MX2014006520A - Particulas quimericas de vph. - Google Patents

Abstract

Esta invención se relaciona con partículas similares al virus (VLP) del virus del papiloma humano (VPH) quimérico que tienen un diámetro de alrededor de 30 nm. La invención además se relaciona con métodos de tratamiento y/o profilaxis de infección por VPH y/o cáncer cervical por la administración de las VLP del VPH quimérico de la invención a un sujeto.

Description

PARTÍCULAS QUIMÉRICAS DE VPH ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con una partícula similar al virus (VLP) del virus del papiloma humano (VPH) quimérico que tiene un diámetro de alrededor de 30 nm y un método de tratamiento y/o profilaxis de infección por VPH y/o cáncer cervical por la administración de una VLP del VPH quimérico de la invención.

El cáncer cervical es principalmente provocado por una infección por VPH y es el tercer cáncer más común entre las mujeres a nivel mundial (Ferlay et al., 2010). Como resultado, el desarrollo de una vacuna para VPH es una prioridad para la investigación preventiva del cáncer. La proteína de cápside mayor Ll es el antígeno de elección para vacunas profilácticas, ya que es inmunodominante y se auto-ensambla en las VLP que son estructural e inmunológicamente similares a los viriones auténticos. La vacunación con las VLP provoca altos títulos de anticuerpos de neutralización (NAb) tanto en animales como en humanos y dos vacunas profilácticas multivalentes a base de VLP de Ll del VPH se han autorizado y son altamente efectivas en la prevención de infecciones del VPH-16 y 18 tipo vacuna y enfermedades asociadas (Schiller et al., 2008).

A pesar de la alta eficacia de las vacunas para VPH basadas en VLP de Ll actuales, la especificidad del tipo (Brown et al., 2009; Wheeler et al., 2009), la carencia de eficacia terapéutica (Grupo de Estudio FUTURE II, 2007; Hildersheim et al., 2007) y el alto costo de las vacunas (Schiller et al., 2008) han limitado su amplia distribución de aplicación, en particular en países desarrollados con >80% de la carga de cáncer cervical (Parkin y Bray, 2006) . Por lo tanto, existe una necesidad urgente para una segunda generación de vacunas económicas para VPH, que amplíe la protección para incluir múltiples tipos de VPH oncogénicos, y mejore la eficacia terapéutica para eliminar las infecciones por VPH y lesiones cancerosas establecidas.

Las vacunas de VPH profilácticas de amplio espectro pueden desarrollarse utilizando epítopos L2 por neutralización cruzada. Los Epítopos L2 pueden incorporarse en las regiones superficiales de Ll para crear quimeras de L1/L2 que despliegan el péptido L2 en la superficie de Ll ensamblada ( O 03/097673; Kawana et al., 1999, 2003; Slupetzky et al., 2007; Kondo et al., 2007, 2008).

El uso de los sistemas de expresión en plantas para la producción a gran escala de antígenos exteriores se ha propuesto como una alternativa efectiva en costos para la producción de vacunas (Fischer et al., 2004), con una tendencia definitiva hacia el uso de una expresión transitoria para la expresión y optimización de proteínas de alto nivel (Rybicki, 2009) . Diversos grupos han expresado Ll de VPH-16 en plantas (Biemelt et al., 2003; WO 2006/119516; Maclean et al. , 2007) .

Una limitación práctica de los sistemas de plantas son las bajas producciones de proteína recombinante, potencialmente un resultado de la inestabilidad de la proteína o un bajo nivel de expresión (Fischer et al., 2004; Obembe et al., 2011). Se estima que las producciones de proteína recombinante expresada en plantas necesitan ser mayores que 1% de la proteína soluble total (PST) para ser económicamente viables (Fischer et al., 2004). Esto en particular es problemático para la expresión de proteínas recombinantes que utilizan plantas transgénicas nucleares transformadas, cuando estos sistemas a menudo se asocian con bajas producciones de proteína recombinante (Rybicki, 2009) .

Ll de VPH-16 se ha expresado transgénicamente en plantas de papa y tabaco transformadas nucleares, pero los bajos niveles de expresión de Ll del VPH-16 (< 1% de PST) se han reportado de modo consistente y las respuestas inmunes provocadas fueron relativamente débiles (Biemelt et al., 2003; Varsani et al., 2003b; Varsani et al., 2006a).

Sin embargo, la optimización del codón de humano del gen Ll y su orientación al cloroplasto han mejorado significativamente la expresión de Ll del VPH-16 tanto en transgénicos como en sistemas de expresión en tabaco transgénico mediados por Agrobacterium hasta alrededor de 17% de PST (Maclean et al., 2007).

Un desarrollo reciente en vacunas para VPH derivadas de plantas fue la expresión de la primera quimera de Ll del VPH-16 Ll en plantas. La quimera de L1/E6/E7 consistió de Ll DEL VPH-16 fusionada C-terminalmente a diversos epitopos E6 y E7 y se expresó en tomates transgénicos (Paz De la Rosa et al., 2009). Sin embargo, las producciones fueron bajas (0.05 - 0.1% de PST) y por lo tanto, no son comercialmente viables.

WO 2011/077371 describe un método para producir polipéptidos de Ll del VPH quimérico con niveles de expresión incrementados en relación con la proteina de Ll del VPH en un sistema de expresión de insecto, planta o levadura. Aunque las quimeras de L1/L2 optimizadas por un codón de humano producidas a partir de Ll del VPH y L2 del VPB (aminoácidos 1-88) en las VLP formadas en plantas de alrededor de 55 nm, las otras quimeras de L1/L2 del VPH sólo fueron capaces de formar capsómeros de aproximadamente 17 nm de diámetro.

Aunque los capsómeros son estables a temperatura ambiente, sólo son capaces de inducir de 20 a 40 veces menos respuestas inmunes humorales en comparación con las VLP (Thones et al., 2008). Por lo tanto, seria benéfico desarrollar una VLP quimérica que comprendiera Ll y L2 que se expresaran a niveles comercialmente viables en un sistema de expresión. Tal VLP quimérica podría ser más fácil de purificar y probablemente ser más inmunogénica que un capsómero quimérico COMPENDIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una partícula similar al virus (VLP) del virus del papiloma humano (VPH) quimérico que tiene un tamaño de alrededor de 30 nm de diámetro, la VLP del VPH quimérico comprende un polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano, el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico además comprende un polipéptido Ll del VPH que incluye un péptido L2 de VPH de entre alrededor de 13 aminoácidos a alrededor de 26 aminoácidos insertados a partir del residuo 414 del polipéptido Ll del VPH 16, y en donde los aminoácidos del péptido L2 del VPH insertado remplazan los aminoácidos correspondientes del polipéptido Ll del VPH 16.

Por ejemplo, el péptido L2 del VPH insertado puede ser un péptido LVEETSFIDAGAP de 13 aminoácidos (SEQ ID NO: 3) codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano como se establece en la SEQ ID NO; 7, o un péptido QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV de 20 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano como se establece en la SEQ ID NO: 9, o un péptido GGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPT de 26 aminoácidos (SEQ ID NO: 4) codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano como se establece en la SEQ ID NO: 8.

De preferencia, el péptido L2 del VPH insertado es el péptido LVEETSFIDAGAP de 13 aminoácidos (SEQ ID NO: 3) codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano como se establece en la SEQ ID NO: 7.

La proteina Ll del VPH tipo 16 además puede codificarse por una secuencia de nucleótidos modificada para ser una señal deficiente de ubicación nuclear.

