WO2020213898A1 - 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20051—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a swine pandemic diarrhea virus vaccine composition
  • a swine pandemic diarrhea virus vaccine composition comprising as an active ingredient the swine pandemic diarrhea virus S1 protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • Porcine epidemic diarrhea is a fatal and highly contagious porcine intestinal disease, characterized by acute diarrhea/vomiting and dehydration, and causes high mortality in newborn piglets.
  • the disease was first reported in the UK in 1971, rapidly spread throughout Europe, and is believed to have migrated to the Asian continent in the 1980s.
  • a coronavirus-analog initially named CV777, was identified in Belgium as a causative agent.
  • Subunit vaccine refers to the mass production of structural or non-structural proteins of known antigenicity that constitute pathogenic microorganisms (E. coli or other expression systems) and use as antigenic proteins of vaccines.
  • vaccines for preventing such diseases do not use bacteria due to problems such as protein folding and glycosylation, and are mainly produced using animal cells.
  • the vaccine production method using animal cells is not easy to manufacture because it takes a large cost to expand facilities for mass production, and in most cases, the price of the vaccine is expensive.
  • inactive viral vaccines prepared using animal cells have disadvantages that not only are not easy to store, but are also highly likely to be contaminated with viruses that can infect animals.
  • the possibility of contamination by viruses that can infect animals is very low. As long as the cultivation area is secured, mass production is possible at any time, as well as long-term storage through plants. It is expected that production will be possible.
  • the present invention was derived to solve the problems of the prior art as described above, and a recombinant porcine epidemic diarrhea virus protein exhibiting high immunogenicity and virus neutralizing ability, as well as efficient production using plants, and a vaccine composition comprising the same It is an object of the present invention to provide a method for producing the protein.
  • the present invention provides a swine pandemic diarrhea virus vaccine composition comprising as an active ingredient a swine pandemic diarrhea virus protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the porcine epidemic diarrhea virus protein is also included in the scope of the present invention for a functional equivalent of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and the functional equivalent refers to the amino acid sequence as a result of addition, substitution, or deletion of amino acids.
  • the present invention provides a feed composition for preventing or treating swine epidemic diarrhea comprising the swine epidemic diarrhea virus protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating swine pandemic diarrhea by administering the swine pandemic diarrhea virus protein to an individual.
  • the present invention provides the use of the porcine epidemic diarrhea virus protein to prevent or treat swine epidemic diarrhea.
  • the present invention provides the use of the porcine epidemic diarrhea virus protein for the manufacture of a porcine epidemic diarrhea vaccine or medicament.
  • the present invention provides a vector for expression of a porcine epidemic diarrhea virus protein comprising a polynucleotide encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the polynucleotide is preferably a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the vector may be sequentially linked to be operable in the sequence of a promoter gene and a polynucleotide encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the vector may have a cleavage map illustrated in FIG. 1, but is not limited thereto.
  • the vector may further include a gene encoding one or more selected from the group consisting of endoplasmic reticulum signal peptide, Fc fragment, and BiP (Chaperone binding protein), but is limited thereto. no.
  • the endoplasmic reticulum signal peptide may be one selected from the group consisting of peptide sequences represented by KDEL, HDEL, SEKDEL, KHEDL, KEEL, and SEHEDL, but is not limited thereto.
  • the promoter is a cauliflower mosaic virus derived 35S promoter, a cauliflower mosaic virus derived 19S RNA promoter, a plant actin protein promoter, a ubiquitin protein promoter, CMV (Cytomegalovirus) promoter, SV40 (Simian virus 40) promoter, RSV (Respiratory syncytial virus) promoter, EF-1 ⁇ (Elongation factor-1 alpha) promoter, pEMU promoter, MAS promoter, histone promoter, Clp promoter, etc. It doesn't work.
  • the recombinant expression vector encodes a polynucleotide encoding BiP (Chaperone binding protein), a gene encoding HDEL (His-Asp-Glu-Leu) peptide, and a pig immunoglobulin Fc fragment. It may further include such a gene.
  • the present invention provides a transformant transformed with the vector.
  • the transformant is preferably microorganisms such as E. coli, Bacillus, Salmonella, yeast, etc., insect cells, animal cells including humans, mice, rats, dogs, monkeys, pigs, horses, cattle Food crops including rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, wheat, red beans, oats, and sorghum, which may be animals such as animals, Agrobacterium tumorfaciens, plants, and the like; Vegetable crops including Arabidopsis, Chinese cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, and carrot; Specialty crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanut, and rapeseed; And fruit trees including apple trees, pears, jujubes, peaches, grapes, tangerines, persimmons, plums, apricots, and bananas; And flowers including roses
  • microorganisms
  • the present invention (a) culturing the transformant; And (b) separating and purifying a swine pandemic diarrhea virus protein from the transformant or culture medium.
  • the transformant may preferably be a cell itself, a plant, or a culture containing cells, and the culture medium may be preferably a culture medium from which cells are removed after culturing the cells, but contains the recombinant antigen of the present invention. If you do, it is not limited to this.
  • the purification in step (b) may be purification using an aqueous fraction, but is not limited thereto.
  • the recombinant porcine epidemic diarrhea virus S1 protein of the present invention is not only effectively expressed in plants, but also has high water solubility, it is easy to separate and purify, and also acts as an antigen in the body to show high immunogenicity and virus neutralization ability. It is expected to be widely used in various fields. In addition, since it exhibits remarkable immunogenicity and virus neutralizing ability in the body, it can be used as a novel swine pandemic diarrhea vaccine composition.
  • FIG. 1 is a diagram showing the arrangement of genes for expression of the swine pandemic diarrhea virus S1 protein (PEDV-S1) in a plant according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing the result of confirming the expression of the swine pandemic diarrhea virus S1 protein in a plant according to an embodiment of the present invention by Western blotting.
  • FIG. 3 is a view showing the separation and purification results of the swine pandemic diarrhea virus S1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a view showing the result of confirming immunogenicity after administration of the recombinant swine epidemic diarrhea virus S1 protein antigen according to an embodiment of the present invention twice.
  • porcine epidemic diarrhea virus protein gene represented by SEQ ID NO: 1 can efficiently produce and isolate the porcine epidemic diarrhea virus protein having high immunogenicity even in plants. Therefore, since the swine pandemic diarrhea virus protein of the present invention can be produced in a stable and efficient mass, it is expected to provide an inexpensive and stable swine pandemic diarrhea vaccine.
  • the term "antigen” is a generic term for all substances that cause an immune response in the body, and preferably viruses, compounds, bacteria, pollen, cancer cells, shrimp, etc., or some peptides or proteins thereof, or It is not limited thereto as long as it is a substance capable of inducing an immune response.
  • PED virus belongs to the coronaviridae, has a single-stranded RNA as a genome, has a length of about 28 Kb, and is a spike protein, which is three major constituent proteins. ) Encodes membrane proteins or envelope proteins and nucleocapsid proteins.
  • spike protein is a major constituent protein of the PED virus, and has a biologically important function of recognizing a target cell and fusing the virus with a cellular membrane.
