KR100534458B1

KR100534458B1 - 갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 형질전환 식물체의제조방법

Info

Publication number: KR100534458B1
Application number: KR10-2003-0044672A
Authority: KR
Inventors: 송민호; 이선교; 유제근; 진석민
Original assignee: (주)넥스젠
Priority date: 2002-07-02
Filing date: 2003-07-02
Publication date: 2005-12-07
Also published as: WO2004005343A1; US20060059588A1; KR20040004143A; AU2003246084A1

Abstract

본 발명은 갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 식물 세포를 다음의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환하는 단계: (ⅰ) 갑상선 자극 호르몬 수용체 (hTSHR) 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체의 세포외 도메인 (hTSHR-ECD)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계를 포함하는 hTSHR 또는 hTSHR-ECD을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법, 형질전환 식물체 및 hTSHR 또는 hTSHR-ECD의 제조방법에 관한 것이다.

Description

갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법{Production of Transformed Plants Expressing Thyroid Stimulating Hormone Receptor}

본 발명은 갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 갑상선 자극 호르몬 수용체 (hTSHR) 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체의 세포외 도메인 (hTSHR-ECD)을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법, 형질전환 식물체 및 hTSHR 또는 hTSHR-ECD의 제조방법에 관한 것이다.

분자 재배 (Molecular farming)는 식물체에서 유전자 재조합 단백질을 생산하는 기술이다. 최근 선진국에서는 분자 재배의 의학적 이용 가능성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 여러 질환의 치료제로서, 유전자재조합 단백질이 널리 이용되고 있는 실정에서 이러한 유전자재조합 단백질을 경제적 가치가 크고 안전한 제품으로 개발하기 위해서는 분자 재배 기술이 유용할 것으로 기대되고 있다.

형질전환 동물 등에서 생산되는 의료용 단백질에 대해서는 광우병 등과 같은 인수공통 전염병의 위험성이 있어 장기적 안전성에 문제점이 제기되고 있으며, 제품생산에 있어서도 경제성이 낮다. 또한, 의료용 단백질을 원핵생물 발현 시스템 을 통해서 생산할 경우, 일부 단백질에서 2차 수식 (secondary modification)이 일어나지 않는 문제점이 있어 치료제로서 효과가 없는 경우가 있다. 그러나 식물체에서 분자 재배 기술로 생산되는 재조합 단백질은 인수공통전염병의 위험성이 없으며, 대량생산이 용이하며, 적절한 2차 수식으로 우수한 치료효과를 나타낼 수 있는 단백질을 경제적으로 생산할 수 있다.

세계적으로 전 인구의 약 10%는 류마티스성 관절염, 자가면역성 갑상선질환, 다발성 경화증, 인슐린 의존형 당뇨병, 자가면역성 피부질환 등의 다양한 자가면역질환에 이환 되어 있다. 모든 자가면역질환은 현재 근치적인 치료법이 없는 실정이며 주로 병증에 따라 치료하는 대증적 요법과 장기간의 면역억제 치료를 시행하고 있는 실정이다.

최근 면역학의 발전에 따라서 이러한 자가면역질환의 치료 및 예방에 있어서 경구 및 비강을 통한 자가항원 투여에 의해서 면역학적 관용성 (immunological tolerance)을 유도함으로써 자가면역반응을 억제하는 경구관용요법 (oral tolerance)이 동물실험을 거쳐 수년 내 사람의 자가면역질환 치료에 있어서 광범위하게 적용될 것으로 예상된다 (미합중국 특허 제 5,733,547 호).

경구관용요법의 임상적 사용을 위해서 해결해야할 가장 중요한 기술적 해결점은 어떻게 치료에 이용할 자가항원을 경제적인 방법을 통해서 대량 얻을 수 있는 가이다. 왜냐하면 경구관용요법의 가장 중심이 되는 개념은 대량의 자가항원을 경구 혹은 비강으로 투여하는 것이 절대적인 조건이기 때문이다.

본 발명자들은 인간자가항원 중 하나로 규명된 인간의 갑상선 자극 호르몬 수용체 (hTSHR)를 대량으로 생산할 수 있는 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, hTSHR 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체의 세포외 도메인 (hTSHR-ECD) 유전자로 형질전환된 식물체를 성공적으로 제조하고 이로부터 생산되는 hTSHR 또는 hTSHR-ECD가 항원성이 높다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 hTSHR 또는 hTSHR-ECD을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 hTSHR 또는 hTHSR-ECD를 발현하는 형질전환 식물체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 hTSHR 또는 hTSHR-ECD의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식물 세포를 다음의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환하는 단계: (ⅰ) 인간의 갑상선 자극 호르몬 수용체 (hTSHR) 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체의 세포외 도메인 (hTSHR-ECD)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시키는 단계를 포함하는 인간의 갑상선 자극 호르몬 수용체 (hTSHR) 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체의 세포외 도메인 (hTSHR-ECD)을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 의해 제조되고 hTSHR 또는 hTHSR-ECD를 발현하는 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명은 인체에서 갑상선 자가면역질환의 발생에 관여되는 자가항원 유전자 전체 또는 일부를 이용하여 형질전환 식물을 개발하고, 이로부터 진단용 및 치료용으로 대량의 대표적 인체자가항원인 인간의 갑상선 자극 호르몬 수용체 (human thyroid stimulating hormone receptor: hTSHR)를 제공한다.

인체의 자가항원인 hTSHR는 갑상선기능항진증의 발생에 있어서 자가항원으로 밝혀져 있다. hTSHR에 대한 항체는 갑상선 자극호르몬과 유사하게 갑상선 세포막에 발현되어있는 갑상선자극호르몬 수용체를 자극하여 갑상선 호르몬의 생성을 증가시켜 갑상선기능항진증을 유발한다. 따라서 hTSHR에 대한 IgG 항체의 검출은 갑상선기능항진증 환자의 진단에 이용될 수 있으며, 대량의 hTSHR를 생산할 수 있으면 경구관용요법에 이용할 수 있다.