De preferencia, el polipéptido de L1/L2 del VPH-16 comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24, o una variante o derivado de las mismas.

De preferencia, el polipéptido de Ll del VPH-16 es como se indica en la SEQ ID NO: 1 y el polipéptido de Ll del VPH-16 se codifica por una polisecuencia de nucleótidos de Ll del VPH-16 optimizada por un codón de humano como se indica en la SEQ ID NO: 2.

En el diámetro de aproximadamente 30 nm, una VLP del VPH quimérico puede ser una VLP del VPH quimérico expresada en una planta y purificada a partir de un sistema de expresión vegetal. De preferencia, La VLP quimérica expresada puede dirigirse al cloroplasto de la planta.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una VLP del VPH quimérico de 30 nm de diámetro de acuerdo con la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

La composición también comprende un adyuvante.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para producir una VLP del VPH quimérico que tiene un tamaño de alrededor de 30 nm de diámetro, el método comprende las etapas de: (i) proporcionar una secuencia quimérica de nucleótidos optimizada por un codón de humano que codifica un polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico, el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico comprende un polipéptido Ll de VPH 16 que tiene un péptido L2 de VPH de entre alrededor de 13 aminoácidos a alrededor de 26 aminoácidos insertados a partir del residuo 414 del polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico, en donde los aminoácidos del péptido L2 del VPH insertado remplaza los aminoácidos correspondientes del polipéptido Ll del VPH 16; (ii) clonar la secuencia quimérica de nucleótidos optimizada por un codón de humano en un vector de expresión adaptado para expresar un polipéptido en una planta; (iii) transformar o infiltrar una célula vegetal con el vector de expresión de la etapa (ii); (iv) expresar el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico en la célula vegetal de la etapa (iii) de modo que el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico expresado se ensamble en una VLP del VPH quimérico que tiene una forma uniforme y un diámetro de alrededor de 30 nm; y (v) recuperar la VLP del VPH quimérico a partir de la célula vegetal.

El vector de expresión de preferencia incluye promotores y otras secuencias reguladoras, o similares, que se unen operativamente a la secuencia de codificación del vector de expresión.

De preferencia, el vector de expresión de la etapa (ii) se adapta para dirigirse a un cloroplasto de una célula vegetal y en la etapa (iv) , la proteina de VPH quimérica expresada se dirige al cloroplasto de la planta.

La etapa (iii) además puede incluir introducir en una célula vegetal una proteina supresora adaptada para inhibir el silenciamiento génico post-transcripcional en una planta. De preferencia, la proteina supresora es la proteina NSs del virus del bronceado del tomate o el pl9 del virus del enanismo arbustivo del tomate.

Por ejemplo, el péptido L2 del VPH insertado puede ser un péptido LVEETSFIDAGAP de 13 aminoácidos (SEQ ID NO: 3) codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano como se establece en la SEQ ID NO: 7, o un péptido QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV de 20 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por codón de humano como se establece en la SEQ ID NO: 9, o un péptido GGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPT de 26 aminoácidos (SEQ ID NO: 4) codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano como se establece en la SEQ ID NO: 8.

De preferencia, el péptido L2 del VPH insertado es el péptido LVEETSFIDAGAP de 3 aminoácidos (SEQ ID NO: 3) codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano como se establece en la SEQ ID NO: 7.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una VLP del VPH quimérico de aproximadamente 30 nra de diámetro, de acuerdo con la invención para su uso en un método para prevenir y/o tratar VPH infección y/o cáncer cervical en un sujeto.

Más específicamente, las VLP del VPH quimérico pueden utilizarse en un método para provocar una respuesta inmune en el sujeto, tal como un anticuerpo neutralizante y/o respuesta CTL. De preferencia, las VLP del VPH quimérico son para su uso en provocar una respuesta inmune de protección cruzada para tipos múltiples de VPH en el sujeto.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de una VLP del VPH quimérico formada regularmente, de aproximadamente 30 nm de diámetro, de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento para su uso en un método para prevenir y/o tratar la infección por VPH y/o cáncer cervical en un sujeto.

Más específicamente, el medicamento puede ser para su uso en un método para provocar una respuesta inmune en el sujeto, tal como una respuesta del anticuerpo neutralizante y/o CTL. De preferencia, el medicamento es para su uso en provocar una respuesta inmune de protección cruzada a tipos múltiples de VPH en el sujeto.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para prevenir y/o tratar la infección por VPH y/o cáncer cervical en un sujeto, el método comprende una etapa de administrar una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de una forma uniforme, de aproximadamente 30 nm de diámetro, una VLP del VPH quimérico de acuerdo con la invención al sujeto.

Más específicamente, el método puede comprender provocar una respuesta inmune en el sujeto, tal como una respuesta del anticuerpo neutralizante y/o CTL. De preferencia, el método comprende provocar una respuesta inmune de protección cruzada a tipos múltiples de VPH en el sujeto.

El sujeto de preferencia es un humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra plásmidos utilizados para crear los constructos de expresión en planta del VPH quimérico. C) Genes quiméricos de VPH de constructos pGA4 se subclonaron directamente en los vectores de expresión de Agrobacterium en plantas: A) pTRAkc-rbcsl-cTP, B) pTRAc y D) pRIC3. Los elementos del vector necesarios para su expresión en plantas se muestran en la figura. P35SS: promotor 35S de CaMV que contiene un intensificador de la transcripción duplicado, CHS: región sin traducir de chalcona sintasa 5', pA35S: señal de poliadenilación 35S de CaMV para la expresión del gen extraño, ColElori: origen de replicacion de E. coli, RK2ori: origen de replicacion de Agrobacterium, bla: gen resistente a ampicilina/carbenicilina, y LB/RB: limites izquierdo y derecho para la integración de T-ADN. El vector pTRAc contiene SAR: regiones de unión al andamio Rb7 del tabaco que flanquean el cásete de expresión. Además, el vector pTRAkc-rbcsl-cTP contiene npt II: el gen resistente a kanamicina, Pnos/pAnos: señal del promotor/poliadenilación del gen nopalina sintasa y rbcsl-cTP: secuencia del péptido de tránsito al cloroplasto de Solanum tuberosum del gen rbcSl de la subunidad pequeña Rubisco. El vector pRIC3 contiene LIR: región intergénica larga de BeYDV, SIR: región intergénica corta de BeYDV, y Rep/RepA: gen rep de BeYDV.

La Figura 2 muestra el tiempo de expresión quimérica L1/L2 orientada al cloroplasto 1-9 días postinfiltración (dpi) en N. benthamiana, ya sea con ( + ) o sin (-) el supresor de silenciamiento NSs. Las quimeras L1/L2 A) L1/L2 (108-120) , ?) L1/L2 (56-81) , C) L1/L2 (17-36) y D) L1/L2 VPB (1-88) en extractos de hoja sin purificar se detectaron por análisis de transferencia Western para CamVirl. M = marcador de proteina con el tamaño en kDa indicado a la izquierda. Control negativo de NSs = extracto vegetal sin procesar infiltrado pBIN-NSs (5 dpi). Controles positivos: N. benthamiana (+) = Ll de VPH-16 derivado de planta.

Las flechas negras indican la posición de las quimeras L1/L2 (~56 kDa) y la flecha gris indica la proteina degradada.

