CN112858682A - 用于尿微量白蛋白的检测试纸条及其制备方法、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于尿微量白蛋白的检测试纸条及其制备方法、检测试剂盒和检测方法，涉及体外诊断技术领域。本发明公开的检测试纸条检测线上包被有作为竞争抗原的重组人白蛋白，该重组人白蛋白由植物重组表达系统表达得到。使用本发明公开的试剂盒检测尿微量白蛋白可以取得更好的检测效果，且该试剂盒的批间重复性好，生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体而言，涉及一种用于尿微量白蛋白的检测试纸条及其制备方法、检测试剂盒和检测方法。
背景技术
尿微量白蛋白测定反映早期肾病和肾损伤情况。病理性增高见于糖尿病肾病、高血压和妊娠子痫前期。在早期尿微量白蛋白阶段是肾病发生的早期信号和预兆，此时肾脏损害处在尚可逆转的时期，如能及时治疗，可以终止或逆转肾病的发展进程。尿微量白蛋白检测可作为全身性或局部炎症反应的肾功能指标，如尿路感染等原因引起的肾脏早期病变；急性胰腺炎并发症的预测指标；服用对肾功能有影响的药物者也可检测尿微量白蛋白，便于早期观察肾功能情况及早采取措施。
尿微量白蛋白检测试剂盒由于其线性宽，市面上企业多使用稀释液进行稀释后检测，增加了操作步骤的同时也对实际检验人的操作提出更高要求。采用竞争法则可以不需稀释，一步加样完成检验。
但目前基于竞争法原理的尿微量白蛋白检测试剂盒也存在诸多问题，例如价格高，抗原难以获取，批间差异大，检测结果准确性不高，有生物安全性问题等。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于尿微量白蛋白的检测试纸条及其制备方法、检测试剂盒和检测方法，以克服上述问题，
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种用于尿微量白蛋白的检测试纸条，其包括：层析膜，所述层析膜上具有检测线，所述检测线包被有作为竞争抗原的重组人白蛋白，所述重组人白蛋白由植物重组表达系统表达得到，所述重组人白蛋白能够与样品的人白蛋白竞争结合来自结合垫的第一抗体，所述第一抗体能够特异性结合样品的人白蛋白。
现有的基于竞争法原理的尿微量白蛋白检测试剂盒，其试纸条的检测线中包被的大部分是以人血清为直接来源的人白蛋白，而本发明实施例提供的检测试纸条，在其检测线中，包被的是由植物重组表达系统表达得到的重组人白蛋白，本发明实施例的研究发现，将由植物重组表达系统表达得到的重组人白蛋白包被在检测线中，以此作为竞争抗原，不仅易于制备，可以取得更好的检测效果和批间重复性，还可以降低生产成本。
在可选的实施方式中，所述植物重组表达系统选自转基因植物表达系统和叶绿体转基因植物表达系统中的任意一种。
目前，常见的植物重组表达系统主要包括三种类型：转基因植物表达系统和叶绿体转基因植物表达系统。
其中，转基因植物表达系统主要是指将外源人白蛋白基因构建在植物表达载体上，利用遗传转化的方法，将外源人白蛋白基因(本领域技术人员根据现有技术容易获取到该基因)转化到植物细胞中并与基因组整合获得稳定表达的转基因植株，从转基因植株获得重组人白蛋白。
叶绿体转基因植物表达系统主要是指以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作，通过一定方法使外源人白蛋白基因穿过细胞膜和叶绿体双层膜进入叶绿体，在同源重组片段的介导下与叶绿体基因组之间发生同源重组，以定点整合方式进入叶绿体基因组，并在其中转录、翻译并获得重组人白蛋白。
在本发明所揭示内容的基础上，本领域技术人员容易想到以合适的植物重组表达系统为直接来源的人白蛋白，而并不限于如上所示的植物重组表达系统，无论何种植物表达系统直接来源的人白蛋白将其作为竞争抗原包被至检测线，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述植物重组表达系统的宿主植物选自大豆、棉花、苜蓿、马铃薯、油菜、水稻、小麦、烟草和玉米中的任意一种。
植物重组表达系统的宿主植物可以是多种多样，本领域技术人员根据实际情况可以选择合适的宿主植物以生产得到重组人白蛋白，无论人白蛋白是以何种植物作为宿主进行重组表达得到，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述层析膜上还具有质控线，所述质控线包被有第二抗体，所述第二抗体能够结合抗体复合物和来自结合垫的游离的所述第一抗体，所述抗体复合物由样品中的人白蛋白与结合垫中的所述第一抗体特异性结合形成。