  • the Spike protein can be used as an attenuated epitope, and during maturation, the Spike protein is often cleaved into a receptor-binding subunit S1 and a membrane-binding subunit S2.
  • the S1 domain of the S protein contains a receptor binding domain (RBD) that mediates specific binding to cell receptors.
  • RBD receptor binding domain
  • vaccine is a biological preparation containing an antigen that causes an immune response in a living body, and refers to an immunogen that induces immunity in a living body by injection or oral administration to a person or animal to prevent infection.
  • the animal is a human or non-human animal, and the non-human animal refers to a pig, cow, horse, dog, goat, sheep, etc., but is not limited thereto.
  • expression vector refers to a vector capable of expressing a peptide or protein encoded by a heterogeneous nucleic acid inserted into the vector, and preferably, a pig Fc fragment is fused. It means a vector prepared to express a target antigen (in the present invention, a porcine epidemic diarrhea virus protein).
  • the "vector” refers to an arbitrary medium for the introduction and/or transfer of a base into a host cell in vitro, in vivo or in vivo, and a replication unit capable of bringing about replication of the bound fragment by binding other DNA fragments ( replicon), and the "replication unit” refers to any genetic unit (e.g., plasmid, phage, cosmid, etc.) that functions as a self-unit of DNA replication in vivo, that is, replicable by its own regulation. Chromosomes, viruses, etc.).
  • the recombinant expression vector of the present invention is preferably a promoter, which is a transcription initiation factor to which RNA polymerase binds, an arbitrary operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and termination of transcription and translation.
  • the 5'UTR region gene of M17 for increasing the amount of protein synthesis
  • the BiP gene for moving the target protein to the endoplasmic reticulum
  • the expression level of the target protein and Fc fragments that increase solubility
  • endoplasmic reticulum signal peptide endoplasmic reticulum signal peptide, meaning the same as the endoplasmic reticulum targeting sequence
  • a marker gene for selection such as a tag gene for easily separating the recombinant protein and an antibiotic resistance gene for selecting a transformant may be further included.
  • the "swine pandemic diarrhea virus protein” of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and is preferably represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. According to an embodiment of the present invention, since the porcine epidemic diarrhea virus protein of the present invention has high solubility, it is easy to separate and purify, and the aggregation of the recombinant protein is inhibited, so that the physiological or pharmacological activity of the recombinant protein It is effective to maintain.
  • the protein of the present invention may be encoded by the gene sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the gene variants are included in the scope of the present invention.
  • the gene may include a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, and most preferably 90% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the "BiP gene” is a part of the BiP sequence used to move the expressed recombinant protein to the endoplasmic reticulum, preferably a gene containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and most preferably a gene represented by SEQ ID NO: 2 or , It may include a nucleotide sequence having a sequence homology of 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the "% of sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing an optimally aligned sequence with a comparison region, and in the comparison region some of the polynucleotide sequences are further referenced to the optimal alignment of the sequence (not including additions or deletions). Additions or deletions (i.e., gaps) can be included compared to).
  • the "BIP gene” is used to transfer the expressed recombinant protein to the endoplasmic reticulum, and when expressed, a part of the sequence may be cut off, leaving only some amino acids.
  • ER signal sequence refers to an amino acid sequence that allows the protein to be recognized by the signal recognition particles on the cytoplasmic reticulum so that the protein is translocated in the ER lumen.
  • the endoplasmic reticulum signal peptide is a plant endoplasmic reticulum signal peptide known to those skilled in the art, its kind and amino acid sequence are not limited, and documents such as US 20130295065 and WO2009158716 can be referred to.
  • the "vesicle signal peptide” is preferably KDEL (SEQ ID NO: 6), HDEL (SEQ ID NO: 7), SEKDEL (SEQ ID NO: 8), KHEDL (SEQ ID NO: 9), KEEL (SEQ ID NO: 10), SEHEDL (SEQ ID NO: Number 11) may be any one polypeptide selected from the group consisting of, most preferably HDEL (His-Asp-Glu-Leu, SEQ ID NO: 7) may be a polypeptide represented by, and is encoded by SEQ ID NO: 4 I can.
  • the gene may include a nucleotide sequence having sequence homology of at least 90%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 98% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the "% of sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing an optimally aligned sequence with a comparison region, and in the comparison region some of the polynucleotide sequences are further referenced to the optimal alignment of the sequence (not including additions or deletions). Additions or deletions (i.e., gaps) can be included compared to).
  • the binding site of the endoplasmic reticulum signal peptide is characterized in that it is added (or linked) to the C-terminus of a protein for expression or synthesis in plant cells.
  • the Fc fragment of the present invention is preferably a pig Fc fragment, more preferably a pig Fc fragment represented by SEQ ID NO: 3, or when fused with a target protein, the expression level and solubility of the target protein is increased. It is not limited thereto as long as it is an Fc fragment.
  • the variant of SEQ ID NO: 3 is included in the scope of the present invention.
  • the gene may include a nucleotide sequence having sequence homology of at least 90%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 98% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the "% of sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing an optimally aligned sequence with a comparison region, and in the comparison region some of the polynucleotide sequences are further referenced to the optimal alignment of the sequence (not including additions or deletions). Additions or deletions (i.e., gaps) can be included compared to).
  • the "cloning site” is a generic term that is inserted for the purpose of linking/dividing each gene in the vector, and preferably the portion represented by'ggatcctg' and'ccccgggca' in SEQ ID NO: 12, 8 of SEQ ID NO: 13 It may be a portion indicated by'RIL, Arg Ile Leu' located at the th to 10 th and "PRA, Pro Arg Ala” located at the 727 th to 729 th, but is not limited thereto.
  • the viral protein may preferably be provided in a form fused with an Fc fragment.
  • the term'fusion' is meant to include both chemical and genetic fusion, and preferably refers to genetic fusion in the present invention.
  • The'genetic fusion' refers to a link formed by a linear covalent bond formed through genetic expression of a DNA sequence encoding a protein.
  • the tag gene is, for example, Avi tag, Calmodulin tag, polyglutamate tag, E tag, FLAG tag, HA tag, His tag, Myc tag, S tag, SBP tag, IgG-Fc tag, CTB tag, Softag 1 tag, Softag 3 tags, Strep tags, TC tags, V5 tags, VSV tags, Xpress tags, and the like may be included, and the IgG-Fc tag may be derived from human, mouse, rabbit, or pig.
  • selection marker genes include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloram.
  • herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloram.
  • Antibiotic resistance genes such as chloramphenicol, aadA genes, etc.
  • the promoters include, for example, pEMU promoter, MAS promoter, histone promoter, Clp promoter, 35S promoter derived from cauliflower mosaic virus, flower 19S RNA promoter derived from cabbage mosaic virus, plant actin protein promoter, ubiquitin protein promoter, CMV (Cytomegalovirus) promoter, SV40 (Simian virus 40) promoter, RSV (Respiratory syncytial virus) promoter, EF-1 ⁇ (Elongation) factor-1 alpha) promoter, etc.
