CN1498963A - 人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用昆虫细胞－杆状病毒表达系统制备重组人乳头瘤病毒的病毒样颗粒(VLP)的方法，其中该病毒衣壳蛋白L2蛋白可以提高衣壳蛋白L1蛋白的表达量及病毒样颗粒的产量。本发明还涉及制备的重组病毒样颗粒在人乳头瘤病毒疫苗研制和临床检测中的应用。

Description

人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的生产方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及用昆虫细胞表达体系表达、纯化人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)的病毒样颗粒(VLP)的方法，还涉及所获得的重组病毒样颗粒，及其在HPV疫苗研制和临床检测中的应用。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。根据感染部位可分为皮肤型和粘膜型两组，粘膜组HPV又根据引起病变的性质分为两类：引起粘膜上皮良性增生病变的低危型和与人类多种器官恶性肿瘤(如宫颈癌、阴茎癌、喉及支气管癌、食管癌、口腔癌等)密切相关的高危型(Zur Hausen H.Biochim Biophys Acta 1996；1288：F55-F78.)。根据核酸序列同源性，HPV可分为80多型，不同型别的HPV引起不同的疾病。HPV 1、2、3、4、7、10、26-29在正常或免疫缺损个体中引起良性疣。HPV 5、8、9、12、14、15、17、19-25、36、46-50在免疫缺损个体中引起扁平状损伤。HPV 6、11、34、39、41-44、51-55引起生殖道或呼吸道粘膜发生非恶性湿疣。HPV 16和18与宫颈癌的发生高度相关，其中HPV 16是最主要的致癌因素。HPV 6和11是90％以上生殖器疣和喉乳头瘤的致病因子。在我国，HPV 6b是HPV 6的主要亚型(国外是以HPV 6a为主)。

完整的乳头瘤病毒(Papillomavirus，PV)颗粒直径约55nm，由病毒基因组DNA与衣壳两部分组成，无包膜，衣壳呈二十面体，由72个壳粒组成，病毒颗粒在CsCl中的浮力密度为1.34g/cm³。病毒基因组是双链环状DNA，约8kb，动物PV和HPV具有相似的基因组结构，遗传信息储存于其中一条DNA链上(Pfister H and Fuchs PG.Intervirology 1994；37：143-9)。基因组含至少8个开放阅读框(ORF)，ORF间可部分或全部重叠，基因组根据功能分为三个功能区：早期区，编码6个非结构蛋白(E1、E2、E4、E5、E6、E7)，编码的蛋白与病毒的复制、转录和转化作用有关；晚期区，含L1、L2两个ORF，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2两个结构蛋白，参与病毒粒子的组装；长控制区(LCR)，又称非编码区或上游调控区，不编码任何蛋白，但含有复制起点、启动子、增强子、沉寂子等多种调控元件，影响病毒的复制和转录。

疫苗防治HPV相关疾病是近几年来的研究热点。EGW病变部位HPV病毒粒子很少，严格的种属特异性决定了HPV疫苗无法直接通过动物体内繁殖病毒体来制备，而且，现还不能从细胞组织培养中获得足够量的病毒粒子。因此，通过获得病毒体进行减毒活疫苗或灭活疫苗的研制路线是行不通的。目前HPV疫苗研究主要集中在基因工程生产HPV亚单位疫苗。

HPV衣壳是HPV疫苗研发及抗原检测的首选目的蛋白。HPV衣壳是由L1和L2蛋白共同构成，二者比例约10∶1。单独的L1蛋白可以自发组装成直径与HPV成熟病毒大小相近(约55nm)的病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)(Rose RC et al.，J Virol 1993，67(4)：1936-1944)，VLP和天然PV的形态相似，都是二十面体结构，只是VLP内部无病毒核酸。在动物实验中，只有L1蛋白装配成的VLP诱发的抗体具有中和病毒、预防感染的能力，而变性的L1蛋白(不具有VLP结构)免疫后不能预防感染(Suzich，J.A et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1995 Dec 5；92(25)：11553-7)。VLP保留了天然病毒粒子的抗原表位，是最有希望的HPV预防性候选疫苗，VLP结构的保留对预防病毒感染至关重要。因此，在HPV疫苗研制及HPV临床诊断中，获得保留有天然病毒构象及尽可能多的表位的重组病毒样颗粒是关键，而且需要高效率的表达及制备方法。

在原核细胞中表达时因缺乏必要的蛋白质翻译后修饰、加工、转运等机制不能在细胞内表达过程中自动折叠形成衣壳立体结构(即VLP)。有报道表明在大肠杆菌中表达L1尽管不能自动装配成VLP，但经过复杂的体外变性复性过程，仍可以形成VLP，但得率非常低，仅有0.02-0.04％(Zhang W，et al.，Virology.1998，243(2)：423-431)。所以，尽管在基因工程产物制备上原核表达系统有成本低、工艺简单、产量高的优点，但实现重组HPV L1装配成VLP这一目的，不适合选择原核表达系统。

