KR100508500B1

KR100508500B1 - 식물체에서 발현된 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드단백질을 포함하는 신증후출혈열 진단 키트

Info

Publication number: KR100508500B1
Application number: KR10-2003-0049089A
Authority: KR
Inventors: 이선교; 주용규; 정남준; 이인희; 박선희; 유제근; 짐 맥펄슨; 코렛트 제이코
Original assignee: (주)넥스젠
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2005-08-17
Also published as: KR20050010177A

Abstract

본 발명은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드 및 그를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물 형질전환체를 제공한다. 본 발명은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법 및 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공한다. 한편, 본 발명은 신증후출혈열의 항체 진단용 키트 및 신증후출혈열의 항체 측정 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 저비용으로 우수한 항원성을 나타내는 신 놈브레 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 얻을 수 있고, 이를 이용하는 경우에는 우수한 민감도 및 특이성으로 신증후출혈열을 진단할 수 있다.

Description

식물체에서 발현된 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 신증후출혈열 진단 키트{Diagnosis Kits for Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Comprising Nucleocapsid Protein from Sin Nombre Virus Expressed in Plants}

본 발명은 식물체에서 발현된 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하는 신증후출혈열 진단 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규 폴리뉴클레오타이드, 그를 포함하는 식물발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물체, 신증후출혈열의 항체 진단용 키트 및 신증후출혈열의 항체 측정 방법에 관한 것이다.

유행성출혈열은 고열, 신부전, 출혈 등을 특징으로 하는 급성 열성질환으로 분야비리대과 (bunyaviridae)의 한타바이러스 (Hantavirus) 속에 속하는 바이러스들에 의해 발생하는 전신 감염질환이다. 이 질환은 전세계적으로 발병되는 전염병으로서, 1982년 WHO에서는 유행성출혈열과 유사한 소련의 출혈성 신염 (hemorrhagic nephrosonephritis), 스칸디나비아 국가들의 유행성 신염 (nephrophthia epidemica) 및 중국의 송고열 (Songo fever) 등을 통합하여 신증후출혈열 (hemorrhagic fever with renal syndrome)로 명명하였다.

현재까지 많은 수의 한타바이러스 균주들이 신증후출혈열 환자 및 한타바이러스 폐 증후군 환자의 혈액과 조직, 그리고 이 바이러스의 자연계 숙주동물인 비단털쥐과 (Family Cricertidae)와 쥐과 (Family Muridae)에 속하는 많은 종의 설치류의 폐장조직에서 분리된 바 있다 (Chu et al., Serological relationships among viruses in the Hantavirus genus, family Bunyaviridae. Virology 198:196-204(1994)).

현재까지 사람에게 질병을 유발하는 것이 확인된 바이러스로는 신 놈브레 바이러스 (Sin Nombre virus) 혈청형, 한탄바이러스 (Hantaan virus) 혈청형, 서울바이러스 (Seoul virus) 혈청형, 벨그레이드바이러스 (Belgrade virus) 혈청형, 푸말라바이러스 (Puumala virus) 혈청형 및 블랙크릭카날바이러스 (Black Creek Canal virus) 혈청형이 있으며, 병원성이 아직 밝혀지지 않은 바이러스로는 프로스펙트힐바이러스 (Prospect Hill virus) 혈청형, 타이바이러스 (Thailand virus) 혈청형 및 소타팔리얌바이러스 (Thottapalayam virus) 혈청형 등이 있다 (Xiao et al., Phylogenetic analyses of virus isolates in the genus Hantavirus, family Bunyaviridae. Virology 198:205-217(1994)). 이들 9개의 바이러스 혈청형은 각각의 혈청형에 속하는 바이러스에 따라 숙주동물을 달리한다.

신 놈브레 바이러스는 1993년 미국 남서부에서 포 코너 (Four Corners) 또는 무에르토 캐논 바이러스 (Muerto Canyon virus)라는 이름으로 처음 발견되었으며 (Nichol et al., Genetic identification of a hantavirus associated with an outbreak of acute respiratory illness. Science 262:914-917(1993)), 이 바이러스에 의해 유발된 출혈열은 치사율이 60% 이상에 달했으며, 이 바이러스의 일차 숙주는 사슴쥐 (Peromyscus maniculatus)로 밝혀졌다 (Childs et. al., Serologic and genetic identification of Peromyscus maniculatus as the primary rodent reservoir for a new hantavirus in southwestern United States. J. Infect. Dis. 169:1271-1280(1994)).

분야비리대과의 한타바이러스 (Hantavirus) 속에 속하는 신 놈브레 바이러스는 약 100 nm 정도의 소형 negative-sense RNA 바이러스로, 유전자는 3분절로 이루어진 단선 구조로, 대 (L, large) 분절, 중 (M, middle) 분절 및 소 (S, small) 분절로 구성되어 있다. 이 RNA는 각기 자신의 뉴클레오캡시드 구조를 가지며 G1과 G2라는 당단백질로 만들어진 하나의 지질막에 감싸여 있다.

신 놈브레 바이러스의 구조 단백질 중에서 면역반응에 관여하는 것은 뉴클레오캡시드 단백질과 G1, G2 막단백질이다. S 분절 RNA는 분자량이 48 kDa인 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하고, M 분절 RNA는 분자량이 125-127 kDa 인 GPC 폴리단백질 전구체를 만들어내며 이 전구체는 대사과정을 거쳐 2개의 막 당단백질인 G1과 G2로 변환된다. L 분절 RNA는 대략 250 kDa의 RNA 의존형 RNA 중합효소를 코딩한다 (Elliott et al., Bunyaviridae genome structure and gene expression. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 169:91-141(1991)).

