KR100455745B1 - 신규의 항균성 펩타이드를 코딩하는 ｃＤＮＡ 및 이를 도입한 병 저항성 형질전환 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배추의 꽃봉오리에서 유래한 항균성 펩타이드와 이를 코딩하는 cDNA, 이 cDNA가 재조합된 식물체 전이용 벡터 및 이를 이용하여 제조된 항균활성을 가지는 형질전환 식물체(transgenic plant)에 관한 것이다.

본 발명의 항균성 펩타이드 BSD1(Brassicastamen specific plantdefensin-like peptide1)은 매우 우수한 항균활성을 가지므로, 이를 코딩하는 유전자를 식물세포에 도입함으로써, 항균활성을 갖는 형질전환 식물체를 제공할 수 있다.

Description

신규의 항균성 펩타이드를 코딩하는 ｃＤＮＡ 및 이를 도입한 병 저항성 형질전환 식물체{A cDNA encoding a novel antifungal peptide, defensin, and disease-resistant transgenic plant prepared by over-expressing the gene}

본 발명은 배추의 꽃봉오리에서 유래한 항균성 펩타이드와 이를 코딩하는 cDNA, 이 cDNA가 재조합된 식물체 전이용 벡터 및 이를 이용하여 제조된 항균활성을 가지는 형질전환 식물체(tranfgenic plant)에 관한 것이다.

농작물은 고착생활을 함으로서 끊임없이 수많은 병원균 (곰팡이, 세균, 바이러스 등)들의 공격을 받게 되고 여러 가지 질병에 걸리게 되어 엄청난 수확량의 감소를 유발하게 된다. 이러한 병원균에 의한 농작물의 피해는 농업 생산성에 가장 큰 영향을 주는 중요한 요인일 뿐만 아니라 생산성 향상을 위하여 사용하는 농약으로 인하여 환경오염이라고 하는 심각한 문제를 새로이 야기시킴으로서 돌이킬 수 없는 자연환경의 파괴와 회복 불능의 환경을 만들어 내고 있다 (Sherman JD et al., Arch. Environ. Health., 52, 332-333, 1997). 뿐만 아니라, 농약을 살포하는 농민들의 경우 맹독성의 농약을 인체에 흡입하므로서 인체내의 축적과 불치의 유전병이 생성되게 되고, 잔류농약의 흡수에 의한 소비자들에게도 치명적인 건강상의 손실을 유발시키게 된다 (London et al., Scan. J., Work. Environ. Health., 24, 18-29, 1998).

따라서, 식물의 병 방제와 농약사용으로 인한 환경오염이나 인체 축적에 의한 치명적 질병 발생 등을 방지할 수 있는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 그 예로서 생물체내에 존재하는 병원균 살균 단백질의 탐색과 분리 및 이들을 코딩하는 유전자의 클로닝과 이들을 이용한 내병성 형질전환 식물체에 대한 개발이 이루어지고 있다. 특히, 식물의 경우에는 고등동물과 달리 병원균으로부터 자신을 보호할 수 있는 별도의 면역체계를 가지고 있지 않으며, 주로 시스테인(cysteine)과 글리신(glycine)이 풍부한 다양한 작은 항균성 단백질을 발현하므로써 병원군의 침입으로부터 자신을 보호하고 있기 때문에, 이와 같은 작은 크기(2kD~9kD)의 항균성 단백질에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있는 실정이다.

이 작은 크기의 항균성 단백질로는 티오닌(thionins; Bohlmann et al., Annul. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 227-240, 1991), 식물디펜신(plant defensins; Gao et al., Nature Biotech. 18, 1307-1310, 2000), 지질 전이 단백질(lipid transfer proteins; Garcia-Olmedo et al., Trends Microbiol. 3, 72-74, 1995), 히베인형 펩타이드(hevein type peptides ; Koo et al., Biochim. Biophys. Acta, 1382, 80-90, 1998), 나틴형 펩타이드(knottin-like peptides; Cammue et al., J. Biol. Chem. 267, 2228-2233, 1992), MBP1(Duvick et al., J. Biol. Chem. 267, 18814-18820, 1992), 1bMBP(Tailor et al., J. Biol. Chem. 272, 24480-24487, 1997), 스네이킨(snakins; Segura et al., Mol. Plant-Microbe. Interact. 12, 16-23, 1999)등의 여덟 종류가 현재 알려져 있다.

이들중, 식물 디펜신은 45개에서 54개의 아미노산 잔기를 가지고 있고, 식물체의 종류에 따라 아미노산의 배열 순서의 유사성은 낮지만 공통적으로 8개의 시스테인 잔기가 4개의 이황화결합을 형성하는 단백질로서(Broekaert et al., Plant Physiol. 108, 1353-1358, 1995), 그램-양성균과 곰팡이의 성장을 저해하는 그룹 Ⅰ 디펜신, 곰팡이에는 저항성을 갖지만 세균에는 저항성이 없는 그룹 Ⅱ 디펜신, 그램-양성균과 그램-음성균에는 저항성을 갖지만 곰팡이에는 저항성이 없는 그룹 Ⅲ 디펜신, 그램-양성균, 그램-음성균 및 곰팡이 모두에게 저항성을 갖는 그룹 Ⅳ 디펜신과 같이 4개의 그룹으로 나뉘어진다(Osborn et al., FEBS Lett. 368, 257-262, 1995, De Samblanx et al., Peptide Res. 9, 262-268, 1996; De Samblanx et al., J. Biol. Chem. 272, 1171-1179, 1997; Segura et al., Mol. Plant-Microbe. Interact. 12, 16-23, 1999).

