KR102013801B1 - Ｈｐｖ 키메라 입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약 30 nm의 직경을 갖는 인간 파필로마바이러스 (HPV) 바이러스 유사 입자 (VLP)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개체에 대한 본 발명의 키메라 HPV VLP의 투여에 의해 HPV 감염 및/또는 자궁경부암의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.

Description

ＨＰＶ 키메라 입자{HPV chimaeric particle}
본 발명은 약 30 nm의 직경을 갖는 키메라 인간 파필로마바이러스 (HPV) 바이러스 유사 입자 (VLP) 및 본 발명의 키메라 HPV VLP의 투여에 의한 HPV 감염 및/또는 자궁경부암의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.
자궁경부암은 주로 HPV 감염에 의해 유발되고 전세계적으로 여성들 사이에서 3번째로 가장 보편적인 암이다 (Ferlay et al., 2010). 그 결과, HPV 백신 개발은 예방적 암 연구를 위한 우선과제이다. L1 주요 캡시드 단백질(major capsid protein)은 면역우성(immunodominant)이고 구조적으로 및 면역학적으로 실제 비리온과 유사한 VLP로 자가-조립되므로, 예방 백신을 위해 선택되는 항원이다. VLP에 의한 백신접종은 동물과 인간에서 중화 항체 (NAb)의 높은 역가를 유발하며 2개의 다가(multivalent) HPV L1 VLP-기반 예방 백신이 허가를 받았고 백신-유형 HPV-16 및 18 감염 및 관련 질환의 예방에 있어서 매우 효과적이다 (Schiller et al., 2008).
현재 L1 VLP-기반 HPV 백신의 높은 효능에도 불구하고, 타입-특이성 (Brown et al., 2009; Wheeler et al., 2009), 치료 효능의 결여 (FUTURE II Study Group, 2007; Hildersheim et al., 2007) 및 백신의 고비용 (Schiller et al., 2008)은, 특히 자궁경부암 부담(burden) 중 >80%를 갖는 개발도상국에서 그의 폭넓은 적용을 제한하였다 (Parkin and Bray, 2006). 그러므로, 다수의 발암성 HPV 타입을 포함하도록 보호를 넓히고, 확립된 HPV 감염과 암성 병변을 제거(clear)하기 위해 치료 효능을 향상시키는, 입수가능한 제2 세대 HPV 백신에 대한 긴급한 요구가 존재한다.
광범위-스펙트럼 예방 HPV 백신이 L2 에피토프를 교차 중화시키는 것을 이용하여 개발될 수 있다. L2 에피토프는 L1의 표면 부위에 포함되어, 조립된 L1의 표면에 L2 펩티드를 나타내는 L1/L2 키메라를 생성할 수 있다 (WO 03/097673; Kawana et al., 1999, 2003; Slupetzky et al., 2007; Kondo et al., 2007, 2008).
외래 항원의 대규모 생산을 위한 식물 발현 시스템의 이용이, 고-수준 단백질 발현 및 최적화를 위한 일시적 발현의 이용을 향한 뚜렷한 경향과 함께 (Rybicki, 2009), 백신 생산에 있어서 비용-효과적인 대안으로 제안되었다 (Fischer et al., 2004). 여러 그룹이 식물에서 HPV-16 L1을 발현시켰다 (Biemelt et al., 2003; WO 2006/119516; Maclean et al., 2007).
식물 시스템의 실제적인 한계는, 잠재적으로 단백질 불안정성 또는 낮은-수준의 발현의 결과인, 재조합 단백질의 낮은 수율이다 (Fischer et al., 2004; Obembe et al., 2011). 식물-발현 재조합 단백질 수율은, 경제적으로 실현 가능해지기 위하여 총 가용성 단백질 (TSP) 중 1%를 초과할 필요가 있는 것으로 추정된다 (Fischer et al., 2004). 이는 이들 시스템이 종종 재조합 단백질의 낮은 수율과 연관되어 있으므로, 핵-형질전환된 식물(nuclear-transformed transgenic plant)을 이용한 재조합 단백질의 발현에 있어서 특히 문제가 된다 (Rybicki, 2009).
HPV-16 L1은 핵-형질전환된 감자 및 담배 식물에서 형질전환에 의해 발현되었으나, 일관되게 HPV-16 L1의 낮은 발현 수준 (<1% TSP)이 보고되었고 유발된 면역 반응은 상대적으로 약했다 (Biemelt et al., 2003; Varsani et al., 2003b; Varsani et al., 2006a).
그러나, L1 유전자의 인간 코돈-최적화와 엽록체로의 표적화는, 형질전환 및 아그로박테리움-매개 일시적 담배 발현 시스템에서, 약 17% TSP까지 HPV-16 L1 발현을 유의하게 향상시켰다 (Maclean et al., 2007).
식물-유래 HPV 백신에서 최근의 발달은 식물에서 최초의 HPV-16 L1 키메라의 발현이었다. L1/E6/E7 키메라는 수 개의 E6 및 E7 에피토프에 C-말단에서 융합된 HPV-16 L1로 구성되었고, 형질전환 토마토에서 발현되었다 (Paz De la Rosa et al., 2009). 그러나 수율이 낮았으므로 (0.05 - 0.1% TSP) 상업적으로 실현 가능하지 않았다.
WO 2011/077371은 곤충, 식물 또는 효모 발현 시스템에서 HPV L1 단백질에 비해 증가된 발현 수준을 갖는 키메라 HPV L1 폴리펩티드를 생산하는 방법을 기술한다. 식물의 HPV L1 및 BPV L2 (아미노산 1-88)로부터 생성된 인간 코돈-최적화 L1/L2 키메라는 약 55 nm의 VLP를 형성하였으나, 나머지 HPV L1/L2 키메라는 단지 직경이 약 17 nm인 캡소미어(capsomere)를 형성할 수 있었다.
캡소미어가 실온에서 안정함에도 불구하고, 그것은 단지 VLP와 비교하여 20 내지 40배 더 낮은 체액성 면역반응을 유도할 수 있다 (Thones et al., 2008). 그러므로, 발현 시스템에서 상업적으로 실현 가능한 수준으로 발현되는 L1 및 L2를 포함하는 키메라 VLP를 개발하는 것이 유용할 것이다. 그와 같은 키메라 VLP는 정제하기 더 용이할 것이고 키메라 캡소미어에 비해 더 높은 면역원성을 가질 것이다.
발명의 요약
본 발명의 제1 양태에 따르면, 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드는, HPV 16 L1 폴리펩티드의 414번 잔기부터 삽입된 약 13개 아미노산 내지 약 26개 아미노산의 HPV L2 펩티드를 포함하는 HPV 16 L1 폴리펩티드를 더 포함하고, 상기 삽입된 HPV L2 펩티드의 아미노산은 HPV 16 L1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산을 치환하는 것인, 약 30 nm의 직경의 크기를 갖는 키메라 인간 파필로마바이러스 (HPV) 바이러스 유사 입자 (VLP)가 제공된다.
예를 들면, 상기 삽입된 HPV L2 펩티드는, 서열번호 7에 기재된 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 13개 아미노산 LVEETSFIDAGAP 펩티드 (서열번호 3), 또는 서열번호 9에 기재된 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 20개 아미노산 QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV 펩티드 (서열번호 5), 또는 서열번호 8에 기재된 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 26개 아미노산 GGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPT 펩티드 (서열번호 4)일 수 있다.
바람직하게는, 상기 삽입된 HPV L2 펩티드는, 서열번호 7에 기재된 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 13개 아미노산 LVEETSFIDAGAP 펩티드 (서열번호 3)이다.
또한, HPV 타입 16 L1 단백질은 핵 위치화 신호(nuclear localisation signal)가 결여되도록 변형된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
바람직하게는, HPV-16 L1/L2 폴리펩티드는 서열번호 22, 서열번호 23 또는 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다.
바람직하게는, HPV-16 L1 폴리펩티드는 서열번호 1에 기재된 것과 같고 HPV-16 L1 폴리펩티드는 서열번호 2에 기재된 인간 코돈-최적화 HPV-16 L1 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
약 30 nm 직경의, 키메라 HPV VLP는 식물 발현 시스템으로부터 정제된 식물 발현 키메라 HPV VLP일 수 있다. 바람직하게는, 발현되는 키메라 VLP는 식물의 엽록체로 표적화될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본 발명에 따른 30 nm 직경의 키메라 HPV VLP 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또한, 이 조성물은 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면,
(i) 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드의 414번 잔기부터 삽입된 약 13개 아미노산 내지 약 26개 아미노산의 HPV L2 펩티드를 갖는 HPV 16 L1 폴리펩티드를 포함하고, 상기 삽입된 HPV L2 펩티드의 아미노산은 HPV 16 L1 폴리펩티드의 상응하는 아미노산을 치환하는 것인, 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드를 코딩하는 키메라 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계;
(ii) 상기 키메라 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열을 식물에서 폴리펩티드를 발현시키도록 개조된(adapted) 발현 벡터로 클로닝하는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 발현 벡터에 의해 식물 세포를 형질전환 또는 주입(infiltrate)시키는 단계;
(iv) 단계 (iii)의 식물 세포에서 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드를 발현시켜, 발현되는 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드가 균일한 형태 및 약 30 nm의 직경을 갖는 키메라 HPV VLP로 조립되게 하는 단계; 및
(v) 상기 식물 세포로부터 키메라 HPV VLP를 회수하는 단계를 포함하는, 약 30 nm의 크기를 갖는 키메라 HPV VLP를 생산하는 방법이 제공된다.
바람직하게는, 발현 벡터는 발현 벡터의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 기타 조절 서열 등을 포함한다.
바람직하게는, 단계 (ii)의 발현 벡터는 식물 세포의 엽록체로 표적화되도록 개조되고 단계 (iv)에서 발현되는 키메라 HPV 단백질은 식물 엽록체로 표적화된다.
단계 (iii)은 식물에서 전사 후 유전자 침묵(post-transcriptional gene silencing)을 억제하도록 개조된 억제자(suppressor) 단백질을 식물 세포로 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 억제자 단백질은 토마토 반점 위조 바이러스(tomato spotted wilt virus)의 NSs 단백질 또는 토마토 덤불 성장위축 바이러스(tomato bushy stunt virus)의 p19이다.
예를 들면, 삽입되는 HPV L2 펩티드는, 서열번호 7에 기재된 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 13개 아미노산 LVEETSFIDAGAP 펩티드 (서열번호 3), 또는 서열번호 9에 기재된 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 20개 아미노산 QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV 펩티드 (서열번호 5), 또는 서열번호 8에 기재된 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 26개 아미노산 GGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPT 펩티드 (서열번호 4)일 수 있다.
바람직하게는, 삽입되는 HPV L2 펩티드는, 서열번호 7에 기재된 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 13개 아미노산 LVEETSFIDAGAP 펩티드 (서열번호 3)이다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 개체에서 HPV 감염 및/또는 자궁경부암을 예방 및/또는 치료하는 방법에 이용하기 위한, 본 발명에 따른 약 30 nm 직경의, 키메라 HPV VLP가 제공된다.
보다 구체적으로, 상기 키메라 HPV VLP는 개체에서, 중화 항체 및/또는 CTL 반응과 같은, 면역 반응을 유발하는 방법에서 이용하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는, 키메라 HPV VLP는 개체에서 다수의 HPV 타입에 대한 교차-보호성(cross-protective) 면역 반응을 유발하는데 이용하기 위한 것이다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 개체에서 HPV 감염 및/또는 자궁경부암을 예방 및/또는 치료하는 방법에 이용하기 위한 의약의 제조에 있어서, 본 발명에 따른, 규칙적 형태이고(regularly shaped), 약 30 nm 직경인, 키메라 HPV VLP의 용도가 제공된다.
보다 구체적으로, 이 의약은 개체에서, 중화 항체 및/또는 CTL 반응과 같은, 면역 반응을 유발하는 방법에 이용하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는, 이 의약은 개체에서 다수의 HPV 타입에 대한 교차-보호성 면역 반응을 유발하는데 이용하기 위한 것이다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 개체에게 본 발명에 따른, 균일한 형태이고, 약 30 nm 직경인, 키메라 HPV VLP의 예방적(prophylactically) 또는 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 HPV 감염 및/또는 자궁경부암을 예방 및/또는 치료하는 방법이 제공된다.
보다 구체적으로, 이 방법은 개체에서, 중화 항체 및/또는 CTL 반응과 같은, 면역 반응을 유발하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이 방법은 개체에서 다수의 HPV 타입에 대한 교차-보호성 면역 반응을 유발하는 단계를 포함한다.
이 개체는 바람직하게는 인간이다.
본 발명은, 본 발명의 모든 구체예가 아닌 일부 구체예가 표시된, 수반되는 도면을 참조하여 하기에 보다 완전하게 기술될 것이다.
기술된 바와 같은 본 발명은 개시된 특정 구체예 및 변형에 한정되어서는 안되며 기타의 구체예가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 특정 용어가 본 명세서에서 사용되지만, 그 용어는 단지 일반적이고 서술하는 의미로 사용되며 한정의 목적으로 사용되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 달리 지시되지 않는 한, 당해 기술 분야에서 인식되는 그의 의미를 갖는다.
본 발명은 규칙적인 형태와 약 30 nm 직경의 크기를 갖는 키메라 인간 파필로마바이러스 (HPV) 바이러스 유사 입자 (VLP) 및 본 발명의 키메라 HPV VLP의 투여에 의한 HPV 감염 및/또는 자궁경부암의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 특히, 규칙적인 형태이고 30 nm 직경인 키메라 HPV VLP는, 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 약 13개 아미노산 내지 약 26개 아미노산의 HPV L2 펩티드가 414번 아미노산 잔기에서 삽입되어, 상응하는 HPV L1 아미노산을 치환시키는 것인 HPV 타입 16 L1 단백질을 포함한다.
L1 주요 캡시드 단백질은 바이러스-유사 입자 (VLP)로 자발적으로 자가-조립되고, 이는 현존하는 HPV 예방 백신의 기초를 형성한다 (Schiller et al., 2008). 재조합 VLP는 포유동물, 곤충, 효모, 세균 및 식물을 포함한, 여러 다양한 숙주 시스템에서 발현되었다.
HPV-16 L1 C-말단 헬릭스 4 (h4)는 VLP 조립에서 역할을 수행하고 414번 내지 426번 잔기에 위치한다 (Varsani et al., 2003a). 이 모티프의 제거는 캡소미어 형성을 초래하고 추가의 VLP로의 자가-조립을 방지한다 (Bishop et al., 2007). 또한, 고도로 보존된 시스테인 잔기 175와 428 간의 이황화결합이 존재하고, 이들 시스테인의 돌연변이는 VLP 대신에 캡소미어의 형성을 초래한다 (Li et al., 1998; McCarthy et al., 1998; Sapp et al., 1998; Fligge et al., 2001; Varsani et al., 2006b). 그러나, 이 연구에서, 414번 아미노산 잔기에 삽입될 경우, 그로 인해 상응하는 HPV L1 아미노산을 치환시키는, 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 약 13개 아미노산 내지 약 26개 아미노산의 HPV L2 펩티드의 삽입은, 작고 규칙적인 형태의, 약 30 nm 직경인 키메라 VLP로 성공적으로 조립될 수 있는 것을 확인했다.
상용 HPV 백신 (현재 효모 또는 곤충 세포에서 발현됨)은, 부분적으로는 고비용의 생산 및 정제 프로토콜의 결과로 비싸다 (Schiller et al., 2008). 또한, 복잡한 정제 방법 및 대규모 전-처리는 조립된 L1 단백질의 안정성 및 회수에 영향을 미칠 수 있고 변성된 L1은 중화 항체를 유도하지 않는다. 그 결과, 낮은 비용의 발현 시스템을 이용한, 백신 항원의 생산과 단순한 생산 및 정제 방법은 모든 상용 단백질 생산 시스템에 있어서 높은 우선순위를 유지한다.
본 발명은 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되지 않는 하기 실시예에 의해 기술될 것이다.
도 1은 HPV 키메라 식물 발현 구조체(construct)를 제조하는데 이용되는 플라스미드를 나타낸다. C) pGA4 구조체로부터 얻은 HPV 키메라 유전자를 아그로박테리움 식물 발현 벡터: A) pTRAkc-rbcs1-cTP, B) pTRAc 및 D) pRIC3로 방향성 있게(directionally) 서브클로닝되었다. 식물 발현에 필요한 벡터 요소가 도면에 표시된다. P35SS: 중복된 전사 인핸서(duplicated transcriptional enhancer)를 포함하는 CaMV 35S 프로모터, CHS: 칼콘 신타제(chalcone synthase) 5' 비번역 영역, pA35S: 외래 유전자 발현을 위한 CaMV 35S 폴리아데닐화 신호, ColE1ori: E. coli 복제 기점, RK2ori: 아그로박테리움(Agrobacterium) 복제 기점, bla: 암피실린/카르베니실린-저항성 유전자, 및 LB/RB: T-DNA 통합을 위한 좌우 보더(border). pTRAc 벡터는 SAR: 발현 카세트를 플링킹(flanking) 하는 담배 Rb7 스캐폴드 부착 영역(scaffold attachment region)을 포함한다. 또한, pTRAkc-rbcs1-cTP 벡터는 npt II: 카나마이신-저항성 유전자, Pnos/pAnos: 노팔린 신타제(nopaline synthase) 유전자의 프로모터/폴리아데닐화 신호 및 rbcs1-cTP: 솔라눔 튜베로숨(Solanum tuberosum) 루비스코(Rubisco) 소형-서브유닛(small-subunit) 유전자 rbcS1의 엽록체-운반(chloroplast-transit) 펩티드 서열을 포함한다. pRIC3 벡터는 LIR: BeYDV 긴 길이의 유전자 간 영역(long intergenic region), SIR: BeYDV 짧은 길이의 유전자 간 영역, 및 Rep/RepA: BeYDV rep 유전자를 포함한다.
도 2는 NSs 침묵 억제자의 존재 (+) 또는 부재 (-)하에, 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)에서 엽록체-표적화 L1/L2 키메라 발현 시간 시험(time trial) 1-9 주입후 일 수 (days post-infiltration: dpi)를 나타낸다. 잎의 조 추출물 중 L1/L2 키메라 A) L1/L2(108-120), B) L1/L2(56-81), C) L1/L2(17-36) 및 D) L1/L2 BPV (1-88)를 CamVir1 웨스턴 블랏 분석에 의해 검출했다. M = 좌측에 표시된 kDa 크기를 갖는 단백질 마커. NSs 음성 대조군 = pBIN-NSs 주입된 식물 조 추출물 (5 dpi). 양성 대조군: 니코티아나 벤타미아나 (+) = 식물-유래 HPV-16 L1. 검은 화살표는 L1/L2 키메라 (~56 kDa)의 위치를 표시하고 회색 화살표는 분해된 단백질을 표시한다.
도 3a)는 3개의 식물 발현 벡터: pTRAc, pTRAkc-rbcs1-cTP 및 pRIC3을 이용하여 발현된 L1/L2 키메라의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 키메라는 NSs와 공동-발현되고, 5 dpi에 추출되고 CamVir1에 의해 검출되었다. HPV-16 L1은 pTRAc 및 pTRAkc-rbcs1-cTP (pRIC3 구조체는 입수가능하지 않음)에 대한 양성 발현 대조군으로 발현되고 음성 발현 대조군은 NSs-주입된 식물이었다. M = 좌측에 kDa으로 표시된 단백질 크기를 갖는 단백질 마커. 검은 화살표는 L1/L2 키메라 또는 HPV-16 L1 (~56 kDa)을 표시하고; b)는 3개의 식물 발현 벡터: pTRAc, pTRAkc-rbcs1-cTP 및 pRIC3을 이용하여 발현된 L1/L2 키메라의 비교를 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다.
도 4는 3개의 상이한 식물 발현 벡터: pTRAc, pTRAkc-rbcs1-cTP 및 pRIC3를 이용하여 발현된 L1/L2 키메라의 조립(assembly)을 나타낸다. 단백질은 NSs 침묵 억제자와 공동-발현되고 5 dpi에 추출되었다. 캡소미어 또는 VLP와 같은 보다 높은-차원의(higher-ordered) 구조로 조립된 키메라 (입체형태-특이적 H16.V5 MAb에 의해 검출됨)가 총 키메라 단백질 (선형-특이적 H16.J4 MAb에 의해 검출됨) 중 퍼센트로 발현된다. HPV-16 L1은 양성 발현 대조군으로 표시되고 음성 발현 대조군은 NSs-주입된 식물이었다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다.
도 5는 식물-생산 백신 항원의 순도를 나타낸다. A) 쿠마시(Coomassie)-염색된 단백질 겔. B) HPV 항원의 웨스턴 블롯 검출. M = 좌측에 kDa으로 표시된 크기를 갖는 단백질 마커. C = 정화된(clarified) 식물 조 추출물. P = 정제된 항원. V1 = L1/L2(108-120), V2 = L1/L2(56-81), V3 = L1/L2(17-36), V4 (+) = HPV-16 L1 및 V5 (-) = NSs-주입된 식물 추출물. 흑색 화살표는 HPV 항원을 표시하고 백색 화살표는 식물 단백질 루비스코를 표시한다.
도 6은 조 시료 및 정제 시료에 존재하는 총 가용성 단백질 (TSP) 및 총 HPV 단백질을 나타낸다. Lowry 분석을 이용하여 TSP를 결정하고 HPV 단백질을 (선형 에피토프-특이적) H16.J4에 의해 검출하였다. V1: L1/L2(108-120), V2: L1/L2(56-81), V3: L1/L2(17-36), V4: HPV-16 L1 (양성 대조군), V5: NSs 식물 추출물 (음성 대조군). 오차 막대는 표준 편차를 표시한다.
도 7은 CamVir1-면역트래핑된(immunotrapped) 조 백신 항원 및 정제된 백신 항원 A) V1: L1/L2(108-120), B) V2: L1/L2(56-81), C) V3: L1/L2(17-36), D) V4: HPV-16 L1 (양성 대조군), E) V5: NSs 식물 추출물 (음성 대조군)의 투과 전자 현미경 사진을 나타낸다. 그리드(grid)가 Zeiss 912 Omega Cryo EFTEM 상에서 관찰되었다. 좌측 스케일 막대 = 50 nm, 우측 스케일 막대 = 200 nm. 옅은 회색 화살표는 HPV-16 캡소미어 (~10 nm)를 나타내고, 백색 화살표는 캡소미어 응집체 또는 소형 VLP (~30 nm)를 나타내고 짙은 회색 화살표는 전체-크기의(full-sized) VLP (~55 nm)를 나타낸다.
