KR20030042947A - 나팔꽃 씨에서 유래한 신규의 항균성 펩타이드, 이를코딩하는 ｃＤＮＡ 및 이를 도입한 병 저항성 형질전환식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나팔꽃 씨에서 유래한 항균성 펩타이드를 코딩하는 cDNA, 이 cDNA가 재조합된 식물체 전이용 벡터 및 이를 이용하여 제조된 강력한 병원균 저항능을 나타내는 형질 전환 식물체(transgenic plant)에 관한 것이다.

본 발명의 cDNA에 의해 코딩된 항균성 펩타이드(Pharbitis nilantimicrobial peptide)는 다양한 병원균에 대하여 우수한 항균 활성을 가지므로, 이 유전자를 식물 세포에 도입하여 항균 활성을 가지는 형질 전환 식물체를 제공할 수 있다.

Description

나팔꽃 씨에서 유래한 신규의 항균성 펩타이드, 이를 코딩하는 ｃＤＮＡ 및 이를 도입한 병 저항성 형질전환 식물체{Antimicrobial peptides isolated from the seed of Pharbitis nill, cDNA encoding the same and disease resistant transgenic plant prepared by overexpressing the gene}

본 발명은 나팔꽃 씨(Pharbitis nill seed)에서 유래한 강력한 항균성 펩타이드 pn-AMP1를 코딩하는 cDNA, 이 cDNA가 재조합된 식물체 전이용 벡터 및 이를 이용하여 제조된 항균 활성을 가지는 형질전환 식물체(transgenic plant)에 관한 것이다.

농작물은 고착생활을 함으로서 끊임없이 수많은 병원균(곰팡이, 세균, 바이러스 등)들의 공격을 받게 되고 여러 가지 질병에 걸리게 되어 엄청난 수확량의 감소를 유발하게 된다. 이러한 병원균에 의한 농작물의 피해는 농업 생산성에 가장 큰 영향을 주는 중요한 요인일 뿐만 아니라 생산성 향상을 위하여 사용하는 농약으로 인하여 환경오염이라고 하는 심각한 문제를 새로이 야기시킴으로서 돌이킬 수 없는 자연환경의 파괴와 회복 불능의 환경을 만들어 내고 있다(Sherman JD et al., Arch. Environ. Health., 52, 332-333, 1997). 뿐만 아니라, 농약을 살포하는 농민들의 경우 맹독성의 농약을 인체에 흡입하므로서 인체내의 축적과 불치의 유전병이 생성되게 되고, 잔류농약의 흡수에 의한 소비자들에게도 치명적인 건강상의 손실을 유발시키게 된다(London et al., Scan. J., Work. Environ. Health., 24, 18-29, 1998).

따라서, 식물의 병 방제와 농약사용으로 인한 환경오염이나 인체 축적에 의한 치명적 질병 발생 등을 방지할 수 있는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 그 예로서 생물체내에 존재하는 병원균 살균 단백질의 탐색과 분리 및 이들을 코딩하는 유전자의 클로닝과 이들을 이용한 내병성 형질전환 식물체에 대한 개발이 이루어지고 있다. 특히, 식물의 경우에는 고등동물과 달리 병원균으로부터 자신을 보호할 수 있는 별도의 면역체계를 가지고 있지 않으며, 주로 시스테인(cysteine)과 글리신(glycine)이 풍부한 다양한 작은 항균성 단백질을 발현하므로써 병원군의 침입으로부터 자신을 보호하고 있기 때문에, 2kD~9kD의 크기를 갖는 항균성 단백질에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있는 실정이다.

이러한 항균성 단백질로는 티오닌(thionins; Bohlmann et al., Annul. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 227-240, 1991), 식물 디펜신(plant defensins; Gao et al., Nature Biotech. 18, 1307-1310, 2000), 지질 전이 단백질(lipid transfer proteins; Garcia-Olmedo et al., Trends Microbiol. 3, 72-74, 1995), 히베인형 펩타이드(hevein type peptides ; Koo et al., Biochim. Biophys. Acta, 1382, 80-90, 1998), 나틴형 펩타이드(knottin-like peptides; Cammue et al., J. Biol. Chem. 267, 2228-2233, 1992), MBP1(Duvick et al., J. Biol. Chem. 267, 18814-18820, 1992), 1bMBP(Tailor et al., J. Biol. Chem. 272, 24480-24487, 1997), 스네이킨(snakins; Segura et al., Mol. Plant-Microbe. Interact. 12, 16-23, 1999) 등의 여덟 종류가 현재 알려져 있다. 이들 펩타이드들은 그들의 항균 활성과 형질전환 식물의 식물 병원균에 대한 증가된 저항성(Gao et al., Nature Biotech. 18, 1307-1310, 2000 and Terras et al., J. Biol. Chem. 267, 15301-15309 )으로 인하여 식물 방어 기작에 있어 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각되어진다.