지금까지 알려진 디펜신 유전자로는 완두(Chiang et al., Mol. Plant-Microbe. Interact. 4, 324-331, 1991), 담배 (Gu et al., Mol. Gen. Genet. 234, 89-96, 1992), 아기장대(Epple et al., FEBS Lett, 400, 168-172, 1997)에서 유래된 유전자가 있으며, 아기장대에서는 적어도 다섯 개의 다른 디펜신 유전자가 확인되었는데, 그 중 pdf 2.3은 묘목, 로제트(rosette) 및 꽃에서 항상 발현되는 반면에, pdf 1.2는 곰팡이 병원균 뿐만 아니라, 메틸 자스모네이트에 의해서 발현됨을 보였다(Epple et al., FEBS Lett. 400, 168-172, 1997). 게다가, 무의 씨앗에서 분리된 항균성 단백질 1(Rs-AFP1)을 발현하는 유전자 변형 담배식물체는 곰팡이 병원균에 대하여 증가된 저항성을 나타낸다는 것이 보고되어 있다(Terras et al., Plant Cell. 7, 573-588, 1995). 이와 같은 식물 디펜신은 그들의 항균활성과 유전자 변형 식물의 곰팡이로부터 증가된 저항성을 보이는 것으로 보아 식물체의 생체 방어작용에서 중요한 역할을 할 것으로 생각되고 있다.

따라서, 식물병 방제와 농약 사용으로 환경오염이나 인체 축적에 의한 치명적 질병발생 등의 방지를 위하여 상기한 종류의 디펜신들 이외에 더 많은 식물 디펜신의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들도 식물체의 생체방어 작용에 중요한 역할을 할 것으로 기대되는 새로운 식물 디펜신을 개발하고자 연구한 결과, 배추의 꽃봉오리로부터 cDNA 라이브러리를 제작하고, 이로부터 강력한 항균활성을 갖는 항균성 펩타이드 BSD1을 코딩하는 cDNA를 분리하여, 이를 벡터에 클로닝하였다. 이어서, 이 벡터로 형질전환시킨아그로박테리움 투멘파시엔스를 이용하여 항균성 펩타이드 BSD1이 과발현되는 형질전환 식물체를 제조하여, 이 식물체가 우수한 병원균 저항성을 보임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 배추의 꽃봉오리로부터 유래된 항균성 펩타이드 BSD1을 코딩하는 cDNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 cDNA를 포함하는 식물체 전이용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 전이용 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항균성 펩타이드 BSD1을 발현하여 항균활성을 갖는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

도 1의 A는 본 발명의 항균성 펩타이드 BSD1 유전자의 염기서열과 이로부터 추론한 아미노산 서열(염기서열의 아래에 단일문자로 표시)을 나타낸 것이다.

<도면기호의 설명>

밑줄: 예측된 성숙(mature) 펩타이드

마이너스 숫자: 시그널 펩타이드

오른쪽의 숫자: 뉴클레오타이드와 아미노산의 갯수

사각박스: 예측되는 폴리-A 시그널

별표: 정지코돈

굵은체의 시스테인: 4개의 이황화결합을 형성하는 것

하나의 화살표 머리: 시그널 펩타이드와 성숙 BSD1 사이의 프로세싱(processing) 자리

도 1의 B는 본 발명의 항균성 펩타이드 BSD1의 아미노산 서열과 다른 식물 디펜신들의 아미노산 서열을 비교한 것이다. 여기서 아미노산 서열은 시그널 펩타이드를 없애고 나타낸 것으로, 굵은체는 보존된 잔기(conserved residue)를 표시한것이다. 그리고, 괄호는 BSD1과 디펜신과의 유사성을 나타낸다.

<도면기호의 설명>

FST: 담배 유래 꽃-특이 티오닌(flower-specific thionin from tobacco; Gu et al., Mol. Gen. Genet. 234, 89-96, 1992)

PPT; 피튜니아 유래 암술-특이 티오닌(pistil-specific thionin from petunia; Karunanandaa et al., Plant Mol. Biol. 26, 459-464, 1994)

J1: 벨 페퍼 유래 열매-특이 디펜신(fruit-specific defensin from bell pepper; Meyer et al., Plant physiol. 112, 615-622, 1996),

γ-H: 보리 유래 γ-호르도티오닌(γ-hordothionin from barley; Colilla et al., FEBS Lett. 270, 191-194, 1990),

γ1-P와 γ2-P: 밀배유 유래 γ1-퓨로티오닌과 γ2-퓨로티오닌(γ1-purothionin and γ2-purothionin from wheat endosperm; Mendez et al., Eur. J. Biochem. 194, 533-539, 1990), Rs-AFP1 (AFP1 from radish seeds; Terras et al., Plant Cell 7, 573-588, 1995),

Pdf 1.2와 Pdf 2.3:아라비도프시스 탈리아나유래 식물 디펜신(plant defensins fromArabidopsis thaliana; Epple et al., FEBS Lett. 400, 168-172, 1997).

F: 꽃, f: 열매, S: 씨앗, St: 수술, Pi, 암술

Rs: 로제트.

도 1의 C는 식물 디펜신들에 공통적으로 존재하는 아미노산과, 예측되는 이황화결합을 나타낸 것이다.

도 2는 배추의 전체유전자를 사용한 BSD1 유전자의 서던 블랏분석(Southern blotting) 결과를 나타낸 것이다.

레인 E:EcoRⅠ, 레인 H:HindⅢ, 레인 B:BamHⅠ

도 3은 배추의 각 조직(A)과 기관(B), 그리고 꽃 분화단계(C)에서 분석한 BSD1 전사체의 발현양 수준을 나타낸 것이다.

<도면기호의 설명>

I: 꽃 봉우리 크기가 0.3㎝인 초록 꽃 조직에서 분리한 RNA

Ⅱ: 꽃 봉우리 크기가 0.8㎝인 초록 꽃 조직에서 분리한 RNA

Ⅲ: 꽃 봉우리 크기가 1㎝인 노란 꽃 조직에서 분리한 RNA

Ⅳ: 개화한 꽃에서 분리한 RNA.

도 4의 A는 대장균에서 재조합 단백질의 생산을 위하여 제작된 벡터 pBSDM의의 지도이다. 여기서, Amp^R는 암피실린 저항성 마커이고, P_tac은 tac 프로모터이다.