전세계적으로 매년 20 만 명 이상의 신증후출혈열 환자가 발생하는 것으로 알려져 있으며, 우리 나라의 경우 매년 약 1,000 명 가량의 신증후출혈열 환자 발생이 보고되고 있다. 현재는 백신개발에 의해 신증후출혈열 환자의 발생건수는 많이 줄었으나, 전세계적으로는 여전히 발생이 되고 있으며, 특히 미국의 경우 해외에 주둔하고 있는 미군들에게서 신증후출혈열 환자가 계속 발생하여 이를 막기 위한 방법을 지속적으로 시도하고 있다. 이에 따라 항원을 이용하여 신증후출혈열 환자를 진단할 수 있는 진단키트 및 진단시약의 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신 놈브레 바이러스의 전체 유전자 중에서 항원성이 가장 우수한 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 식물체에 형질전환하여 식물 형질전환체를 얻은 다음, 이로부터 분리·정제된 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 항원 단백질이 바이러스와 동일한 면역학적 항원성을 나타내는 것을 확인하고, 이를 신 놈브레 바이러스에 의한 신증후출혈열을 진단하는 데 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드를을 포함하는 식물발현용 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 식물 형질전환체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 신증후출혈열의 항체 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신증후출혈열의 항체 측정 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부를 포함하는 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 신규한 폴리뉴클레오타이드는 항원으로 작용할 수 있는 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 것으로서, 식물체내에서의 발현을 최적화 하기 위하여 변형된 서열을 갖는다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 디자인은 다음과 같은 기준에 의해 실시된다: (ⅰ) GC 함량을 50% 이상으로 하고, (ⅱ) 식물이 선호하는 코돈을 갖도록 하며, (ⅲ) 인트론 유사 서열을 제거하는 것이다.

본 발명의 신규한 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 일부의 서열도 포함한다. 즉, 상기 일부 서열에 의 해 코딩되는 아미노산 서열이 항원성을 나타내는 경우에는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 포함된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 형질전환을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 쌀 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분 및 CaMV 35S 터미네이터를 포함한다.

선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자 (예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반한다. 또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptⅡ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식물 세포를 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터로 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계를 포함하는 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 본 발명의 방법에 의해 제조된 식물 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 식물세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 입자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 및 아그로박테리움-매개 형질전환 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함한다. 이 중에서, 아그로박테리움-매개 형질전환이 가장 바람직하다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 일반적으로 잎 디스크, 그리고 다른 조직 (자엽 및 배축)을 가지고 실시된다. 아그로박테리움-매개 형질전환은 쌍자엽 식물에서 가장 효율적이다.

형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제 (예: 대사 억제제, 항생제 및 제초제)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 내성을 부여하는 표지 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다.

식물 원형질 또는 다양한 익스플랜트로부터 식물체의 발달 또는 재분화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 형성된 형질전환 발근 신초는 적합한 식물 성장 배지에 치상된다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호).

한편, 본 발명자들은 신규한 형질전환 식물체 (예: 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채)를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 특정 식물체의 형질전환을 위한 가장 효율적인 방법을 구축하였다. 이러한 방법은 PCT/KR02/01461, PCT/KR02/01462 및 PCT/KR02/01463에 개시되어 있으며, 상기 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 방법은 다양한 식물체에 적용되지만, 바람직하게는 담배, 참외, 오이, 수박 및 유채에 적용된다.

본 발명에 있어서, 바람직한 형질전환 방법은 아그로박테리움 시스템을 이용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)-바이너리 벡터 시스템을 이용하여 실시된다.

아그로박테리움 시스템을 이용하는 방법에 있어서, 구체적인 일 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a') 식물 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음의 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)로 식물체의 익스플랜트를 감염시키는 단계: 서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 그 일부; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위; (b') 상기 감염된 익스플랜트를 재분화 배지에서 재분화하여 재분화 신초를 얻는 단계; 및 (c') 상기 재분화 신초를 발근 배지에서 배양하여 형질전환 식물체를 얻는 단계.

상기한 구체적인 일 실시예에서, 형질전환에 적합한 익스플랜트는 발아된 종자로부터 유래된 어떠한 조직도 포함하며, 바람직하게는 자엽 및 배축이고, 가장 바람직하게는 자엽이다. 종자의 발아는 적합한 배지를 이용하여 적합한 암/광조건 하에서 실시된다. 식물 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 튜머페이션스를 가지고 실시된다 (Depicker, A. et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)).

보다 바람직하게는, pBin19, pRD400, pRD320 및 pHS737과 같은 바이너리 벡터 시스템이 이용된다 (An, G. et al., "Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986); R. K. Jain, et al., Biochem. Soc. Trans. 28:958-961(2000)).

아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 익스플랜트의 감염은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 감염 과정은 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양물에 자엽을 함침시켜 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테리움 튜머페이션스는 식물 내로 감염된다. 공동배양액에는 바람직하게는 아세토시링곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 형질전환을 돕기 위한 것이다.

아그로박테리움 튜머페이션스에 의해 형질전환된 익스플랜트는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 신초의 재분화를 성공적으로 야기한다. 본 발명에 따르면, 재분화 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 식물 성장 조절제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 한편, 본 발명의 재분화 배지는 pH 완충 역할을 하는 MES를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 재분화 배지에는 식물 성장 조절제가 포함된다. 식물 성장 조절제 중 함유되는 시토키닌은 6-벤질아미노퓨린 (BAP), 키네틴, 제아틴, 이소펜틸아데노신 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 6-벤질아미노퓨린이 이용된다. 한편, 옥신계 성장 조절제 (예: 1- 나프탈렌아세트산, 인돌아세트산, (2,4-디클로로페녹시) 아세트산)도 재분화배지에 포함될 수 있다.

재분화된 조직은 발근 배지에서 발근되어 형질전환 식물이 생산된다.