  • the terminator is, for example, nopaline synthase (NOS), rice amylase RAmy1 A terminator, paseolin terminator, and Octopine of Agrobacterium tumafaciens.
  • NOS nopaline synthase
  • rice amylase RAmy1 A terminator rice amylase RAmy1 A terminator
  • paseolin terminator paseolin terminator
  • Octopine of Agrobacterium tumafaciens The terminator of the gene, the rrnB1/B2 terminator of E. coli, and the like, but the above examples are only examples and are not limited thereto.
  • the "vector" may have a cleavage map disclosed in FIG. 1, but is not limited thereto.
  • the "vector” is preferably a gene comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and most preferably consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, but is 80% or more of the sequence of SEQ ID NO: 13, More preferably, it may include an amino acid sequence having a sequence homology of 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the amino acid sequence may be encoded by the gene sequence represented by SEQ ID NO: 12, but is not limited thereto.
  • the gene may include a nucleotide sequence having a sequence homology of 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the "% of sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing an optimally aligned sequence with a comparison region, and in the comparison region some of the polynucleotide sequences are further referenced to the optimal alignment of the sequence (not including additions or deletions). Additions or deletions (i.e., gaps) can be included compared to).
  • transgenic organism refers to the change in the genetic properties of an organism by the injected DNA
  • “transgenic organism” is a molecular genetic method by injecting an external gene.
  • the prepared living organism preferably it is a living organism transformed by the recombinant expression vector of the present invention, and the living organism is not limited as long as it is a living organism such as microorganisms, eukaryotic cells, insects, animals, plants, preferably E. coli, Salmonella, Bacillus, yeast, animal cells, mice, rats, dogs, monkeys, pigs, horses, cows, acrobacterium tumourfaciens, plants, etc., but are not limited thereto.
  • plant may be used without limitation as long as it is a plant capable of mass-producing protein, but more specifically, tobacco, Arabidopsis thaliana, corn, rice, soybean, canola, alfalfa, sunflower, alfalfa, sorghum, wheat, It may be selected from the group consisting of cotton, peanuts, tomatoes, potatoes, lettuce and peppers, preferably tobacco.
  • Tobacco in the present invention is not particularly limited as long as it is a plant of the genus Tobacco (Nicotiana genus) and is capable of overexpressing a protein, and the present invention is carried out by selecting an appropriate variety according to the purpose of the transformation method and mass production of the protein.
  • I can.
  • Nicotiana benthamiana L. or Nicotiana tabacum cv. Varieties such as xanthi can be used.
  • the transformants are transformation, transfection, Agrobacterium-mediated transformation method, particle gun bombardment, sonication, electroporation. ) And PEG (polyethylen glycol)-mediated transformation method, etc., but there is no limitation as long as it is a method capable of injecting the vector of the present invention.
  • solubility means the degree to which a protein or peptide of interest can be dissolved in a solvent suitable for administration to the human body. Specifically, it may indicate the degree of solute saturation for a given solvent at a specific temperature. Solubility can be measured by determining the saturation concentration of the solute, for example, adding an excessive amount of the solute to a solvent, stirring it, filtering it, and then measuring the concentration using a UV spectrometer or HPLC, but is not limited thereto. , High solubility is advantageous for the separation and purification of the recombinant protein, and the aggregation of the recombinant protein is inhibited, thereby maintaining the physiological or pharmacological activity of the recombinant protein.
  • prevention means any action of inhibiting or delaying the onset of swine pandemic diarrhea by administration of the recombinant swine pandemic diarrhea virus protein according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which symptoms of swine epidemic diarrhea are improved or beneficially altered by administration of the protein according to the present invention.
  • “individual” refers to a subject to which the recombinant swine pandemic diarrhea virus protein of the present invention can be administered, and the subject is not limited.
  • the "vaccine composition" of the present invention can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. and sterile injectable solutions according to a conventional method.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. and sterile injectable solutions according to a conventional method.
  • it can be prepared using diluents or excipients such as generally used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and these solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, and sucrose in the lecithin-like emulsifier.
  • compositions for oral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous agents, suspensions, emulsions, and lyophilized formulations.
  • non-aqueous agents propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • the term "immunoantigen adjuvant” generally refers to any substance that increases the body fluid and/or cellular immune response to an antigen. Accordingly, the composition for a vaccine of the present invention may further include an “immune antigen adjuvant”.
  • the immunoantigen adjuvants include, for example, Complete Freund's adjuvant (CFA), Incomplete Freund's adjuvant (IFA), alum, oil, Lipid A, monophosphoryllipid.
  • Bacterial preparations such as A, BCG (Bacillus-Calmette-Guerrin), nucleic acids such as CpG-DNA and dsRNA, bacterial ingredient preparations such as tuberculin, natural polymer substances such as keyhole limpet hemocyanin or yeast mannan, muramyl tripeptide or Muramyl dipeptide or derivatives thereof, alum, nonionic block copolymer, interleukin 2 (IL-2) or granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) and cytokines such as interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), and the like.
  • IL-2 interleukin 2
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • cytokines such as interferon- ⁇ (IFN- ⁇ )
  • IMS1313 oil adjuvant was used in an embodiment of the present invention. .
  • the vaccine composition or pharmaceutical composition of the present invention is formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions according to a conventional method. Can be used.
  • the route of administration of the vaccine composition according to the present invention is not limited thereto, but oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, Includes sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral as used herein includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the vaccine composition of the present invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the dosage of the vaccine composition or pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of the age, weight, sex, and physical condition of the individual.
  • the amount required to induce an immunoprotective response in an individual without significant side effects may vary depending on the presence of recombinant proteins and excipients used as immunogens.
  • each dose contains 0.1 to 1000 ⁇ g of protein, preferably 0.1 to 100 ⁇ g, per ml of the sterile solution of the recombinant protein of the present invention.
  • the initial dose may be followed by randomly repeated antigen stimulation.
  • the "feed composition” is a feed containing the recombinant swine pandemic diarrhea virus S1 protein of the present invention, and the feed includes by-products such as pork, beef, and chicken, corn, rice, general rice straw, wild grass , Grasses, ancy ridges, hay, wild grasses, etc., but are not limited thereto, and there is no limitation as long as feed is used for raising livestock.
  • Methods of adding and mixing the recombinant swine epidemic diarrhea virus S1 protein of the present invention to such feed include methods such as mechanical mixing, adsorption, and occlusion, but are not limited thereto.
  • Example 1 Recombinant porcine epidemic diarrhea virus S1 protein (PEDV-S1) plant expression vector preparation
  • a recombinant plant expression vector was constructed to express the swine pandemic diarrhea virus S1 protein in the plant.
  • the genetic information for the swine pandemic diarrhea virus S1 protein was obtained, and a gene (SEQ ID NO: 1) was synthesized with a sequence optimized for expression in Nicotiana benthamiana.
  • a polynucleotide encoding a biP (chaperone binding protein) signal peptide (SEQ ID NO: 2), a polynucleotide encoding a swine pandemic diarrhea virus S1 protein (SEQ ID NO: 1), a polynucleotide encoding pFc2 (SEQ ID NO: 3), a porcine immunoglobulin Fc fragment (pFc), and a polynucleotide encoding a HDEL (His-Asp-Glu-Leu) peptide (SEQ ID NO: Number 4) was connected in order to prepare a porcine epidemic diarrhea virus S1 protein plant expression vector.