도 4의 B는 대장균에서 수용성 재조합 BSD1 생산을 전기영동(레인 1~6) 및 웨스턴 블랏분석법(레인 7)으로 확인한 결과이다.

레인 1~4: IPTG 유도 0, 1, 2 및 4 시간 후의 전체 수용성 단백질

레인 5: GST-BSD1 융합 단백질 분획

레인 6: 트롬빈 가수분해 후 순수분리된 재조합 BSD1

레인 7: 재조합 BSD1

도 5는 시험관 내에서의 BSD1 펩타이드의 항균활성을 측정한 결과이다.

<도면기호의 설명>

A는뉴로스포라 크랴샤(Neurospora crassa) 곰팡이와 항균 펩타이드 BSD1을 공배양한 페트리 디쉬 (petri-dish)이다.

B는푸자리움 옥시스포리움(Fusarium oxysporium) 곰팡이와 항균 펩타이드 BSD1을 공배양한 페트리 디쉬이다.

Disc 1은 3차 증류수 100㎕를 첨가한 후의 항균활성 (대조구) 조사결과이다.

Disc 2는 소 혈장 (BSA) 단백질 100㎍을 첨가한 후의 항균활성 조사결과이다.

Disc 3은 분리한 BSD1 펩타이드 25㎍을 첨가한 후의 항균활성 조사결과이다.

Disc 4는 분리한 BSD1 펩타이드 50ug을 첨가한 후의 항균활성 조사결과이다.

Disc 5는 분리한 BSD1 펩타이드 50㎍을 단백질 분해효소인 프로네이즈(pronase) 200㎎/㎖로 37℃에서 2시간 동안 처리하여 BSD1 펩타이드를 분해한 후의 항균활성 조사결과이다.

도 6는 BSD1의 시험관내에서 항균활성을 조사한 것으로, 곰팡이 포자의 성장 저해 곡선이다.

- ■-:푸자리움 옥시스포리움포자

- ●-:뉴로스포라 크랴샤포자

- ▲-:파이토프소라 파라스티카(Phytophthora parasitica) 포자

도 7의 A는 BSD1으로의 형질전환 담배를 제조하기 위한 벡터이다.

도 7의 B는 BSD1을 발현하는 T₂형질전환 담배의 노던 블랏분석(Northern blotting) 결과이고, C는 웨스턴 블랏 (Western blot) 결과이다.

<도면기호의 설명>

W: 야생형 담배

vec: 백터만으로 형질전환된 담배

#H-1, #H-5, #H-12, #H-17, #H-21 및 #H-22: BSD1으로 형질전환된 담배

도 7의 D는 형질전환된 담배의파이토프소라 파라스티카에 대한 병 저항성을 조사한 결과이다.

I 및 Ⅲ: 벡터만으로 형질전환된 식물체

Ⅱ 및 Ⅳ: BSD1으로 형질전환된 식물체

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 배추 유래 항균성 펩타이드 BSD1(Brassicastamen specific plantdefensin-like peptide1)의 cDNA는 배추의 꽃봉오리로부터 제작한 cDNA 라이브러리를 이용하여 얻어진 클론들을 무작위로 선별하여 N-말단의 염기서열을 분석한 다음, 이 분석한 서열을 기초로 하여 공지의 식물 디펜신과 유사성을 보이는 cDNA를 선택하고, 부분적인 염기서열을 프로브로 사용하여 BSD1 전체 염기서열을 포함하는 cDNA를 분리한 것이다. 이 BSD1의 cDNA에 포함된 유전자 절편은 서열번호 1의 서열을 갖는 것으로, 510bp의 크기를 갖는다. 이로부터 추론된 항균성 펩티드 BSD1의 아미노산 서열은 서열번호 2와 같다.

또한, 본 발명은 식물 병원균에 대하여 저항성이 강한 형질전환 식물을 제조하는데 사용될 수 있는 BSD1의 cDNA를 포함하는 식물 전이용 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시예로서 BSD1의 cDNA 절편을 바이너리(binary) 벡터인 pGA643의 XbaI/ClaI 부위에 클로닝하여 재조합 식물체 전이용 벡터인 pGA643-BSD1을 제조하였다. 이어서, 이 재조합 벡터 pGA643-BSD1으로아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens) EHA101를 형질전환시켜 항균성을 갖는 형질전환 식물체의 제조시 매개체로 사용될 수 있는 형질전환 미생물을 수득한 다음, 이 미생물을 이용하여 BSD1을 식물체에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하였다.

이어서, 본 발명의 BSD1 펩타이드를 발현하는 항균성을 갖는 형질전환 식물체의 일례로서, 상기아그로박테리움 투메파시엔스를 이용하여 잎 조작 형질전환방식으로 담배잎 세포에 BSD1 cDNA를 도입시키고, 이를 식물 성체의 생장을 유도하는 조건하에서 배양하여, BSD1을 발현하는 형질전환 담배를 제조하였다. 형질전환 식물체의 식물병원균에 대한 저항성을 측정하고자, 형질전환 담배를피토프토라 파리시니카(phytphtora parasitica var nitotianae)로 감염시키고 배양한 결과, 감염 5일후 벡터만으로 형질전환된 담배는 질병증상이 나타나기 시작하여 감염 10일후에 완전히 사멸되었으나, BSD1으로 형질전환된 담배의 경우에는피토프토라 파리시니카감염에 의한 증상이 나타나지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 BSD1을 코딩하는 유전자를 일반적인 형질전환 식물체의 제조방법에 따라 목적하는 식물세포에 도입하므로써 농작물을 비롯한 각종 식물체의 항균성을 효과적으로 증식시킬 수 있음을 제시하는 것이다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만 본 발명이 이들예로만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> BSD1 cDNA의 클로닝

