KR101339703B1 - 식물을 이용한 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 (ｐｅｄｖ) 백신의 제조 방법 및 그에 따른 ｐｅｄｖ 백신 - Google Patents

식물을 이용한 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 (ｐｅｄｖ) 백신의 제조 방법 및 그에 따른 ｐｅｄｖ 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 중화 결정기 부위 (CO-26K equivalent, COE)를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 유전자 sCOE - Co1, 상기 sCOE-Co1 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 sCOE - Co1 융합 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체에서 sCOE-Co1 융합 단백질을 대량 생산하는 방법, 상기 sCOE - Co1 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하여 sCOE-Co1 융합 단백질을 대량 생산하는 식물체의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 sCOE-Co1 융합 단백질을 대량 생산하는 식물체 및 이의 종자, 상기 sCOE - Co1 융합 유전자를 포함하는 식물체의 sCOE-Co1 융합 단백질 대량 생산용 조성물 및 상기 방법에 의해 제조된 단백질 또는 상기 식물체를 유효성분으로 포함하는 PEDV 백신 조성물을 제공한다.

Description

식물을 이용한 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 (ＰＥＤＶ) 백신의 제조 방법 및 그에 따른 ＰＥＤＶ 백신 {Method for preparing recombinant porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) vaccine using plant and the PEDV vaccine thereof}
본 발명은 식물을 이용한 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV) 백신의 제조 방법 및 그에 따른 PEDV 백신에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 중화 결정기 부위 (CO-26K equivalent, COE)를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 유전자 sCOE - Co1, 상기 sCOE - Co1 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 sCOE - Co1 융합 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체에서 sCOE-Co1 융합 단백질을 대량 생산하는 방법, 상기 sCOE - Co1 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하여 sCOE-Co1 융합 단백질을 대량 생산하는 식물체의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 sCOE-Co1 융합 단백질을 대량 생산하는 식물체 및 이의 종자, 상기 sCOE - Co1 융합 유전자를 포함하는 식물체의 sCOE-Co1 융합 단백질 대량 생산용 조성물 및 상기 방법에 의해 제조된 단백질 또는 상기 식물체를 유효성분으로 포함하는 PEDV 백신 조성물에 관한 것이다.
돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)는 니도바이러스 목 (order Nidovirales), 코로나비리대 과 (family Coronaviridae), 코로나바이러스 속 (genus Coronaviruses)의 그룹 I의 멤버로 분류된다. PEDV는 돼지, 특히 신생 돼지 설사병의 병원체이다. PEDV는 융모의 장세포를 파괴하고, 공장 (jejunum) 및 소장(ileum) 내부 융모들의 위축을 초래하여, PEDV에 감염된 어린 돼지에서 95%까지의 폐사율을 일으킨다. 게놈은 선형 양성-센스, 단일 가닥 RNA의 단일 분자로 구성된다. CV777 균주의 전체 게놈의 완전한 서열은 poly A-tail을 제외한 길이가 28,033 뉴클레오티드인 것으로 밝혀졌다. PEDV 게놈의 바이러스 코딩-단백질은 큰 스파이크 당단백질 (spike glycoprotein) 또는 페플로머 (peplomer) (S, 180-220 kDa), 막 관통 당단백질 (M, 27-32 kDa), 소량의 비리온 (virion)을 갖는 작은 외피 단백질, 및 인산화된 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질 (N, 55-58 kDa)의 4개의 구조 단백질을 갖는다 (Cavanagh D, Briton P, Academic Press, pp549-554, 2008). 스파이크 단백질은 숙주세포의 수용기에 바이러스 입자를 부착시키며, 그 후에 막 융합에 의해 세포로 침투한다. S 당단백질은 또한 숙주에서 중화 항체의 유도를 자극한다 (Yeo et al ., Virus Genes 26:239-246, 2003). 따라서, S 당단백질은 PEDV에 대한 백신의 개발을 위해 필수적이다. 예상된 폴리펩티드는 29개의 잠재적인 N-연결 당화 자리를 포함하는 길이가 1,383인 아미노산이며, 코로나바이러스 스파이크 단백질과 유사한 구조적 특징을 보여준다. PEDV의 S 당단백질은 잘려진 아미노 및 카르복시 소단위체인 S1 및 S2를 생성하기 위한 단백질 분해 자리가 결여되어 있으나, 그룹 II의 코로나바이러스의 다른 멤버에서 S 단백질의 단백질 분해 절단 자리에서 보존된 노나머 (nonamer) 및 GxCx 모티프의 존재를 기반으로 S1 도메인 (1~789 아미노산) 및 S2 도메인 (790~1,383 아미노산)으로 분리될 수 있다 (Follis et al ., Virology 350:358-369, 2006). 전염성의 위장염 바이러스의 중화 결정기 (neutralizing epitope)에 대한 서열 정보를 기반으로, Chang 등은 S1 도메인 내에서 499-638 아미노산의 부위에 걸친 139개의 아미노산을 포함하는 PEDV의 중화 결정기 부위 (CO-26K equivalent, COE 유전자)를 규명했다 (Chang et al ., Mol Cells 14:295-299, 2002). 이전의 연구에서, 식물-최적화 코돈 사용빈도 (codon usage)를 기반으로 변경된 PEDV의 합성 COE (sCOE) 유전자가 담배 식물체에서 발현되었다. 대장균 이열성 독소 B 소단위체 (heat-labile toxin B subunit, LTB) 유전자와 융합된 sCOE 유전자가 형질전환 담배 식물체, 벼 종자 및 상추 식물체에서 발현되었다. 대안적으로, 콜레라 독소 B 소단위체 (CTB)와 융합된 sCOE 유전자가 상추 식물체에서 발현되었다 (Huy et al ., Mol Biotechnol 48:201-209, 2011). 따라서, COE 유전자는 PEDV 감염에 대한 소단위체 백신의 개발에 중요한 목표로 여겨진다.
