KR101566002B1 - 콜레라 독소 b 서브유닛과 바이러스 항원 단백질의 융합 항원 단백질 백신, 이를 발현하는 식물체 및 이의 용도 - Google Patents
콜레라 독소 b 서브유닛과 바이러스 항원 단백질의 융합 항원 단백질 백신, 이를 발현하는 식물체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 콜레라 독소 B 서브유닛과 댕기 바이러스 항원 단백질의 융합 항원 단백질을 이용한 댕기 바이러스 백신에 관한 것으로, 콜레라 독소 B 서브유닛 (cholera toxin B subunit; CTB)과 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III (synthetic consensus dengue virus envelope protein domain III) 단백질이 융합된 CTB-scEDIII 단백질을 생산하는 형질전환 식물체는 경구 백신으로 사용될 수 있으며, 4가지 혈청형의 댕기 바이러스에 대한 교차-중화 활성을 갖는 항체 형성을 유도하여 4가지 혈청형의 댕기 바이러스에 대한 감염을 예방할 수 있다.
Description
본 발명은 콜레라 독소 B 서브유닛과 댕기 바이러스 항원 단백질의 융합 단백질을 이용한 댕기 바이러스 백신에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 콜레라 독소 B 서브유닛 (cholera toxin B subunit; CTB) 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III (synthetic consensus dengue virus envelope protein domain III) 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB - scEDIII 유전자, 상기 CTB -scEDIII 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 CTB - scEDIII 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체에서 CTB - scEDIII 융합 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 CTB-scEDIII 융합 단백질을 대량 생산하는 방법, 상기 CTB-scEDIII 융합 단백질을 대량 생산하는 식물체의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 CTB-scEDIII 융합 단백질을 대량 생산하는 식물체 및 이의 종자, 상기 CTB-scEDIII 융합 유전자를 포함하는 식물체의 CTB-scEDIII 융합 단백질 대량 생산용 조성물 및 상기 방법에 의해 제조된 단백질 또는 상기 식물체를 유효성분으로 포함하는 댕기 바이러스 백신 조성물에 관한 것이다.
댕기 (dengue)는 열대와 아열대 지역에서 가장 주요하게 발생하는 모기 매개 바이러스성 질병 중 하나이다. 주로 아열대 지역에서 발생하지만, 이 병은 전 세계적으로 매년 약 5천만~1억 명의 사람들을 감염시킨다. 최근에 댕기는 지리적 경계를 초월하여, 세계 인구의 약 50%에 대해 감염 위험성을 갖는 심각한 공중보건 문제가 되고 있다. 이 질병의 잠재성 및 상당한 경제적 부담 때문에 댕기에 효과적인 백신을 생산하기 위한 집중적인 연구가 필요하다.
댕기 바이러스 E 단백질은 도메인 III (EDIII)의 숙주세포 수용체 결합 모티프와 연관되어 있다. 이전 연구에서, EDIII에 기초한 재조합 단백질이 E. coli 및 효모에서 발현되었으며, 효율적인 면역원성 (immunogenicity)이 증명되었다. 댕기에 대한 백신을 개발하기 위한 많은 노력이 1940년대 초부터 시작되었으며, 몇 가지 타입의 백신이 보고되었다. 그러나 현재까지 인간 사용을 위한 효과적인 댕기 백신이 아직까지 허가되지 않고 있다 (Murrell et al ., 2011 Biotechnol Adv 29:239-247).
댕기 바이러스는 4가지 항원성과 관련하여 다른 혈청형 (DEN-1 내지 -4)으로 이루어지는데, 이는 한 가지의 댕기 바이러스 혈청형의 감염이 잠재적으로 생명을 위협하는 댕기 출혈열 (dengue hemorrhagic fever; DHF) 또는 항체 의존성 강화 (antibody-dependent enhancement; ADE)로 언급되는 다른 혈청형의 연속 감염 후에 발생하는 댕기 충격 증후군 (dengue shock syndrome; DSS) 등의 댕기 증상을 일으킬 수 있으므로 효과적인 댕기 백신을 개발하는 것을 어렵게 만든다 (Huang et al., 2006 J Immunol 176:2825-2832). 4가 (tetravalent) 댕기 백신은 ADE 없이 모든 혈청형에 대한 방어를 제공하는 것으로 생각된다. 이러한 백신을 위해, 일치 (consensus) 아미노산 서열이 4가지 다른 댕기 바이러스 혈청형의 분리주로부터 EDIII 서열의 정렬에 의해 추정되었다. 재조합 일치 외피 단백질 도메인 III (cEDIII)로 면역된 마우스는 댕기 바이러스의 4가지 혈청형 모두에 대한 중화 항체가 만들어졌다 (Chiang et al ., 2011 PLoS ONE 6:e23319).
형질전환 식물체에서 상업용 및 의료용 단백질의 생산은 활발하게 연구되어 왔고, 유전 공학의 발달에 의해 빠르고 유연성 있는 생산 시스템이 개발되었다. 식물체 기반 생산 시스템은 경구 백신 접종에 의해 점막 면역 표적에 항원을 전달할 수 있는 능력을 갖는 안전하고 저렴한 백신을 제공한다. 그러나 식물체의 낮은 항원 단백질 생산 수준은 경구 면역 관용 및 낮은 면역 반응을 초래하여 식물체를 이용한 경구 백신 접종 방법에 걸림돌이 된다 (Kim et al ., 2010 Mol Biotechnol 44:14-21).
식물에서 고수율을 얻기 위해, 보고된 일부 재조합 단백질은 세포 이하 (sub-cellular) 표적화 및 엽록체 형질전환을 통해 총 가용성 단백질의 47% 수준까지 그들의 안정적인 발현이 현저하게 증가되었다. 유전자 최적화, 강력한 프로모터 사용, 효율적인 비번역 리더 (leader) 서열 및 3' 비번역 서열 (UTR)과 같은 유전 공학적 접근 방법도 상기 목적을 위해 사용되었다. 게다가, 일시적 발현 시스템은 고가의 단백질 발현을 위해 일반적으로 사용되는 방법이 되었다. 일시적 발현 시스템을 이용하여 TSP 80%까지의 재조합 단백질 수율이 보고되었고, 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma)에 대해 특화된 유전자형 백신의 신속한 고수율 생산이 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana)에서 성공적으로 이루어졌다 (Bendandi et al ., 2010 Ann Oncol 21:2420-2427).