환자에서 발견되는 hTSHR 항체는 원핵세포 발현 시스템에 의해서 발현된 유전자 재조합 단백질에는 결합하지 않는 것으로 밝혀져 있어 대장균에서 생산된 hTSHR는 환자의 IgG 항체 검출에 이용될 수 없다. 또한, 이러한 사실은 원핵세포에서 발현된 hTSHR가 면역원 (immunogen)으로서 작용하기 위해서는 당쇄화 (glycosylation)과 같은 2차 수식 (secondary modification)이 있어야 함을 시사한다. 따라서 진단용 항원이나 경구 관용요법에 사용하기 위해서 진핵세포 발현 시스템이 사용되어야 한다. 최근의 백시니아 바이러스 (vaccinia virus)를 이용한 발현 시스템으로 hTSHR을 발현할 경우에도 항체 결합의 친화도가 낮아 상용화가 어려운 것으로 알려졌다.

본 발명자들이 개발한 형질전환 식물체를 이용하는 인체 자가항원 생산기술은 인체의 단백질을 식물에서 대량으로 생산하는 기술로서 새로운 차세대 약물개발기술 (특히 자가면역치료에 이용되는 인체자가항원 생산기술)의 분야에서 핵심이 되는 기술이다.

본 발명에서는 hTSHR 또는 hTSHR의 전체 서열 중에서 세포외 도메인에 해당하는 hTSHR-ECD가 이용되기도 한다. hTSHR-ECD의 hTSHR의 항원으로서의 기능에 가장 중요한 부분이다 (GS Seetharamaiah, et al., Requirement of glycosylation of the human thyrotropin receptor ectodomain for its reactivity with autoantibodies in patients' sera, J. Immunol., 158:2798-2804(1997)).

한편, 본 발명에서 이용되는 hTSHR 또는 hTSHR의 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 공지된 서열 뿐만 아니라, 식물세포에서의 발현에 적합하도록 변형된 서열도 이용될 수 있다. 본 발명에서 이용되는 hTSHR의 뉴클레오타이드 서열의 예시적인 예는 첨부한 서열목록 제 1 서열과 같고, hTSHR의 뉴클레오타이드 서열의 예시적인 예는 서열목록 제 1 서열에서 뉴클레오타이드 1-1254이며, 이는 제 2 서열의 아미노산 서열에서 1-418에 해당하는 것이다. 식물세포에서의 발현에 적합하도록 서열을 변형시키는 것은 GC 함량의 조절 (약 50%), 식물 선호 코돈 사용 (codon usage)의 선택, 인트론 유사 서열 제거 등을 통하여 이루어진다 (Kusnadi et al., Biotechnol. Bioeng. 56:473-484(1997); WO 9116432).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 형질전환을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 쌀 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함한다.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 입자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 및 아그로박테리움-매개 형질전환 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-매개 형질전환이 가장 바람직하다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 일반적으로 잎 디스크, 그리고 다른 조직 (자엽 및 배축)을 가지고 실시된다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 쌍자엽 식물에서 가장 효율적이다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제 (예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 예시적인 표지는 글리코포스페이트 내성 유전자 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 시스템을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜드로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 형성된 형질전환 발근 신초는 적합한 식물 성장 배지에 치상된다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

한편, 본 발명자들은 신규한 형질전환 식물체 (예: 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채)를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 특정 식물체의 형질전환을 위한 가장 효율적인 방법을 구축하였다. 이러한 방법은 PCT/KR02/01461, PCT/KR02/01462 및 PCT/KR02/01463에 개시되어 있으며, 상기 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 방법은 다양한 식물체에 적용되지만, 바람직하게는 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채에 적용된다.

본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.

아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 식물 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)로 식물체의 익스플랜트를 감염시키는 단계: (ⅰ) hTSHR 또는 hTSHR-ECD를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b') 상기 감염된 익스플랜트를 재분화 배지에서 재분화하여 재분화 신초를 얻는 단계; 및 (c') 상기 재분화 신초를 발근 배지에서 배양하여 형질전환 식물체를 얻는 단계.

상기한 구체적인 일 실시예에서, 형질전환에 적합한 익스플랜트는 발아된 종자로부터 유래된 어떠한 조직도 포함하며, 바람직하게는 자엽 및 배축이고, 가장 바람직하게는 자엽이다. 종자의 발아는 적합한 배지를 이용하여 적합한 암/광조건 하에서 실시된다. 식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 가지고 실시된다 (Depicker, A. et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)).

보다 바람직하게는, pBin19, pRD400 및 pRD320과 같은 바이너리 벡터 시스템 이 이용된다 (An, G. et al., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986)). 본 발명에 적합한 바이너리 벡터는 (i) 식물에서 작동하는 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 구조 유전자; 및 (iii) 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 바이너리 벡터에 이용되는 프로모터의 예는 CaMV 35S 프로모터, 1 프로모터, 2 프로모터 및 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아그로박테이룸 튜머페이션스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테이룸 튜머페이션스의 배양물에 자엽을 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테이룸 튜머페이션스는 식물내로 감염된다.

아그로박테이룸 튜머페이션스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 신초의 재분화를 성공적으로 야기한다. 최종적으로, 발근 배지에서 재분화된 신초의 발근에 의해 형질전환 식물이 생산된다.

본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989).)

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 형질전환 식물체로부터 hTSHR 또는 hTHSR-ECD를 회수하는 단계를 추가적으로 포함한다. hTSHR 또는 hTHSR-ECD의 형질전환의 다양한 기관 (예: 줄기, 잎, 뿌리, 열매, 종자 등)으로부터 유래된 조직으로부터 얻을 수 있으며, 상기 조직으로부터 얻는 추출액을 통상적인 정제과정을 거쳐 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 정제 단계는 당업계에서 통상적으로 이용되는 정제방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 정제하게 된다.

따라서, 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인간의 갑상선 자극 호르몬 수용체 (hTSHR) 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체의 세포외 도메인 (hTSHR-ECD)의 제조방법을 제공한다: (a) 식물 세포를 다음의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환하는 단계: (ⅰ) hTSHR 또는 hTSHR-ECD를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 형질전환 식물체로부터 hTSHR 또는 hTHSR-ECD를 회수하는 단계.