형질전환 식물체 및 형질전환 세포 현탁 배양 시스템은 다양한 항원 단백질 생산을 위한 생물반응기 및 전도유망한 생산 시스템으로 고려되어 왔다. 그러나, 형질전환 식물체에서 항원의 낮은 발현 수준은 동물 모델에서 낮은 면역 반응 및 면역 관용을 유발한다. 이 한계는 식물 기반 경구 백신의 개발을 방해하는 주요 장애물이다. 한가지 해결책은 CTB (콜레라 독소 B 소단위체), LTB (장독소성 대장균 이열성 장독소 B 소단위체) 및 독소의 다양한 B 소단위체과 같은 리간드를 통해서 점막 면역 시스템으로 항원 전달을 증가시키는 것이다.
유도성 벼 α-아밀라아제 3D 프로모터 (RAmy3D)는 당 결핍 조건 하의 벼 세포 현탁 배양 시스템에서 목적 유전자의 발현 효율을 향상시키기 위해 사용되었다. RAmy3D 유전자는 벼 실생이 발달하는 동안 처음으로 발현된다. 이들 인자들은 당 결핍 조건하에서 RAmy3D의 고수준 발현을 위해 필요하다. RAmy3D 프로모터는 벼 세포 현탁 배양에서 이종 유전자를 고도로 발현시키기 위해 사용되어 왔다 (Kim et al ., Plant Mol Biol 68:369-377, 2008).
한편, 한국등록특허 제0509120호에는 '돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프 단백질을 발현하는 형질전환체 및 그를 포함하는 경구투여용 백신 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0066556호에는 '돼지 유행성 설사병 바이러스의 에피토프와 점막면역보조제를 발현하는 형질전환체 및 이를 포함하는 백신 조성물'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 식물을 이용한 재조합 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV) 백신의 제조 방법 및 그에 따른 PEDV 백신에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 합성 중화 항원 결정기 sCOE (CO-26K equivalent)와 점막면역체계에서 M 세포 결합에 의해 면역반응을 증가시키는 리간드인 Co1이 융합된 sCOE-Co1 항원 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 제조하였고, 이를 발현하는 형질전환 벼 캘러스에서 수용성 sCOE-Co1 항원 단백질을 추출하여 실험동물인 마우스에 경구 투여한 결과, PEDV 항원 단백질에 대한 IgG 및 IgA 항체가 유도되는 면역반응이 일어나는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 중화 결정기 부위 (CO-26K equivalent, COE)를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 유전자 sCOE - Co1을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 sCOE - Co1 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 sCOE - Co1 융합 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체에서 sCOE-Co1 융합 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 PEDV의 중화 결정기 부위를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 sCOE - Co1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 sCOE-Co1 융합 단백질을 생산하는 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 sCOE-Co1 융합 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 PEDV의 중화 결정기 부위를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 sCOE - Co1 유전자를 포함하는, 식물체의 sCOE-Co1 융합 단백질 대량 생산용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 단백질 또는 상기 식물체를 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV) 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 돼지 유행성 설사병을 방어하기 위해 PEDV에 대한 중화 결정기와 점막면역보조제 Co1이 융합된 sCOE-Co1 단백질을 생산하는 형질전환 식물체는 경구 백신으로 사용될 수 있으며, PEDV에 대한 중화 활성을 갖는 항체 형성을 유도하여 PEDV의 감염을 예방할 수 있다. 더욱이 본 발명의 sCOE-Co1 단백질을 생산하는 식물 형질전환체는 장기간 보관 및 이동이 가능하여 백신 제조가 용이하고, 백신의 경구 투여가 가능하므로 주사 접종으로 인한 비용 소모를 절감할 수 있어 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 벼 발현 벡터 pMYV733 및 게놈 DNA PCR 분석을 나타낸다. (A) 합성 COE 유전자 (sCOE)는 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1과 융합되었고, 벼 아밀라아제 3D 유전자의 신호 펩티드 (3Dsp), 프로모터 (RAmy3D-p), 및 비번역 부위 (3' UTR) 조절 하의 식물 발현 벡터로 도입되었고, 벼 캘러스에 형질전환되었다. 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (HPT) 유전자는 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (35S-p) 및 종결자 (35S-t)의 조절 하에서 선발 마커로 사용되었다. LB 및 RB는 각각 T-DNA의 왼쪽 및 오른쪽 경계이다. (B) 게놈 DNA PCR 증폭은 야생형 및 형질전환체로 추정되는 벼 캘러스의 게놈 DNA에서 sCOE - Co1 융합 유전자를 증폭하기 위해 수행되었다. 레인 M은 100 base-pair DNA ladder (ELPIS Biotech, 서울, 한국)이다. 레인 PC는 양성 대조구로 사용된 플라스미드 pMYV733으로부터 증폭된 PCR 산물이다. 레인 NC는 음성 대조구로 사용된 야생형이다. 레인 1-14는 형질전환체로 추정되는 독립적인 라인이다.