最早关于HPV衣壳蛋白装配成病毒样颗粒(VLP)的研究是用痘苗病毒表达系统表达HPV-16的L1和L2蛋白(Zhou J et al.，Virology 1991Nov；185(1)：251-257)。Rose等用杆状病毒表达系统单独表达HPV-11 L1蛋白时自动装配成VLP(Rose RC et al.，J Virol 1993，67(4)：1936-1944)，WO9420137(Rose RC et al.)公开了杆状病毒表达系统制备L1蛋白及VLP。Hofmann在酿酒酵母中表达了HPV-6a L1和L1+L2并观察到了自组装成的VLP(Hofmann KJ，et al.，Virology.1995，209(2)：506-518.)，WO9531532(Hofmann KJ，et al.)公开了由酵母表达系统制备重组VLP(L1，L1+L2)的方法。然而，酵母细胞用于表达HPV衣壳蛋白时，VLP产量低。酵母作为低等真核生物，具有与哺乳动物细胞非常不同的蛋白质翻译后加工系统，表达的蛋白含有酵母来源的糖基化修饰，这会影响到抗原表位，并且应用于人体时会引起机体的免疫反应。此外，哺乳细胞表达外源蛋白时，产量低、操作复杂、成本高，不适合于制备疫苗。

据报道，细菌表达的GST-BPV4 L2诱导的血清中和抗体使动物免受BPV-4感染(Gaukroger JM，et al.，J.Gen.Virol.77(Pt 7)：1577-1583，1996)，HPV L2存在交叉中和表位(Roden RBS，et al.，Virology 270(2)：254-257，2000)。

本发明人在相关工作中发现，利用杆状病毒表达系统同时表达HPV的L1和L2蛋白，二者可装配成VLP，特别令人意想不到地是，L2蛋白的引入大大提高了VLP的产量，并且增加了VLP的抗原表位，免疫后诱发机体产生了更广泛的抗体反应。因此，本发明人基于这一发现，完成了本发明。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了一种高效制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，所述方法包括如下步骤：(a)分别将编码所述病毒衣壳蛋白L1和L2的基因克隆到杆状病毒载体中，构建重组杆状病毒；(b)用所构建的重组杆状病毒感染昆虫细胞，表达所述衣壳蛋白，形成病毒样颗粒；和(c)纯化所述病毒样颗粒。其中用含L1基因的重组杆状病毒和含L2基因的重组杆状病毒同时感染昆虫细胞时，含L1基因的重组杆状病毒感染复数占二者总感染复数的比例在30％至100％。

在本发明的一个优选实施方案中，在衣壳蛋白编码区的起始密码子前引入了核苷酸序列“AAT”，以利于杆状病毒载体对外源基因的表达。

在本发明的一个实施方案中，所述人乳头瘤病毒为HPV 6b亚型，利用本发明方法，L1和L2蛋白表达量可以分别达到细胞总蛋白的16％和13％，每5×10⁷细胞贴壁培养物可以纯化得到40μg以上高纯度VLP。另外，采用细胞悬浮培养技术可以获得更高的产量和产率。

本发明还涉及由本发明方法制备的HPV病毒样颗粒，以及所述HPV病毒样颗粒在制备疫苗和诊断剂中的应用。

具体实施方式

本发明提供了一种高效制备重组HPV VLP的方法。用昆虫细胞表达体系高效率表达、纯化HPV衣壳蛋白，获得重组病毒样颗粒。衣壳蛋白编码区起始密码子前引入“AAT”序列，并且在L1蛋白表达的同时增加L2蛋白的表达，提高了L1蛋白的表达量及组装成病毒样颗粒的产量。纯化的病毒样颗粒可达95％以上的纯度。病毒样颗粒具有天然HPV病毒粒子的免疫原性，可诱导机体产生高滴度的抗体，诱导机体产生细胞免疫反应。抗体可以抑制感染性HPV对敏感细胞的吸附和对人上皮组织的感染。其中，由L1和L2蛋白组装成的病毒样颗粒同时诱导出特异于L1和L2蛋白的两种抗体。由本发明提供的方法制备的L1-L2 VLP具有更广泛的免疫反应和免疫保护效果。在本发明的一个实施方案中，进行了HPV6b衣壳蛋白的表达，在我国，HPV 6b是HPV 6的主要亚型。本发明提供的方法同样适用于制备HPV 6a、11、16、18等其它型别HPV的重组病毒样颗粒。本发明方法中使用的杆状病毒载体及昆虫细胞是本领域熟知的常规载体和细胞，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)载体、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)载体、昆虫细胞Sf9、Sf21、BmN等。