현재 형질전환 식물체를 이용한 분자 재배 및 식용성 백신 기술은 새로운 치료제의 개발기술로서 부각되고 있다. 이러한 측면에서, 본 발명은 인간과 같은 진핵세포 발현 시스템에서 이루어지기 때문에, 최종적으로 생산된 hTSHR 또는 hTHSR-ECD가 2차 수식될 가능성이 높고 (즉, 항원성이 높고), 형질전환 식물체를 손쉽게 재배하여 인체 자가항원 hTSHR 또는 hTHSR-ECD를 대량으로 생산할 수 있는 이점이 있다. 본 발명에 의해 제조된 hTSHR 또는 hTHSR-ECD는 경구 관용요법에 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: tshr 유전자의 클로닝

GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 공지된 인간 tshr cDNA 정보 (XM-056624, XM-041159, XM-041157, M73747 및 BC009237)로부터 cDNA 염기서열을 확인하여 RT-PCR 방법으로 전장의 인간 tshr 유전자를 증폭하여 TA 벡터에 클로닝한 다음 시퀀싱하여 인간 tshr 유전자를 확인하였다.

i) tshr 유전자 전체의 클로닝

tshr 유전자 전체 (약 2.3 kb)를 PCR 기법을 이용하여 식물발현용 카세트를 갖는 벡터의 카세트에 서브클로닝하기 위하여, 먼저 GenBank 데이타베이스로부터 검색한 tshr 유전자 염기배열을 참고로 하여 디자인한 두개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하였다. tshr 유전자의 5'-플랭킹 부위에 위치하는 프라이머는 tshr 유전자의 출발 코돈과 카세트에의 클로닝을 위한 제한효소 BamHI의 인식부위를 포함하도록 디자인하였고 (5'-AAGGATCCC ATG AGG CCG GCG GAC-3'), 3'-플랭킹 부위에 위치하는 프라이머는 tshr 유전자의 정지 코돈과 카세트에의 클로닝을 위한 제한효소 BamHI의 인식부위를 포함하도록 디자인하였다 (5'-ATGGATCC TTA CAA AAC CGT TTG CAT-3').

PCR 시료 조성은 1.25 unit Taq DNA 중합효소 (Boehringer Mannheim), 2.5 ㎕ 10 x 완충액 (Boehringer Mannheim), 2 ㎕ 2.5 mM dNTP, 0.25 ㎕ 100 pM 프라이머, 50 ng tshr 유전자를 포함하는 DNA 총 25 ㎕로 수행하였다. PCR은 95℃에서 전변성 2분, 55℃에서 프라이머의 어닐링 1분, 72℃에서 신장반응 1분, 92℃에서 변성 1분, 72℃에서 최종 신장반응 10분의 조건으로 30회 반응하였다. PCR 후 시료를 분석하기 위하여 4℃로 유지하였고 0.8% TAE 아가로스 겔에 전기영동을 한 후, 상응하는 크기의 밴드를 용출하여 원하는 tshr DNA 단편을 회수하였다. 증폭된 DNA에서 tshr 유전자는 첨부한 서열목록 제 1 서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 글래스 밀크 등을 사용하여 정제한 tshr 유전자 단편을 적절한 제한효소로 절단한 후, 상응하는 제한효소로 절단한 식물발현용 카세트를 포함하고 있는 식물체 형질전환용 바이너리 벡터 (binary vector) pRD400 (Raju et al., Gene 211: 383-384(1992)) 내에 도입하여 도 1과 같은 tshr 유전자 식물발현용 카세트를 제작하였다.

ii) tshr 유전자 일부의 cloning

인체에서 tshr 유전자가 발현되었을 때 생산되는 단백질 중 세포 외로 노출되는 세포외 도메인 (extracellular domain)에 해당하는 유전자 (tshr-ecd, 약 1.24 kb)를 PCR 기법을 이용하여 식물발현용 벡터의 카세트에 서브클로닝하기 위하여, 먼저 GenBank 데이타베이스로부터 검색한 tshr 유전자 염기배열을 참고로 하여 디자인한 두개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하였다.

tshr 유전자의 5'-플랭킹 부위에 위치하는 프라이머는 tshr 유전자의 출발 코돈과 카세트에의 클로닝을 위한 제한효소 BamHI의 인식부위를 포함하도록 디자인하였고 (5'-AAGGATCCC ATG AGG CCG GCG GAC-3'), 3'-플랭킹 부위에 위치하는 프라이머는 tshr 유전자의 시작으로부터 세포외 도메인이 끝나는 1239번째 부근의 염기서열을 포함하도록 하며 새로운 정지 코돈과 카세트에의 클로닝을 위한 제한효소 BamHI의 인식부위를 포함하도록 디자인하였다 (5'-ATGGATCC TTA GCC CAT TAT GTC TTC-3').

PCR 시료조성은 1.25 unit Taq DNA 중합효소 (Boehringer Mannheim), 2.5 ㎕ 10x 완충액 (Boehringer Mannheim), 2 ㎕ 2.5 mM dNTP, 0.25 ㎕ 100 pM 프라이머, 50 ng tshr 유전자를 포함하는 DNA 총 25 ㎕로 수행하였다. PCR은 95℃에서 전변성 2분, 55℃에서 프라이머의 어닐링 1분, 72℃에서 신장반응 1분, 92℃에서 변성 1분, 72℃에서 최종 신장반응 10분의 조건으로 30회 반응하였다. PCR 후 시료를 분석하기 위하여 4℃로 유지하였고 0.8% TAE 아가로스 겔에 전기영동을 한 후, 상응하는 크기의 밴드를 용출하여 원하는 tshr DNA 단편을 회수하였다. 글래스 밀크 등을 사용하여 정제한 tshr-ecd 유전자 단편을 적절한 제한효소로 절단한 후 상응하는 제한효소로 절단한 식물발현용 카세트를 포함하고 있는 식물체 형질전환용 바이너리 벡터 (binary vector) pRD400 내에 도입하여 도 2와 같은 tshr-ecd 유전자 식물발현용 카세트를 제작하였다.