  • the plant expression vector prepared in Example 1 above was transformed into Agrobacteria strain LBA4404 using an electric shock method (Electroporation).
  • Transformed Agrobacteria were 5 ml of YEP (Yeast Extract Peptone) liquid medium (yeast extract 10 g, peptone 10 g, NaCl 5 g, kanamycin 50 mg/L, rifampicin 25 mg/L) at 28°C for 16 hours During shaking culture, 1 ml of the primary culture was inoculated into 50 ml of new YEP medium, followed by shaking culture at 28° C. for 6 hours. The cultured Agrobacteria were collected by centrifugation (7,000 rpm, 4° C.
  • Agro-infiltration was performed by injecting the Agrobacteria suspension onto the back side of Nicotiana ventamiana leaves using a syringe from which the injection needle was removed.
  • the protein in the aqueous fraction (S) contained in the solution and the protein in the pellet (P) fraction were confirmed by Western blotting. .
  • 30 ⁇ L of each fraction was mixed with the SDS sample buffer and then heated.
  • proteins were separated by size by electrophoresis on a 10% SDS-PAGE gel, and the separated proteins were transferred to a PVDF membrane, and after a blocking step using 5% skim milk, pFc2 was recognized.
  • Anti-pig secondary antibody was combined, and the ECL solution was treated according to the method provided by the manufacturer to confirm the expression of the recombinant swine pandemic diarrhea virus S1 protein. The results are shown in FIG. 2.
  • the vector for expression of the recombinant swine pandemic diarrhea virus S1 protein of the present invention can effectively express the recombinant swine pandemic diarrhea virus S1 protein in plants, and the recombinant swine pandemic diarrhea virus S1 protein prepared using the vector is Since it has high solubility, it is easy to separate and purify, and it was confirmed that it is effective in maintaining the physiological or pharmacological activity of the recombinant protein by inhibiting aggregation of the recombinant protein.
  • Example 3 Isolation and purification of recombinant porcine epidemic diarrhea virus S1 protein
  • the elution solution containing the recombinant protein was replaced with a physiological saline (PBS) solution using a filter having a size of 30 kD and concentrated to obtain an isolated and purified recombinant swine pandemic diarrhea virus protein.
  • PBS physiological saline
  • the separated and purified protein was confirmed by protein electrophoresis (SDS-PAGE) and coomassie staining. (Fig. 3)
  • the recombinant protein of the present invention was well purified without significant difference from the existing protein.
  • the antibody in the blood formed by administration of the recombinant antigen protein to the serum prepared in Example 4 above has the ability to neutralize the swine pandemic diarrhea virus.
  • PEDV QIAP1401 strain virus and Vero cells were used as infection hosts.
  • the serum of the collected blood was separated, immobilized at 57°C for 30 minutes, and then binary diluted with MEM (Minimum Essential Media Eagle) medium containing 10 ug/ml of trypsin.
  • An equal amount of 316 TCID 50 /0.1 ml of PEDV virus was mixed with each diluted serum and neutralized at 37°C for 90 minutes.
  • Vero cells prepared as a monolayer in a 96 well plate were washed three times with PBS, and then 100 ⁇ l of a serum-virus mixture was added, followed by incubation at 37°C for 2 hours. After the cultivation was completed, 100 ⁇ l of the medium to which 2 ⁇ g/ml of trypsin was added was added, followed by incubation at 37° C. for 3 to 5 days until the cytopathic effect (CPE) appeared.
  • CPE cytopathic effect
  • the average neutralizing antibody value by the recombinant PEDV-S1 antigen protein was 16.0 (Log2), and the neutralizing antibody value by the commercially available vaccine was 7.2 (Log2), indicating that the neutralizing antibody by the recombinant PEDV-S1 antigen protein was higher.
  • the recombinant porcine epidemic diarrhea virus S1 protein of the present invention is not only effectively expressed in plants, but also has high water solubility, so it is easy to separate and purify, and also acts as an antigen in the body, resulting in high immunogenicity and virus. Since it exhibits neutralizing ability, it could be confirmed that it can be used as a vaccine composition for a novel swine pandemic diarrhea.
  • Recombinant swine pandemic diarrhea virus S1 protein 20 mg Lactose 100 mg Talc 10 mg
  • the above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional tablet preparation method.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare a capsule.
  • Recombinant swine pandemic diarrhea virus S1 protein 100 mg Vitamin E 0.7 mg L-carnitine 0.7 mg
  • Feed is prepared by mixing the ingredients according to a conventional feed manufacturing method.
  • the recombinant porcine epidemic diarrhea virus S1 protein of the present invention is not only effectively expressed in plants, but also has high water solubility, it is easy to separate and purify, and also acts as an antigen in the body to show high immunogenicity and virus neutralization ability. It is expected to be widely used in various fields. In addition, since it exhibits remarkable immunogenicity and virus neutralizing ability in the body, it is expected to be used as a novel swine pandemic diarrhea vaccine composition, and thus has industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질, 이를 포함하는 백신 조성물 등에 관한 것이다.

Description

돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물 및 이의 제조 방법
본 발명은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물 등에 관한 것이다.
본 출원은 2019년 4월 16일에 출원된 한국특허출원 제10-2019-0044008호 에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
돼지 유행성 설사병 바이러스 (PED, Porcine epidemic diarrhea)는 치명적이고 전염성이 높은 돼지 장 질환으로서, 급성 설사/구토 및 탈수를 특징으로 하며, 신생 자돈에서 높은 치사율을 초래한다. 상기 질병은 1971년 영국에서 최초 보고되었고, 유럽 전역으로 급속히 퍼져 나갔으며, 1980년대에 아시아 대륙으로 건너온 것으로 추정된다. 1978년에 초기에 CV777로 명명된 코로나바이러스-유사체를 벨기에에서 원인 병원체로서 동정한 바 있다.
이러한 PED를 예방하기 위해 보다 안전하고 경제적이며, 질병 발생시, 보다 신속하게 대응할 수 있는 전략으로 아단위 백신(Subunit vaccine) 개발의 필요성이 대두되고 있다. 아단위 백신은 병원성 미생물을 구성하고 있는 항원성이 알려진 구조 또는 비구조 단백질을 재조합 미생물에서(대장균 또는 타 발현 시스템) 대량 생산하여 백신의 항원 단백질로 사용하는 것을 말한다.
국내에서는 대부분 약독화 PED 생백신을 사용하고 있지만, 이러한 백신의 가장 큰 문제점은 약독화 되었더라도 바이러스가 살아 있기에 독성이 회복되면서 병원성을 띠게 되므로 안전성에 문제가 발생할 수 있다. 또한 백신을 개발함에 있어서 약독화하는 단계로 동물세포에서 100회 계대배양을 하게 되는데 비교적 긴 시간이 소요되므로 변이 속도가 빠른 바이러스에 대한 신속한 대응이 어려우며 동물세포배양을 이용하기에 백신개발 비용 또한 비교적 높은 편이다.