점막 면역 시스템에서 면역 반응을 증가시키기 위한 다른 전략은 점막 면역 세포에서 항원 흡수를 향상시키기 위해 점막 면역 유도 위치에 융합된 항원 단백질을 전달할 수 있는 능력을 갖는 리간드와 항원 단백질의 융합이다. 형질전환 식물체에서 알려진 대표적인 리간드는 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB) 및 장관 독소 생산성 E. coli 장독소 (enterotoxin) B 서브유닛 (LTB)이다. E. coli에서 생산된 이열성 독소 (heat labile toxin) 및 비브리오 콜레라에서 생산된 콜레라 독소 (CT)는 AB5 독소 패밀리의 일원이다. CT는 세포 부착에 관련된 비독성 B 서브유닛과 번역 후 (post-translationally) A1 및 A2 펩티드로 절단되는 독성 A 서브유닛으로 구성된다. B 서브유닛은 도넛형 오량체 (pentameric) 형태를 가지며, 핵이 있는 모든 동물 세포에서 나타나는 GM1-갱글리오시드 (ganglioside)에 결합한다. CTB는 CT에 대한 항원 단백질일 뿐만 아니라, 다양한 단백질 또는 펩티드 항원과 화학적 또는 유전적 결합을 통하여 다른 백신 관련 항원을 위한 경구 전달 운반 시스템 (oral delivery carrier system)의 주요 후보물질 중 하나이다 (Boyhan and Daniell 2011 Plant Biotechnol J 9:585-598).
점막 분비물에서 CTB에 의한 분비 IgA 항체뿐만 아니라 높은 혈청 IgG 항체 농도 (titer) 유도에 의해 드러난 점막 면역 활성화 (immunopotentiating) 효과는 몇 가지 연구에서 보고되었다. CTB는 식물체에서 고수준의 항원을 발현시키기 위해 다른 항원성 펩티드 또는 단백질에 대한 안정적인 운반 분자 및 융합 파트너로 제안되어 왔다. CTB 또는 LTB 융합 단백질이 갖는 기능에 대한 우려는 결정적이지 않으며, 최근의 연구 활동은 CTB 또는 LTB 융합 단백질의 기능적 활성을 보여준다 (Rosales-Mendoza et al ., 2011 Plant Cell Rep 30:1145-1152).
한편, 한국공개특허 제2008-0048068호에는 '보호 반응을 유도하는 댕기 열 바이러스 캡시드 단백질 및 약학적 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제 2012-0079258호에는 ' 콜레라 독소 Ｂ 서브유닛과 돼지 유행성 설사 바이러스의 중화 항원 결정기를 포함하는 재조합 유전자, 이를 발현하는 식물체 및 이의 용도'가 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 콜레라 독소 B 서브유닛과 댕기 바이러스 항원 단백질의 융합 항원 단백질을 이용한 댕기 바이러스 백신에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 점막면역체계에서 M 세포 결합에 의해 면역반응을 증가시키는 리간드인 콜레라 독소 B 서브유닛 (cholera toxin B subunit; CTB) 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III (synthetic consensus dengue virus envelope protein domain III) 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII를 융합하여 CTB - scEDIII 융합 유전자를 제조하였고, 발현된 CTB-scEDIII 융합 단백질이 M 세포에 효과적으로 결합한다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 콜레라 독소 B 서브유닛 (cholera toxin B subunit; CTB) 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III (synthetic consensus dengue virus envelope protein domain III) 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB - scEDIII 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 CTB - scEDIII 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 CTB - scEDIII 융합 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체에서 CTB-scEDIII 융합 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 CTB 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB - scEDIII 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계 및 재분화하는 단계를 포함하는 CTB-scEDIII 융합 단백질을 생산하는 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 CTB-scEDIII 융합 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB) 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB -scEDIII 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 식물체의 CTB-scEDIII 융합 단백질 대량 생산용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 단백질 또는 상기 식물체를 유효성분으로 포함하는 댕기 바이러스 (dengue virus) 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 점막면역체계에서 M 세포 결합에 의해 면역반응을 증가시키는 콜레라 독소 B 서브유닛 (cholera toxin B subunit; CTB)과 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III (synthetic consensus dengue virus envelope protein domain III) 단백질이 융합된 CTB-scEDIII 단백질을 생산하는 형질전환 식물체는 경구 백신으로 사용될 수 있으며, 댕기 바이러스에 대한 중화 활성을 갖는 항체 형성을 유도하여 댕기 바이러스 감염을 예방할 수 있다.
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더욱이 본 발명의 CTB-scEDIII 단백질을 생산하는 형질전환 식물체는 장기 보관 및 이동이 가능하여 백신 제조가 용이하고, 백신의 경구 투여가 가능하기 때문에 주사 접종으로 인한 비용 소모를 절감할 수 있어 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 CTB-scEDIII 융합 유전자를 이용한 벼 캘러스의 형질전환을 나타낸다. (A) 벼 아밀라아제 3D 유전자의 프로모터 (RAmy3D) 및 3' 비번역 영역 (3' UTR)의 조절 하의 콜레라 독소 B (CTB) 서브유닛과 융합된 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII를 포함하는 식물 발현 플라스미드 (pMYV659)가 구축되었다. (B) CTB-scEDIII 융합 유전자는 형질전환된 것으로 추정되는 벼 캘러스에서 CTB-scEDIII 유전자 특이적 프라이머를 사용한 게놈 DNA PCR 증폭으로 검출되었다. 레인 PC: 양성 대조구로 사용된 CTB-scEDIII 융합 유전자를 포함하는 식물 발현 플라스미드, 레인 M: 100 bp DNA 래더 (ELPIS BIOTECH, Seoul, Korea), 레인 NC: 음성 대조구로 사용된 비-형질전환 벼 캘러스, 레인 1~12: 형질전환된 것으로 추정되는 벼 캘러스. (C) 당 결핍에 의한 유도 후의 형질전환 벼 캘러스로부터의 총 RNA 추출물은 CTB-scEDIII 융합 유전자 전사체를 검출하기 위한 노던 블럿 분석을 수행하였다. 레인 NC: 음성 대조구로 사용된 비-형질전환 벼 캘러스의 총 RNA 추출물, 레인 1~12: 형질전환 벼 캘러스의 총 RNA 추출물.
