KR20160077239A

KR20160077239A - 식물 유래의 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20160077239A
Application number: KR1020140185686A
Authority: KR
Inventors: 안동준; 임성인; 송재영; 정혜영; 손은주; 황인환; 박남조; 이용직; 김남형; 구성민
Original assignee: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장); 주식회사 바이오앱
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2016-07-04
Also published as: KR101732624B1

Abstract

본 발명은 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 식물체에서 발현된 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 셀룰로오즈 결합 도메인 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 이용 시, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 고효율로 생산할 수 있고, 다른 생산 방법에 비해 안전성 및 안정성이 있는 장점이 있다. 또한, 상기 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2는 셀룰로오즈 결합 도메인(cellulose-binding domain: CBD) 단백질을 포함하기 때문에, 돼지 열병 바이러스 노출 경로 및 항체 생성 경로를 판별하는데 있어 효과적인 마커로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

식물 유래의 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조방법{Vaccine composition for classical swine fever from plant and manufacturing method thereof}

본 발명은 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 식물체에서 발현된 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

돼지 열병은 돼지열병 바이러스(classical swine fever virus, CSFV)가 원인 병원체인 질병으로 사람이나 다른 동물에는 감염되지 않지만 돼지에는 일단 발생하면 치료가 되지 않고 감염된 대부분이 사망하는 전염병의 일종이다(Penrith, M.-L., Vosloo, W. and Mather, C. (2011), Classical Swine Fever (Hog Cholera): Review of Aspects Relevant to Control. Transboundary and Emerging Diseases, 58: 187-196). 돼지열병은 세계동물보건기구(OIE)에서 A급 질병으로 분류하고 있고, 국내에서도 가축전염병예방법에서 제1종 가축전염병으로 분류되는 질병으로, 돼지에 매우 전염력이 강해 치사율이 높으며 고열 및 출혈을 동반하고 급성, 아급성 또는 만성으로 감염된다. 이와 같이 돼지열병은 폐사율과 이환율이 높아 돼지 열병의 근절 없이는 양돈산업의 미래를 보장할 수 없다고 할 정도로 예방이 중요한 문제로 인식되는 전염병이다. 돼지 열병은 돼지가 유일한 자연숙주로, 상기 돼지 열병의 전파는 바이러스가 주원인이며 감수성이 있는 모든 연령대의 돼지가 감염될 수 있다. 우리나라에서는 질병대책으로 순화생독 바이러스인 LOM strain으로 제조한 생독백신으로 예방접종을 실시하고 있다. 돼지 열병 생백신은 야외 바이러스와 혈청학적으로 감별을 할 수 없기 때문에, 야외바이러스 감염과 백신접종에 의한 항체를 감별할 수 있도록 마커 백신 등 유전자재조합 백신 등이 세계적으로 개발 진행 중에 있다. 우리나라 역시 백신 사용에 있어서 야외 감염 항체와 백신접종으로 인한 항체를 간편하고 정확하게 판별할 수 있는 실용화 가능한 백신 개발에 주력하고 있다.

한편, 분자생물학과 유전공학 기술의 눈부신 발달은 식물분야에도 적용되어 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산하려는 노력들이 꾸준히 이어지고 있다. 식물에서 유용물질을 생산하는 것은 여러 가지 장점이 있는데, 1) 생산 단가를 파격적으로 줄일 수 있고, 2) 종래 대중적 방법(동물세포나 미생물에서 합성하여 단백질을 분리 정제하는)에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원(바이러스, 암유전자, 장독소 등)을 원천 배제할 수 있으며, 3) 상품화 단계에서도 동물세포나 미생물과는 달리 종자로 seed stock 관리가 가능하다는 점에서 유리한 점을 갖는다. 또한, 4) 해당물질의 수요가 급증할 경우 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물세포 시스템에 비해 절대적으로 유리하기 때문에 최단 기간에 높아진 수요에 따른 공급이 가능하다는 것도 장점이다.