1-1. 배추의 꽃봉오리 cDNA 라이브러리의 제조

Double stranded cDNA는 Gubler과 Hoffman의 방법(Gubler and Hoffman, Gene, 23, 263-271, 1983)에 따라 배추의 꽃 봉오리로부터 얻어낸 total RNA로부터 mRNA를 분리하고, 이렇게 분리한 oligo(dt) primed poly(A) mRNA와 avian myeloblastosis virus에서 얻어낸 역전사 효소를 반응시켜 역전사시킨 다음, RNase H 와 DNA 폴리머라제 I으로 처리하였다. 이렇게 만들어진 DNA를 T4 DNA 폴리머라아제로 평활말단(blunt-end)으로 만들고,EcoRI 메틸라아제로 메틸화시킨 후,EcoRⅠ효소로 절단한 다음 세파로스 CL-4B 컬럼을 사용하여 size-fractionation하여 2kb이상의 것들을EcoR1-cleaved λgt11과 결찰(ligation)하므로서 배추 꽃봉오리의 cDNA 라이브러리를 제조하였다.

1-2. BSD1 cDNA 클론의 선별

BSD1 cDNA의 단편에³²P[ATP]를 표시하고, 이것을 프루브 (probe)로 사용하여 상기에서 제조한 cDNA 라이브러리로부터 full-length의 BSD1 클론을 선별하였다. 이때 5x10⁵개의 cDNA 플라그 (plaque)에서 2개의 양성 클론을 얻어내었으며, 이 과정은 Sambrook와 Russell (Molecular cloning, Chapter 11, 2001, Cold SpringHarbour)의 방법에 준하여 실험하였다.

상기한 방법으로 얻어낸 클론으로부터 BSD1의 cDNA를 추출하고, 생거의 디데옥시 DNA 염기서열 결정방법(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467, 1977)에 따라 자동화 염기서열 결정기(automatic DNA Sequencer, Applied Biosystems model 373A)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 서열번호 1에 나타내었으며, 이로부터 추론된 BSD1의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내었다.

1-3. BSD1과 다른 식물 디펜신들과의 아미노산 서열의 비교

배추로부터 분리된 항균성 펩타이드 BSD1의 아미노산 서열(서열번호 2)과 공지의 식물 디펜신들의 아미노산 서열을 비교하고, 그 결과를 도 1의 A 내지 C에 나타내었다.

본 발명의 BSD1의 추론된 아미노산 서열은 N-말단에 29개의 예측할 수 있는 시그널 펩타이드(putative signal peptide)를 가지고 있고, 예측된 절단 자리는 -1(G)의 아미노산 잔기에 작은 아미노산을 가지며, -3(V)의 위치에서 잔기는 비방향성이 크고, 극성의 아미노산을 가지는 von Heijne의 법칙(von Heijne, G. Nucl. Acid. Res. 14, 4683-4690, 1986)을 잘 따르는 것을 보였다. 추론된 아미노산 서열을 기본으로 하여, BSD1 단백질은 약 6kD의 분자량을 갖는 것으로 예측되고, 10.57의 등전점을 가지는 것으로 보였다.

BSD1과 다른 식물 디펜신들을 전체적으로 비교해 보았을 때, 벨 페퍼 유래의 열매-특이 디펜신인 J1(J1 from bell pepper; Meyer et al., Plant Physiol. 112,615-622, 1996)과는 27%의 유사성을 보이고, 담배 유래 꽃-특이 티오닌인 FST(FST from tobacco; Gu et al., Mol. Gen. Genet. 234, 89-96, 1992)와는 38%의 유사성을 나타내는 등 다른 식물 디펜신들과 낮은 유사성을 나타내었다. 더욱이, 무의 씨앗 유래의 디펜신인 Rs-AFP1과 비교해보면, 모든 식물 디펜신들에 잘 보존되어있는 13번 위치와 34번 위치의 두 개의 글라이신(glycine)과 11번 위치의 방향성 잔기가 BSD1에서는 라이신(lysine), 알라닌(alanine), 그리고, 글라이신(glycine)으로 구성되어 있었다(도 1의 B 참조). 그러나, 4개의 이황화결합을 형성할 것으로 추측되는 8개의 시스테인과 29번 잔기의 글루타믹 엑시드(glutamic acid)의 위치와 존재는 다른 식물 디펜신들과 정확하게 일치하였다(도 1의 C 참조). 따라서, 비록 본 발명의 BSD1이 다른 식물 디펜신들과 비교하여 아미노산 서열에 있어서 약간의 차이가 있을지라도, BSD1의 전체적인 구조는 식물 디펜신 그룹으로 분류할 수 있다.

한편, 배추의 게놈(genome)에서 BSD1과 유사성을 가지고 있는 유전자의 개수를 알아보기 위해서, 방사성 동위원소로 표지된 BSD1 cDNA를 프로브로 사용하여 제노믹 서든 블랏분석(genomic southern blotting)을 수행하였다(도 2 참조).

이러한 결과로부터, 배추의 게놈에는 여러 개 아이소타입(isotype)의 BSD1 유사 유전자(homologues)가 존재함을 알 수 있었으며, 이와같이 멀티 카피 (multi-copy) 유전자들이 코드하는 BSD1과 유사 단백질들은 식물체내에서 병 저항성 기능을 수행하는 데 대단히 중요한 기능을 수행함을 알 수 있었다.

<실시예 2> BSD1의 발현양상 비교

상기 실시예 1에서 분리한 BSD1 유전자의 발현양상을 비교, 관찰하기 위하여배추로부터 분리된 여러 가지 조직과 기관별로 노던 블랏분석(Northern blotting)을 수행하였다. 노던 블랏분석 방법은 다음과 같다.

