ES2653251T3

ES2653251T3 - Partículas de tipo papilomavirus (VLP) como vacunas de amplio espectro del virus del papiloma humano (VPH)

Info

Publication number: ES2653251T3
Application number: ES10762572.5T
Authority: ES
Inventors: Richard B.S. Roden; Reinhard Kirnbauer; Christina Schellenbacher
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 2009-04-10
Filing date: 2010-04-12
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2030-04-12
Also published as: BRPI1013895B1; US10046026B2; CN107080833A; EP2416798A2; US9149503B2; WO2010118424A3; WO2010118424A2; EP2416798A4; US20120093821A1; CN102458440A; US20160200774A1; DK2416798T3; EP2416798B1; BRPI1013895A2; HK1242997A1

Abstract

Una composición de partícula de tipo virus (VLP), ensamblada a partir de un polipéptido quimérico que comprende una proteína L1 de papilomavirus (PV) en la que se inserta un péptido presentado en superficie que consiste en la siguiente secuencia de una proteína L2 de papilomavirus: a) QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV (SEQ ID NO:9) o b) QLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID NO:56) o c) LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID NO:57) en la que el péptido L2 se inserta en el bucle DE de la proteína L1.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

de un epítopo de linfocito T por un linfocito T es a través de un mecanismo en el que los linfocitos T reconocen fragmentos péptídicos de antígenos que están unidos a moléculas complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I o de clase II expresadas sobre células presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones de la presente invención, los epítopos o fragmentos epitópicos identificados tal como se describen en el presente documento encuentran su uso en la detección de células presentadoras de antígeno que tienen moléculas del MHC capaces de unirse y presentar los epítopos o fragmentos.

Tal como se usa en el presente documento, "VPH" y "papilomavirus humano" se refieren a los miembros de la familia papilomavirus que son capaces de infectar seres humanos. Existen dos grupos principales de VPH definidos por su tropismo (grupos genital/mucosal y cutáneo), cada uno de los cuales contiene múltiples "tipos"·o "cepas" víricas (por ejemplo, VPH 16, VPH 18, VPH 31, VPH 32, etc.). De interés particular en la presente invención son los tipos de VPH que están asociados con la infección genital y con la neoplasia maligna, así como los que producen papilomas benignos, tanto en la mucosa como en la piel, que dan como resultado la morbilidad para el paciente.

El término "vacuna" se refiere a una formulación que contiene 1, 2, 3, 4, 5 o más composiciones de VLP de la presente invención. Las composiciones de VLP típicamente estarán en una forma que es capaz de administrarse a un sujeto e induce una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica suficiente como para inducir inmunidad para prevenir y/o mejorar una infección y/o para reducir al menos un síntoma de una infección y/o mejorar la eficacia de otra terapia anti-VPH o profiláctico. Típicamente, una vacuna comprende una solución salina convencional o medio de solución acuosa tamponada en el que la composición de la presente invención está suspendida o disuelta, aunque la administración de polvo seco, por ejemplo, mediante inhalación, e incluso la formulación con un adyuvante adicional, tal como alumbre, también se contempla. La composición de la presente invención se puede usar de manera conveniente para prevenir, mejorar o tratar de otro modo una infección. Tras la introducción en un hospedador, una composición inmunogénica de la invención (por ejemplo, una vacuna) es capaz de provocar una respuesta inmunitaria que incluye, pero sin limitación, la producción de anticuerpos y/o citocinas y/o la activación de linfocitos T citotóxicos, células presentadoras de antígeno, los linfocitos T colaboradores, células dendríticas y/o otras respuestas celulares. Típicamente, tal respuesta será de reacción cruzada entre diversos tipos de papilomavirus, incluyendo, pero sin limitarse a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de los tipos de VPH descritos en el presente documento. Los tipos particulares de VPH de reacción cruzada se tratan en alguna parte del presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, las vacunas, anticuerpos o sueros inmunológicos "profiláctico" y "preventivo" son vacunas, anticuerpos o sueros inmunológicos que se diseñan y administran para evitar la infección, enfermedad y/o cualquier secuela(s) provocada(s) por o asociada(s) a un organismo patógeno, en particular, VPH.