본 발명에 따라 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블롯팅을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)). 한편, 형질전환 시 이용되는 벡터에 β-글루쿠로니다아제 유전자가 있는 경우에는 재분화된 자엽 조직의 일부를 X-gluc (5-Bromo-4-Chloro-3-Indole-β-D-Glucuronic Acid) 등의 기질 용액에 침지시켜 발색되는 양상을 육안으로 관찰함으로써 형질전환 여부를 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식물 세포를 상술한 본 발명의 벡터로 형질전환하는 단계; (b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; (c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 형질전환 식물체로부터 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 의해 제조된 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공한다.

본 발명의 식물 형질전환체의 다양한 기관 (예: 줄기, 잎, 뿌리, 열매, 종자 등)으로부터 유래된 조직으로부터 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 얻을 수 있으며, 상기 조직으로부터 얻은 추출액을 통상적인 정제과정을 거쳐 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 정제 단계는 당업계에서 통상적으로 이용되는 정제방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 정제하게 된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단에 6 x His이 있는 경우에는, Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 을 이용하여 소망하는 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 신속하고 용이하게 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 식물 형질전환체를 이용함으로써 저렴한 비용으로 신 놈브레 바이러스 유래 뉴클레오캡시드 단백질을 대량 생산할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 시험 대상의 개체로부터 시험액 (testing fluid)을 수득하는 단계; (b) 상기 본 발명의 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 상기 시험액과 항원-항체 반응을 유도하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 항원-항체 반응의 발생 (occurrence) 여부를 측정하는 단계를 포함하는 신증후출혈열의 항체 측정 방법을 제공한다.

본 발명에서는 다양한 생체액 (예: 혈액, 혈청, 오줌, 땀 등)에 적용될 수 있지만, 바람직하게는 혈액이고, 보다 바람직하게는 혈청이다.

본 발명의 방법은 항원-항체 결합을 원리로 하는 모든 분석방법이 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assy) 방법에 따라 실시하는 것이다. 보다 구체적으로는, (ⅰ) 웰 플레이트에 항-인간 항체를 흡착시키는 단계; (ⅱ) 상기 웰 플레이트에 검체의 혈청을 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계; (ⅲ) 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 첨가하여 반응시키는 단계; (ⅳ) 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단일클론 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; (ⅴ) 상기 웰 플레이트를 세척한 후 발색효소 또는 형광물질이 결합된 2차 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (ⅵ) 2차 항체의 결합여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법으로 실시된다.

상기 발색 효소는 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 페록시다아제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알칼린 포스파타아제를 이용하는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), ECF 기질 등이 이용되고, 호스 래디쉬 페록시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, 루미놀, ABTS (2,2´-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 등이 이용된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 신증후출혈열의 항체 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 진단 키트가 포함하는 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질은 식물체에서 발현된 재조합 단백질로서, 인간 및 동물에는 감염성이 없으면서, 신 놈브레 바이러스 항체에 대한 특이성 및 민감성이 매우 우수하며, 이러한 하기의 실시예에서 증명되어 있다.

본 발명의 진단 키트가 기본적으로 ELISA 용으로 개발되는 경우에는, 플레이트 (또는 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질로 표면 코팅된 플레이트), 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 신규 유전자의 합성

천연의 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자와 동일하게 428개의 아미노산 (참조: 서열목록 제 2 서열)을 암호화하면서도, 기존의 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과는 다르게, 식물체가 선호하는 최적의 뉴클레오타이드 서열을 디자인하였다. 신규 유전자의 디자인 기준은, 첫째, GC 함량을 50% 이상으로 하고, 식물이 선호하는 코돈을 갖도록 하였으며, 그리고 인트론 유사 서열을 제거하는 것이다. 이렇게 디자인된 뉴클레오타이드 서열은 Plant Biotechnology Institute (이하 "PBI"로 표시), National Research Centre (SK, 캐나다)에서 화학적으로 합성하였다. 합성된 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 DNA는 서열목록 제 1 서열에 기재되어 있다.

실시예 2: 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 식물 발현용 벡터의 제작

신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드를 코딩하는 합성 유전자는 1284 bp로 구성되어 있으며, 5'-말단에 XbaI과 3'-말단에 BamHI의 인식부위를 가질 수 있도록 합성되어 있다.

식물 발현용 바이너리 벡터인 pHS737 (PBI, National Research Centre, 캐나다)을 제한효소 XbaI과 BamHI 효소로 함께 처리하여 절단한 후 분리·정제하였다. 상기 1284 bp 합성 유전자와 절단된 pHS737 벡터를 혼합하고, 이 혼합물에 라이게이션 완충액 (KOSCO, 한국) 및 T4 리가아제 (KOSCO, 한국)를 첨가한 후 1시간 이상 16℃에서 반응 시켰다. 그런 다음, 반응물을 CaCl₂로 처리된 컴피턴트 세포 (E. coli strain DH5α(Promega, 미국)에 형질전환시킨 후 항생제 카나마이신 (100 mg/㎖)이 포함된 LB 배지에서 항생제 저항성 균주를 선별하였다.

선발된 클론으로부터 알칼리 방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였고, 정방향 프라이머 5'-AAT CTA GAA ATG TCA ACA CT-3'과 역방향 프라이머 5'-AAG GAT CCC CGA GCT TAA GC-3'를 사용해서 중합효소연쇄반응 (PCR)을 실시하였다. PCR 증폭에서 이용된 효소는 Taq 중합효소(솔젠트, 한국)이고, 온도 조건은 다음과 같이 세팅하였다: 96℃에서 2분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 연결반응, 72℃에서 2분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장 반응을 하였다.

이어, 증폭 생성물을 1.0% 아가로스 겔에서 분석하여 목적하는 인서트 서열이 플라스미드에 있음을 확인하였다 (참조: 도 2).