잎, 줄기, 뿌리 및 꽃봉오리 각각의 RNA 20㎍을 1.5% 포름알데하이드-아가로스 겔(formaldehyde-agarose gel)에서 분리한 후, 나이론 멤브레인(nylon membrane)으로 이동시켰다. 이 멤브레인을 자외선(UV)에 쬐인후, 0.5M의 Na₂HPO₄(pH 7.2), 1mM의 EDTA, 1%의 BSA) 및 7% SDS의 용액에서 65℃의 조건하에서 방사성 동위원소로 표지된 BSD1 프로브(probe)를 넣어서 하루동안 반응시켰다. 이 멤브레인을 0.1%의 SDS를 포함하는 2XSSC(1XSSC는 0.15M의 NaCl과 0.015M의 소듐싸이터레이트임)에서 37℃의 온도조건하에 10분 동안 두 번 세척한 후, 다시 0.1%의 SDS를 포함하는 0.2X SSC 용액에서 60℃의 조건하에 10분 동안 두 번 세척하였다. 이 멤브레인을 말려서 -70℃에서 X-ray 필름에 노출시켜 도 3을 얻었다.

도 3으로부터, BSD1의 전사체(transcript)는 오직 꽃봉오리에서만 발현되었으며, 다른 조직에서는 발현되지 않는 다는 것을 알 수 있다(도 3의 A 참조). 또한, 꽃의 기관별로 전사체의 발현 양상을 관찰하였을 때, 오직 수술에만 발현될 뿐, 다른 기관에서는 발현되지 않는 다는 것을 알 수 있다(도 3의 B 참조).

따라서, 위에서 언급한 것과 같이, 본 발명의 cDNA를 암호화하는 단백질은 BSD1(Brassicastamen specific plantdefensin-like peptide1)이라고 확신할 수 있다.

또한, 배추꽃의 개화과정을 4단계(I 단계; 0.3㎝의 초록 꽃봉오리: 단계 Ⅱ;0.8㎝의 초록 꽃봉오리: 단계 Ⅲ; 1㎝의 노란 꽃봉오리: 및 단계 Ⅳ; 개화된 꽃)로 나눈 다음, 각각의 단계에서의 RNA를 분리하여 상기에서와 동일한 방법으로 노던 블랏분석을 수행하여 BSD1 유전자의 발현양상을 관찰하였다.

그 결과, BSD1의 전사체는 단계 I에서는 관찰되지 않았고, 단계 Ⅱ에서 가장 많은 전사체가 발현되며, 전사체는 꽃이 완전히 개화될 때까지 점차 감소해 간다는 것을 관찰하였다(도 3의 C 참조). 이러한 사실로부터, 대부분의 식물 디펜신 유전자들이 씨앗(Bloch and Richardson, FEBS Lett. 279, 101-104, 1991; Terras et al., J. Biol. Chem. 267, 15301-15309, 1992; Terras et al., Plant Cell, 7, 573-588, 1995; Osborn et al., FEBS Lett. 368, 257-262, 1995; Nitti et al., Eur. J. Biochem. 228, 250-256, 1995), 완두의 잎(Ching et al., Mol. Plant-Microbe. Interact. 4, 324-331, 1991), 감자의 괴경(Moreno et al., Eur. J. Biochem. 223, 135-139, 1994), 벨 페퍼의 익은 열매(the ripe fruits of bell pepper; Meyer et al., Plant Physiol. 112, 615-622, 1996)등에서 발현되는 것과 달리, 본 발명의 BSD1은 식물의 수술과 꽃 분화의 초기단계에서만 발현되는 디펜신으로, 본 발명에서 최초로 발명된 디펜신이라는 것을 알 수 있다.

또한, BSD1 유전자가 환경적인 자극에 의해서 발현되는지를 관찰하기 위해서, 배추의 4일된 유묘에 1mM의 살리실린산(salicylic acid), 0.1mM의 메틸 자스모네이터(methyl jasmonate), 2mM의 에틸렌(ethylene; ethephon), 2mM의 과산화수소(H₂O₂) 및 1mM의 질산은(AgNO₃)과 같은 화학유도제를 처리하여, 전사체의양을 관찰하였다. 그 결과, 발현이 관찰되지 않았다. 따라서, 이로부터 BSD1 유전자는 환경적인 자극에 의해 발현되지 않는 유전자라는 것을 알 수 있다.

<실시예 3> 대장균에서 재조합 단백질의 발현 및 이 단백질의 항균활성 조사

3-1. 재조합 단백질의 발현

대장균내에서의 단백질 발현 벡터로 사용되는 pGEX를 약간 변형한 pAK-SS 벡터(Amersham Pharmacia Biotech.)를 글루타치온-에스-트랜스퍼레이즈(GST)와 합성된 단백질을 만들기 위해 사용하였다.

즉, 실시예 1의 BSD1의 cDNA에서 예측되어지는 N-말단 시그널 염기서열(putative N-terminal signal sequence)을 뺀 부분을 센스 프라이머(sense primer: 5´-AAACCATGGGGTCATGCAAGAGGCAACC-3´)와 안티센스 프라이머(antisense primer: 5´-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3´)를 사용하여NcoI의 제한효소 자리를 PCR(polymerase chain reaction)방식으로 생성시켰다.XhoI 제한효소로 자른 PCR 산물을 T4 DNA 폴리머라아제로 염기서열을 채우고,NcoI의 제한효소로 자른후에, pAK-SS 벡터의NcoI과SmaI 제한효소의 자리에 연결시켜, tac 프로모터의 조절을 받으면서 GST 유전자의 아래에 BSD1 유전자를 포함하는 pBSDM 벡터를 제작하였다(도 4의 A 참조). 그 유전자의 염기서열은 자동화 염기서열 결정기(automatic DNA sequencer, Applied Biosystems model 373A)를 사용하여 확인하였다.

상기의 재조합 벡터 pBSDM을 전기충격방법 (electroporation)으로 대장균(BL21 [pLys S] DE3)에 도입하였으며, BSD1 유전자가 도입된 대장균으로부터 프라스미드 (plasmid)를 분리한 후, BSD1 유전자를 클로닝하는데 사용한 제한효소를 이용하여 절편하고, 절편된 유전자를 1% 아가로스 (agarose) 전기영동 방법으로 확인하여 BSD1 유전자의 도입을 윤 등의 방법 (Yun et al, Plant Physiol., 111; 1219-1225, 1996)으로 확인하였다.