실시예 2: 식물 형질전환

i) Agrobacterium tumefaciens GV3101의 감염

식물체 형질전환용 바이너리 벡터 (binary vector) pRD400에 클로닝하여 획득한 실시예 1의 pRD400-tshr과 pRD400-tshr-ecd (도 3)를 컨쥬게이션에 의하여 각각 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens GV3101(mp90); Plant-cell-rep. 15(11):799-803(1996))로 도입시켰다. 유전자가 도입된 아그로박테리움을 선발하기 위하여 컨쥬게이션을 실시한 혼합액을 50 mg/L 가나마이신 및 30 mg/L 겐타마이신이 첨가된 LB 고체배지에 도말한 후, 28℃에서 2일 배양한 후 선별하였다. 선발된 유전자를 지닌 아그로박테리움을 슈퍼브로스 (BHI 배지, pH 5.6)에 접종한 후 28℃에서 2일간 배양한 후 식물체의 감염에 사용하였다.

ii) 참외 형질전환

소독한 참외 종자를 파종하여 확보한 자엽을 생장점이 완전히 배제되도록 자엽을 채취하였다. 한편, pRD400-tshr과 pRD400-tshr-ecd에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션tm를 100 μM 아세토시린곤 (acetosyringone)이 함유된 슈퍼 브로스 (Super broth: 37 g/L Brain heart infusion broth(Difco) 및 0.2% 수크로스, pH 5.6)에서 18시간 동안 28℃에서 배양한 다음, 배양액을 감염 배지를 이용하여 20배로 희석하였다. 상기 감염 배지 (pH 5.6)는 MSB5 (Murashige & Skoog medium including Gamborg B5 vitamins), 3.0% 수크로스, 0.5 g/LMES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid Monohydrate], 6.0 mg/L 키네틴, 1.5 mg/L IAA (Indole-3-acetic acid), 1.0 mg/L CuSO₄ㆍ5H₂O, 100 μM 아세토시린곤 및 5% DMSO (dimethylsulfoxide)를 포함한다.

이어, 상기 자엽을 감염 배지 40 ㎖에 침지시키고 20분 동안 배양하 후, 자엽을 공동배양 배지 (MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 6.0 mg/L 키네틴, 1.5 mg/L IAA, 1.0 mg/L CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.6% 아가, 100 μM 아세토시린곤 및 5% DMSO) 로 옮겼다. 암배양 조건 (26±1℃, 24시간 night)으로 3일 동안 공동배양 후, 자엽을 선발 배지 (MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 6.0 mg/L 키네틴, 1.5 mg/L IAA, 1.0 mg/L CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.6% 아가, pH5.6, 100 mg/L 카나마이신 및 500 mg/L카르베니실린)에 치상하고, 26±1℃ 온도와 4,000 Lux 조도에서 16시간 광조건에서 3주 동안 광배양 하여 신초의 발생을 유도하였다.

신장된 신초를 발근 배지 (MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 0.1 mg/L NAA (α-Naphtalene Acetic Acid), 1.0 mg/L CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.6% 아가, pH5.6, 100 mg/L카나마이신 및 500 mg/L 카르베니실린)에 이식하여 2주일 동안 배양하고, 형질전환된 것으로 추정되는 발근된 신초를 선별하였다.

iii) 오이 형질전환

소독한 오이 종자를 파종하여 확보한 자엽을 생장점이 완전히 배제되도록 자엽을 채취하였다. 한편, pRD400-tshr과 pRD400-tshr-ecd에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스를 상기의 i)과 같은 조건으로 배양하고 상기 오이 자엽 절편을 ii)참외형질전환과 동일한 방법으로 조제한 감염배지에 각각의 아그로바테리움을 혼합한 감염용액에 침지시켜 10분 동안 혼합하였다.

그런 다음, 2일 동안 26℃에서 광배양 조건으로 공동배양 배지 (BAP 2 mg/L, NAA 0.01 mg/L가 함유된 MSB5에서 광배양한 다음 저온 (4℃)에서 4일 동안 아그로박테리움 튜머페이션스 및 자엽을 공동배양 하였다. 그리고 나서, 자엽을 MS-B5, MES 0.5g/L, 3% 수크로스, 0.4% 피타겔을 기본으로 하는 선발 배지에 BAP 2 mg/L, NAA 0.01 mg/L, 카르베니실린 500 mg/L, 카나마이신 100mg/L을 추가하여 4주 동안 26±1℃ 및 8,000 Lux, 16시간/8시간 (광/암)의 조건에서 배양하였다.

이어, 재분화된 신초를 일정량의 NAA 0.01 mg/L, 카나마이신 100 mg/L 및 일정량의 아가 0.4%를 포함하는 발근 배지에 옮겨 26±1℃ 및 8,000 Lux, 16시간/8시간 (광/암)의 조건으로 배양하여 발근한 개체를 형질전환체로 추정하여 하기 실시예의 방법을 이용하여 분석하였다.

iv) 수박 형질전환

소독한 수박 종자를 파종하여 확보한 자엽을 생장점이 완전히 배제되도록 자엽을 채취하였다. 한편, pRD400-tshr과 pRD400-tshr-ecd에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스를 상기의 i)과 같은 조건으로 배양하고 상기 오이 자엽 절편을 ii)참외형질전환과 동일한 방법으로 조제한 감염배지에 각각의 아그로바테리움을 혼합한 감염용액에 침지시켜 10분 동안 혼합하였다. 그런 다음, BAP 2 mg/L가 함유된 공동 배양배지 (4.04 g/L MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 0.6% agar, pH 5.6)에 치상하고, 4000 Lux로 16시간의 광배양 조건에서 2일간 25℃±1℃로 배양하였다. 배양한 자엽은 배지 (MSB5, BAP 2 mg/L, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 0.4% 피타겔, pH 5.6, 카베니실린 500 mg/L, 카나마이신 200 mg/L)에 치상 후 7일간 25℃±1℃에서 4주간 배양하여 신초를 선발하였다.

v) 유채 형질전환

소독한 유채 종자를 파종하여 확보한 자엽을 생장점이 완전히 배제되도록 엽병을 채취하였다. 한편, pRD400-tshr과 pRD400-tshr-ecd에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스를 상기의 i)과 같은 조건으로 배양하고 상기 유채 엽병을 ii)참외형질전환과 동일한 방법으로 조제한 감염배지에 각각의 아그로박테리움을 혼합한 감염용액에 침지시켜 10분 동안 혼합하였다. 그런 다음 공동 배지 (MSB5, 3% 수크로스, 1 mg/L 2,4-D, 6.5 g/L 아가 파우어, pH 5.8)에 25℃에서 2일 배양한 후 4℃에서 4일 배양하였다.