이와 같이 식물체를 형질전환시켜 이로부터 유용물질을 생산하는 방법이 주목을 받는 배경에는 식물체의 단백질 합성경로가 있다. 포유동물의 단백질 합성에는 해독 후 수식 과정이 필수적인데, 식물체는 진핵생물 단백질의 합성 경로를 가지고 있기 때문에 포유동물에서 발현되는 단백질과 거의 유사한 단백질을 생산할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 여러 가지 장점에도 불구하고 식물체로부터 유용한 생리활성 물질(의학적으로 유용한 단백질, 백신 및 산업적으로 가치가 있는 효소 등)을 고효율로 수득하는 기술이 그리 많은 성공을 거두지 못하고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 식물체를 이용한 단백질 생산에 있어서 낮은 효율을 개선하기 위해 연구한 결과, 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 셀룰로오즈 결합 도메인(CBD) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체를 이용 시, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 고효율로 생산할 수 있고, 이 경우 다른 생산 방법에 비해 안전성 및 안정성이 있음을 확인하였다. 또한, 상기 pmE2 단백질은 돼지 열병 바이러스 노출 경로 및 항체 생성 경로를 판별하는 마커로서도 이용 가능한 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 형질전환 식물체에서 발현된, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 및 이의 생산방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 pmE2 단백질을 유효 성분으로 포함하는 돼지 열병 예방용 백신, 약학적 또는 사료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 pmE2 단백질을 포함하는 돼지 열병 바이러스 진단용 조성물 및 진단키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 백신 조성물을 동물에 투여함으로써 돼지 열병을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 재조합 단백질을 이용한 돼지 열병 바이러스의 검출방법 및 돼지 열병 바이러스 항체 생성 경로 판별 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은, 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 셀룰로오즈 결합 도메인 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명의 목적은, 상기 형질전환 식물체에서 발현된, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은, (a) 상기 재조합 벡터로 아그로박테리움을 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물체에 도입하는 단계; 및 (c) 상기 식물체에서, 발현된 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 pmE2 단백질을 유효 성분으로 포함하는 돼지 열병 예방용 백신, 약학적 또는 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 pmE2 단백질을 포함하는 돼지 열병 바이러스 진단용 조성물 및 진단키트를 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 백신 조성물을 동물에 투여함으로써 돼지 열병을 예방하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 pmE2 단백질을 이용한 항원-항체반응을 통해 시료 내에서 돼지 열병 바이러스를 검출하는 것을 특징으로 하는, 돼지 열병 바이러스의 검출방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 1) 상기 백신 조성물을 검체에 투여한 후, 검체로부터 혈액을 채취하는 단계; 2) 상기 1)단계에서 채취한 혈액으로부터 혈청을 분리하는 단계; 및 3) 상기 2)단계에서 분리된 혈청에 상기 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 항원으로 처리하여 반응시키는 단계;를 포함하는, 돼지 열병 바이러스 항체 생성 경로 판별 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 셀룰로오즈 결합 도메인 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 이용 시, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 고효율로 생산할 수 있고, 다른 생산 방법에 비해 안전성 및 안정성이 있는 장점이 있다. 또한, 상기 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질은 셀룰로오즈 결합 도메인(cellulose-binding domain: CBD) 단백질을 구성으로 포함하기 때문에, 바이러스 노출 경로 및 항체 생성 경로를 판별하는데 있어 효과적인 마커로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터의 개열 지도를 나타낸 도이다.
도 2는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에서 CBD 단백질의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 것을 나타낸 도이다.
도 3은 형질전환된 식물체에서 발현된 단백질의 항원성 여부를 ELISA으로 확인한 것을 나타낸 도이다.
도 4는 형질전환된 식물체에서 발현된 단백질의 항원성 여부를 웨스턴 블랏으로 확인한 것을 나타낸 도이다.
도 5는 형질전환 식물체로부터 분리 및 정제한 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2를 확인한 것을 나타낸 도이다.
도 6은 형질전환 식물체로부터 분리 및 정제한 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2를 정량한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 투여한 후, 수득한 혈청에서 돼지 열병 바이러스에 대한 특이항체와 상기 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2에 포함된 CBD 단백질에 대한 특이항체가 형성되었는지 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2를 투여한 마우스에서 항체 역가를 확인한 도이다.
도 9는 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2를 이용하여 돼지열병 바이러스의 감염 경로를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2를 이용 시 바이러스의 감염 경로 판별에 이용 가능 여부를 서로 다른 항원과 면역화된 마우스 혈청간의 반응을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 식물발현 단백질의 방어능 실험의 개략적인 내용을 나타낸 도이다.
도 12는 공격 접종 후 동물 모델(돼지)의 체온 변화 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 공격 접종 후 동물 모델(돼지)에서 백혈구 수치 변화 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 공격 접종 후 동물 모델(돼지)에서 채혈 및 시료 채취 후 항원 검출 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 공격 접종 후 동물 모델(돼지)를 부검한 뒤 항원 검출 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 공격 접종 후 동물 모델(돼지)의 방어 항체가 검사 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은, 돼지 열병 바이러스(classical swine fever virus)의 GP55 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 셀룰로오즈 결합 도메인(Cellulose Binding Domain, CBD) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, "발현 벡터"는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드는 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명에 있어서, "돼지 열병 바이러스(classical swine fever virus)"는 Pestivirus에 속하는 약 12.3~12.5 kb 크기의 envelope-associated glycoprotein(E protein)의 일종인 E2 glycoprotein에 항원 결정 부위를 가지고 있어서, 상기 E2 단백질은 상대적으로 중요한 구조 단백질로 인식되고 있다. 돼지 열병 바이러스의 E2 단백질은 바이러스 중화항체반응을 유발하고, 면역학적으로 돼지 열병의 방어 기작에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시될 수 있고, 셀룰로오즈 결합 도메인 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 벡터는 CaMV 35S 프로모터 유전자; M17의 5' UTR 부위 유전자; BiP(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 M17의 5' UTR 부위 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어 질 수 있고, 상기 BiP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 벡터는 하기의 벡터지도로 표시될 수 있으며, 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 당해 유전자의 염기 서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 돼지 열병 바이러스 게놈 DNA 또는 각 유전자를 주형으로 목적한 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 다양한 염기 서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 상기 서열번호 1 내지 5로 표시되는 염기서열의 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 서열번호 1 내지 5의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 GP55 단백질은 CSFV(Classical Swine Fever Virus)의 E2 항원 도메인 중 하나이며, M17의 5' UTR 부위 유전자는 단백질 합성량을 증가시키기 위하여, BiP 단백질은 genomic DNA 서열을 이용하여 목적 단백질을 N-말단 소포체로 이동시키기 위하여 사용될 수 있다. 또한, CBD 단백질은 하이브리드 단백질 태그(hybrid protein tag)로서 사용될 수 있고, HDEL 단백질은 단백질이 소포체 내에 머물도록 함으로써 분자 샤페론에 의한 폴딩(folding)과 조합(assembly)이 증가되어 단백질의 분해를 보다 최소화할 수 있도록 하여, 최종 목적 단백질이 소포체에 축적될 수 있도록 조합되어 사용될 수 있다.

[도]

상기 벡터로는 pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용하는 것이 바람직하며, 본 발명의 일실시예에서는 pBI121 벡터를 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명은, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

상기 본 발명의 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 방법은 이에 제한되지는 않으나, 아그로박테리움(Agrobacterium sp .)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation), 또는 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 아그로박테리움(Agrobacterium sp .)-매개에 의한 방법을 사용하여 본 발명의 재조합 벡터로 식물체인 애기장대에 도입하였다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체는 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 식물체는 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물체를 형질전환 한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 본 발명에 따른 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환된 식물체는 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 식물은 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 상기 쌍자엽 식물로는 이에 제한되지는 않으나, 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추,감자, 터마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리일 수 있고, 상기 단자엽 식물로는 이에 제한되지는 않으나, 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파일 수 있다.