이러한 방법으로 제조한 형질전환된 대장균을 암피실린(ampicillin, 50㎍/㎖)과 클로람페니콜(chloramphenicol, 33㎍/㎖)의 항생제를 가지고 있는 배지에서 28℃의 조건하에서 배양하였다. 대장균의 OD₆₀₀가 0.6정도가 될 때, 0.4mM의 IPTG(isoprophyl β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여, 재조합 단백질의 합성을 유도하였다.

이 대장균을 28℃에서 4시간 동안 배양한 후에 원심분리로 수확하고, 0.1mM의 PMSF를 포함한 PBS 완충용액(phosphate-buffered saline, containing 140mM의 NaCl, 2.7mM의 KCl, 10mM의 Na₂HPO₄및 1.8mM의 KH₂PO₄, pH 7.6)으로 녹인 다음, 초음파 분쇄기(sonicator)로 파쇄하고, 수용성 분획을 10,000g로 20분 동안 원심분리하였다. 재조합 단백질을 글루타치온 친화 크로마토그래피(glutathione affinity chromatography)로 분리하고, 재조합 단백질의 N-말단을 트롬빈 절단에 의해서 제거하여 BSD1 단백질을 순수분리하였다.

순수분리된 단백질을 SDS-폴리아크릴 아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동으로 확인하고, 그 결과를 도 4의 B에 나타내었다. 도 4의 B에서 레인 1~4는 상기 IPTG 첨가전, 첨가 1시간 후, 2시간 후 및 4시간 후의 전체 수용성 단백질이고, 레인 4는 GST-BSD1 융합 단백질 분획이며, 레인 5는 트롬빈 가수분해 후, 순수 분리된 재조합 BSD1이다. 한편, 레인 7은 재조합 BSD1을 GST-BSD1의 항체를 가지고 웨스턴 블롯분석을 한 것이다.

이상의 결과로부터, 형질전환된 대장균에서 발현된 단백질은 분자량 약 6kDa의 단백질이라는 것을 알 수 있다.

3-2. 순수분리된 재조합 단백질의 항균활성

상기에서 분리된 단백질을 3차 증류수 10ℓ를 사용하여 4℃에서 24시간 충분히 투석하였으며, 투석된 단백질 용액은 스피드-백 (speed-vac) 기기를 사용하여 건조시킨 다음, 다시 3차 증류수를 첨가하여 최적의 항균활성을 갖는 농도의 단백질 용액으로 제조하였다.

그 다음, 곰팡이 성장억제 조사법(radial growth-inhibition assays; Yun et al., Plant physiol. 111, 1219-1225, 1996)으로푸자리움 옥시스포리움(Fusarium oxysporium)과뉴로스포라 크랴샤(Neurospora crassa)를 사용하여 항균활성을 측정하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5로부터,푸자리움 옥시스포리움과뉴로스포라 크랴샤의 곰팡이 균들이 BSD1 단백질에 의해서 성장이 현격하게 억제됨을 확인할 수 있었다.

또한, 마이크로 스펙트로 포토미터리 조사법(microspectrophotometry assays; Terras et al., J. Biol. Chem. 267, 15301-15309, 1992; Hu and Reddy, Plant Mol. Biol. 34, 949-959, 1997)에 의해서, 50% 곰팡이 성장 저해를 위하여 요구되는 단백질 농도(IC₅₀)를 측정하였다. 즉,푸자리움 옥시스포리움,뉴로스포라크랴샤,파이토프소라 파라스티카각각의 포자 현탁액(2×10⁴/㎖)을 25℃에서 표시된 단백질(50㎕의 단백질 용액 + 50㎕의 포테이토 덱스트로쓰 브로쓰: Difco)과 함께 26~44시간 동안 마이크로 타이터 플레이터(micro-titer plate)에서 배양하면서, 곰팡이의 성장을 ELISA(Enzyme-linkes immunosorbent assay) 플레이터 판독기로 490nm에서의 값으로 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6로부터,푸자리움 옥시스포리움,뉴로스포라 크랴샤및파이토프소라 파라스티카의세가지 곰팡이의 50% 성장을 저해하는데 BSD1 단백질이 30~100㎍ 정도 요구됨을 알 수 있었다.

<실시예 4> BSD1 식물체 전이용 벡터 및 형질전환 미생물의 제조

BSD1 유전자를 도입한 식물체 전이용 벡터를 제조하고자, BSD1의 510bp cDNA 절편을 바이너리 벡터인 pGA643(An, G et al, 1988. Plant Mol. Biol. Manuals, Kluwer, Dordrecht, p. A3/1-A3/19, 1988)의 XbalⅠ/ClaⅠ 부위에 클로닝하여, 재조합 식물체 전이용 벡터인 "pGA643-BSD1"을 제조하였다(도 7의 A 참조). 도 7의 A에서, npt Ⅱ는 카나마이신 저항성을 나타내는 키메릭 유전자로서 노파린(nopaline) 합성효소 유전자의 프로모터 및 전사종결자와 네오마이신 인산전이효소 Ⅱ 코딩서열을 포함하고, CaMV는 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus, CaMV)의 35S 프로모터를 나타낸다.

이어서, 상기 재조합 벡터 pGA643-BSD1을아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA101(Clontech, USA)미생물에 전기충격법(electrophoration)으로 형질전환시킨 다음, 10㎍/㎖의 카나마이신 및 5㎍/㎖의 테트라사이클린을 포함하는 LB 아가 플레이트 선백배지에 도말하고, 28℃에서 2일동안 배양하여 형질전환된아그로박테리움 투메파시엔스를 선별하였다.

<실시예 5> 형질전환 담배의 제조

아그로박테리움이 매개하는 잎 조각 형질전환법(Horsch et al., Science, 227, 1229-1231, 1985)으로 BSD1을 발현하는 형질전환 담배를 제조하였다.