Tal como se usa en el presente documento, vacunas "terapéuticas" son vacunas que se diseñan y administran a los pacientes ya infectados por un organismo patógeno tal como al menos una cepa de VPH. Las vacunas terapéuticas (por ejemplo, vacunas terapéuticas del VPH) se usan para prevenir y/o tratar el desarrollo de tumores benignos o malignos en estos individuos infectados.

Los términos "inhibición", "reducción", o "prevención", o cualquier variación de esos términos, cuando se usa en la reivindicaciones y/o la memoria descriptiva incluye cualquier descenso medible o inhibición completa para lograr un resultado deseado, tal como inhibición, reducción o prevención de infección vírica, difusión vírica, crecimiento vírico,

o transmisión vírica.

A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o procedimiento que se está empleando para determinar el valor.

Se contempla que uno o más miembros de una lista proporcionada en el presente documento se puede, de manera específica, excluir de o incluir en una invención reivindicada.

Un "sujeto", tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier animal que se ha infectado por, o que está en riesgo de infectarse por, un papilomavirus. Los sujetos adecuados (pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como ratón, rata, conejo, cobaya o cerdo), animales de granja (tales como ganado vacuno), animales deportivos (tales como perros o caballos) y animales domésticos o mascotas (tales como un caballo, un perro o un gato). Se incluyen los primates no humanos y los pacientes humanos.

Los términos "proteína", "polipéptido", y "péptido", tal como se usa en el presente documento, no se restringen a ningún número particular de aminoácidos; estos términos se usan a veces de manera intercambiable en el presente documento. Las propiedades y las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la invención, y de los ácidos nucleicos que las codifican, son bien conocidas y se pueden determinar de manera rutinaria, así como descargar desde diversas bases de datos conocidas. Véase, por ejemplo, las bases de datos de NCBI GenBank. Algunas secuencias se proporcionan en el presente documento. Esta información es precisa a partir de la fecha de presentación de la presente solicitud. Sin embargo, alguna información de secuencia se actualiza de manera rutinaria (por ejemplo, para corregir errores en entradas anteriores), de manera que la información actualizada (corregida) sobre las proteínas y los ácidos nucleicos que las codifican se incluye en la presente solicitud. La información proporcionada en las bases de datos de secuencias tratadas en el presente documento se incorpora a

9

imagen8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

que han resultado positivos a la exposición al VPH o que se considera que están en riesgo de infección basándose en una posible exposición.

En algunas realizaciones, el tratamiento se administra en presencia de adyuvantes o vehículos y otros antígenos, bien antígenos del VPH u antígenos de otros patógenos. Por otro lado, en algunos ejemplos, el tratamiento comprende la administración de otros agentes usados de manera común frente a la infección vírica, tales como uno

o más antivíricos.

La inmunogenicidad de las composiciones de VLP se pueden potenciar mediante el uso de estimuladores adicionales no específicos de la respuesta inmunitaria, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes adecuados incluyen todos los compuestos inmunoestimuladores aceptables, tales como citocinas, toxinas o composiciones sintéticas tales como alumbre.

Se puede usar una serie de adyuvantes para potenciar una respuesta de anticuerpos frente a una VLP descrita en el presente documento. Los adyuvantes se pueden usar para (1) atrapar el antígeno en el cuerpo para provocar una liberación lenta; (2) atraer a células implicadas en la respuesta inmunitaria al sitio de administración; (3) inducir la proliferación o la activación de células del sistema inmunitario; o (4) mejorar la difusión del antígeno en todo el cuerpo del sujeto.