도 2는 sCOE - Co1 융합 유전자의 발현을 측정하기 위한 노던 블럿 분석을 나타낸다. 야생형 및 형질전환된 벼 캘러스로부터 준비된 총 RNA (30 ㎍)는 32P-표지 sCOE-Co1 융합 유전자 프로브와 혼성화되었다. 레인 NC는 야생형 벼 캘러스의 총 RNA이다. 레인 1-12는 형질전환 벼 캘러스의 총 RNA이다.
도 3은 COE-Co1 융합 단백질의 검출 및 N-당화 분석을 나타낸다. 1차 항체로 항-COE 항체를 사용하여 형질전환 벼 캘러스 라인 #9 (A) 및 라인 #11 (B)에서 COE-Co1 융합 단백질의 웨스턴 블럿 분석. 레인 M은 SDS-PAGE 표준으로 사전 염색된 마커 (ELPIS Biotech)이다. 레인 10, 20 및 40은 미리 결정된 양 (10, 20 및 40 ng)의 E. coli에서 정제된 COE 단백질을 포함한다. 레인 NC는 야생형 벼 캘러스의 단백질 추출물이다. 레인 1-5는 발현 유도 1-5일 후의 형질전환 캘러스의 단백질 추출물이다. (C) COE-Co1 융합 단백질의 N-당화 분석. 레인 N은 효소가 처리되지 않은 단백질 추출물이다. 레인 F, F1 및 H는 각각 PNGase F, Endo F1 및 Endo H 효소가 처리된 단백질 추출물이다.
도 4는 정량적 농도계측기를 사용한 단백질 발현 수준의 측정을 나타낸다. 형질전환 벼 캘러스 라인 #9 (A) 및 라인 #11 (B)의 COE-Co1 융합 단백질의 발현 수준은 당 결핍 조건 하에서 시간별로 측정되었고, % TSP로 나타내었다.
도 5는 마우스 급이 계획 및 COE-특이 항체의 검출을 나타낸다. COE-Co1 융합 단백질을 발현하는 형질전환 벼 캘러스 및 야생형의 단백질 추출물은 마우스 경구 면역을 위해 황산암모늄으로 침전시켜 농축하였다. (A) 실험 그룹 (n=5)에서 각 마우스는 1주 간격으로 총 10회의 급이 동안에 COE-Co1 융합 단백질 40 ㎍을 포함하는 PBS 버퍼 2 ml이 위관 영양법으로 경구 투여 (gavage)되었다. 혈액 및 배설물 샘플은 4, 6, 8 및 10주 급이한 후 10일째에 수집되었다. 마우스 혈청 및 배설물 샘플은 각각 100배 및 4배 희석되었고, 세균 COE에 대한 혈청 IgG (B) 및 배설물 IgA (C) 항체 수준을 측정하기 위해 사용되었다. 제시된 결과는 5 마리의 면역된 마우스의 평균 OD 결과를 보여준다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 6은 면역된 마우스에서 COE-특이 IgG 및 IgA 항체-분비 세포 (antibody-secreting cell, ASC)의 측정을 나타낸다. 105 SPL 당 COE-특이 ASC (A) 또는 106 PPL 당 COE-특이 ASC (B)는 ELISPOT을 이용하여 측정되었다. SPL 및 PPL은 각각 비장 (spleen) 및 소장 내 림프절 (Peyer's patche)의 림프구를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001은 비교된 값 사이의 유의차를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 중화 결정기 부위 (CO-26K equivalent, COE)를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 유전자 sCOE - Co1을 제공한다.
본 발명에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV)의 COE 유전자는 PEDV의 주요 구성 단백질인 스파이크 (spike) 단백질의 일부로서, 목표 세포를 인식하고 바이러스와 세포막 (cellular membrane)을 융합시키는 기능을 갖는다. 따라서 바이러스 감염에 필수적인 역할을 하는 COE (CO-26K equivalent) 유전자가 중화 결정기 (neutralizing epitope)로 이용될 수 있다.
용어 "중화 결정기"는 흔히 "에피토프 (epitope)"와 호환하여 사용된다. "에피토프"는 특정 항체에 의해 인식되는 항원결합 부위의 아미노산 잔기, 또는 T 세포에서 T 세포 수용체 단백질 및/또는 주요 조직적합성 복합체 (Major Histocompatibility Complex, MHC) 수용체에 의해 인식되는 잔기이다. 에피토프는 항체, T 세포 수용체 또는 HLA 분자에 의해 인식되는 부위를 형성하는 분자로, 일차, 이차 및 삼차 펩티드 구조, 또는 전하를 의미한다.