실시예 3: 식물체의 형질전환

실시예 3-1: 아그로박테리움 튜머페이션스 ( Agrobacterium tumefaciens ) GV3101 감염 브로스의 제조

실시예 2에서 제작한 재조합 pHS737/SNV 벡터를 접합 (conjugation)에 의하여 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101 (Mp90)에 도입하였다. 재조합 pHS737/SNV 벡터를 가진 대장균 S17-1과 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101 (Mp90)를 각각 액체 LB배지에서 대수기까지 배양하였다. 이들 각각의 세포들을 에펜도르프 튜브에 1:1로 함께 혼합한 다음 30초간 원심분리하여 세포들을 농축시킨 후 28℃에서 1-2일 동안 정치배양을 하였다. 시간이 경과한 세포들이 든 에펜도르프 튜브는 살살 흔들어 주어 농축된 세포를 부유화시킨 다음, 50 mg/L 카나마이신 및 30 mg/L 겐타마이신이 첨가된 LB 고체배지에 도말한 다음, 28℃에서 2일 동안 배양한 후 콜로니를 선별하였다. 상기 벡터가 도입된 균주를 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101-pHS737/SNV로 명명하였다 (Alt-Morbe et al., J. Bacteriol. 178:4248-4257(1996)).

pHS737/SNV를 갖는 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101-pHS737/SNV 를 슈퍼브로스 (BHI 배지, pH 5.6)에 접종한 후 28℃에서 2일간 배양하였으며, 이 배양물을 식물체의 감염에 사용하였다.

실시예 3-2: 식물세포의 형질전환 및 재분화

먼저 소독한 담배의 종자를 파종하여 2 주 이상 무균 배양한 신선하고 어린 잎을 채취하였다. 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 유전자를 가진 pHS737 벡터를 갖는 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101(Mp90)를 100 μM 아세토시링곤 (acetosyringone)이 함유된 수퍼 브로스 (Super broth: 37 g/l Brain heart infusion broth(Difco), 0.2% 수크로스, pH 5.6)에서 18시간 동안 배양한 다음, 이 배양액에 상기 자엽 절편을 침지시켜 20 분간 혼합하였다.

그런 다음, 25℃에서 암배양 조건으로 공동배양 배지 [3.0% 수크로스 , 0.5 g/L MES(2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Monohydrate) , 1.0 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA가 함유된 MSB5 (Murashige & Skoog medium including Gamborg B5 vitamins)]에서 2 일 동안 공동배양하였다. 그리고 나서, 세균을 제거하는 클린 업 (clean up) 단계를 거쳐, 잎 절편을 선발 배지 (MSB5, 0.5 g/L MES , 3 % 수크로스 및 0.6 % 피타겔을 기본으로 하는 배지에 BAP 1.0 mg/L , NAA 0.1 mg/L, 카르베니실린 500 mg/L 및 카나마이신 100 mg/L 포함)에 이식하여 2 주 동안 배양하여 형질전환된 것으로 추정되는 발근된 신초를 선별하여, 재분화 배지 (MSB5, 500 mg/L 의 MES, BAP 0.01 mg/L, NAA 0.1 mg/L, 카르베니실린 500 mg/L, 카나마이신 100 mg/L, 3% 수크로스, 0.6% 아가)에서 배양하였다. 재분화된 신초를 발근 배지 (MSB5, 500 mg/L 의 MES, NAA 0.1 mg/L, 카르베니실린 500 mg/L, 카나마이신 100 mg/L, 3% 수크로스, 0.6% 아가)에 옮겨 배양하여 발근한 개체를 형질전환체로 추정하여 하기 실시예 4의 방법을 이용하여 분석하였다.

실시예 4: 형질전환 식물체의 PCR 분석

상기 실시예 3에서 확보한 형질전환 식물체의 확인은 다음과 같이 실시하였다: 선발 배지에서 형질전환체로 선발된 신초 10 mg을 에드워드 (Edward) 방법 (Nucleic Acids Research, 19:1349(1991))을 사용하여 식물 지놈 DNA를 분리한 후, 이를 주형 DNA로 하여 PCR 분석을 실시하였다.

신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 형질전환 식물체의 PCR 분석에 사용된 프라이머는 뉴클레오캡시드 단백질 유전자 의 염기 서열에 대응하는 것으로서, 정방향 프라이머는 5'-AAT CTA GAA ATG TCA ACA CT-3' 이고, 역방향 프라이머는 5'-AAG GAT CCC CGA GCT TAA GC-3' 이다. PCR 반응은 Taq 중합효소 (솔젠트, 한국)를 이용하여 96℃에서 2분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 연결반응, 72℃에서 2분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장 반응을 한 후 반응산물은 1.0% 아가로스 겔에서 분석하였다 (참조: 도 3). 도 3 에서 M 열은 분자량 마커, 1 열은 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함하는 양성 표준 플라스미드의 PCR 산물, 2 열은 야생종 담배의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물, 3 열부터 10 열까지는 선발된 담배 형질전환체의 DNA를 주형으로 한 PCR 산물들을 나타낸 것이다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 식물 형질전환체에서 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자에 해당하는 1.3 kb DNA 밴드가 관찰되어 형질전환되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 형질전환 식물체에서 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 분리 및 정제

적당량의 액체질소가 들어있는 막자사발에 형질전환 식물체의 잎 1 g을 잘라서 넣고 식물조직을 분쇄하였다. 식물 생중량 0.5 g 당 단백질 분해효소 제거제가 함유된 추출완충액 (250 mM Sucrose, 1 M Hepes, 1 mM MgCl₂, 1 mM DTT) 2 ㎖ 를 첨가하여 미세하게 갈았다. 추출액을 12,000 rpm, 4 ℃에서 30분 이상 원심분리한 후 상등액을 취하여 새 튜브로 옮겼다. 이 용해된 세포용액을 니켈 수지가 함유된 프로본드 (Probond) 컬럼 (Quiagen GmbH, 독일)에 첨가하여 실온에서 10분간 약하게 흔들어주면서 세포용액내의 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 니켈 수지에 잘 흡착되도록 하였다.