Los adyuvantes incluyen, aunque sin limitación, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, sales minerales, polinucleótidos, y sustancias naturales. Los adyuvantes específicos que se pueden usar incluyen IL-1, IL2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-interferón, GM-CSF, BCG, sales de aluminio, tales como hidróxido de aluminio u otro compuesto de aluminio, compuestos de MDP, tales como thur-MDP y nor-MDP, CGP (MTP-PE), lípido A, y monofosforil lípido A (MPL) o agentes microbianos inactivos. RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, MPL, dimicolato de trehalosa (TDM) y estructura de pared celular (CWS) en una emulsión de escualeno/Tween 80 al 2 %. Se pueden usar incluso antígenos de MHC. Otros adyuvantes o procedimientos se ejemplifican en las Patentes de EE.UU. 6.814.971, 5.084.269, 6.656.462.

Los diversos procedimientos para lograr el efecto adyuvante para la vacuna incluyen el uso de agentes tales como hidróxido de aluminio o fosfato (alumbre), usado de manera común como una solución de aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el 0,1 % en solución salina tamponada con fosfato, mezcla con polímeros sintéticos de azúcares (CARBOPOL®) usada como una solución de aproximadamente el 0,25 %, agregación de una proteína en la vacuna mediante tratamiento por calor con temperaturas que varían entre aproximadamente 70 ° a aproximadamente 101 °C durante un período de 30 segundos a 2 minutos, respectivamente. La agregación mediante reactivación con anticuerpos (Fab) tratados con pepsina a la albúmina; la mezcla con células bacterianas (por ejemplo, C. parvum), endotoxinas o componentes de lipopolisacáridos de bacterias Gram negativas; la emulsión en vehículos de aceite fisiológicamente aceptables (por ejemplo, monooleato de manida (Aracel A)); o emulsión con una solución del 20 % de un perfluorocarbono (FLUOSOL-DA®) usado como un sustituto del bloque también se pueden emplea para producir un efecto adyuvante. Un adyuvante típico es el adyuvante completo de Freund (que contiene Mycobacterium tuberculosis muertas), los adyuvantes incompletos de Freund e hidróxido de aluminio.

Para la administración a seres humanos, serán evidentes una variedad de adyuvantes adecuados para un trabajador experto. Entre estos se incluyen, por ejemplo, Alum-MPL como adyuvante, o la formulación comparable, ASO4, que se usa en la vacuna aprobada de la L1 del VPH Cervarix®, AS03, AS02, MF59, montanide, adyuvantes basados en saponina tales como GPI-0100, adyuvantes basados en CpG o imiquimod. En realizaciones de la invención, un adyuvante se acopla físicamente a la VLP, o se encapsula por la VLP, en lugar de mezclarse simplemente con ellas.

Además de adyuvantes, puede ser deseable coadministrar modificadores de respuesta biológica (BRM, del inglés biologic response modifiers) para mejorar las respuestas inmunitarias. Los BRM han demostrado que regulan positivamente la inmunidad de los linfocitos T o que regulan negativamente la actividad de células supresoras. Tales BRM incluyen, aunque sin limitación, Cimetidine (CIM; 1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); o ciclofosfamida de baja dosis (CYP; 300 mg/m2) (Johnson/ Mead, NJ) y citocinas tales como γ-interferón, IL-2 o IL-12 o genes que codifican proteínas implicadas en funciones inmunitarias de los linfocitos T colaboradores, tales como B-7. En realizaciones de la invención, estos genes están encapsulados por la VLP para facilitar su suministro en un sujeto.

La forma de aplicación puede variar ampliamente. Cualquiera de los procedimientos convencionales de administración de una vacuna son aplicables. Se cree que estos incluyen la aplicación oral sobre una base sólida fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, por vía parenteral mediante inyección, inhalación de un polvo, mediante un parche transcutáneo, mediante instilación vaginal y similares. La dosificación de la vacuna dependerá de la vía de administración y variará de acuerdo con el tamaño y la salud del sujeto.