在可选的实施方式中，第二抗体为抗第一抗体的多克隆抗体，第二抗体的种属来源与第一抗体的种属来源不同。
在可选的实施方式中，所述层析膜的材质为硝酸纤维素膜。
在可选的实施方式中，所述检测试纸条还包括所述结合垫，所述结合垫中包被有所述第一抗体；
在可选的实施方式中，所述第一抗体标记有信号指示剂。
通过信号指示剂，便于检测者观察抗体与抗原的结合情况。
所述信号指示剂选自胶体金、荧光微球、荧光素和量子点中的任意一种。
在可选的实施方式中，第一抗体为单克隆抗体。
在可选的实施方式中，所述检测试纸条还包括样品垫和吸水垫，所述吸水垫、所述层析膜、所述结合垫和所述样品垫依次搭接组成所述检测试纸条。
第二方面，本发明实施例提供如前述实施方式任一项所述的检测试纸条的制备方法，其包括：在所述层析膜上的检测线位置包被作为抗原的所述重组人白蛋白。
第三方面，本发明实施例提供一种检测尿微量白蛋白的试剂，所述试剂适用于基于竞争法原理检测尿微量白蛋白的方法，所述试剂含有作为竞争抗原的重组人白蛋白；
所述重组人白蛋白由植物重组表达系统表达得到，所述重组人白蛋白能够与样品的人白蛋白竞争结合抗人白蛋白抗体。
相较于以人血清来源的人白蛋白作为竞争抗原，本发明提供的检测尿微量白蛋白的试剂，其以由植物重组表达系统表达得到的重组人白蛋白作为竞争抗原，不仅易于制备，可以取得更好的检测效果和批间重复性，还可以降低生产成本。
在可选的实施方式中，所述基于竞争法原理检测尿微量白蛋白的方法选自免疫比浊法、酶联免疫法和化学发光法中的任意一种。
需要说明的是，本发明实施例提供的试剂可以适用于任何基于竞争法原理检测尿微量白蛋白的方法，包括但不限于免疫比浊法、酶联免疫法和化学发光法。
第四方面，本发明实施例提供一种尿微量白蛋白的检测试剂卡或检测试剂盒，其包括前述实施方式任一项所述的检测试纸条。
使用本发明实施例提供的检测试剂卡或检测试剂盒检测尿微量白蛋白可以取得更好的检测效果，且该试剂盒的批间重复性好，生产成本低。
第五方面，本发明实施例提供一种检测尿微量白蛋白的方法，其包括：采用如前述实施方式任一项所述的检测试纸条、前述实施方式任一项所述的试剂盒、或者前述实施方式任一项所述的试剂进行检测。
在可选的实施方式中，上述检测方法以非疾病诊断为目的。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了制备用于尿微量白蛋白的检测试纸条的方法，制备方法参考如下步骤进行：
(1)制备层析膜
(a)羊抗鼠抗体(第二抗体)用包被工作液稀释成浓度为1.2mg/ml，使用划膜仪按0.8μL/cm的喷量喷至硝酸纤维素膜的质控线(C线)；37℃鼓风干燥3-4h；
(b)植物重组表达系统表达得到的重组人白蛋白(购自天津灏洋TBD货号：20180066，水稻重组表达系统)用划膜工作液稀释至0.6mg/mL，使用划膜仪按0.8μL/cm的喷量喷至硝酸纤维素膜的检测线(T线)，C线与T线间距是3-4mm，37℃鼓风干燥3-4h。
(2)制备结合垫
(a)清洗：取50μL荧光微球(直径200nm的含有高亮稀土染料的羧基聚苯乙烯微球)至1.5mL离心管中，加入1mL 0.01M MES缓冲液中，震荡混匀，15000r/min离心15min，弃上清，加入1mL 0.01M MES缓冲液，超声打散微球；重复此步骤三次，已达到清洗微球的目的，最后得到清洗后的微球液；
(b)活化：向清洗后的1mL微球液中，加入250μL EDC溶液，避光活化2h，15000r/min离心15min，弃上清，加入1mL 0.01M MES缓冲液，超声打散微球，15000r/min离心15min，弃上清；
(c)标记：加入1mL 0.05M硼酸盐缓冲液，超声打散，加入20μL抗人白蛋白抗体(第一抗体)混匀，避光反应2h；
(d)封闭1：加入100μL 1M甘氨酸溶液，避光反应30min；
(e)封闭2：加入100μL 10％BSA溶液，避光反应30min；
(f)离心复溶：15000r/min离心15min，弃上清，加入100μL稀释液，超声打散微球，制得含荧光微球标记的抗人白蛋白抗体的标记物溶液。
(g)喷涂：将标记溶液，按照3μL/cm喷至玻璃纤维素膜上；
(h)干燥：将喷有标记物的玻璃纤维素膜放入37℃鼓风干燥箱中，干燥3-4h；制得结合垫，放入干燥器中，备用。