뉴클레오캡시드 단백질이 흡착된 수지를 동량의 pH 7.8 흡착 완충용액 (20 mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride)으로 2회 세척하여 수지에 흡착된 식물세포 유래 단백질을 제거하였다. 이와 같이 세척된 수지에 동량의 pH 6.0 세척 완충용액 (20 mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride)을 첨가하여 실온에서 약하게 흔들어주어 수지를 재차 세척하고, 다시 동량의 pH 4.0 용출 완충용액 (20 mM Sodium Phosphate, 500 mM Sodium Chloride)을 첨가하여 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 용출시켰다.

식물 형질전환체에서 발현된 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질은 아미노 말단에 6개의 히스티딘 잔기를 가지고 있어 양이온을 띠는 니켈 수지에 결합되어 쉽게 분리된다. 이러한 과정을 거쳐 식물세포 단백질들이 모두 제거된 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질만을 순수하게 정제하였다. 이와같이 용출된 단백질을 센트리콘 (Amicon Co., U.S.A.)을 사용하여 농축하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동한 후 쿠마시블루로 염색한 결과 야생형 담배에서는 검출되지 않는 48 kD의 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 세포 용출액에서 검출되었고, 특히 니켈 수지 칼럼으로 용출한 경우는 식물세포 단백질이 모두 제거된 순수한 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 검출됨을 확인하였다.

상기의 방법으로 정제된 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질은 브래드포드 (Bradford) 방법에 의해 염색제 (Protein assay kit, Bio-Rad)를 넣고 UV-분광광도계로 595 nm에서 흡광도를 측정하고 BSA (Bovine Serum Albumin) standard와 비교해서 단백질 정량을 실시하였다. 추출된 단백질은 양이 동일하도록 조정하여 각 시료를 8% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 하였고, 이에 대해 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다 (참조: Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press). 웨스턴 블럿 분석은 아래와 같은 방법으로 시행되었다. 상기 SDS-PAGE 겔에 있는 단백질을 Semi-Dry Transfer Units (Hoefer, 미국)를 이용하여 PVDF 막으로 이동시켰다. 겔에 있는 단백질 전부가 PVDF 막에 이동한 것을 확인한 다음 PVDF막을 건조시켰다. 이 PVDF막을 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 항원에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체 (Center of disease control, Georgia, USA)가 첨가된 0.5% BSA/TBS (Tris-Buffered Saline) 용액에 1시간 동안 반응시킨 다음 TBS 용액으로 PVDF 막을 5분씩 세 번 세척하였다. 그런 다음 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)와 1시간 동안 반응시킨 후 다시 TBS 용액으로 PVDF 막을 10분씩 세 번 세척하였다. 마지막으로 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가된 왼충액에 PVDF 막을 넣고 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 그 결과를 판독하였다(참조: 도 5). 도 5에서 확인할 수 있듯이, 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과 상기 결과와 동일하게 48 kD의 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 확인되었다.

실시예 7: 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질이 흡착된 96-웰 플레이트를 이용한 신증후출혈열의 진단

실시예 7-1 : 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체 역가 측정

식물 형질전환체에서 분리·정제된 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 신증후출혈열의 진단에 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 뉴클레오캡시드 단백질을 항원-항체 반응을 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 측정하였다.

96-웰 마이크로타이터 플레이트에 정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 인산염 완충용액에 연속적으로 희석하여, 웰당 100 ㎕ 씩 분주한 후, 4℃에서 8시간 이상 방치하여 항원을 웰에 고정시켰다. 단백질 항원이 흡착된 플레이트를 세척 완충용액 (0.05 % Tween 20, 0.01 M Phosphate, pH 7.6)으로 3회 세척하여 플레이트에 흡착되지 못한 항원을 제거하고, 신 놈브레바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 항원에 대한 단일클론항체 (Centers of disease control, Georgia, USA)를 희석액 (0.1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Trisma base, 150 mM NaCl)에 일정 희석배수로 희석하여 웰 당 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 반응시켜 항원-항체반응을 유도하였다. 그런 다음 세척 완충용액으로 각각의 웰을 3회 세척한 후에 블롯킹 완충액을 각 웰에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 상기와 동일하게 세척하였다. 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)를 분주하고 상기와 동일하게 반응 및 세척하였다. 마지막으로 각 웰에 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 ELISA 판독기 (ELISA Reader, Titertek, USA) 로 405 nm 파장에서 그 결과를 판독하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 표의 가로축은 정제된 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 희석 배수를 나타내며 (희석 전 양: 73 ng, 20480 배 희석: 36 pg), 세로축은 상기 단백질에 대한 항체의 초기 역가를 1로 보았을 때 희석한 배수를 나타낸 것이다. 표 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 뉴클레오캡시드 단백질은 우수한 항원성을 나타낸다.

도 6은 정제 완료 된 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 36 pg과 반응하는 항체 역가군을 야생형 식물체에서 분리한 단백질과 비교하여 도식화 한 것이다. 그림에서와 같이 재조합 식물체에서 분리 정제한 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성은 탁월하게 나타났으며, 이와 비교하여 야생형 식물체에서 분리한 단백질은 전혀 항원성을 나타내지 않았다.