La preparación de vacunas que contienen polipéptido o secuencia(s) de péptidos como principios activos generalmente se entienden bien en la materia, tal como se ejemplifica mediante las Patentes de Estados Unidos 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; y 4.578.770. Típicamente, tales vacunas se preparan como inyectables bien como soluciones líquidas o como suspensiones: las formas sólidas adecuadas para la solución en o la suspensión en líquido antes de la inyección también se pueden preparar. La preparación también puede emulsionarse. El principio activo inmunogénico se mezcla a menudo con excipientes que son farmacéuticamente

11 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

aceptables y compatibles con el principio activo. Tales excipientes son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol y similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores de pH

: o adyuvantes que potencian la eficacia de las vacunas. En realizaciones específicas, las vacunas se formulan con una combinación de sustancias, tal como se describe en las Patentes de Estados Unidos 6.793.923 y 6.733.754.

Las vacunas se pueden administrar mediante inhalación. En determinadas realizaciones se puede administrar una vacuna como un aerosol. Tal como se usa en el presente documento, el término "aerosol" o "composición aerosolizada" se refiere a una suspensión de partículas sólidas o líquidas en un gas. Los términos se pueden usar de manera general para referirse a una composición que se ha vaporizado, nebulizado o convertido de otra manera desde una forma sólida o líquida a una forma inhalable que incluye partículas sólidas o líquidas de fármaco en suspensión. Tales aerosoles se pueden usar para suministrar una vacuna a través del sistema respiratorio. Tal como se usa en el presente documento, "sistema respiratorio" se refiere al sistema de órganos en el cuerpo responsable de la toma de oxígeno y la exhalación de dióxido de carbono. El sistema generalmente incluye todos los conductos de aire desde la nariz hasta los alveolos pulmonares. En mamíferos se considera de manera general que incluye los pulmones, los bronquios, los bronquiolos, la tráquea, los conductos nasales y el diafragma. Para los fines de la presente divulgación, el suministro de una vacuna al sistema respiratorio indica que un fármaco se suministra a uno

: o más de los conductos de aire del sistema respiratorio, en particular a los pulmones.

Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios (para aplicación anal o vaginal) y, en algunos casos, formulaciones orales. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialcalenglicoles o triglicéridos: tales supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 10 %, preferentemente desde el 1 % a aproximadamente el 2 %. Las formulaciones orales incluyen excipientes normalmente empleados como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, las formulaciones de liberación sostenida o los polvos que contienen de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 95 % de principio activo, preferentemente desde el 25 % a aproximadamente el 70 %.

Las composiciones de VLP se pueden formular en una vacuna como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) y aquellos que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, de potasio, de amonio, de calcio o de hierro, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.

En muchos casos, será deseable tener múltiples administraciones de la vacuna, por lo general a lo sumo, al menos,

o sin exceder 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o más vacunas que incluyen todos los intervalos entre ellos. Las vacunas normalmente estarán a 1, 2, 3, 4, 5, 6, a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, a 12 semanas/mes/año de intervalo, incluyendo todos los valores y rangos entre ellos, más normalmente a partir de intervalos de tres a cinco semanas. Típicamente, los refuerzos periódicos a intervalos de 1-15 años, normalmente diez años, serán deseables para mantener niveles protectores de los anticuerpos. El trascurso de la inmunización puede ir seguido de ensayos para anticuerpos frente a los antígenos, tal como se describe en las anteriormente citadas, Patentes de Estados Unidos 3.791.932; 4.174.384 y 3.949.064, que son ilustrativas de estos tipos de ensayos.

Las composiciones y los procedimientos relacionados de la presente invención, particularmente la administración de una VLP que comprende un epítopo de L2 del VPH a un paciente/sujeto, también se pueden usar en combinación con la administración de la selección del VPH tradicional y/o otras vacunas, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, frotis de Pap, PCR, análisis por transferencia de Southern, administración de CERVARIX™, CERVARIX™, vacunas para el VPH u otros agentes infecciosos, terapia ablativa de lesiones del VPH, terapias inmunomoduladoras para las lesiones del VPH (por ejemplo, Aldara™) o similares.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto. Los diferentes aspectos de la presente invención implican la administración de una cantidad eficaz de una composición a un sujeto. En algunas realizaciones de la presente invención, una VLP que comprende un epítopo de L2 del VPH se administra al paciente para proteger frente a o tratar la infección por uno o más patógenos del VPH. Tales composiciones generalmente se disolverán o se dispersarán en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del ámbito del buen criterio médico, adecuadas para poner en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otras complicaciones problema acordes con una relación beneficio/riesgo razonable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", significa un material farmacéuticamente aceptable, composición o vehículo, tal como un líquido o una carga sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante, implicado en llevar o transportar un agente químico. El vehículo