상기 sCOE - Co1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 sCOE - Co1 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 순서대로 벼 아밀라아제 3D(RAmy3D) 프로모터, RAmy3D 신호 펩티드 코딩 서열, sCOE - Co1 융합 유전자 및 벼 아밀라아제 3D 유전자의 3' 비번역 부위 (3' UTR) 서열을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 도 1에 기재된 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 sCOE - Co1 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.
sCOE - Co1 유전자 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신 (kanamycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), G418, 블레오마이신 (Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 벼 아밀라아제 3D (RAmy3D), CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이며, 더욱 바람직하게는 벼이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 sCOE - Co1 융합 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체에서 sCOE-Co1 융합 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 PEDV의 중화 결정기 부위를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 sCOE - Co1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 sCOE-Co1 융합 단백질을 생산하는 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에서, 상기 sCOE - Co1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 유전자총-매개 형질전환 방법일 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 sCOE-Co1 융합 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 벼 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직한 단자엽 식물은 택사과 (Alismataceae), 자라풀과 (Hydrocharitaceae), 지채과 (Juncaginaceae), 장지채과 (Scheuchzeriaceae), 가래과 (Potamogetonaceae), 나자스말과 (Najadaceae), 거머리말과 (Zosteraceae), 백합과 (Liliaceae), 지모과 (Haemodoraceae), 용설란과 (Agavaceae), 수선화과 (Amaryllidaceae), 마과 (Dioscoreaceae), 물옥잠과 (Pontederiaceae), 붓꽃과 (Iridaceae), 버먼초과 (Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과 (Commelinaceae), 곡정초과 (Eriocaulaceae), 화본과 (벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과 (Araceae), 개구리밥과 (Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과 (Typhaceae), 사초과 (방동사니과, Cyperaceae), 파초과 (Musaceae), 생강과 (Zingiberaceae), 홍초과 (Cannaceae) 또는 난초과 (Orchidaceae)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 PEDV의 중화 결정기 부위를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 sCOE - Co1 유전자를 포함하는, 식물체의 sCOE-Co1 융합 단백질 대량 생산용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 sCOE - Co1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 조성물은 유효성분으로 sCOE - Co1 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 PEDV 백신을 대량 생산할 수 있다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
용어 "면역원" 또는 "항원성 물질"은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 항원성 물질은 돼지에서 유행성 설사병을 유발하는 PEDV일 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 PEDV의 중화 결정기 부위를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 형태일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 유전자 서열로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 단백질 또는 상기 식물체를 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV) 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 백신 조성물에서, 상기 백신은 바람직하게는 경구 백신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 백신 조성물은 본 발명의 형질전환 식물체에서 생산된 sCOE-Co1 융합 단백질 추출물 또는 이의 농축액을 포함하는 형태이거나, 형질전환 식물 자체 또는 형질전환 식물체의 건조 분말 형태로 사용할 수 있다. 또한 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분으로서 식물의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 유효성분인 식물은 통상 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 특정한 최대 허용범위가 없이 면역 반응을 유도하는 수준으로 사용될 수 있다.
용어 "예방"은 본 발명의 PEDV의 중화 결정기 부위를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 sCOE - Co1 유전자를 발현하는 형질전환체, 상기 형질전환체에서 생산된 sCOE-Co1 융합 단백질 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 상기 PEDV 감염을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말하며, 용어 "치료"는 본 발명의 PEDV의 중화 결정기 부위를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 sCOE - Co1 유전자를 발현하는 형질전환체, 상기 형질전환체에서 생산된 sCOE-Co1 융합 단백질 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 상기 PEDV 감염 증상이 호전되는 모든 행위를 말한다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calciumcarbonate), 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
벼 발현 벡터의 구축
sCOE - Co1 융합 유전자는 PCR (polymerase chain reaction) 증폭을 위한 주형으로 sCOE 유전자를 포함하는 플라스미드 pMYV93으로부터 정방향 프라이머 (5'-GGA TCC GTT ACT TTG CCA TCC TT -3': 서열번호 2) 및 Co1 리간드 (하기 이탤릭체로 표시)가 포함된 역방향 프라이머 (5'- GGT ACC TGG AAG TGG AGA TCT AGC TGG AAG CTG ATG AAA AGA AAC ATC TGT GAT TCC C -3': 서열번호 3)를 사용하여 증폭되었다. BamHI 및 KpnI 제한 효소 자리 (프라이머의 밑줄)는 용이한 서브클로닝을 위해 프라이머에 포함시켰다. PCR 반응은 5분 동안 94℃ 1회; 30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 및 30초 동안 72℃의 30회 반복; 5분 동안 72℃ 1회의 PCR 조건으로 수행되었다. PCR 산물은 pMYV730을 제작하기 위해 pGEM®T-Easy 벡터 (Promega, Madison, WI)에 클로닝되었다. 그 서열은 T7 및 SP6 프라이머로 DNA 서열 분석을 통해 확인되었다. pMYV730의 sCOE - Co1 융합 유전자는 BamHI 및 KpnI을 처리하여 절단시켰고, pMYV733을 형성하기 위해 RAmy3D 유전자의 신호 펩티드 및 3' 비번역 부위 (3' UTR)를 갖는 RAmy3D 프로모터 발현 시스템의 조절하에 있는 벼 발현 벡터 pMYV657의 동일한 자리에 도입되었다.