또한 본 발명은, 상기 형질전환 식물체에서 발현된, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질은 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질 및 셀룰로오즈 결합 도메인 단백질이 융합된 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질의 변이체란 재조합 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

또한, 본 발명은,

(a) 상기 재조합 벡터로 아그로박테리움을 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물체에 도입하는 단계; 및 (c) 상기 식물체에서, 발현된 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산 방법을 제공한다.

상기 식물체는 애기장대, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수, 벼, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 식물체일 수 있으나, 바람직하게는 애기장대이며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 분리 및 정제하는 방법은 해당 물질의 물리, 화학적 특성에 따라 적합한 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 비결정 셀룰로오즈(amorphous cellulose: AMC), 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그래피, 용매추출, 반응추출, HPLC 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 비결정 셀룰로오즈이며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에서는, 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 셀룰로오즈 결합 도메인 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; CaMV 35S 프로모터 유전자; M17의 5' UTR 부위 유전자; BiP(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 제작한 재조합 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 애기장대에 형질전환시킨 후, 상기 형질전환된 식물체를 배양하여 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질 및 셀룰로오즈 결합 도메인 단백질이 융합된, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 분리 및 정제하여 수득하였다. 상기 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질은 상기 형질전환된 식물체에서 높은 수준으로 발현되어 대량생산이 가능하고, 돼지 열병 바이러스에 대한 면역원성을 가지며, 매우 높은 역가를 나타냄을 확인하여 바이러스 중화능이 있음을 확인하였다. 또한, 상기 pmE2 단백질이 포함하고 있는 CBD 단백질 검출 여부에 따라 바이러스 노출 경로를 판별하는 마커로서 사용가능함을 확인하였다. 또한, 동물 모델에 상기 pmE2 단백질을 접종 시, 돼지 열병 바이러스의 방어에 효과적이고, 바이러스 증폭 및 전파를 억제하며, 방어능이 우수함을 확인하였다.

또한, 본 발명은, 상기 pmE2 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 열병 예방용 백신 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원성 물질을 함유한 생물학적인 제제로서, 돼지 열병의 예방을 위하여 생물체에 주입 또는 주사하여 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다.

본 발명의 백신 조성물에는 pmE2 단백질 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 백신 조성물과 약학적 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 재조합 단백질의 멸균용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000 ㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100㎍을 함유한다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은, 상기 pmE2 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 열병의 예방용 사료 조성물을 제공한다.

상기 사료로는 돼지고기, 소고기 및 닭고기 등의 부산물을 비롯하여 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다. 이러한 사료에 본 발명의 pmE2 단백질에 대한 항체를 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은, 상기 pmE2 단백질을 포함하는 돼지 열병 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, pmE2 단백질을 포함하는 돼지 열병 바이러스 진단 키트를 제공한다.

상기 진단용 키트는 필요에 따라서 반응액이 포함되도록 제작될 수도 있으며, 이는 공지기술을 적용하면 용이하게 실시할 수 있는 것이다. 본 발명의 키트는 돼지 열병 바이러스 진단에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 완충액 등일 수 있다. 또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

상기 동물은 바람직하게는 포유류이며, 더욱 바람직하게는 돼지이다.

또한, 본 발명은 상기 pmE2 단백질을 이용한 항원-항체반응을 통해 시료 내에서 돼지 열병 바이러스를 검출하는 것을 특징으로 하는, 돼지 열병 바이러스의 검출방법을 제공한다.

상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴블랏(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 시료는 세포, 혈액, 소변, 타액 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

1) 상기 백신 조성물을 검체에 투여한 후, 검체로부터 혈액을 채취하는 단계; 2) 상기 1)단계에서 채취한 혈액으로부터 혈청을 분리하는 단계; 및3) 상기 2)단계에서 분리된 혈청에 상기의 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 항원으로 처리하여 반응시키는 단계;를 포함하는, 돼지 열병 바이러스 항체 생성 경로 판별 방법을 제공한다.

상기 3)단계의 반응에서 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질 및 셀룰로오즈 결합 도메인 단백질 대한 항체가 함께 검출될 경우, 상기 검체에서 형성된 항체는 상기 백신 조성물의 투여에 의해 생성된 것으로 판별할 수 있다. 또한, 상기 3)단계의 반응에서 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질에 대한 항체만 검출된 경우, 돼지 열병 바이러스의 감염에 의해 생성된 것으로 판별할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 돼지 열병 바이러스 항원 GP55 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

식물체에서 고효율로 돼지열병 항원 단백질을 생산할 수 있도록, 돼지 열병 항원 GP55 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, pBI121 벡터에 CaMV 35S 프로모터 유전자; M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자(서열번호 3); BiP(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4); GP55 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 1); 셀룰로오즈 결합 도메인(Cellulose Binding Domain, CBD) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2); 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 제조합 벡터를 제작하였다.

상기 GP55 단백질은 CSFV(Classical Swine Fever Virus)의 E2 항원 도메인 중 하나이며, M17의 5' UTR 부위 유전자는 단백질 합성량을 증가시키기 위하여, BiP 단백질은 genomic DNA 서열을 이용하여 목적 단백질을 N-말단 소포체로 이동시키기 위하여 사용되었다. 또한, CBD 단백질은 하이브리드 단백질 태그(hybrid protein tag)로서 사용되었고, HDEL 단백질은 단백질이 소포체 내에 머물도록 함으로써 분자 샤페론에 의한 폴딩(folding)과 조합(assembly)이 증가되어 단백질의 분해를 보다 최소화할 수 있도록 하여, 최종 목적 단백질이 소포체에 축적될 수 있도록 조합되어 사용되었다. 제작된 재조합 벡터의 염기서열을 서열번호 5로 나타내었다.