本发明的方法具有如下优点：1)表达效率高。2)L2蛋白可以提高L1蛋白的表达量及VLP的产量。3)包含了L2蛋白的VLP抗原表位增加，免疫机体产生了针对L1和L2的抗体。4)制备的VLP免疫产生的抗体具有中和病毒预防感染的效果。5)属于真核表达系统表达，具有与高等生物类似的蛋白质翻译加工系统，有利于表达产物蛋白具有天然的高级结构，保持原有活性与功能。6)昆虫细胞可实现大规模悬浮培养，相对操作技术简单、成本低，适合于规模生产。

附图说明

图1示出重组杆状病毒转移质粒pFB-6L1和pFB-6L2酶切鉴定。

图2示出重组杆状病毒的PCR鉴定。

图3示出重组病毒感染的Sf9细胞中L1蛋白的表达与Western印迹杂交的结果。M：标准蛋白分子量标记；1：做为对照的感染bacmid的Sf9细胞；2：感染Bac6L1的Sf9细胞；1′、2′分别是1、2的Western印迹鉴定结果。箭头指示L1蛋白条带。

图4示出重组病毒感染的Sf9细胞中L2蛋白的表达与Western印迹杂交的结果。M：标准蛋白分子量标记；1：感染bacmid的Sf9细胞做对照；2：感染Bac6L2的Sf9细胞；1′、2′分别是1、2的Western印迹鉴定结果。箭头指示L2蛋白条带。

图5示出不同比例重组病毒感染的Sf9细胞中L1和L2蛋白的表达。其中不同比例的Bac6L1和Bac6L2同时感染Sf9细胞，总的病毒感染复数为10PFU/细胞。在SDS-PAGE电泳图中，L1和L2蛋白条带以箭头标出。Bac6L1∶Bac6L2＝100/0时的L1蛋白表达量定为1，计算出其它条件下L1和L2蛋白的相对表达量，所得的相对值在柱方图的对应位置示出。

图6示出VLP的电镜观察与免疫电镜鉴定的结果。其中A，B分别是从Bac6L1和Bac6L1+Bac6L2感染的Sf9细胞中纯化的VLP。内嵌图C，D分别为B图中的VLP与HPV 6 L1和L2抗体进行免疫电镜检测的结果。

图7示出纯化的VLP的SDS-PAGE和Western印迹鉴定结果。其中M：标准蛋白分子量标记；A，B：分别是从Bac6L1和Bac6L1+Bac6L2感染的Sf9细胞中纯化的VLP。N′(N＝A，B)是用HPV 6 L2抗体检测N的Western印迹结果。N″是用HPV 6 L1抗体和L2抗体混和物检测N的Western印迹结果。实心箭头指示L1蛋白条带，空心箭头指示L2蛋白条带。

图8示出用ELISA分析L1-L2 VLP的免疫反应性的结果。

图9示出用ELISA方法测定免疫小鼠血清抗体效价的结果。其中L1A，L1N，L1+2A，L1+2N，control分别代表按照表2分组免疫后的小鼠血清。

图10示出L1-L2-VLP诱导出特异于L2蛋白的抗体。

图11示出免疫小鼠抗体识别构象依赖的表位。其中未变性的HPV-6L1 VLP(对应图线L1A和L1+2A)和变性的VLP(对应图线L1A denat.和L1+2A denat.)包被于酶标板孔中，抗血清L1A和L1+2A用于ELISA检测。

图12示出HPV-6 L1-VLP免疫血清(L1A)与HPV-11和16 L1-VLP的交叉反应。

图13小鼠脾淋巴细胞增殖反应放射计数。

图14小鼠脾淋巴细胞经HPV 6 L1 VLP体外诱导后IFN-γ，IL-2，IL-10的分泌。

图15激光共聚焦扫描显微镜观察上皮细胞对VLP的吸附摄入及抗血清对其阻断作用。其中A和B分别为HPV-6 L1 VLP和L1-L2 VLP对上皮细胞的吸附摄入；C：阴性对照；抑制实验D-G中都用的是HPV-6 L1-L2VLP，而D、E、F、G中所用的抗体分别为未免疫、L1 VLP免疫、L1-L2VLP免疫小鼠血清和已知的兔抗HPV-6 L1 VLP多抗。