따라서, 농작물에 감염되는 각종 병원균의 방제나 살균과정에 엄청난 양으로사용되어 자연환경의 파괴와 농축산물을 포함한 인체에의 치명적 손상을 유발하는 농약의 과다투여 방지를 위하여 상기에서 보고된 펩타이드 이외에 강력한 병원균 저항성 무공해 생물농약의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들도 인체나 농작물에 손상이 없으며 식물 병원균을 강력하게 살균할 수 있는 병원균 저항성 펩타이드를 분리하고자 연구하게 되었고, 그 결과, 나팔꽃 씨에 티오닌과 유사한 항균특성을 나타내는 히베인형 펩타이드 Pn-AMP1 및 Pn-AMP2가 존재함을 발견하고, 이들 항균성 펩타이드의 분자량과 N-말단 아미노산 서열을 결정하였다(Koo et al., Biochim. Biophys. Acta, 1382, 80-90, 1998).

본 발명자들은 계속된 연구로, 상기 Pn-AMP1 펩타이드의 N-말단 아미노산 서열에 기초하여 올리고 뉴클레오타이드 프로브 (probe)를 제조하고, 이를 사용하여 cDNA 라이브러리 (cDNA library)를 제작한 다음, 이로부터 강력한 항균활성을 갖는 항균성 펩타이드 pn-AMP1을 코딩하는 cDNA를 분리하여 이를 벡터에 클로닝하였다. 이어서, 이 벡터로 형질 전환시킨아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용하여 강력한 항균성 펩타이드가 다량으로 발현되는 형질전환 식물체를 제조하여, 이 식물체가 우수한 병원균 저항성을 보임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 나팔꽃의 씨로부터 유래한 강력한 신규의 항균성 펩타이드 pn-AMP1을 코딩하는 cDNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 cDNA를 포함하는 식물체 전이용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 식물 전이용 벡터로 형질 전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 강력한 항균성 펩타이드pn-AMP1유전자를 도입하고 이 유전자가 코딩하는 펩타이드를 대량으로 발현하여 강력한 항균 활성을 갖는 형질 전환 식물체를 제공하는 것이다.

도 1의 A는 항균성 펩타이드 유전자pn-AMP1의 염기 서열과 이로부터 추론한 아미노산 서열(염기 서열의 아래에 단일 문자로 표시)을 나타낸 것이다.

<도면 기호의 설명>

검정 박스: 예측되는 머추어 펩타이드(mature peptide)

밑줄: 예측되는 폴리-A 시그널

오른쪽 숫자: 뉴클레오타이드와 아미노산의 숫자

별표: 정지 코돈

도 1의 B는 나팔꽃의 씨에서 분리한 성숙한 항균성 신규의 펩타이드(mature Pn-AMP1)의 아미노산과pn-AMP1cDNA에서 예측되는 아미노산 서열을 비교한 것이다.

<도면 기호의 설명>

점: 나팔꽃 씨에서 분리한 항균 펩타이드 Pn-AMP1과pn-AMP1cDNA로부터 추론한 아미노산 서열을 비교하였을 때 동일한 아미노산들을 표시함.

우측숫자 1/25: pn-AMP1의 전구체중 N-말단 절단부위를 구성하는 25개 아미노산 (N-terminal signal peptide)의 개수.

우측숫자 1/41: pn-AMP1의 머추어 펩타이드(mature peptide)의 아미노산 개수.

우측숫자 26/66: pn-AMP1의 전구체중 N-말단부위로부터 계산한 아미노산의 개수.

우측숫자 67/91: pn-AMP1 전구체의 N-말단부위로부터 C-말단부위까지 포함한 전체 펩타이드의 아미노산 개수.

도 2는 나팔꽃 게놈에서 항균성 펩타이드 유전자의 갯수를 알아보기 위한 서든 블랏 분석(southern blot analysis)결과를 나타낸 것이다

<도면기호의 설명>

왼쪽의 숫자: DNA 사이즈 마커 (size marker)

XbaI, EcoRI, ClaI, EcoRI/ClaI: 나팔꽃 씨에서 분리한 게놈 DNA를 XbaI, EcoRI, ClaI, EcoRI/ClaI의 제한효소를 사용하여 절단한 후³²P[dATP]로 표지된 pn-AMP1 유전자를 이용하여 혼성화한 서든 블랏 분석(southern blot analysis) 결과밴드 (hybridization bands)

도 3은 나팔꽃의 각 조직(잎, 뿌리, 자엽)과 씨에서pn-AMP1전사체의 발현양상을 관찰하기 위한 노든 블랏 분석(northern blot analysis) 결과이다.