	뉴클레오캡시드 단백질의 희석 배수
항체 희석배수	10	20	40	80	160	320	640	1280	2560	5120	10240	20480
100	2.42	2.14	2.35	2.41	2.32	2.25	2.19	2.20	1.87	1.61	1.56	1.76
200	1.94	2.03	2.15	2.16	2.26	2.21	2.19	2.12	2.03	1.91	1.88	1.56
400	1.50	1.49	1.56	1.69	1.80	1.91	1.88	1.83	1.87	1.91	1.92	1.54
800	1.10	0.90	1.10	1.16	1.17	1.20	1.55	1.32	1.56	1.44	1.64	1.43
1600	0.95	0.91	0.96	0.90	0.90	0.81	1.32	0.97	1.24	1.22	1.24	1.22
3200	0.77	0.78	0.73	0.73	0.73	0.91	0.98	0.77	0.92	1.02	1.10	1.13
6400	0.69	0.66	0.60	0.71	0.71	0.83	0.84	0.73	0.65	0.95	1.01	0.94
1280	0.83	0.63	0.61	0.66	0.64	0.68	0.81	0.76	1.03	1.32	0.91	0.93

실시예 7-2 : 신증후출혈열의 진단

식물 형질전환체에서 분리·정제된 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 실질적으로 신증후출혈열의 진단에 사용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 신증후출혈열 환자의 혈청 내의 항체 역가를 측정하였다.

96-웰 마이크로타이터 플레이트에 인산염 완충용액으로 일정량 희석된 항-인간 IgM 항체 (goat anti-human IgM, KPL, U.S.A.) 를 웰당 100 ㎕ 씩 분주한 후, 4℃에서 8시간 이상 방치하여 항체를 웰에 고정시켰다. 항체가 흡착된 플레이트를 세척 완충용액 (0.05 % Tween 20, 0.01 M Phosphate, pH 7.6)으로 3회 세척하여 플레이트에 흡착되지 못한 항체를 제거하고, 환자 혈청을 희석액 (0.1% BSA, 0.05% Tween 20, 20 mM Trisma base, 150 mM NaCl)에 일정 희석배수로 희석하여 웰 당 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 반응시키고 상기와 동일한 세척액으로 3회 세척하였다.

농도별로 희석액에 용해된 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 각 웰에 100 ㎕ 씩 분주한 후 실온에서 1시간 이상 방치하여 2차 항원-항체반응을 유도하였다. 다시 세척 완충용액으로 각각의 웰을 세척한 후에 희석액에 10 ug/ ㎖ 농도로 용해된 뉴클레오캡시드 항원 단백질에 대한 단일클론항체 (Center of disease control, Georgia, USA)를 각 웰당 100 ㎕씩 분주하여 실온에서 1 시간 동안 반응시킨 후 세척액으로 3회 세척하였다.

그런 다음 퍼옥시다아제 표지 2차 항체 (peroxidase labelled-anti human IgG, KPL, U.S.A.)를 분주하고 상기와 동일하게 반응 및 세척하였다. 마지막으로 각 웰에 ABTS 발색기질액 (KPL, U.S.A.)을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시켜 발색시킨 후 ELISA 판독기 (ELISA Reader, Titertek, USA) 로 405 nm 파장에서 그 결과를 판독하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 결과는 흡광도 값이 1.5 이상인 희석배수를 양성으로 판독하였다.

번호	혈청	항체 역가
1	환자 1	1600
2	환자 2	1600
3	환자 3	6400
4	환자 4	6400
5	환자 5	800
6	환자 6	200
7	환자 7	400
8	환자 8	400
9	환자 9	25600
10	환자 10	6400
11	환자 11	1600
12	환자 12	12800
13	환자 13	25600
14	환자 14	12800
15	환자 15	800
16	환자 16	1600
17	환자 17	200
18	환자 18	25600
19	환자 19	1600
20	환자 20	25600
21	정상인 1	< 100
22	정상인 2	< 100
23	정상인 3	< 100
24	정상인 4	< 100
25	정상인 5	< 100
26	정상인 6	< 100
27	정상인 7	< 100
28	정상인 8	< 100
29	정상인 9	< 100
30	정상인 10	< 100

표 2에 나타낸 바와 같이 정상인의 혈청은 항체 역가가 모두 100 이하를 나타낸 반면, 신증후 출혈열 환자의 혈청에서는 항체 역가가 200-25600을 나타내어 신증후 출혈열 환자와 정상인의 감별이 뚜렷하게 나타났다. 이는 재조합 식물체에서 분리한 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 항원을 이용한 항원-항체 반응이 높은 특이성으로 발생함을 보여주는 것으로서, 이를 통해 신증후 출혈열 환자를 감별할 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 신규한 폴리뉴클레오타이드 및 그를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물 형질전환체를 제공한다. 본 발명은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법 및 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공한다. 한편, 본 발명은 신증후출혈열의 항체 진단용 키트 및 신증후출혈열의 항체 측정 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 저비용으로 우수한 항원성을 나타내는 신 놈브레 바이러스의 재조합 뉴클레오캡시드 단백질을 얻을 수 있고, 이를 이용하는 경우에는 우수한 민감도 및 특이성으로 신증후출혈열을 진단할 수 있다.

도 1은 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함하는 식물형질전환용 벡터의 제조과정 및 유전자 지도를 나타내는 모식도.

도 2는 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자가 클로닝된 pHS737 벡터를 제한효소 XbaI과 BamHI로 절단하여 전기영동한 결과를 나타내는 사진. M, 1 kb DNA 래더; 레인 1, XbaI과 BamHI로 절단한 pHS737 벡터; 레인 2, 삽입 서열의 PCR 산물; 및 레인 3, XbaI과 BamHI로 절단한 뉴클레오캡시드 유전자를 포함하는 pHS737 벡터 (pHS737/SNV).

도 3은 형질전환 식물체에서 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 유전자의 PCR 분석 결과를 나타내는 사진. M, 1 kb DNA 래더; 레인 1, 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 포함하는 양성 표준 플라스미드의 PCR 산물; 레인 2, 야생종 담배의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물; 및 레인 3-11, 선발된 담배 형질전환체의 DNA를 주형으로 한 PCR 산물.