图16裸鼠肾包膜下移植物的组织学鉴定(HE染色)  原始放大倍数200×。A，B：分别是经抗血清和对照血清处理感染性病毒悬液得到的结果。

以下实施例是用于说明本发明，但不是限制其范围。

实施例1增加“AAT”序列的HPV 6b L1和L2编码序列的获得

以重组HPV 6b L1和L2基因的质粒载体(pGEM-T easy，Promega公司)为模板，用如下引物，按常规PCR方法分别扩增在起始密码子前增加“AAT”序列的HPV 6b L1和L2编码序列。L1基因上游引物P1：5′-CCGGATCC_BamHIAATA₅₇₈₉TGTGGCGGCCTAGCGACAGCA-3′；下游引物P2：5′-CAGGATCC_BamHIT₇₂₉₁TACCTTTTAGTTTTGGCGCGCTT-3′。L2基因上游引物P3：5′-GCAGATCT_BglIIAATA₄₄₂₃TGGCACATAGTAGGGCCCGACGACG-3′；下游引物P4：5′-CTAGATCT_BglIIC₅₈₀₂TAGGCCGCCACATCTGAAAAAAATAAGGG-3′。黑体字显示了在引物中引入的BamH I和Bgl II酶切位点，下标数字为相应碱基在原型HPV-6基因组中的位置。

实施例2 重组杆状病毒的构建

1、重组杆状病毒转移质粒的构建

分别用BamH I和Bgl II酶切实施例1中获得的PCR扩增片断，低融点琼脂糖电泳回收HPV-6 L1和L2基因基因片段，分别与经BamH I酶切并脱磷的pFastbac I(GIBCO BRL公司)载体连接，转化DH5 α菌株，涂布于氨苄青霉素抗性LB平板，37℃过夜培养，挑单克隆于液体LB培养基中培养，用碱裂解法小量提取质粒，经酶切电泳初步鉴定筛出阳性克隆，然后用多酶切鉴定筛选出正向阳性克隆，获得的重组杆状病毒转移质粒分别命名为pFB-6L1和pFB-6L2。酶切电泳鉴定结果见图1，其中，泳道1：L1基因的PCR产物(1.5k bp)；泳道2：pFB-6L1/Xba I(1.5k bp)；泳道3：pFB-6L1/StuI(1.2k bp)；泳道4：pFB-6L1/BamH I(1.5k bp)；泳道5：pBR322/Hinf I DNA标记；泳道6：pFB-6L2/Pst I(0.48k bp)；泳道7：pFB-6L2/BamH I+EcoR I(1.4kbp)；泳道8：L2基因的PCR产物(1.4kbp)。酶切位点在载体多克隆位点或(和)L1、L2基因内部，酶切结果均与预期相符。测序结果进一步证实重组正确。

2、重组杆状病毒的获得

将pFB-6L1和pFB-6L2分别转化大肠杆菌DH10Bac(GIBCO BRL公司，菌体中含有杆状病毒穿梭载体bacmid)，在菌体内，通过转座作用使外源基因整合到bacmid，并受杆状病毒多角体蛋白基因启动子的直接控制，将提取的bacmid通过脂质体介导转染昆虫细胞Sf9(GIBCO BRL公司)，培养细胞至充分病变，收获重组杆状病毒。扩增病毒，提取病毒DNA，用上述P1、P2、P3、P4引物及根据bacmid提供的插入位点两侧的M13正反向引物序列合成的引物通过PCR方法分别鉴定L1和L2基因重组杆状病毒(图2)，其中泳道1：Bac6L1用引物M13+和M13-扩增的产物(3.8kbp)；泳道2：Bac6L1用P1和M13-扩增的产物(2.1k bp)；泳道3：Bac6L1用M13+和P2扩增的产物(3.2k bp)；泳道4：Bac6L1用P1和P2扩增的产物(1.5k bp)；泳道5：λDNA/Hind III标记；泳道6：Bac6L2用P3和P4扩增的产物(1.4kbp)；泳道7：Bac6L2用M13+和P4扩增的产物(3.1k bp)；泳道8：Bac6L2用P3和M13-扩增的产物(2.0k bp)；泳道9：Bac6L2用M13+和M13-扩增的产物(3.7k bp)。

分别获得HPV-6 L1和L2基因以正确方式插入的重组杆状病毒，命名为Bac6L1和Bac6L2。杆状病毒的构建、纯化、滴度测定及细胞培养的具体方法参照GIBCO BRL公司Bac-to-Bac杆状病毒表达系统操作手册。病毒的扩增是于75cm培养瓶内接种1×10⁷个Sf9细胞，加入原病毒液5～10μl(病毒感染复数MOI约0.01～0.1)，27℃培养48～72h，收获培养上清，离心去除细胞残渣，获得重组杆状病毒。