한편, 이러한 질병을 예방하기 위한 백신들은 단백질의 접힘(folding), 당화과정(glycosylation) 등의 문제로 인하여 박테리아를 이용하지 못하고, 주로 동물 세포를 이용하여 생산되고 있다. 그러나 동물 세포를 이용한 백신 생산 방법은 대량 생산을 위한 설비 확충에 큰 비용이 소요되기 때문에 제조가 용이하지 않고, 백신의 가격이 고가인 경우가 대부분이다. 또한, 동물 세포를 이용하여 제조된 비활성 바이러스 백신들은 저장이 용이하지 않을 뿐만 아니라, 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 높다는 단점을 가지고 있다. 그러나 식물의 경우에는 동물 세포와 달리 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 매우 낮고, 경작 면적만 확보되면 언제든지 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라, 식물체를 통하여 장기 보관이 가능하기 때문에, 안정적으로 저렴한 백신의 생산이 가능할 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로, 식물체를 이용하여 효율적인 생산이 가능할 뿐만 아니라, 높은 면역원성 및 바이러스 중화능을 나타내는 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질, 이를 포함하는 백신 조성물, 상기 단백질의 제조 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물을 제공한다. 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 기능성 동등물도 본 발명의 권리범위에 포함되며, 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 아미노산 서열과 적어도 60 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로서, 상기 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미하며, 식물체를 이용하여 안정적으로 생산될 수 있는 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질의 아미노산 서열이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질을 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질을 개체에 투여함으로써 돼지 유행성 설사병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질의 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질의 돼지 유행성 설사병 백신 또는 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질 발현용 벡터를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 벡터는 프로모터 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 순서로 작동가능하도록 순차적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 벡터는 도 1에 기재된 개열지도를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 벡터는 소포체 신호 펩타이드, Fc 단편 및 BiP(Chaperone binding protein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 소포체 신호 펩타이드는 KDEL, HDEL, SEKDEL, KHEDL, KEEL, 및 SEHEDL 로 표시되는 펩타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 등이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 BiP(Chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 유전자, 돼지의 면역글로불린 Fc 단편을 코딩하는 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함 하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질의 생산 방법을 제공한다. 상기 형질전환체는 바람직하게는 세포 자체, 식물체, 또는 세포를 포함하는 배양물일 수 있으며, 상기 배양액은 바람직하게는 세포를 배양한 후, 세포를 제거한 배양액일 수 있으나, 본 발명의 재조합 항원을 포함하고 있다면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 단계 (b)의 정제는 수용성 분획을 사용하여 정제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 수용해성을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, 체내에서 항원으로 작용하여 높은 면역원성 및 바이러스 중화능을 나타내므로 다양한 분야에 폭넓게 사용가능할 것으로 기대된다. 또한, 체내에서 현저한 면역원성 및 바이러스 중화능을 나타내므로 신규한 돼지 유행성 설사병 백신 조성물로 사용가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 (PEDV-S1)의 발현을 위한 유전자의 배열을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질의 분리 정제 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 항원을 2 회 투여하고 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질 유전자를 이용하면, 식물체에서도 높은 면역원성을 가지는 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질을 효율적으로 생산 및 분리가 가능하다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질은 안정적이고 효율적인 대량 생산이 가능하기 때문에, 저렴하며 안정적인 돼지 유행성 설사병 백신을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
본 명세서에 있어서, "항원(antigen)"이란 체내에서 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 바이러스, 화합물질, 세균, 꽃가루, 암세포, 새우 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질이나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "돼지 유행성 설사병 (PED, porcine epidemic diarrhea) 바이러스"는 코로나바이러스과(coronaviridae)에 속하며 단일 가닥 RNA를 게놈(genome)으로 가지며 길이는 약 28Kb이고, 3개의 주요 구성 단백질인 spike 단백질) 막단백질 또는 외피 단백질 그리고 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하고 있다. 본 발명에서 용어, "스파이크(Spike) 단백질"은 PED 바이러스의 주요 구성 단백질로서, 목표 세포를 인식하고 바이러스와 세포막(cellular membrane)를 융합시키는 생물학적으로 중요한 기능을 가지고 있다. 스파이크(Spike) 단백질의 일부 유전자를 약독화 항원결정기(neutrali zation epitope)로 이용할 수 있으며, 성숙 과정에서 스파이크 단백질은 종종 수용체 결합 서브 유닛 S1과 막 결합 서브 유닛 S2로 절단된다. 특히 S 단백질의 S1 도메인은 세포 수용체에 특이적인 결합을 매개하는 수용체 결합 도메인(receptor binding domain: RBD)을 포함하고 있다.
본 명세서에 있어서, "백신(vaccine)"이란 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "발현용 벡터(expression vector)"란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 돼지의 Fc 단편이 융합된 목적 항원(본 발명에서는, 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질)을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, "복제 단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 단백질의 합성량을 증가시키기 위한 M17의 5' UTR 부위 유전자, 목적 단백질을 소포체로 이동시키기 위한 BiP 유전자, 목적 단백질의 발현량 및 용해성을 증가시키는 Fc 단편, 단백질이 소포체 내에서 안정적으로 유지될 수 있도록 단백질의 분해를 최소화하기 위한 소포체 신호 펩타이드(endoplasmic reticulum signal peptide, 소포체 표적화 서열과 같은 의미) 유전자, 클로닝사이트(cloning site) 등을 추가로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 재조합 단백질을 용이하게 분리하기 위한 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 "돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질"은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하며, 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시된다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질은 높은 용해성(solubility)을 가지고 있기 때문에, 분리정제가 용이하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 효과적이다.
또한, 본 발명의 단백질은 서열번호 1로 표시되는 유전자 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 상기 유전자 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 "BiP 유전자"는 발현된 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용되었던 BiP 서열 중 일부로서, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 유전자이고 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 유전자이나, 서열번호 2의 염기서열과 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 더 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 "BIP 유전자"는 발현 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용되는 것으로, 발현될 때 서열 일부가 잘려나가 일부 아미노산만이 남을 수도 있다.
상기 "소포체 신호 펩타이드"(ER 신호 서열)는 세포질 세망 상의 신호 인식 입자에 의해 단백질이 인식되는 것을 허용하여 단백질이 ER 내강 내에 전위되게 하는 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명에서 상기 소포체 신호 펩타이드는 당업자에게 알려진 식물 소포체 신호 펩타이드라면 그 종류 및 아미노산 서열이 제한되지 않으며, 예를 들어 US 20130295065, WO2009158716 등의 문헌을 참고로 할 수 있다. 본 발명에서 상기 "소포체 신호 펩타이드"는 바람직하게 KDEL(서열번호 6), HDEL(서열번호 7), SEKDEL(서열번호 8), KHEDL(서열번호 9), KEEL(서열번호 10), SEHEDL(서열번호 11) 로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 폴리펩타이드일 수 있으며, 가장 바람직하게 HDEL(His-Asp-Glu-Leu, 서열번호 7) 로 표시되는 폴리펩타이드일 수 있으며, 서열번호 4로 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 소포체 신호 펩타이드는 서열번호 4의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열과 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상, 가장 바람직하게는 98 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 더 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 소포체 신호 펩타이드의 결합 위치는 식물세포 내에서 발현 또는 합성을 목적으로 하는 단백질의 C-말단에 추가(또는 연결)되는 것을 특징으로 한다.