실시예 2. 돼지 열병 바이러스의 항원성 GP55 단백질 및 CBD 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 형질전환 식물체의 제조

돼지 열병 바이러스의 항원성 GP55 단백질 및 CBD 단백질을 포함하는 융합 재조합 단백질을 발현하는 형질전환 식물체를 제조하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제작한 재조합 벡터를 아그로박테리움-매개 형질전환 방법으로 돼지 열병 바이러스 GP55 단백질 및 CBD 단백질을 포함하는 융합 재조합 단백질을 발현하는 애기장대를 제조하였다. 상기 실시예 1의 재조합 벡터는 식물에서 카나마이신에 대한 내성을 가지므로, 형질전환된 애기장대의 선별은 카나마이신 내성검사 및 CBD에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 후, 상기 융합 재조합 단백질의 발현을 확인하였다. 또한, 애기장대에서 목적 단백질의 발현 및 발현 수준 정량을 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블럿을 통해 형질전환 애기장대에서 CBD 단백질이 발현됨을 확인함에 따라, 이와 융합된 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질 또한 발현되었음을 확인하였다.

실시예 3. 형질전환 식물체에서 제조된 돼지 열병 바이러스 GP55 단백질의 항원성 확인

상기 실시예 2에서 제조한 형질전환 식물체에서 유래한 돼지 열병 바이러스의 항원성 GP55 단백질 및 CBD 단백질을 포함하는 융합 재조합 단백질에서, 돼지 열병 바이러스 GP55 단백질의 항원성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 2에서 제조한 형질전환 식물체의 세대진전을 통해 목적단백질의 발현이 안정된 호모종자를 최종 확보하였고, 종자 라인별로 목적단백질의 발현수준을 정량하여 실험에 사용할 라인을 결정하였다. 상기 결정된 라인의 종자를 배양하여 식물체를 얻고, ELISA 수행목적으로 단백질추출에 보편적으로 사용하는 추출 버퍼를 이용하여 단백질을 추출하였다. 돼지 열병 항원검출에 쓰이고 있는 임상진단용 키트(제노바이오텍(현,메디안 디노스틱), CSFV-Ag ELISA kit)를 사용하여 상기 실시예 2에서 제조한 형질전환 식물체에서 유래한 돼지 열병 바이러스의 항원성 GP55 단백질 및 CBD 단백질이 융합된 단백질에서, 돼지 열병 바이러스 GP55 단백질의 항원성을 확인하였으며, 상기 ELISA 결과 및 웨스턴 블랏 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제조한 식물유래 단백질은 ELISA 및 웨스턴 블랏 실험 모두 판매용 임상진단 항체와 뚜렷한 반응성을 보이고 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 실시예 2에서 제조한 형질전환 식물체에서 유래한, 돼지 열병 바이러스의 항원성 GP55 단백질 및 CBD 단백질을 포함하는 융합 재조합 단백질에서, 돼지 열병 바이러스 GP55 단백질은 항원성을 가짐을 확인하였다. 또한, 상기 돼지 열병 바이러스 GP55 단백질은 형질전환된 식물체에서 높은 수준으로 발현됨을 확인하여, 대량 생산이 가능함을 확인하였다.

실시예 4. 형질전환 식물체로부터 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2(plant-made E2 )의 분리 및 정제

4-1. 융합 재조합 단백질의 분리정제

본 발명에서 제조한 형질전환 식물체는 셀룰로오즈 결합 도메인(CBD) 단백질이 함께 발현되도록 제조하였기 때문에, 셀룰로오즈를 이용하여 고효율로 단백질을 분리 정제하였다. 이때 목적단백질의 분리정제용 수지(resin)로는 결정 셀룰로오즈(microcrystalline cellulose: MCC)를 재료로 특수 제조한 비결정 셀룰로오즈(amorphous cellulose: AMC)를 사용하였다.

4-2. 분리정제한 재조합 단백질의 분획별 확인

상기 실시예 4-1에 따라 분리 정제한 재조합 단백질을 두 가지 방법으로 확인하였다. 첫번째 방법으로, 목적 단백질인 돼지 열병 바이러스 GP55 단백질의 존재를 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 상기 분리 정제된 단백질에는 CBD와 목적단백질인 돼지 열병 바이러스 GP55 단백질이 융합(fusion)되어 있으므로, 일차항체로 사용한 CBD에 대한 반응은 돼지 열병 바이러스 GP55 단백질의 존재를 간접적으로 표시하게 된다. 이때, 단백질을 포함하는 식물용액의 각 분획들에서 돼지 열병 바이러스 GP55 단백질이 분포하는 정도를 상대적으로 비교함으로써, 분리 및 정제 과정의 문제점 등을 확인할 수 있도록, 겔의 각 well에는 각 분획을 동일한 비율로 로딩하였으며, 도 5에 나타내었다. 두번째 방법으로, 도 5에 나타낸 바와 같이, 각 분획을 SDS-PAGE 겔에서 코마시(Coomassie) 염색을 시행하여 단백질 밴드를 확인하였으며, 전반적인 양상을 코마시 염색한 웨스턴 블롯 결과와 비교하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블랏한 결과, GP55 단백질이 레진(resin)에 상당히 결합함을 확인하였다. 또한, Ub 레인(lane)에는 소량이 남아있음을 확인하였다. E1 및 E2 레인에서는, 3회의 세척 과정을 통하여 미량의 단백질이 세척되어 소실되지만 대부분의 단백질은 회수됨을 확인하였다. 상기 회수된 단백질을 SDS-PAGE로 확인하였을 때, GP55 단백질의 밴드가 선명하게 육안으로 확인되었으며, 비특이적 밴드(nonspecific band)는 확인되지 않을 정도로 순도가 좋음을 확인하였다.