La Figura 3 a) muestra una transferencia Western de las quimeras L1/L2 expresadas utilizando 3 vectores de expresión en plantas: pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP y pRIC3. Las quimeras se co-expresaron con NSs, se extrajeron 5 dpi y se detectaron con CamVirl. La Ll de VPH-16 se expresó como un control de expresión positiva para pTRAc y pTRAkc-rbcsl-cTP (el constructo pRIC3 no estuvo disponible) y el control de expresión negativa fueron plantas infiltradas con NSs. M = marcador de proteina con el tamaño de la proteina indicado en kDa a la izquierda. Las flechas negras indican las quimeras L1/L2 o Ll de VPH-16 (~56 kDa) ; y b) muestra la comparación de las quimeras L1/L2 expresadas utilizando 3 vectores de expresión en plantas: pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP y pRIC3. Las barras de error indican la desviación estándar.

La Figura 4 muestra el ensamble de las quimeras L1/L2 expresadas utilizando 3 diferentes vectores de expresión en plantas: pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP y pRIC3. Las proteínas se co-expresaron con el supresor de silenciamiento NSs y se extrajeron 5 dpi. Las quimeras ensambladas en las estructuras de orden superior tales como capsómeros o las VLP (detectadas por el MAb de H16.V5 específico conformacional ) se expresan como un porcentaje de la proteína quimérica total (detectada por el MAb de H16.J4 específico lineal) . La Ll de VPH-16 se expresó como un control de expresión positivo y el control de expresión negativo fueron plantas infiltradas con NSs. Las barras de error indican la desviación estándar.

La Figura 5 muestra la pureza de los antígenos de vacuna producidos en plantas. A) Gel de proteína teñido con Coomassie. B) Detección de antígenos de VPH por transferencia Western. M = Marcador de proteína con su tamaño en kDa indicado a la izquierda. C = extracto vegetal sin purificar aclarado. P = antígeno purificado. VI = L1/L2 (108-120) , V2 = L1/L2 (56-81) , V3 = L1/L2 (17-36) , V4 ( +) = Ll de VPH-16 y V5 (-) = extracto vegetal infiltrado con NSs. Las flechas negras indican los Antígenos de VPH y las flechas blancas indican la proteína vegetal Rubisco.

La Figura 6 muestra la proteína soluble total (PST) y la proteína de VPH total en las muestras sin purificar y purificadas. La PST se determinó utilizando el ensayo de Lowry y la proteína de VPH se detectó con H16.J4 (específica del epitopo lineal). VI: L1/L2 ( 108-120 ) , V2 : L1/L2 (56-81) , V3: L1/L2 (17-36) , V4 : Ll DE VPH-16 (control positivo), V5 : extracto vegetal de NSs (control negativo) . Las barras de error indican la desviación estándar.

La Figura 7 muestra micrografias electrónicas de transmisión de antigenos de vacuna sin purificar y purificados inmunoatrapados con CamVirl A) VI: Ll/L2(108-120), B) V2: L1/L2 (56-81) , C) V3 : L1/L2 ( 17-36) , D) V : Ll DE VPH-16 (control positivo), E) V5: extracto vegetal NSs (control negativo) . Las cuadriculas se observaron en un Zeiss 912 Omega Cryo EFTE . Escala de barras izquierda = 50 nm, escala de barras derecha = 200 nm. Las flechas verde brillante indican capsómeros de VPH-16 (~10 nm) , las flechas blancas representan agregados de capsómero o las VLP pequeñas (~30 nm) y las flechas gris oscuro indican las VLP de tamaño completo (~55 nm) .

La Figura 8 muestra una micrografia de transmisión electrónica del antigeno L1/L2 (56-81) de vacuna sin purificar inmunoatrapado con CamVirl. Las cuadriculas se observaron en un Zeiss 912 Omega Cryo EFTEM. Escala de barras = 100 nm.

La Figura 9 muestra un ELISA directo de sueros de ratón utilizando Ll de VPH-16 producido con célula de insecto como el antigeno de recubrimiento. VI = L1/L2 ( 108-120) , V2 = L1/L2 (56-81) , V3 = L1/L2 ( 17-36) , V4 = Ll de VPH (+ vacuna control), V5 = extracto vegetal (- vacuna control). A) titulación del antisuero de ratón para todas las vacunas. B) La gráfica muestra los valores obtenidos para los MAb de H16.V5 y CamVirl de control positivo ELISA. C) Valores de absorbancia pre-purgado de la vacuna en una dilución de 1:50. Los marcadores representan el valor medio de las muestras por triplicado y las barras de error indican la desviación estándar .

La Figura 10 muestra una detección por transferencia western de L2 de VPH-16 etiquetado con His y expresado por E. coli en suero de ratón a una dilución de 1:100. M = marcador de proteina con el tamaño de la proteina en kDa. VI = L1/L2 ( 108-120 ) , V2 = L1/L2 ( 56-81 ) , V3 = L1/L2 (17-36) , V4 = VPH Ll (+ vacuna control), V5 = extracto vegetal (- vacuna control). PB = sueros pre-purgados . FB = sueros purgados finales. Para los controles de la transferencia western: +ve = anti-His de ratón (1:2000; Serotec) , -ve = sin anticuerpo primario. La flecha negra indica L2 (-80 kDa) .

La Figura 11 muestra un ensayo de neutralización de PsV para VPH-16. Los sueros hechos a partir de ratones vacunados con V1-V5 se probaron para su capacidad de neutralizar los PsV para VPH-16. A) VI = L1/L2 (108-120 ) , B) V2 = L1/L2 (56-81) , C) V3 = L1/L2 ( 17-36) , D) V4 = Ll de VPH-16 (+ve vacuna control), E) V5 = Extracto vegetal infiltrado con NSs (-ve vacuna control). F) H16.V5 = +ve control de la neutralización. Control celular = -ve infección / control de expresión SEAP. Control de PsV = +ve infección / control de expresión SEAP. Las muestras se analizaron por triplicado y las barras de error indican la desviación estándar.

La Figura 12 muestra un ensayo de neutralización PsV de VPH-18. A) VI = Ll/L2(108- 120), B) V2 = L1/L2 (56-81) , C) V3 = L1/L2 (17-36) , D) V4 = Ll de VPH-16, E) V5 = extracto vegetal infiltrado con NSs (-ve vacuna control) . F) Sueros anti-Cervarix de conejo = +ve control de la neutralización.

La Figura 13 muestra un ensayo de neutralización PsV de VPH-45. A) VI = L1/L2 ( 108-120 ) , B) V2 = L1/L2 ( 56-81) , C) V3 = L1/L2 (17-36) , D) V4 = Ll de VPH-16, E) V5 = extracto vegetal infiltrado con NSs (-ve vacuna control). F) H45.N5 = +ve control de la neutralización.

La Figura 14 muestra un ensayo de neutralización PsV de VPH-52. A) VI = L1/L2 ( 108-120 ) , B) V2 = L1/L2 (56-81) , C) V3 = L1/L2 (17-36) , D) V4 = Ll DE VPH-16, E) V5 = extracto vegetal infiltrado con NSs (-ve vacuna control). F) H52.C1 = +ve control de la neutralización.

La Figura 15 muestra los aminoácidos ( SEQ ID NO: 1) de Ll de VPH-16.

La Figura 16 muestra la secuencia de nucleótidos ( SEQ ID NO: 2) de Ll de VPH-16 optimizada por codón de humano .

La Figura 17 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) del epitopo L2 (108-120) que se insertó en la secuencia Ll de VPH.

La Figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) del epitopo L2 (56-81) que se insertó en la secuencia Ll de VPH.

La Figura 19 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) del epitopo L2 (17-36) que se insertó en la secuencia Ll de VPH.