형질전환된 유채를 선별하기 위하여 선발 배지 (MSB5, 3% 수크로스, 5 g/L MES, 2 mg/L BA, 0.01 mg/L NAA, 20 mg/L 카나마이신, 500 mg/L 수도펜, 6.5 g/L 아가 파우어, pH 5.8)으로 옮긴 후 2주 동안 25℃, 16h 명/ 8h 암 조건에서 배양하였다. 2주 이후 성장한 신초의 뿌리를 유도하기 위하여 MSB5, 3% 수크로스, 5 g/L MES, 0.1 mg/L NAA, 20 mg/L 카나마이신, 500 mg/L 수도펜, 6.5 g/L 아가, pH 5.8인 배지로 옮긴 후 뿌리를 유도하였다.

vi) 담배 형질전환

소독한 담배 종자를 파종하여 2주 이상 무균 배양한 신선하고 어린 담배잎을 채취하였다. pRD400-tshr과 pRD400-tshr-ecd에 의해 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스를 실시예 2 i) 과 같이 배양하여 실시예2 ii) 참외형질전환과 동일한 방법으로 조제한 감염배지에 혼합하였다. 이 감염용액에 채취한 담배잎을 0.5-1 ㎠의 크기로 절단하여 10-15분 동안 침지시킨 후, 공동배양 배지 (MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/L MES, 1.0 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA, pH5.8, 0.6% 아가)로 옮겼다.

암배양 조건 ( 26±1℃, 24시간 night)으로 2일 동안 공동배양 후, 잎 절편을 선발 배지 (MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/LMES, 1.0 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA, 0.6% 아가, pH5.6, 100 mg/L 카나마이신 및 500 mg/L 카르베니실린)에 치상하고, 26±1℃ 온도와 4,000 Lux 조도에서 16시간 광조건에서 2주 동안 광배양 하여 신초의 발생을 유도하였다. 신장된 신초를 발근 배지 (MSB5, 3.0% 수크로스, 0.5 g/LMES, 0.01 mg/L NAA, 0.6% 아가, pH5.6, 100 mg/L카나마이신 및 500 mg/L 카르베니실린)에 이식하여 2주일 동안 배양하며 형질전환된 것으로 추정되는 발근된 신초를 선별하였다.

실시예 3: 식물 형질전환체의 PCR 확인

상기 실시예 2에서 확보한 형질전환체의 확인은 다음과 같이 실시하였다:

선발 배지에서 형질전환체로 선발된 신초 10 mg으로부터 Edwards 방법 (Nucleic Acids Research, 19:1349(1991))을 사용하여 식물 지놈 DNA를 분리한 후, 이를 주형 DNA로 하여 PCR 분석을 실시하였다.

pRD400-tshr의 형질전환식물체의 PCR 분석에서 사용된 프라이머는 tshr 유전자의 염기 서열에 대응하는 것으로서, 전방향 프라이머는 5'-AAGGATCCC ATG AGG CCG GCG GAC-3'이고, 역방향 프라이머는 5'-ATGGATCC TTA CAA AAC CGT TTG CAT-3'이다.

pRD400-tshr-ecd의 형질전환식물체의 PCR 분석에서 사용된 프라이머는 tshr-ecd 유전자의 염기 서열에 대응하는 것으로서, 전방향 프라이머는 5'-AAGGATCCC ATG AGG CCG GCG GAC-3'이고, 역방향 프라이머는 5'-ATGGATCC TTA GCC CAT TAT GTC TTC-3'이다.

PCR 반응은 Taq 중합효소를 이용하여, 96℃에서 2분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장반응을 하였고, 반응 산물은 1.0% 아가로스 겔에서 분석하였다.

도 4에서 M 레인은 1 kb 레더, 1 레인은 유전자를 포함하는 양성표준 플라스미드 pRD400-tshr의 PCR 산물, 2 레인은 야생종 담배의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물, 3, 4, 5, 6 및 7 레인은 각각 선발된 유채, 담배, 참외, 오이 및 수박의 DNA를 주형으로 한 PCR 산물들을 로딩한 것이다. 도 4에서 확인할 수 있듯이, 형질전환체에 해당하는 레인에서는 tshr 유전자에 해당하는 2.3 kb의 밴드가 관찰되어 상기 실시예에서 식물 형질전환이 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있다.

도 5에서 M 레인은 1 kb 레더, 1 레인은 유전자를 포함하는 양성표준 플라스미드 pRD400-tshr-ecd의 PCR 산물, 2 레인은 야생종 담배의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물, 3, 4, 5, 6 및 7 레인은 각각 선발된 유채, 담배, 참외, 오이 및 수박의 DNA를 주형으로 한 PCR 산물들을 로딩한 것이다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, 형질전환체에 해당하는 레인에서는 tshr-ecd 서열에 해당하는 1.3 kb의 밴드가 관찰되어 상기 실시예에서 식물 형질전환이 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있다.

실시예 4: 식물 형질전환체 내 TSHR 또는 TSHR-ECD 단백질의 웨스턴 블롯 분석

형질전환식물체의 잎 1 g을 잘라서 막자사발에 넣고 미리 제조한 2.5 ㎖ 추출완충액 (5 ㎖ 100 mM Tris-Cl, pH 7.5, 40 ㎕ 500 mM EDTA, pH 8.0, 1.5 ㎖ 1 mg/㎖ 루펩틴, 600 ㎕ 5 mg/㎖ BSA, 3 ㎖ 1 mg/㎖ DTT, 사용직전에 30 mg/㎖ PMSF (스톡용액; 0.003 g PMSF in 10 ㎕ IPA) 50 ㎕를 첨가)를 가하여 미세하게 갈았다. 추출액을 12,000 rpm, 4℃에서 30분 이상 원심 분리한 후 상층액을 취하여 새 튜브로 옮기고 얼음에 보관하였다. 상기의 식물 추출액에 다이 시약 (Protein assay kit, Bio-Rad)를 넣고 UV-스펙트로포토미터로 595 nm에서 흡광도를 측정하고 소혈청 알부민 표준물질과 비교해서 브래드포드 방법에 의해 형질전환식물체의 단백질 정량을 실시하였다. 그런 다음, 상기 상등액을 단백질의 양이 동일하도록 조정하여 각각 시료로 하여 8% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 하였다.

상기의 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 하여 나타난 단백질 밴드를 PVDF 멤브레인에 전이한 후, 단백질이 전이된 PVDF 멤브레인에 1차 항체 (anti TSHR-rabbit, 1:1000 희석, Santa Cruz Biotechnology.Inc)를 가하여 1시간 배양을 하였다. 배양 후 멤브레인을 세척한 후 2차 항체 (rabbit-goat HRP, 1:1000희석, Santa Cruz Biotechnology.Inc)를 가하고 다시 1시간 배양을 하고 멤브레인을 세척하였다. 항체의 부착이 완결된 후 4-클로로-1-나프톨 (4-CN)을 기질로 하여 발색반응을 실시하여 TSHR 단백질의 예상 크기에의 발색밴드 (약 76 kDa)를 조사하여 TSHR 단백질의 존재를 확인하였다 (참조: 도 6).