4-3. 분리 정제한 단백질의 정량

상기 4-1에서 분리한 단백질용액을 한번 더 정제하기 위하여, 상기 단백질 용액을 PBS에 투석하였다. 이후 원심 필터 튜브(Centrifugal filter tube)를 사용하여 농축하고, SDS-PAGE 겔에서 코마시 염색을 수행한 결과를 도 6에 나타내었다. 일정농도의 BSA(Bovine Serum Albumin) 용액을 표준으로 하여, 단백질 밴드의 농도를 상대 비교하였으며, 목적단백질(CBD단백질을 포함함)을 정량하였다. 이때 분리한 단백질용액(투석 전), 투석 후 단백질용액, 농축 후 단백질용액 및 농축 시 떨어지는 용액(손실되는 단백질 확인 가능)등을 각각 로딩하여 함께 정량함으로써, 정제 및 정량과정을 재검토하는 정확성을 기하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 투석 후에도 단백질 소실 없이 버퍼교환이 가능하고, 농축 과정을 통하여 최종 백신원료 단백질 항원을 원하는 농도로 제조하고 표준단백질과 비교하여 정량할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 상기 형질전환된 식물체에서 발현된 돼지 열병 바이러스의 항원성 GP55 단백질 및 CBD 단백질을 포함하는 융합 재조합 단백질을 "pmE2(plant-made E2)"이라 명명하였다.

실시예 5. 모델 동물에서 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 의 면역원성 및 바이러스 중화능 확인

모델 동물에서 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2가 생체 내에서 항체를 유도하여 면역원성 및 바이러스 중화능을 갖는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 모델 동물인 마우스에 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 단백질을 투여하였다. 음성대조군 마우스에는 PBS를 투여하였고, 조건 투여군은 항원에 동량의 Freund's adjuvant를 섞어 투여하였으며, 2주 간격으로 3회 투여한 후 각 혈청을 취하였다. 투여 항원에 대한 특이항체의 생성여부는 돼지열병 바이러스에 대한 임상진단용 항체키트(제노바이오텍(현,메디안 디노스틱), CSFV-Ab ELISA kit)를 사용하여 확인하였다. 키트 사용 수칙에 따라 성적을 판정한 결과를 도 7에 나타내었다. 또한, 동일한 마우스 혈청에서 바이러스 중화능을 농림축산검역본부에 의뢰한 결과를 도 8에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 모든 조건군에서 항체역가는 양성값을 기록함을 확인하여, 본 발명의 방법으로 제조한 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2는 마우스에서 돼지열병 바이러스에 대한 면역원성을 가지는 것으로 확인하였다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 모든 조건군에서 매우 높은 역가를 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따라 제조한 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2는 마우스에서 특이항체를 생성하고, 이 항체는 높은 역가의 바이러스 중화능을 가짐을 확인하였다.

실시예 6. 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 을 돼지 열병 바이러스 노출경로 판별 마커로서의 활용 가능성 확인

식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2(돼지 열병 바이러스의 항원성 GP55 단백질 및 CBD 단백질을 포함하는 융합 재조합 단백질)에는 CBD 단백질이 융합되어 있으므로, 상기 CBD 단백질을 바이러스 노출경로를 판별해내는 마커로서 활용 가능성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2이 포함하는 CBD 단백질을 항원으로 하여 ELISA법으로 다음의 각 혈청에서 상기 항원들에 대한 특이항체를 측정하였다. 임상진단용 키트(제노바이오텍(현,메디안 디노스틱), CSFV-Ab ELISA kit)에 포함된 대조군(swine) 혈청, 축산전문농장에서 사육중인 모돈 7 개체와 자돈 28 개체의 혈청, 상기 실시예 5에서 취한 마우스 혈청 등에서 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2이 포함하는 CBD 단백질에 대한 특이항체를 측정하였다. 대상 모돈의 채혈시 연령과 가장 최근에 시행된 돼지열병 백신 시기는 확인이 불가하였으며, 대상 자돈의 채혈시 연령은 약 3주령이고, 대상 자돈 역시 백신 시행여부는 확인이 불가하였다. 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2을 돼지 열병 바이러스 노출경로 판별 마커로서 활용 가능성에 대하여 확인한 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 식물 유래 단백질에 노출된 마우스의 혈청에서 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2이 포함하는 CBD 단백질에 대한 특이항체가 함께 검출되었다. 반면, 키트에 포함된 대조군 혈청 및 사육된 모돈과 자돈의 혈청은 모든 검체에서 돼지열병 바이러스에 대한 특이항체는 키트사용 수칙에 따라 분석한 결과 양성값의 역가로 검출되었으나, 상기 CBD 단백질에 대한 특이항체는 검출되지 않았다. 이때, 모돈과 자돈에서 검출된 돼지열병 바이러스에 대한 특이항체는 그 유래를 확인할 수 없으나, CBD 단백질에 대한 특이항체는 검출되지 않아, 본 발명에서 사용한 단백질과는 무관한 것으로 판단되었다.

따라서, 본 발명의 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2은 바이러스 노출경로를 판별하는 마커로서 충분히 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2에서 포함하는 CBD 단백질이 일반적으로 면역반응을 유발하여 특이항체를 형성하는 것인지를 확인하고자 하였다. CBD 단백질이 일반적으로 항체를 만드는 성질의 단백질이라면 pmE2에 의한 CBD 항체형성 여부는 야외바이러스 감염에 의한 CSFV 항체와 pmE2 항체 생성여부를 positively 검증하는데 신뢰도를 높일 수 있다. 이를 확인하기 위하여, GFP(green fluorescent protein)와 CBD가 융합된 단백질을 형질전환 대장균에서 얻고, 이를 항원으로 마우스에 주사한 후 얻은 혈청으로부터 GFP와 CBD에 대한 특이항체를 ELISA법으로 각각 확인하였다. 이때 항원으로 유래가 다른 몇 가지 단백질에 대하여 실험하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 대장균 유래 GFP-CBD 주사한 마우스 혈청은 다양한 GFP 단백질에 대해 흡광도가 증가하였으므로, α-GFP IgG가 잘 생성됨을 확인하였고, 여러 종류 CBD 단백질에 대한 α-CBD IgG도 높은 역가로 생성되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2에 함께 융합시킨 CBD 단백질은 목적단백질의 종류와 관계없이 각각의 특이항체를 생성함을 확인하였다. 또한, 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2(돼지 열병 바이러스의 항원성 GP55 단백질 및 CBD 단백질을 포함하는 융합 재조합 단백질)은 돼지 열병 바이러스의 항원성 GP55 단백질을 포함하고 있어, 이를 항원으로 이용할 수 있다. 또한, CBD 단백질이 포함되어 있어 이를 각 특이항체를 검출에 이용할 수 있음을 확인하여, 동물에서 바이러스 노출경로가 백신접종인지 혹은 자연감염인지를 구별하는 용도로도 활용할 수 있음을 확인하였다.