도 8은 CamVir1-면역트래핑된 조 백신 항원 L1/L2(56-81)의 투과 전자 현미경 사진을 나타낸다. 그리드가 Zeiss 912 Omega Cryo EFTEM 상에서 관찰되었다. 스케일 막대 = 100 nm.
도 9는 곤충 세포-생산 HPV-16 L1을 코팅 항원으로 이용한, 쥐 혈청의 직접 경합(direct) ELISA를 나타낸다. V1 = L1/L2(108-120), V2 = L1/L2(56-81), V3 = L1/L2(17-36), V4 = HPV L1 (+ 백신 대조군), V5 = 식물 추출물 (- 백신 대조군). A) 모든 백신에 대한 쥐 항혈청의 적정. B) ELISA 양성 대조군 MAb H16.V5 및 CamVir1에 대하여 얻어진 값을 나타내는 그래프. C) 1:50 희석도에서 백신 사전-채혈(pre-bleed) 흡광도 값. 마커는 3개의 반복 시료의 평균값을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 10은 1:100의 희석도에서 쥐 혈청에 의한 E. coli-발현 His-태깅(tagged) HPV-16 L2의 웨스턴 블롯 검출을 나타낸다. M = kDa의 단백질 크기를 갖는 단백질 마커. V1 = L1/L2(108-120), V2 = L1/L2(56-81), V3 = L1/L2(17-36), V4 = HPV L1 (+ 백신 대조군), V5 = 식물 추출물 (- 백신 대조군). PB = 사전-채혈 혈청. FB = 최종 채혈 혈청. 웨스턴 블롯 대조군에 대하여: +ve = 쥐 항-His (1:2000; Serotec), -ve = 1차 항체 부재. 흑색 화살표는 L2 (~80 kDa)를 나타낸다.
도 11은 HPV-16 PsV 중화 분석을 나타낸다. V1-V5에 의해 백신접종된 쥐로부터 얻은 풀링된 혈청(pooled sera)에 대하여 HPV-16 PsV를 중화시키는 능력을 시험하였다. A) V1 = L1/L2(108-120), B) V2 = L1/L2(56-81), C) V3 = L1/L2(17-36), D) V4 = HPV-16 L1 (+ve 백신 대조군), E) V5 = NSs-주입된 식물 추출물 (-ve 백신 대조군). F) H16.V5 = +ve 중화 대조군. 세포 대조군 = - ve 감염 /SEAP 발현 대조군. PsV 대조군 = +ve 감염 /SEAP 발현 대조군. 시료를 3회 반복 분석하였고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 12는 HPV-18 PsV 중화 분석을 나타낸다. A) V1 = L1/L2(108-120), B) V2 = L1/L2(56-81), C) V3 = L1/L2(17-36), D) V4 = HPV-16 L1, E) V5 = NSs-주입된 식물 추출물 (-ve 백신 대조군). F) 토끼 항-Cervarix 혈청 = +ve 중화 대조군.
도 13은 HPV-45 PsV 중화 분석을 나타낸다. A) V1 = L1/L2(108-120), B) V2 = L1/L2(56-81), C) V3 = L1/L2(17-36), D) V4 = HPV-16 L1, E) V5 = NSs-주입된 식물 추출물 (-ve 백신 대조군). F) H45.N5 = +ve 중화 대조군.
도 14는 HPV-52 PsV 중화 분석을 나타낸다. A) V1 = L1/L2(108-120), B) V2 = L1/L2(56-81), C) V3 = L1/L2(17-36), D) V4 = HPV-16 L1, E) V5 = NSs-주입된 식물 추출물 (-ve 백신 대조군). F) H52.C1 = +ve 중화 대조군.
도 15는 HPV-16 L1의 아미노산 (서열번호 1)을 나타낸다.
도 16은 HPV-16 L1의 인간-코돈 최적화 뉴클레오티드 서열 (서열번호 2)을 나타낸다.
도 17은 HPV L1 서열에 삽입된 L2 (108-120) 에피토프의 아미노산 서열 (서열번호 3)을 나타낸다.
도 18은 HPV L1 서열에 삽입된 L2 (56-81) 에피토프의 아미노산 서열 (서열번호 4)을 나타낸다.
도 19는 HPV L1 서열에 삽입된 L2 (17-36) 에피토프의 아미노산 서열 (서열번호 5)을 나타낸다.
도 20은 HPV L1 서열에 삽입된 L2 BPV (1-88) 에피토프의 아미노산 서열 (서열번호 6)을 나타낸다.
도 21은 HPV L1 서열에 삽입된 L2 (108-120)의 인간-코돈 최적화 DNA 뉴클레오티드 서열 (서열번호 7)을 나타낸다.
도 22는 HPV L1 서열에 삽입된 L2 (56-81)의 인간-코돈 최적화 DNA 뉴클레오티드 서열 (서열번호 8)을 나타낸다.
도 23은 HPV L1 서열에 삽입된 L2 (17-36)의 인간-코돈 최적화 DNA 뉴클레오티드 서열 (서열번호 9)을 나타낸다.
도 24는 HPV L1 서열에 삽입된 L2 BPV (1-88)의 인간-코돈 최적화 DNA 뉴클레오티드 서열 (서열번호 10)을 나타낸다.
도 25는 HPV 16 L1/L2(108-120) 키메라 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 22)을 나타낸다.
도 26은 HPV 16 L1/L2(56-81) 키메라 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 23)을 나타낸다.
도 27은 HPV 16 L1/L2(17-36) 키메라 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 24)을 나타낸다.
도 28은 HPV 16 L1/L2 BPV(1-88) 키메라 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열번호 25)을 나타낸다.
도 29는 HPV 16 L1/L2(108-120) 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 인간-코돈 최적화 DNA 뉴클레오티드 서열 (서열번호 26)을 나타낸다.
도 30은 HPV 16 L1/L2(56-81) 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 인간-코돈 최적화 DNA 뉴클레오티드 서열 (서열번호 27)을 나타낸다.
도 31은 HPV 16 L1/L2(17-36) 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 인간-코돈 최적화 DNA 뉴클레오티드 서열 (서열번호 28)을 나타낸다.
도 32는 HPV L1/L2 BPV(1-88) 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 인간-코돈 최적화 DNA 뉴클레오티드 서열 (서열번호 29)을 나타낸다.
실시예 1: L1 키메라의 일시적 식물 발현
방법 및 재료
식물 발현 벡터
3개의 바이너리(binary) 아그로박테리움 식물 발현 벡터를 이용하여 HPV 키메라 발현을 최적화하였다: pTRAc 및 pTRAkc-rbcs1-cTP (독일, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology의 Prof. Rainer Fischer에 의해 제공됨) 및 대두 황화 위축 제미니바이러스(Bean yellow dwarf geminivurus: BeYDV) 벡터 pRIC3 (Richard Halley-Stott에 의해 제조됨). 두 개는 발현 단백질을 세포질 (pTRAc) 또는 엽록체 (pTRAkc-rbcs1-cTP)로 표적화하는 비-복제성 벡터이고 (Maclean et al., 2007), 세 번째는 자가 복제성 세포질-표적화 벡터 (pRIC3)이다. pRIC3 벡터는, 크기가 감소되고 식물체(planta)에서 전이유전자(transgene) 발현의 유사한 증폭을 나타낸, 제3 세대 pRIC 벡터이다 (Regnard et al., 2010).
이들 벡터는 식물에서 단백질 발현에 필요한 여러 요소를 포함한다 (도 1). pTRAkc-rbcs1-cTP 벡터 (도 1A)는 pTRAc (도 1B)의 파생물(derivative)이고, 감자 rbcS1 유전자의 엽록체-운반 펩티드 서열을 포함한다. pRIC3 (도 1D)는 자가-복제에 필요한 BeYDV 복제-관련 단백질을 포함한다 (Regnard et al., 2010).
L1 키메라의 합성
이 연구에서 사용된 4개의 HPV-16 L1/L2 키메라가 표 1에 기술되어 있다. 이 키메라는 South African HPV-16 L1 단리 유전자 서열 (SALI: GenBank accession no. AY177679) 및 414번 아미노산의 h4 헬릭스(helix)에 위치한 L2 에피토프("F-위치"를 나타냄)로 구성되어 있다. 이들 키메라 유전자는 Dr Inga Hitzeroth (Plant Vaccine Group, UCT)에 의해 설계되고, 인간-코돈 최적화되고 GENEART AG (Regensburg, Germany)에 의해 고속 대량 유전자 조립(high throughput gene assembly)을 이용하여 인 실리코 합성되었다. 합성된 L2 에피토프 서열은 F-위치의 L1 서열을 대체하고 L1 단백질로 단순히 삽입되지 않았다.
표 1: HPV -16 L1 키메라 구조체의 요약
구조체 삽입된 에피토프 에피토프의 L1 위치 서열 치환 ( aa )
L1/L2(108-120) HPV-16 L2 aa 108-120 F-위치 aa 414-426 13
L1/L2(56-81) HPV-16 L2 aa 56-81 aa 414-439 26
L1/L2(17-36) HPV-16 L2 aa 17-36 aa 414-433 20
L1/L2 BPV(1-88) BPV-1 L2 aa 1-88 aa 414-505 88
L1 키메라 유전자의 서브클로닝
HPV-16 L1/L2, 키메라 서열을 키메라 유전자의 측면에 위치한(flank) 3' XhoI 및 5' BspHI, MluI 또는 HindIII 제한효소 (RE) 부위를 이용하여 pGA4 벡터로부터 절단하였다 (도 1C). pTRAc의 경우, AflIII 및 XhoI를 이용하고 (도 1B), pTRAkc-rbcs1-cTP의 경우, MluI 및 XhoI를 이용하고 (도 1A), 및 pRIC3의 경우, HindIII 및 XhoI를 이용하여 (도 1D), 방향성 있게(directionally) HPV 유전자를 서브클로닝하였다. DH5-α 화학적 적격(chemically competent) E. coli 세포 (E.cloniTM, Lucigen)를 키메라 플라스미드 구조체에 의해 형질전환하고 암피실린 저항성 (100 ㎍/ml)을 이용하여 재조합체를 선발하였다. pTRAc HPV-16 L1/L2 키메라 구조체 L1/L2(108-120), L1/L2(56-81) 및 L1/L2(17-36)를 Mark Whitehead (Plant Vaccine Group, UCT)에 의해 제공받았다. 본 연구에서 이용된 플라스미드 구조체가 표 2에 요약된다.
표 2: 본 연구에서 이용된 아그로박테리움 발현 구조체
식물 발현 벡터 시험된 키메라 플라스미드 복제 세포 내 위치 출처
pTRAc L1/L2 비-복제성 세포질 M. Whitehead
pTRAkc-rbcs1-cTP L1/L2 비-복제성 엽록체 본 연구
pRIC3 L1/L2 자가-복제성 세포질 본 연구
재조합 L1 키메라의 확인
상이한 L2 에피토프에 결합하는 pTRAc 벡터-특이적 프라이머 및 키메라-특이적 프라이머를 이용한 콜로니 PCR에 의해 L1 키메라 재조합 클론을 스크리닝하였다 (표 3). 3 mM의 최종 MgCl2 농도에서 각 프라이머 1 μM을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 GoTaq Flexi DNA Polymerase 키트 (Promega)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
표 3: HPV 키메라의 PCR 및 시퀀싱에서 이용된 프라이머
프라이머 표적 검출된 키메라 프라이머 명 프라이머 서열 PCR 산물 ( kb )
pTRAc
벡터		 모든 키메라
 pTRAc Fwd 5'-CATTTCATTTGGAGAGGACACG-3' (서열번호 11) ~1.7
pTRAc Rvs 5'-GAACTACTCACACATTATTCTGG-3' (서열번호 12)
L1/L2
키메라


 모든 키메라 ModNew Fwd 5'-CGACGACCTGTACATCAAGG-3' (서열번호 13) -
L1/L2(108-120) VEET Rvs 5'-GATGAAGCTGGTCTCCTCC-3' (서열번호 14) 0.41
L1/L2(56-81) SAF2 Rvs 5'-GGATGTAGCCGGTCCTGC-3' (서열번호 15) 0.44
L1/L2(17-36) QLYK Rvs 5'-ACCTTGGGGATGATGTCAGG-3' (서열번호 16) 0.44
L1/L2 BPV(1-88) SALIBPV Rvs 5'-TATCTAGGGCTTCCTCCAGC-3' (서열번호 17) 0.56
벡터-특이적 프라이머를 이용한 콜로니 PCR
pTRAc 벡터-특이적 프라이머 (Mark Whitehead에 의해 설계됨)는 다중 클로닝 부위 (MCS)의 상류(upstream) 및 하류(downstream)에 결합하여 유전자 삽입을 검출한다. PCR 프로파일은 95℃에서 3분 동안의 초기 변성 단계, 뒤이어 95℃에서 30초, 59℃에서 30초 및 72℃에서 3분 동안의 25회 사이클, 및 72℃에서 3분 동안의 최종 신장 단계로 구성되었다. PCR 산물을 0.8% TBE 아가로스 겔에서 분리시키고 에티듐 브로마이드를 이용하여 검출하였다.
에피토프 -특이적 프라이머를 이용한 콜로니 PCR
HPV L2 에피토프-특이적 프라이머 (Marieta Burger에 의해 설계됨)를 이용하여 재조합 pTRAkc-rbcs1-cTP 및 pRIC3 클론에서 올바른 키메라 삽입물(insert)을 확인하였다. PCR 프로파일은 95℃에서 2분 동안의 초기 변성 단계, 뒤이어 95℃에서 30초, 55℃ (L1/L2 키메라)에서 20초 및 72℃에서 30초 동안의 25회 사이클, 및 72℃에서 3분 동안의 최종 신장 단계로 구성되었다. PCR 산물을 1.2% TBE 아가로스 겔에서 분리시키고 에티듐 브로마이드를 이용하여 검출하였다.
제한효소 절단
1.5 kb 키메라 유전자 삽입물의 측면에 위치한(flank) RE 부위(pTRAkc-rbcs1-cTP 클론의 경우, EcoRI / XhoI, 또는 pRIC3의 경우, HindIII / XhoI)를 이용한 제한효소 절단에 의해 제조합체를 확인하였다. 재조합 DNA (~500 ㎍)를 제조사의 설명서에 따라 (Roche/Fermentas) 반응 당 1U의 효소를 이용하여, 1 내지 2시간 동안 37℃에서 절단하였다. 절단된 DNA를 0.8% TBE 아가로스 겔 상에서 분리시키고 에티듐 브로마이드에 의해 염색하였다.
L1 키메라의 시퀀싱
pTRAkc-rbcs1-cTP 재조합체 내의 HPV 키메라 유전자 삽입물을 pTRAc 벡터-특이적 프라이머를 이용하여 시퀀싱하였다. 서열을 DNAMAN 다중 정렬 소프트웨어를 이용하여 HPV 키메라 서열과 정렬하였다.
아그로박테리움 형질전환
아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101::pMP90RK 세포를 Shen 및 Forde (1989)에 의해 기술된 방법을 이용하여 일렉트로컴피턴트(electrocompetent)하게 제조하였다. 아그로박테리움의 형질전환을 Maclean 등(2007)에 의해 기술된 바와 같이 수행하고 재조합 클론을 항생제 선발에 의해 스크리닝하였다 (50 ㎍/ml 카르베니실린, 50 ㎍/ml 리팜피신 및 30 ㎍/ml 카나마이신). (전술된 바와 같이) 콜로니 PCR 및 제한효소 절단에 의해 성공적인 형질전환을 확인하였다.
N. benthamiana 의 아그로주입( agroinfiltration )
A. tumefaciens 재조합 키메라 배양물, 및 토마토 반점 위조 바이러스 (TSWV)의 NSs 침묵 억제자를 코딩하는 pBIN-NSs 플라스미드를 포함하는 A. tumefaciens LBA4404 배양물 (Takeda et al., 2002)을, Maclean et al. (2007)에 의해 기술된 바와 같이 주입(infiltration)을 위해 제조하였다. 아그로박테리움 세포를 주입용 배지 (10 mM MgCl2, 10 mM MES, 3% 수크로스 및 150 μM 아세토시린곤 수용액(acetosyringone in water), pH 5.6) 중에 희석시켜, 개별 아그로박테리움 키메라 균주에 대하여 0.25의 최종 OD600 및 A. tumefaciens LBA4404 (pBIN-NSs)와 공동-주입된(co-infiltrated) 구조체에 대하여 0.5의 합쳐진(combined) OD600 \이 되게 하였다. 주입 전 vir 유전자의 발현을 가능하게 하기 위하여 균주를 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
6주령 N. benthamiana의 잎에 대하여 잎의 배면(ventral side)으로부터 배축 대기 공간(abaxial air space)으로 박테리아의 현탁액을 주사함으로써 아그로주입(agroinfiltrate)을 수행하였다 (Maclean et al., 2007). 이 식물을 원하는 시간 동안 22℃에서 16시간의 광조건, 8시간의 암조건하에서 성장시켰다. 주입후 1 내지 9일 (days post-infiltration: dpi)에 키메라 발현 시간 시험(time trial)을 수행하고, 키메라를 NSs 침묵 억제자의 존재 또는 부재하에 공동-발현시켰다. 개별 식물을 각 키메라에 대하여 이용하였고, 동일한 식물의 개별 잎에 대하여 상대적인 벡터 발현을 위한 pTRAc, pTRAkc-rbcs1-cTP 또는 pRIC3 키메라 구조체를 주입하였다.
식물로부터 단백질 추출
에펜도르프 튜브(eppendorf tube)의 뚜껑을 이용하여 절단된 잎 조각(leaf disc)을 아그로주입된 잎으로부터 수집하고 (조각 당 ~10 mg, 구조체 당 3 조각) 액체 질소 중에서 분쇄하였다. 잎 물질을 프로테아제 억제제 (EDTA-fee Complete Protease Inhibitor; Roche)를 포함한 1.5M NaCl 고염(high salt) PBS (HS PBS) 추출 완충액 조각 당 250 ㎕ 중에 재현탁하였다. 식물의 조 추출물을 13,000 rpm에서 5분 동안 원심분리에 의해 2회 정화하고 상층액을 -20℃에 저장하였다.
식물-발현 L1 키메라의 웨스턴 블롯 검출
식물 추출물을 로딩(loading) 완충액 중에서 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하고 (Sambrook et al., 1989), 10% SDS-PAGE 겔에 의해 분리시키고 반-건조 일렉트로블롯팅(semi-dry electroblotting)에 의해 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 이 막을 블록킹(blocking) 완충액 중에서 실온에서 30분 동안 블록킹하고 (1x PBS, pH 7.6 중 5% skim milk, 0.1% Tween-20) 블록킹 완충액 중에 희석된 항-L1 1차 항체 중에 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 230-236번 아미노산에 위치한 L1 선형 에피토프 GFGAMDF에 결합하는 쥐의 단일클론성 (MAb) CamVir1 (1:10000; Abcam, UK) (McLean et al, 1990), 또는 L1 단백질의 FG 루프 내 261-280번 아미노산에 위치한 선형 에피토프에 결합하는 H16.J4 (1:2500) (Christensen et al., 1996)에 의해 HPV-16 L1 단백질을 검출하였다. 두 결합 부위는 L2 에피토프 삽입에 의해 파괴되지 않는다.
막을 블록킹 완충액으로 4× 15분 동안 세척하고, 블록킹 완충액 중에 희석된 2차 고트-항-마우스-알칼라인 포스파타제 컨쥬게이트 (1:10000; Sigma) 중에 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 최종적으로 막을 세척 완충액 (1x PBS 중 0.1% Tween 20, pH 7.6)으로 4× 15분 동안 세척하고, 니트로 블루 테트라졸리움 클로라이드/5-브로마-4-클로로-3-인도일 포스페이트 기질 (NBT/BCIP substrate; Roche)을 이용하여 현상하였다. GeneTools (SYNGENE)를 이용하여 항-L1 웨스턴 블롯에서 검출된 밴드의 밀도를 측정함으로써 키메라 발현을 비교하였다.
포획(capture) ELISA 에 의한 키메라 정량
N. benthamiana로부터 추출된 L1 키메라를 변형된 폴리비닐 알코올 (PVA)-블록킹 ELISA 방법을 이용한 포획 ELISA에 의해 정량하였다 (Studentsov et al., 2002). 요약하면, 96-웰(well) Maxisorp 마이크로타이터(microtitre) 플레이트를 밤새도록 4℃에서 1:2000인 쥐 항 HPV-16 L1 MAb (CamVir1 또는 H16.J4)로 코팅하고 PVA로 블록킹하였다. 식물 추출물을 웰에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다. 이후, 세척 단계와 토끼 항-HPV-16 다중클론성 혈청 (1:1000)의 첨가를 수행하였다. 플레이트를 밤새도록 4℃에서 인큐베이션하고 HPV-16 L1 단백질을 돼지 항-토끼(swine anti-rabbit) 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 컨쥬게이트 (1:5000; DAKO) 및 1.2-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 기질 (OPD; DAKO; Denmark)에 의해 검출하였다.
상업용 HPV 백신 Cervarix를 양성 ELISA 대조군 및 HPV-16 L1 VLP 표준물질로 이용하였다. 각 시료를 3회 반복으로 분석하고 Cervarix 표준 곡선을 이용하여 정량하였다. 각 시료에 존재하는 키메라 단백질의 양 (mg)을 식물 조직의 킬로그램 당 키메라 (mg/kg)로 표시하였다.
각 잎의 조 추출물에 대한 총 가용성 단백질 (TSP)을 제조사의 설명서에 따라 소 혈장 감마 글로빈 (bovine plasma gamma globin) IgG 단백질 표준물질 (Bio-Rad)을 이용한 Lowry 단백질 분석을 이용하여 결정하였다 (Biorad DC Protein Assay; Microplate Assay Protocol). 잎 조직 매스(mass) 및 단백질 추출 효율에서의 차이를 설명하기 위하여, ELISA-정량된 키메라 단백질 (mg)이 TSP의 퍼센트로 표시되는 상대적인 키메라의 수율을 계산하였다.
키메라 발현 수율의 통계 분석
상이한 식물 발현 벡터를 이용하는 키메라 발현에서의 통계적 차이를 ANOVA 및 the Fischer LSD Post Hoc test를 이용하여 결정하였다. 차이는 p < 0.01에서 통계적으로 유의한 것으로 보고되었다.