실시예 5: 식물체에서 발현된 TSHR 및 TSHR-ECD의 ELISA 분석

형질전환 식물체의 잎 1 g을 잘라서 막자사발에 넣고, 미리 제조한 1 ㎖ PBS완충액 (20 mM 포타슘 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 7.4)를 가하여 미세하게 갈았다. 추출액을 10,000 rpm, 4℃에서 5분 이상 원심 분리한 후 상층액을 취하여 새 튜브로 옮기고 얼음에 보관하였다. ELISA 플레이트 96-웰에 PBS 완충액을 각각 50㎕ 씩 분주하였다. 그리고 도 7에서 나타낸 것과 같이 해당하는 ELISA 플레이트 웰에 음성대조군으로 야생종 담배의 추출물을 각각 분주하였고, pRD400-tshr 또는 pRD400-tshr-ecd로 형질전환된 유채, 담배, 참외, 오이 및 수박 형질전환체의 추출물들을 해당 웰에 각각 분주한 후, 4℃의 습윤 챔버 (moisture chamber)에서 14시간 동안 추출물들을 웰에 코팅하였다.

코팅된 플레이트의 웰들을 각각 200 ㎕ 세정 완충액 (PBS 완충액 + 0.2% Tween20)으로 4-5회 세척한 다음, 4℃의 희석 완충액 (세정 완충액 + 5% 시킴 밀크) 50 ㎕를 첨가하여 37℃의 습윤 챔버에서 1시간 동안 블롯킹을 실시하였다. 블러킹을 종료한 후, 다시 200 ㎕ 세정 완충액으로 각 웰을 4-5회 세척하고 연속 희석한 그레이브 병의 환자 혈청을 각 농도별 (1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200, 1/6400 및 1/12800)로 50 ㎕씩 A 레인에서 H 레인까지 도 7과 같이 첨가하였으며 4℃에서 2시간 방치하였다. 위와 같이 200 ㎕ 세정 완충액으로 세척한 후, 4℃의 블롯킹 완충액 (PBS 완충액 + 1% BSA, 5% 수크로스, 0.05% NaN₃) 300 ㎕를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 블러킹을 실시하였다. 블러킹을 종료한 후, 다시 200 ㎕ 세정 완충액으로 각 웰을 3회 세척하였으며, 10 ㎕의 희석한 IgG 컨쥬게이트 (퍼옥시다아제 레이블링, 1/1000 희석)를 넣어 4℃에서 1시간 동안 방치하였다.

그 다음 세정 완충액으로 세척하고 ABST 퍼옥시다아제 기질 (KPL corp. U.S.A.)를 첨가하여 30분 반응 후 50 ㎕의 정지 완충액을 넣어 반응을 정지시켰다. 반응 종료 후 ELISA 리더 (TECAN sunrise)를 사용하여 405 nm에서 반응의 정도를 측정하였다. tshr 유전자가 도입된 형질전환 식물체에서 생산된 재조합단백질들에 대한 측정 결과는 도 7에 나타낸 것처럼, 약 1/5000으로 희석한 재조합단백질 시료들에서도 명확한 반응을 나타내고 있으므로 형질전환 식물체에서 기능적인 TSHR 단백질들이 생산되고 있다는 것을 알 수 있다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 인간의 갑상선 자극 호르몬 수용체 (hTSHR) 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체의 세포외 도메인 (hTSHR-ECD)을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법 및 형질전환 식물체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기한 형질전환 식물체로부터 hTSHR 또는 hTSHR-ECD를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 인간과 같은 진핵세포 발현 시스템에서 이루어지기 때문에, 최종적으로 생산된 hTSHR 또는 hTHSR-ECD가 2차 수식될 가능성이 높고, 형질전환 식물체를 손쉽게 재배하여 인체 자가항원 hTSHR 또는 hTHSR-ECD를 대량으로 생산할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 인간의 갑상선 자극 호르몬 수용체 유전자 (tshr)의 식물발현용 카세트를 나타내는 도면;

도 2는 갑상선 자극 호르몬 수용체의 세포외 도메인 유전자 (tshr-ecd)의 식물발현용 카세트를 나타내는 도면;

도 3은 식물체 형질전환용 벡터 pRD400에 클로닝된 tshr 또는 tshr-ecd를 나타내는 도면;

도 4는 tshr 형질전환식물체에서 형질전환된 tshr 유전자의 PCR 결과를 보여주는 사진;

도 5는 tshr-ecd 형질전환식물체에서 형질전환된 tshr-ecd 유전자의 PCR 결과를 나타내는 사진;

도 6은 형질전환 식물체에서의 TSHR 단백질의 발현을 확인한 웨스턴 블롯 분석을 나타내는 사진; 및

도 7은 그레이브 병의 환자로부터 얻은 IgGs를 이용하여 형질전환 식물에서생산된 TSHR 단백질의 ELISA 분석을 나타내는 사진.