도 2는 CTB-scEDIII 융합 단백질의 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타낸다. 당 결핍에 의한 유도 후의 형질전환 벼 캘러스에서 생산된 CTB-scEDIII 융합 단백질은 끓이지 않는 조건 (A, B) 또는 5분 동안 끓이는 조건 (C, D) 하에서 SDS-PAGE를 통해 분리되었고, 항-CT 항체 (A, C) 또는 항-댕기 바이러스 항체 (B, D)를 사용한 웨스턴 블럿이 수행되었다. 레인 PC1: 상용 박테리아 CTB, 레인 PC2: E. coli에서 정제된 EDIII (혈청형 2), 레인 NC: 음성 대조구로 사용된 비-형질전환 벼 캘러스 단백질 추출물, 레인 2, 3, 6, 7, 8, 12: 형질전환 벼 캘러스의 단백질 추출물. 화살표는 결합 (assemble)된 CTB-scEDIII 융합 단백질을 나타낸다.
도 3은 CTB-scEDIII 융합 단백질의 GM1-ELISA 및 정량 결과를 나타낸다. 형질전환 벼 캘러스에서 생산된 CTB-scEDIII 융합 단백질의 GM1-갱글리오시드 수용체에 대한 생물학적 결합 활성은 항-CT 항체 (A) 또는 항-댕기 바이러스 항체 (B)를 사용한 GM1-ELISA에 의해 확인되었다. (C) CTB-scEDIII 융합 단백질의 생산 수준은 당 결핍에 의한 유도 7일 후의 동결건조된 벼 캘러스에서 GM1-ELISA에 의해 측정되었다.
도 4는 파이어판 (Peyer's patch)에서의 식물 생산 리간드 융합 단백질의 생물학적 활성을 나타낸다. 형질전환 벼 캘러스에서 생산된 기능적 CTB-scEDIII 융합 단백질의 M 세포 특이적 표적화 능력은 형광 현미경을 사용하여 시험관 내 (A) 및 생체 내 (B)에서 UEA-1+WGA- M 세포에 대하여 측정되었다. 붉은색: M 세포에 결합된 로다민 (rhodamine) 표지 UEA-1, 녹색: CTB-scEDIII 융합 단백질과 결합된 FITC (fluorescein isothiocyanate) 결합 항-마우스 IgG, 노란색: 파이어판에서 M 세포에 CTB-scEDIII 융합 단백질의 결합을 나타내는 UEA-1 및 cEDIII의 조합을 나타낸다.
도 2는 CTB-scEDIII 융합 단백질의 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타낸다. 당 결핍에 의한 유도 후의 형질전환 벼 캘러스에서 생산된 CTB-scEDIII 융합 단백질은 끓이지 않는 조건 (A, B) 또는 5분 동안 끓이는 조건 (C, D) 하에서 SDS-PAGE를 통해 분리되었고, 항-CT 항체 (A, C) 또는 항-댕기 바이러스 항체 (B, D)를 사용한 웨스턴 블럿이 수행되었다. 레인 PC1: 상용 박테리아 CTB, 레인 PC2: E. coli에서 정제된 EDIII (혈청형 2), 레인 NC: 음성 대조구로 사용된 비-형질전환 벼 캘러스 단백질 추출물, 레인 2, 3, 6, 7, 8, 12: 형질전환 벼 캘러스의 단백질 추출물. 화살표는 결합 (assemble)된 CTB-scEDIII 융합 단백질을 나타낸다.
도 3은 CTB-scEDIII 융합 단백질의 GM1-ELISA 및 정량 결과를 나타낸다. 형질전환 벼 캘러스에서 생산된 CTB-scEDIII 융합 단백질의 GM1-갱글리오시드 수용체에 대한 생물학적 결합 활성은 항-CT 항체 (A) 또는 항-댕기 바이러스 항체 (B)를 사용한 GM1-ELISA에 의해 확인되었다. (C) CTB-scEDIII 융합 단백질의 생산 수준은 당 결핍에 의한 유도 7일 후의 동결건조된 벼 캘러스에서 GM1-ELISA에 의해 측정되었다.
도 4는 파이어판 (Peyer's patch)에서의 식물 생산 리간드 융합 단백질의 생물학적 활성을 나타낸다. 형질전환 벼 캘러스에서 생산된 기능적 CTB-scEDIII 융합 단백질의 M 세포 특이적 표적화 능력은 형광 현미경을 사용하여 시험관 내 (A) 및 생체 내 (B)에서 UEA-1+WGA- M 세포에 대하여 측정되었다. 붉은색: M 세포에 결합된 로다민 (rhodamine) 표지 UEA-1, 녹색: CTB-scEDIII 융합 단백질과 결합된 FITC (fluorescein isothiocyanate) 결합 항-마우스 IgG, 노란색: 파이어판에서 M 세포에 CTB-scEDIII 융합 단백질의 결합을 나타내는 UEA-1 및 cEDIII의 조합을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 콜레라 독소 B 서브유닛 (cholera toxin B subunit; CTB) 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III (synthetic consensus dengue virus envelope protein domain III) 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB - scEDIII 유전자를 제공한다.
상기 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB)은 숙주 세포에 대한 결합 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 콜레라 독소는 A1 및 A2 서브유닛과 5개의 B 서브유닛이 결합한 형태의 복합체이며, 콜레라 독소의 내재화 및 활성화를 위해 CTB가 점막 면역계 (mucosal immune system)의 M 세포 (microfold cell)에 결합한다. 이때, CTB는 세포막 이중층의 GM1-갱글리오시드 (ganglioside)와 특이적으로 반응하여 결합한 후에 CTB에 결합되어 있는 A 서브유닛 또는 항원 단백질이 세포막을 통과하게 한다. CTB는 점막 장벽을 통과하는 결합 항원의 흡수 증가 및 결합 항원의 효율적인 제시를 통해 항원의 면역원성을 개선하여 점막 면역 강화를 위한 강력한 점막 면역 보조제 (adjuvant) 및 수송체 (carrier) 분자로서 이용될 수 있다.