<도면기호의 설명>

dpa: 개화후 경과한 일수

rRNA: 대조구로 사용한 라이보조말(ribosomal) RNA의 발현량

도 4의 A는 형질전환 담배를 제조하기 위하여 만든 재조합 DNA 벡터이다.

도 4의 B는 T2 형질전환 담배에서 pn-AMP1의 발현을 확인하기 위하여 웨스튼 블랏 분석(western blot)을 수행한 결과이다.

<도면기호의 설명>

RB: 우측보드(right board)

LB: 좌측보드(left board)

BamHI, PstI, HindIII, XbaI, ClaI, BglII: 벡터내에 존재하는 제한효소자리

NPTⅡ: 네오마이신 포스포 트랜스퍼레이즈(neomycin phosphotransferase).

pn-AMP1cDNA: 나팔꽃 씨의 항균 펩타이드 유전자

2'/7': 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유전자중 2'/7' 유전자의 비해독 (untranslated) 유전자 염기서열.

도 4의 B의 왼쪽에 표기된 숫자: 표준 단백질의 분자량

PMC :pn-AMP1유전자를 도입하여 자가증식시킨 제 2후손 세대 (T2-generation)의 형질 전환 담배 라인(transgenic plant lines).

도 5의 A는 파이토푸소라 파라시티카(Phytophthra parasitica)의 균사를 포함하는 두개의 아가 플럭(agar plugs)을 한달간 무균상태에서 키운 형질전환 담배 (PMC12 라인)와 와일드 타입 (wild-type) 담배에 12일 동안 감염시킨 뒤의 사진이다.

도 5의 B는pn-AMP1유전자를 과량발현시킨 (over-expression) 형질 전환 담배의파이토푸소라 파라시티카에 대한 저항성을 정량적으로 분석한 결과이다.

도 5의 C는 형질전환 담배 식물체 (PMC12 라인)에 병원성 곰팡이를 감염시킨 후 9일째 나타난 형질 전환 식물체의 항균 능력을 대조구 식물체 전체와 비교한 사진이다.

도 5의 D는 형질전환 담배 식물체 (PMC12 라인)에 병원성 곰팡이를 감염시킨 후 9일째 나타난 형질 전환 식물체로부터 병원균을 살포한 부분 (dropping region)의 항균 능력을 대조구 식물체로부터 떼어낸 잎과 비교하기 위하여 잎을 떼어낸 후 찍은 비교 사진이다.

<도면기호의 설명>

pnAMP:pn-AMP1유전자를 도입하여 pn-AMP1 펩타이드를 과량 발현시킨 (over-expression) 형질전환 담배 식물체.

Vector: 재조합 식물체 전이용 벡터인 pGA643만을 도입하여 제조한 형질전환 담배 식물체.

이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.

본 발명에서는 나팔꽃의 씨로부터 분리되고, 다양한 식물 병원균에 강력한 항균 활성을 갖는 펩타이드 Pn-AMP1의 N-말단 아미노산 서열로부터 제작한 cDNA 라이브러리에서 이에 상응하는 cDNA를 분리하였다(pn-AMP1). 분리된 cDNA로부터 추론한 머추어 단백질 (mature protein) 부분의 아미노산 순서는 나팔꽃의 씨로부터 분리한 Pn-AMP1 펩타이드와 정확하게 일치함을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터, 본 실험에서 클로닝한 유전자는 Pn-AMP1 펩타이드를 코딩하는 정확한 유전자라는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 식물 병원균에 대하여 저항성이 강한 형질 전환 식물체를 제조하는데 사용할 수 있는pn-AMP1의 cDNA를 포함하는 식물 전이용 벡터 및 이 벡터로 형질 전환된 형질전환 미생물을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시예로서pn-AMP1cDNA 절편을 바이너리 벡터(binary vector)인 pGA643 벡터의 XbaI/ClaI 부위에 클로닝하여 재조합 식물체 전이용 벡터인 pn-AMP1-643을 제조하였다. 이어서,이 재조합 벡터를 이용하여 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA101을 형질 전환시켜 항균성을 갖는 형질 전환 식물체의 제조시 매개체로 사용될 수 있는 형질 전환 미생물을 수득하였고, 이 미생물을 이용하여pn-AMP1를 식물체에 도입하여 형질 전환 식물체를 제조하였다.