<110> NEXGEN BIOTECHNOLOGIES, INC. <120> Production of Transformed Plants Expressing Thyroid Stimulating Hormone Receptor <150> KR2002-38064 <151> 2002-07-02 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2292 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2289) <400> 1 atg agg ccg gcg gac ttg ctg cag ctg gtg ctg ctg ctc gac ctg ccc 48 Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro 1 5 10 15 agg gac ctg ggc gga atg ggg tgt tcg tct cca ccc tgc gag tgc cat 96 Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His 20 25 30 cag gag gag gac ttc aga gtc acc tgc aag gat att caa cgc atc ccc 144 Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro 35 40 45 agc tta ccg ccc agt acg cag act ctg aag ctt att gag act cac ctg 192 Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu 50 55 60 aga act att cca agt cat gca ttt tct aat ctg ccc aat att tcc aga 240 Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg 65 70 75 80 atc tac gta tct ata gat gtg act ctg cag cag ctg gaa tca cac tcc 288 Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser 85 90 95 ttc tac aat ttg agt aaa gtg act cac ata gaa att cgg aat acc agg 336 Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg 100 105 110 aac tta act tac ata gac cct gat gcc ctc aaa gag ctc ccc ctc cta 384 Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu 115 120 125 aag tcc ttg gca ttt tca aac act gga ctt aaa atg ttc cct gac ctg 432 Lys Ser Leu Ala Phe Ser Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu 130 135 140 acc aaa gtt tat tcc act gat ata ttc ttt ata ctt gaa att aca gac 480 Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp 145 150 155 160 aac cct tac atg acg tca atc cct gtg aat gct ttt cag gga cta tgc 528 Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys 165 170 175 aat gaa acc ttg aca ctg aag ctg tac aac aat ggc ttt act tca gtc 576 Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val 180 185 190 caa gga tat gat ttc ttt ggg aca aag ctg gat gct gtt tac cta aac 624 Gln Gly Tyr Asp Phe Phe Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn 195 200 205 aag aat aaa tac ctg aca gtt att gac aaa gat gca ttt gga gga gta 672 Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val 210 215 220 tac agt gga cca agc ttg ctg gac gtg tct caa acc agt gtc act gcc 720 Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala 225 230 235 240 ctt cca tcc aaa ggc ctg gag cac ctg aag gaa ctg ata gca aga aac 768 Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn 245 250 255 agc tgg act ctt aag aaa ctt gca ctt tcc ttg agt ttc ctt cac ctc 816 Ser Trp Thr Leu Lys Lys Leu Ala Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu 260 265 270 aca cgg gct gac ctt tct tac cca agc cac tgc tgt gct ttt aag aat 864 Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn 275 280 285 cag aag aaa atc aga gga atc ctt gag tcc ttg atg tgt aat gag agc 912 Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser 290 295 300 agt atc gag acg ttg cgc cag aga aaa tct gtg aat gcc ttg aat agc 960 Ser Ile Glu Thr Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser 305 310 315 320 ccc ctc cac cag gaa tat gaa gag aat ctg ggt gac agc att gtt ggg 1008 Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly 325 330 335 tac aag gaa aag tcc aag ttc cag gat act cat aac aac gct cat tat 1056 Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr 340 345 350 tac gtc ttc ttt gaa gaa caa gag gat gag atc att ggt ttt ggc cag 1104 Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln 355 360 365 gag ctc aaa aac ccc cag gaa gag act cta caa gct ttt gac agc cat 1152 Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His 370 375 380 tat gac tac acc ata tgt ggg gac agt gaa gac atg gtg tgt acc ccc 1200 Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro 385 390 395 400 aag tcc gat gag ttc aac ccg tgt gaa gac ata atg ggc tac aag ttc 1248 Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe 405 410 415 ctg aga att gtg gtg tgg ttc gtt agt ctg ctg gct ctc ctg ggc aat 1296 Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn 420 425 430 gtc ttt gtc ctg ctt att ctc ctc acc agc cac tac aaa ctg aac gtc 1344 Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val 435 440 445 ccc cgc ttt ctc atg tgc aac ctg gcc ttt gcg gat ttc tgc atg ggg 1392 Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly 450 455 460 atg tac ctg ctc ctc atc gcc tct gta gac ctc tac act cac tct gag 1440 Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu 465 470 475 480 tac tac aac cat gcc atc gac tgg cag aca ggc cct ggg tgc aac acg 1488 Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr 485 490 495 gct ggt ttc ttc act gtc ttt gca agc gag tta tcg gtg tat acg ctg 1536 Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu 500 505 510 acg gtc atc acc ctg gag cgc tgg tat gcc atc acc ttc gcc atg gcc 1584 Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Ala 515 520 525 ctg gac cgg aag atc cgc ctc agg cac gca tgt gcc atc atg gtt ggg 1632 Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly 530 535 540 ggc tgg gtt tgc tgc ttc ctt ctc gcc ctg ctt cct ttg gtg gga ata 1680 Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile 545 550 555 560 agt agc tat gcc aaa gtc agt atc tgc ctg ccc atg gac acc gag acc 1728 Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr 565 570 575 cct ctt gct ctg gca tat att gtt ttt gtt ctg acg ctc aac ata gtt 1776 Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val 580 585 590 gcc ttc gtc atc gtc tgc tgc tgt tat gtg aag atc tac atc aca gtc 1824 Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val 595 600 605 cga aat ccg cac aac cca ggg gac aaa gat acc aaa att gcc aag agg 1872 Arg Asn Pro His Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys Arg 610 615 620 atg gct gtg ttg atc ttc acc gac ttc acg tgc atg gcc cca atc tca 1920 Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Thr Cys Met Ala Pro Ile Ser 625 630 635 640 ttc tat gct gtg tca gca att ctg aac aag cct ctc atc act gtt agc 1968 Phe Tyr Ala Val Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val Ser 645 650 655 aac tcc aaa atc ttg ctg gta ctc ttc tat cca att aac tcc tgt gcc 2016 Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala 660 665 670 aat cca ttc ctc tat gct att ttc acc aag gcc ttc cag agg gat gtg 2064 Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp Val 675 680 685 ttc atc cta ctc agc aag ttt ggc atc tgt aaa cgc cag gct cag gca 2112 Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln Ala 690 695 700 tac cgg ggg cag agg gtt cct cca aag aac agc act gat att cag gtt 2160 Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln Val 705 710 715 720 caa aag gtt acc cac gac atg agg cag ggt ctc cac aac atg gaa gat 2208 Gln Lys Val Thr His Asp Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu Asp 725 730 735 gtc tat gaa ctg att gaa aac tcc cat cta acc cca aag aag caa ggc 2256 Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln Gly 740 745 750 caa atc tca gaa gag tat atg caa acg gtt ttg t aa 2292 Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu 755 760 <210> 2 <211> 763 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Pro Ala Asp Leu Leu Gln Leu Val Leu Leu Leu Asp Leu Pro 1 5 10 15 Arg Asp Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His 20 25 30 Gln Glu Glu Asp Phe Arg Val Thr Cys Lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro 35 40 45 Ser Leu Pro Pro Ser Thr Gln Thr Leu Lys Leu Ile Glu Thr His Leu 50 55 60 Arg Thr Ile Pro Ser His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg 65 70 75 80 Ile Tyr Val Ser Ile Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser 85 90 95 Phe Tyr Asn Leu Ser Lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg 100 105 110 Asn Leu Thr Tyr Ile Asp Pro Asp Ala Leu Lys Glu Leu Pro Leu Leu 115 120 125 Lys Ser Leu Ala Phe Ser Asn Thr Gly Leu Lys Met Phe Pro Asp Leu 130 135 140 Thr Lys Val Tyr Ser Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp 145 150 155 160 Asn Pro Tyr Met Thr Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu Cys 165 170 175 Asn Glu Thr Leu Thr Leu Lys Leu Tyr Asn Asn Gly Phe Thr Ser Val 180 185 190 Gln Gly Tyr Asp Phe Phe Gly Thr Lys Leu Asp Ala Val Tyr Leu Asn 195 200 205 Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Val Ile Asp Lys Asp Ala Phe Gly Gly Val 210 215 220 Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Asp Val Ser Gln Thr Ser Val Thr Ala 225 230 235 240 Leu Pro Ser Lys Gly Leu Glu His Leu Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asn 245 250 255 Ser Trp Thr Leu Lys Lys Leu Ala Leu Ser Leu Ser Phe Leu His Leu 260 265 270 Thr Arg Ala Asp Leu Ser Tyr Pro Ser His Cys Cys Ala Phe Lys Asn 275 280 285 Gln Lys Lys Ile Arg Gly Ile Leu Glu Ser Leu Met Cys Asn Glu Ser 290 295 300 Ser Ile Glu Thr Leu Arg Gln Arg Lys Ser Val Asn Ala Leu Asn Ser 305 310 315 320 Pro Leu His Gln Glu Tyr Glu Glu Asn Leu Gly Asp Ser Ile Val Gly 325 330 335 Tyr Lys Glu Lys Ser Lys Phe Gln Asp Thr His Asn Asn Ala His Tyr 340 345 350 Tyr Val Phe Phe Glu Glu Gln Glu Asp Glu Ile Ile Gly Phe Gly Gln 355 360 365 Glu Leu Lys Asn Pro Gln Glu Glu Thr Leu Gln Ala Phe Asp Ser His 370 375 380 Tyr Asp Tyr Thr Ile Cys Gly Asp Ser Glu Asp Met Val Cys Thr Pro 385 390 395 400 Lys Ser Asp Glu Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Lys Phe 405 410 415 Leu Arg Ile Val Val Trp Phe Val Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gly Asn 420 425 430 Val Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ser His Tyr Lys Leu Asn Val 435 440 445 Pro Arg Phe Leu Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Phe Cys Met Gly 450 455 460 Met Tyr Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Asp Leu Tyr Thr His Ser Glu 465 470 475 480 Tyr Tyr Asn His Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Pro Gly Cys Asn Thr 485 490 495 Ala Gly Phe Phe Thr Val Phe Ala Ser Glu Leu Ser Val Tyr Thr Leu 500 505 510 Thr Val Ile Thr Leu Glu Arg Trp Tyr Ala Ile Thr Phe Ala Met Ala 515 520 525 Leu Asp Arg Lys Ile Arg Leu Arg His Ala Cys Ala Ile Met Val Gly 530 535 540 Gly Trp Val Cys Cys Phe Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Val Gly Ile 545 550 555 560 Ser Ser Tyr Ala Lys Val Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Thr Glu Thr 565 570 575 Pro Leu Ala Leu Ala Tyr Ile Val Phe Val Leu Thr Leu Asn Ile Val 580 585 590 Ala Phe Val Ile Val Cys Cys Cys Tyr Val Lys Ile Tyr Ile Thr Val 595 600 605 Arg Asn Pro His Asn Pro Gly Asp Lys Asp Thr Lys Ile Ala Lys Arg 610 615 620 Met Ala Val Leu Ile Phe Thr Asp Phe Thr Cys Met Ala Pro Ile Ser 625 630 635 640 Phe Tyr Ala Val Ser Ala Ile Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val Ser 645 650 655 Asn Ser Lys Ile Leu Leu Val Leu Phe Tyr Pro Ile Asn Ser Cys Ala 660 665 670 Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Ile Phe Thr Lys Ala Phe Gln Arg Asp Val 675 680 685 Phe Ile Leu Leu Ser Lys Phe Gly Ile Cys Lys Arg Gln Ala Gln Ala 690 695 700 Tyr Arg Gly Gln Arg Val Pro Pro Lys Asn Ser Thr Asp Ile Gln Val 705 710 715 720 Gln Lys Val Thr His Asp Met Arg Gln Gly Leu His Asn Met Glu Asp 725 730 735 Val Tyr Glu Leu Ile Glu Asn Ser His Leu Thr Pro Lys Lys Gln Gly 740 745 750 Gln Ile Ser Glu Glu Tyr Met Gln Thr Val Leu 755 760