키메라 조립( assembly )
전술된 H16.J4 및 H16.V5 포획 ELISA를 이용하여 HPV 단백질의 보다 높은-차원의 면역원성 구조(immunogenic structure)로의 조립을 평가하였다. H16.J4 MAb는 261-280번 아미노산으로 구성된 L1 선형 에피토프에 결합하고 (Christensen et al., 1996), 이로 인해 식물 추출물에 존재하는 전체 HPV 단백질에 기여한다. H16.V5는 260-290번 아미노산을 반드시 포함하고 L1 잔기 Phe-50, Ala-266, 및 Ser-282에 특이적으로 결합하는 (White et al., 1999) 입체형태적 L1 에피토프에 결합하므로 (Christensen et al., 1996, 2001), 조립된 HPV 단백질의 검출에 이용하였다. 상이한 벡터를 이용하여 발현된 키메라의 조립을 비교하기 위하여, 조립된 HPV 단백질의 양을 전체 HPV 단백질 중 퍼센트로 표시하였다.
결과
L1 키메라 클론의 확인
L1 키메라 (표 1)를 pTRAkc-rbcs1-cTP 및 pRIC3 식물 발현 벡터로 성공적으로 클로닝하고 E. coli 및 아그로박테리움 GV3101에 형질전환시켰다.
MCS의 상류 및 하류에 결합하는 pTRAc-특이적 프라이머 또는 상이한 L2 에피토프에 결합하는 키메라-특이적 프라이머를 이용한 콜로니 PCR에 의해 pTRAkc-rbcs1-cTP 재조합 클론을 스크리닝하였다. 모든 키메라가 표 3에서 예측된 예상 크기의 단편을 생성하였다.
또한, 키메라 유전자 삽입물의 측면에 위치한 EcoRI 및 XhoI RE 부위를 이용한 제한효소 (RE) 절단에 의해 클론을 확인하였다. 예상대로, 모든 키메라가 1.5 kb 유전자 삽입물을 포함하였다. 클론을 시퀀싱하고 DNAMAN 다중 서열 정렬 소프트웨어를 이용하여 개별 키메라를 확인하였다.
유사하게, 키메라 에피토프-특이적 프라이머를 이용한 콜로니 PCR 및 HindIII / XhoI 제한효소 절단에 의해 pRIC3 재조합 클론을 확인하였다. 모든 키메라가 표 3에 기술된 0.2-0.6 kb 키메라 특이적 PCR 밴드 및 RE 절단물(RE digests) 중 1.5 kb 유전자 단편을 생성하였다. 따라서, 모든 HPV 키메라가 pTRAkc-rbcs1-cTP 및 pRIC3 식물 발현 벡터로 성공적으로 서브클로닝되었다.
N. benthamiana 에서 L1 키메라 발현의 최적화
NSs 침묵 억제자와의 공동-발현
N. bethamiana에서 엽록체-표적화된 HPV-16 L1/L2 발현을 주입 후 1 내지 9일 (dpi) 시간 시험(time trial)에서 조사하였다. 키메라를 NSs 침묵 억제자 단백질의 존재 (+) 또는 부재 (-) 하에 발현시켜 키메라 발현에 대한 그의 효과를 조사하였다. 항-L1 MAb CamVir1을 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 발현을 분석하였다. L1/L2 (108-120)가 나머지 키메라보다 더 높았으나 (run higher), 예측된 ~56 kDa L1 밴드에 의해, 모든 L1/L2 키메라를 검출하였다 (도 2).
침묵 억제자 단백질 NSs와 공동-주입될 경우, 모든 키메라가 발현에서 장기적인 증가를 나타내어 (도 2A 내지 D), 그것이 식물에서 번역 후 유전자 침묵을 방지하고 단백질 축적을 증가시키는데 효과적이라는 것을 시사하였다. 선형-에피토프 특이적 MAb H16.J4를 이용한 ELISA 검출은, L1/L2 수율의 16배까지의 증가로 (데이터는 표시되지 않음) 이 결과를 확인하였다. NSs 부재하의 키메라 발현은 1-3 dpi에 검출되고 3-5 dpi에 정점에 도달한 반면, NSs와 공동-발현된 키메라는 3 dpi에 검출되고 5-7 dpi에 발현이 정점에 도달하였다. 5-9 dpi의 발현에서 소량의 감소가 있었고, 이는 발현 수준이 서서히 감소된다는 것을 시사하였다 (ELISA 결과, 데이터는 표시되지 않음). 그 결과, 추가 실험에서 모든 키메라가 NSs와 공동-발현되었다.
L1/L2 (17-36) 키메라에 대하여 여러 고분자 밴드가 검출되어, 엽록체 신호 서열 (cTP)이 절단되지 않았을 수 있거나 또는 키메라가 글리코실화되었을 수 있다는 것을 시사하였다. 그러나, 후속 웨스턴 블롯에서 분석된 L1/L2 (17-36)는 이러한 고분자량 밴드를 나타내지 않아, 도 2C에서 단백질이 부분적으로 변성되었다는 것을 시사하였다.
BPV L2 1-88번 아미노산 에피토프를 포함하는 L1/L2 키메라는 HPV-16 L2 에피토프를 포함하는 키메라에 비하여 낮은 발현 수준을 가졌다. 나머지 키메라에 대해 요구되는 15분의 현상 시간에 비하여 (도 2A-C), L1/L2 BPV (1-88) 웨스턴 블롯에서의 밴드는 16시간의 현상 후에 비로소 가시화되었다 (도 2D). ELISA 정량은 L1/L2 BPV(1-88)가 40 mg/kg 식물 조직의 최대 수율을 달성한다는 것을 추정한 반면, 나머지 L1/L2 키메라에 대하여 1000 - 4600 mg/kg의 높은 발현 수율이 추정되었다 (데이터는 표시되지 않음). 또한, L1/L2 BPV(1-88) 식물 추출물은 L1 분해와 관련된 특징적인 ~45 kDa 밴드를 포함하여 (도 2D), L1/L2 BPV(1-88)가 이 발현 시스템에서 불안정하다는 것을 시사한다. 이 결과는 상이한 시간 시험으로부터의 여러 L1/L2 BPV(1-88) 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다.
L1 / L2 키메라 수율에 대한 엽록체 표적화의 효과
HPV 단백질의 엽록체로의 표적화는 식물 발현 수율을 유의하게 개선시킬 수 있다 (Maclean et al., 2007). 엽록체-표적화의 중요성을 결정하기 위하여, pTRAc (세포질-표적화) 및 pTRAkc-rbcs1-cTP (엽록체-표적화) L1/L2 키메라 구조체를 3-9 dpi 시간 시험에서 N. benthamiana에서 pBIN-NSs와 공동-주입하였다. L1/L2 BPV(1-88) 키메라는 나머지 L1/L2 키메라와 비교할 경우 N. bethamiana에서 매우 낮은 발현을 나타내므로, 이 연구에 포함되지 않았다.
웨스턴 블롯과 ELISA 데이터는, 3 dpi에 키메라의 최대 발현 및 20-45 mg/kg 식물 조직의 수율로, 세포질-표적화된 L1/L2 키메라에 대한 낮은 발현을 일관되게 보여주었다 (데이터는 표시되지 않음). 세포질-표적화된 L1/L2(108-120), L1/L2(56-81) 및 L1/L2(17-36)의 발현은 로딩 전 3x로 희석되고 양성 대조군으로 포함된 엽록체-표적화된 L1/L2(108-120) 키메라에 비하여 약하게 검출되었다. 키메라 수율의 비교는, L1/L2 키메라 발현이 엽록체로 표적화될 경우 40 내지 80배 증가했다는 것을 나타낸다. 이들 결과를 고려하여, pTRAkc-rbcs1-cTP 벡터를 이용하여 추가의 키메라 발현 연구를 수행하였다.
자가- 복제성 pRIC3 식물 발현 벡터를 이용한 최적화
키메라 수율을 향상시키기 위한 시도로, 특히 낮은-발현의 L1/L2 BPV(1-88)에 대하여, 식물 발현 벡터 pRIC3 (자가 복제성, 세포질-표적화 벡터)를 NSs 존재하에 3-9 dpi 시간 시험에서 pTRAkc-rbcs1-cTP (비-복제성 엽록체-표적화 벡터)와 비교하였다.
두 벡터에 대한 최대 키메라 수율이 3-5 dpi에 수득되었다. HPV-16 L2 에피토프 108-120번 아미노산, 56-81번 아미노산 및 17-36번 아미노산을 포함하는 세 개의 L1/L2 키메라는 자가-복제성 pRIC3 벡터에 비하여 엽록체-표적화 pTRAkc-rbcs-cTP 벡터를 이용하여 더 잘 발현되었다. L1/L2 BPV(1-88)는 어느 벡터에 대해서도 높게 발현되지 않았고 두 구조체에 대하여 분해가 관찰되었다.
ELISA 정량은 자가-복제성 pRIC3 벡터가 대다수의 키메라에 대하여 발현 수율을 향상시키지 않았다는 것을 나타낸다. 수율은 pTRAkc-rbcs1-cTP 벡터를 이용하여 3배까지 더 높아서, 엽록체-표적화는 pRIC3 벡터보다 키메라의 높은-발현에 보다 효과적이고, 이는 발현 단백질을 궁극적으로 세포질로 표적화한다는 것을 시사한다. L1/L2 BPV(1-88) 발현 수준은 NSs 음성 대조군과 유사하여, 식물이 L1/L2 BPV(1-88) 생산을 위한 실현 가능한 시스템이 아니라는 것을 시사했고, L1/L2 BPV(1-88)의 발현이 더 추구되지 않았다.
pTRAkc-rbcs1-cTP 및 pRIC3 벡터를 이용한 발현 최적화로부터 얻은 결과가 표 4에 요약되어 있다. L1/L2(108-120), L1/L2(56-81) 및 L1/L2(17-36)가 높게-발현되었다. 예비 시간 시험에서 발현을 최대화하는 것으로 나타난 변수는: NSs와의 공동-발현, 5 dpi의 추출 및 발현된 L1/L2 단백질을 엽록체로 표적화하는 pTRAkc-rbcs-cTP 벡터의 이용이다.
표 4: L1 키메라 발현 및 최적화의 요약
최대 키메라 발현 　
키메라 추출
( dpi ) 		벡터 수율 ( mg / kg ) 수율 (% TSP ) 증가 배수
( fold increase )
( pTRAkc - rbcs1 - cTP vs. pRIC3 )
L1/L2(108-120) 5 pTRAkc-rbcs1-cTP 600 3.7 1.8
L1/L2(56-81) 5 pTRAkc-rbcs1-cTP 280 1.7 2.4
L1/L2(17-36) 5 pTRAkc-rbcs1-cTP 440 2.9 1.8
L1/L2 BPV(1-88) 5 pTRAkc-rbcs1-cTP - - -
L1 / L2 키메라의 상대적인 벡터 발현
세 개의 고-발현 L1/L2 키메라를 쥐의 면역원성 연구를 위한 백신 항원으로 선택하였다: L1/L2(108-120), L1/L2(56-81) 및 L1/L2(17-36). 세 개의 생물학적 반복(biolotical repeat)을 포함한 최종 발현 연구를 수행하여 L1/L2 결과를 확인하고 통계적으로 유효한 데이터를 수득하였다. 모든 세 개의 벡터 (pTRAc, pTRAkc-rbcs1-cTP 및 pRIC3)를 각 L1/L2 백신 항원의 발현에 대하여 직접 비교하고, HPV-16 L1을 양성 대조군으로 포함시키고 (pTRAc 및 pTRAkc-rbcs1-cTP 구조체가 이용가능했음) NSs-주입된 식물은 음성 대조군으로 작용하였다. 키메라를 NSs와 공동-발현시키고 5 dpi에 추출하였다.
식물에 대한 발현의 효과
5 dpi의 추출 전 주입된 잎에 대한 조사는, 자가-복제성 pRIC3 벡터가 식물의 건강(health)에 대해 역효과를 미친다는 것을 시사하였다. pRIC3에 의해 주입된 잎의 색은 황색/갈색이었고 주입된 영역에서 잎 조직의 괴사(necrosis)가 관찰되었다. 이것은 키메라를 또한 식물 세포질로 표적화하는 pTRAc 잎에서 더 낮은 정도로 관찰되었다. pTRAkc-rbcs-cTP 잎은, NSs-주입된 음성 대조군의 잎 및 주입되지 않은 잎과 닮아서, 가장 건강한 것으로 보여, 엽록체 내 키메라의 축적이 식물의 건강에 더 적은 영향을 미친다는 것을 시사한다 (결과는 표시되지 않음). NSs-주입된 잎은 (주사바늘의 주사 표시를 제외하고는) 주입되지 않은 잎과 유사하게 보였기 때문에, 주입은 식물의 건강에 대해 관찰가능한 효과를 갖지 않는 것으로 보인다. 이들 결과는 모든 시간 시험에 대하여 일관되게 관찰되었다.
HPV 단백질의 웨스턴 블롯 검출
HPV 단백질을 항-L1 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하였다 (도 3a). 엽록체 표적화 벡터를 이용하여 NSs-주입된 식물 추출물 (음성 대조군)은 검출되지 않았고 식물-유래 HPV-16 L1 (양성 대조군)은 검출되었다. 상이한 벡터를 이용한 발현을 직접 비교하였고, pTRAkc-rbcs1-cTP가 일관되게 가장 높은 발현 수율을 제공하고, 뒤이어 pRIC3, 그 후 pTRAc가 높은 발현 수율을 제공했다.
HPV 단백질의 ELISA 정량화
CamVir1를 이용하여 HPV 키메라를 정량하기 위해 포획 ELISA를 이용하였다. L1/L2 키메라 및 HPV-16 L1 수율이 도 3b에 나타난다. 세 개의 식물 발현 벡터를 이용한 키메라 발현에서의 통계적인 차이를 ANOVA 및 Fischer LSD Post Hoc test를 이용하여 결정하였다. 차이는 p < 0.01에서 통계적으로 유의한 것으로 보고되었다.
pTRAkc-rbcs1-cTP를 이용한 L1/L2 키메라 및 HPV-16 L1의 엽록체-표적화 발현은 NSs 주입된 음성 대조군 (p = 0.000 - 0.002), 및 세포질-표적화 pTRAc 벡터 (p = 0.000 - 0.004)보다 유의하게 높은 수율을 제공하였다. 또한, pTRAkc-rbcs1-cTP는 pRIC3에 비하여 L1/L2(56-81) 발현을 유의하게 향상시켰다 (p = 0.006). pRIC3 벡터는 pTRAc에 비하여 통계적으로 어느 키메라의 발현도 향상시키지 않았다.
최적화 실험과 비교하여 (도 2, 표 4), 상대적인 시간 시험은 키메라 발현에서의 유사한 경향을 보여주었다. 엽록체-표적화된 L1/L2 키메라는 가장 높은 수율 (1040 - 1310 mg/kg; 2 - 3% TSP)을 제공하고, 세포질-표적화 벡터 pTRAc (50 - 260 mg/kg; <1% TSP)에 비하여 28배까지 및 자가-복제성 벡터 pRIC3 (190 - 660 mg/kg; <1% TSP)에 비하여 7배까지 키메라 발현을 향상시켰다.
세포질-표적화된 키메라의 수율은 비-복제성 pTRAc 벡터에 비하여 자가 복제성 벡터 pRIC3를 이용하여 4배까지 향상되었다. 이는, 엽록체로의 표적화가 식물에서 키메라 발현을 증가시키는 탁월한 전략인 것으로 보임에도 불구하고, 벡터의 자가-복제가 키메라 발현을 향상시킨다는 것을 시사한다.
엽록체-표적화된 HPV-16 L1이 보다 높은 평균 수율 (1710 mg/kg, 4% TSP)을 보였으나, L1/L2 키메라와 L1 간 차이는 통계적으로 유의하지 않아서, L2 에피토프 치환이 엽록체에서 재조합 단백질의 발현 및 축적에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, 웨스턴 블롯팅 (3a) 및 ELISA 발현 데이터 (도 3b)는 일관되게, L1/L2(56-81)보다 세포질-위치화(localisation) L1/L2(108-120) 및 L1/L2(17-36)의 더 높은 수준을 나타내어, 더 짧은 L2 서열 치환 (각각 13개 및 20개의 아미노산)을 갖는 L1/L2(108-120) 및 L1/L2(17-36) 키메라가 26개의 아미노산 서열 치환을 갖는 L1/L2(56-81)보다 더 잘 발현되고 더 높은 안정성을 갖는다는 것을 시사한다.
HPV 단백질의 조립
H16.J4 (선형 에피토프-특이적 MAb) 및 H16.V5 (입체형태적 에피토프-특이적 MAb) 포획 ELISA를 이용하여 캡소미어 또는 VLP와 같은 보다 높은-차원 구조로의 키메라 조립을 평가하였다. V5-검출된(V5-detected) 입체형태적 HPV 단백질의 양을 각 벡터 구조체에 대하여 J4-검출된 총 HPV 단백질 중 퍼센트로 표시하였다 (도 4).
낮은 퍼센트의 발현된 키메라가 H16.V5-검출된 보다 높은-차원의 구조로 조립되었다. 음성 대조군으로 이용된, NSs 식물 추출물은 H16.J4 또는 H16.V5 MAb에 결합하지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). 낮게-발현하는 pTRAc 키메라는 가장 높은 비율의 조립된 단백질을 갖고 (11-18%), 높게-발현하는 pTRAkc-rbcs1-cTP 키메라 (5-9%)가 이를 뒤따르는 것으로 보인다. pRIC3 키메라는 높은 퍼센트의 조립된 단백질을 포함하지 않았다 (< 2%). pTRAkc-rbcs1-cTP 키메라가 가장 높은 퍼센트의 조립된 단백질을 포함하지 않았음에도 불구하고, 더 높은 발현 수율은 pTRAc 및 pRIC3보다 각각 40x 및 4x까지 더 많은 조립된 단백질을 제공한다. 이는 pTRAkc-rbcs1-cTP가 면역원성 L1/L2 키메라의 생산에 이용하기 위한 가장 좋은 벡터라는 추가의 증거를 제공한다.
논의
식물에서 L1 키메라 일시적 발현의 최적화
모든 L1 키메라가 아그로박테리움-매개 일시적 시스템(Agrobacterium mediated transient system)을 이용하여 식물에서 성공적으로 발현되었다 (도 2). NSs 침묵 억제자의 이용, 아그로주입에 의해-전달된(agroinfiltration-delievered) 자가-복제성 바이러스 벡터의 이용 및 발현 단백질의 엽록체로의 표적화를 포함한, 여러 방법이 식물에서 키메라 발현을 최적화하기 위해 이용되었다.
NSs 침묵 억제자와의 공동-발현
아그로박테리움-매개 일시적 발현은 일반적으로 주입 후 60-72 시간 (~3일)에 정점에 도달한 후 숙주 식물에서 전사 후 유전자 침묵 (PTGS)을 유발한 결과 신속하게 감소한다 (Voinnet, 2001). PTGS는 외래 RNA 분자가 서열-특이적 방식으로 인식되고 분해되는, 적응적(adaptive) 항-바이러스 식물 방어 메커니즘이다 (Meins, 2000; Sijen and Kooter, 2000). 반작용-방어 전략(counter-defensive strategy)으로, 여러 식물 바이러스는 이 메커니즘의 여러 단계를 억제하는 단백질을 진화시켰다 (Voinnet, 2001). PTGS 반응이 식물 세포질에서 전이유전자 mRNA의 축적을 감소시키고 아그로박테리움-매개 일시적 발현의 효율을 제한함에도 불구하고 (de Carvalho et al., 1992; Van Blokland et al., 1994), 단백질과 바이러스 침묵 억제자와의 공동-발현은 PTGS 반응을 억제하고 높은 수준의 일시적 발현을 가능하게 하여, 전이유전자의 보다 높은 수율 (특정한 경우 50배) 및 장기간 발현을 제공하는 것으로 확인되었다 (Voinnet et al., 2003).
토마토 반점 위조 바이러스 (TSWV) 침묵 억제자 NSs와의 공동-주입은 PTGS를 억제하고 일시적 발현을 증가시킨다 (Takeda et al., 2002). 이 효과는 L1/L2 키메라의 일시적 발현에서 유사하게 관찰되었다 (도 2). 키메라는 일반적으로 바이러스 침묵 억제자의 부재하에서 3-5 dpi에 최대 발현 수준을 나타내었다. 그러나, NSs와의 공동-발현은 키메라의 발현에서 장기간 증가를 나타냄으로써, 발현 수준이 16배까지 증가하고 5-7 dpi에 정점에 도달하였다.
자가- 복제성 BeYDV 벡터의 이용
세포질(cytoplasmic) HPV-16 L1 수율은 자가-복제성 pRIC 벡터를 이용하여 50% 향상되었다 (Regnard et al., 2010). 그 결과, 제3 세대 pRIC3 벡터를 키메라 수율을 향상시키기 위한 잠재적 전략으로 조사하였다. 세 개의 L1/L2 키메라를 조사하였다: L1/L2(108-120), L1/L2(56-81) 및 L1/L2(17-36). 모든 키메라가 pTRAc (비-복제성 벡터)에 비하여, pRIC3 (자가-복제성 벡터)를 이용하여 보다 높은 발현 수준을 나타내어, 식물 세포질에서 전이유전자 증폭이 L1/L2 수율을 향상시킨다는 것을 시사한다 (도 3a 및 b). 그러나, 엽록체-표적화가 L1/L2 키메라의 고수준 축적에서 보다 효과적이었고 (도 3b) pRIC3-주입된 잎에서 잎 조직의 가시적인 괴사가 관찰되어, 벡터의 자가-복제가 식물의 건강에 부정적인 영향을 미친다는 것을 시사한다.
L1 키메라의 엽록체- 표적화
pTRAkc-rbcs1-cTP 벡터를 이용하여 L1 키메라를 엽록체로 표적화하였다. 엽록체 운반 펩티드 (cTP)가 발현된 키메라와 융합되고 엽록체로 들어간 후 SPP (stromal processing peptidase)에 의해 절단된다 (Robinson and Ellis, 1984). 엽록체에서 단백질의 고수준 축적을 담당하는 여러 요인이 존재한다: (a) 세포 프로테아제(cellular protease)로부터의 보호, (b) 색소체의 상이한 단백질 가수분해 기구 및 (c) L1의 올바른 폴딩을 보조하여 단백질 안정성을 향상시키는 보호성 플라스미드-특이적 샤페론(protective plasmid-specific chaperone) (Fernandez-San Millan et al., 2008). 이 연구에서, 엽록체-표적화는 매우 효과적이었고 세포질로 표적화되는 키메라에 비하여 L1/L2 키메라 수율을 40 내지 80배 증가시켰다 (도 3a).