La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) del epitopo L2 de VPB (1-88) que se insertó en la secuencia Ll de VPH.

La Figura 21 muestra la secuencia de nucleótidos de ADN (SEQ ID NO: 7) optimizada por codón de humano de L2 (108-120) que se insertó en la secuencia Ll de VPH.

La Figura 22 muestra la secuencia de nucleótidos de ADN (SEQ ID NO: 8) optimizada por codón de humano de L2 (56-81) que se insertó en la secuencia Ll de VPH.

La Figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos de AND (SEQ ID NO: 9) optimizada por codón de humano de L2 (17-36) que se insertó en la secuencia Ll de VPH.

La Figura 24 muestra la secuencia de nucleótidos de ADN (SEQ ID NO: 10) optimizada por codón de humano de L2 de VPB (1-88) que se insertó en la secuencia Ll de VPH.

La Figura 25 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) del polipéptido quimérico L1/L2 (108-120) de VPH 16.

La Figura 26 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 23) del polipéptido quimérico L1/L2 (56-81) de VPH 16.

La Figura 27 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) del polipéptido quimérico L1/L2 (17-36) de VPH 16.

La Figura 28 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) del polipéptido quimérico L1/L2 (1-88) de VPH 16.

La Figura 29 muestra la secuencia de nucleótidos de ADN (SEQ ID NO: 26) optimizada por codón de humano que codifica el polipéptido quimérico L1/L2 ( 108-120 ) de VPH 16.

La Figura 30 muestra la secuencia de nucleótidos de ADN (SEQ ID NO: 27) optimizada por codón de humano que codifica el polipéptido quimérico L1/L2 (56-81) de VPH 16.

La Figura 31 muestra la secuencia de nucleótidos de ADN (SEQ ID NO: 28) optimizada por codón de humano que codifica el polipéptido quimérico L1/L2 (17-36) de VPH 16.

La Figura 32 muestra la secuencia de nucleótidos de ADN (SEQ ID NO: 29) optimizada por codón de humano que codifica el polipéptido quimérico Ll/L2(l-88) de VPB del VPH.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención ahora se describirá más completamente en lo sucesivo con referencia a las figuras acompañantes, en las cuales se muestran algunas, pero no todas las modalidades de la invención.

La invención como se describe no deberá limitarse a las modalidades especificas descritas y modificaciones y otras modalidades' se pretenden para incluirse dentro del alcance de la invención. Aunque se emplean términos específicos en la presente, sólo se utilizan en un sentido genérico y descriptivo y no para propósitos de limitación.

Los términos utilizados en la presente tienen sus significados reconocidos en la técnica a menos que se indique de otro modo.

La invención actual proporciona una partícula (VLP) similar al virus del papiloma humano (VPH) quimérico que tiene una forma regular y un tamaño de alrededor de 30 nm de diámetro y un método de tratamiento y/o profilaxis de infección por VPH y/o cáncer cervical por la administración de una VLP del VPH quimérico de la invención. En particular, una VLP del VPH quimérico formada de modo regular y 30 nm de diámetro comprende una proteína Ll de VPH tipo 16 en la cual un péptido L2 del VPH de entre alrededor de 13 aminoácidos y alrededor de 26 aminoácidos codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por codón de humano ha sido insertada en el residuo 414 de aminoácidos, remplazando de este modo los aminoácidos Ll de VPH correspondientes.

La proteína con cápside mayor Ll se auto-ensambla de modo espontáneo en partículas similares a virus (VLP) , que forman la base de las vacunas de VPH profilácticas actuales (Schiller et al., 2008). Las VLP recombinantes se han expresado en diversos sistemas huésped que incluyen mamíferos, insectos, levaduras, bacterias y plantas.

La hélice 4 (h4) C-terminal de Ll de VPH-16 juega un papel en el ensamble de las VLP y se ubica entre los residuos 414-426 (Varsani et al., 2003a). La eliminación de estos motivos resulta en la formación de capsómeros y además evita el auto-ensamble en las VLP (Bishop et al., 2007). Además, existen enlaces disulfuro entre los residuos 175 y 428 cisteína altamente conservados, y las mutaciones de estas cisteínas resultan en la formación de capsómeros en lugar de las VLP (Li et al., 1998; cCarthy et al., 1998; Sapp et al., 1998; Fligge et al., 2001; Varsani et al., 2006b). Sin embargo, en este estudio, se mostró que la inserción de un péptido L2 del VPH de entre alrededor de 13 aminoácidos y alrededor de 26 aminoácidos codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por codón de humano, cuando se insertó en el residuo 414 de aminoácidos, remplaza de este modo los aminoácidos Ll de VPH correspondientes, fue capaz de ensamblarse exitosamente en las VLP quiméricas pequeñas formadas de modo regular, de alrededor de 30 nm de diámetro.

Las vacunas de VPH comerciales (actualmente expresadas en células de levadura o insecto) son costosas (Schiller et al., 2008), parcialmente como resultado de protocolos de producción y purificación costosos, además de métodos de purificación complicada y pre-tratamiento extenso que pueden afectar la estabilidad y recuperación de la proteina Ll ensamblada y Ll desnaturalizada que no induce anticuerpos neutralizantes. Como resultado, la producción de antigenos de vacuna que utilizan sistemas de expresión de bajo costo y procesos de producción y purificación simples mantiene la alta prioridad en cualquier sistema de producción de proteínas comercial.

La invención se describirá a manera de los siguientes ejemplos los cuales no deben interpretarse como limitantes de ninguna manera del alcance de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: EXPRESIÓN VEGETAL TRANSITORIA DE LAS QUIMERAS Ll MÉTODOS Y MATERIALES Vectores de expresión vegetal Se utilizaron tres vectores de expresión de Agrobacterium en plantas binarias para optimizar la expresión quimérica de VPH: pTRAc y pTRAkc-rbcsl-cTP (proporcionados por el Profesor Rainer Fischer; Instituto de Biología Molecular y Ecología Aplicada de Fraunhofer, Alemania) y el vector pRIC3 de geminivirus (BeYDV) de la haba enana amarilla (creado por Richard Halley-Stott ) . Dos de los vectores no se replican los cuales tienen como objetivo la proteina expresada para cualquiera del citoplasma (pTRAc) o cloroplasto (pTRAkc-rbcsl-cTP) (Maclean et al., 2007), y el tercero es un vector (pRIC3) de auto-replicación orientado al citoplasma. El vector pRIC3 es un vector pRIC de tercera generación (Regnard et al., 2010), que se ha reducido en tamaño y ha mostrado una amplificación similar de la expresión transgénica en plantas.

Los vectores contienen un número de elementos necesarios para la expresión de proteina en plantas (Figura 1) . El vector pTRAkc-rbcsl-cTP (Figura 1A) es un derivado de pTRAc (Figura IB), y contiene la secuencia de péptidos de tránsito al cloroplasto del gen rbcSl de la papa. El pRIC3 (Figura ID) contiene las proteínas asociadas para la replicación de BeYDV necesarias para su auto-replicación (Regnard et al. , 2010) .