Claims

다음의 단계를 포함하는 인간의 갑상선 자극 호르몬 수용체 (hTSHR) 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체의 세포외 도메인 (hTSHR-ECD)을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법:

(a) 식물 세포를 다음의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환하는 단계: (ⅰ) hTSHR를 코딩하는 서열번호 1 기재의 뉴클레오타이드 서열 또는 hTSHR-ECD를 코딩하는 서열번호 1 기재의 1-1254 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위;

(b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및

(c) 상기 형질전환된 식물세포를 재분화 배지에서 재분화하여 재분화 신초를 얻고, 이를 발근 배지에서 배양하여 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 식물체는 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 형질전환은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 아그로박테리움 시스템은 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 최종적으로 얻은 형질전환 식물체로부터 hTSHR 또는 hTHSR-ECD를 회수하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고 hTSHR 또는 hTHSR-ECD를 발현하며, 형질전환 식물세포의 재분화에 의하여 무성번식 되는 형질전환 식물체.
다음의 단계를 포함하는 인간의 갑상선 자극 호르몬 수용체 (hTSHR) 또는 갑상선 자극 호르몬 수용체의 세포외 도메인 (hTSHR-ECD)의 제조방법:

(a) 식물 세포를 다음의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환하는 단계: (ⅰ) hTSHR 또는 hTSHR-ECD를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위;

(b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계;

(c) 상기 형질전환된 식물세포를 재분화 배지에서 재분화하여 재분화 신초를 얻고, 이를 발근 배지에서 배양하여 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및

(d) 상기 형질전환 식물체로부터 hTSHR 또는 hTHSR-ECD를 회수하는 단계.
제 6 항에 있어서, 상기 식물체는 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 형질전환은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 아그로박테리움 시스템은 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템인 것을 특징으로 하는 방법.