实施例3 L1蛋白和L2蛋白在Sf9细胞中的表达

1.病毒感染与蛋白表达的检测

在24孔板中按每孔3×10⁵个Sf9细胞接种，每孔加0.5ml TC-100完全培养基(GIBCO BRL公司)，28℃培养1小时以上，使细胞完全贴壁。实施例2获得的重组杆状病毒病毒以感染复数(MOI)为10感染细胞，28℃培养72h后收获细胞，细胞经PBS(1L：8g NaCl+0.2g KCl+1.44gNa₂HPO₄+0.24gKH₂PO₄，pH7.4)洗涤后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。检测不同比例的L1和L2基因重组杆状病毒同时感染细胞的蛋白表达情况时保证总MOI＝10。向收集的细胞加1×SDS-PAGE上样缓冲液(200μl/10⁶细胞)，煮沸5分钟，室温下离心2分钟(10000rpm)，取20μl进行SDS-PAGE不连续电泳(积层胶5％，pH6.8；分离胶10％，pH8.8)。凝胶用考马斯亮兰R250染色，或用于Western印迹杂交，ECL Western印迹荧光检测按试剂盒(Amersham Pharmacia公司)使用说明书进行。蛋白电泳凝胶经染色、扫描后，用图像处理软件TotalLab(Nonlinear Dynamics公司)分析特异条带对应蛋白质的分子量、相对含量及占细胞总蛋白百分比。

根据所述方法，分别收获重组杆状病毒Bac6L1和Bac6L2感染的Sf9细胞，对细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳和Western印迹杂交(图3，图4)，结果显示：相对于阴性对照(空载bacmid感染细胞)，Bac6L1表达出表观分子量为54.5kD的蛋白(图3的泳道2，箭头所示)，并且此蛋白非常特异地与抗HPV-6 L1抗体(H6C6，由Milton S.Hershey医学中心Christensen惠赠)反应(图3泳道2′，箭头所示)；Bac6L2表达出表观分子量约72.0kD的蛋白(图4的泳道2，箭头所示)，此蛋白也与兔抗HPV-6 L2多克隆抗体(由华盛顿大学Fred Hutchinson癌症研究中心Carter惠赠)反应(图4的泳道2′，箭头所示)。在优化的条件下，L1和L2蛋白表达量可以分别达到细胞总蛋白的16％和13％。

2.L2蛋白表达可以提高L1蛋白表达量

如1中所述方法，进行单独的Bac6L1或Bac6L2感染或者二者按不同比例同时感染Sf9细胞，对细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳，假定单独Bac6L1感染表达的L1蛋白量为1，对L1和L2蛋白对应的各条带进行相对含量分析，结果见图5。其中，比值代表总MOI＝10时Bac6L1与Bac6L2感染的相对量。结果表明，适当的L2蛋白表达可以提高L1蛋白的表达量，以Bac6L1∶Bac6L2＝3∶1(75％)比例同时感染获得的L1蛋白表达量最高，之后，L1蛋白表达量随Bac6L1占感染细胞总病毒的比例的下降而下降；相反，L2蛋白表达量始终随Bac6L1占感染细胞总病毒的比例的下降(Bac6L2所占比例的上升)而上升。

实施例4 VLP的大量制备与鉴定

1.病毒感染

方法I：收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/ml，加入病毒液，接种于培养瓶内，27℃培养72h；

方法II：收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/ml，接种于培养瓶内，27℃孵育2～5h或更长时间，弃去培养液，以1/2量无血清培养基(含病毒)加入培养瓶内，27℃孵育2～5h，再补加1/2量2×血清培养基，继续培养至感染后72h。

2.表达产物VLP的提取

收集感染72h的5×10⁸Sf9细胞，4℃4000g×10min，4℃PBS洗涤两次；10ml PBS(含0.1％Triton X-100，1mmol/L PMSF)悬浮细胞，冰浴30min；冰浴超声粉碎细胞；4℃10000g×15min，离心，上清加于325g/L蔗糖-PBS垫层的离心管上部，4℃25000rpm(141000g，BACKMAN SW-28转头)离心150min；弃上清，沉淀加2ml 307g/L CsCl-PBS，超声波助悬浮，补加307g/L CsCl至11ml，4℃33500rpm(141000g，BACKMAN SW-41转头)离心20h；收集1.29g/ml密度带，4℃PBS透析，PEG20000浓缩，收获蛋白4℃或-70℃保存。

3.表达产物VLP的鉴定

从Bac6L1和Bac6L1+Bac6L2(Bac6L1∶Bac6L2＝3∶1)感染的细胞(MOI＝10 PFU/cell，72hpi)纯化VLP，经负染，电镜观察VLP形态(图6A和B)。Bac6L1感染细胞纯化的VLP(L1-VLP)和Bac6L1+Bac6L2感染细胞纯化的VLP(L1+2-VLP)形态上无明显差异，VLP为圆形，直径约50nm。免疫电镜结果显示L1+2-VLP可以分别与抗HPV-6 L1-VLP抗体和抗HPV-6 L2抗体呈阳性反应(图6C，D)，这与SDS-PAGE电泳和Western印迹杂交鉴定L1+2-VLP组成的结果(图7)一致，说明L2蛋白可以自发参入到L1蛋白自组装形成的VLP中。对L1+2-VLP的SDS-PAGE电泳图谱中的L1和L2蛋白相对含量分析表明，二者摩尔比例为4∶1。