상기 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III (EDIII)는 플라비바이러스 속 (genus Flavivirus)의 댕기 바이러스 및 다른 플라비바이러스 속에서 높게 보존되는 영역의 에피토프 (epitope)이다. 본 발명의 scEDIII는 4가지의 댕기 바이러스 (댕기-1, 댕기-2, 댕기-3 및 댕기-4)의 혈청형에 대해 항체 의존성 강화 (ADE)를 일으키지 않고, 유사한 정도의 중화 및 예방 효과를 제공할 수 있다.
용어 "에피토프 (epitope)"는 흔히 "항원 결정기" 또는 "중화 결정기"와 호환하여 사용된다. "에피토프"는 특정 항체에 의해 인식되는 항원결합 부위의 아미노산 잔기, 또는 T 세포에서 T 세포 수용체 단백질 및/또는 주요 조직적합성 복합체 (Major Histocompatibility Complex, MHC) 수용체에 의해 인식되는 잔기이다. 에피토프는 항체, T 세포 수용체 또는 HLA 분자에 의해 인식되는 부위를 형성하는 분자로, 일차, 이차 및 삼차 펩티드 구조, 또는 전하일 수 있다.
상기 CTB - scEDIII 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 CTB - scEDIII 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로 순서대로 벼 아밀라아제 3D (RAmy3D) 프로모터, RAmy3D 신호 펩티드 코딩 서열, CTB - scEDIII 융합 유전자 및 벼 아밀라아제 3D 유전자의 3' 비번역 부위 (3' UTR) 서열을 포함할 수 있으며, 더 바람직하게는 상기 재조합 벡터는 5'에서 3' 방향으로 순서대로 벼 아밀라아제 3D (RAmy3D) 프로모터, RAmy3D 신호 펩티드 코딩 서열, CTB 유전자 서열, Gly-Pro-Gly-Pro (GPGP) 연결 펩티드 코딩 서열, scEDIII 유전자 서열 및 벼 아밀라아제 3D 유전자의 3' 비번역 부위 (3' UTR) 서열을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 도 1A에 기재된 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 CTB - scEDIII 융합 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.
CTB - scEDIII 융합 유전자 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신 (kanamycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), G418, 블레오마이신 (Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 벼 아밀라아제 3D (RAmy3D), CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이며, 더 바람직하게는 단자엽 식물세포이며, 더욱 바람직하게는 벼이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자 총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 CTB - scEDIII 융합 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체에서 CTB-scEDIII 융합 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 CTB 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB - scEDIII 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 CTB-scEDIII 융합 단백질을 생산하는 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에서, 상기 CTB - scEDIII 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 유전자 총-매개 형질전환 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 CTB-scEDIII 융합 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
상기 식물체는 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직한 단자엽 식물은 택사과 (Alismataceae), 자라풀과 (Hydrocharitaceae), 지채과 (Juncaginaceae), 장지채과 (Scheuchzeriaceae), 가래과 (Potamogetonaceae), 나자스말과 (Najadaceae), 거머리말과 (Zosteraceae), 백합과 (Liliaceae), 지모과 (Haemodoraceae), 용설란과 (Agavaceae), 수선화과 (Amaryllidaceae), 마과 (Dioscoreaceae), 물옥잠과 (Pontederiaceae), 붓꽃과 (Iridaceae), 버먼초과 (Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과 (Commelinaceae), 곡정초과 (Eriocaulaceae), 화본과 (벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과 (Araceae), 개구리밥과 (Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과 (Typhaceae), 사초과 (방동사니과, Cyperaceae), 파초과 (Musaceae), 생강과 (Zingiberaceae), 홍초과 (Cannaceae) 또는 난초과 (Orchidaceae)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 화본과 (벼과)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB) 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB -scEDIII 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 식물체의 CTB-scEDIII 융합 단백질 대량 생산용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 CTB - scEDIII 융합 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 상기 조성물은 유효성분으로 CTB - scEDIII 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 댕기 바이러스 백신을 대량 생산할 수 있다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
용어 "면역원" 또는 "항원성 물질"은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 항원성 물질은 댕기 열 (dengue fever; DF), 댕기 출혈열 (dengue hemorrhagic fever; DHF) 또는 댕기 충격 증후군 (dengue shock syndrome; DSS) 등을 유발하는 댕기 바이러스일 수 있고, 더욱 바람직하게는 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB) 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB - scEDIII 유전자에 의해 발현되는 단백질일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 단백질 또는 상기 식물체를 유효성분으로 포함하는 댕기 바이러스 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 백신 조성물에서, 상기 백신은 바람직하게는 경구 백신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 백신 조성물은 본 발명의 형질전환 식물체에서 생산된 CTB-scEDIII 융합 단백질 추출물 또는 이의 농축액을 포함하는 형태이거나, 형질전환 식물 자체 또는 형질전환 식물체의 건조 분말 형태로 사용할 수 있다. 또한 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분으로서 식물의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 유효성분인 식물은 통상 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 특정한 최대 허용범위가 없이 면역 반응을 유도하는 수준으로 사용될 수 있다.