12

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

ácido nucleico de la L1 del BPV1 (SEQ ID NO:82):

17

imagen15

imagen16

5

10

15

20

25

30

35

40

45

imagen17

Los oligonucleótidos sintéticos orientados de manera inversa (de espaldas) (1., véase los pares de cebadores anteriormente) que codifican los aminoácidos 18-31 de la L2 del VPH16 se usaron para la inserción en el ORF de la L1 del BPV1 mediante una PCR inversa de touchdown, usando el vector de transferencia de baculovirus BPV1 L1pEVmod (Kirnbauer y col. (1992) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 89, 12180-12184). Para evitar productos no específicos, la temperatura de hibridación disminuyó en 1,5 °C durante siete ciclos, seguido por 30 ciclos adicionales a la temperatura final de touchdown. Posteriormente, las secuencias de L2 insertadas se unieron mediante ligadura de extremos romos. Las mutaciones silenciosas se introdujeron en el extremo C-terminal del ORF de la L1 (tramo poli-A) mediante (2.) para evitar mutaciones del amplímero. La secuencia L1-L2 mutada se volvió a clonar en el vector pEVmod y los epítopos de L2 insertados se alargaron adicionalmente mediante la replicación de la PCR (3.)

La siguiente serie de péptidos que abarca el extremo N-terminal de la L2 del VPH16 se incorporó en el BPV1 L1 pEVmod empleando un sitio de enzima de restricción (ccgcgg) SstII recién establecido entre los aa 133 / 134 mediante PCR inversa de touchdown usando el par de cebadores (4.). Los oligonucleótidos de cadena doble (con sitios de SstII en los flancos) que codifican los péptidos de los aa 2-22 (5.), aa 35-75 (6.) de la L2 del VPH16 se generaron mediante hibridación de nucleótidos sintéticos, o mediante generación de amplímeros de PCR que codifican los aa 75-112 (7.), aa 115-154 (8.), aa 149-175 (9.), aa 172-200 (10.), aa 13-107 (11.) de la L2 del VPH16, respectivamente y se clonaron en el sitio de SstII de la L1 del BPV (aa 133 / 134). SstII (ccgcgg) codifica para prolina

(P) -arginina (R), añadida a ambos extremos de la L2 en las proteínas de fusión traducidas.

Un plásmido que codifica la L1 del VPH16 (que deriva del clon genómico 114K (27)) -aa 17-36 de la L2 del VPH16 (referido adicionalmente como 16L1-16L2 17-36) se generó mediante subclonación de los oligos sintéticos de codón optimizado (Geneart, Alemania) en los sitios BgIII a KpnI del vector de transferencia de baculovirus pSynwtVI(Kirnbauer y col. (1993) J Virol 67, 6929-36). Los vectores de expresión recombinante se verificaron mediante secuenciación bidireccional (VBC-Biotech; Viena, Austria).

Los baculovirus recombinantes se generaron mediante cotransfección de células de insecto Sf-9 con vectores de transferencia y ADN de baculovirus linealizado (BaculoGold, BD Biosciences). La expresión y purificación de las VLP se realizó tal como se describe anteriormente en Kirnbauer y col. (1992) (citado anteriormente). En resumen, las proteínas quiméricas se expresaron mediante infección de células de insecto con reservorios de baculovirus amplificado durante 3 días. Posteriormente, las células recolectadas se lisaron mediante ultrasonidos en PBS / NaCl 0,8 M / CaCl2 2 mM / PMSF 1 mM. Tras la adición de Brij58 al 0,5 %, las proteínas se incubaron durante la noche a 4 °C. Las estructuras de elevada masa molecular se purificaron mediante ultracentrifugación en almohadillas de sacarosa / PBS (35 % p/v) y gradientes de densidad CsCl / PBS al 29 % (p/p) durante al menos 24 horas cada una.