도 4는 형질전환 식물체에서 발현된 신 놈브레 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동한 결과 사진. M, 분자량 마커; 레인 1, 야생종 담배의 단백질; 및 레인 2, 형질전환 식물체 내 발현된 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질.

도 5는 형질전환 식물체에서 발현된 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여주는 사진. M, 분자량 마커; 레인 1, 1 구간 용출액; 레인 2, 2 구간 용출액; 레인 3, 3 구간 용출액; 및 레인 4, 야생형 담배

도 6은 형질전환 식물체에서 발현된 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 항원성을 보여주는 그래프.

<110> NEXGEN BIOTECHNOLOGIES, INC. <120> Diagnosis Kits for Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Comprising Nucleocapsid Protein from Sin Nombre Virus Expressed in Plants <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1284 <212> DNA <213> nucleotide sequence encoding nucleocapsid of sin nombre virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1284) <400> 1 atg tca aca ctg aag gag gtt cag gac aat atc act ctg cat gag caa 48 Met Ser Thr Leu Lys Glu Val Gln Asp Asn Ile Thr Leu His Glu Gln 1 5 10 15 caa ttg gtt aca act agg caa aag cta aag gac gcg gag aga gcg gtt 96 Gln Leu Val Thr Thr Arg Gln Lys Leu Lys Asp Ala Glu Arg Ala Val 20 25 30 gag ctt gat cct gac gac gtc aat aag tcc act ttg cag agc cgt agg 144 Glu Leu Asp Pro Asp Asp Val Asn Lys Ser Thr Leu Gln Ser Arg Arg 35 40 45 gca gcc gtt agt gca ctg gaa aca aag ctc gga gag ctg aag aga gag 192 Ala Ala Val Ser Ala Leu Glu Thr Lys Leu Gly Glu Leu Lys Arg Glu 50 55 60 ctt gct gat ctt atc gct gcg cag aaa ctc gcc tct aag ccc gtc gat 240 Leu Ala Asp Leu Ile Ala Ala Gln Lys Leu Ala Ser Lys Pro Val Asp 65 70 75 80 cca acg ggt att gaa cca gac gac cac ctc aaa gaa aag tct tca ctt 288 Pro Thr Gly Ile Glu Pro Asp Asp His Leu Lys Glu Lys Ser Ser Leu 85 90 95 aga tat ggt aac gta ttg gat gta aat agt att gat ttg gaa gag cca 336 Arg Tyr Gly Asn Val Leu Asp Val Asn Ser Ile Asp Leu Glu Glu Pro 100 105 110 tcc ggc caa acc gct gac tgg aag tcg atc gga ctc tac att cta agt 384 Ser Gly Gln Thr Ala Asp Trp Lys Ser Ile Gly Leu Tyr Ile Leu Ser 115 120 125 ttc gcc ttg cca atc atc ctt aag gcc ctt tat atg ctc agc acc cgg 432 Phe Ala Leu Pro Ile Ile Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu Ser Thr Arg 130 135 140 ggt agg caa acc att aag gag aac aaa ggc acc cgc ata cgc ttt aag 480 Gly Arg Gln Thr Ile Lys Glu Asn Lys Gly Thr Arg Ile Arg Phe Lys 145 150 155 160 gat gat tcg tct tac gag gag gtg aat ggt ata cgc aaa ccc cgt cac 528 Asp Asp Ser Ser Tyr Glu Glu Val Asn Gly Ile Arg Lys Pro Arg His 165 170 175 ctt tac gtt agc atg cca aca gct cag tca acc atg aag gcc gat gag 576 Leu Tyr Val Ser Met Pro Thr Ala Gln Ser Thr Met Lys Ala Asp Glu 180 185 190 atc act cct ggt cga ttt aga act atc gct tgt ggg ttg ttc cct gca 624 Ile Thr Pro Gly Arg Phe Arg Thr Ile Ala Cys Gly Leu Phe Pro Ala 195 200 205 caa gtt aag gcc agg aac att att tct cca gtc atg ggg gtg att ggg 672 Gln Val Lys Ala Arg Asn Ile Ile Ser Pro Val Met Gly Val Ile Gly 210 215 220 ttt agc ttc ttc gtg aaa gac tgg atg gaa aga ata gac gaa ttt ctg 720 Phe Ser Phe Phe Val Lys Asp Trp Met Glu Arg Ile Asp Glu Phe Leu 225 230 235 240 gcc gct cgc tgc cct ttc ctc cct gaa caa aag gac ccg cgt gac gct 768 Ala Ala Arg Cys Pro Phe Leu Pro Glu Gln Lys Asp Pro Arg Asp Ala 245 250 255 gct cta gca act aac cgt gct tac ttc ata aca cgt cag atg cag gtg 816 Ala Leu Ala Thr Asn Arg Ala Tyr Phe Ile Thr Arg Gln Met Gln Val 260 265 270 gac gaa tca aag gtt tct gat att gaa gat ttg atc gct gat gct agg 864 Asp Glu Ser Lys Val Ser Asp Ile Glu Asp Leu Ile Ala Asp Ala Arg 275 280 285 gca gaa tcc gca acc att ttc gca gat atc gct aca cca cat agc gtg 912 Ala Glu Ser Ala Thr Ile Phe Ala Asp Ile Ala Thr Pro His Ser Val 290 295 300 tgg gtc ttc gcc tgc gcc ccg gat cgt tgt ccc cca acg gcc ttg tac 960 Trp Val Phe Ala Cys Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr Ala Leu Tyr 305 310 315 320 gtg gct gga atg cct gag ctg gga gct ttt ttc ggc att ctt cag gat 1008 Val Ala Gly Met Pro Glu Leu Gly Ala Phe Phe Gly Ile Leu Gln Asp 325 330 335 atg agg aat acc atc atg gct tcc aaa tcg gtt gga act tcc gaa gaa 1056 Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Ser Val Gly Thr Ser Glu Glu 340 345 350 aaa ctt aaa aag aag tca gca ttt tat caa agc tat ctc agg cga act 