항-L1 웨스턴 블롯에서 검출된 엽록체-표적화 키메라는 ~56 kDa의 밴드를 생성하여 (도 2), 신호 펩티드가 축적된 단백질로부터 효과적으로 제거되었다는 것을 시사한다. L1/L2(108-120)가 웨스턴 블롯에서 나머지 키메라보다 더 높게 가나(run high) (도 2), 동시에 분석된, pTRAc에 의해 발현된 세포질-국소화 L1/L2(108-120), 및 곤충 세포-발현 L1/L2(108-120) (데이터는 표시되지 않음)가 유사한 밴드 패턴을 나타냈기 때문에, 이 현상은 신호 펩티드의 불충분한 절단에 의해 유발되는 것이 아니다.
아마도 키메라의 글리코실화 또는 불충분한 변성의 결과, ~65 kDa의 보다 높은 분자량의 밴드가 L1/L2(17-36) 키메라에 대하여 검출되었다 (도 2). BHK (baby hamster kidney cell)에서 생성된 HPV-16 L1의 글리코실화 형태가 McLean 등 (1990)에 의해 기술되었고, 여기서 CamVir1는 L1에 대하여 2개의 밴드를 검출하였다: 56 kDa L1 주요 밴드 및 ~64 kDa의 소수(minor) 밴드. N-글리코실화 억제자 투니카마이신의 존재하에서 감염될 경우, 추가의 밴드는 세포 용해물로부터 나중에 제거되었다. 식물이 글리코실화 경로를 포함하나 (Rybicki, 2009), 후속 웨스턴 블롯은 단일 ~56 kDa 밴드를 나타내어, L1/L2(17-36) 키메라가 글리코실화 대신에 초기 실험에서 부분적으로 변성되었다는 것을 시사한다 (도 3a).
식물 발현 벡터의 직접 비교
(i) 단백질의 엽록체로의 표적화 (Maclean et al., 2007) 또는 (ii) 아그로주입-전달 자가-복제성 BeYDV-유래 발현 벡터의 이용 (Regnard et al., 2010)의 2가지 전략은 식물-발현 L1 수율을 최대 530 - 550 mg/kg까지 증가시켰다. 이는 L1-기반 키메라를 이용하여 이러한 전략을 직접 비교하는 첫 번째 연구였다. 식물 발현 벡터 pRIC3 (자가-복제성, 세포질-표적화 벡터)을 이용한 키메라 발현 수준을 pTRAkc-rbcs1-cTP와 직접 비교하였다. pTRAc (비-복제성, 세포질-표적화 벡터)를 이용한 발현을 비교의 목적을 위해 포함시켰고 HPV-16 L1을 양성 대조군으로 이용하였다 (도 3a 및 b).
엽록체-표적화는 대부분의 키메라에 대하여 가장 높은 수율을 가져왔고 (도 3a 및 b) 발현 단백질을 세포질로 표적화하는, pRIC3에 비해 7배까지, 및 pTRAc에 비해 28배까지 L1/L2 키메라 발현을 향상시켰다 (도 3b). 통계 분석은, 엽록체-표적화된 L1/L2 수율이 세포질-표적화된 L1/L2 수율보다 유의하게 더 높다는 것을 밝혔다 (p < 0.01). 그러나, 엽록체-표적화된 키메라와 자가-복제성 pRIC3 벡터를 이용하여 발현되는 키메라 간의 수율 차이는 L1/L2(56-81)의 경우만 유의하였다. 이 결과는, pTRAkc-rbcs1-cTP가 HPV 키메라의 고수준 생산을 위해 이용하기에 최적의 벡터라는 증거를 제공한다.
L1 / L2 키메라의 발현
HPV -16 L2 에피토프를 포함하는, 고발현 L1 / L2 키메라
L1/L2(108-120), L1/L2(56-81) 및 L1/L2(17-36) 키메라는, 나머지 키메라보다 20배까지 더 높은 수율을 가지며, 높은 수준으로 발현되었다 (표 4). 그 결과, 이들 3개의 L1/L2 키메라를 쥐의 면역원성 연구를 위한 백신 항원으로 선택하였다.
엽록체-표적화된 L1/L2 키메라는 ~ 1200 mg/kg 식물 조직 (2-3% TSP)의 최고 키메라 수율을 일관되게 보여주었다. HPV-16 L1이 L1/L2 키메라보다 더 높은 수율을 보였으나, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다 (도 3b). 이는, L2 에피토프가 엽록체에서 HPV 단백질의 발현 및 축적에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, 이 키메라는 아그로박테리움-매개 담배 발현 시스템을 이용하여 생산된, 공개된 HPV-16 L1의 수율보다 ~2배 더 높고 (Maclean et al., 2007; Regnard et al., 2010) 이들 키메라의 생산은 상업적으로 실현 가능하다 (>1% TSP; Fischer et al., 2004).
보다 높은-차원의 구조로의 조립은 단백질 가수분해에 대한 더 낮은 감수성과 연관되어 있고 (Chen et al., 2000) L1/L2의 높은 축적이 조립의 결과일 수 있다는 가설이 세워졌다. 입체형태 특이적 H16.V5 MAb는 조립된 단백질에 결합하고 (Christensen et al., 1996) 보다 높은-차원의 구조로의 조립을 검출하는데 이용될 수 있다 (Carter et al., 2003; Wang et al. 2003; Ryding et al., 2007). 모든 식물-발현 L1/L2 키메라 및 HPV-16 L1 대조군은 낮은 비율의 조립된 단백질 (<20% TSP)을 포함하는 것으로 보여, 대부분의 단백질이 조립되지 않은 L1 단량체로 존재한다는 것을 시사한다. 그러나, L1/L2(56-81) 및 L1/L2(17-36) 키메라는 H16.V5의 결합에 결정적인 것으로 나타난 L1 C-말단 부위 428-483번 아미노산과 겹치는 L2 서열을 포함하여 (Varsani et al., 2006b), 이 MAb가 키메라 조립의 검출에 적합하지 않을 수 있고 유사한 정량을 위해 이용될 수 없다는 것을 시사한다.
BPV L2 1-88번 아미노산 에피토프를 갖는 L1 / L2 키메라의 불안정성
L1/L2 BPV(1-88) 키메라는 HPV-16 L2 에피토프를 포함하는 키메라와 비교하여 낮은 발현 수준을 가졌다 (도 2). L1/L2 BPV(1-88)가 H16.J4 MAb을 프로브로 이용한 웨스턴 블롯에서 검출되고 40 mg/kg 식물 조직의 낮은 수율을 보였으나, ELISA 정량은 발현 수준이 NSs 음성 대조군과 유사한 것으로 추정하였다 (도 2, ELISA 데이터는 표시되지 않음). 또한, 엽록체-표적화된 L1/L2 BPV(1-88)는 부분적으로 분해되었고 (도 2D), 이는 여러 HPV L1 발현 연구에서 전술되었다 (Hagensee et al., 1993; Sasagawa et al., 1995; Li et al., 1997; Kohl et al., 2007).
이 결과는 L1/L2 BPV(1-88)가 잘 발현되지 않을 뿐 아니라, 현재 식물 발현 시스템에서 안정하지 않다는 증거를 제공한다. L1/L2 BPV(1-88) 키메라는 가장 큰 L2 서열 치환을 포함하고 88개 잔기의 에피토프가 L1의 전체 C-말단 영역을 치환하였다 (표 1). HPV L1 C-말단 영역은 VLP 조립에서 역할을 담당하고 (Zhou et al., 1991b; Varsani et al., 2006b; Bishop et al., 2007), C-말단 영역의 결실은 분해에 대한 감수성이 더 낮은, 보다 높은-차원의 구조로의 조립을 방지한다 (Chen et al., 2000). 외래 에피토프 서열에 의한 L1 C-말단 영역의 서열 치환은 HPV 키메라 발현을 위한 효과적인 전략이 아니고 식물은 L1/L2 BPV(1-88) 발현을 위한 실현 가능한 시스템이 아니다.
실시예 2: HPV 항원의 정제 및 조립
방법 및 재료
항원의 대-규모 일시적 발현 및 추출
Maclean 등 (2007)에 의해 기술된 바와 같이, NSs 침묵 억제자 단백질을 코딩하는 A. tumefaciens LBA4404 (pBIN-NSs) 및 HPV-16 L1 또는 L1/L2 키메라를 코딩하는 아그로박테리움 GV3101 균주를 N. benthamiana 식물 (2-4주령)에 진공-주입(vacuum-infiltrate)하였다. 식물을 5일 동안 16시간의 광조건, 8시간의 암조건으로 22℃에서 성장시켰다.
주입된 잎을 수집하고, 중량을 측정하고 막자 사발을 이용하여 액체 질소 중에서 분쇄하였다. 0.5M NaCl과 프로테아제 억제제 (Roche Complete EDTA-free)를 포함하는 PBS 추출 완충액을 1:4 (w/v)의 비율로 첨가하고 시료를 Waring 블렌더에서 10분 동안 얼음상에서 균질화하였다. 균질 현탁액(homogenate)을 얼음 위에서 6x 20초 간격의 초음파 처리 및 휴지기로 초음파 처리하고 (Macrotip sonication; Level 8; Heat Systems - Ultrasonics, Inc. Sonicator Cell Disruptor Model W-225 R), 용해물(lysate)을 미라클로스 (CALBIOCHEM)의 2중층을 통해 여과시켰다. 조 추출물을 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리에 의해 2회 정화하였다. 펠릿을 1ml PBS 중에 재현탁하고 -70℃에 저장하였다. 상층액과 펠릿을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하여 HPV 항원의 상층액으로 국소화(localization)를 체크하였다.
HPV 항원의 파일럿 정제( pilot purification )
식물-발현 L1 백신 항원의 정제를 위하여 여러 방법을 조사하였다. 교차류 미세여과(cross-flow microfiltration) 및 수크로스 및 세슘 클로라이드 밀도 구배를 이용한 초원심분리와 같은 크기-기반 방법, 및 L1 및 L1-기반 키메라의 신속한 정제를 위한 단일-단계 양이온-교환 및 헤파린 크로마토그래피를 시험하였다. 0.5M NaCl를 함유한 PBS 중에 추출된 L1 단백질을 크로마토그래피 이전에 저염 PBS (LS PBS: 10mM NaCl PBS, pH 7.4) 중에 10배 희석하여, 컬럼에 L1이 결합될 수 있게 하였다. 한외여과를 이용하여 항원을 농축시키고 쥐의 면역원성 연구에 다운스크림 적용(downstream application)을 위하여 크로마토그래피 분획을 탈염시켰다.
전반적으로, 헤파린 크로마토그래피 및 Macrosep® 한외여과 스핀 튜브를 이용한 정용여과를 이용한 정제가 부분적으로-정제된 L1 및 L1-기반 키메라를 수득하기 위한 가장 우수한 전략이었고, 이들 방법은 후속의 쥐 면역학 실험을 위한 백신 항원을 제조하는데 이용되었다.
백신 항원의 정제
시료 준비
실시예 1에 전술된 바와 같이, HPV-16 L1 및 L1-기반 키메라를 N.bethamiana에서 발현시키고 추출 완충액으로 LS PBS를 이용하여 추출하였다. L1/L2(108-120), L1/L2(56-81), L1/L2(17-36), HPV-16 L1 및 NSs-주입된 식물 추출물에 대한 이중-정화(double-clarified) 조 상층액 (각각 백신 1-5)을 잔해를 제거하기 위하여 크로마토그래피 전에 0.22 ㎛ 밀리포어 필터를 통해 여과시켰다.
헤파린 크로마토그래피
AKTA Explorer System 10를 이용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 이 과정은 GE Healthcare 컬럼 지시 매뉴얼에 권고된 바를 따랐고 0.5 ml/분의 유속을 유지하였다. 시료를 로딩하기 전에 컬럼을 10 컬럼 부피 (cv)의 저염 세척 완충액 (LS PBS: 10mM NaCl PBS)으로 평형화시켰다. 조 추출물 (10-20 ml)을 사전 패킹된(pre-packed) 1ml HiTrap 헤파린 양이온-교환 컬럼 (GE Healthcare, Amersham Biosciences AB, Sweden)에 로딩하고 컬럼을 10 cv의 LS PBS 세척 완충액으로 세척하였다. 선형 이온 강도 구배를 이용한 파일럿 실험에서 각 HPV 항원에 대한 용리 프로파일을 최적화하여, 1.5M NaCl를 함유한 10 cv의 0-100% 고염 PBS (HS PBS) 용리 완충액을 컬럼에 적용하였다. <50% HS PBS를 컬럼에 적용한 경우 모든 항원이 용리되는 것을 확립한 후, 백신 항원의 정제를 위하여 50% 단계 용리 구배 (0.75M NaCl)를 적용하였다. 단계 용리 구배는 10 cv의 50% HS PBS, 이후 10 cv의 100% HS PBS였다. 최종적으로 컬럼을 5 cv의 증류수 및 5 cv의 20% 에탄올로 세척하였다. 분획 (1 ml)을 수집하고 웨스턴 도트 블롯에 의해 분석하였다.
정제된 HPV 항원의 웨스턴 도트 블롯 검출
도트 블롯을 실시예 1에 전술된 바와 같이 수행하였다. CamVir1 (1:10000)을 이용하여 L1을 검출하고 Cervarix를 양성 대조군으로 이용하였다. 고농도의 정제된 항원을 함유하는 용리된 분획을 풀링하고 -70℃에 저장하였다. NSs-주입된 식물 추출물 (V5: 음성 대조군)에 대하여, 용리된 단백질 피크에 상응하는 분획을 풀링하고 L1 양성 대조군 백신 (V4) 도트 블롯으로 시험하여, 이 분획이 L1을 포함하지 않는다는 것을 확인하였다.
한외여과에 의한 정제된 항원 시료의 탈염
50% HS PBS 용리 완충액 (0.75M NaCl) 중 정제된 항원을 쥐의 백신접종(vaccination) 전에 탈염시켰다. 10kDa MWCO 필터 (Macrosep® Centrifugal Devices, 10K Omega, PALL Life Sciences)를 갖는 한외여과 스핀 튜브를 이용하여 시료를 7000g에서 15-30분 동안 시료를 신속하게 원심분리함으로써 정제된 L1 분획을 농축 및 탈염시켰다. L1 항원을 포함한 농축물(retentate)을 LS PBS에 희석시키고, 시료가 상용 PBS (~0.15M NaCl)에서 발견되는 것과 유사한 NaCl 농도를 포함할때까지 제조사의 설명서에 따라 수차례 한외여과에 의해 재-농축하였다. 농축물과 여과물 분획을 모두 조사하였다.
항원 순도의 분석
정제를 평가하기 위한 HPV 항원의 쿠마시 염색 및 웨스턴 블롯 검출
각 백신 항원에 대한 조 추출물 및 정제된 시료를 쿠마시 염색 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 비교하였다. 실시예 1에 전술된 바와 같이 시료를 제조하고 동일한 부피를 2개의 10% SDS-PAGE 단백질 겔로 로딩하였다. 하나의 겔을 쿠마시 용액으로 밤새도록 실온에서 염색하고 2x 2시간 37℃에서 탈염색(destain)하였다. 나머지 겔을 니트로셀룰로스 막으로 블롯팅하고 CamVir1을 프로브로 이용하여 조사하였다(probe).
총 가용성 단백질 정량
음성 대조군 백신 (V5: NSs-주입된 식물 추출물)은 항-L1 웨스턴 블롯팅에 의해 정량할 수 없다. 그 결과, 총 가용성 단백질 (TSP)의 양을 (실시예 1에 전술된) Biorad Lowry 단백질 분석을 이용하여 각 백신 항원에 대하여 결정하여 TSP가 모든 백신에 대하여 유사하다는 것을 확인했다.
TSP 대비 항원의 농축( enrichment )을 결정하기 위한 포획 ELISA 에 의한 HPV 항원의 검출
선형 에피토프-특이적 단일클론 항체 (MAb) H16.J4를 이용하여, 실시예 1에 기술된 바와 같이 포획 ELISA를 수행하였다. 항원 농축을 결정하기 위하여 조 시료 및 정제 시료에서 ELISA에 의해 결정된 HPV 항원 수율을 상응하는 TSP 수율과 비교하였다.
정제된 백신 항원의 웨스턴 블롯 정량화
백신 Cervarix (40 ㎍/ml의 곤충 세포-생산 HPV-16 L1을 포함함)의 연속 희석물(dilution series)을 이용하여 식물-생산 HPV 항원 (V1-4)을 정량하였다. 항원의 여러 희석물(dilution)을 분석하여 정량화가 표준 곡선의 선형 범위 내에서 이루어졌는지를 확인하였다. 동일한 부피의 정제된 항원 및 Cervarix 희석물을 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하고, 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 블롯팅하고, HPV 항원을 CamVir1 (1:10000)로 검출하였다.
덴시토미트리(densitometry) (GeneTools, Syngene, Synoptics Ltd)를 이용하여 (Aires et al., 2006; Bazan et al., 2009에 의해 수행된 바와 같이) 항원을 정량하고 Cervarix 연속 희석물에 의해 생성된 표준 곡선을 이용하여 시료 중에 존재하는 HPV 단백질의 양을 결정하였다. 정량된 HPV 항원을 -70℃에 저장하였다.
항원의 세포질 발현 및 추출
엽록체로의 표적화와 대조적으로, 키메라 HPV L1/L2 단백질이 세포질로 표적화될 경우 작은 바이러스 유사 입자도 형성되는지를 규명하기 위하여, 전술된 방법을 이용하여 침묵 억제자 NSs와 함께 pRIC L1/L2 (108-120); L1/L2 (56-81) 및 L1/L2 (17-36)를 보유한 재조합 아그로박테리움을 N. benthamiana 식물에 주입하였다. 3 내지 5일 후 주입된 잎을 수집하고, 분쇄하고, 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하였다.
투과 전자 현미경 관찰에 의한 구조 분석
정제된 백신 항원의 분취물(aliquot)을 쥐의 백신접종을 위해 제조되는 것과 같이 전-처리하였다. 항원을 4℃에서 밤새도록 해동시키고, 필요한 농도로 PBS에 재현탁하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
정제 효과를 결정하기 위하여, 전-처리된 정제된 항원과 각 항원에 대한 식물 조 추출물을 PBS 중에 10x로 희석시키고, L1 단량체 및 조립된 L1 단백질에 결합하는 선형 에피토프-특이적 HPV-16 L1 항체인 CamVir1 (1:1000)을 이용하여 면역트래핑하고 (McLean et al., 1990), 글로-방전된(glow-discharged) 탄소-코팅 구리 그리드에 포획하였다. 단백질을 2% 우라닐 아세테이트에 의해 음성적으로 염색시키고(negatively stained) Zeiss 912 Omega Cryo EFTEM에서 관찰하였다.
결과
식물-발현 HPV 항원의 정제
정제된 추출물에서 HPV 항원의 검출
L1과 L1/L2 키메라의 정화된 상층액으로의 국소화를 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다. 쿠마시-염색된 단백질 겔은, 상층액 내 루비스코의 풍부한 존재 및 펠릿에 존재하는 여러 오염 단백질(contaminating protein)의 제거를 나타냈다 (데이터는 표시되지 않음).
HPV 항원의 파일럿 정제
L1/L2 키메라가 L1과는 대조적으로 여러 구조로 조립되는 것으로 보이므로, 크기-기반 기법을 이용한 정제는 대체적으로 성공적이지 않았고 백신 항원 간 재현성이 없었다. 또한, 단백질 분해가 검출되어 크로마토그래피를 이용한 정제를 대안으로 조사하였다.
L1-기반 키메라의 정제에서 HiTrap SPFF 또는 POROS 50HS 컬럼을 이용한 양이온-교환 크로마토그래피는 성공적이지 않았으나, 헤파린 친화성 크로마토그래피는 모든 항원을 정제하였다. 교차류 여과(cross-flow filtration) 또는 원심분리 스핀 컬럼에 의한, 2개의 한외여과-기반 방법을 이용하여 크로마토그래피 분획에서 염의 농도와 제거를 조사하였다. 교차류 한외여과는 효과적이었으나, 이 방법은 시간이 많이 소요되고 유의한 단백질 분해가 검출되어, 스핀 컬럼의 우선적인 이용을 가져왔다. 따라서, 헤파린 크로마토그래피와 원심분리 한외여과가 후속의 쥐 면역학 실험을 위한 백신 항원을 정제하기 위한 가장 좋은 전략으로 간주되었다.
헤파린 크로마토그래피를 이용한 정제
HPV 항원 용리를 위하여 높은 NaCl 구배를 이용한 헤파린 크로마토그래피에 의해 정화된 식물 조 상층액으로부터 백신 항원을 정제하였다. 선형 0-100% 1.5M NaCl 구배를 이용하여 각 HPV 항원에 대하여 단계 용리 구배를 최적화하였다. 모든 HPV 항원을 0.45 내지 0.75M NaCl로 용리시켰다 (데이터는 표시되지 않음). 그 결과, 50% (0.75M NaCl) 단계 구배를 이용하여 쥐의 면역원성 연구를 위한 백신 항원을 정제하였다. CamVir1 도트 블롯을 이용하여 용리물(eluate) 분획 중 정제된 HPV 항원의 검출을 결정하였다.
HS PBS 용리 완충액을 컬럼에 적용할 경우 흡수 피크가 검출되었고 이 분획은 정제된 HPV 항원을 포함하였다. NSs-주입된 식물 추출물 (음성 대조군)에 대한 그래프를 포함한, 나머지 백신 항원에 대한 크로마토그램은 유사했다. 이는, HPV 항원이 기타 오염 식물 단백질과 공동-정제되었다는 것을 나타낸다.
부분적으로-정제된 HPV 항원 (또는 음성 대조군에 대하여 공동-용리된 식물 단백질)을 포함하는 분획을 풀링한 후 한외여과 스핀 컬럼을 이용하여 탈염시켰다. 웨스턴 도트 블롯은 HPV 항원이 성공적으로 유지되고 농축되었다는 것을 나타냈다 (데이터는 표시되지 않음).
백신 항원의 순도
정제된 시료를 식물 조 추출물과 비교함으로써 백신 항원의 순도를 조사하였다. 이는 시료 중에 존재하는 총 단백질을 나타내는 쿠마시 염색 (도 5A), 및 HPV 항원을 검출하고 항원 수율에서의 손실을 나타내는 웨스턴 블롯 분석 (도 5B)을 이용하여 수행하였다. L1/L2(108-120) 키메라 (V1)는 나머지 L1/L2 키메라 (V2-3) 및 L1 대조군 (V4)보다 더 높게 나타난다는 것을 주목한다.
도 5는 정제 과정의 결과, 정제된 시료에 L1이 강화되었다는 것을 나타낸다. 쿠마시-염색 겔은 정제된 시료에서 총 단백질의 큰 감소를 나타내는 반면, 웨스턴 블롯 결과는 정제 후 항원 수율에서 단지 소량의 감소가 존재한다는 것을 나타낸다. L1 항원은 음성 대조군 (V5: NS-주입된 식물 추출물)에서 검출되지 않았다.