Síntesis de las quimeras Ll Las cuatro quimeras L1/L2 de VPH-16 utilizadas en este estudio se describen en la Tabla 1. Las quimeras consisten de una secuencia génica aislada Ll de VPH-16 sudafricano (SALI: acceso GenBank no. AY177679) con un Epítopo L2 ubicado en la hélice h4 en el aminoácido 414 (denotado como la "posición F") . Estos genes quiméricos se diseñaron por el Dr. Inga Hitzeroth (Grupo de Vacunas Vegetales, UCT) , se optimizaron en codón de humano y se sintetizaron in silico por GENEART AG (Regensburg, Alemania) utilizando un ensamble génico de alto rendimiento. Las secuencias del epítopo L2 sintetizado remplazan la secuencia Ll en la posición F y no se insertaron simplemente en la proteina Ll.

Tabla 1 : Resumen de los constructos quiméricos L1 de VPH-16 Subclonación de los genes quiméricos Ll Las secuencias quiméricas L1/L2 de VPH-16, se escindieron a partir de los vectores pGA4 utilizando 3' Xhol y cualquiera de los sitios de encima de restricción (RE) 5' BspHI, MluI o HindIII que flanquean los genes quiméricos (Figura 1C) . Los genes de VPH se subclonaron direccionalmente en los vectores de expresión vegetal, utilizando AflIII y Xhol para pTRAc (Figura IB), MluI y Xhol para pTRAkc-rbcsl-cTP (Figura 1A) , y HindIII y Xhol para pRIC3 (Figura ID). Las células de E. coli DH5-a químicamente competentes (E.cloni™, Lucigen) se transformaron con los constructos de plásmido quimérico y se seleccionaron los recombinantes utilizando resistencia a ampicilina (100 µq/m.l) . Los constructos quiméricos L1/L2 de VPH-16 L1/L2 (108-120) , L1/L2 (56-81) y L1/L2 ( 17-36) de pTRAc se proporcionaron por Mark Whitehead (Grupo de Vacunas en Plantas, UCT) . Los constructos de plásmido utilizados en este estudio se resumen en la Tabla 2.

Identificación de quimeras Ll recombinantes Los clones de quimera Ll recombinante se seleccionaron por PCR de colonia, utilizando cebadores específicos del vector pTRAc y cebadores específicos de quimera que se unen a los diferentes epítopos L2 (Tabla 3) . La PCR se realizó utilizando el kit de ADN Polimerasa GoTaq Flexi (Promega) cuando por instrucciones del fabricante se utilizó 1 µ? de cada cebador en una concentración de MgCl2 final de 3 mM.

Tabla 3: Cebadores utilizados en PCR secuenciación de las uimeras de VPH PCR de colonias que utiliza cebadores específicos para el vector Los cebadores pTRAc específicos para el vector (diseñados por Mark Whitehead) se une corriente arriba y corriente abajo del sitio de clonación múltiple (MCS) para insertar las inserciones génicas. El perfil PCR consiste de una etapa de desnaturalización inicial a 95°C durante 3 min, seguida por 25 ciclos a 95°C durante 30 s, a 59°C durante 30 s y a 72 °C durante 3 min, y una etapa de alargamiento final a 72 °C durante 3 min. Los productos PCR se separaron en un gel de agarosa TBE al 0.8% y se detectó que utilizan bromuro de etidio .

PCR de colonia que utiliza cebadores específicos para el epitopo Los cebadores específicos para el epitopo L2 de VPH (diseñados por Marieta Burger) se utilizaron para verificar el inserto quimérico correcto en los clones pTRAkc-rbcsl-cTP y pRIC3 recombinantes . El perfil de PCR consistió de una etapa de desnaturalización inicial a 95°C durante 2 min, seguida por 25 ciclos a 95°C durante 30 s, a 55°C (quimeras L1/L2) durante 20 s y a 72 °C durante 30 s, y una etapa de alargamiento final a 72°C durante 3 min. Los productos PCR se separaron en un gel de agarosa TBE a 1.2% y se detectó que utilizan bromuro de etidio.

Digestión de la enzima de restricción Los recombinantes se verificaron por digestión de la enzima de restricción que utiliza sitios RE que flanquean el inserto génico quimérico de 1.5 kb (EcoRI / Xhol para los clones pTRAkc-rbcsl-cTP, o HindIII / Xhol para los clones pRIC3) . El ADN recombinante (~500 µg) se sometió a digestión durante 1-2 horas a 37 °C, utilizando 1 U de enzima por reacción según las instrucciones del fabricante (Roche/Fermentas) . El ADN digerido se separó en un gel de agarosa TBE al 0.8% y se sometió a tinción con bromuro de etidio .

Secuenciación de las quimeras Ll El inserto génico quimérico de VPH en pTRAkc-rbcsl-cTP recombinante se secuenció utilizando los cebadores específicos pTRAc para el vector. Las secuencias se alinearon con las secuencias quiméricas de VPH utilizando el software de alineación DNAMAN.

Transformación por Agrobacterium Las células de Agrobacterium tumefaciens GV3101 : :pMP90RK se hicieron electrocompetentes utilizando el método descrito por Shen y Forde (1989). La transformación de Agrobacterium se realizó como se describe por Maclean et al. (2007) y los clones recombinantes se seleccionaron por selección de antibiótico (50 µ?/p?? de Carbenicilina, 50 µg/ml de Rifampicina y 30 µg/ml de Kanamicina) . La transformación exitosa se confirmó por PCR de colonia y digestión de la enzima de restricción (como se describe en lo anterior) .

Agroinfiltración de N. benthamiana Los cultivos de quimeras recombinantes de A. tumefaciens, así como los cultivos de LBA4404 de A. tumefaciens que contienen el plásmido pBIN-NSs que codifica el supresor de silenciamiento NSs del virus del bronceado del tomate (TSWV) (Takeda et al., 2002), se prepararon por infiltración como se describe por Maclean et al. (2007). Las células de Agrobacterium se diluyeron en un medio de infiltración (MgCl2 10 mM, MES 10 mM, sacarosa al 3% y acetosiringona 150 µ? en agua, pH 5.6) para proporcionar una OD600 final de 0.25 para cepas de quimera de Agrobacterium individuales y una ??ß?? combinada de 0.5 para los constructos co-infiltrados con LBA4404 (pBIN-NSs) de A. tumefaciens . Las cepas se incubaron a 22 °C durante 2 horas para permitir la expresión de los genes vir antes de la infiltración.

Se agroinfiltraron hojas de N. benthamiana de seis semanas de edad al inyectar la suspensión bacteriana en los espacios aéreos abaxiales del lado ventral de la hoja (Maclean et al., 2007). Las plantas se sometieron a crecimiento bajo condiciones de 16 hr de luz y 8 hr de oscuridad a 22 °C durante el periodo de tiempo deseado. Las pruebas de tiempo de expresión quimérica se llevaron a cabo 1-9 días post-infiltración (dpi) , y las quimeras ya sea coexpresaron con o sin el supresor de silenciamiento NSs. Las plantas se utilizaron por separado para cada quimera, y las hojas separadas de la misma planta se infiltraron con cualquiera de los constructos quiméricos pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP o pRIC3 para la expresión comparativa del vector.

Extracción de proteínas a partir de las plantas Los discos foliares se cortaron utilizando la tapa de un tubo eppendorf, se cosecharon a partir de las hojas agroinfiltradas (~10 mg por disco, 3 discos por constructo) y se molieron en nitrógeno liquido. El material foliar se resuspendió en 250 µ? por disco de un regulador de extracción de PBS con alto contenido de sal NaCl 1.5 (HS PBS) que contenia el inhibidor de proteasa (Inhibidor de Proteasa Completo libre de EDTA; Roche) . El extracto vegetal sin purificar se aclaró dos veces por centrifugación a 13,000 rpm durante 5 min y el sobrenadante se almacenó a -20°C.