즉, 무균 상태에서 배양한 담배의 잎을 disc 형태의 절편으로 만들고, 28℃ shake incubator에서 적절히 (O.D₆₀₀= 0.5) 배양한 상기 형질전환된아그로박테리움 투메파시엔스를leaf disc와 공배양(co-cultivation )하였다. 공배양은 공동배양 배지에 leaf disc를 두고, 배양한아그로박테리움 투메파시엔스를 첨가한 후, 28℃ 배양기에서 적절한 시간동안 배양하는 것이다. 공동배양 후, 모든 leaf disc를 MS 10 배지 (카나마이신 100㎎/ℓ, 카르베니실린(carbenicillin) 500㎎/ℓ)로 옮기고 부정싹을 유도하였다. 매 3주 간격으로 새로운 MS 10 배지로 계대 배양해 주었다. 기내에서 부정싹(adventitious shoot)을 유도하여아그로박테리움 투메파시엔스와 공배양한 담배의 절편을 캘러스 형성을 피하면서 옥신과 사이토키닌이 적당한 농도로 들어 있는 배지에 치상하였다. 이 배지는 형질전환된 싹만이 분화되게 하기 위해 항생제를 첨가한 배지를 사용한다. 2주마다 계대배양하여 싹의 분화를 유도하고, 적절한 크기로 생장시킨 후 뿌리 분화 배지에 옮겼다. 그리고, MS 배지의 조성분을 반으로 줄이고, 생장조절제를 제거하며, 낮은 수준의 옥신 (0.5 M NAA)을 첨가하여 배양된 줄기나 소식물체로부터 부정근을 발생시켰다. 기내에서 뿌리를 분화시킨 형질전환 담배 식물체를 토양의 새 환경조건에 순화시키기 위하여 먼저 기내에서 식물체를 꺼내고, 한천을 깨끗이 제거하여 살균된 토양에 옮겼다. 토양에 옮긴 식물체는 높은 습도 조건의 밀폐된 공간 하에서 생장시키면서 서서히 외부환경에 순화시켜 나간다. 이때, 기내의 식물체를 토양에 옮기기 전에 항생제가 포함된 멸균증류수에서 몇 차례 씻어주므로서 식물 조직에 남아있을 수도 있는아그로박테리움 투메파시엔스를 제거해 주었다. 이런 방법으로 형질전환된 담배를 제조하였다.

한편, 선별된 형질전환 담배에서 많은 양이 전사체를 발현하는 동형접합자의 T₂세대의 개체를 항균활성 조사를 위하여 선정하였다(도 7의 B).

<실시예 6> 형질전환 담배에서 BSD1의 발현 및 항균활성

6-1. 면역 블랏분석

상기 실시예 5의 형질전환 담배 식물체의 각 조직을 채취하고, 이 시료에 프로테이즈 저해제 혼합액(protease inhibitor cocktail; 100㎎/㎖의 PMSF, 19㎎/㎖의 아프로티닌 및 25㎎/㎖ 루펩틴(leupeptin), Boehringer Mannheim, GmbH, Germany)을 1:4 (w/v)로 처리하여 단백질 용액을 추출 (homogenization) 하고, 6000 x g에서 원심분리하여 세포조각을 제거하였다. 상층액을 얻은 후, 80% 포화 암모늄 설페이트 (ammonium sulfate)를 첨가하여, 단백질을 침지시킨 다음, 단백질 침전물을 획득하였다. 단백질 침전물을 앞에서 사용한 프로테이즈 저해제 혼합액소량을 사용하여 녹인 다음, 같은 용액 10ℓ를 사용하여 투석시켰다. 이렇게 투석이 끝난 단백질 용액을 브라드포드 시약(Bradford reagent)을 사용하여 단백질을 정량한 후, SDS-전기영동 방법으로 단백질들을 분리시킨 다음, 18% 전기이동법 (electro-transfer)으로 분리된 단백질들을 PVDF (Millipore) 막에 이동시킨 다음, 항-BSD1 항체를 이용하여 반응시켰다(Lee et al., J. Biol. Chem. 270, 21806-21812, 1995). ECL 검출용액으로 발색반응을 시켜, 본 발명의 형질전환 담배에서 BSD1 단백질이 발현됨을 확인하였다(도 7의 C).

한편, 상기한 항-BSD1 항체 제조는 200㎍의 순수 분리된 GST-BSD1 단백질을 혼성화액(Freund´s complete adjuvant)과 완전히 혼합시킨 후, 토끼의 피하 조직에 2주 간격으로 150㎍의 단백질과 혼성화액을 섞은 후 주사하여 제조한 것이다.

6-2. 형질전환 담배의 항균 활성 조사

상기 6-1에서 본 발명의 형질전환 담배가 항균활성을 가지는 BSD1 펩타이드를 발현하는 것으로 확인되었는 바, 다음과 같은 방법으로 형질전환 담배의 항균 활성을 조사하였다. 즉, 상기 실시예 5에서 선정된 형질전환 개체를 이용하여 곰팡이 균주(Phytphora parasiticavar nitotianae)에 대하여 저항성을 조사하였다(H대 et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 766-771, 1999)

즉, 형질전환 담배를 MS 아가배지(Ms agar medium)에서 25℃로 한달동안 무균의 배양병에서 성장시켰다. 곰팡이 균사체 (Phytphora parasiticavar nitotianae; ATCC)를 포함하는 두 개의 아가 플러그(agar plug; 1㎝ 직경)는 배양병의 식물체의 같은 거리에 놓고, pGA643 벡터만으로 형질전환된 변형 식물체와 일반적인 담배식물체를 대조구로 사용하여 곰팡이의 감염양상을 여러 표본을 가지고 Alexander 등의 방법 (Alexander et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90; 7327-7331, 1993)에 따라 병 저항성을 조사하였다.