이어서, 본 발명의 pn-AMP1 펩타이드를 발현하는 항균성 형질 전환 식물체의 일례로서, 상기아그로박테리움 투머파시엔스를 이용하여 잎 조작 형질 전환 방식으로 담배 잎 세포에pn-AMP1cDNA를 도입한 후, 식물 호르몬을 조절하여 담배 잎 절편체로부터 pn-AMP1 펩타이드를 발현하는 형질 전환 담배를 제조하였다. 이러한 형질 전환 담배로부터 분리한 pn-AMP1 펩타이드를, 와일드 타입 (wild-type)의 나팔꽃 씨로부터 분리한 Pn-AMP1 펩타이드와 항균 활성을 비교해 본 결과, 항균력에 있어서 거의 비슷한 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터, 본 실험에서 클로닝한pn-AMP1유전자를 도입하여 제조한 형질전환 담배는 와일드 타입 (wild-type)의 나팔꽃 씨에서 생성되는 Pn-AMP1과 거의 같은 활성의 펩타이드를 생성함을 알 수 있었다. 또한, 형질 전환 식물체의 식물 병원균에 대한 저항성을 측정하고자, 파이토푸소라 파라시티카(phytophthra parasiticavar. nicotianae)의 균사와 포자낭을 포함하는 아가 플럭을 감염시키거나 분리된 포자낭을 직접 형질 전환 담배 잎에 감염시켰다. 그 결과, 감염 3일 후 벡터만으로 형질 전환된 담배는 잎이 시드는 질병 증상이 나타나기 시작하여 감염 9일 후에는 잎이 완전히 고사하고 줄기가 부패하여 사멸되었으나, pn-AMP1이 높은 수준으로 발현되는 형질 전환 담배는파이토푸소라 파라시티카감염에 대한 증상이 나타나지 않고 건강한 상태를 유지하였다. 이러한 결과는 본 발명의pn-AMP1을 코딩하는 유전자를 일반적인 형질전환 식물체의 제조 방법에 따라 목적하는 식물 세포에 도입하므로써 농작물을 비롯한 각종 식물체의 항균성을 효과적으로 증식시킬 수 있음을 제시한 것이다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 자세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

1-1. pn-AMP1 cDNA의 분리

나팔꽃의 씨로부터 토탈 RNA (total RNA)를 분리한 뒤 이를 이용하여 두가닥 cDNA (double stranded cDNA)를 합성하였다. 이 cDNA를 pBluscriptII SK(-) 벡터(프로메가 회사, 미국)의EcoRI과XhoI자리로 클로닝하여 플라스미드 cDNA 라이브러리를 작성하였다. 이를 대장균에 도입하여 1차로 10⁴콜로니가 생성되었고, 콜로니 혼성화(colony hybridization)을 통하여pn-AMP1cDNA를 선별하였다.

pn-AMP1cDNA 선별을 위한 프로브 (probe)를 얻기 위해서 Pn-AMP1 펩타이드(Koo et al., Biochim. Biophys. Acta, 1382, 80-90, 1998)의 17에서 25번 아미노산에 해당하는 프라이머 [5-TG(C/T) TG(C/T) (A/T)(C/G)N CA(A/G) TGG GGN TA(C/T) GG-3]와 oligo(dT)17 프라이머를 이용하여 PCR (94℃, 5분, 변성/ 94℃, 30초- 50℃, 30초, 20회 증폭/ 72℃, 1분 프라이머 연장)을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물(약 500bp)을 아가로스 겔로부터 회수하여³²P-[dATP]로 표시한 뒤 사용하였다.

상기 방법으로 얻어낸 클론은 생거 디데옥시 (dideoxy) DNA 염기 서열 결정 방법에 따라 자동화 염기 서열 결정기(automatic DNA Sequencer, Applied iosystems model 373A)를 이용하여 염기 서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 서열번호 1에 나타내었으며, 이로부터 추론되는pn-AMP1의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내었다. 또한, 도 1의 A에도pn-AMP1의 염기 서열과 추론되어지는 아미노산 서열을 나타내었다. 이들로부터,pn-AMP1은91의 아미노산을 코딩하는 273bp 의 단백질 합성 명령신호 (open reading frame)를 가지는 583bp의 cDNA라는 것을 알 수 있다.

1-2. pn-AMP1 유전자로부터 추론되어지는 아미노산 서열과 나팔꽃으로부터 분리한 Pn-AMP1 펩타이드의 아미노산 서열 비교

pn-AMP1의 cDNA로부터 추론되어지는 아미노산 서열과 본 실험실에서 여러 가지 크로마토 그래피 방법을 사용하여 나팔꽃 씨에서 분리한 Pn-AMP1 단백질 (Koo et al., Biochim. Biophys. Acta, 1382, 80-90, 1998)의 아미노산 서열을 비교해 보았을 때pn-AMP1은 N-말단의 시그널 펩타이드(signal peptide, 25 잔기), 머추어 단백질(mature protein, 41잔기) 그리고 C-말단 서열(27잔기)로 구성된 전구체 단백질 (precursor protein)로서 발현되어지는 것으로 생각되어진다. 추론 되어지는 N-말단의 25 잔기의 시그널 펩타이드(signal peptide)는 다른 시그널 서열에서 관찰되어지는 (-1,-3)법칙을 따르나, 추론된 C-말단은 다른 단백질과 서열 유사성을 나타내지 않았다.