실시예 7. 목적 동물(돼지)에서의 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 방어능 확인

7-1. 목적 동물(돼지)에 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 접종

돼지 동물 모델에서 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2의 방어능을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 도 11에 나타낸 바와 같이, 돼지 열병 항체 음성돈 8두를 선별하여 실험에 사용하였다. 이중 4 두는 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2를 접종하지 않은 대조군으로서 사용하였고, 실험군으로서 2 두는 100 ㎍의 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2를 각각 1회 접종하였다. 나머지 2 두는 100 ㎍을 각각 2주 간격으로 2회 접종하였다. 야외 바이러스로부터의 방어력을 조사하기 위하여, 돼지열병 야외바이러스(연천주: 2012년 국내 야생멧돼지에서 분리)를 ^6.0 TCID 50/㎖ 농도로 접종하였다. 공격접종은 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2를 접종한 후 14일째 실시하였으며 공격 접종 후 2주째 실험을 종료하고 부검을 실시하였다.

7-2. 공격 접종 이후 돼지의 임상증상 확인

식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2를 접종한 돼지에서 야외주 공격접종 이후에 전형적인 열병 증상인 고열이 발생하는지를 조사하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 pmE2 단백질을 접종하지 않은 대조군 4마리에서는 공격접종 후 3일부터 열이 오르기 시작하여 7일 이후에는 4마리 모두 체온이 40도를 넘었고 11일까지 고열이 유지됨을 확인하였다. 반면, 본 발명의 pmE2 단백질을 1회 접종 혹은 2회 접종한 돼지 모두에서 공격 접종 후 10일간 관찰하였지만 체온 상승은 관찰 되지 않았고 4두 모두 40도 이하로 유지됨을 확인하였다.

또한, 돼지 열병 바이러스에 감염이 될 때 백혈구 수치가 일반적으로 9000 이하로 떨어지는 증세를 보이므로, 본 발명의 pmE2 단백질 접종을 통하여 백혈구 수치 감소 억제 여부를 조사하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 대조군 돼지 4마리는 공격접종 후 3일부터 백혈구 수치가 감소하였고 7일에는 4마리 모두 백혈구 수치가 9000 이하로 떨어지는 것을 확인하였다. 반면 본 발명의 pmE2을 주사한 돼지에서는 개체 차이를 보이기는 하지만 1회 접종, 2회 접종 돼지 모두 공격접종 10일 이후에는 백혈구 수치가 모두 9000이상을 유지함을 확인하였다.

따라서, 백신을 접종한 개체에서는 돼지열병 관련 임상증상이 관찰되지 않아 본 발명의 pmE2 단백질을 접종 시 돼지 열병 바이러스 방어에 효과적임을 확인하였다.

7-3. 공격 접종 이후 돼지의 채혈 및 시료에서 항원 검출 확인

공격 접종 이후 본 발명의 pmE2 단백질이 바이러스 증식(propagation)을 억제하는지 확인하고, 돼지의 채혈 및 시료에서 항원이 검출되는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 공격 접종 후 3일, 5일, 7일 및 10일경에 대조군과 실험군 돼지의 전혈, 비즙, 타액 및 분변을 채취하고, 야외주 바이러스 항원을 PCR 방법으로 확인하였다. PCR 조건은 30min/42℃, 15min/94℃, (40cycles: 30sec/94℃, 30sec/55℃, 45sec/72℃), 5min/72℃으로 5' NCR 부위를 421bp 증폭하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다

도 14에 나타낸 바와 같이, 공격 접종 후 3일 째 대조군 돼지에서는 전혈에서 항원이 검출되었고 5일에는 비즙과 타액 및 분변에서까지 항원이 검출되었다. 반면 본 발명의 pmE2 백신을 1회 접종한 돼지에서는 비즙과 타액에서는 항원이 검출되지 않았으며, 전혈에서는 항원이 검출되었고 약양성 반응을 보이는 시료들이 많음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 pmE2 백신을 2회 접종한 돼지 중 1마리는 공격 접종 후 3일부터 10일까지 조사하였을 때 항원이 전혀 검출되지 않았으며 1마리에서는 공격접종 3일후 분변에서, 5일후 전혈에서, 7일후 비즙에서 약한 항원 반응을 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 pmE2 단백질을 처리하면, 체내에서 바이러스 증폭을 억제하고 전파를 저해함을 확인하였다.

7-4. 공격 접종 이후 돼지 장기 내 항원 검출 조사

공격 접종후 14일째 대조군과 실험군 돼지를 부검하여 다양한 장기에서 공격 접종한 야외주 바이러스 항원 검출 여부를 PCR법으로 수행하여 본 발명의 pmE2 단백질이 돼지 체내 장기의 바이러스 증폭에 어떤 영향을 주었는지를 조사하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 대조군 모든 돼지에서는 편도, 심장, 신장, 폐, 간, 비장, 소장, 대장, 악하림프절, 서혜부 및 장간막 모두에서 공격 접종한 바이러스 항원이 검출된 반면, 본 발명의 pmE2 단백질을 1회 주사한 돼지에서는 편도, 악하림프절 및 장간막 등에서 항원이 검출되었고 심장, 신장, 폐, 간, 소장 및 대장에서는 바이러스 항원이 검출되지 않았다. 또한, 본 발명의 pmE2 단백질을 2회 주사한 돼지 중 1마리에서는 편도에서 항원이 검출되었고, 악하 림프절, 서혜부, 장간막에서는 약양성 반응을 나타낸 반면, 나머지 한 마리의 모든 장기에서는 항원이 검출되지 않았다.