1104 Lys Leu Lys Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg Thr 355 360 365 caa tcc atg gga att cag ttg gat caa aaa att att atc ctc tac atg 1152 Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp Gln Lys Ile Ile Ile Leu Tyr Met 370 375 380 tct cat tgg gga aga gag gcc gtg aac cac ttt cat ctc ggt gat gat 1200 Ser His Trp Gly Arg Glu Ala Val Asn His Phe His Leu Gly Asp Asp 385 390 395 400 atg gac ccc gag ttg cgg gag tta gcg cag acc ctt gtt gac atc aaa 1248 Met Asp Pro Glu Leu Arg Glu Leu Ala Gln Thr Leu Val Asp Ile Lys 405 410 415 gtc aga gag ata tct aac caa gaa ccg ctt aag ctc 1284 Val Arg Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Leu Lys Leu 420 425 <210> 2 <211> 428 <212> PRT <213> nucleotide sequence encoding nucleocapsid of sin nombre virus <400> 2 Met Ser Thr Leu Lys Glu Val Gln Asp Asn Ile Thr Leu His Glu Gln 1 5 10 15 Gln Leu Val Thr Thr Arg Gln Lys Leu Lys Asp Ala Glu Arg Ala Val 20 25 30 Glu Leu Asp Pro Asp Asp Val Asn Lys Ser Thr Leu Gln Ser Arg Arg 35 40 45 Ala Ala Val Ser Ala Leu Glu Thr Lys Leu Gly Glu Leu Lys Arg Glu 50 55 60 Leu Ala Asp Leu Ile Ala Ala Gln Lys Leu Ala Ser Lys Pro Val Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Ile Glu Pro Asp Asp His Leu Lys Glu Lys Ser Ser Leu 85 90 95 Arg Tyr Gly Asn Val Leu Asp Val Asn Ser Ile Asp Leu Glu Glu Pro 100 105 110 Ser Gly Gln Thr Ala Asp Trp Lys Ser Ile Gly Leu Tyr Ile Leu Ser 115 120 125 Phe Ala Leu Pro Ile Ile Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu Ser Thr Arg 130 135 140 Gly Arg Gln Thr Ile Lys Glu Asn Lys Gly Thr Arg Ile Arg Phe Lys 145 150 155 160 Asp Asp Ser Ser Tyr Glu Glu Val Asn Gly Ile Arg Lys Pro Arg His 165 170 175 Leu Tyr Val Ser Met Pro Thr Ala Gln Ser Thr Met Lys Ala Asp Glu 180 185 190 Ile Thr Pro Gly Arg Phe Arg Thr Ile Ala Cys Gly Leu Phe Pro Ala 195 200 205 Gln Val Lys Ala Arg Asn Ile Ile Ser Pro Val Met Gly Val Ile Gly 210 215 220 Phe Ser Phe Phe Val Lys Asp Trp Met Glu Arg Ile Asp Glu Phe Leu 225 230 235 240 Ala Ala Arg Cys Pro Phe Leu Pro Glu Gln Lys Asp Pro Arg Asp Ala 245 250 255 Ala Leu Ala Thr Asn Arg Ala Tyr Phe Ile Thr Arg Gln Met Gln Val 260 265 270 Asp Glu Ser Lys Val Ser Asp Ile Glu Asp Leu Ile Ala Asp Ala Arg 275 280 285 Ala Glu Ser Ala Thr Ile Phe Ala Asp Ile Ala Thr Pro His Ser Val 290 295 300 Trp Val Phe Ala Cys Ala Pro Asp Arg Cys Pro Pro Thr Ala Leu Tyr 305 310 315 320 Val Ala Gly Met Pro Glu Leu Gly Ala Phe Phe Gly Ile Leu Gln Asp 325 330 335 Met Arg Asn Thr Ile Met Ala Ser Lys Ser Val Gly Thr Ser Glu Glu 340 345 350 Lys Leu Lys Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Gln Ser Tyr Leu Arg Arg Thr 355 360 365 Gln Ser Met Gly Ile Gln Leu Asp Gln Lys Ile Ile Ile Leu Tyr Met 370 375 380 Ser His Trp Gly Arg Glu Ala Val Asn His Phe His Leu Gly Asp Asp 385 390 395 400 Met Asp Pro Glu Leu Arg Glu Leu Ala Gln Thr Leu Val Asp Ile Lys 405 410 415 Val Arg Glu Ile Ser Asn Gln Glu Pro Leu Lys Leu 420 425

Claims

서열목록 제 1 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
(ⅰ) 상기 제 1 항의 폴리뉴클레오타이드; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 식물발현용 벡터.
다음의 단계를 포함하는 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조방법:

(a) 식물 세포를 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터로 형질전환하는 단계;

(b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계; 및

(c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계.
상기 제 3 항의 방법에 의해 제조된 식물 형질전환체.
다음의 단계를 포함하는 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 제조방법:

(a) 식물 세포를 상기 제 2 항의 식물발현용 벡터로 형질전환하는 단계;

(b) 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계;

(c) 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화시켜 형질전환 식물체를 수득하는 단계; 및

(d) 상기 형질전환 식물체로부터 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 수득하는 단계.
상기 제 5 항의 방법에 의해 제조된 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질.
상기 제 6 항의 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 신증후출혈열의 항체 진단용 키트.
다음의 단계를 포함하는 신증후출혈열의 항체 측정 방법:

(a) 시험 대상의 개체로부터 시험액 (testing fluid)을 수득하는 단계;

(b) 상기 제 6 항의 신 놈브레 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 상기 시험액과 항원-항체 반응을 유도하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)에서 항원-항체 반응의 발생 (occurrence) 여부를 측정하는 단계.