나팔꽃의 지노믹(genomic) DNA가pn-AMP1과 유사한 펩타이드를 코딩하는 멀티-진(Multi-gene) 패밀리(family)를 갖는지를 알아보기 위하여³²P-[dATP]로 표시된pn-AMP1cDNA를 프로브 (probe)로 하여 서든블랏 (Southern blot) 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 2 전기영동의 각 레인 (lane)에서 명확한 두개의 밴드를 확인할 수 있었다. 이 결과로부터pn-AMP1유전자는 나팔꽃의 지노믹 (genomic) DNA에서 두 개의 유전자로 구성되어 있음을 확인할 수 있음으로서 pn-AMP1 이외에 이와 유사한 염기서열을 가진 유전자가 한 개 더 존재할 것으로 추정할 수 있었다.

그러므로, 본 발명에서 분리한pn-AMP1cDNA가 만드는 항균성 펩타이드는 나팔꽃 씨에서 분리한 Pn-AMP1 단백질처럼 다양한 병원균에 강한 항균력을 나타내며 식물체내에서 병 저항성 기능을 수행하는데 대단히 중요한 기능을 수행할 것이다.

<실시예 2>pn-AMP1유전자의 발현 양상의 비교

상기 실시예 1에서 분리한pn-AMP1cDNA의 발현 양상을 비교, 관찰하기 위하여 나팔꽃으로부터 분리된 여러 가지 조직과 개화 시기별로 채취한 RNA를 이용하여 노던 블랏 분석(northern blotting analysis)을 수행하였다. 노던 블랏 분석 방법은 다음과 같다.

잎, 뿌리, 자엽, 개화 후 20일, 30일, 40일 및 50일이 지난 시료로부터 각각의 RNA 20㎍을 1.5% 포름알데하이드-아가로스 겔(formaldehyde-agarose gel)에서 분리한 후, 나이론 멤브레인(nylon membrane)으로 이동시켰다. 이 멤브레인을 자외선(UV)에 쬐인 후, 0.5M NaHPO₄(pH 7.2, 1mM EDTA, 1% BSA) 및 7% SDS의 용액에서 65℃의 조건 하에서 방사선 동위원소로 표지된pn-AMP1cDNA 프로브(probe)를 넣고 하루 동안 반응시켰다. 이 멤브레인 (membrane)을 2XSSC(0.3M NaCl, 0.03M 소듐싸트레이트)로 37℃에서 15분 동안 2번 세척한 후, 다시 0.1%의 SDS를 포함하는 0.2X SSC 용액으로 60℃에서 15분 동안 2번 세척하였다. 이 멤브레인을 말려서 -70℃에서 X-ray 필름에 노출시켜 도 3을 얻었다. 도 3로부터,pn-AMP1전사체는 건조 초기 상태의 씨(개화 후 30일)에서 발현되기 시작하여 완전 건조 상태의 씨(개화 후 50일)에서 최대로 발현됨을 알 수 있었다.

또한,pn-AMP1유전자가 환경적인 자극에 의해서 발현되는지를 관찰하기 위해서 2주된 나팔꽃의 잎에 1mM의 살리실산(salicylic acid), 0.1mM의 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 2mM의 에틸렌(ethylene; ethephone)과 같은 화학 유도제를 처리하여, 전사체의 양을 관찰하였다. 그 결과, 발현이 관찰되지 않았다. 따라서,pn-AMP1은 환경 자극에 의해서 발현되지 않으며, 성숙한 씨에서 발단 단계 특이적으로 발현하여 병원균으로부터 씨를 보호하는 역할을 수행할 것으로 판단되었다.

<실시예 3>pn-AMP1유전자를 도입한 식물체 전이용 벡터제조 및pn-AMP1유전자가 도입된 형질 전환 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 제조

pn-AMP1유전자를 도입한 식물체 전이용 벡터를 제조하기 위하여 ppn-AMP1cDNA 절편을 바이너리 벡터인 pGA643(An, G et al, 1998. Plant Mol. Manuals, Kluwer, Dordrecht, p. A3/1-A3/19, 1998)의 XbaI/ ClaI부위에 클로닝하여 콜리 플라워 모자이크 바이러스(CaM virus)의 35S 프로모터(promoter)와 2/7전사 종결자의 조절 하에서 발현될 수 있는 재조합 식물체 전이용 벡터인pn-AMP1-643을 제조하였다(도 4의 A). 도 4의 A에서 nptII는 네오마이신 인산전이효소 (neomycin phosphotransferase)로서 형질 전환 후 형질전환 식물체를 선별하기 위한 항생제 마커(marker)이다.