따라서, 본 발명의 pmE2 백신이 돼지에서 바이러스 공격으로부터 돼지를 보호할 수 있음을 의미하고 농도-의존적(dose-dependent)으로 효과가 있음을 확인하였다.

7-5. 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 의 항체가 확인

돼지 열병 백신의 방어능을 표현하는 주요 지표인 방어 항체가를 조사하고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 공격접종 전후로 항체가가 10을 넘기지는 못하였지만 본 발명의 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2를 주사한 돼지에서는 야외주 바이러스 공격접종 후 항체가가 급격히 증가됨을 확인하였다. 이는 본 발명의 pmE2에 의해 열병 바이러스를 중화할 수 있는 항체가 이미 기억 되었다가 바이러스 공격 접종에 의해 부스팅(boosting)된 것으로 판단된다. 또한, 본 발명의 pmE2 단백질을 1회 접종한 돼지에서는 공격 접종 전에 각각 16 및 8의 방어 항체가를 나타내다가 공격 접종 후 5일 이후에는 32의 수치를 나타내었다. 이후 공격 접종 후 14일에는 512의 수치를 나타내었다. pmE2 백신을 2회 접종한 돼지 2마리에서는 백신 접종 14일에 16의 수치를 나타내었고 28일 이후에는 각각 512, 2048의 높은 방어 항체가를 보였으며 공격접종 이후에는 항체가가 더 높이 올라가 두 마리 모두에서 4096의 수치를 보임을 확인하였다.

따라서, 임상적으로 방어 항체가는 32 이상이면 방어능이 있다고 판단하는 상황임을 고려할 때, 본 발명의 식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2은 돼지에서 돼지 열병 바이러스에 대한 방어능이 우수한 것으로 확인하였다.

이하 본 발명의 약학적 조성물 및 사료 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제조

1-1. 산제의 제조

식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캡슐제의 제조

식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 사료 조성물의 제조

식물 유래 돼지 열병 항원 단백질 pmE2 100 mg

비타민 E 0.7 mg

L-카르니틴 0.7 mg

통상의 사료 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하여 사료를 제조한다.

<110> Animal and plant quaratine agency BioApplications Inc. <120> Vaccine composition for classical swine fever from plant and manufacturing method thereof <130> 1-61 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1026 <212> DNA <213> DNA sequence for gp55 of Classical swin fever virus <400> 1 aacggctagc ctgcaaggaa gattacaggt acgcaatatc atcaaccaat gagatagggc 60 tactcggggc cggaggtctc accaccacct ggaaagaata caaccacgat ttgcaactga 120 atgacgggac cgttaaggcc atttgcgtgg caggttcctt taaagtcaca gcacttaatg 180 tggtcagtag gaggtatttg gcatcattgc ataaggaggc tttacccact tccgtgacat 240 tcgagctcct gttcgacggg accaacccat caactgagga aatgggagat gacttcgggt 300 tcgggctgtg cccgtttgat acgagtcctg ttgtcaaagg aaagtacaat acaaccttgt 360 tgaacggtag tgctttctat cttgtctgtc caatagggtg gacgggtgtt atagagtgca 420 cagcagtgag cccaacaact ctgagaacag aagtggtaaa gaccttcagg agggacaagc 480 cctttccgca cagaatggat tgtgtgacca caacagtgga aaatgaagat ttattctact 540 gtaagttggg gggcaactgg acatgtgtga aaggtgaacc agtggtctac acgggggggc 600 tagtaaaaca atgcagatgg tgtggctttg acttcaatga gcctgacgga ctcccacact 660 accccatagg taagtgcatt ttggcaaatg agacaggtta cagaatagtg gattcaacag 720 actgtaacag agatggtgtt gtaatcagca cagaggggag tcatgagtgc ttgatcggta 780 acacgactgt caaggtgcat gcatcagatg aaagactggg ccccatgcca tgcagaccta 840 aagagatcgt ctctagtgca ggacctgtaa ggaaaacttc ctgtacattc aactacgcaa 900 aaactttgaa gaacaagtac tatgagccca gggacagcta cttccagcaa tatatgctta 960 agggcgagta tcagtactgg tttgacctgg acgtgactga ccgccactca gattacttcg 1020 cagaag 1026 <210> 2 <211> 429 <212> DNA <213> DNA sequence for cellulose-binding domain <400> 2 tttcgaagtt caccagtgcc tgcacctggt gataacacaa gagacgcata ttctatcatt 60 caggccgagg attatgacag cagttatggt cccaaccttc aaatctttag cttaccaggt 120 ggtggcagcg ccattggcta tattgaaaat ggttattcca ctacctataa aaatattgat 180 tttggtgacg gcgcaacgtc cgtaacagca agagtagcta cccagaatgc tactaccatt 240 caggtaagat tgggaagtcc atcgggtaca ttacttggaa caatttacgt ggggtccaca 300 ggaagctttg atacttatag ggatgtatcc gctaccatta gtaatactgc gggtgtaaaa 360 gatattgttc ttgtattctc aggtcctgtt aatgttgact ggtttgtatt ctcaaaatca 420 ggaacttct 429 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> 5'UTR of M17 gene <400> 3 ggcgtgtgtg tgtgttaaag a 21 <210> 4 <211> 273 <212> DNA <213> DNA sequence for chapherone binding protein(BiP) <400> 4 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taa 273 <210> 5 <211> 1862 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> particle sequence of recombinant vector <400> 5 tctagaggcg tgtgtgtgtg ttaaagaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60 gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120 cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180 tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240 ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcaat agaagaggct acgaagttaa 300 ggatccaacg gctagcctgc aaggaagatt acaggtacgc aatatcatca accaatgaga 360 tagggctact cggggccgga ggtctcacca ccacctggaa agaatacaac cacgatttgc 420 aactgaatga cgggaccgtt aaggccattt gcgtggcagg ttcctttaaa gtcacagcac 480 ttaatgtggt cagtaggagg tatttggcat cattgcataa ggaggcttta cccacttccg 540 tgacattcga gctcctgttc gacgggacca acccatcaac tgaggaaatg ggagatgact 600 tcgggttcgg gctgtgcccg tttgatacga gtcctgttgt caaaggaaag tacaatacaa 660 ccttgttgaa cggtagtgct ttctatcttg tctgtccaat agggtggacg ggtgttatag 720 agtgcacagc agtgagccca acaactctga gaacagaagt ggtaaagacc ttcaggaggg 780 acaagccctt tccgcacaga atggattgtg tgaccacaac agtggaaaat gaagatttat 840 tctactgtaa gttggggggc aactggacat gtgtgaaagg tgaaccagtg gtctacacgg 900 gggggctagt aaaacaatgc agatggtgtg gctttgactt caatgagcct gacggactcc 960 cacactaccc cataggtaag tgcattttgg caaatgagac aggttacaga atagtggatt 1020 caacagactg taacagagat ggtgttgtaa tcagcacaga ggggagtcat gagtgcttga 1080 tcggtaacac gactgtcaag gtgcatgcat cagatgaaag actgggcccc atgccatgca 1140 gacctaaaga gatcgtctct agtgcaggac ctgtaaggaa aacttcctgt acattcaact 1200 acgcaaaaac tttgaagaac aagtactatg agcccaggga cagctacttc cagcaatata 1260 tgcttaaggg cgagtatcag tactggtttg acctggacgt gactgaccgc cactcagatt 1320 acttcgcaga atcccgggca gattacgaca ttccaacaac tgatgcagag aatttgtatt 1380 ttcagggtcg ggcacaccac caccaccacc actttcgaag ttcaccagtg cctgcacctg 1440 gtgataacac aagagacgca tattctatca ttcaggccga ggattatgac agcagttatg 1500 gtcccaacct tcaaatcttt agcttaccag gtggtggcag cgccattggc tatattgaaa 1560 atggttattc cactacctat aaaaatattg attttggtga cggcgcaacg tccgtaacag 1620 caagagtagc tacccagaat gctactacca ttcaggtaag attgggaagt ccatcgggta 1680 cattacttgg aacaatttac gtggggtcca caggaagctt tgatacttat agggatgtat 1740 ccgctaccat tagtaatact gcgggtgtaa aagatattgt tcttgtattc tcaggtcctg 1800 ttaatgttga ctggtttgta ttctcaaaat caggaacttc tcacgatgag ctctagctcg 1860 ag 1862