벼 형질전환
도정된 성숙 벼 종자 (Oryza sativa L. cv. Dongin)는 살균되었고, 캘러스 유도를 확실히 하기 위하여 7일 동안 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyalic acid) 2 mg/L, 수크로오스 30g/L, 및 키네틴 0.2 mg/L가 첨가된 N6 염류 및 비타민 배지 (Chu et al ., Sci Sin 18:659-668, 1975)에서 배양되었다. 벼 캘러스가 준비되었고, 유전자총-매개 형질전환 방법을 통해 플라스미드 pMYV733으로 형질전환되었다 (Chen et al ., Nat Biotechnol 16:1060-1064, 1998). 유전자총-매개 형질전환 후, 캘러스는 2,4-D 2 mg/L, 수크로오스 30g/L, 키네틴 0.2 mg/L, 및 글루코오스 10g/L가 첨가된 항생제가 없는 N6 공배양 배지에서 3일 동안 암 상태로 배양된 후, 항생제 하이그로마이신 B (50 mg/L)가 첨가된 N6 선발 배지 (N6SE)에 옮겨졌다. 2-3주 후, 형질전환된 것으로 추정되는 벼 캘러스가 관찰되었다.
게놈 DNA PCR 분석
게놈 DNA는 ZymoBead™ 게놈 DNA 키트 (Zymo Research, Orange, CA)를 이용하여 야생형 및 형질전환된 것으로 추정되는 벼 캘러스에서 분리되었다. 게놈 DNA의 농도는 자외선 (UV) 분광광도계를 이용하여 260 nm에서 측정되었다. PCR은 게놈 DNA 500 ng, sCOE - Co1 융합 유전자-특이 프라이머 (정방향 프라이머 5' -GGA TCC GTT ACT TTG CCA TCC TT-3' (서열번호 2) 및 역방향 프라이머 5' -GGT ACC TGG AAG TGG AGA TCT AGC-3' (서열번호 4)), 200 μM dNTPs, 1 x Taq 폴리머라아제 버퍼, 및 2 유닛 (unit) iTaq 폴리머라아제 (iNtRON Biotechnology, 서울, 한국)를 포함하는 25 ㎕ 부피에서 수행되었다. PCR 산물은 1.0% 아가로스 겔 전기영동 후 EtBr (ethidium bromide) 용액에서 염색하여 분석되었다.
노던 블럿 분석
형질전환 벼 캘러스에서 RAmy3D 프로모터 조절하의 COE - Co1 융합 유전자는 당 결핍 조건 하에서 5일 동안 유도되었다. 총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 TRI Reagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH)를 사용하여 야생형 및 형질전환 벼 캘러스로부터 추출되었다. RNA 샘플 (30 ㎍)은 1.2% 포름알데히드-아가로스 겔에서 전기영동으로 분리되었고, Hybond N+ 막 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)에 모세관 현상으로 블럿팅 (capillary-blotted)되었다. 블럿은 65℃의 혼성화 배양기 (Finemould Precision Ind. Co., 서울, 한국)에서 1 mM EDTA, 250 mM Na2HPO4·7H2O, 1% 가수분해된 카제인 (hydrolyzed casein), 및 7% SDS가 포함된 버퍼 (pH 7.4)에서 32P-표지된, 무작위로 준비된 sCOE-Co1 프로브 (Promega)와 함께 밤새 혼성화되었다. 블럿은 65℃에서 각 15분 동안 세척 버퍼 A (2 x SSC, 0.1% SDS)로 2회, 세척 버퍼 B (2 x SSC, 1% SDS)로 2회 및 세척 버퍼 C (0.1 x SSC, 0.1% SDS)로 2회 세척되었다. 혼성화된 밴드는 X-선 필름 (AGFA, Mortsel, Belgium)을 사용하여 자기방사법 (autoradiography)으로 검출되었다.