이어서, 상기 재조합 벡터pn-AMP1-643을 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA101 박테리아(크론텍, 미국)에 전기 충격법으로 형질 전환시킨 다음, 10㎍의 카나마이신 및 5㎍ 테트라사이클린을 포함하는 YEP 아가 플래이트 선택 배지에 도말하고, 28℃에서 2일 동안 배양하여 형질 전환된 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 선발하였다.

<실시예 4>pn-AMP1유전자가 과량 발현된(perexpression) 형질 전환 담배의 제조.

아그로박테리움을 매개로 하는 잎 조작 형질 전환법(Horsch et al., Science, 227, 1229-1231, 1985)으로pn-AMP1을 대량으로 발현하는 형질 전환 담배를 제조하였다.

즉, 무균 상태에서 배양한 담배의 잎을 절편으로 만들고 절편체에 상처를 가한 후, 이를 28℃ 혼탁 배양기에서 600nm에서의 흡광도가 0.5 정도가 (O.D₆₀₀= 0.5)되도록 배양한 상기 형질 전환된아그로박테리움 투머파시엔스와 공배양하였다. 공배양은 공동 배양 배지(MS 기본 배지, 2㎎/ℓNAA, 0.5㎎/ℓ BAP)에 절편체를 띄우고, 배양한아그로박테리움 투머파시엔스를 첨가한 후, 28℃에서 암 상태로 48시간 동안 배양하는 것이다. 공배양 후, 모든 잎 절편체를 MS 액체 배지에서 세척한 뒤, 이를 MS 0.5배지(MS 기본배지, 0.5㎎/ℓ BAP, 100㎎/ℓ 카나마이신, 250㎎/ℓ 카르베니실린(carbenicillin))에서 형질 전환 부정싹을 유도하였다. 이때 사용한 MS 0.5배지는 담배잎 절편체로부터 캘러스의 형성을 피하면서 부정싹을 유도하고, 100㎎/ℓ카나마이신을 첨가하여 형질 전환체만이 생존할 수 있도록 제작된 배지이다. 2주 마다 계대 배양하여 싹의 분화를 유도하고, 적절한 크기로 생장시킨 후 뿌리 분화 배지(MS 기본 배지)로 옮겼다. 기내에서 뿌리를 분화시킨 형질 전환 담배 식물체를 토양의 새 환경 조건에 순화시키기 위하여 먼저 기내에서 식물체를 꺼내고, 한천을 깨끗하게 제거하여 살균된 토양에 옮겼다. 토양에 옮긴 식물체는 높은 습도 조건의 밀폐된 조건 하에서 생장시키면서 서서히 외부 환경에 순화시켰다. 이런 방법으로 형질 전환 담배를 제조하였다.

<실시예 5> 형질 전환 담배에서 pn-AMP1 펩타이드의 발현검정 및 항균 활성측정

5-1. 웨스턴 블랏 분석

실리카겔 C-18 메트릭스에 결합시킨 Pn-AMP1 펩타이드를 혼성화 액과 섞은 후 토끼의 피하 조직에 2주 간격으로 주사하여 Pn-AMP1에 대한 폴리클로날 항체(polyclonal antibody)를 제조하였다. 이러한 방법으로 제조한 항체를 이용하여 형질 전환 담배에서 많은 양의 pn-AMP1을 발현하는 T1과 T2세대의 개체를 선정하기 위하여 웨스턴 블랏 분석 (Western blot)을 수행하였다.

즉, 형질전환 담배 잎으로부터 단백질을 추출하고, 열에 변성되는 단백질들을 제거하기 위하여 이를 80℃에서 15분 가열하였다. 원심분리에 의하여 침전물들을 제거한 후 15% SDS 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동하였다. 그리고, 전기이동법으로 분리된 단백질을 니트로 셀룰로스(nitro-cellulose) 멤브레인(membrane)으로 이동시킨 다음 anti-Pn-AMP1 항체를 이용하여 반응시켰다. ECL 검출 용액의 발색 반응을 이용하여 본 발명에서 제조한 35개의 카나마이신 저항성 담배 개체에서 pn-AMP1 펩타이드가 발현됨을 확인하였다. 자가 수분된 T1은 카나마이신 (kanamycin)이 첨가된 배지에서 3:1(저항성: 민감성)로 분리되어졌고, T1 자가 수분 후 6개의 동형 접합자 라인이 pn-AMP1의 발현 수준에 따라 선별되어졌다. 이를 도 4의 B에 나타내었다. 도4의 B에 나타낸 바와 같이, pn-AMP1은 T2 형질 전환 라인에서 1㎎의 전체 용해성 단백질의 0.3(PMC32)에서 1.6(PMC12)㎍ 수준으로 발현되는 반면, 벡터만으로 형질 전환된 대조구 식물체에서는 pn-AMP1 항체에 의해서 인식되지 않았다. 이로써, 외부에서 도입된pn-AMP1유전자가 담배 내에서 머추어 단백질로써 정확하게 발현됨을 알 수 있었다.