그 결과, 감염시킨지 5일 후 벡터만으로 형질전환된 대조구 담배에서는 질병 증상이 나타나기 시작하였지만, BSD1이 도입된 형질전환 담배에서는 외형적인 변화를 관찰할 수 없었다. 감염시킨지 8일 후에는 벡터만 형질전환된 담배에서는 잎이 시들고 줄기가 물러지는 것과 같은 심각한 질병증상이 나타났고, 감염된지 10일 후에는 식물체 전체가 완전하게 병원균의 감염으로 죽은 것을 알 수 있었다(도 7의 D-I 참조). 그러나, BSD1의 유전자가 도입된 형질전환 담배에서는 감염시킨 곰팡이와 접촉한 면의 잎 표면만 노랗게 변화되는 것을 제외하고는 확연한 질병 증상없이 상당히 건강하게 살아가는 것을 확인할 수 있었다(도 7의 D-Ⅱ 참조).

한편, 상기 벡터만으로 형질전환된 담배와 BSD1으로 형질전환된 담배의 식물체내에서 곰팡이의 성장을 관찰하기 위하여, 365nm 익싸이터(exciter)와 420nm의 형광필터(fluoresence filter)를 가지고 있는 형광 현미경(fluoresence microscope; Carl Zeiss, Thornwood, NY)을 사용하여 아닐린 블루염색을 하여 관찰하였다. 그 결과, 벡터만으로 형질전환된 담배는 곰팡이 균사가 완전히 성장했고(도 7의 D-Ⅲ 참조), BSD1으로 형질전환된 담배는 서서히 균사의 성장을 시작하려는 단계를 보임으로써 병원균의 성장을 확실하게 저해하고 있음을 알 수 있다(도 7의 D-Ⅳ 참조).

이상의 설명에서와 같이, 다른 식물체에 존재하는 저 분자량의 살균 펩타이드보다 병원균 살균력이나 병원균 성장억제 능력이 뛰어난 펩타이드인 배추 BSD1 유전자의 이용은 병원균에 저항성이 강한 형질전환 농작물 제조에 이용이 가능할 뿐만 아니라, 병원균 조절 단백질로의 생산도 가능하여 독성이 전혀 없는 생물학적 무공해 병원균 방제물질로도 이용이 가능하다. 따라서, 기존에 농작물의 병 방제를 위하여 사용하던 맹독성의 농약을 대체하여 환경오염이나 인체질병을 방지할 수 있는 무독성의 생물학적 내병성 형질전환 작물을 개발할 수 있을 것이다.

<110> LEE, Sangyeol LIM, Chaeoh CHO, Mooje <120> A cDNA encoding a novel antifungal peptide, defensin, and disease-resistant transgenic plant prepared by over-expressing the gene <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 510 <212> DNA <213> Brassica campestris <220> <221> CDS <222> (27)..(269) <220> <221> mat_peptide <222> (114)..(269) <400> 1 gaaaaagtaa aaaagtaaaa tatagc atg gct aag ttt gct tcc atc atc 50 Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile 1 5 acc ttc ctc ttc gtt gtt ctt att atc ttt tct gct ttt gaa aca cca 98 Thr Phe Leu Phe Val Val Leu Ile Ile Phe Ser Ala Phe Glu Thr Pro 10 15 20 acg att gtg gaa ggg cag agg tca tgc aag agg caa cct aat tca ggg 146 Thr Ile Val Glu Gly Gln Arg Ser Cys Lys Arg Gln Pro Asn Ser Gly 25 30 35 40 agt aaa aat tgt atg aag gat agt gaa tgc cgg gag gtt tgc atc tat 194 Ser Lys Asn Cys Met Lys Asp Ser Glu Cys Arg Glu Val Cys Ile Tyr 45 50 55 gcc gag aaa gca atg cgt gct act tgt gat tat aca ttc cca agg cgc 242 Ala Glu Lys Ala Met Arg Ala Thr Cys Asp Tyr Thr Phe Pro Arg Arg 60 65 70 cgg tgt ttc tgc cac ttt cca tgt caa t aaacagagcc gttccaagac 290 Arg Cys Phe Cys His Phe Pro Cys Gln 75 80 atttttatgc cctatgccaa ataaatatta ctagatgact ttctgcgata tcgcgggata 350 aagtccattt caatattatt ataataagtt ttctatatca ttgaatataa aaatttcgat 410 tacttaaatt tttgataaaa attaatgaat atttttgata ggttaataat gtaagaataa 470 cattaaattt tattacaata aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 510 <210> 2 <211> 81 <212> PRT <213> Brassica campestris <400> 2 Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile Thr Phe Leu Phe Val Val Leu Ile 1 5 10 15 Ile Phe Ser Ala Phe Glu Thr Pro Thr Ile Val Glu Gly Gln Arg Ser 20 25 30 Cys Lys Arg Gln Pro Asn Ser Gly Ser Lys Asn Cys Met Lys Asp Ser 35 40 45 Glu Cys Arg Glu Val Cys Ile Tyr Ala Glu Lys Ala Met Arg Ala Thr 50 55 60 Cys Asp Tyr Thr Phe Pro Arg Arg Arg Cys Phe Cys His Phe Pro Cys 65 70 75 80 Gln

Claims (6)

1. 배추 꽃봉오리로부터 유래된 서열번호 1의 염기서열을 갖는 항균성 펩타이드 BSD1(Brassicastamen specific plantdefensin-like peptide1)을 코딩하는 cDNA.
2. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 항균성 펩타이드 BSD1.
3. 제 1항의 항균성 펩타이드 BSD1의 cDNA를 포함하는 식물체 전이용 벡터.
4. 제 3항의 식물체 전이용 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens).
5. 제 4항의아그로박테리움 투메파시엔스로 형질전환되어 BSD1을 발현하는 형질전환 식물체.
6. 제 5항에 있어서, 상기 식물체가 담배임을 특징으로 하는 형질전환 식물체.