상기 "Fc 단편(Fc fragment)"이란 면역글로불린이 파파인(papain)에 의해 소화되었을 때, 중쇄(heavy chain; H chain) 부분만이 S-S 결합으로 연결되고, 항원 결합부위를 가지지 않는 부분을 Fc 단편이라고 하며, 본 발명의 Fc 단편은 바람직하게는 돼지의 Fc 단편이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3로 표시되는 돼지의 Fc 단편이나, 목적 단백질과 융합되었을 때, 목적 단백질의 발현량 및 용해성을 증가시키는 Fc 단편이라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 Fc 단편은 서열번호 3의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열과 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상, 가장 바람직하게는 98 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 더 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 "클로닝 사이트"란 벡터 내에서 각 유전자를 연결/구분하는 것을 목적으로 삽입된 것을 총칭하며, 바람직하게는 서열번호 12 내에서 'ggatcctg', 'ccccgggca'로 표시되는 부분, 서열번호 13의 8번째 내지 10번째에 위치하는 'RIL, Arg Ile Leu', 727번째 내지 729번째에 위치하는'PRA, Pro Arg Ala'로 표시되는 부분일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 바이러스 단백질은 바람직하게 Fc 단편과 융합(fusion)된 형태로 제공 될 수 있다. 상기 용어 '융합(fusion)'은 화학적 또는 유전적 융합을 모두 포함하는 의미로, 본 발명에서는 바람직하게 유전적 융합을 지칭한다. 상기 '유전적 융합'이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형(linear)의 공유결합으로 이루어진 연결(link)을 의미한다.
상기 태그용 유전자는 일례로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있으며, 상기 IgG-Fc 태그는 인간, 쥐, 토끼 또는 돼지로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 선별용 마커 유전자에는 일례로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 일례로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 일례로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이나, 상기 예는 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 상기 "벡터"는 도 1에 개시된 개열지도를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서, 상기 "벡터"는 바람직하게는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 유전자이고 가장 바람직하게는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지나, 서열번호 13의 서열과 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 아미노산 서열은 서열번호 12로 표시되는 유전자 서열로 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 12의 염기서열과 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상, 가장 바람직하게는 98 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 더 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “형질전환(transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, "형질전환체(transgenic organism)"란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아크로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, "식물"은 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 구체적으로는 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 Nicotiana benthamiana L. 나 Nicotiana tabacum cv. xanthi 등의 품종을 이용할 수 있다.
상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기충격법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, "용해성(solubility)"이란 목적 단백질 또는 펩타이드가 인체에 투여하기 적합한 용매에 용해될 수 있는 정도를 의미한다. 구체적으로는 특정 온도에서 주어진 용매에 대하여 용질이 포화된 정도를 나타내는 것일 수 있다. 용해성은 용질의 포화 농도를 결정함으로써 측정할 수 있으며, 예컨대 용매에 용질을 과량으로 첨가하고 이를 교반하고 여과한 다음, 농도를 UV 분광기 또는 HPLC 등을 사용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 높은 용해성은 재조합 단백질의 분리정제에 유리하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 장점을 가진다.
본 명세서에 있어서, "예방(prevention)"이란 본 발명에 따른 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질의 투여에 의해 돼지 유행성 설사병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, "치료(treatment)"란 본 발명에 따른 단백질의 투여에 의해 돼지 유행성 설사병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, "개체(individual)"란 본 발명의 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.
본 발명의 "백신 조성물"은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서, "면역항원보강제(adjuvant)"란 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭한다. 이에, 본 발명의 백신용 조성물은 "면역항원보강제(adjuvant)"를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역항원보강제로는 예를 들어, 완전 프로인트 아쥬반트로 (Complete Freund's adjuvant, CFA), 불완전 프로인트 아쥬반트로 (Incomplete Freund's adjuvant, IFA), 명반, 오일, Lipid A, 모노포스포릴리피드 A, BCG (Bacillus-Calmette-Guerrin) 등의 세균 제제, CpG-DNA, dsRNA 등의 핵산, 투베르쿨린 등의 세균 성분 제제, 키홀 림펫 헤모시아닌이나 효모 만난 등의 천연 고분자 물질, 무라밀 트리펩티드 또는 무라밀 디펩티드 또는 그들의 유도체, 명반 (alum), 비이온성 블록 코폴리머, 인터류킨 2 (IL-2) 나 과립구 마크로파지콜로니 자극인자 (Granulocyte Macrophage colony stimulating Factor, GM-CSF), 인터페론-α (IFN-α), 인터페론-β (IFN-β) 등의 사이토카인 등을 들 수 있고, 이들의 1 종 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 IMS1313 오일 아쥬반트를 사용하였다.
본 발명의 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 재조합 단백질의 멸균용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000 ㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎍을 함유한다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "사료 조성물"은 본 발명의 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질을 포함하는 사료로서, 상기 사료로는 돼지고기, 소고기, 닭고기 등의 부산물을 비롯하여, 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시 리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료라면 제한이 없다. 이러한 사료에 본 발명의 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질을 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 (PEDV-S1) 식물 발현 벡터 제조
도 1과 같이 식물체에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질을 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물 발현 벡터를 제작하였다. 보다 자세하게는, 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질에 대한 유전자 정보를 확보하고, 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana)에서의 발현에 최적화된 서열로 유전자(서열번호 1)를 합성하였다. pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 BiP(chaperone binding protein) 신호 펩타이드 (signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2), 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 1), 돼지의 면역글로불린 Fc 단편(porcine Fc fragment; pFc)인 pFc2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 3) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4)를 순서대로 연결하여 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 식물 발현 벡터를 제작하였다.
실시예 2: 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질의 발현 획인
2.1. 식물 발현 벡터 일과성 발현(transient expression)
상기의 실시예 1에서 준비한 식물 발현 벡터를 아그로박테리아 균주 LBA4404에 전기충격법 (Electroporation)을 이용하여 형질전환 시켰다. 형질 전환된 아그로박테리아를 5ml의 YEP(Yeast Extract Peptone) 액체 배지 (효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25 mg/L)에서 28 ℃의 조건에서 16시간 동안 진탕배양 한 후 1차 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지에 접종하여 28 ℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양 하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리아는 원심분리 (7,000 rpm, 4 ℃ 5분)하여 수집한 후, 인필트레이션 (Infiltration) 버퍼 (10 mM MES (pH 5.7), 10 mM MgCl 2, 200 μM 아세토시링곤)에 600 nm의 파장에서 O.D. 1.0의 농도로 다시 현탁시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사 바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션 (Agro-infiltration)을 수행하였다.