면역블럿 검출
형질전환 벼 캘러스는 면역블럿 분석으로 COE-Co1 융합 단백질의 존재를 검출하기 위해 분석되었다. COE - Co1 융합 유전자의 발현은 수크로오스가 없는 N6 액체 배지에서 유도되었다. 총 수용성 단백질은 막자와 막자사발을 사용하여 액체질소에서 분쇄하여 벼 캘러스로부터 추출되었다. 분쇄물은 단백질 추출 버퍼 (200 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 400 mM 수크로오스, 10 mM EDTA, 14 mM 2-머캅토에탄올, 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), 및 0.05% Tween-20)로 현탁되었고, 비수용성 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 4℃에서 15분 동안 13,000g로 원심분리되었다. 단백질 농도는 Bradford 단백질 분석 (Bio-Rad Inc., Hercule, CA)으로 측정되었다. 80 ㎍의 총 수용성 단백질을 포함하는 단백질 추출물의 분취액은 pH 8.3의 Tris-glycine 버퍼 (25 mM Tris-Cl, 250 mM 글리신 및 0.1% SDS)에서 2-3시간 동안 120V로 12% SDS-PAGE에 의해 분리되었다. 분리된 단백질 밴드는 3시간 동안 130mA로 mini-transblot apparatus (Bio-Rad)를 사용하여 전달 버퍼 (50 mM Tris-Cl, 40 mM 글리신, 및 20% 메탄올) 속에서 Hybond C 막으로 옮겨졌다. 비-특이적 항체 반응은 10% 탈지분유가 포함된 TBST 버퍼 (0.05% Tween-20이 첨가된 Tris-buffered saline)를 사용하여 차단되었다. 막은 3.0% 탈지분유를 포함하는 TBST 항체 희석 버퍼에 마우스 항-COE 다클론 항체의 1:5,000 희석액과 함께 배양되었다. 막은 TBST 버퍼로 3회 세척된 후, TBST 버퍼에서 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase)가 결합된 항-마우스 IgG (Promega S372B)의 1:7,000 희석액으로 2시간 동안 배양되었다. 막은 TBST 버퍼로 2회 세척하고, TMN 버퍼 (100 mM Tris-Cl, pH 9.5, 5 mM MgCl2, 및 100 mM NaCl)로 1회 세척되었다. 발색은 BCIP/NBT 용액 (Sigma, St. Louis, MO)을 사용하였다. 막은 단백질 발현 수준을 평가하기 위해 농도계측기 (Alpha Ease FCTM software Version 3.3.3, AlphaInotech)로 평가되었다.
PNGase F 및 엔도글리코시다아제 ( Endo F1 및 Endo H) 처리
형질전환 벼 캘러스에서 생산된 COE 단백질의 N-당화 구조는 탈당화 (deglycosylation) 효소를 사용하여 측정되었다. 형질전환 벼 캘러스는 상기 기재된 것처럼 분쇄되었다. 분쇄물은 변성 추출 버퍼 (0.5% SDS 및 1% 2-머캅토에탄올 포함)로 현탁되었고, 그 후에 비수용성 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 4℃에서 15분 동안 13,000g로 원심분리되었다. 단백질 추출물은 10분 동안 가열되었고, 5분 동안 얼음 위에서 냉각되었다. 식물-생산 단백질의 N-당화 산물은 1시간 동안 10 x 반응 버퍼 3.5 ㎕, 1000 유닛 효소 및 단백질 추출물 50 ㎍을 포함하는 37℃의 반응 혼합물 35 ㎕에서 PNGase F 및 엔도글리코시다제 F1 및 H (Endo F1 및 Endo H) (ELPIS Biotech, 서울, 한국)를 이용하여 제거되었다. 처리는 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 가시화되었다.
벼 캘러스 단백질 추출물의 준비
높은 발현 수준을 갖는 형질전환 벼 캘러스 (라인 #9)는 N6 액체 배지에서 배양되었고, COE-Co1 융합 단백질의 생산은 당 결핍 조건 하에서 유도되었다. 형질전환 벼 캘러스는 진공-펌프 여과기를 사용하여 수집되었고 믹서기를 사용하여 분쇄되었다. 총 수용성 단백질(TSP)은 PBS (phosphate buffered saline) 버퍼로 추출되고, 비수용성 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 4℃에서 15분 동안 13,000g로 원심분리 되었다. 총 수용성 단백질은 적절한 농도의 황산암모늄으로 침전시켰다. 침전된 단백질은 마우스에게 먹이기 전에 황산암모늄을 제거하기 위해 PBS 버퍼에서 투석되었다. 투석 후에, 재조합 단백질은 SDS-PAGE로 분석되었고, 이종 (heterologous) 단백질의 수준은 웨스턴 블럿 분석의 정량적 농도계측을 이용하여 추정되었다.
벼 단백질 추출물을 사용한 경구 면역
암컷 BALB/c 마우스는 Dong Yang Oriental Company (서울, 한국)에서 구매되었고, 무작위로 5마리씩 2 그룹으로 나누었다. 도 5에 나타낸 것처럼, 실험용 마우스는 10주 동안 매주 경구 투여 (gavage) 되었다 (Yoshida et al ., Int J Biol Sci 7:301-307, 2011). 혈액 및 배설물 샘플은 이전에 기재된 것처럼, 4, 6, 8, 및 10주 급이한 후 10일째에 수집되었다. 수집된 혈액 샘플은 1시간 동안 실온에서 보관되었고, 13,000 g로 10분 동안 원심분리되기 전에 1시간 동안 얼음 위에서 냉각되었다. 혈청은 상층액에서 수집되었고, 추가의 분석을 위해 -70℃에 보관되었다. 배설물 샘플 (200 mg)은 0.01% 소듐 아지드 (sodium azide)를 포함하는 PBS 버퍼 1 ml에 용해시켰다. 비수용성 물질은 10분 동안 13,000g로 원심분리하여 제거되었다. 배설물 추출물도 추가의 분석을 위해 -70℃에 보관되었다.