5-2. 형질 전환 담배로부터 pn-AMP1의 순수분리 및 분리한 단백질의 항균 활성 조사

상기 5-1에서 본 발명의 형질 전환 담배가 pn-AMP1을 발현하는 것으로 확인되었는 바, 5-1에서 선정된 형질전환 담배 라인들을 이용하여 다음과 같은 방법으로 pn-AMP1 펩타이드를 순수분리하고 분리한 단백질을 이용하여 여러 가지 식물 병원균에 대한 항균활성을 조사하였다.

먼저, 형질 전환 담배와 대조구 담배 잎에 0.1M 트리스 완충액 (pH7.0)을 첨가(담배 잎 무게비와 완충액의 부피비: w/v ratio = 1;5로 첨가)하고, 전자 믹서 (Wahring blender)를 사용, 균질화(homogenization)한 후, 원심분리하여 가용성 분획(soluble fraction)을 추출하였다. 이렇게 추출한 조 단백질 (crude proteins)를 80℃에서 15분간 열을 가한 뒤 원심분리 (SS-34 rotor을 이용하여 15,000rpm에서 40분간 원심분리함)에 의하여 침전물들을 제거하였다. 상층 단백질들을 30-70% 암모늄 설페이트 (ammonium sulfate)로 침전시킨 후, 침전 단백질을 물에 녹여 이를 SEP-PAK 역상분리 칼럼(reverse-phase column)을 이용하여 염을 제거하고 동시에 단백질을 농축하였다. 상기 방법을 통하여 부분적으로 분리된 단백질을 사용하여 여러 가지 종류의 식물 병원균에 대한 항균력을 측정하였는데, 이때 사용한 방법은 마이크로 스펙트로 포토미터리 조사법 (microspectrophotopmetry assay; Terras et al., J. Biol. Chem. 267, 15301-15309, 1992; Hu and Reddy, Plant Mol. Biol. 34, 949-959, 1997)을 이용하였다. 항균력은 측정에 사용한 병원성 곰팡이의 생육을 50% 저해시키는 데 요구되는 단백질 농도를 IC₅₀(병원성 곰팡이의 50% 생육저해에 필요한 단백질 농도) 값으로 측정하였다. 즉, 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) 및 파이토푸소라 파라시티카(Phytophthra parasitica)의 포자 현탁액(2X10⁴/㎖) 각각을 25℃에서 형질전환된 식물체에서 분리한 단백질과 함께 26-44시간 동안 마이크로 타이트 플래이트에서 배양하면서, 곰팡이의 성장을 ELISA(Enzyme-linkes immunosorbent assay)플래이트 판독기를 이용하여 490nm에서의 흡광도 값으로 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

형질전환체-라인식물체	apn-AMP1 수준(㎍/㎎의 전체단백질)	파이토푸소라 파라시티카에 대한 IC50값	보트리티스 시네리아에 대한 IC50값
대조구(벡터)	bUD	250	200
PMC12 라인	1.6	23	42
PMC21 라인	1.2	35	40
PMC25 라인	1.0	30	38
PMC32 라인	0.3	50	50
a: IC50값은 병원균의 성장을 50% 저해하는데 필요한 pn-AMP1 단백질 농도를 표시함.b: 측정되지 않는 값을 의미함.

표 1로부터, 형질전환 담배는 강력한 항균활성을 갖는 다는 것을 알 수 있다. 특히, pn-AMP1를 높은 수준으로 발현하는 PMC12 라인은 대조구 식물체에 비해파이토푸소라 파라시티카에 대해서 10배,보트리티스 시네리아에 대해서는 5배 높은 항균 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.

5-3. 형질 전환 담배의 병원성 곰팡이에 대한 저항성 분석

다음과 같은 두 가지 방법을 이용하여 병원균에 대한 병 저항성도 확인하였다. 즉, 곰팡이 균주파이토푸소라 파라시티카에 대한 병 저항성을 조사하기 위하여 pn-AMP1의 발현 수준이 서로 다른 4개 T2 라인을 선정하였고, 병 발생률을 수치화하기 위하여 증상에 따라 아래와 같은 5가지 색인(wilt index)으로 분류하였다(Alexander et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90; 7327-7331, 1993). 이 때, 0-4까지의 값(Alexander et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90; 7327-7331, 1993)이 나타내는 의미는 다음과 같다.