2.2. 식물체에서 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질의 발현 획인
상기의 실시예 2.1에서 준비한 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 용액에 포함되어 있는 수용성 분획(S)에 있는 단백질과 펠릿(pellet; P) 분획에 있는 단백질을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 보다 자세하게는, 각 분획 30 μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10 % SDS-PAGE 겔에 전기영동하여 크기별로 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5 % 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 후에, pFc2를 인식하는 anti-pig secondary antibody를 결합시키고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 발현된 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질의 대부분이 수용성 분획에 존재함을 확인하였다.
상기 결과를 통하여, 본 발명의 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 발현용 벡터는 식물체에서 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있으며, 상기 벡터를 이용하여 제조된 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질은 높은 용해성(solubility)을 가지고 있기 때문에, 분리정제가 용이하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질의 분리 정제
상기의 실시예 2.1에서 준비한 니코티아나 벤타미아 40g에 단백질 추출 용액 (50 mM Tris (pH 7.2), 150 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1X 단백질가수분해효소 억제제 (protease inhibitor)) 200 mL을 첨가하고 블랜더로 조직을 파쇄한 후 13,000 rpm에서 20분간 4 ℃에서 원심분리하여 단백질 추출액을 회수하였다. 발현된 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질의 분리 정제를 위해 protein A-sepharose 레진이 충진된 컬럼으로 친화크로마토그래피를 실시하였다. 컬럼에 레진을 5 mL 충진한 후 세척 용액 (50 mM Tris (pH 7.2), 150 mM NaCl) 50 mL로 평형화 시켰다. 회수한 단백질 추출액을 컬럼에 적용한 후 세척 용액 100 mL을 흘려 보내 레진을 세척하고 용출 용액 (0.1 M sodium citrate (pH 3.0), 150 mM NaCl)으로 재조합 단백질을 용출하고 중화용액 (1 M Tris (pH 9.0))을 첨가하여 단백질 용출액을 중화시켰다. 재조합 단백질이 포함된 용출 용액은 30 kD 크기의 필터를 사용하여 생리식염수 (PBS) 용액으로 교체 및 농축을 실시하여 분리 정제된 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질을 획득하였다. 분리 정제된 단백질은 단백질 전기영동 (SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색법 (coomassie staining)을 통해 확인하였다. (도 3)
도 3에 나타난 바와 같이, 약 120 Kd 크기를 가진 재조합 단백질이 정제된 것을 확인하였다.
본 발명의 재조합 단백질은 기존의 단백질과의 큰 차이 없이 잘 정제되었다. 이러한 결과는 단백질을 식물에서 발현시키는 경우 당구조가 변이되어 생산 효율이 떨어질 수 있는 문제점이 발견되지 않았음을 확인한 것으로, 본 발명에 따른 단백질이 식물에서 잘 생산되는 것을 확인한 결과이다.
실시예 4: 식물발현 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질의 면역원성 확인
재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 항원이 생체 내에서 항체를 유도하여 면역원성을 가지는지 확인하기 위하여, 각 그룹당 5마리씩의 6 주령의 암컷 기니피그를 이용하여 실험을 진행하였다. 보다 자세하게는, 음성대조군은 생리식염수를 투여하였고 양성대조군은 시중에 시판중인 돼지 유행성 설사병 백신(중앙백신)을 투여하였으며 실험군은 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질을 1회당 150 ㎍씩 3주 간격으로 2회 피하로 투여하였다. 항원 투여시에는 동량의 IMS1313 adjuvant(SEPPIC)를 섞어 주사하였다. 혈액은 항원 투여전과 2차 투여후 2주차 후에 경정맥 또는 심장에서 채취 후 혈청을 분리하여 -20℃에 냉동 보관하였다. 각 혈청에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질에 대한 특이항체의 생성는 His tag이 융합된 PEDV-S1 재조합 단백질이 코팅된 엘라이자(ELISA) 플레이트를 이용하여 확인하였으며 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 항원비투여군의 혈청에서는 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질에 대한 반응성이 전혀 관찰되지 않았으나 시판백신 또는 재조합 항원 단백질을 2 회 투여한 군의 혈청에서는 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질에 대해 반응성을 나타내는 것을 확인하였으며 시판 백신 투여군에 비해 재조합 항원 단백질을 투여한 군이 상대적으로 더 높은 특이항체 생성률을 보이는 것을 확인하였다.
실시예 5: 혈중 중화항체가 확인
상기의 실시예 4에서 준비한 혈청으로 재조합 항원 단백질의 투여로 형성된 혈중 항체가 돼지 유행성 설사병 바이러스 중화능을 가지는지 확인하였다. 보다 자세하게는, 중화항체 시험에는 PEDV QIAP1401 strain 바이러스와 Vero cell을 감염숙주로 사용하였다. 채혈된 혈액의 혈청을 분리하여 57℃에서 30분간 비동화한 후 10ug/ml의 trypsin이 함유된 MEM(Minimum Essential Media Eagle) 배지로 2진 희석하였다. 각 희석 혈청에 316 TCID 50/0.1ml의 PEDV 바이러스를 동량 혼합하여 37℃에서 90분간 중화시켰다. 배양이 끝나기 직전 96 well plate에 monolayer 상태로 준비한 Vero cell을 PBS로 3회 세척 후, 혈청-바이러스 혼합액 100㎕ 첨가 후 37℃에서 2시간 배양하였다. 배양이 끝난 다음 2㎍/ml의 트립신이 첨가된 배지를 100㎕ 첨가 후, 37℃에서 세포변성효과 (CPE)가 나타날 때까지 3일~5일간 배양하였다. 중화항체 역가는 CPE 나타나기 직전 well의 혈청 희석배수를 현미경 하에서 관찰하여 측정하였다(표 1).
그 결과, 재조합 PEDV-S1 항원 단백질에 의한 중화항체가가 평균 16.0 (Log2), 시판백신에 의한 중화항체가는 7.2 (Log2)로 재조합 PEDV-S1 항원 단백질에 의한 중화항체가 형성이 더 높음을 알 수 있었다.
투여 항원 개체번호 중화항체가
생리식염수 1 < 4
2 < 4
3 < 4
4 < 4
5 < 4
시판백신 6 8
7 4
8 8
9 8
10 8
PEDV-S1:pFc2 11 16
12 16
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 수용해성을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, 체내에서 항원으로 작용하여 높은 면역원성 및 바이러스 중화능을 나타내므로 신규한 돼지 유행성 설사병의 백신 조성물로 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
이하 본 발명의 약학적 조성물 및 사료 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 조성물의 제조
1.1. 산제의 제조
재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1.2. 정제의 제조
재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1.3. 캡슐제의 제조
재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1.4. 주사제의 제조
재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2,974 mg
Na 2HPO 42H 2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1.5. 액제의 제조
재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적정량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음, 정제수를 가하여 전체를 100 mL로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 2. 사료 조성물의 제조
재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질 100 mg
비타민 E 0.7 mg
L-카르니틴 0.7 mg
통상의 사료 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하여 사료를 제조한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 S1 단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 수용해성을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 또한, 체내에서 항원으로 작용하여 높은 면역원성 및 바이러스 중화능을 나타내므로 다양한 분야에 폭넓게 사용가능할 것으로 기대된다. 또한, 체내에서 현저한 면역원성 및 바이러스 중화능을 나타내므로 신규한 돼지 유행성 설사병 백신 조성물로 사용가능할 것으로 기대되는 바, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (13)

  1. 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물.