El desensamblaje de la VLP en capsómeros pentaméricos se logró en condiciones reductoras mediante diálisis extensiva en TrisHCl 10 mM a pH 7,9 / DTT 10 mM / 2-mercaptoetanol (2-ME) al 7,5 % (adaptado por McCarthy y col. (1998) J Virol 72, 32-41). Las inmunizaciones se realizaron con pentámeros sometidos a rediálisis en tampón equivalente sin 2-ME. Para las inmunizaciones con antígeno desnaturalizado, la VLP se sometió a diálisis frente a PBS (NaCl 0,5 M / CaCl2 1 mM / Tween-80 0,02 %) y se hirvieron en SDS al 4 %.

B. Análisis por transferencias de Western

Las células Sf-9 se infectaron durante 3 días, se recolectaron, se desnaturalizaron en tampón de lisis (2-ME al 2 %) y se analizaron mediante SDS-Page y análisis por transferencia de Western. La expresión de proteínas L1 se verificó mediante anticuerpo monoclonal (mAb) AU1 que reconoce el epítopo lineal DTYRYI (BAbCO) de la L1 del BPV (SEQ ID NO:93), o Camvir-1 generado frente a la L1 del VPH16 (BD Pharmingen). Para verificar la antigenicidad de los péptidos de L2, las muestras se ensayaron con mAb RG-1 dirigidos a los aa 17-36 de la L2 del VPH16 (Gambhira y col. (2007b) J Virol 81, 13927-31), o suero policlonal de conejo generado frente a los aa 1-88 marcados con His de la L2 del VPH16 o los aa 11-200 marcados con His de la L2 del VPH16 (Pastrana y col. (2005a) Virology 337, 365-72).

20 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

C. Microscopía electrónica de transmisión (MET)

Las partículas purificadas se cargaron sobre rejillas de cobre recubiertas de carbón con brillo descargado, se fijaron en glutaraldehído al 2,5 %, se tiñeron de manera negativa con uranilacetato al 1 %, y se visualizaron con el microscopio electrónico JEOL 1010 a 80 kV y a 30.000 aumentos.

D. Inmunización

Las proteínas se sometieron a diálisis de manera extensiva frente a PBS que contiene NaCl 0,5 M / CaCl2 1 mM / Tween-80 al 0,02 %. Dos conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW) se inmunizaron con cada 50 µg de partículas naturales o desnaturalizadas con SDS en adyuvante completo de Freund (CFA), seguido por tres refuerzos cuatro, seis y ocho semanas más tarde en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (Charles River; Kisslegg, Alemania). Como alternativa, los inmunógenos se administraron en una mezcla de 10:1 de gel de hidróxido de aluminio (A8222, SIgma-Aldich) y monofosforil lípido A (S6322, Sigma-Aldrich) (citado como Alumbre-MPL) preparada de acuerdo con los protocolos del fabricante. A los ratones Balb/c se les dio 10 µg de antígeno y se reforzó cuatro, ocho y diez semanas después de la primera inyección. Los sueros se recolectaron 14 días después del último refuerzo y se almacenaron a -20 °C. E. ELISA

Los títulos de anticuerpos específicos generados contra los aa 2-22. 75-112, 115-154, 149-175, 172-200 de L1 del BPV1-L2 del VPH16 (denominado además como BL1-16L2) se determinaron mediante ELISA, usando los polipéptidos de aa 1-88 de la L2 marcados con His del VPH16 o los aa 11-200 de la L2 del VPH16 para recubrir las placas de microtítulo.

Estos antígenos se generaron usando el vector pET28A (Pastrana y col. (2005a) (citado anteriormente) transformado en E. coli de Rosetta DE3 (Novagen), se indujeron por IPTG y se purificaron por afinidad sobre columnas de Ni-NTA (Qiagen). Las proteínas eluídas se agruparon, se verificaron mediante análisis por transferencia de Western, se cuantificaron mediante el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce) y se almacenaron a -20 °C.