혈청 및 배설물 추출물의 항체 검출
항원-특이적 IgG 및 IgA 항체의 분석을 위해, ELISA는 이전에 기재된 프로토콜 (Kim et al ., Mol Biotechnol 44:14-21, 2010)에서 약간 수정된 방법에 따라 수행되었다. 간략하게, ELISA 플레이트는 중탄산염 (bicarbonate) 버퍼 (15 mM Na2CO3, 25 mM NaHCO3, pH 9.6)에 용해된 항원 100 ㎕ (0.8 ㎍/웰)로 코팅되었고, 비닐 랩으로 덮어서, 4℃에서 밤새 배양했다. 웰은 PBST 버퍼 (0.05% Tween-20이 첨가된 PBS)로 3회 세척되었고, 웰당 1% BSA를 포함하는 PBS 버퍼 300 ㎕를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, PBST 버퍼로 3회 세척되었다. 혈청 및 배설물 추출물은 PBS 버퍼로 1:100 또는 1:4로 희석하였고, 항원 코팅 플레이트에 로딩하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 플레이트는 PBST 버퍼로 3회 세척되었고, 알칼리 포스파타아제가 결합된 항-마우스 IgG (Sigma A-3688) 또는 항-마우스 IgA (Sigma A-4937)의 1:10,000 희석액 100 ㎕를 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, PBST 버퍼로 3회 세척하였다. 플레이트는 포스페이트 기질 정제 (Sigma S0942-100TAB) 1개를 첨가한 알칼리 포스파타아제 버퍼 (10% (v/v) 디에탄올 아민, 0.1% MgCl2, 0.02% 소듐 아지드, pH 9.8) 100 ㎕를 첨가하여 암상태의 실온에서 30분 동안 발색시켰다. 플레이트는 ELISA 판독기 (Packard Instrument, Meriden, CA)로 405 nm 파장에서 판독되었다.
ELISPOT 분석
가장 높은 COE-특이 IgG 항체 수준을 보여주는 면역된 마우스의 비장 및 PP (Peyer's patche)의 림프구는 Kim 등에 의해 기재된 것처럼 마지막 면역 보조주사 (booster) 후 10일에 분리되었다. ELISPOT 분석은 Kim 등에 의해 기재된 것처럼 비장 및 PP에서 분리된 림프구를 사용하여 COE-특이 항체-분비 세포 (ASC)의 수를 측정하기 위해 수행되었다 (Kim et al ., J Immunol 185:5787-5795, 2010).
데이터 해석
결과는 엑셀 2007 소프트웨어 (Microsoft)를 사용하여 계산되었고, 적어도 3번의 독립적인 실험의 평균±표준 편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 student's t-test를 사용하여 계산되었고, 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다.
실시예 1. 벼 발현 벡터의 구축 및 벼 형질전환
합성 COE (sCOE) 유전자는 3' 말단에 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1과 융합되었고, RAmy3D 프로모터 발현 시스템의 조절 하의 벼 발현 벡터로 도입되어, 플라스미드 pMYV733이 얻어졌다 (도 1A). 식물 발현 벡터는 유전자총-매개 형질전환 방법을 통해 벼 캘러스에 형질전환되었다. 2-3주 후에, 형질전환된 것으로 추정되는 캘러스가 선발 마커로 하이그로마이신 B를 포함하는 선발 배지에서 나타났다. sCOE-Co1 융합 유전자 크기에 해당하는 PCR 산물은 14개의 형질전환된 것으로 추정되는 벼 캘러스에서 게놈 DNA PCR 증폭 분석으로 증폭되었다. 모든 형질전환 벼 캘러스는 468 bp의 예상 밴드를 나타내었다 (도 1B). DNA 밴드가 야생형 식물 게놈 DNA에서는 증폭되지 않았다.
실시예 2. 형질전환 벼 캘러스에서 COE - Co1 의 발현
형질전환 벼 캘러스에서 유도성 RAmy3D 프로모터 조절 하의 sCOE - Co1 융합 유전자의 발현은 수크로오스가 없는 고체 N6 배지에서 5일 동안 유도되었다. sCOE -Co1 융합 유전자의 mRNA 전사체는 32P-표지 sCOE - Co1 융합 유전자 프로브를 사용하여 노던 블럿 분석으로 확인되었다. 12개의 형질전환 벼 캘러스 라인 중 9개는 sCOE-Co1 전사체의 존재를 보여주었다 (도 2). 강한 mRNA 발현을 보여주는 2개의 형질전환 라인 (라인 #9 및 #11)이 웨스턴 블럿 분석을 위해 선발되었다.