0; 증상 없음

1; 약간의 고사;

2; 명확한 잎 고사, 줄기 썩음이나 성장 저해 없음

3; 명확한 잎 고사, 성장 저해, 줄기 썩음 없음

4, 심각한 잎 고사, 줄기 썩음

먼저, MS 기본 배지가 들어있는 무균의 플라스틱 용기(phyta tray)에서 한 달간 배양한 담배에파이토푸소라 파라시티카의 균사가 포함된 두개의 아가 플럭(agar plug; 직경 0.5cm)을 감염시켰다. 감염 후 3 ,6, 9 및 12일째, 다섯 가지 색인에 해당하는 식물체의 수를 세어 저항성을 비교하였다. 그 중, 감염 후 9일째, 각 색인에 해당하는 식물의 수를 세고, 이로부터 병 발생률을 계산하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

형질전환체-라인식물체	발병비율 색인(Wilt index)	a병 발생율(Disease rate)
	0		1	2	3	4
대조구(벡터)	0	2	5	7	36	3.54
PMC12 라인	21	11	10	9	0	1.16
PMC21 라인	18	14	10	9	0	1.22
PMC25 라인	17	13	11	10	0	1.3
PMC32 라인	0	3	6	6	35	3.43
a: pn-AMP1의 발현량이 서로 다른 각각의 형질전환 담배 식물체의 50개 seedlings를 이용하여P. parasitica감염후 9일째 측정한 발병율. 숫자는 각 발병비율 색인 (Wilt index)에 대한 식물체 개수를 나타냄.

표 2로부터, 대조구 식물체와 pn-AMP1을 낮은 수준으로 발현하는 형질 전환 담배(PMC 32)에서는 식물체 전체가 완전하게 병원균의 감염으로 죽는 반면, pn-AMP1을 높은 수준으로 발현하는 형질 전환 담배(PMC12, 21, 25)에서는 확연한 질병 증상 없이 건강하다는 것을 알 수 있다. 또한, 이 실험결과로서 PMC12 라인에 병원성 곰팡이를 감염시킨 후 12일째에 찍은 사진을 도 5의 A에 나타내었다.

한편, 또 다른 분석 조건 하에서 형질 전환 담배의 병 저항성을 확인하였다. 즉,파이토푸소라 파라시티카로부터 포자낭을 분리한 후 계대하여 튼튼하게 자란 담배 잎의 표면에 10㎕(10⁴포자낭/㎖ 물)의 포자낭 용액을 떨어뜨렸다. 그 후, 3일과 9일째 감염 부위에서의 증상을 상기에서와 같은 다섯가지의 색인에 근거하여 분류하고 이로부터 병발생률을 계산하였다. 세번의 반복 실험을 통해서 표준 편차와 함께 그 결과를 도 5의 B에 나타내었다.

도 5의 B로부터, 감염 3일째, 대조구 식물체와 PMC32라인에서 약간의 잎 고사 현상이 나타났으며 감염 9일째에는 심각한 잎 고사와 줄기 섞음 현상이 나타났지만, pn-AMP1을 높은 수준으로 발현하는 형질 전환 담배(PMC12, 21, 25)에서는 다섯 가지 색인에 해당하는 질병 증상 없이 감염부위에서 약간의 괴사만이 나타났다.

즉, 토탈(total) 단백질 1㎎당 1.0~1.6㎍정도로 pn-AMP1을 높은 수준으로 발현하는 형질 전환 담배가 대조구 식물체 및 0.3㎍정도로 낮은 수준으로 발현하는 형질 전환 담배에 비해서 훨씬 더 낮은 병 발생률을 나타냄을 알 수 있었다.

또한, 이러한 결과는 도 5의 C와 D로부터도 확인할 수 있다.

이상의 설명에서와 같이, 다양한 병원균에 대하여 성장 억제 능력이 뛰어난 항균성 펩타이드를 코딩하는pn-AMP1유전자의 이용은 병원균에 저항성이 강한 형질 전환 식물체의 제조에 이용이 가능할 것이다. 따라서, 기존에 농작물의 병 방제를 위하여 사용하던 맹독성의 농약을 대체하여 환경 오염이나 인체의 질병을 방지할 수 있는 무독성의 생물학적 내병성 형질 전환 작물을 개발할 수 있을 것이다.

Claims (5)

1. 서열번호 1로 표시되고, 나팔꽃(Pharbitis nill)씨에서 유래한 항균성 신규 펩타이드 pn-AMP1을 코딩하는 cDNA.
2. 제 1항의 항균성 펩타이드pn-AMP1의 cDNA를 포함하는 식물체 전이용 벡터.
3. 제 2항의 식물체 전이용 벡터로 형질 전환된 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens).
4. 제 3항의아그로박테리움 투머파시엔스를 도입하여 형질 전환되어 pn-AMP1을 과량으로 발현하는 형질 전환 식물체.
5. 제 4항에 있어서, 상기의 식물체가 담배임을 특징으로 하는 형질 전환 식물체.