(3)制备样品垫
(a)配制pH 7.4的PBS：称取8g NaCl，5.8g Na2HPO4，0.2g KCl，0.2g KH2PO4溶于1L纯化水中，即为pH 7.4的PBS；
(b)配制样品垫处理液：分别称取5g蔗糖，5g PVP-K30，5g PEG-20000，量取20mlTween-20，至1L pH 7.4的PBS中，磁力搅拌器上混匀待用；
(c)样品垫的处理：将玻璃纤维素膜装于自封袋中，80mL/张，加入样品垫处理液，浸泡30min；
(d)样品垫的干燥：将充分浸泡过的玻璃纤维素膜放入37℃鼓风干燥箱中，干燥8-10h；放入干燥器中待用。
(4)组装
依次将吸水垫、层析膜、结合垫和样品垫依次搭接并粘贴在底板上，检测线靠近结合垫，质控线远离结合垫，形成用于尿微量白蛋白的检测试纸条，切成标准规格后，组装到卡壳中，制得用于尿微量白蛋白的检测试剂卡。
需要说明的是，检测试纸条和检测试剂卡的制备方法为本领域的常规方法，本实施例制备方法的区别在于使用由植物重组表达系统表达得到的重组人白蛋白包被至T线作为竞争抗原。
实施例2
本实施例提供了一种尿微量白蛋白的检测试剂盒，其包括实施例1的检测试剂卡。
实施例3
本实施例提供了采用实施例1的试剂卡或实施例2的试剂盒进行尿微量白蛋白检测的方法：
取60μL人的新鲜尿液，加入试剂卡中，反应时间结束后，使用仪器对试剂卡进行扫描获得样品的尿微量白蛋白含量浓度。
实验例1
采用实施例2的试剂盒检测已知尿微量白蛋白含量的43个样本，以检测线包括的是人血清来源的人白蛋白的试剂盒作为对照，结果见下表1和表2。
表1 实施例2试剂盒和对照试剂盒的实际检测结果
表2 实施例2试剂盒和对照试剂盒的线性分析结果
| 对照试剂盒 | 实施例2试剂盒 | |
| 整体线性 | 0.9957 | 0.9973 |
| 阴性段线性 | 0.6780 | 0.9340 |
| 阳性段线性 | 0.9954 | 0.9971 |
| 阴阳判读有误 | 1 | 0 |
从表1和表2数据可以看出，实施例1的试剂盒与对照试剂盒的总体线性相当，但在阴性段的线性和阴阳判读上明显优于对照试剂盒，即说明实施例1的试剂在阴性样本的判读上结果的准确性更高。
实验例2
批间重复性
采用多批次的实施例2的试剂盒和对照试剂盒(同实验例1)检测不同浓度的人白蛋白含量，结果见下表3和表4。
表3 10个批次的实施例2的试剂盒的检测结果
表4 10个批次的对照试剂盒的检测结果
从表3和表4可以看出，10个批次的实施例2的试剂盒在检测1.9和10mg/dL两个浓度上的CV值都比对照试剂盒小，说明本发明实施例2试剂盒的批间差异小，重复性高。
实验例3
采用实施例2的试剂盒和对照试剂盒检测60mg/mLγ球蛋白，结果见下表5。
表5
γ球蛋白是人体内普遍存在的蛋白，当样本中只含有γ球蛋白、无人白蛋白时，试剂盒应不出现假阳干扰检测。但人血清来源的人白蛋白可能由制备工艺过程中带入γ球蛋白等杂蛋白，由带有干扰物的人白蛋白原料制备的试剂盒有被干扰的风险。实验例3即反应出了植物来源的人白蛋白制备的试剂盒不会因杂蛋白产生干扰，而人来源的人白蛋白制备的试剂盒有部分批次产生被干扰的情况。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于尿微量白蛋白的检测试纸条，其特征在于，其包括：层析膜，所述层析膜上具有检测线，所述检测线包被有作为竞争抗原的重组人白蛋白，所述重组人白蛋白由植物重组表达系统表达得到，所述重组人白蛋白能够与样品的人白蛋白竞争结合来自结合垫的第一抗体，所述第一抗体能够特异性结合样品的人白蛋白。
2.根据权利要求1所述的用于尿微量白蛋白的检测试纸条，其特征在于，所述植物重组表达系统选自转基因植物表达系统和叶绿体转基因植物表达系统中的任意一种；
优选地，所述植物重组表达系统的宿主植物选自大豆、棉花、苜蓿、马铃薯、油菜、水稻、小麦、烟草和玉米中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的检测试纸条，其特征在于，所述层析膜上还具有质控线，所述质控线包被有第二抗体，所述第二抗体能够结合抗体复合物和来自结合垫的游离的所述第一抗体，所述抗体复合物由样品中的人白蛋白与结合垫中的所述第一抗体特异性结合形成。
4.根据权利要求3所述的检测试纸条，其特征在于，所述层析膜的材质为硝酸纤维素膜。
5.根据权利要求1或2所述的检测试纸条，其特征在于，所述检测试纸条还包括所述结合垫，所述结合垫中包被有所述第一抗体；