El ELISA se realizó tal como se describe anteriormente (Gambhira y col. (2007b) J Virol 81, 13927-31). Las placas Maxisorb (Nunc) se recubrieron toda la noche con 0,1 µg / pocillo de péptido de L2 en tampón de carbonato (a pH 9,6) y se bloquearon con BSA-PBS al 1 %. Las diluciones seriadas de diez veces de antisuero se incubaron por triplicado en pocillos en BSA / PBS / Tween-20 (Tw-20) al 0,05 %. Tras 3 lavados con PBS / Tween-20 al 0,05 %, el anticuerpo conjugado con peroxidasa en BSA / PBS / Tween-20 al 0,05 % (1:5000) se añadió y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se lavaron y se desarrollaron mediante adición del sustrato ABTS (Boehringer Mannheim). La densidad óptica (DO) a 405 nm se determinó usando un lector de ELISA (Dynatech).

F. ELISA usando el péptido sintético biotinilado de los aa 18-31 de la L2 del VPH16

El antisuero generado frente a los aa 18-31 de BL1-16L2, los aa 17-36 de BL1-16L2, los aa 17-36 de 16L1-16L2 se examinaron mediante ELISA usando el péptido biotinilado de los aa 18-31 de la L2 del VPH16 (LYKTCKQAGTCPPD (SEQ ID NO:94); JPT Peptide Technologies; Berlín, Alemania) como antígeno (Slupetzky y col. (2007) Vaccine 25, 2001-10). Se añadió un µg de péptido /pocillo a las placas de estreptavidina Nunc durante toda la noche (tal como se especifica mediante el protocolo general de recubrimiento con estrepavidina Nunc). Las placas se lavaron con PBS, se bloquearon durante toda la noche con leche desnatada en polvo al 0,5 % / PBS a 4 °C, y se incubaron con antisuero diluido de forma seriada durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras tres lavados con PBS, se añadió una dilución de 1:10.000 de conjugado, las placas se lavaron, se desarrollaron con ABTS y se determinaron con DO a 405 nm.

G. Ensayo de neutralización de pseudovirion

Los pseudoviriones se produjeron en células 293TT y se purificaron sobre gradientes Optiprep (Sigma) tal como se describe por Buck y col. (véase la página web mundial: ccr.cancer.gov/lco/protocols.asp) con pequeñas modificaciones. Se usaron los siguientes plásmidos para la expresión de las proteínas de la cápside L1 y L2 o fosfatasa alcalina secretada (SEAP):

Plásmidos de empaquetamiento: VPH5: p5sheLL; VPH6: p6sheLL; HPV16: p16L1h, p16L2h; VPH18: peL1fB, peL2bhb; VPH45: p45shell, CRPV: pCRPVL1, pCRPVL2 (proporcionado por J. Schiller, NIH, mapas de plásmido y referencias: véase la página web mundial home.ccr.cancer.gov/Lco/plasmids.asp), VPH31: p31L1h, p31L2h (Konda y col. (2007) Virology 358, 266-72); VPH52: p52L1h, p52L2h (no publicado) VPH58: p58L1h, p58L2h (Konda y col. (2007) (citado anteriormente) (proporcionado por Kanda, Tokyo) VPH11: L1 del VPH11, L2 del VPH11, L1/L2 del VPH11, no publicado (proporcionado por M. Müller, Heidelberg) Plásmido diana: pYSEAP (proporcionado por J. Schiller, NIH)

Los vectores de expresión para empaquetar las proteínas de la cápside se cotransfectaron con el plásmido reportero pYSEAP y la generación de la cápside se detectó mediante colorimetría. Los ensayos de neutralización se realizaron de acuerdo con un protocolo adaptado (véase la página web mundial: ccr.cancer.gov/lco/neutralizationassay.htm). Los pseudoviriones se preincubaron con diluciones seriadas a 1:2 de suero, comenzando a 1:100 en pocillos

21

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

25

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

Claims

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

39