Detección por transferencia Western de las quimeras Ll expresadas en plantas Los extractos vegetales se incubaron a 95°C durante 5 min en un regulador de carga (Sambrook et al, 1989), se separaron por un gel SDS-PAGE al 10% y se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa al someterlos a electrotransferencia semi-seca. La membrana se bloqueó en un regulador de bloqueo durante 30 min a temperatura ambiente (leche descremada al 5%, Tween-20 al 0.1% en lx PBS, pH 7.6) y se incubó durante la noche a 4°C en un anticuerpo primario anti-Ll, diluida en el amortiguador de bloqueo. Se detectó la proteina Ll de VPH-16 con ya sea CamVirl (1:10000; Abcam, Reino Unido) monoclonal (MAb) de ratón, el cual se une al epitopo GFGAMDF de Ll lineal ubicado en los aminoácidos 230-236 (McLean et al., 1990), o H16.J4 (1:2500) el cual se une al epitopo lineal ubicado en los aminoácidos 261-280 dentro del bucle FG de la proteína Ll (Christensen et al., 1996). Ambos sitios de unión no se destruyen por las inserciones del epítopo L2.

Las membranas se lavaron con el amortiguador de bloqueo por 4x 15 min, y se incubaron en un conjugado secundario de cabra-anti-ratón-fosfatasa alcalina (1:10000; Sigma) diluido en un amortiguador de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron finalmente con un amortiguador de lavado (Tween-20 al 0.1% en lx PBS, pH 7.6) por 4x 15 min y se desarrolló con un sustrato de cloruro de tetrazolio Nitro blue/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoilo (sustrato de NBT/BCIP; Roche) . La expresión quimérica se comparó al medir la densidad de las bandas detectadas en transferencias western anti-Ll utilizando GeneTools (SYNGENE) .

Cuantificación quimérica por captura con ELISA Las quimeras Ll que se extrajeron a partir de N. benthamiana se cuantificaron por captura con ELISA utilizando un método de alcohol polivinílico (PVA) modificado-ELISA de bloqueo (Studentsov et al., 2002). Brevemente, se recubrió una placa de microtitulación de 96 pozos Maxisorp con MAb anti-Ll de VPH-16 de ratón (cualquiera de CamVirl o H16.J4) 1:2000 durante la noche a 4°C y se bloqueó con PVA. El extracto vegetal se agregó a los pozos y se incubó durante 1 hora a 37 °C. Esto se siguió por una etapa de lavado y la adición de suero policlonal anti-VPH-16 de conejo (1:1000). La placa se incubó durante la noche a 4°C y la proteína Ll de VPH-16 se detectó con un conjugado de peroxidasa de rábano picante anticonejo (HRP) en salmuera (1:5000/ DAKO) y sustrato de diclorhidrato de 1, 2-fenilendiamina (OPD; DAKO; Dinamarca) .

La vacuna para VPH comercial Cervarix se utilizó como un control ELISA positivo y como un estándar de VLP Ll de VPH-16. Cada muestra se analizó por triplicado y se cuantificó utilizando la curva estándar de Cervarix. La cantidad de proteína quimérica presente en cada muestra (mg) se expresó como quimera por kilogramo de tejido vegetal (mg/kg) .

La proteína soluble total (PST) para cada extracto foliar sin purificar se determinó utilizando el ensayo de proteínas de Lowry (Ensayo de Proteína Biorad DC; Protocolo de Ensayo de Microplacas ) según las instrucciones del fabricante utilizando un estándar de proteína de IgG gamma globina de plasma bovino (Bio-Rad) . El rendimiento relativo de la quimera se calculó donde la proteína quimérica (mg) cuantificada por ELISA se expresó como un porcentaje de PST, con el fin de tomar en cuenta las diferencias en la masa de tejido foliar y la eficiencia de extracción de la proteína.

Análisis estadístico de los rendimientos de expresión quimérica Las diferencias estadísticas en la expresión quimérica utilizando los diferentes vectores de expresión en plantas se determinaron utilizando el ANOVA y la prueba de Fischer LSD Post Hoc. Las diferencias se reportaron a p < 0.01 como estadísticamente significativas.

Ensamble quimérico El ensamble de las proteínas de VPH en las estructuras inmunogénicas de orden superior se evaluó utilizando un ELISA de captura de H16.J4 y H16.V5 como se describe en lo anterior. Las uniones del MAb a H16J4 para un epítopo Ll lineal comprende los aminoácidos 261-280 (Christensen et al., 1996) y de este modo proporciona la proteína de VPH total presente en el extracto vegetal. El H16.V5 se une a un epítopo Ll de conformación (Christensen et al., 1996, 2001) que contiene los aminoácidos 260-290 esenciales y específicamente se une a los residuos Ll de Phe-50, Ala-266, y Ser-282 ( hite et al., 1999), de este modo se utilizó para la detección de la proteína de VPH ensamblada. Para comparar el ensamble quimérico expresado utilizando diferentes vectores, la cantidad de proteína de VPH ensamblada se expresó como un porcentaje de la proteína de VPH total.

RESULTADOS Verificación de clones de la quimera Ll Las quimeras Ll (Tabla 1) se clonaron exitosamente en los vectores de expresión pTRAkc-rbcsl-cTP y pRlC3 vegetales y transformados en E. coli y Agrobacterium GV3101.

Los clones recombinantes pTRAkc-rbcsl-cTP se seleccionaron por PCR de colonia utilizando cebadores específicos para pTRAc que se unen corriente arriba y corriente abajo del MCS, o cebadores específicos para la quimera que se une a los diferentes epítopos L2. Todas las quimeras produjeron fragmentos del tamaño esperado como se predijo en la Tabla 3.

Los clones además se verificaron por digestión de la enzima de restricción (RE) utilizando sitios RE de EcoRI y RE de Xhol que flanquean el inserto génico quimérico. Como se esperó, todas las quimeras contuvieron un inserto génico de 1.5 kb. Los clones fueron secuenciados y las quimeras individuales se confirmaron utilizando el software de alineación de secuencias múltiples DNAMAN.

Los clones recombinantes pRIC3 se verificaron de modo similar por PCR de colonia utilizando los cebadores específicos para el epítopo quimérico y la digestión de enzima de restricción HindlII / Xhol. Todas las quimeras produjeron las bandas PCR específicas para las quimeras de 0.2-0.6 kb descritas en la Tabla 3 y el fragmento génico de 1.5 kb en las digestiones de RE. De este modo, todas las quimeras de VPH se subclonaron exitosamente en los vectores de expresión vegetal pTRAkc-rbcsl-cTP y pRIC3.

Optimización de la expresión quimérica Ll en N. benthamiana Co-expresión con el supresor de silenciamiento NSs La expresión L1/L2 de VPH-16 orientada a cloroplasto en N. benthamiana se examinó en una prueba de tiempo de a 1-9 días post-infiltración (dpi) . Las quimeras se expresaron ya sea con ( + ) o sin (-) la proteina supresora de silenciamiento NSs para examinar sus efectos en la expresión quimérica. La expresión se analizó por transferencia estern utilizando el MAb anti-Ll de CamVirl. Todas las quimeras L1/L2 se detectaron, con la banda Ll prevista de ~56 kDa (Figura 2), aunque L1/L2 (108-120) función por arriba de las otras quimeras.