도 5A에서 (V2 및 V4보다 농축된) 정제된 항원 V1 및 V3에 대하여 추가적인 쿠마시-염색 단백질 밴드가 검출되었으므로, 시료는 단지 부분적으로-정제되었고, 따라서, 정제된 시료가 여러 오염 식물 단백질을 포함한다는 것을 보여주었다. 또한, NSs 음성 대조군 (V5)은 웨스턴 블롯에서 검출되지 않았으나, 여러 유사한 쿠마시 밴드가 정제된 NSs 시료에서 관찰되었다.
정제된 시료에서 HPV 항원의 농축
(a) TSP가 나머지 백신 항원에 비하여 (HPV 항원과 공동-정제된 식물 단백질을 포함하는) NSs 음성 대조군과 유사하다는 것을 확인하고, (b) 정제 후 HPV 항원 농축을 결정하기 위해 정제된 항원의 TSP를 결정하였다. 정제된 HPV 백신 항원 (V1-4)에 대한 TSP는 유사하였으나, 아마도 보다 많은 용리물 분획의 풀링이나 더 높은 한외여과 농축의 결과, NSs 식물 추출물 음성 대조군 (V5)에 대한 TSP는 거의 2배 더 높았다 (데이터는 표시되지 않음). 그 결과, 그에 맞춰 1x PBS에 희석시켰다.
선형-특이적 H16.J4 MAb를 이용한 포획 ELISA를 이용하여, 조 시료 및 정제된 시료에 존재하는 HPV 항원의 양을 추정하였다. TSP 및 HPV 항원의 농축에 대한 정제의 효과를 결정하기 위하여, H16.J4-검출 HPV 수율을 조 시료 및 정제된 시료에 대한 TSP 수율과 직접 비교하였다 (도 6).
도 6은 예상대로 식물 추출물의 정제가 TSP와 총 HPV 단백질을 감소시켰다는 것을 보여준다. 그러나, TSP에 비하여, 정제된 시료 (V1-4)에서 HPV 항원의 5배까지의 농축(enrichment)이 존재하여, 헤파린 크로마토그래피가 높은 비율의 오염 단백질을 제거하는데 효과적이라는 것을 시사한다. NS-주입된 식물 추출물 (V5)은 TSP에서 정제와 유사한 감소를 보였고 "정제된" 음성 대조군에서 TSP의 양은 HPV 백신 항원 (V1-4)에 대하여 수득된 수준 내에 존재한다.
정제된 HPV 항원의 웨스턴 블롯 정량
덴시토미트리와 표준 물질로 상용 백신 Cervarix를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 HPV 항원을 정량하였다 (데이터는 표시되지 않음). 특히 수회의 동결-해동 사이클 후에, ~45 kDa로 가시화되는, 일부 L1 단백질 분해가 정제된 항원 배치(batch) 중 일부에서 검출되었다. 그러나, 쥐의 면역원성 연구를 위해 제조된 시료에서 전장 56 kDa의 L1 밴드만 정량되었다.
정제된 백신 항원의 구조 분석
조 시료 및 정제된 시료에서 식물의 엽록체에서 생성된 L1과 L1/L2 키메라의 구조적 조립을 면역포획(immunocapture) 투과 전자 현미경 관찰에 의해 분석하였다 (도 7). 세포질에서 생성된 L1/L2 키메라의 구조적 조립을 조 시료로부터 면역포획 투과 전자 현미경 관찰에 의해 분석하였다 (도 8). 항원 정제는, 특히 L1/L2(108-120) 및 음성 대조군에 대하여, 오염 배경 단백질의 제거를 가져왔다 (각각 도 7A 및 E). 음성 대조군 (NSs-주입된 식물 추출물)에 비하여, 모든 HPV 항원은 캡소미어 (~10 nm), 캡소미어 응집체, 소형 VLP (~30 nm) 또는 전체-크기의 VLP (55 nm)인 2차 HPV 구조를 포함하는 것으로 나타났다.
소형 키메라 VLP (cVPL)로 조립된 정제된 L1/L2(108-120)는 형태가 규칙적이나 크기에서 변화하는 (~30 nm) 반면, VLP-유사 구조를 조 추출물에서 볼 수 있었으나, L1/L2(56-81)는 캡소미어와 일부 응집체만을 포함하는 것으로 보였다. 정제된 L1/L2(17-36)는 조 추출물과 대조적으로 무정형 cVLP의 혼합된 집단 및 높은 비율의 캡소미어 응집체를 포함하여, 정제가 보다 높은-차원의 구조 형성을 촉진했다는 것을 시사한다. 정제된 H4, HPV-L1 양성 대조군은, 이전 연구에서 기술된 바와 같이 (Biemelt et al., 2003; Maclean et al., 2007), 별개의 VLP (~50 nm)로 조립되었다.
논의
L1의 안정성이 다수의 정제 단계에 의해 부정적으로 영향받음에도 불구하고, 백신의 상용 정제를 위해 엄격한 정제가 요구된다. 헤파린 친화도 크로마토그래피가 조립된 L1을 선택적으로 정제하기 위하여 이용될 수 있고, 단일-단계 크로마토그래피 방법을 이용한 정제 전략이 HPV 백신의 신속하고 비용-효과적인 생산을 위하여 이상적일 것이다. 이 연구는 쥐에서 후속의 면역원성 연구를 위하여 헤파린 크로마토그래피를 이용한 식물-발현 HPV-16 L1 및 3개의 L1/L2 키메라의 정제를 보고한다.
L1 / L2 키메라 정제의 최적화
HPV-16 L1 및 L1-기반 키메라를 조 추출물 상층액으로 위치시키고 여러 방법을 이용하여 정제하였다. 크기-의존적 정제 방법이 식물-발현 HPV L1을 정제하는데 이용되었으나 (Biemelt et al., 2003; Maclean et al., 2007; Fernandez-San Millan et al., 2008), 이들 방법은 L1/L2 키메라 정제에 있어서 비효율적이고 항원 간 재현성이 없었다. L1 기반 키메라는 수크로스와 CsCl 밀도 구배 초원심분리를 이용한 여러 분획에서 광범위하게(broadly) 검출되어, L1/L2 키메라가 캡소미어, 응집체 및 VLP와 같은, 이종의, 보다 높은-차원의 구조로 조립되었다는 것을 나타냈다. 또한, 조립의 정도는 키메라와 L1 양성 대조군 간에 다른 것으로 보였다. 이는 투과 전자 현미경 관찰에 의해 확인되었고 (도 7), 이는 상이한 L1/L2 키메라와 L1 대조군 간의 명백한 차이를 나타냈다.
크로마토그래피는 표면 전하에 기초하여, 또는 프로테오글리칸 헤파린에 대한 친화도에 의해 HPV L1를 선택적으로 정제하는 다음 전략이었다. 효모-발현 HPV L1의 정제를 위한 양이온-교환 크로마토그래피의 이용은 P-11 포스포셀룰로스 (Kim et al., 2009, 2010) 또는 POROS 50HS 컬럼 (Cook et al., 1999)을 이용하여 입증되었다. 대조적으로, 식물-발현 L1/L2 키메라는 강한 양이온-교환 HiTrap SPFF 컬럼 또는 POROS 50HS 컬럼을 이용하여 효율적으로 정제되지 않았다. 적은 비율의 단백질이 POROS 50HS 레진에 강하고 비가역적으로 결합했으나, 대부분의 L1/L2 단백질은 어느 컬럼에도 결합하지 않았다. 이 현상은 Cook et al. (1999)에 의해, 10%의 HPV-11 L1이 레진에 결합하지 않았고 45-65%는 0.5M NaOH를 이용한 POROS 50HS 컬럼의 스트리핑(strippin) 없이 회수될 수 없었다고 기술되었다.
그 결과, L1/L2 키메라의 저조한(poor) 정제의 원인은 명확하지 않지만, 양이온-교환 크로마토그래피를 더 추구하지 않았다. 양전하 잔기 473-488번 아미노산 및 492-505번 아미노산을 포함하는 2개의 HPV-16 L1 염기성 C-말단 영역이 존재한다 (Zhou et al., 1991b; Sun et al., 1995, 2010). L2 서열 삽입은 L1의 C-말단 내 주요 염기성 영역과 겹쳐지지 않았고 414-439번 아미노산에서 최대 26개의 잔기를 치환시켰다. 가능한 설명은, L1의 전체 표면 전하가, 삽입된 L2 에피토프의 아미노산 구성에 의해 또는 단백질 조립의 차이에 의해 영향받았다는 것이다. 또한, 식물 조 추출물은 컬럼에 보다 강하게 결합하고 HPV L1 결합을 경쟁에서 이긴(out-compete) 수개의 오염 단백질을 포함했을 수도 있다.
백신 항원의 정제
쥐에서 후속 면역원성 연구를 위하여 헤파린 크로마토그래피를 이용하여 백신 항원을 정제하였다 (Joyce et al., 1999; Bazan et al., 2009; Johnson et al., 2009; Kim et al., 2009, 2010에 의해 기술됨). 헤파린은 유사한 방식으로 L1 및 L1/L2 키메라에 가역적으로 결합하였고 (데이터는 표시되지 않음), 모든 항원은 0.75M NaCl에 의해 용리되었다. 이는 헤파린-결합 HPV-16 L1이 0.5 - 1.2M NaCl에서 용리되었던 기타 연구와 비교할만하다 (Bazan et al., 2009; Kim et al., 2010; Baek et al., 2011).
헤파린은 L1의 C-말단에 존재하지 않는 입체형태적 모티프에 결합함으로써 조립된 L1 단백질을 선택적으로 정제하고 (Fleury et al., 2009) L2 서열 치환에 의해 영향받지 않는다. 변성된 L1은 중화 항체의 생성을 유발하지 않으므로, 이는 특히 백신 생산에 있어서 유리하다 (Kirnbauer et al., 1992; Suzich et al., 1995; Breitburd et al., 1995). 또한, Kim 등 (2010)은 헤파린 크로마토그래피를 이용한 HPV-16 L1의 정제가 높은 회수율 (~60%)을 제공하고 면역원성 VLP (직경이 25-65 nm)를 생성한다는 것을 보여주었다.
헤파린-정제 시료의 순도를 쿠마시 염색 및 CamVir1을 이용한 L1의 웨스턴 블롯 검출에 의해 조사하였다 (도 5). 조 시료와 비교할 경우, 항원 수율에서의 상대적으로 낮은 감소와 함께 총 단백질의 유의한 감소가 존재하였으므로, 정제된 시료에 L1 또는 L1/L2 키메라로 강화(enrich)되었다. 이는 H16.J4 포획 ELISA 및 TSP 분석에 의해 확인되었다 (도 6).
시료를 부분-정제하였고 시료는 정제된 음성 대조군에도 존재하는 (V5, 도 5A) 여러 오염 식물 단백질을 (V1 및 V2, 도 5A) 포함했다. 또한, 헤파린 크로마토그래피를 이용한 효모-발현 HPV-16 L1의 정제에서 오염물질이 관찰되었다 (Kim et al., 2010). 그 결과, 헤파린 크로마토그래피를 이용한 단일 단계 방법은 고도로-정제된 HPV L1 및 L1/L2 키메라를 얻기에 충분하지 않다. Kim 등 (2010)은, 효모로부터 공동-정제된 오염 단백질이 추가의 양이온-교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계에 의해 완전하게 제거되지 않았다는 것을 나타내어, 다수의 오염물질이 L1과 유사한 등전점 및 소수성 프로파일을 갖는다는 것을 시사한다. 또한, 추가의 크로마토그래피 단계는 L1 회수율을 ~10%까지 감소시켰다. 그러나, 헤파린 크로마토그래피 전에 효모-발현 HPV-16 L1의 암모늄 술페이트 침전에 의해 순수한 HPV-16 L1이 수득되었고, 이는 식물-발현 HPV L1-기반 단백질을 이용한 추가의 정제 연구에서 조사되어야할 방법이다.
항원의 웨스턴 블롯 정량
CamVir1-검출 L1 밴드의 강도를 측정하는 덴시토미트리 및 상용 백신 Cervarix를 HPV-16 L1 표준물질로 이용한, 웨스턴 블롯 분석에 의해 정제된 항원을 정량하였다 (Heidebrecht et al., 2009에 의해 논의됨)(데이터는 표시되지 않음).
특히 수회의 동결-해동 사이클 후, 정제된 항원의 배치(batch) 중 일부에서 L1 분해가 검출되었다. 이는 고농도의 V1, V2 및 V4에서 관찰되었다. 그러나, 대부분의 항원 단백질은 분해되지 않았고 단지 쥐가 유사한 투여량(dose)의 전장 항원에 의해 면역화되었다는 것을 확인하기 위해 전체-크기 56 kDa인 L1 밴드만 정량하였다. 다른 그룹은 곤충 세포 (Kirnbauer et al., 1992), 효모 (Cook et al., 1999) 및 박테리아 (Zhang et al., 1998)에서 발현된 경우 유사한 HPV-16 L1 분해 패턴을 보고하였다. 앞으로의 정제 연구에 있어서의 고려사항은, VLP의 해체(disassembly)가 저염 조건에서 일어나므로, 추출 및 정용여과 완충액의 염 농도이다 (Murata et al., 2009). 0.5 또는 1M NaCl까지 염 농도를 증가시키는 것은 VLP를 안정화시키고 (Mach et al., 2006) 정제된 시료에서 관찰되는 분해를 감소시킬 수 있다.
백신 항원의 조립
면역포획 전자 현미경 관찰을 이용하여 식물 세포의 엽록체에서 생산된 식물-유래 HPV-16 L1 및 L1/L2 키메라의 조립을 분석하였다 (도 7). 정제는 일부 배경 단백질을 제거하는 것으로 나타났고 모든 식물-발현 L1/L2 키메라와 L1 양성 대조군은 캡소미어, 응집체 및 VLP와 같은 보다 높은-차원의 구조로 조립되었다.
식물-발현 HPV-16 L1 VLP는 담배 엽록체로 위치될 경우, 일반적으로 직경 ~55 nm로 존재한다 (Maclean et al., 2007; Fernandez-San Millan et al., 2008; Lenzi et al., 2008). 이 연구에서, HPV-16 L1은 전체-크기의(full-sized) VLP로 조립되었다 (~50 nm, 도 7 Dii).
키메라의 VLP로의 조립은 L2 에피토프의 길이에 의해 영향받는 것으로 나타났고, L1/L2(108-120), L1/L2(17-36) 및 L1/L2(56-81)는 각각 13, 20 및 26 잔기 에피토프 치환을 포함했다. 가장 짧은 L2 에피토프를 갖는 식물-발현 L1/L2(108-120)는 L1 VLP보다 더 작은, 약 ~30 nm 직경의 별개의 cVLP로 성공적으로 조립되었다 (Chen et al., 2000) (도 7A). 대조적으로, 보다 큰 무정형 VLP-유사 구조의 존재가 작은 cVPL의 부분적-조립이 존재할 수 있다는 것을 시사하나, L1/L2(17-36)는 대부분 캡소미어 응집체를 형성하였다 (도 7C). 최종적으로, 가장 긴 L2 에피토프를 갖는 L1/L2(56-81)는 대부분 캡소미어로 조립되었다 (도 7B).
또한, L1/L2(108-120)는 곤충 세포에서 발현되었고, CsCl-정제된 키메라는 별개의 ~30 nm 직경의 cVLP 대신에, 무정형 VLP 및 캡소미어 응집체로 조립되는 것으로 확인되었다 (Varsani et al., 2003a).
pRIC 발현 벡터를 이용한 식물 주입의 결과, 세포질로 표적화된 키메라는 검출가능한 L1/L2(56-81) VLP의 형성을 초래하였다 (도 8). 이는, 본 명세서에 기술된 키메라 VLP가 식물의 세포질에서도 형성될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3: L1 / L2 키메라의 면역원성
이 연구에서, 식물-유래 L1 및 교차-중화 L2 에피토프 108-120번 아미노산, 56-81번 아미노산 및 17-36번 아미노산을 포함하는 3개의 L1/L2 키메라 후보 백신을 쥐에 면역접종하였다. 키메라의 면역원성을 키메라 조립에 대해 분석하고 및 동종 HPV-16 및 이종 HPV-18, 45 및 52 PsV에 대한 그의 항-L1, 항-L2 및 보호성 NAb를 유발하는 능력을 조사하였다.
방법 및 재료
쥐의 면역화
South African Vaccine Producers Animal Unit (Johannesburg, South Africa)으로부터 얻은 암컷 C57/BL6 쥐를 케이프 타운 대학교, Health Science Faculty 내 Animal Unit에서 Biosafty Level 2 (BSL-2) 조건하에 유지시켰다. 이 연구에 대한 허가는 케이프 타운 대학교 연구 윤리 위원회에 의해 부여되었다 (AEC 008/037).
식물-유래 HPV-16 L1/L2 후보 백신에 대한 체액성 항체 반응을 시험하기 위하여 쥐 (7-8 주령)를 면역화시켰다. 대조군은 식물 발현 HPV-16 L1 (양성 대조군) 및 NSs-주입된 식물 추출물 (음성 대조군)을 포함하였다. L1/L2(108-120) 키메라가 항-L1 반응을 유발(illicit)하는 것은 본 발명자의 실험실에 의해 확인되었고 (Varsani et al., 2003a; SAF로 공개), 따라서 추가의 양성 대조군으로 제공되었다. 백신접종의 상세한 사항이 표 5에 나타난다.
면역원성 연구에서 이용된 식물-유래 백신 항원
백신 백신 No .
( * n=10) 		그룹 No . ( * n=5) 항원 투여량
(㎍) 		† TSP ( mg / ml )
L1/L2(56-81) V2 G3 & G4 10 0.14
L1/L2(17-36) V3 G5 & G6 10 0.09
HPV-16 L1 (+) V4 G7 & G8 10 0.33
식물 추출물 (-) V5 G9 & G10 N/A 0.16
*n = 쥐의 수
†TSP = 총 가용성 단백질(total soluble protein)
100 ㎕ Dulbecco's PBS (DPBS; Sigma) 중에 10 ㎍의 투여량을 포함하도록 정제된 백신 항원을 조정하였다. 실시예 1에 전술된 바와 같은 Bradford 단백질 분석을 이용하여 각 백신의 총 가용성 단백질 (TSP)을 평가하여, 나머지 HPV 백신과 비교하여 음성 백신 대조군이 유사한 TSP를 포함한다는 것을 확인하였다 (표 5). 시린지-압출(syringe-extrusion) 기법을 이용하여 1:1 부피비로 Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA)에서 백신 항원의 균질화에 의해 백신을 제조하였다 (Koh et al., 2006).
쥐를 백신 당 5마리 쥐의 2개의 그룹으로 나누고 우측방(right flank), 좌측방 또는 서혜부(inguinal site)로 피하로 주사하였다. 백신접종 (0 일차) 12일 전에 사전-채혈(pre-bleed)을 수행하고, 62 일차에 (백신접종 후 ~9주) 최종 채혈을 얻기 전 13, 27, 41 및 48일차에 (시험 채혈을 얻는 것 대신 부스트를 처리하기로(boost) 결정한 경우, 48 일차를 제외하고, 약 2주마다) 쥐에 부스트를 처리하였다. 혈청을 분리하고 -70℃에 저장하였다.
쥐의 혈청에서 항- L1 항체의 ELISA 검출
곤충 세포-생산 HPV -16 L1 의 제조
쥐의 혈청에서 항-L1 항체를 검출하기 위한 ELISA 항원으로 곤충 세포-생산 HPV-16 L1을 이용하였다. 오염 식물 단백질에 대한 항체의 배경 검출을 피하기 위하여 식물-발현 L1 대신 곤충 세포-발현 L1을 이용하였다. 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (Sf-9) 세포를 SF90011 무-혈청 배지 (Gibco)에서 27℃에서 진탕하면서 배양하고, 1.0의 감염 다중도(multiplicity of infection: MOI) 및 1x106 개 세포/ml의 세포 밀도로 감염시켰다. 세포를 96시간 후 원심분리에 의해 (5분 동안 1000 x g) 수집하고 펠릿을 DPBS로 세척하고 -70℃에 저장하였다.
프로테아제 억제제 (Roche Complete EDTA-free)를 포함하는 고염 PBS (0.8M NaCl 1x PBS) 중에 세포를 4 x 106 개 세포/ml까지 재현탁하고 5x 20s 간격의 초음파 처리 및 휴지기로 얼음상에서 초음파 처리함으로써 (Microtip sonication; Level 5; Heat Systems - Ultrasonics, Inc. Sonicator Cell Disruptor Model W-225 R) HPV-16 L1을 추출하였다. 세포 용해물을 원심분리에 의해 (5분 동안 5000g) 정화하여 세포 파편을 제거하고 상층액을 이용하여 원심분리 단계를 반복하였다. 상용 백신 Cervarix (20 ㎍ HPV-16 L1)를 (전술된 바와 같이) HPV-16 L1의 웨스턴 블롯 정량을 위한 HPV-16 L1 표준물질로 이용하고 L1을 CamVir1 (1:10000; Abcam®)에 의해 검출하였다.
항- L1 항체의 ELISA 검출
직접 경합 ELISA에 의해 항-L1 항체의 역가를 결정하였다. 96-웰 Maxisorp 마이크로타이터 플레이트 (Nunc)를 1x PBS에 희석된 곤충 세포-생산 HPV-16 L1 항원 100 ㎕/well (30 ng)로 코팅하고 밤새도록 4℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 블록킹 완충액 (1x PBS 중 1% skim milk; 200 ㎕/웰)에 의해 블록킹한 후 PBS로 4x 세척하였다.
쥐의 혈청을 분석을 위해 백신으로 풀링하였다 (10마리 쥐/ 백신). 최종 채혈 쥐의 혈청을 1:50 내지 1:51200 희석 범위로, 3회 반복의(triplicate) 4배 시리즈로 블록킹 완충액에 희석하였다. 풀링된 사전-채혈 혈청을 1:50 희석도에서 시험하고 음성 대조군으로 제공하였다. 희석된 혈청을 웰에 첨가하고 (100 ㎕/웰) 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 양성 대조군 웰은 1:50 희석도의 항-L1 항체: 선형 및 입체형태적 에피토프에 결합하는 CamVir1 (Abcam®) (McLean et al., 1990), 및 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 H16.V5 MAb (Christensen et al., 1996)를 포함하였다. 항체가 부재하는 블랭크 웰(blank well)을 배경 대조군(background control)으로 포함시켰다.