优选地，所述第一抗体标记有信号指示剂；
优选地，所述信号指示剂选自胶体金、荧光微球、荧光素和量子点中的任意一种；
优选地，所述检测试纸条还包括样品垫和吸水垫，所述吸水垫、所述层析膜、所述结合垫和所述样品垫依次搭接组成所述检测试纸条。
6.如权利要求1-5任一项所述的检测试纸条的制备方法，其特征在于，其包括：在所述层析膜上的检测线位置包被作为竞争抗原的所述重组人白蛋白。
7.一种检测尿微量白蛋白的试剂，其特征在于，所述试剂适用于基于竞争法原理检测尿微量白蛋白的方法，所述试剂含有作为竞争抗原的重组人白蛋白；
所述重组人白蛋白由植物重组表达系统表达得到，所述重组人白蛋白能够与样品的人白蛋白竞争结合抗人白蛋白抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述基于竞争法原理检测尿微量白蛋白的方法选自免疫比浊法、酶联免疫法和化学发光法中的任意一种。
9.一种尿微量白蛋白的检测试剂卡或检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-6任一项所述的检测试纸条。
10.一种检测尿微量白蛋白的方法，其特征在于，其包括：采用如权利要求1-6任一项所述的检测试纸条、权利要求9所述的检测试剂卡或检测试剂盒、或者权利要求7或8所述的检测尿微量白蛋白的试剂进行检测。
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Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5723755A (en) * | 1995-05-16 | 1998-03-03 | Francis E. Lefaivre | Large scale production of human or animal proteins using plant bioreactors |
| CN1276835A (zh) * | 1997-08-07 | 2000-12-13 | 奥本大学 | 通用的叶绿体整合和表达载体、其转化植物及产物 |
| US20030084484A1 (en) * | 2001-07-27 | 2003-05-01 | Newell Bascomb | Commercial use of arabidopsis for production of human and animal therapeutic and diagnostic proteins |
| US20030084482A1 (en) * | 2001-06-08 | 2003-05-01 | Gerald Hall | Production of proteins in plants |
| US20090171070A1 (en) * | 1999-01-30 | 2009-07-02 | Novozymes Biopharma Uk Limited | Process for the Purification of Recombinant Albumin |
| CN102879586A (zh) * | 2012-10-11 | 2013-01-16 | 南京基蛋生物科技有限公司 | 微量白蛋白荧光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 |
| KR20160077239A (ko) * | 2014-12-22 | 2016-07-04 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 식물 유래의 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조방법 |
| CN105884886A (zh) * | 2015-01-26 | 2016-08-24 | 武汉大学 | 检测重组蛋白提取物中残留杂蛋白的特异性抗体及检测试剂 |
| US20170226476A1 (en) * | 2014-08-08 | 2017-08-10 | Cefo Co., Ltd | Composition for preserving cells, containing, as active ingredients, plantderived recombinant human serum albumin and plant peptides |