용어 "예방"은 본 발명의 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB) 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB-scEDIII 유전자를 발현하는 형질전환체, 상기 형질전환체에서 생산된 CTB-scEDIII 융합 단백질 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 댕기 바이러스 감염을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말하며, 용어 "치료"는 본 발명의 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB) 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB - scEDIII 유전자를 발현하는 형질전환체, 상기 형질전환체에서 생산된 CTB-scEDIII 융합 단백질 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 댕기 바이러스 감염 증상이 호전되는 모든 행위를 말한다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 바이러스 일부 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제2보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calciumcarbonate), 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 발현 벡터의 구축
4가지 댕기 바이러스 혈청형에 대한 교차-중화 활성 (cross-neutralizing activity)을 갖는 일치 댕기 바이러스 외피 단백질 도메인 III (103 aa)를 코딩하며 식물 최적화 코돈 사용빈도를 기반으로 변형된 scEDIII 유전자는 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB) 유전자에 유전적으로 융합되었다. CTB 유전자는 CTB - EDIII 유전자를 포함하는 pMYV498로부터 유전자 특이 프라이머 (정방향 프라이머 CTBFBG: 5'-AGA TCT ACA CCT CAA AAT-3'; 서열번호 2 및 역방향 프라이머 CTBRB: 5'-GC GGA TCC CGG GCC TGG GCC ATT-3'; 서열번호 3)를 사용하여 증폭되었다. 상기 프라이머는 용이한 서브클로닝을 위하여 각각 BglII 및 BamHI 자리 (밑줄)를 포함한다. PCR 산물은 pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI)에 클로닝 되었고, 그것의 서열은 DNA 서열 분석으로 확인되었다. CTB 유전자는 BglII 및 BamHI으로 자른 후, CTB - scEDIII 융합 유전자를 포함하는 플라스미드 (pMYV659)를 제작하기 위해 pMYV657의 BamHI 자리에 서브클로닝 되었다 (Kim et al ., 2012 Plant Cell Tiss Organ Cult 109:509-515). 벼 아밀라아제 3D 신호 펩티드를 포함하는 CTB - scEDIII 융합 유전자는 벼 아밀라아제 3D 유전자의 프로모터 및 3' 비번역 영역의 조절하에 있다. 유연한 Gly-Pro-Gly-Pro (GPGP) 연결 펩티드는 CTB와 cEDIII 단백질 사이에 위치한다 (도 1A).
2. 벼
캘러스
형질전환
벼 캘러스 (Oryza sativa L. cv. Dongin)를 준비하였고, 유전자 총-매개 형질전환 방법으로 벼 캘러스에 pMYV659를 형질전환시켰다. 3 내지 5일 후, 벼 캘러스는 2,4-D (2 mg/l), 수크로오스 (30 g/l), 프롤린 (0.5 g/l), 글루타민 (0.5 g/l), 카제인 효소 가수분해물 (0.3 g/l), 젤라이트 (2 g/l) 및 선별을 위한 항생제로 하이그로마이신 B (50 mg/l)가 첨가된 N6 선발 배지로 옮겼고, 2 내지 3주 동안 배양하였다.
3. 게놈
DNA
PCR
증폭
형질전환된 것으로 추정되는 (putative transgenic) 벼 캘러스 및 비-형질전환 벼 캘러스의 게놈 DNA는 ZymoBead™ Genomic DNA Kit (Zymo Research, Orange, CA)를 사용하여 정제되었고, 게놈 DNA PCR 분석에 사용되었다. 벼 캘러스에서 CTB - scEDIII 융합 유전자의 존재는 유전자 특이적인 정방향 프라이머 (CTBFBG) 및 역방향 프라이머 (5'-GGT ACC GGA GGA GCC CTT-3'; 서열번호 4)를 사용하여 측정되었다. 총 반응 부피 20 ul의 PCR 혼합물에는 100 ng의 게놈 DNA, 10 pmol의 프라이머, 200 μM의 dNTP, 1×Taq 폴리머라아제 버퍼 (1 mM Tris-Cl, pH 8.8, 5 mM KCl 및 0.01% Triton X-100), 1.5 mM MgCl2, 및 2 U i-Taq 폴리머라아제 (iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)가 포함되었다. 식물 발현 벡터 pMYV659 DNA (50 ng)가 양성 대조구로 사용되었고, 증폭된 DNA는 1.0% 아가로스 겔 전기영동으로 확인되었다.
4. 노던
블럿
분석
총 RNA는 당 결핍 조건 하에서 5일 동안 유도한 비-형질전환 및 형질전환 벼 캘러스 조직으로부터 Trizol Reagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH)를 이용하여 제조사의 지시에 따른 방법으로 추출했다. 30 ㎍의 총 RNA는 1.2% 포름알데하이드 (formaldehyde)-함유 아가로스 겔에서 확인한 후, Hybond-N+ 막 (AmershamPharmacia Biotech, Piscataway, NJ)으로 옮겼다. 블럿은 65℃의 혼성화 배양기 (Finemould Precision Ind., Seoul, Korea)를 사용하여, 변형된 Church 버퍼 (1 mM EDTA, 250 mM Na2HPO4·7H2O, 1% 가수분해된 카제인 및 7% SDS, pH 7.4) 내에서 32P-표지 random-primed (Promega) CTB-scEDIII 프로브로 밤새 혼성화되었다. 블럿은 65℃에서 각각 15분 동안 0.1% SDS가 첨가된 2×SSC 버퍼로 2회 및 1% SDS가 첨가된 2×SSC 버퍼로 2회 세척하였다. 혼성화된 밴드는 X-선 필름 (Fuji Photo Film Co. HR-G30, Tokyo, Japan)을 사용하여 자기방사법 (autoradiography)으로 검출되었다.
5.