Todas las quimeras mostraron un incremento prolongado en la expresión cuando se co-infiltraron con la proteina supresora de silenciamiento NSs (Figura 2 A-D) , lo que sugiere que fue efectiva en prevenir el silenciamiento génico post-traducción y al intensificar la acumulación de la proteina en plantas. La detección ELISA utilizando el H16.J4 MAb especifico para el epitopo lineal confirmó los resultados, con un incremento de hasta 16 veces en los rendimientos L1/L2 (datos no mostrados). La expresión quimérica sin NSs se detectó en 1-3 dpi y los picos a los 3-5 dpi, mientras que las quimeras co-expresadas con NSs se detectaron a los 3 dpi y la expresión del pico a los 5-7 dpi. Hubo una pequeña reducción en la expresión entre los 5-9 dpi, sugiriendo que existe un declive lento en los niveles de expresión (resultados ELISA, datos no mostrados) . Como resultado, todas las quimeras se co-expresaron con NSs en los demás experimentos.

Se detectaron diversas bandas de alto peso molecular para la quimera L1/L2 (17-36), sugiriendo que la secuencia de señal en el cloroplasto (cTP) no se escindió o que la quimera pudo haberse glicosilado. Sin embargo, la L1/L2 (17-36) analizada en transferencias western posteriores no desplegó estas bandas de alto peso molecular, sugiriendo que la proteina se desnaturalizó parcialmente en la Figura 2C.

La quimera L1/L2 que contiene el epitopo en los aminoácidos 1-88 de la L2 de VPB tuvo bajos niveles de expresión en comparación con las quimeras que contienen epitopos L2 de VPH-16. Las bandas en las transferencias western de L1/L2 de VPB (1-88) solo fueron visibles después de 16 horas de desarrollo (Figura 2D) , en comparación con el tiempo de desarrollo de 15 min requerido para las otras quimeras (Figuras 2A-C) . La cuantificación ELISA estimada para L1/L2 de VPB(l-88) logró rendimientos máximos de 40 mg/kg en tejido vegetal, mientras que los altos rendimientos de expresión de 1000 - 4600 mg/kg se estimaron para las otras quimeras L1/L2 (datos no mostrados) , además, el extracto vegetal L1/L2 de VPB(l-88) contuvo una banda de -45 kDa característica (Figura 2D) asociada con la degradación de Ll, sugiriendo que L1/L2 de VPB(l-88) es inestable en este sistema de expresión. Estos resultados se confirmaron por diversas transferencias western en L1/L2 de VPB(l-88) desde diferentes pruebas de tiempo.

Efecto del cloroplasto orientado al rendimiento quimérico L1/L2 La orientación de las proteínas de VPH al cloroplasto puede mejorar significativamente los rendimientos de la expresión vegetal ( aclean et al., 2007). Para determinar la importancia de la orientación al cloroplasto, los constructos quiméricos L1/L2 de pTRAc (orientación citoplásmica) y pTRAkc-rbcsl-cTP (orientación al cloroplasto) se co-infiltraron con NSs para pBIN en N. benthamiana en un tiempo de prueba de 3-9 dpi. La quimera L1/L2 de VPB(l-88) no se incluyó en este estudio, como se muestra una expresión muy baja en N. benthamiana cuando se compara con las otras quimeras L1/L2.

Las transferencias Western y datos ELISA demostraron de modo consistente una baja expresión para las quimeras L1/L2 orientadas al citoplasma, con una expresión máxima de las quimeras a 3 dpi y rendimientos de 20-45 mg/kg en tejido vegetal (datos no mostrados). La expresión de L1/L2 (108-120) , L1/L2 (56-81) y L1/L2 (17-36) orientados al citoplasma se detectó débilmente en comparación con la quimera L1/L2 ( 108-120 ) orientada al cloroplasto diluida 3x antes de cargarse e incluirse como un control positivo. La comparación de rendimientos quiméricos indica que la expresión quimérica L1/L2 se incrementó 40 - 80 veces cuando se orientó al cloroplasto. Tomando en consideración estos resultados, se hicieron estudios adicionales de expresión quimérica utilizando el vector pTRAkc-rbcsl-cTP .

Optimización utilizando el vector de expresión vegetal pRIC3 de auto-replicación En un intento para mejorar los rendimientos quiméricos, en particular para la L1/L2 de VPB(l-88) de baja expresión, el vector pRlC3 de expresión vegetal (vector de auto-replicación, dirigido al citoplasma) se comparó con pTRAkc-rbcsl-cTP (vector sin replicación orientado al cloroplasto) en una prueba de tiempo de 3-9 dpi en presencia de NSs.

Los rendimientos quiméricos máximos para ambos vectores se obtuvieron a 3-5 dpi. Las tres quimeras L1/L2 que contuvieron los aminoácidos 108-120, 56-81 y 17-36 en los epítopos L2 de VPH-16 se expresaron mejor utilizando el vector pTRAkc-rbcs-cTP orientado al cloroplasto comparado con el vector pRIC3 de auto-replicación . La L1/L2 de VPB(l-88) no fue altamente expresado para cualquiera del vector y degradación que fueron visibles para ambos constructos.

La cuantificación ELISA muestra el vector pRIC3 de auto-replicación que no mejora los rendimientos de la expresión para la mayoría de las quimeras. Los rendimientos se encontraron hasta 3 veces mayores utilizando el vector pTRAkc-rbcsl-cTP, sugiriendo que orientado al cloroplasto es más efectivo en la alta expresión de quimeras que el vector pRIC3, que finalmente se orienta a la proteína expresada al citoplasma. Los niveles de expresión L1/L2 de VPB(l-88) fueron similares al control negativo NSs, sugiriendo que las plantas no son un sistema viable para la producción de L1/L2 de VPB(l-88) y no se buscó más la expresión de L1/L2 VPB(1-88) .

Los resultados de optimización de la expresión utilizando los vectores pTRAkc-rbcsl-cTP y pRIC3 se resumen en la Tabla 4. La L1/L2 ( 108-120 ) , L1/L2 (56-81) y L1/L2 (17-36) fueron altamente expresadas. Los parámetros mostrados para maximizar la expresión en las pruebas de tiempo preliminares fueron: co-expresión con NSs, extracción a los 5 dpi y uso del vector pTRAkc-rbcs-cTP para orientar la proteína L1/L2 expresada al cloroplasto.

Tabla 4: Resumen de la expresión quimérica L1 v optimización Expresión del vector comparativa de las quimeras L1/L2 Se seleccionaron tres quimeras L1/L2 de alta expresión como antigenos de vacuna para los estudios de inmunogenicidad en ratones: L1/L2 ( 108-120 ) , L1/L2 (56-81) y L1/L2 (17-36) . Se realizó un estudio de expresión final que incluyó tres repeticiones biológicas para confirmar los resultados de L1/L2 y obtener datos estadísticamente válidos. Los tres vectores (pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP y pRIC3) se compararon directamente para la expresión de cada uno de los antígenos de vacuna L1/L2, se incluyó Ll de VPH-16 como un control positivo (los constructos pTRAc y pTRAkc-rbcsl-cTP estuvieron disponibles) y las plantas infiltradas con NSs sirvieron como el control negativo. Las quimeras se coexpresaron con NSs y se extrajeron a los 5 dpi.