Claims

돼지 열병 바이러스(classical swine fever virus)의 GP55 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 셀룰로오즈 결합 도메인(Cellulose Binding Domain, CBD) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 셀룰로오즈 결합 도메인(Cellulose Binding Domain, CBD) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 CaMV 35S 프로모터 유전자; M17의 5' UTR 부위 유전자; BiP(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터.
제4항에 있어서,
상기 M17의 5' UTR 부위 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터.
제4항에 있어서,
상기 BiP 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 포함되는 것을 특징으로 하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 하기의 벡터지도로 표시되는 것을 특징으로 하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 재조합 벡터.
[도]
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산용 형질전환 식물체.
제9항의 형질전환 식물체에서 발현된, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질.
제10항에 있어서,
상기 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질은 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질 및 셀룰로오즈 결합 도메인 단백질이 융합된 것을 특징으로 하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질.
(a) 제1항의 재조합 벡터로 아그로박테리움을 형질전환시키는 단계;
(b) 상기 형질전환된 아그로박테리움을 식물체에 도입하는 단계; 및
(c) 상기 식물체에서, 발현된 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 분리 및 정제하는 단계;를 포함하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산 방법.
제12항에 있어서,
상기 식물체는 애기장대, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수, 벼, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근, 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립, 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 식물체인 것을 특징으로 하는, 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질 생산 방법.
제10항의 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 열병 예방용 백신 조성물.
제10항의 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 열병 예방용 약학적 조성물.
제10항의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 열병 예방용 사료 조성물.
제10항의 재조합 단백질을 포함하는 돼지 열병 바이러스 진단용 조성물.
제10항의 재조합 단백질을 포함하는 돼지 열병 바이러스 진단 키트.
제14항에 따른 백신 조성물을 동물에 투여함으로써 돼지 열병을 예방하는 방법.
제10항의 재조합 단백질을 이용한 항원-항체반응을 통해 시료 내에서 돼지 열병 바이러스를 검출하는 것을 특징으로 하는, 돼지 열병 바이러스의 검출방법.
제20항에 있어서,
상기 항원-항체 반응은 조직면역염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴블랏(Western Blotting), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion Assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 단백질칩(protein chip) 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 돼지 열병 바이러스의 검출방법.
제20항에 있어서,
상기 시료는 세포, 혈액, 소변, 타액 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 돼지 열병 바이러스의 검출방법.
1) 제14항의 백신 조성물을 검체에 투여한 후, 검체로부터 혈액을 채취하는 단계;
2) 상기 1)단계에서 채취한 혈액으로부터 혈청을 분리하는 단계; 및
3) 상기 2)단계에서 분리된 혈청에 제10항의 식물 유래 돼지 열병 항원 pmE2 단백질을 항원으로 처리하여 반응시키는 단계;를 포함하는, 돼지 열병 바이러스 항체 생성 경로 판별 방법.
제20항에 있어서,
상기 3)단계의 반응에서 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질 및 셀룰로오즈 결합 도메인 단백질 대한 항체가 함께 검출될 경우, 상기 검체에서 형성된 항체는 제14항의 백신 조성물의 투여에 의해 생성된 것으로 판별하는 것을 특징으로 하는, 돼지 열병 바이러스 항체 생성 경로 판별 방법.
제20항에 있어서,
상기 3)단계의 반응에서 돼지 열병 바이러스의 GP55 단백질에 대한 항체만 검출된 경우, 돼지 열병 바이러스의 감염에 의해 생성된 것으로 판별하는 것을 특징으로 하는, 돼지 열병 바이러스 항체 생성 경로 판별 방법.