웨스턴
블럿
분석
비-형질전환 및 형질전환 벼 캘러스는 CTB-scEDIII 융합 단백질을 검출하기 위해 웨스턴 블럿 분석으로 분석되었다. 형질전환 벼 캘러스는 당 결핍 조건 하에서 7일 동안 유도한 후 추출 버퍼 (200 mM TrisCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 400 mM 수크로오스, 10 mM EDTA, 14 mM 2-머캅토에탄올, 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) 및 0.05% Tween-20)를 이용하여 단백질을 추출하였다. Bradford 단백질 분석법 (Bio-Rad, Inc., Hercules, USA)으로 측정된 30 ㎍의 총 가용성 단백질 (TSP)은 5분 동안 끓인 후 또는 끓이지 않고 15% SDS-PAGE로 분리되었으며, SDS-PAGE는 트리스-글리신 버퍼 (25 mM Tris-Cl, 250 mM 글리신, pH 8.3 및 0.1% SDS)에서 120V로 2~2.5시간 동안 수행되었다. 분리된 단백질 밴드는 mini-transblot 장치 (Bio-Rad)를 사용하여 (150 mA, 2시간) SDS-PAGE 겔에서 Hybond-C 막 (Amersham Pharmacia Biotech RPN303C)으로 옮겨졌다. 비특이적 항체 결합은 5% 탈지분유가 포함된 TBS 버퍼 (20 mM TrisCl, pH 7.5 및 500 mM NaCl)로 블로킹했고, 이어서 TBS 버퍼로 5분 동안 세척하였다. 막은 TBST 항체 희석 버퍼 (0.05% Tween-20 및 2% 탈지분유가 포함된 TBS)에 1:5000으로 희석된 토끼 항-CT 항체 (Sigma, St. Louis, MO) 또는 1:2500으로 희석된 마우스 항-댕기 바이러스 항체 (Serotech, Oxford, UK)와 2시간 동안 반응시켰고, 이어서 TBST 버퍼 (0.05% Tween-20이 포함된 TBS)로 3회 세척하였다. 막은 1:5000으로 희석된 AP (alkaline phosphatase; Sigma) 결합 염소 항-토끼 또는 마우스 IgG와 2시간 동안 반응시켰다. 막은 TBST 버퍼로 2회 및 TMN 버퍼 (100 mM Tris-Cl, pH 9.5, 5 mM MgCl2 및 100 mM NaCl)로 1회 세척한 후, 미리 혼합된 BCIP/NBT 용액 (Sigma)을 사용하여 발색시켰다.
6.
G
M1
ELISA
현탁 배양에 사용하기 위한 CTB-scEDIII 융합 단백질이 고발현되는 형질전환 벼 캘러스 라인이 웨스턴 블럿 분석에 의해 선발되었다. 형질전환 벼 캘러스는 당 결핍 조건 하에서 7일 동안 유도된 후, 진공 펌프를 사용하여 수확되었다. 형질전환 벼 캘러스에서 생산된 CTB-scEDIII 융합 단백질의 생물학적 활성은 GM1-ELISA에 의해 검출되었다. 형질전환 및 비-형질전환 벼 캘러스 동결건조 분말 (건조 세포 중량 100 mg)은 냉각된 막자 및 막자사발을 이용하여 미세한 분말로 분쇄하였고, 총 가용성 단백질은 미세하게 분쇄된 벼 캘러스 분말에 추출 버퍼 (200 mM TrisCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 400 mM 수크로오스, 10 mM EDTA, 14 mM 2-머캅토에탄올, 1 mM PMSF 및 0.05% Tween-20)를 조금씩 첨가하여 추출하였다.
GM1-ELISA를 위해, 96웰 미세적정 (microtiter) 플레이트는 웰 당 100 ㎕의 모노시알로갱글리오시드 (monosialoganglioside) GM1 (3.0 ㎍/l)을 코팅하였고, 플라스틱 랩으로 덮은 후, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 웰은 PBST 버퍼 (0.05% Tween-20이 포함된 PBS)로 3회 세척하고, 1% BSA가 포함된 PBS 버퍼를 웰 당 300 ㎕ 첨가하여 비특이적 결합을 블로킹한 후, 37℃에서 2시간 동안 반응시켰고, 다시 PBST 버퍼로 3회 세척하였다. 총 가용성 단백질은 PBS 버퍼에 1:10으로 희석하였다. 표준물질로 사용된 상용 CTB (Sigma) 및 단백질 추출물을 순차적 희석하여 웰에 분주한 후 (100 ㎕/웰), 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 플레이트에 0.1% BSA를 포함하는 0.01 M PBS 버퍼에 1:5000으로 희석된 토끼 항-CT 항체 또는 1:2500으로 희석된 마우스 항-댕기 바이러스 항체를 분주하고 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, PBST 버퍼로 3회 더 세척하였다. 플레이트는 0.1% BSA 버퍼에 1:5000으로 희석된 AP 결합 염소 항-토끼 또는 마우스 IgG와 함께 반응시킨 후, PBST 버퍼로 3회 세척하였다. 플레이트는 100 ㎕의 AP 기질을 첨가하여 어두운 상태의 상온에서 12분 동안 발색시켰다. 흡광도는 SpectraCountTM (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL) ELISA 판독기를 사용하여 405 nm에서 측정하였다. 건조된 형질전환 벼 캘러스 유래의 생물학적으로 활성이 있는 CTB-scEDIII 융합 단백질의 수준은 항-CT 항체를 이용한 GM1-ELISA에 의해 계산되었다.
7. 시험관 내 및 생체 내 항원 흡수 분석
밤새 단식시킨 수컷 BALB/c 마우스 (Charles River Technology, MA, through Orient Bio., Sungnam, Korea)의 파이어판 (Peyer's patch)을 포함하는 장관 루프 (gut loop)가 시험관 내 CTB-scEDIII 융합 항원 결합 분석을 위해 사용되었다. 장관 루프는 얼음으로 냉각한 PBS 버퍼로 세척하였고, 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 고정시켰다. 조직은 2.5% BSA, 0.1% 글리신 및 항-마우스 CD16/32 항체/PBS를 처리하여 비특이적 결합을 블로킹하였고, 항원 결합을 위해 비-형질전환 및 형질전환 벼 캘러스의 단백질 추출물 (CTB-scEDIII 융합 단백질 50 ㎍)이 2시간 동안 처리되었다. 상기 조직은 Alexa Flour 350® 결합-WGA (Invitrogen, Carlsbad, CA), 로다민 (rhodamine)-표지 UEA-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 및 마우스 항-댕기 바이러스 항체에 이어서, FITC (fluorescein isothiocyanate)-결합 항-마우스 IgG (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)로 염색되었다. 그 후, 상기 조직은 공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM; LSM 510 META; Carl Zeiss, Thornwood, NY)을 사용하여 분석되었다.