4.L2蛋白与L1蛋白同时表达可以提高病毒样颗粒的产量

与单独L1蛋白表达相比，L2蛋白与L1蛋白同时表达可以显著提高病毒样颗粒的产量。比较单独感染Bac6L1(MOI＝10或15)和同时感染Bac6L1(MOI＝10)和Bac6L2(MOI＝5)，后者的VLP产量是前者的4-5倍(表1)。

             表1 L2蛋白与L1蛋白同时表达可以提高病毒样颗粒的产量

                              L1-VLP                    L1+L2-VLP        L1-VLP/L1+L2-VLP

MOI/(PFU/细胞)       Bac6L1＝10    Bac6L1＝15    Bac6L1∶Bac6L2＝10∶5   平行实验中的比值

VLP产量/μg  实验1   101           /             466                     1∶4.6

             实验2   /             103           441                     1∶4.3

实施例5 VLP的免疫原性

将上述实施例4所述的经大量细胞培养纯化得到的病毒样颗粒用于免疫检测和免疫动物。

动物免疫方案：取BALB/c小鼠，随机分组，每组8只，按下述方案(表2)选择四肢上部内侧皮下免疫。免疫方法、小鼠血清的分离、小鼠脾淋巴细胞的分离、脾淋巴细胞增殖试验、细胞因子IL-2，IFN-γ，IL-10测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)方法参照文献(沈关心，周如麟，主编：现代免疫学实验技术，武汉，湖北科学技术出版社，1998；朱立平，陈学情，主编：免疫学常用实验方法，北京，人民军医出版社，2000)。

                                    表2 小鼠免疫方案

分组L1-VLP免疫加佐剂(L1A)L1-VLP免疫不加佐剂(L1N)L1+L2-VLP免疫加佐剂(L1+2A)L1+L2-VLP免疫不加佐剂(L1+2N)对照组

第一次免疫(第1天)每只75μl(8μg)L1-VLP+75μl FCA每只75μl(8μg)L1-VLP+75μl PBS每只75μl(8μg)L1+2-VLP+75μlFCA每只75μl(8μg)L1+2-VLP+75μl PBS每只75μl PBS+75μlFCA

第二次免疫(第15天)每只75μl(4μg)L1-VLP+75μl FIA每只75μl(4μg)L1-VLP+75μl PBS每只75μl(4μg)L1+2-VLP+75μl FIA每只75μl(4μg)L1+2-VLP+75μl PBS每只75μl PBS+75μlFIA

第三次免疫(第30天)每只75μl(4μg)L1-VLP+75μl FIA每只75μl(4μg)L1-VLP+75μl PBS每只75μl(4μg)L1+2-VLP+75μl FIA每只75μl(4μg)L1+2-VLP+75μl PBS每只75μl PBS+75μlFIA

VLP的免疫反应性

用一系列已知抗体(鼠单克隆抗体H6E51，识别HPV-6及HPV-11VLP共有的变性表位；H6M48，识别HPV-6型特异性L1 VLP构像表位；H6K57，识别HPV-6及HPV-11共有的L1 VLP构象表位，由Milton S.Hershey医学中心Christensen惠赠；兔抗HPV-6 L1-VLP多克隆抗体(rabbitL1)由澳大利亚Queensland大学Frazer惠赠；其它抗体同实施例3中所述)对纯化的VLP的免疫反应性进行鉴定，针对L1+2 VLP的ELISA结果见图8，其中兔对照血清(rabbit control)和鼠对照血清(mouse control)取自未经VLP免疫动物。HPV-6 L1和L2兔多抗与L1+2 VLP呈阳性反应，该VLP中保留了HPV-6和HPV-11病毒粒子共有的表面线性表位(与H6E51阳性反应)和表面构象表位(与H6K57阳性反应)以及HPV-6特异性构象表位(与H6M48阳性反应)。

免疫血清抗体鉴定

第三次免疫后14天取血，摘除眼球，收集血液于1.5ml EP管内，37℃放置30min，转4℃放置30min，2000g离心20min，收取血清，-20℃保存备用。对不同组免疫小鼠获得的血清(每组各鼠血清合并)用ELISA方法测定抗体效价(图9)。实验制备的VLP可诱导出特异于HPV-6 L1VLP的抗体，其中，加佐剂组免疫血清(L1A和L1+2A)滴度在1∶10000以上，未加佐剂组免疫血清(L1N和L1+2N)滴度约1∶2000，阴性对照组(control)未测到抗体活性。

L1+2-VLP免疫血清可以与L2重组杆状病毒(Bac6L2)感染细胞裂解物发生阳性反应，而与对照的非重组病毒(bacmid)感染细胞裂解物不反应(图10)。免疫血清抗体测定结果说明，我们所提取的HPV-6 VLP免疫小鼠后，诱导机体产生了高滴度的特异性抗体，并且免疫佐剂可以提高VLP的免疫原性。