2개의 형질전환 라인 (라인 #9 및 #11)의 COE-Co1 융합 단백질 발현은 당 결핍 조건 하에서 시간별로 유도되었다. 면역블럿 분석은 형질전환 벼 캘러스 단백질 추출물에서 COE-Co1 융합 단백질을 검출하기 위해 수행되었다. 세균의 COE 양성 대조구가 약 16 kDa에서 확인된 반면에, 26 kDa보다 약간 적은 분자량을 갖는 COE-Co1 융합 단백질이 검출되었다. COE-Co1 융합 단백질은 2개의 가능성 있는 N-당화 자리 때문에 예상보다 더 큰 크기로 검출되었다. N-당화 상태를 분석하기 위해, 단백질 추출물은 PNGase F, Endo F1 및 Endo H로 처리되었다. PNGase F는 변성된 단백질에서 중심 펩티드의 글리칸을 제거하고, Endo F1 및 Endo H는 올리고당의 디아세틸키토비오스 (diacetylchitobiose) 중심에서 2개의 N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine) 잔기 사이를 절단하여, 하나의 N-아세틸글루코사민 잔기를 갖는 절단된 (truncated) 당 분자를 생성한다. 탈당화 효소를 처리한 후에, 처리되지 않은 밴드보다 작은 단백질 밴드가 검출되었고 (도 3C), 이는 벼-생산 COE-Co1 융합 단백질이 N-당화 된다는 것을 나타낸다.
실시예 3. COE - Co1 융합 단백질의 정량
웨스턴 블럿 분석에서 검출된 밴드는 농도 계측 방법을 사용하여 COE-Co1 융합 단백질의 발현 수준을 평가하기 위해 스캔되었다. 미리 결정된 단백질 농도 (10, 20 및 40 ng)는 표준 곡선을 만들기 위해 사용되었다 (도 3A 및 3B). 형질전환 라인 #9 (도 4A) 및 라인 #11 (도 4B)의 COE-Co1 융합 단백질의 발현 수준은 당 결핍 조건 하에서 시간별로 평가되었다. 가장 높은 발현 수준은 형질전환 벼 캘러스 라인 #9에서 유도 3일 후에 TSP의 0.083%에 달했다 (도 4A).
실시예 4. 경구로 면역된 마우스의 혈청 IgG 및 배설물 IgA 항체
BALB/c 마우스의 실험 그룹 (n=5)은 형질전환 또는 야생형 벼 캘러스 단백질 추출물이 10회 경구 투여되었다 (도 5A). COE-Co1 융합 단백질을 포함하는 형질전환 식물체 단백질 추출물로 면역된 마우스에서 세균의 COE에 대한 혈청 IgG 항체는 8주 및 10주에 야생형 식물체 단백질 추출물로 면역된 마우스에서 관찰된 것에 비해 높은 비율로 유도되었다 (도 5B). COE-Co1 융합 단백질로 면역된 마우스는 8주 및 10주에 음성 대조구로 야생형 벼 단백질 추출물이 급이된 마우스에 비해 강한 COE-특이적 IgA 수준이 유도되었다 (도 5C).
실시예 5. COE -특이적 면역 반응의 측정
전신 (systemic area) 및 점막 영역 (mucosal compartment)에서 항원-특이적 면역 반응을 관찰하기 위해, 마지막 경구 면역화 후에 비장 및 PP (Peyer’s patche)에서 분리된 림프구의 COE-특이적 IgG- 및 IgA-분비 세포의 수가 ELISPOT으로 평가되었다. COE-Co1 융합 단백질로 면역된 마우스의 비장에서 분리된 림프구의 COE-특이적 IgG- 및 IgA-분비 세포의 수는 야생형 식물체 단백질로 면역된 마우스에 비해서, 각각 3배 및 8배 더 높은 수준으로 관찰되었다 (도 6A). 면역된 마우스에서 분리된 PP (Peyer's patche) 림프구는 대조구 마우스에 비해 2배 더 많은 수의 항-COE IgA 항체 분비 세포를 포함한다 (도 6B). 종합적으로, 식물 유래의 COE-Co1 융합 단백질을 사용한 경구 면역은 COE 항원에 대해 효율적인 전신 면역 반응 및 점막 면역 반응을 유도할 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 중화 결정기 부위 (CO-26K equivalent, COE)를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 유전자 sCOE - Co1.
  2. 제1항의 sCOE - Co1 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 5'에서 3' 방향으로 순서대로 벼 아밀라아제 3D(RAmy3D) 프로모터, RAmy3D 신호 펩티드 코딩 서열, sCOE - Co1 융합 유전자 및 벼 아밀라아제 3D 유전자의 3' 비번역 부위 (3' UTR) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제2항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  5. 제2항의 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 sCOE - Co1 융합 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체에서 sCOE-Co1 융합 단백질을 대량 생산하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물체는 벼인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 중화 결정기 부위를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 sCOE-Co1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 sCOE-Co1 융합 단백질을 생산하는 식물체의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 sCOE - Co1 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항의 방법에 의해 제조된 sCOE-Co1 융합 단백질을 생산하는 식물체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 식물체.
  12. 제9항에 따른 식물체의 종자.
  13. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 돼지 유행성 설사병 바이러스 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 중화 결정기 부위를 코딩하는 합성 유전자 sCOE와 M 세포-표적 펩티드 리간드인 Co1 유전자가 융합된 sCOE-Co1 유전자를 포함하는, 식물체의 sCOE-Co1 융합 단백질 대량 생산용 조성물.
  14. 제5항의 방법에 의해 제조된 단백질 또는 제9항의 식물체를 유효성분으로 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV) 백신 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 경구 백신인 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 (PEDV) 백신 조성물.
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