수컷 BALB/c 마우스는 비-형질전환 벼 또는 CTB-scEDIII 융합 단백질을 포함하는 형질전환 벼 캘러스의 단백질 추출물을 10분 동안 경구적으로 투여한 후, 안락사시켰다. 마우스의 파이어판을 포함하는 장관 루프를 준비하였고, 얼음으로 냉각한 PBS로 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 2.5% BSA, 0.1% 글리신 및 항-마우스 CD16/32 항체/PBS로 비특이적 결합을 블로킹한 후, 상기 조직은 Alexa Flour 350® 결합-WGA, 로다민-표지 UEA-1 및 항-댕기 바이러스 항체에 이어서, FITC-결합 항-마우스 IgG로 염색되었고, CLSM으로 분석되었다.
실시예
1. 식물 발현 벡터의 구축 및 게놈
DNA
PCR
분석
댕기 바이러스 외피 당단백질의 일치 EDIII (scEDIII) 단백질을 코딩하는 유전자가 식물-최적화 코돈 사용빈도를 기반으로 합성되었으며, 이는 4가지 댕기 바이러스 혈청형에 대한 교차-중화 활성을 갖는 아미노산 서열로 추정되었다. 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB)을 코딩하는 유전자는 목적 단백질의 낮은 생산 수준에서 기인하는 낮은 면역 반응 및 면역 관용을 극복하기 위해 scEDIII 유전자의 N-말단에 융합되었다. CTB - scEDIII 융합 유전자는 당 결핍-유도성 프로모터인 RAmy3D 프로모터의 조절하에 있는 pMYV659 식물 발현 벡터에 삽입되었다. 벼 캘러스는 유전자 총-매개 형질전환 방법을 통해 발현 플라스미드로 형질전환되었고, 형질전환된 것으로 추정되는 캘러스는 하이그로마이신 하에서 선발되었다. 12개의 독립적인, CTB - scEDIII 융합 유전자를 갖는 것으로 추정되는 형질전환 벼 캘러스는 형질전환 2 내지 4주 후에 선발되었다. CTB - scEDIII 융합 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용한 게놈 DNA PCR 증폭 결과, 12개 형질전환 벼 캘러스 모두에서 신호 서열을 포함하는 CTB - scEDIII 유전자 크기에 해당하는 DNA 단편 (720 bp)이 검출되었다. 비-형질전환 벼 캘러스에서는 CTB - scEDIII 융합 유전자에 대한 DNA 밴드가 검출되지 않았다 (도 1B).
실시예
2. 형질전환 벼
캘러스에서
CTB
-
scEDIII
융합 유전자의 발현
CTB - scEDIII 융합 유전자의 전사는 32P-표지 CTB - scEDIII 융합 유전자 프로브를 사용한 노던 블럿 분석으로 형질전환 벼 캘러스에서 확인하였다. CTB -scEDIII 융합 유전자에 대한 양성 신호는 12개의 형질전환 벼 캘러스 라인에서 추출된 총 RNA 중 11개에서 검출되었고, 비-형질전환 벼 캘러스에서는 신호가 검출되지 않았다 (도 1C). 또한, CTB - scEDIII 융합 유전자에 대한 양성 신호 아래의 부가적인 밴드가 2개의 형질전환 라인 (레인 2 및 8, 도 1C)에서 검출되었는데, 이는 CTB -scEDIII 전사체의 절단형 (truncated form)일 것이다. 노던 블럿 분석에서 강한 신호를 나타내는 6개의 형질전환 벼 캘러스 라인이 CTB-scEDIII 융합 단백질의 생산을 위해 시험되었다. 항-CT 항체를 사용한 면역 블럿의 결과는 항-댕기 바이러스 항체의 면역 블럿과 동일한 양상을 나타냈고, 이는 CTB 및 cEDIII 단백질이 동일한 부위에 위치하며, 단일 단백질로 발현된다는 것을 나타낸다. 끓이지 않은 조건 하에서 항-CT 및 항-댕기 바이러스 항체를 사용한 면역 블럿의 결과는 2개의 주요 밴드 (약 130 kDa의 상단 밴드 및 약 95 kDa의 하단 밴드)를 보여준다 (도 2A 및 2B). 끓이는 조건 하에서도, 2개의 밴드가 형질전환 벼 캘러스 라인에서 검출되었다 (도 2C 및 2D). 비-형질전환 벼 캘러스 단백질 추출물에서는 CTB-scEDIII 융합 단백질에 해당하는 밴드가 검출되지 않았다.
실시예
3. CTB-scEDIII 융합 단백질의 생물학적 활성 측정 및 정량
형질전환 벼 캘러스 라인 #12는 웨스턴 블럿 분석에 기초하여 가장 높은 CTB-scEDIII 융합 단백질 수준을 갖기 때문에, 생물학적 활성 및 발현 수준의 측정을 위해 선발하였다. 항원의 면역원성은 운반체 및 면역 보조제로 작용하는 CTB와 결합될 때, 점막 장벽을 통과하는 결합 항원의 흡수 증가 및 장 점막 면역 세포에 의한 결합 항원의 효율적인 제시에 의해 향상될 수 있다. GM1-갱글리오시드에 CTB 융합 단백질의 결합은 융합 단백질의 내재화 (internalization) 및 활성화를 위해 필요하다. 형질전환 벼 캘러스는 당 결핍 조건 하에서 7일 동안 유도된 후 동결건조되었고, 동결건조된 형질전환 벼 캘러스에서 CTB-scEDIII 융합 단백질의 GM1 결합 활성은 항-CT 및 항-댕기 바이러스 항체를 사용하여 확인하였다 (도 3A 및 3B). 이는 생물학적 활성을 갖는 식물 생산 CTB-scEDIII 융합 단백질이 성공적으로 발현되는 것을 나타낸다. GM1-ELISA는 동결건조된 형질전환 벼 캘러스에서 CTB-scEDIII 융합 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해 사용되었다. CTB-scEDIII 융합 단백질의 양은 알려져 있는 박테리아 CTB의 양과 비교하여 계산되었다. CTB-scEDIII 단백질의 발현 수준은 항-CT 항체를 사용한 GM1-ELISA 분석에 의해 약 0.68 mg/g 동결건조된 벼 캘러스인 것으로 측정되었다.