| CN107641155A (zh) * | 2016-07-20 | 2018-01-30 | 北京泰柏生物科技有限责任公司 | 一种在植物中表达重组人血清白蛋白的方法 |
| CN107827975A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-03-23 | 海南大学 | 一种用紫花苜蓿表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法 |
-
2019
- 2019-11-27 CN CN201911179069.4A patent/CN112858682B/zh active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5723755A (en) * | 1995-05-16 | 1998-03-03 | Francis E. Lefaivre | Large scale production of human or animal proteins using plant bioreactors |
| CN1276835A (zh) * | 1997-08-07 | 2000-12-13 | 奥本大学 | 通用的叶绿体整合和表达载体、其转化植物及产物 |
| US20090171070A1 (en) * | 1999-01-30 | 2009-07-02 | Novozymes Biopharma Uk Limited | Process for the Purification of Recombinant Albumin |
| US20030084482A1 (en) * | 2001-06-08 | 2003-05-01 | Gerald Hall | Production of proteins in plants |
| US20030084484A1 (en) * | 2001-07-27 | 2003-05-01 | Newell Bascomb | Commercial use of arabidopsis for production of human and animal therapeutic and diagnostic proteins |
| CN102879586A (zh) * | 2012-10-11 | 2013-01-16 | 南京基蛋生物科技有限公司 | 微量白蛋白荧光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 |
| US20170226476A1 (en) * | 2014-08-08 | 2017-08-10 | Cefo Co., Ltd | Composition for preserving cells, containing, as active ingredients, plantderived recombinant human serum albumin and plant peptides |
| KR20160077239A (ko) * | 2014-12-22 | 2016-07-04 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 식물 유래의 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조방법 |
| CN105884886A (zh) * | 2015-01-26 | 2016-08-24 | 武汉大学 | 检测重组蛋白提取物中残留杂蛋白的特异性抗体及检测试剂 |
| CN107641155A (zh) * | 2016-07-20 | 2018-01-30 | 北京泰柏生物科技有限责任公司 | 一种在植物中表达重组人血清白蛋白的方法 |
| CN107827975A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-03-23 | 海南大学 | 一种用紫花苜蓿表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法 |
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