当用于包被的HPV-6 L1-VLP抗原在碱性(pH＝10.6)和还原剂存在条件下加热处理后，免疫血清(L1A和L1+2A)与变性抗原的结合力显著下降(图11)。说明，制备的抗血清中的抗体主要识别构象依赖的抗原表位。

为了进一步考察用本发明的VLP免疫获得的血清在不同HPV型别之间的免疫交叉反应性，分析了用HPV-6 L1-VLP免疫获得的抗血清L1A同时与HPV-6，-11，-16的L1 VLP抗原的免疫反应性。结果(图12)表明：L1A显示出与HPV-6 L1 VLP的高反应性，在低稀释倍数(小于300)情况下，亦与HPV-11 L1 VLP呈阳性交叉反应，而与HPV-16 L1VLP在稀释倍数为33时仅有微弱反应。可见，用HPV-6 L1-VLP免疫获得的抗血清对HPV-11抗原显示出一定的交叉反应，而与HPV-16无明显交叉反应。

淋巴细胞增殖反应测定结果

取L1A、L1+2A及对照组小鼠脾脏淋巴细胞，分别以HPV-6 L1 VLP抗原刺激，同时设分裂原ConA阳性对照和1640培养基阴性(medium)对照，每个处理设三个重复。用³H-TdR掺入法测定淋巴细胞的增殖反应。放射计数及刺激指数(SI)计算结果如表3及图13。可见免疫组小鼠脾淋巴细胞在特异性抗原刺激下发生明显的增殖反应，³H-TdR掺入值(cpm)升高，明显高于未免疫对照组，P＜0.01，L1A和L1+2A两组间无显著性差异，P＞0.05，L1A和L1+2A组刺激指数(SI)分别为6.4和6.2，而对照组为1.1。

                             表3 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应

小鼠分组  ConA(cpm)    HPV-6 L1 VLP(cpm)   培养基(cpm)   ConA刺激指数   VLP刺激指数

L1A       17034±4317  7690±1842          1195±248     14.3           6.4

L1+2A     21101±5371  8098±1621          1302±331     16.2           6.2

对照      20844±4668  1426±360           1318±259     15.8           1.1

细胞因子IFN-γ，IL-2，IL-10测定

对小鼠脾淋巴细胞在抗原刺激下分泌细胞因子的情况采用双抗体夹心ELISA方法进行了测定。根据系列浓度标准品450nm的光密度推导浓度与光密度之间的线性函数关系，再计算被检样品中的细胞因子含量，结果见表4和图14。ConA可以非特异性刺激免疫组(L1A和L1+2A)和对照(未免疫)组IFN-γ、IL-2、IL-10的释放，HPV-6 L1 VLP刺激只引起IFN-γ释放的微弱增加，但可以特异的使免疫组IL-2和IL-10分泌明显增加，显著高于未免疫对照组，P＜0.01。IL-10在无诱生剂存在下可有低水平的表达。

  表4 HPV 6 L1 VLP体外诱导免疫小鼠脾淋巴细胞对IL-6，IL-2，IFN-γ分泌的影响

        IFN-γ(pg/ml)                       IL-2(pg/ml)               IL-10(pg/ml)

小鼠分组  ConA      VLP     培养基    ConA     VLP      培养基   ConA     VLP      培养基

L1A       175±10  16±0.8  7.1±1.5  249±63  94±12   23±3.1  427±21  107±11  26±5.6

L1+2A     157±18  13±1.1  9.4±0.4  226±77  102±15  20±4.9  435±39  93±5.3  19±3.2

对照      192±35  12±1.2  7.6±0.8  190±23  19±2.1  19±1.5  464±41  28±2.4  23±1.9

上述结果说明，制备的VLP具有良好的抗原性，在免疫的小鼠体内同时诱导了细胞免疫和体液免疫。

实施例6 免疫血清中和病毒、抗感染作用

1.上皮细胞对VLP的吸附摄入与免疫血清的阻断作用

研究资料表明乳头瘤病毒结构基因表达产物装配成的VLP可吸附于宿主敏感细胞并被吞入至胞浆内。VLP的这一特性为研究VLP与细胞之间的相互作用提供了方便，同时为研究相应抗体的中和作用也提供了一种有效的手段。本实施例以人胚上皮细胞为靶细胞，检测了前述实施例制备的VLP与其受体间的相互作用，激光共聚焦扫描显微镜观察结果如图15所示，当VLP不与免疫血清孵育可见细胞浆内荧光染色阳性，说明VLP可被吸附并进入细胞内，在实验条件下，细胞吸附与内吞L1-VLP与L1+L2-VLP的能力未见明显差异。VLP预先与免疫血清作用后，就不能有效地被细胞摄入，说明免疫血清具有中和作用，阻断了VLP对细胞的吸附，进而阻断了细胞对VLP的摄入。这在细胞水平上提示免疫血清具有中和病毒、阻断感染的作用。

