 예측된 크기 18 kDa를 지닌 PR-10에 상응하는 18 kDa 단백질이 탄저병균으로 감염된 고추 열매에서 검출되었다(도 4B). 저항성 반응에서 면역블럿 분석은 CbPR-10 단백질 수준이 C. baccatum의 열매 내에서 탄저병균으로의 감염 후 첫 번째 날에 다소 증가되었고, 더욱 유지됨을 나타내었다. 그러나 민감성 반응에서 CaPR-10 기저 수준은 C. annuum 내에서 첫 번째 날에 유의적으로 감소한 후 다소 증가되었다. 예측된 크기 19 kDa을 지닌 인산화된 PR-10 단백질은 C. baccatum의 감염된 열매에서 뚜렷하게 검출가능한 반면 C. annuum 내에서는 검출 불가능하였다. 약 20 kDa의 분자량을 지닌 알려지지 않은 약한 밴드가 C. baccatum 및 C. annuum 내에서 항-CaPR-10 항체와 교차-반응하였다. 이들 데이터는 CbPR-10 단백질의 인산화가 탄저병균에 대한 C. baccatum의 열매의 저항성 반응에 아마도 관련됨을 나타낸다.
감염된 고추 열매 내에서의 PR-10 단백질의 면역위치화
진균 감염 동안 PR-10 단백질의 위치 및 축적을 명백히 하기 위해 단백질의 면역조직화학적 조사가 두 종의 열매의 가로절단-섹션으로 수행되었다. 섹션은 각각 0. 24, 48 및 72 HAI에서 탄저병균으로 감염된 미숙성 열매로부터 준비되었다(도 5). PR-10 단백질의 축적은 0 HAI에서 두 열매 모두에서 외부 표피 세포에는 거의 위치하지 않았다. 진균 감염 후 PR-10 축적은 열매의 표피 세포 및 표피-하층에서 점진적으로 증가되었다. 그러나 단백질의 양은 C. baccatum 보다 C. annuum의 열매 내에서 유의적으로 높았다. 결과는 CbPR-10 단백질은 정상 발달 동안 고추 열매의 표피 세포 내에 위치함을 나타낸다. 진균 유도된 CbPR-10 축적은 C. baccatum의 열매의 표피 세포뿐만 아니라 피질 유조직 세포 내에 대량으로 발생한 반면 훨씬 더 적은 양의 CaPR-10 단백질은 C. annuum의 정상 또는 감염된 열매 내에서 관찰되었다.
재조합 CbPR-10 단백질의 리보뉴클레아제 활성
CbPR-10 단백질의 기능적 활성을 평가하기 위해 재조합 CbPR-10 단백질이 E. coli에서 발현되고, 정제되고(도 6), Bantignies et al. Plant Mol. biol. 42: 871-81 (2000)의 방법에 따라 리보뉴클레아제 활성을 시험하였다. 미숙성 고추 열매로부터 추출된 총 RNA는 CaPR-10 또는 RNase A(SIGMA, 미국) 뿐만 아니라 재조합 CbPR-10로 인큐베이트되었다. RNase A는 양성 대조군으로 사용되었고 재조합 CaPR-10 단백질은 C. annuum와 C. baccatum 사이의 상대 효소 활성의 비교를 위해 사용되었다. 도 7에서 CbPR-10 보다 상대적으로 더 강한 CbPR-10의 효소 활성이 아가로스 겔 내의 분해 생성물의 더 빠른 이동에 의해 나타났다. 또다른 대조군으로서 RNase A는 동일한 조건 하에서 고추 RNA를 완전히 분해한다. 도 8은 시간 경과 동안 상대 효소 활성이 CaPR-10와 CbPR-10 사이에서 비교되었다. 결과는 CbPR-10가 CaPR-10보다 훨씬 더 강한 리보뉴클레아제 활성을 지님을 나타내었다.
재조합 CbPR-10과 CaPR-10 단백질 사이의 항균 활성
재조합 CbPR-10의 항균 활성이 식물 내의 CbPR-10의 생물학적 특성을 명백히 하기 위해 조사되었다. 탄저병균의 생장 상의 CbPR-10의 효과를 조사하기 위해 재조합 CbPR-10 단백질이 진균 포자로 보정되었다. CaPR-10 단백질의 관련 활성은 양성 대조군으로 비교되었다. 진균 포자는 1시간에 발아하기 시작하였고 커버 글라스의 표면의 침착 6시간 후 첫 번째 아프레소리움을 발달시켰다. 그러나 진균의 정상 발달은 재조합 PR-10 단백질의 적용에 의해 심하게 손상되었다. 낮은 농도의 단백질에서 균사의 끝은 연장하고 아프레소리움을 발달시키지 않고 분지되는 경향이 있었다(도 9). 포자의 발아는 0.5 mg/ml의 CaPR-10와 CbPR-10 단백질 모두에서 완전히 차단되었다. 더욱이 비정상 생장을 나타내는 진균의 생존력은 Live/Dead 박테리아 생존력 키트(Molecular probe, 미국)로 염색함으로서 조사되었다. 결과는 진균의 생존력이 0.05 mg/L 정도로 낮은 PR-10 단백질로 심하게 영향을 받는 것을 나타내었다.
본 발명의 효과는 고추(Capsicum baccatum)로부터의 발병기전 관련-10(CbPR-10) 단백질을 인코드하는 DNA 서열을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 식물의 형질전환 또는 산업적 이용을 위해 유전자 구조물 내에 발명되거나 다른 적당한 프로모터 및 터미네이터와 융합된 cDNA 서열을 포함한 서열을 제공한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 캅시쿰 바카툼(Capsicum baccatum)으로부터의 발병기전 관련 단백질 10(CbPR-10)을 인코드하는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 지니는 분리된 핵산 분자
  2. 삭제
  3. 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드와 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 지니는 프로모터 서열을 포함하는 조절 서열로 구성된 E. coli 또는 식물 세포의 형질전환용 발현 벡터
  4. 미생물 또는 식물 세포 내에서 제 3항의 발현 벡터의 발현에 의해 수득된 서열번호 2의 아미노산 서열을 지니는 단백질
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
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