  2. 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질을 유효성분으로 포함하는, 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료용 사료 조성물.
  3. 제1항의 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 돼지 유행성 설사병을 예방 또는 치료하는 방법.
  4. 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질 발현용 벡터.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 벡터는 도 1에 기재된 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 벡터는 소포체 신호 펩타이드, Fc 단편 및 BiP(Chaperone binding protein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 소포체 신호 펩타이드는 KDEL, HDEL, SEKDEL, KHEDL, KEEL, 및 SEHEDL 로 표시되는 펩타이드 서열로 이루어진 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는, 벡터
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환된, 형질전환체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 형질전환체는 식물인 것을 특징으로 하는, 형질전환체.
  10. (a) 제8항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 정제는 수용성 분획을 사용하여 정제하는 것을 특징으로 하는, 단백질의 생산 방법.
  12. 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 돼지 유행성 설사병 예방 또는 치료 용도.
  13. 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 단백질의 돼지 유행성 설사병 백신 또는 약제의 제조를 위한 용도.
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EP20790761.9A EP3957323A4 (en) 2019-04-16 2020-04-13 VACCINE COMPOSITION AGAINST PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA (PED) VIRUS AND METHOD OF PRODUCTION THEREOF
CN202080017262.2A CN113490508B (zh) 2019-04-16 2020-04-13 猪流行性腹泻(ped)病毒疫苗组合物及其制备方法
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102209198B1 (ko) * 2019-04-02 2021-02-02 주식회사 바이오앱 식물에서의 발현이 최적화된 재조합 이리신 유전자 및 이를 이용한 재조합 이리신 단백질의 생산 방법
CN116217714B (zh) * 2022-10-14 2024-03-15 华中农业大学 一种全猪源pedv单克隆抗体及其抗原表位

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070045817A (ko) * 2005-10-28 2007-05-02 한국생명공학연구원 돼지 유행성 설사병 예방용 항원 단백질을 발현하는형질전환 식물체 및 이의 제조방법
WO2009158716A1 (en) 2008-06-28 2009-12-30 The Donald Danforth Plant Science Center Improved protein production and storage in plants
US20130295065A1 (en) 2011-01-20 2013-11-07 Protalix Ltd. Nucleic acid construct for expression of alpha-galactosidase in plants and plant cells
KR101339703B1 (ko) * 2012-07-23 2013-12-11 전북대학교산학협력단 식물을 이용한 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 (ｐｅｄｖ) 백신의 제조 방법 및 그에 따른 ｐｅｄｖ 백신
WO2016130838A1 (en) * 2015-02-11 2016-08-18 New York Blood Center, Inc. Porcine epidemic diarrhea virus immunogenic compositions
WO2018213912A1 (en) * 2017-05-25 2018-11-29 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Porcine epidemic diarrhea virus-like particles
KR20190044008A (ko) 2017-10-19 2019-04-29 도쿄엘렉트론가부시키가이샤 기판 처리 장치, 기판 처리 방법 및 프로그램

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW393860B (en) * 1997-06-09 2000-06-11 Sony Corp Receiving device and receiving method
KR20120066555A (ko) 2010-12-14 2012-06-22 단국대학교 산학협력단 돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 ｐｅｄｖ 백신 조성물
WO2016130569A1 (en) * 2015-02-09 2016-08-18 Mj Biologics, Inc. A composition comprising pedv antigens and methods for making and using the composition
AU2015241107B2 (en) * 2014-04-03 2019-10-03 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Porcine epidemic diarrhea virus vaccine
KR101570453B1 (ko) * 2014-05-22 2015-11-20 경북대학교 산학협력단 돼지 유행성 설사 바이러스의 재조합 스파이크 1 단백질을 발현하는 재조합 세포
JO3701B1 (ar) 2014-05-23 2021-01-31 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي
KR101757331B1 (ko) * 2014-12-19 2017-07-12 경북대학교 산학협력단 신규한 돼지 유행성설사 바이러스 및 그의 이용
KR101732624B1 (ko) * 2014-12-22 2017-05-08 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) 식물 유래의 돼지 열병 백신용 조성물 및 이의 제조방법
CA2977980C (en) * 2015-02-27 2022-04-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Porcine epidemic diarrhea virus strains and immunogenic compositions therefrom
US10344293B2 (en) * 2016-05-12 2019-07-09 Bio Applications Inc. Vaccine composition for classical swine fever from plant and manufacturing method thereof
WO2018135860A1 (ko) * 2017-01-17 2018-07-26 포항공과대학교 산학협력단 식물 세포에서의 목적 단백질 발현을 위한 재조합 벡터
JP2020506915A (ja) * 2017-01-30 2020-03-05 ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド ブタコロナウイルスワクチン
KR101848082B1 (ko) * 2017-05-11 2018-04-12 주식회사 바이오앱 셀룰로오즈 결합 도메인을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 사용하여 단백질을 분리정제하는 방법
CN107664697B (zh) * 2017-08-16 2020-02-07 浙江大学 表达载体及其制备方法、pedv-s1蛋白及包含该蛋白的间接elisa检测试剂盒
CN109456412B (zh) * 2018-04-10 2019-09-03 扬州优邦生物药品有限公司 一种猪流行性腹泻病毒基因工程疫苗及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070045817A (ko) * 2005-10-28 2007-05-02 한국생명공학연구원 돼지 유행성 설사병 예방용 항원 단백질을 발현하는형질전환 식물체 및 이의 제조방법
WO2009158716A1 (en) 2008-06-28 2009-12-30 The Donald Danforth Plant Science Center Improved protein production and storage in plants
US20130295065A1 (en) 2011-01-20 2013-11-07 Protalix Ltd. Nucleic acid construct for expression of alpha-galactosidase in plants and plant cells
KR101339703B1 (ko) * 2012-07-23 2013-12-11 전북대학교산학협력단 식물을 이용한 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 (ｐｅｄｖ) 백신의 제조 방법 및 그에 따른 ｐｅｄｖ 백신
WO2016130838A1 (en) * 2015-02-11 2016-08-18 New York Blood Center, Inc. Porcine epidemic diarrhea virus immunogenic compositions
WO2018213912A1 (en) * 2017-05-25 2018-11-29 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Porcine epidemic diarrhea virus-like particles
KR20190044008A (ko) 2017-10-19 2019-04-29 도쿄엘렉트론가부시키가이샤 기판 처리 장치, 기판 처리 방법 및 프로그램

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE PROTEIN NCBI; 17 May 2014 (2014-05-17), ANONYMOUS: "Spike protein [Porcine epidemic diarrhea vims", XP055751640, Database accession no. AHZ45711 *

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KR20200121447A (ko) 2020-10-26
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KR102213745B1 (ko) 2021-02-09
EP3957323A4 (en) 2023-02-15
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JP2022522743A (ja) 2022-04-20

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