免疫血清在裸鼠异源组织移植模型中的抗感染作用

裸鼠异源组织移植模型是由Kreider等人建立的HPV感染试验模型(Kreider J W，et al.Nature，1985，317(6038)：639-641.)。HPV体外感染人上皮组织后，将感染的组织块移植于无胸腺小鼠肾包膜下培养，HPV可以复制扩增，并引起感染组织发生增生病变。在裸鼠异源组织移植模型中，直接评估了VLP免疫血清的抗HPV感染能力。从新鲜的尖锐湿疣活检标本制备HPV悬液，与血清孵育后，用其感染新鲜的人包皮上皮组织块(1×1mm)，将组织块移植入裸鼠肾包膜下，通过小鼠体内培养，饲养至第102天时取出移植物，发现对照血清(未免疫小鼠)处理过的病毒的感染移植物直径由移植前的1mm增至2-4mm，增厚，对肾实质有一定侵入，硬度增加，表面有颗粒突起，呈菜花状，而L1-VLP和L1+2-VLP免疫血清中和过的病毒的感染移植物未见上述变化，L1-VLP和L1+L2-VLP两组免疫血清中和试验结果相似。取出移植物经固定、包埋、切片、HE染色，进行组织学鉴定，结果如图16。抗血清中和过的病毒悬液感染的包皮组织具有正常上皮组织的分化特征(图16A)，而未经抗血清中和的HPV可以感染包皮，引起上皮角化不全(上皮分化不明显)，发生增生性病变，棘层变厚，上部出现凹空细胞，呈HPV感染的典型症状(图16B)。因此，组织学结果进一步证实，抗血清具有中和病毒，抑制病毒感染的作用。

实施例7 临床检测

基于VLP抗原包被的酶联免疫吸附试验(ELISA)：

用50μl包被液(磷酸盐缓冲液PBS)将抗原适当稀释，使微量反应板上每孔加样50μl，37℃包被1h，再置于4℃包被过夜。倾去孔内液体，用PBS洗涤两次。随后加5％脱脂奶粉-PBS 50μl/孔，室温封闭30分钟。加用1％脱脂奶粉-PBS稀释的患者血清50μl/孔，37℃(或室温)孵育1小时后用PBS洗5次。之后加入用1％脱脂奶粉-PBS 1/1000稀释的HRP标记的羊抗鼠/兔IgG 50μl/孔，37℃(或室温)孵育1小时。再次用PBS洗7次。洗涤后，每孔加新鲜配制的50μl底物液(2.43ml 0.1M柠檬酸+2.57ml 0.2M Na₂HPO₄+5ml H₂O+4mg OPD+15μl 30％H₂O₂)，37℃避光显色反应5-15分钟。最后每孔加50μl 2M H₂SO₄ 50μl终止反应。用酶标仪于490nm波长检测每孔光密度值。结果判定，阴性对照OD＜0.2，按下式计算P/N值：

P/N＝(待检孔OD-空白对照孔OD)/(阴性对照孔OD-空白对照孔OD)

若P/N≥2.1，判为阳性；≤1.5判为阴性；1.5-2.1为可疑。

用上述方法，酶标反应板每孔加入50μl HPV-6b L1-L2 VLP(0.1-0.2μg，PBS稀释)包被，对来自临床明确诊断为尖锐湿疣患者的血清进行检测发现阳性率为38％。基于上述抗原抗体反应原理，应用制备的VLP或/和VLP抗体可以设计出多种检测诊断方法，包括但不限于ELISA、RIA、快速试纸条检测等方法。

Claims (9)

1.一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)分别将编码所述病毒衣壳蛋白L1和L2的基因克隆到杆状病毒载体中，构建重组杆状病毒；

(b)用所构建的重组杆状病毒感染昆虫细胞，表达所述衣壳蛋白，形成病毒样颗粒；和

(c)纯化所述病毒样颗粒。

2.如权利要求1所述的方法，其中在衣壳蛋白L1和L2编码区起始密码子前引入“AAT”序列，以利于杆状病毒载体对外源基因的表达。

3.如权利要求1所述的方法，其中用含L1基因的重组杆状病毒和含L2基因的重组杆状病毒同时感染昆虫细胞时，含L1基因的重组杆状病毒感染复数占二者总感染复数的比例在30％至100％。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述人乳头瘤病毒选自人乳头瘤病毒亚型6b、6a、11、16和18。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述人乳头瘤病毒为亚型6b。

6.由权利要求1-5任一项的方法获得的重组人乳头瘤病毒的病毒样颗粒。

7.如权利要求6的病毒样颗粒抗原的抗体。

8.包含权利要求6的病毒样颗粒的疫苗。

9.一种诊断试剂盒，其包含权利要求6的病毒样颗粒或权利要求7的抗体。

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