4x PBS 세척 단계 후, 블록킹 버퍼에 희석된 고트 항-마우스 홀스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트 (1:2000; Sigma)를 웰에 첨가하고 (100 ㎕/웰) 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS (200 ㎕/웰)로 4x 세척하고 웰마다 100 ㎕의 O-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 (OPD) (DAKO; Denmark)를 첨가하였다. 플레이트를 암 조건에서 30분 동안 실온에서 현상하고, 반응을 0.5M H2SO4에 의해 중지시키고 490 nm에서 흡광도를 검출하였다. 1:50으로 희석된 상응하는 사전-채혈 혈청의 흡광도 판독값(absorbance reading)보다 더 높은 흡광도 판독값을 생성하는 최대 혈청 희석도(maximum serum dilution)의 역수로 항-L1 결합의 역가를 표현하였다.
통계 분석
양방, 비대응표본 t-검정 (two-tailed, non-paired t-test)을 이용하여, 음성 대조군 백신 대비, 최종 채혈 항-L1 반응의 통계적 유의성을 계산하였다 (p = 0.01). 일원분산분석(One-way Analysis of Varience: ANOVA)을 이용하여 백신을 비교하고, Fisher LSD, Turkey HSD 및 Bonferroni 검정을 이용하여 유의성을 결정하였다 (p = 0.01).
항- L2 항체의 웨스턴 블롯 검출
E. coli -생산 HPV -16 L2 의 제조
E. coli (David Mutepfa에 의해 제공)에서 pProEX htb 벡터를 이용하여 생산된 His-태깅 HPV-16 L2 단백질을 쥐의 혈청 중 항-L2 항체의 웨스턴 블롯 검출에 이용하였다. E. coli 배양물을 37℃에서 진탕하며 0.6의 OD600까지 배양한 후 0.6 mM 이소-프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)의 첨가에 의해 유도시켰다. 3시간 후, 원심분리 (4℃에서 15분 동안 3800g)에 의해 세포를 수집하고 펠릿을 유지시키고 중량을 측정하였다.
봉입체(inclusion body)를 4 부피의 용해 완충액 (50 mM Tris pH 8.5, 5 mM β-머캅토에탄올) 중 세포의 재현탁에 의해 추출하고 페닐메탄술포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 라이소자임 (Roche)을 각각 0.4 mM 및 0.08 ㎍/㎕의 최종 농도까지 첨가하였다. 세포를 얼음에서 20분 동안 인큐베이션하고, Triton-X를 1% 까지 첨가하고 용액에 점성이 있을때까지 37℃에서 20분 동안 추가로 인큐베이션하였다. DNase 및 RNase를 각각 4 ㎍/ml 및 40 ㎍/ml까지 첨가하고 점성이 없어질 때까지(viscosity cleared) 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
봉입체를 4℃에서 15분 동안 마이크로원심분리에서 13,000 rpm으로 원심분리함으로써 수집하고 펠릿을 1 ml 용해 완충액 (2.5 mM Tris pH 8.0, 3.125 mM β-머캅토에탄올, 0.2 mM EDTA, 0.0025% Triton-X)에 재현탁하고 실온에서 10분 동안 용해되게 하였다. 시료를 4℃에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하고 펠릿을 PBS에 의해 4x 세척하였다. 펠릿을 펠릿 중량의 1 부피 PBS에 재현탁하고, 소 혈청 알부민 (BSA) 표준물질을 이용한 쿠마시 염색에 의해 정량하고 -20℃에 저장하였다.
항- L2 항체의 웨스턴 블롯 검출
E. coli-생산 HPV-16 L2 항원을 5x 로딩 완충액에서 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하고 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 10-웰 콤(comb)을 사용하는 대신 2-웰 콤을 사용하였다: 단백질 마커를 위한 작은 웰, 및 함께 융합되어, 단백질이 전체에 걸쳐 동등하게 확산될 수 있게 하는 하나의 넓은 웰을 생성한, 9개의 웰로 구성된 큰 웰.
E. coli-발현 His-태깅 HPV-16 L2 항원 (2.5 mg)을 10% SDS-PAGE 겔 상에서 분리시키고 (Sambrook et al., 1989) 실시예 1에 전술된 바와 같이 반-건조 일렉트로블롯팅에 의해 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 그 후 웨스턴 블롯팅 프로토콜을 변형하여, L2 단백질 (~80 kDa)을 포함하는 55-130 kDa의 막의 부분을 12개의 유사한-크기의 스트립(strip)으로 나누고 상이한 혈청을 프로브로 이용하였다. 막 스트립을 25-웰 조직 배양 플레이트의 개별 웰로 이동시키고 4시간 동안 실온에서 블록킹 완충액 중에 인큐베이션하였다.
개별 사전-채혈 및 최종 채혈 쥐의 혈청을 백신으로 풀링하고 (백신 당 10마리의 쥐) 막 스트립을 양성 대조군 쥐 항-His 항체 (1:2000, Serotech) 또는 블록킹 완충액 중에 1:100으로 희석된 풀링된 쥐의 혈청을 프로브로 이용하여 조사하였다. 혈청을 상이한 웰에 첨가하고 밤새도록 실온에서 진탕하면서 인큐베이션하였다. 그 후 스트립을 블록킹 완충액으로 4x 10분 세척하고 알칼라인 포스파타제에 결합된 2차 고트 항-마우스 IgG 항체 (1:5000; Sigma)를 프로브로 이용하여 2시간 동안 실온에서 조사하였다. 개별 스트립을 세척 완충액에 의해 4x 10분 동안 다시 세척한 후 NBT/BCIP (Roche)에 의해 현상하였다.
덴시토미트리 (GeneTools, Syngene, Synoptics, Ltd)를 이용하여 각 L2 밴드의 흡광도 크기(absorbance intensity)를 측정하였다. 음성 대조군 백신과 연관된 값을 이용하여 값을 비-특이적 배경 흡광도에 대하여 정규화시켰다. HPV-16 L1 최종 채혈에서 관찰된 값의 2배보다 큰(>2x) 흡광도 값을 갖는 L2 밴드를 갖는 혈청이 항-L2 반응을 유발하였다.
HPV 슈도 비리온 ( pseudovirion ) 중화 분석
중화 분석을 위한 준비
HPV 슈도비리온 (PsV) 중화 분석을 위해 이용된 프로토콜은 Dr John Schiller’s Lab of Cellular Oncology technical files로부터 취하고 HPV L1/L2 pSheLL 플라스미드와 pYSEAP 리포터 플라스미드는 Dr John Schiller에 의해 친절하게 제공받았다.
(실시예 1에 전술된 바와 같이) pYSEAP 플라스미드를 SalI 및 BamHI 제한효소 절단을 이용하여 체크하였다. HPV L1/L2 pSheLL 플라스미드는 크기가 유사했고 유사한 제한효소 부위를 가졌고, 따라서, 플라스미드를 시퀀싱하여 HPV L1 및 L2 유전자의 상류 및 하류에 결합하는 2 세트의 pSheLL 벡터-특이적 프라이머를 이용하여 그들의 존재를 확인하였다(confirm their identity) (표 6). DNAMAN 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 서열을 HPV L1/L2 pSheLL 플라스미드 서열 및 HPV L1 또는 L2 유전자 서열과 정렬시켰다.
표 6: pSheLL 벡터-특이적 시퀀싱 프라이머
시퀀싱 표적 프라이머 서열 T m
(℃) 		크기 ( nt )
HPV L1 L1 Fwd TGACCTTATGGGACTTTCCTAC (서열번호 18) 56.3 22
　 L1 Rvs CACCATAAGCAGCCACAAT (서열번호 19) 55.5 19
HPV L2 L2 Fwd TACCACCACGAACAAGCAC (서열번호 20) 57.5 19
　 L2 Rvs AAGCCATACGGGAAGCAA (서열번호 21) 55.4 18
pYSEAP 플라스미드 및 HPV-16, 18, 45 및 52 pSheLL 플라스미드 (표 7)에 대한 적절한 항생제 선발하에 배양한 E. coli 배양물로부터 내독소-불포함(endotoxin-free) 플라스미드 DNA (NucleoBond® Xtra Midi EF, Macherey-Nagel)를 제조하고 DNA를 -70℃에 저장하였다.
표 7: 본 연구에서 이용된 HPV PsV 중화 분석 플라스미드 벡터
플라스미드 HPV
타입 		목적 유전자 크기 ( bp ) 항생제 저항성
p16 SheLL HPV -16 L1 & L2 10827 암피실린 (100 ㎍/ ml )
p18 SheLL HPV -18 L1 & L2 10723 암피실린 (100 ㎍/ ml )
p45 SheLL HPV -45 L1 & L2 10814 암피실린 (100 ㎍/ ml )
p52 SheLL HPV -52 L1 & L2 10725 암피실린 (100 ㎍/ ml )
pYSEAP - SEAP 5297 블라스티시딘 (75 ㎍/ ml )
HEK293TT 세포의 형질감염( transfection )
HEK293TT 세포주를 Dr John Schiller에 의해 친절하게 제공받았다. 2010년 6월에 수정된 “Production of Papillomaviral Vectors (Pseudoviruses)”프로토콜에 기술된 바와 같이 HPV PsV를 제조하였다.
HEK293TT 세포를 1% GlutaMAXTM (Gibco) 및 10% 소태아혈청(fetal calf serum, Gibco)을 포함하는 cDMEM (complete high glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 배양하였다. TT 항원 (cDMEM-Ab)을 선발하기 위해 cDMEM 배지에 1% 비-필수 아미노산 (Gibco), 100 units/ml 페니실린 (Gibco), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (Gibco), 10 ㎍/ml FunginTM (InvivoGen) 및 250 ㎍/ml 하이그로마이신 B (Roche)를 보충하였다. 이 프로토콜에 기술된 바와 같이 세포의 해동(thawing) 및 계대(passaging)를 수행하였다.
다음날 50-70% 밀집도(confluence)에 도달하게 하기 위해, 175cm2 플라스크 중 cDMEM (항생제 또는 하이그로마이신 B 불포함)에 세포를 프리-플레이팅(pre-plated)하였다. 형질감염 당일, 신선한 cDMEM을 세포에 첨가하고 내독소-불포함 플라스미드 DNA의 분취물(aliquot)을 얼음에서 해동시켰다. 형질감염 혼합물을 하기와 같이 제조하였다: 175 ㎕ FuGene6 (Roche)를 백색-뚜껑 원추형 튜브(white-capped conical tube)(Sterilin) 중 GlutaMAX를 함유한 5.7 ml DMEM (무 혈청 배지)에 첨가하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 총 40 ㎍ DNA를 첨가하고 (각 플라스미드 20 ㎍), 혼합물을 실온에서 추가로 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포에 적상으로(dropwise) 첨가하였다. 플라스크를 5% CO2 가습 인큐베이터에서 37℃에서 40-48시간 동안 인큐베이션하고 배지를 형질감염 6시간 후 교체하였다 (cDMEM).
슈도비리온 의 추출
형질감염 40-48시간 후 슈도비리온을 수집하였다. 세포를 0.05% Trypsin-EDTA (Gibco)에 의해 트립신화(trypsinisation)함으로써 수집하고 cDMEM의 첨가에 의해 불활성화시켰다. 세포를 원추형 바닥(conical-bottomed) 폴리스티렌 Sterilin 튜브로 옮기고 (슈도비리온이 폴리프로필렌 튜브에 비-특이적으로 흡착함), 계수하고 1200 rpm x 8 분으로 원심분리하였다. 펠릿을 0.5ml DPBS (Invitrogen)에 의해 세척하고 DPBS-Mg (추가의 9.5 mM MgCl2를 포함한 DPBS)의 1.5 펠릿 부피에 재현탁하여 >100 x 106 개 세포/ml의 높은 세포 밀도를 달성하였다.
10% Brij-58 (Sigma)를 최종 농도 0.5% (w/v)까지 재현탁 펠릿에 첨가하고 Benzonase (Sigma) 및 Plasmid-SafeTM ATP-dependent DNase (Epicentre)를 각각 0.5% (v/v) 및 0.2% (v/v) 첨가하였다. Chris Buck의 "Improved Maturation of HPV and Polyomavirus" 프로토콜을 이용하여, 멸균 암모늄 술페이트 (1M, pH 9.0)를 최종 농도 25 mM까지 첨가하여 분자간 L1 이황화결합의 형성을 촉진시켰다. 혼합물을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 용해시킨 후 밤새도록 슈도비리온 성숙을 위한 바람직한 온도로 옮겼다 (HPV-16 및 18의 경우 25℃ 및 HPV-45 및 52의 경우, 37℃).
성숙된 용해물(matured lysate)을 얼음에서 5분 동안 냉각시키고 용해물의 최종 NaCl 농도를 850 mM로 조정하고 얼음에서 추가로 10분 동안 인큐베이션하였다. 용해물을 4℃에서 10분 동안 3000 x g로 원심분리함으로써 정화하였다. 상층액을 수집하고, 펠릿을 동일 펠릿 부피의 고염 DPBS (0.8M NaCl)에 재현탁시키고 및 재-원심분리하여 펠릿을 재-추출하였다. 상층액을 풀링하고, 재-원심분리하고 백색의 뚜껑달린 폴리스티렌 튜브로 옮기고 얼음에 유지시켰다.
슈도비리온의 정제
PsV를 Optiprep 밀도 구배 원심분리에 의해 정제한다. Optiprep (60% w/v 이오딕사놀(iodixanol) 용액; Sigma)을 DPBS 중에 46% (w/v) Optiprep 스톡 용액으로 희석시키고, 0.625M NaCl 내지 최종 농도 0.8M NaCl, CaCl2 0.9mM, MgCl2 0.5mM 및 KCl 2.1mM로 보충하였다. 고염 DPBS (0.8M NaCl)를 이용하여 스톡 용액을 27%, 33% 및 39% Optiprep으로 희석시키고, 박벽(thin wall) 5 ml 폴리알로머 초원심분리 튜브 (Beckman)에서 1.5 ml 단계(step)로 Optiprep 희석물 (27 - 39%)을 언더레이(underlaying)함으로써 3-단계 구배를 제조하였다. 구배를 방치하여 실온에서 4시간 동안 확산시켰다. 이중-정화된 세포 상층액을 선형화된 Optiprep 구배 상으로 층을 이루게 하고 Beckman SW55ti 로터에서 50,000 rpm으로 (234,000 x g) 3.5시간 동안 16℃에서 원심분리하였다. 주사 바늘로 튜브의 바닥에 구멍을 뚫고 분획을 백색의 뚜껑달린 폴리스티렌 튜브에 수집하였다: 제1 분획은 ~0.75 ml이고, 제2-11 분획은 각각 ~0.25 ml이고 제12 분획은 구배의 나머지를 포함하였다.
HPV 타입-특이적 항-L1 도트 블롯을 이용하여, 분획을 스크리닝하기 위한 프로토콜을 변형시켜 캡시드에 존재하는 주요 단백질인 HPV L1의 존재를 검출하였다 (Buck et al., 2008). 각 분획을 니트로셀룰로스 막 (0.5 ㎕) 위에 스팟을 찍고 Cervarix (HPV-16 L1), E. coli-생산 His-태깅 HPV-16 L2, 또는 최초에 구배상으로 로딩된 정화된 HPV-16, 18, 45 또는 52 상층액을 양성 대조군으로 이용하였다.
막을 실온에서 30분 동안 블록킹 완충액에서 블록킹한 후 블록킹 완충액 중에 희석된 적절한 1차 항-L1 항체를 프로브로 이용하여 실온에서 밤새도록 반응시켰다(probe). CamVir1 (1:5000; Abcam)을 이용하여 HPV-16을 검출하였다. 또한, 토끼 항 HPV-16 L2 혈청이 이용가능했고 HPV-16 분획 (1:2000)에서 L2를 검출하는데 이용하였다. Dr Neil Christensen에 의해 친절하게 제공된 H16.I23, H45.N5, H52.C1 및 H52.D11 MAb를 이용하여 각각 HPV-18, 45 및 52를 검출하였다 (1:2000; Christensen et al., 1996). 막을 1:10,000 2차 항체 (알칼라인 포스파타제에 접합된 고트 항-마우스 IgG 또는 고트 항-래빗 알칼라인 포스파타제 컨쥬게이트; Sigma)를 프로브로 이용하여 반응시키고, 세척하고 전술된 바와 같이 현상하였다. 고농도의 L1을 포함하는 피크 분획을 폴리스티렌 튜브에 풀링하고 적정을 위해 70℃에 저장하였다.
슈도비리온의 전자 현미경 관찰
정제된 HPV PsV를 전자 현미경 관찰을 이용하여 분석하였다. PsV (1:1000)를 글로-방전된 탄소-코팅 구리 그리드 상에 모으고(trapped), 2% 우라닐 아세테이트에 의해 염색하고, Zeiss EM 912 CRYO EFTEM을 이용하여 관찰하였다.
슈도비리온 적정
PsV 적정 및 중화 분석은 적정에 NAb가 포함되지 않았다는 것을 제외하고는, “Papillomavirus Neutralisation Assay” 프로토콜을 기초로 하였다. SEAP 분석에서 명확한(robust) 신호를 위해 요구되는 최소량의 PsV를 결정하기 위해 PsV 스톡을 중화 분석 전에 적정하였다.
HEK293TT 세포를 cDMEM-Ab 중에 70-80% 밀집도까지 성장시키고, 기술한 바와 같이 수집하고, DPBS로 세척하고 중화 배지 (HEPES를 포함하고 페놀 레드 또는 소듐 피루베이트를 포함하지 않고, 10% 소태아혈청이 보충된 고 글루코스 cDMEM; Gibco)에서 3.0 x 105 개 세포/ml로 희석시켰다. 내벽으로부터 증발되는 것을 피하기 위하여 각 내부 웰에 100 ㎕ 세포 현탁액 및 외부 웰에 페놀 레드를 갖는 150 ㎕의 DMEM로 96-웰 조직 배양 처리된 플레이트 (Corning Costar)에 세포를 프리-플레이팅하였다. PsV의 첨가 전에 세포를 3-4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
미-처리 멸균 96-웰 폴리스티렌 플레이트 (Nunc) 내 중화 배지에 일 PsV의 연속 희석물을 제조하고 (1:250부터 1:64000까지의 2배 희석물(doubling dilution)) 3회 반복으로 시험하였다. Schiller의 프로토콜에 요약된 바와 같이 PsV 희석물을 프리-플레이팅된 세포에 첨가했고 (100 ㎕/웰), 각 플레이트는 슈도비리온이 없는 6개의 음성 대조군 웰을 포함하였다 (세포 대조군). 플레이트를 가습 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
(수정된 Schiller의 프로토콜에서 수행된 바와 같이) 제조사의 프로토콜에서 주어진 것의 0.6 부피로 부피를 조정하는 것을 제외하고는, 매뉴얼 지시에 따라 Great EscAPeTM SEAP Chemiluminescence Kit 2.0 (Clontech Laboratories, Inc.)를 이용하여 SEAP 활성을 검출하였다. 상층액 (125 ㎕)을 멸균된 미처리 96-웰 폴리스티렌 플레이트 (Nunc)로 옮기고 1000 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 정화된 상층액 (15 ㎕)을 백색 96-웰 Optiplate (96F white maxisorb luminometer plates; Nunc)로 옮기고, 45 ㎕ 1x 희석 완충액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 65℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 5분 동안 얼음에서 냉각시킨 후 60 ㎕의 기질을 웰마다 첨가하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트 루미노미터(microplate luminometer)(Digene DML 2000)를 이용하여 SEAP 생성을 검출하였다. 중화 분석을 위해 선택된 PsV 희석물은 적정 곡선의 선형 범위 내에서 발생한 최소량의 PsV를 사용한 것이었다. HPV-52 역가가 매우 낮았으므로, 1:125 내지 1:4000로 재적정하였다.
슈도비리온 중화 분석
인 비트로 중화 분석을 이용하여 쥐의 혈청에서 HPV-특이적 항체 반응을 검출하고 종말점 중화 역가(endpoint neutralisation titre)를 결정하였다.
대조군은 하기를 포함했다:
(a) 세포 대조군 (음성 감염 대조군): 세포를 중화 배지 단독 (혈청 또는 슈도비리온 불포함)과 세포 배양물 상층액의 배경 판독값(background reading)을 제공하기 위해 인큐베이션하였다. 이 대조군과 연관된 발광 값(luminescent value)은 0% PsV 중화를 나타냈다.
(b) PsV 대조군 (양성 PsV 감염 대조군): PsV는 세포 감염 전 중화 완충액에 사전-인큐베이션하였다. 이 대조군과 연관된 값은 100% PsV 중화를 나타냈다.
(c) 분석에 이용된 HPV-타입 PsV를 중화하는 것으로 알려진 MAb 또는 항혈청 (양성 중화 분석 대조군): PsV를 사전-결정된 중화 역가 (0-100% 중화)를 포괄하는 6개의 희석물과 사전-인큐베이션하였다.
(d) 사전-채혈: PsV를 풀링된 쥐의 사전-채혈과 함께 사전-인큐베이션하였다 (음성 대조군).
NAb 양성 대조군 (표 8)을 시험 혈청 중화 분석 전에 적정하여 PsV 중화 분석에 이용될 중화 희석 범위를 결정하였다. HPV-16, 45 및 52 중화 대조군은 H16.V5, H45.N5, H52.C1 및 H52.D11 MAb이었다. HPV-18 대조군은 본 발명자의 실험실로부터 얻은 토끼 항-Cervarix 혈청이었다.
표 8: HPV 타입-특이적 중화 항체
양성 대조군 항체 중화된 HPV 타입 희석 배수 희석 범위
쥐 H16.V5 복수(ascite) HPV-16 10-배 2x102 - 2x107
토끼 항-Cervarix 혈청 HPV-18 4-배 50 - 51200
쥐 H45.N5 복수 HPV-45 4-배 800 - 819200
쥐 H52.C1 상층액 HPV-52 10-배 2x102 - 2x107
쥐 H52.D11 상층액 HPV-52 10-배 2x102 - 2x107
식물-생산 HPV-16 키메라 후보 백신에 의해 면역화 쥐로부터 얻은 혈청을 풀링하고(10마리 쥐/백신) HPV 16, 및 HPV-18, 45 및 52의 중화에 대하여 시험하였다. 풀링된 백신 혈청을 1:50 내지 1:12800의 범위에서 3회 반복으로 4-배 희석하였다. 또한, 음성 대조군으로서 사전-채혈을 풀링하고 3회 반복으로 1:50의 가장 낮은 희석도에서 시험하였다. 멸균된 미-처리 96-웰 조직 배양 플레이트에서 혈청 연속 희석물을 제조하였다 (1:10 내지 1:2560).