실시예
4. 파이어판의 M 세포에
CTB
-
scEDIII
융합 단백질의 결합
M 세포 (microfold cell)는 점막 면역계의 전문화된 항원 샘플링 상피 세포 (specialized antigen sampling epithelial cell)이다. 따라서 Peyer's patch에 대한 CTB-scEDIII 융합 단백질의 결합 능력은 마우스 모델에서 M 세포 결합 분석으로 확인하였다. 형질전환 벼 캘러스에서 발현된 기능적 CTB-scEDIII 융합 단백질의 M 세포 특이적 표적화 능력은 형광 현미경을 이용하여 UEA-1+WGA- M 세포에 대해 측정하였다. 파이어판 조직은 50 ㎍의 CTB-scEDIII 융합 단백질을 함유하는 형질전환 벼 캘러스 단백질 추출물과 함께 배양하였다. 붉은색은 로다민-표지 UAE1과만 결합한 UEA-1+WGA- M 세포를 나타내고, 보라색은 로다민-표지 UAE1 (붉은색) 및 Alexa Flour 350® 결합-WGA (푸른색)와 결합한 장세포 (enterocyte)를 나타내고, 노란색은 M 세포 (붉은색)에 결합한 CTB-scEDIII 융합 단백질 (FITC-결합 항-마우스 IgG, 녹색)을 나타내며, 흰색은 장세포 (보라색)에 결합한 CTB-scEDIII 융합 단백질 (녹색)을 나타낸다. 시험관 내 및 생체 내 분석에서, 노란색 및 흰색 검출은 CTB-scEDIII 융합 단백질이 파이어판의 M 세포 및 장세포에 결합한다는 것을 나타낸다 (도 4). 녹색 또한 노란색과 함께 검출되었으며, 이는 CTB-scEDIII 융합 단백질이 M 세포에 결합한다는 것을 나타낸다. 녹색 점을 갖는 CTB-scEDIII 융합 단백질은 파이어판의 장세포에 널리 퍼져있다. 파이어판의 M 세포 또는 장 세포는 cEDIII 단독으로 또는 비-형질전환 벼 캘러스 단백질 추출물과는 상호작용이 없었다 (도 4).
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY
<120> Fusion protein vaccine containing cholera toxin B subunit and
virus antigen protein, transgenic plant expressing CTB fusion
antigen gene, and uses thereof
<130> PN12350
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTB-scEDIII fusion gene
<400> 1
acacctcaaa atattactga tttgtgtgca gaataccaca acacacaaat acatacgcta 60
aatgataaga tattttcgta tacagaatct ctagctggaa aaagagagat ggctatcatt 120
acttttaaga atggtgcgac ttttcaagta gaagtaccag gtagtcaaca tatagattca 180
caaaaaaaag cgattgaaag gatgaaggat accctgagga ttgcatatct tactgaagct 240
aaagtcgaaa agttatgtgt atggaataat aaaacgcctc atgcgattgc cgcaattagt 300
atggcaaatg gcccaggccc gggatccaag ggcatgtcct acgctatgtg caccggcaag 360
ttcaagttgg agaaggaggt ggctgagacc cagcacggca ccatcttgat caaggtgaag 420
tacgagggcg atggcgctcc ttgcaagatc cctttcgaga tccaggatgt ggagaagaag 480
cacgtgaacg gaaggttgat caccgctaac cctatcgtga ccgataagga gtcccctgtg 540
aacatcgagg ctgagcctcc tttcggcgat tcctacatcg tgatcggcgt gggcgataag 600
gctttgaagt tgaactggtt caagaagggc tcctccggta cc 642
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
agatctacac ctcaaaat 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 3
gcggatcccg ggcctgggcc att 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
ggtaccggag gagccctt 18
Claims (11)
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 콜레라 독소 B 서브유닛 (cholera toxin B subunit; CTB) 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III (synthetic consensus dengue virus envelope protein domain III) 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB - scEDIII 유전자.
- 제1항의 CTB - scEDIII 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제2항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 5'에서 3' 방향으로 순서대로 벼 아밀라아제 3D (RAmy3D) 프로모터, RAmy3D 신호 펩티드 코딩 서열, CTB - scEDIII 융합 유전자 및 벼 아밀라아제 3D 유전자의 3' 비번역 부위 (3' UTR) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제2항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 제2항의 재조합 벡터를 식물체에 도입하여 CTB - scEDIII 융합 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체에서 CTB-scEDIII 융합 단백질을 대량 생산하는 방법.
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, CTB 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB - scEDIII 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 CTB-scEDIII 융합 단백질을 생산하는 식물체의 제조 방법. - 제6항의 방법에 의해 제조된 CTB-scEDIII 융합 단백질을 생산하는 식물체.
- 제7항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB) 유전자와 댕기 바이러스 외피 당단백질 도메인 III 단백질을 코딩하는 합성 유전자 scEDIII가 융합된 CTB - scEDIII 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 식물체의 CTB-scEDIII 융합 단백질 대량 생산용 조성물.
- 제5항의 방법에 의해 제조된 단백질 또는 제7항의 식물체를 유효성분으로 포함하는 댕기 바이러스 (dengue virus) 백신 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 백신은 경구 백신인 것을 특징으로 하는 댕기 바이러스 백신 조성물.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020130002649A KR101566002B1 (ko) | 2013-01-09 | 2013-01-09 | 콜레라 독소 b 서브유닛과 바이러스 항원 단백질의 융합 항원 단백질 백신, 이를 발현하는 식물체 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20140090502A KR20140090502A (ko) | 2014-07-17 |
| KR101566002B1 true KR101566002B1 (ko) | 2015-11-05 |
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Family Applications (1)
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| KR (1) | KR101566002B1 (ko) |
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| KR102524247B1 (ko) * | 2018-12-21 | 2023-04-21 | 가톨릭대학교 산학협력단 | p40-EBI3의 복합체 및 이의 용도 |
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-
2013
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), June 2012, Volume 109, Issue 3, pp 509-515 |
| Protein Expression and Purification, Volume 74, Issue 2, December 2010, Pages 236-241 |
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| KR20140090502A (ko) | 2014-07-17 |
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