PsV를 적정 분석에서 사전-결정된 농도까지 중화 완충액에 희석하였다. 또 다른 미처리 96-웰 플레이트에서, 100 ㎕의 희석된 PsV를 각 웰에 첨가하고 25 ㎕의 희석된 혈청 (또는 PsV 대조군 웰의 경우, 중화 완충액)을 3개의 반복 웰(triplicate well)에 첨가하여, 사전-희석된 혈청의 추가적인 1:5 희석물을 생성하였다. PsV와 혈청을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 감염성 PsV의 중화를 가능하게 한 후, 프리-플레이팅된 HEK-293TT 플레이트 내 각 웰에 100 ㎕를 첨가하였다 (세포 대조군 웰의 경우, 중화 완충액). 플레이트를 37℃ 가습된 CO2 인큐베이터에서 추가로 72시간 동안 인큐베이션하였다.
상층액을 전술된 바와 같이 수집하고 SEAP의 존재에 대하여 분석하였다. 혈청과 사전-인큐베이션되지 않은 대조군 시료에 비하여 SEAP 활성을 50% 이상 감소시키는 최대 혈청 희석도의 역수로, 중화 역가를 나타냈다.
결과
HPV -16 L1 에 대한 체액성 면역 반응
곤충 세포-발현 HPV-16 L1을 코팅 항원으로 이용하여, 직접 경합 ELISA에 의해 HPV-16 L1에 대하여 유발된 항체의 검출을 수행하였다 (도 9). 1:50에서 상응하는 사전-채혈 혈청의 흡광도 판독값보다 더 높은 흡광도 판독값을 포함하는 최대 혈청 희석도의 역수로 항 L1 역가를 표시하였다.
L1/L2(56-81) 키메라와 음성 대조군 백신 (V2 및 V5; 도 9A) 및 백신 사전-채혈에 대하여 항-L1 반응이 검출되지 않았다 (도 9C). 이에 비하여, ELISA MAb (H16.V5, CamVir1, 도 9B) 및 식물-유래 L1 양성 대조군 (V4, 도 9A)은 우수한 반응을 보였고 식물-유래 L1/L2(17-36) 및 L1/L2(108-120) 키메라는 각각 200 및 12800의 항-L1 역가를 유발하였다 (V3 및 V1, 도 9A). HPV-16 L1이 가장 높은 항-L1 역가를 유발하였으나 (12800-51200), L1/L2(108-120)는 유사한 반응을 보여 (각각 V4 및 V1, 도 9A), L2 108-120번 아미노산 에피토프의 삽입물이 나머지 키메라에 비하여 L1 면역원성에 대하여 영향을 덜 미친다는 것을 시사한다. 또한, L1/L2(108-120) 및 HPV-16 L1 항-L1 반응은 그에 상응하는 사전-채혈 및 NSs-주입된 식물 추출물로부터 통계적으로 유의하였다 (p = 0.01).
HPV -16 L2 에피토프에 대한 체액성 면역 반응
E. coli-생산 His-태깅 HPV-16 L2 단백질에 대한 항-L2 반응을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 결정하였다. 개별적인 쥐의 혈청을 각 백신에 대하여 풀링하고 항-L2 반응에 대하여 분석하였다 (도 10).
음성 백신 대조군 (V5; 식물 추출물) 및 이 실험에서 추가의 음성 L2 대조군으로 제공되는 L1 백신 대조군 (V4; 식물-발현 HPV-16 L1)으로부터 얻은 항혈청에서 ~80 kDa L2 밴드와 유사한 비-특이적 밴드가 검출되었다 (도 10). 키메라 항혈청을 이용하여 강한 L2 밴드가 검출되었으므로, 모든 키메라 백신 (V1-3)은 항-L2 반응을 생성하는 것으로 보였다 (도 10). 그러나, L1/L2(108-120) 및 L1/L2(17-36) 키메라 (각각 V1 및 V3)만이 최종적인 항-L2 반응을 생성했고, L2 밴드는 HPV-16 L1 (V4)의 강도의 2배보다 높았다(>2X).
중화 분석
플라스미드 분석
제한효소 절단 및 시퀀싱을 이용하여 pYSEAP 및 HPV-16, 18, 45 및 52 L1/L2 pSheLL 플라스미드의 존재를 확인하였다 (데이터는 표시되지 않음).
Optiprep 정제 및 정제된 분획에서 HPV PsV 검출
27-39% Optiprep 선형 구배 상에서의 밀도 구배 초원심분리에 의해 정화된 세포 상층액으로부터 HPV PsV를 정제하였다. 구배로부터 1/3 지점에(a third of the way up from the gradient) 높은 옅은 회색 밴드가 희미하게 나타났고 분획을 튜브에 바닥으로부터 수집하였다.
Cervarix 및 E. coli-생산 His-태깅 HPV-16 L2를 대조군으로 이용하여, HPV 타입-특이적 항-L1 도트 블롯 CamVir1을 이용하여 PsV의 존재에 대하여 분획을 스크리닝하고 HPV-16 L2에 대한 토끼 항혈청을 이용하여 HPV-16 L1 및 L2를 검출하였다. 최초 정화된 세포 상층액을 HPV 타입-특이적 대조군으로 이용하여, H16.I23, H45.N5, H52.C1 및 H52.D11 MAb를 이용하여 각각 HPV-18, 45 및 52를 검출하였다 (데이터는 표시되지 않음).
L2 단백질이 공동-조립된(co-assembled) L1/L2 VLP에서 L1 캡시드의 표면에 내부적으로 위치하므로, HPV-16은 H16.V5를 이용하여 분획 3-5에서 검출되고 HPV-16 L2 항혈청에 의해 약하게 검출되었다 (Buck et al., 2008). HPV-18, 45 및 52 L1은 각각 분획 5-7, 4-6 및 6-10에서 강하게 검출되었다. PsV 분획을 풀링하고 전자 현미경 관찰에 의해 조사하고 중화 분석에서 이용하였다.
전자 현미경 관찰 분석
풀링된 PsV 시료를 투과 전자 현미경 관찰에 의해 조사하여 그의 조립, 형태 및 정제를 결정하였다 (데이터는 표시되지 않음). 모든 HPV 타입이 구형의 PsV (55 nm)로 조립되었다. HPV-45 PsV는 전적으로 완전히-조립된 PsV 입자로 존재하는 것으로 나타났다. 일부 캡소미어와 응집체가 관찰되었으나, HPV-16 및 18 PsV가 주로 조립되었다. HPV-52 PsV는, 아마도 HEK293TT 세포에서 낮은 HPV-52 L1 및 L2 발현의 결과, 높은 비율의 캡소미어 응집체 및 부분적인 PsV를 포함하였다.
HPV PsV 적정
정제된 PsV를 적정하여 중화 분석을 위해 이용될 PsV의 희석도를 결정하였다. 이용된 희석도는 적정 곡선의 선형 범위 내에서 명확한 신호를 생성하는 최소량의 PsV였다.
HPV-16 및 18 PsV의 경우, 적정 곡선의 선형 범위가 1:250 내지 1:1000의 희석도에서 나타나므로 (데이터는 표시되지 않음), 1:500을 중화 분석을 위하여 선택하였다. HPV-45 PsV는 가장 높은 역가를 가지며, 1:500 내지 1:2000의 희석도에서 선형 범위가 나타났고, 따라서 추가 작업을 위하여 1:1000을 선택하였다 (데이터는 표시되지 않음). HPV-52 PsV는 보다 낮은 희석도를 이용하여 재-적정되어야 했다. 선형 범위는 1:125 내지 1:250의 희석도에서 발생하였고 (데이터는 표시되지 않음), 1:200 희석물을 HPV-52 중화 분석에 이용하였다.
양성 대조군 중화 항체의 적정
그의 중화 능력을 체크하고 적합한 희석 범위를 결정하기 위해, NAb 양성 대조군을 쥐의 항혈청에 의한 중화 분석 전에 시험하였다. 모든 양성 대조군 항체가 중화 항체였고, 시험된 희석 범위 내에서 선형 관계를 보였다 (표 9).
표 9: 양성 대조군 중화 항체의 적정
HPV PsV 타입 양성 대조군 희석 범위 PsV 중화도 (%)
HPV-16 H16.V5 2x102 - 2x107 19 - 100
HPV-18 항-Cervarix 혈청 50 - 51200 34 - 99
HPV-45 H45.N5 800 - 819200 29 - 100
HPV-52 H52.C1 2x102 - 2x107 0 - 98
H52.D11 2x102 - 2x107 0 - 98
HPV PsV 중화 분석
식물-생산 HPV-16 L1 및 L1/L2 키메라에 의해 면역화된 쥐로부터 얻은 혈청을 HPV-16 PsV의 동종 중화(homologous neutralisation) 및 HPV-18, 45 및 52 PsV에 대한 이종 교차-보호(heterologous cross-protection)에 대하여 시험하였다 (도 10-13). 모든 양성 대조군 NAb는 HPV-16, 18, 45 및 52 PsV를 성공적으로 중화시켜 (도 10-13F), 중화 분석 결과가 유효하다는 것을 보여주었다. 중화 역가는, 혈청에 의해 처리되지 않은 대조군 시료에 비하여 >50% 까지 SEAP 활성을 감소시키는 혈청의 최고 희석도로 정의되었다.
HPV -16
HPV-16 PsV 중화 분석으로부터 얻은 결과가 도 11에 표시된다. 식물-유래 HPV-16 L1 혈청 (V4; 도 11D)은 H16.V5 양성 대조군 (도 11F)을 모방(mimick)하였고 HPV-16 PsV를 강하게 중화시켰고, 유사한 중화 곡선을 갖는 L1/L2(108-120)가 뒤를 이었다 (V1; 도 11A). L1/L2(56-81) 및 L1/L2(17-36)는 HPV-16 NAb를 유발하는 것으로 나타나지 않아서 (V2-3; 도 11B-C), 음성 대조군과 유사한 중화 곡선을 나타냈다 (V5; 도 11E).
HPV -18
모든 백신으로부터 얻은 항혈청은 HPV-18 PsV를 중화시키지 않았다 (도 12). L1/L2(56-81) 및 L1/L2(17-36) 키메라 (V2-3, 도 12B-C)는 타입-특이적 HPV-16 L1 백신 및 음성 대조군과 유사한 중화 곡선을 생성하였다 (V4-5, 도 12D-E). L1/L2(108-120)는 일부 중화 활성을 갖는 것으로 나타났고, <800의 혈청 희석도 역수는 발광 판독값을 사전-채혈 및 중화되지 않은 HPV-18 대조군의 발광 판독값 미만으로 감소시켰다 (V1; 도 12A). 그러나, 키메라는 SEAP 수준을 >50% 감소시키지 않았다.
HPV -45
HPV-45 PsV 중화 분석으로부터 얻은 결과 (도 13)는, 한 중화 곡선을 가져, L1/L2 키메라 백신 중 어느 것도 (V1, V2 및 V3; 도 13A-C) HPV-45 NAb의 유의한 역가를 유발하지 않았고, 중화 곡선이 HPV-16 L1 및 음성 백신 대조군과 유사했다 (V4-5; 도 13D-E)는 것을 시사한다.
HPV -52
HPV-52 PsV 중화 분석 (도 14)은, HPV-16 L1과 음성 대조군 혈청에서 나타난 바와 같이 (V4-5; 도 14D-E), L1/L2(56-81) 혈청이 HPV-52를 중화시키지 않았다는 증거를 제공한다 (L2; 도 14C). L1/L2(108-120) 및 L1/L2(17-36) 키메라 백신은 낮은 역수 희석도 (50-200)에서 일부 중화 활성을 가져서, 중화되지 않은 HPV-52 PsV 대조군에 비하여 >50% SEAP 수준을 감소시킨 (V1 및 V3; 도 14A 및 C) 것으로 보였다.
H52.C1 NAb 대조군에서 나타난 바와 같이 분석이 성공적이었음에도 불구하고 (도 14F), 3개의 반복 시료 간에 더 많은 변이(variation)가 존재하고 추세선(trend line)을 확립하기 어려웠다. 이는 반복물 간 작은 차이를 과장시켰을 수 있는 HPV-52 PsV의 부분적 정제 및 낮은 농도에 기인할 수 있다. HPV-52 PsV 감염 대조군에 대한 값은, V1, V2 및 V4가 (도 14A-B 및 D) V3, V5 및 H52.C1로부터 상이한 플레이트에서 분석되었기 (도 14C 및 E-F) 때문에, 백신 간에 상이하다. 시간적 제약으로 이 분석을 반복하지 못했다.
표 10은 식물-유래 백신에 의해 유발된 HPV-16, 18, 45 및 52 PsV 중화 항체 역가를 요약한다. L1/L2(108-120)는 동종 HPV-16 NAb를 유발하고 항혈청은 이종 HPV-52 PsV를 교차-중화시켜, 이 백신이 보호에 있어서 가장 높은 가능성을 갖는다는 것을 시사한다. L1/L2(17-36) 키메라는 낮은 수준의 교차-중화 HPV-52 NAb를 유발하나, 동종 HPV-16 NAb는 검출되지 않아서, HPV-16 L1에 대한 면역원성이 약화될(compromised) 수 있다는 것을 시사한다. L1/L2(56-81)는 NAb를 유발하지 않았다. 어떤 HPV 백신도 계통 발생적으로-관련된(phylogenically-related) HPV 타입 18 및 45에 대한 교차-중화 항체를 유발하지 않았다.
표 10: 식물-유래 L1 및 L1 / L2 키메라 후보 백신에 대한 중화 역가의 요약
PsV 중화 분석 역가 * 　
백신 키메라 HPV -16 HPV -18 HPV -45 HPV -52
V1 L1/L2(108-120) 50-500 0-50 0-50 50-200
V2 L1/L2(36-58) 0-50 0-50 0-50 0-50
V3 L1/L2(17-36) 0-50 0-50 0-50 50-200
V4 HPV-16 L1 500-5000 0-50 0-50 0-50
V5 식물 추출물 0-50 0-50 0-50 0-50
+ 대조군
　		 H16.V5 2x105 - 2x106 　 　 　
α-CamVir1 12800-51200
H45.N5 　 3200-12800
H52.C1 　　 2x104 - 2x105
2x105 - 2x106
H52.D11
백신 면역원성의 개괄
구조적 조립(structural assembly) (상기 실시예 2 참조), 항-L1 및 L2 체액성 반응 및 L1/L2 키메라 항혈청에서 검출된 HPV-타입 NAb가 표 11에 요약된다. VLP로의 조립은 보다 높은 항-L1 및 HPV-16 PsV 중화 역가와 연관된 것으로 보여, 조립이 L1 면역원성과 연관되어 있다는 것을 시사한다.
표 11: L1 및 L1 / L2 키메라 백신에 대한 항체 반응

백신
식물-발현 항원 		TEM
구조 * 		항- L1 반응 ** 항- L1 역가 항- L2 반응 *** HPV -
16/18/45/52
중화
V1
V2
V3		 L1/L2(108-120)
L1/L2(56-81)
L1/L2(17-36)		 VLPs
C / CA
CA / VLPs		 Y
N
Y		 12800
0-50
200		 Y
N
Y		 HPV-16/52
None
HPV-52
V4
V5		 HPV-16 L1 (+)
식물 추출물 (-)		 VLPs
N/A		 Y
N		 >12800
0-50		 N
N		 HPV-16
None
* TEM 항원 조립: C = 캡소미어, CA = 캡소미어 응집체, VLPs = 바이러스-유사 입자.
** 항-L1 항체의 ELISA 검출. Y = 존재, N = 부재.
*** 항-L2 항체의 웨스턴 블롯 검출.
논의
식물-유래 HPV-16 L1 (Maclean et al., 2007; Fernandez-San Millan et al., 2008) 및 L1-기반 키메라 (Paz De la Rosa et al., 2009)는 면역원성 VLP로 조립되고 중화 항체 (NAb)의 생성을 유발한다. 이 연구에서, HPV-16 L1의 h4 영역에 교차-중화 HPV-16 L2 108-120번 아미노산, 56-81번 아미노산 또는 17-36번 아미노산 에피토프를 포함하는 3개의 식물-유래 L1/L2 키메라의 면역원성을 분석하였다. 쥐는 피하로 Freund's incomplete adjuvant 중 10 ㎍의 식물-유래 항원에 의해 면역화되고, 7주 내에 4회의 증폭 백신접종(booster vaccination)을 받았다.
체액성 면역 반응
식물-유래 L1/L2 키메라에 의해 유발된 체액성 항-L1 및 L2 반응을 이 연구에서 분석하여, L2 펩티드가 나타나는지 및 L2 삽입이 L1 면역원성을 제대로 약화시키는지를 결정하였다.
곤충 세포-발현 HPV-16 L1 또는 E. coli-발현 His-태깅 L2 항원을 이용하여, 각각 직접 경합 ELISA (도 9) 및 웨스턴 블롯팅 (도 10)에 의해 쥐의 항혈청 중 L1 및 L2 항체의 검출을 수행하였다. 이 연구에서 식물-유래 HPV-16 L1이 항-L1 양성 대조군으로 기능하고, 12800 - 51200의 역가로, 가장 높은 항-L1 반응을 유발하였다 (도 9A). 이 결과는, 부분적으로-정제된 식물-유래 HPV-16 L1 VLP를 이용한 기타 쥐 면역원성 연구와 유사하다 (역가 = 20000 - 40960; Maclean et al., 2007; Fernandez-San Millan et al., 2008).
음성 대조군 백신 (V5: NSs-주입된 식물 추출물) 및 백신 사전-채혈 (V1-5 PB)은 항-L1 반응을 생성하지 않았다 (도 9). 그러나, 음성 대조군 (V4-5, 도 10)으로부터 얻은 항혈청은 E. coli-발현 His-태깅 HPV-16 L2 항원을 검출하지 않았으므로, 혈청 중 His-태깅 L2 단백질에 결합하는, 비-특이적 항체의 존재를 입증했다. 이는 아마도 오염 식물 단백질을 포함한 백신을 초래하는, 항원의 부분적인 정제로 인한 것이다. 그럼에도 불구하고, 음성 대조군 밴드는 L1/L2(108-120) 및 L1/L2(17-36) 키메라에 대한 밴드보다 덜 뚜렷하여, 이들 L1/L2 키메라가 항-L2 반응을 유발했다는 것을 시사했다.
L1/L2(108-120)는 구별되는 ~30 nm cVLP로 조립되었고 가장 성공적인 키메라 백신 (표 11)이어서, ~12800의 역가를 갖는 가장 높은 항-L1 반응 (도 9A) 및 항-L2 반응 (도 10)을 유발했다. 또한, L1/L2(108-120) 및 HPV-16 L1 항혈청만이 사전-채혈 및 NSs-주입된 식물 추출물 (음성 대조군)에 비하여 유의한 항-L1 반응을 보였다 (p = 0.01). Varsani 등 (2003a)에 의해 분석된 곤충 세포-발현 L1/L2(108-120) 키메라는 식물-유래 키메라에 비해 보다 높은 항-L1 역가 (>204800)를 유발하였으나, 10x 더 높은 투여량이 이용되었다 (100 ㎍ vs. 10 ㎍). 이를 종합하면, L2 108-120번 아미노산 펩티드가 L1 cVLP의 표면에 효과적으로 나타난다는 강력한 증거가 존재한다.
L1/L2(17-36) 백신은 ~200의 역가를 갖는, 상대적으로 약한 항-L1 반응을 유발하였으나 (도 9A), 강한 항-L2 반응을 유발하여 (도 10), L2 펩티드가 조립된 L1의 표면에 나타난다는 것을 시사한다. 유사하게, 박테리아 티오레독신 (thioredoxin)(Trx)으로의 L2 20-38번 아미노산 펩티드의 융합은 56-120번 아미노산을 포함하는 기타 Trx-L2 펩티드에 비하여 강한 항-L2 반응을 유발하였고 (Rubio et al., 2009), HPV 16 L2 17-36번 아미노산 펩티드에 대한 RG-1 MAb는 웨스턴 블롯팅 및 ELISA에서 L2를 검출하는 것으로 확인되었다 (Gambhira et al., 2007).
L1/L2(56-81) 캡소미어 백신은 가장 낮은 혈청 희석도 1:50에서 검출가능한 항-L1 반응을 유발하지 않았고 (도 9A) 항-L2 반응은 결정적이지 않았으며 (도 10), 항-L1 및 L2 반응은 백신 사전-채혈 (V1-5 PB) 및 음성 대조군에 유사하였다 (도 9-10). 그 결과, 식물-유래 L1/L2(56-81)는, E. coli-발현 Trx-L2 융합 펩티드 (Rubio et al., 2009) 및 BPV-1 L1 VLP의 DE 루프 내에 유사한 L2 에피토프를 포함한 곤충 세포-발현 L1/L2 키메라 (Slupetzkey et al., 2007; Schellenbacher et al., 2009)와 달리, 면역원성을 갖는 것으로 보이지 않는다.
슈도비리온 중화 분석
HPV-16, 18, 45 및 52 PsV를 중화시키는 항체를 유발하는 능력에 대하여 L2 에피토프 108-120번 아미노산, 56-81번 아미노산 및 17-36번 아미노산을 포함하는 L1/L2 키메라를 조사하였다. 이 연구에서 분석된 모든 L2 에피토프는 동종 HPV-16를 중화시키고 HPV-52를 교차-중화시키는 항체를 유발하는 것으로 나타났다 (Kawana et al., 2003; Slupetzky et al., 2007; Kondo et al., 2007, 2008; Gambhira et al., 2007; Schellenbacher et al., 2009). 또한, L2 56-81번 아미노산은 HPV-18을 교차-중화시키고 L2 17-36번 아미노산은 HPV-18 및 45를 교차-중화시킨다 (Gambhira et al., 2007; Kondo et al., 2007, 2008; Alphs et al., 2008; Schellenbacher et al., 2009; Rubio et al., 2009).
HPV-16 L1이 키메라 후보 백신의 골격이고 대부분의 자궁경부암을 유발하므로 HPV-16을 선택하고, 이어서 계통 발생적으로-관련된 HPV-18 및 HPV-45를 선택하였다. HPV 16, 18 및 45는 아프리카에서 자궁경부암의 48%, 23% 및 10%, 및 전세계적으로 자궁경부암의 61%, 10% 및 6%와 관련된다 (de Sanjose et al., 2010). HPV-52는 아프리카에서 단지 5위이고 (3%) 전세계적으로 6위로 (6%) 평가되나, HPV-52는 남아프리카 여성에서 낮은-등급 및 높은-등급의 자궁경부 병변에서 매우 우세한 것으로 나타나 HPV-52 교차-중화는 지역적 유의성(local significance)을 갖는다 (Allan et al., 2008).
동종 HPV -16 중화
식물-유래 L1/L2(56-81) 및 L1/L2(17-36)은 검출가능한 HPV-16 NAb 역가를 유발하지 않아서, 사전-채혈 및 NSs-주입된 식물 추출물에 유사한 결과를 제공하였다 (도 11). 이전 연구는 BPV-1 또는 HPV-16 L1의 표면 영역에 위치한 HPV-16 L2 펩티드 17-36번 아미노산, 18-38번 아미노산, 56-75번 아미노산 또는 69-81번 아미노산을 포함한 L1/L2 키메라가 HPV-16 NAb를 유발했다는 것을 보여주었다 (Slupetzkey et al., 2007; Kondo et al., 2008; Schellenbacher et al., 2009); 그러나, 삽입 부위는 이 연구에서 이용된 부위와 상이했고 키메라는 cVLP로 조립되었다. 또한, 이 연구에서 L1/L2(56-81) 키메라에 대하여 얻어진 결과와 유사하게, HPV-16 L2 73-84번 아미노산에 대한 MAb는 비-중화성(non-neutralising)인 것으로 확인되었고 HPV-16 PsV를 중화시키지 않았다 (Gambhira et al., 2007).
이 연구에서, L1/L2(108-120) 및 HPV-16 L1만이 H16.V5 (양성 중화 대조군)와 유사한 방식으로 HPV-16 PsV를 중화시켜, 각각 50-500 및 500-5000의 역가를 생성하였다 (표 10). 이 결과는 식물-유래 HPV L1 항원을 이용한, 다른 쥐 면역원성 연구와 일치한다. 유사한 또는 더 높은 투여량의 식물-유래 HPV-16 L1 VLP는 400-1600의 HPV-16 NAb 역가를 유발하였고 (Maclean et al., 2007; Fernandez-San Millan et al., 2008), 식물-유래 L1/E6/E7 cVLPS는 적혈구응집반응(hemagglutination) 분석을 이용하여 ~400의 HPV-16 NAb 역가를 유발하였다 (Paz De la Rosa et al., 2009). 또한, HPV-16 L2 108-120번 아미노산 펩티드에 의한 사람의 면역화는 100-1000의 HPV-16 NAb 역가를 유발하는 것으로 나타났고 (Kawana et al., 2003) L2 에피토프 108-120번 아미노산 (Slupetzkey et al., 2007) 또는 L2 75-112번 아미노산 및 115-154번 아미노산 (Schellenbacher et al., 2009)을 포함하는 L1/L2 키메라로부터 얻은 쥐의 항혈청은 역가 <1000로 동종 HPV-16 PsV를 중화시켰다. 그러므로, 이 연구에서 얻어진 역가는 기타 발현 시스템에서 생성된 L1/L2 키메라 백신에 의해 보고된 범위 내에 존재한다.
이종 HPV -18, 45 및 52 중화
계통 발생적으로-관련된 HPV-18 및 45 PsV에 대한 중화 활성이 모든 HPV 백신에 대하여 검출되지는 않았다 (도 12-13). 유사하게, L1/L2(56-81) 항혈청은 HPV-52 PsV를 중화시키지 않았다 (도 14). L1/L2(108-120) 및 L1/L2(17-36)가 낮은 HPV-52 NAb 역가 (50-200)를 유발하는 것으로 나타났으나, 아마도 부분적으로-조립된 PsV의 정제로 인하여, 분석에 많은 변이가 존재하였고, 이 분석은 결과를 확인하기 위해 반복되어야 한다.
이전의 연구는, L2 56-81번 아미노산 펩티드를 포함하는 L1/L2 키메라가 HPV-18 및 52를 교차-중화시킨다는 것을 입증하였다 (Kondo et al., 2008). 그러나, 이 키메라는 L1/L2(56-81)와 달리 cVLP로 조립되어, VLP 조립이 높은 NAb 역가의 생성을 유도하는데 중요하다는 것을 시사한다. 또한, L2 17-36번 아미노산 또는 18-36번 아미노산을 포함하는 L1/L2 키메라 (Kondo et al., 2008; Schellenbacher et al., 2009)는 HPV-18, 45 및 52에 대한 NAb를 유발한다. 그러나, L2 펩티드가 DE 루프 내로 삽입되었고 (Schellenbacher et al., 2009) Kondo 등 (2008)에 의해 수행된 연구의 경우 투여량은 서술되지 않았다. 이 연구에서, 쥐에서 식물-유래 L1/L2(17-36)에 의해 유발되는 낮은 HPV-52 NAb 역가는 곤충 세포에서 발현된 유사한 L1/L2 키메라에 의해 유발된 역가와 비교될 만하여 (Schellenbacher et al., 2009), 이 발현 시스템이 HPV-52를 교차 중화시키는 항원의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
식물-유래 L1/L2(108-120) 키메라는 HPV-52 NAb를 유발하는 것으로 보였고, L2 108-120번 아미노산 펩티드가 사람에서 각각 50-1000의 HPV-52 NAb 역가를 유발하는 것으로 확인된 증거에 의해 지지되는, 교차-보호성 HPV 백신으로서의 가능성을 가질 수 있다 (Kawana et al., 2003). HPV-16 L2 108-120번 아미노산이 HPV-45를 교차-중화시킨다는 증거는 존재하지 않으나, 유사한 L2 96-115번 아미노산 또는 75-112번 아미노산 에피토프를 포함하는 L1/L2 키메라는 계통 발생적으로-관련된 HPV-18를 교차-중화시켰다 (Kondo et al., 2008; Schellenbacher et al., 2009). 그러나, 이 연구에서 보고된 NAb 역가는 낮았고 (<100) 유발된 HPV-18 NAb는 너무 낮아서 L1/L2(108-120) 항혈청에서 검출할 수 없었다는 것이 가능하다.
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Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr 370 375 380 Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Gln Leu Tyr 405 410 415 Lys Thr Cys Lys Gln Ala Gly Thr Cys Pro Pro Asp Ile Ile Pro Lys 420 425 430 Val Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu 435 440 445 Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Phe 465 470 475 480 Thr Leu Gly Lys Arg Lys Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr 485 490 495 Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg Lys Leu 500 505 <210> 25 <211> 501 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chimaeric HPV L1/L2 BPV(1-88) polypeptide <400> 25 Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn 20 25 30 Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys 50 55 60 Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg 130 135 140 Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160 Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr 165 170 175 Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn 180 185 190 Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met 195 200 205 Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220 Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro 260 265 270 Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser 275 280 285 Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala 290 295 300 Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu 340 345 350 Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu 355 360 365 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr 370 375 380 Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400 Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Met Ser Ala 405 410 415 Arg Lys Arg Val Lys Arg Ala Ser Ala Tyr Asp Leu Tyr Arg Thr Cys 420 425 430 Lys Gln Ala Gly Thr Cys Pro Pro Asp Val Ile Pro Lys Val Glu Gly 435 440 445 Asp Thr Ile Ala Asp Lys Ile Leu Lys Phe Gly Gly Leu Ala Ile Tyr 450 455 460 Leu Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Trp Ser Thr Gly Arg Val Ala Ala 465 470 475 480 Gly Gly Ser Pro Arg Tyr Thr Pro Leu Arg Thr Ala Gly Ser Thr Ser 485 490 495 Ser Leu Ala Ser Ile 500 <210> 26 <211> 1521 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human-codon optimised nucleotide sequence encoding chimaeric HPV L1/L2(108-120) polypeptide <400> 26 atgagcctgt ggctgcccag cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgcc cgtgagcaag 60 gtggtgagca ccgatgagta cgtggcccgg accaacatct actaccacgc cggcacctcc 120 agactgctgg ccgtgggcca cccctacttc cccatcaaga agcccaacaa caacaagatc 180 ctggtgccca aggtgagcgg cctgcaatac cgggtgttca gaatccacct gcccgacccc 240 aataagttcg gcttccccga caccagcttc tacaaccccg acacccagag actggtgtgg 300 gcctgcgtgg gcgtggaggt gggcagaggc cagcctctgg gcgtgggcat cagcggccac 360 cctctgctga acaagctgga cgacaccgag aacgccagcg cctacgccgc caacgccggc 420 gtggataaca gagaatgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctcatcggc 480 tgcaagcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcagcc cctgcaccaa cgtggccgtg 540 aatcctggcg actgtcctcc cctggaactc atcaacaccg tgatccagga cggcgacatg 600 gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctcc aggccaataa gagcgaggtg 660 cccctggaca tctgcaccag catctgcaag taccccgact acatcaagat ggtgagcgag 720 ccctacggcg atagcctgtt cttctacctg cggcgggagc agatgttcgt gcggcacctg 780 ttcaacagag ccggcgccgt gggcgagaac gtgcccgacg acctgtacat caagggcagc 840 ggcagcaccg ccaacctggc cagcagcaac tacttcccta cccccagcgg ctccatggtg 900 accagcgacg cccagatctt caacaagccc tactggctcc agagagccca gggccacaac 960 aatggcatct gctggggcaa ccagctgttc gtgaccgtgg tggataccac ccggagcacc 1020 aacatgtccc tgtgcgccgc catcagcacc agcgagacca cctacaagaa caccaacttc 1080 aaggagtacc tgaggcacgg cgaggagtac gacctccagt tcatcttcca gctgtgcaag 1140 atcaccctca ccgccgacgt gatgacctac atccacagca tgaacagcac catcctggag 1200 gactggaact tcggcctgca gccccctcct ggcggcaccc tggtggagga gaccagcttc 1260 atcgacgccg gagcccccgc atgccagaag cacacccctc ccgcccctaa ggaggacccc 1320 ctgaagaagt acaccttctg ggaggtgaac ctgaaggaga agttcagcgc cgacctggac 1380 cagttccctc tgggcagaaa gttcctgctg caagccggcc tgaaggccaa gcctaagttc 1440 accctgggca agagaaaggc cacccccacc acaagcagca ccagcaccac cgccaagcgg 1500 aagaagcgca agctgtgata g 1521 <210> 27 <211> 1521 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human-codon optimised nucleotide sequence encoding chimaeric HPV L1/L2(56-81) polypeptide <400> 27 atgagcctgt ggctgcccag cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgcc cgtgagcaag 60 gtggtgagca ccgatgagta cgtggcccgg accaacatct actaccacgc cggcacctcc 120 agactgctgg ccgtgggcca cccctacttc cccatcaaga agcccaacaa caacaagatc 180 ctggtgccca aggtgagcgg cctgcaatac cgggtgttca gaatccacct gcccgacccc 240 aataagttcg gcttccccga caccagcttc tacaaccccg acacccagag actggtgtgg 300 gcctgcgtgg gcgtggaggt gggcagaggc cagcctctgg gcgtgggcat cagcggccac 360 cctctgctga acaagctgga cgacaccgag aacgccagcg cctacgccgc caacgccggc 420 gtggataaca gagaatgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctcatcggc 480 tgcaagcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcagcc cctgcaccaa cgtggccgtg 540 aatcctggcg actgtcctcc cctggaactc atcaacaccg tgatccagga cggcgacatg 600 gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctcc aggccaataa gagcgaggtg 660 cccctggaca tctgcaccag catctgcaag taccccgact acatcaagat ggtgagcgag 720 ccctacggcg atagcctgtt cttctacctg cggcgggagc agatgttcgt gcggcacctg 780 ttcaacagag ccggcgccgt gggcgagaac gtgcccgacg acctgtacat caagggcagc 840 ggcagcaccg ccaacctggc cagcagcaac tacttcccta cccccagcgg ctccatggtg 900 accagcgacg cccagatctt caacaagccc tactggctcc agagagccca gggccacaac 960 aatggcatct gctggggcaa ccagctgttc gtgaccgtgg tggataccac ccggagcacc 1020 aacatgtccc tgtgcgccgc catcagcacc agcgagacca cctacaagaa caccaacttc 1080 aaggagtacc tgaggcacgg cgaggagtac gacctccagt tcatcttcca gctgtgcaag 1140 atcaccctca ccgccgacgt gatgacctac atccacagca tgaacagcac catcctggag 1200 gactggaact tcggcctgca gccccctcct ggcggcacag gcggcctggg catcggcacc 1260 ggcagcggca ccgggggcag gaccggctac atccccctgg gcaccagacc ccccaccccc 1320 ctgaagaagt acaccttctg ggaggtgaac ctgaaagaga agttcagcgc cgacctggac 1380 cagttccctc tgggccggaa gttcctgctc caggctgggc tgaaggccaa gcccaagttc 1440 accctgggca agcggaaggc cacccccacc acctccagca ccagcaccac cgccaagcgg 1500 aagaaacgga agctgtgatg a 1521 <210> 28 <211> 1521 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human-codon optimised nucleotide sequence encoding chimaeric HPV L1/L2(17-36) polypeptide <400> 28 atgagcctgt ggctgcccag cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgcc cgtgagcaag 60 gtggtgagca ccgatgagta cgtggcccgg accaacatct actaccacgc cggcacctcc 120 agactgctgg ccgtgggcca cccctacttc cccatcaaga agcccaacaa caacaagatc 180 ctggtgccca aggtgagcgg cctgcaatac cgggtgttca gaatccacct gcccgacccc 240 aataagttcg gcttccccga caccagcttc tacaaccccg acacccagag actggtgtgg 300 gcctgcgtgg gcgtggaggt gggcagaggc cagcctctgg gcgtgggcat cagcggccac 360 cctctgctga acaagctgga cgacaccgag aacgccagcg cctacgccgc caacgccggc 420 gtggataaca gagaatgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctcatcggc 480 tgcaagcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcagcc cctgcaccaa cgtggccgtg 540 aatcctggcg actgtcctcc cctggaactc atcaacaccg tgatccagga cggcgacatg 600 gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctcc aggccaataa gagcgaggtg 660 cccctggaca tctgcaccag catctgcaag taccccgact acatcaagat ggtgagcgag 720 ccctacggcg atagcctgtt cttctacctg cggcgggagc agatgttcgt gcggcacctg 780 ttcaacagag ccggcgccgt gggcgagaac gtgcccgacg acctgtacat caagggcagc 840 ggcagcaccg ccaacctggc cagcagcaac tacttcccta cccccagcgg ctccatggtg 900 accagcgacg cccagatctt caacaagccc tactggctcc agagagccca gggccacaac 960 aatggcatct gctggggcaa ccagctgttc gtgaccgtgg tggataccac ccggagcacc 1020 aacatgtccc tgtgcgccgc catcagcacc agcgagacca cctacaagaa caccaacttc 1080 aaggagtacc tgaggcacgg cgaggagtac gacctccagt tcatcttcca gctgtgcaag 1140 atcaccctca ccgccgacgt gatgacctac atccacagca tgaacagcac catcctggag 1200 gactggaact tcggcctgca gcctcctcct ggcggcaccc agctgtacaa gacctgcaag 1260 caggccggca cctgcccccc tgacatcatc cccaaggtgc cagcccccaa agaggacccc 1320 ctgaagaagt acaccttctg ggaagtgaac ctgaaagaga agttcagcgc cgatctggac 1380 cagttccccc tcggccggaa gttcctgctc caggctggcc tgaaggccaa gcccaagttc 1440 accctgggca agaggaaggc cacccccacc acaagcagca ccagcaccac cgccaagcgg 1500 aagaaacgga agctgtgatg a 1521 <210> 29 <211> 1509 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Human-codon optimised nucleotide sequence encoding chimaeric HPV L1/L2 BPV(1-88) polypeptide <400> 29 atgagcctgt ggctgcccag cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgcc cgtgagcaag 60 gtggtgagca ccgatgagta cgtggcccgg accaacatct actaccacgc cggcacctcc 120 agactgctgg ccgtgggcca cccctacttc cccatcaaga agcccaacaa caacaagatc 180 ctggtgccca aggtgagcgg cctgcaatac cgggtgttca gaatccacct gcccgacccc 240 aataagttcg gcttccccga caccagcttc tacaaccccg acacccagag actggtgtgg 300 gcctgcgtgg gcgtggaggt gggcagaggc cagcctctgg gcgtgggcat cagcggccac 360 cctctgctga acaagctgga cgacaccgag aacgccagcg cctacgccgc caacgccggc 420 gtggataaca gagaatgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctcatcggc 480 tgcaagcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcagcc cctgcaccaa cgtggccgtg 540 aatcctggcg actgtcctcc cctggaactc atcaacaccg tgatccagga cggcgacatg 600 gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctcc aggccaataa gagcgaggtg 660 cccctggaca tctgcaccag catctgcaag taccccgact acatcaagat ggtgagcgag 720 ccctacggcg atagcctgtt cttctacctg cggcgggagc agatgttcgt gcggcacctg 780 ttcaacagag ccggcgccgt gggcgagaac gtgcccgacg acctgtacat caagggcagc 840 ggcagcaccg ccaacctggc cagcagcaac tacttcccta cccccagcgg ctccatggtg 900 accagcgacg cccagatctt caacaagccc tactggctcc agagagccca gggccacaac 960 aatggcatct gctggggcaa ccagctgttc gtgaccgtgg tggataccac ccggagcacc 1020 aacatgtccc tgtgcgccgc catcagcacc agcgagacca cctacaagaa caccaacttc 1080 aaggagtacc tgaggcacgg cgaggagtac gacctccagt tcatcttcca gctgtgcaag 1140 atcaccctca ccgccgacgt gatgacctac atccacagca tgaacagcac catcctggag 1200 gactggaact tcggcctgca gcctccccct ggcggcacca tgagcgcccg gaagcgggtg 1260 aagcgggcca gcgcctacga cctgtaccgg acctgcaagc aggccggcac ctgcccccct 1320 gacgtgatcc ccaaggtgga gggcgacaca atcgccgaca agatcctgaa gttcggcggc 1380 ctggccatct acctgggcgg cctgggcatt ggcacctggt ccaccggcag agtggccgct 1440 ggaggaagcc ctagatacac ccccctgcgg accgccggca gcacaagcag cctggccagc 1500 atctgatga 1509

Claims (29)

  1. (i) 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드를 코딩하는 키메라 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계로서, 상기 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드는 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드의 414번 잔기부터 삽입된 HPV L2 펩티드를 갖는 HPV 16 L1 폴리펩티드를 포함하고, 상기 삽입된 HPV L2 펩티드의 아미노산은 상기 HPV 16 L1 폴리펩티드의 아미노산을 치환하고, 상기 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 22, 23, 및 24로 구성된 군에서 선택되는 것인 단계;
    (ii) 상기 키메라 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열을 식물에서 폴리펩티드를 발현시키도록 개조된 발현 벡터로 클로닝하는 단계;
    (iii) 단계 (ii)의 발현 벡터에 의해 식물 세포를 형질전환 또는 주입(infiltrate)시키는 단계;
    (iv) 단계 (iii)의 식물 세포에서 상기 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드를 발현시켜, 발현된 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드가 30 nm의 직경을 갖는 키메라 HPV VLP로 조립되게 하는 단계; 및
    (v) 1.5 M의 NaCl 농도를 갖는 고염 추출 완충액을 이용하여 상기 식물 세포로부터 상기 키메라 HPV VLP를 회수하는 단계를 포함하는, 30 nm의 직경을 갖는 키메라 인간 파필로마바이러스 (HPV) 바이러스 유사 입자 (VLP)를 생산 및 회수하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 단계 (ii)의 발현 벡터는 발현되는 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드를 상기 식물 세포의 세포질로부터 엽록체로 지향(direct)시키기 위한 폴리펩티드를 코딩하는 표적화 서열(targeting sequence)을 더 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 발현 벡터는 상기 발현 벡터의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 기타 조절자(regulator) 등을 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 식물에서 전사 후 유전자 침묵(post-transcriptional gene silencing)을 억제하도록 개조된 억제자(suppressor) 단백질에 의한 상기 식물 세포의 공동-주입(co-infiltration) 또는 공동-형질전환(co-transformation) 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 억제자 단백질은 토마토 반점 위조 바이러스(tomato spotted wilt virus)의 NSs 단백질 또는 토마토 덤불 성장위축 바이러스(tomato bushy stunt virus)의 p19인 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 삽입된 HPV L2 펩티드는,
    (i) 서열번호 7의 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 서열번호 3의 13개 아미노산 펩티드;
    (ii) 서열번호 9의 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 서열번호 5의 20개 아미노산 펩티드;
    (iii) 서열번호 8의 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 서열번호 4의 26개 아미노산 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열(human codon-optimised nucleotide sequence)에 의해 코딩되는 키메라(chimaeric) HPV 16 L1/L2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드는, HPV 16 L1 폴리펩티드의 414번 잔기부터 삽입된 HPV L2 펩티드를 포함하는 HPV 16 L1 폴리펩티드를 더 포함하고, 상기 삽입된 HPV L2 펩티드의 아미노산은 상기 HPV 16 L1 폴리펩티드의 아미노산을 치환하고, 상기 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 22, 23, 및 24로 구성된 군에서 선택되는 것인, 30 nm의 직경을 갖는, 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 키메라 인간 파필로마바이러스 (HPV) 바이러스 유사 입자 (VLP).
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 삽입된 HPV L2 펩티드는,
    (i) 서열번호 7의 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 서열번호 3의 13개 아미노산 펩티드(amino acid peptide);
    (ii) 서열번호 9의 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 서열번호 5의 20개 아미노산 펩티드;
    (iii) 서열번호 8의 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는, 서열번호 4의 26개 아미노산 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 키메라 HPV VLP.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드를 코딩하는 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열은 핵 위치화 신호(nuclear localisation signal)가 결여되도록 변형된 것인 키메라 HPV VLP.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드는 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 키메라 HPV VLP.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드는 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것인 키메라 HPV VLP.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드는 식물에서 발현되고 식물로부터 회수되는 것인 키메라 HPV VLP.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 키메라 HPV 16 L1/L2 폴리펩티드는 상기 식물의 엽록체로 표적화되는 것인 키메라 HPV VLP.
  14. 개체에서 HPV 감염 또는 자궁경부암을 예방 또는 치료하는 방법에 이용하기 위한, 청구항 7 내지 13 중 어느 한 항의 키메라 HPV VLP로서, 상기 방법은 상기 키메라 HPV VLP의 치료적 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 키메라 HPV VLP.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 방법은 상기 개체에서 면역 반응을 유발하는 단계를 더 포함하는 것인 키메라 HPV VLP.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 면역 반응은 중화 항체 반응 또는 세포독성 T 림프구 반응인 것인 키메라 HPV VLP.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 면역 반응은 상기 개체에 존재하는 다수의 HPV 타입에 대한 교차-보호성 면역 반응인 것인 키메라 HPV VLP.
  18. 청구항 14에 있어서, 상기 개체는 인간인 것인 키메라 HPV VLP.
  19. 청구항 7 내지 13 중 어느 한 항의 키메라 HPV VLP 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 보조제를 포함하는, 개체에서의 HPV 감염 또는 자궁암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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