Efecto de expresión en plantas El examen de las hojas infiltradas antes de la extracción con 5 dpi sugirió que el vector pRIC3 de auto-replicación tuvo efectos adversos en la salud de la planta. Las hojas infiltradas con pRIC3 fueron de color amarillo/café y la necrosis del tejido foliar fue visible en las áreas infiltradas. Esto se observó en un menor grado en las hojas con pTRAc, que también orientaron las quimeras al citoplasma de la planta. Las hojas con pTRAkc-rbcs-cTP parecieron ser las más saludables, parecidas a las hojas del control negativo infiltrado con NSs y las hojas sin infiltrar, sugieren que la acumulación de las quimeras en el cloroplasto tiene menos de un impacto en la salud de la planta (resultados no mostrados), la infiltración parece no tener un efecto que pueda observarse en la salud de la planta, cuando la hoja infiltrada con NSs se observa similar a la hoja no infiltrada (excluyendo las marcas de inyección de la jeringa). Estos resultados se observaron de modo consistente para todas las pruebas de tiempo.

Detección de las proteínas de VPH por transferencia Western La proteina de VPH se detectó por transferencia western anti-Ll (Figura 3A) . El extracto vegetal infiltrado con NSs (control negativo) no se detectó y la Ll de VPH-16 derivado de la planta (control positivo) se detectó utilizando el vector orientado al cloroplasto. La expresión utilizando los diferentes vectores se compare directamente con pTRAkc-rbcsl-cTP de modo consistente dando los rendimientos de expresión más altos, seguidos por pRIC3, y después pTRAc.

Cuantificación ELISA de las proteínas de VPH El ELISA de captura se utilizó para cuantificar las quimeras de VPH utilizando CamVirl. Los rendimientos quiméricos L1/L2 y Ll de VPH-16 se muestran en la Figura 3b. Las diferencias estadísticas en la expresión de quimera utilizando los 3 vectores de expresión vegetal se determinaron utilizando ANOVA y la prueba Fischer LSD Post Hoc. Las diferencias se reportaron como estadísticamente significativas en p < 0.01.

La expresión dirigida al cloroplasto de las quimeras L1/L2 y Ll de VPH-16 utilizando pTRAkc-rbcsl-cTP dieron rendimientos significativamente mayores que el control negativo infiltrado por NSs (p = 0.000 - 0.002), y el vector pTRAc orientado al citoplasma (p = 0.000 - 0.004). Además, pTRAkc-rbcsl-cTP mejoró significativamente la expresión Ll/L2(56-81) comparada con pRIC3 (p = 0.006). El vector pRIC3 no mejoró estadísticamente la expresión de ninguna de las quimeras comparadas con pTRAc .

En comparación con los experimentos de optimización (Figura 2, Tabla 4), la prueba de tiempo comparativa demostró tendencias similares en la expresión quimérica. Las quimeras L1/L2 orientadas al cloroplasto dieron los mayores rendimientos (1040 - 1310 mg/kg; 2 - 3% PST) , mejorando la expresión quimérica hasta por 28 veces en comparación con el vector pTRAc orientado al citoplasma (50 - 260 mg/kg; <1% de PST) y hasta 7 veces en comparación con el vector pRIC3 de auto-replicación (190 - 660 mg/kg; <1% PST) .

Los rendimientos quiméricos orientados al citoplasma se mejoraron hasta 4 veces utilizando el vector pRIC3 de auto-replicación en comparación con el vector pTRAc sin replicación. Esto sugiere que la auto-replicación del vector mejora la expresión quimérica, aunque la orientación al cloroplasto parece ser una estrategia superior para incrementar la expresión quimérica en plantas.

Aunque Ll de VPH-16 orientada al cloroplasto demostró mayores rendimientos promedio (1710 mg/kg, 4% de PST) , las diferencias entre las quimeras L1/L2 y Ll no fueron estadísticamente significativas, indicando que las sustituciones del epítopo L2 no parecen afectar la expresión y acumulación de proteina recombinante en cloroplastos . Sin embargo, la transferencia western (3a) y datos de expresión ELISA (Figura 3b) revelaron de modo consistente mayores niveles de L1/L2 ( 108-120 ) y L1/L2 ( 17-36) ubicadas en el citoplasma que L1/L2 ( 56-81 ) , sugiriendo que las quimeras L1/L2 (108-120) y L1/L2 ( 17-36) con sustituciones de secuencia L2 más cortas (de 13 y 20 aminoácidos, respectivamente) pueden expresarse mejor y tener una mayor estabilidad que L1/L2 (56-81) con un remplazo de secuencia de 26 aminoácidos.

Ensamble de las proteínas de VPH El ensamble de quimera en estructuras de orden superior tales como capsómeros o VLP se evaluaron utilizando ELISA de captura de H16.J4 (específico del epítopo lineal MAb) y H16.V5 (MAb específico del epítopo conformacional ) . La cantidad de la proteína de VPH conformacional detectada por V5 se expresó como un porcentaje de la proteína de VPH total detectada por J4 para cada uno de los constructos del vector ( Figura ) .

Un bajo porcentaje de las quimeras expresadas ensambladas en las estructuras de orden superior se detectaron por H16.V5. El extracto vegetal NSs, utilizado como un control negativo, no se unió al MAb H16.J4 o H16.V5 (datos no mostrados). Las quimeras pTRAc de baja expresión parecieron tener la mayor proporción de la proteína ensamblada (11-18%), seguidas por las quimeras pTRAkc-rbcsl-cTP de alta expresión (5-9%). Las quimeras pRIC3 no contienen un alto porcentaje de proteína ensamblada (< 2%). Aunque las quimeras pTRAkc-rbcsl-cTP no contienen el mayor porcentaje de proteína ensamblada, los mayores rendimientos de expresión resultan en hasta 40x y 4x más proteína ensamblada que en pTRAc y pRIC3 respectivamente. Esto además proporciona evidencia de que pTRAkc-rbcsl-cTP es el mejor vector para utilizarlo para producción de las quimeras L1/L2 inmunogénicas .

DISCUSION Optimización de la expresión transitoria de la quimera Ll en plantas Todas las quimeras Ll se expresaron exitosamente en plantas utilizando un sistema transitorio mediado por Agrobacteriu (Figura 2). Diversos métodos se utilizaron para optimizar la expresión quimérica en plantas; incluyendo el uso de un Supresor de silenciamiento NSs, el uso de un vector viral de auto-replicación suministrado por agroinfiltración y orientación de la proteina expresada al cloroplasto.

Co-expresión con el supresor de silenciamiento NSs La expresión transitoria mediada por Agrobacterium alcanzan sus picos a las 60-72 horas (~3 días) postinfiltración y entonces declina rápidamente como resultado de desencadenar el silenciamiento del gen de post-transcripción (PTGS) en la planta huésped (Voinnet, 2001) . El PTGS es un mecanismo de defensa de la planta anti-viral adaptativo, donde las moléculas de ARN extraño se reconocen y se degradan de una manera especifica de la secuencia ( eins, 2000; Sijen y Kooter, 2000) . Como una estrategia de contra-defensa, muchos virus de plantas han evolucionado proteínas que suprimen diversas etapas del mecanismo (Voinnet, 2001) . Aunque las respuestas del PTGS reduzcan la acumulación del ARNm transgénico en el citoplasma de la planta y limiten la eficiencia de expresión transitoria (de Carvalho et al., 1992; Van Blokland et al., 1994), se ha mostrado que la coexpresión de proteínas con supresores de silenciamiento viral reprime las respuestas del PTGS y permite un alto nivel de expresión transitoria, resultando en altos rendimientos (50 veces en los mismos casos) y en la expresión prolongada del transgen (Voinnet et al., 2003).

La co-infiltración con el supresor de silenciamiento NSs en el virus del bronceado del tomate (TSVW) suprime el PTGS e incrementa la expresión transitoria (Takeda et al., 2002) . Este efecto se observó de modo similar en la expresión transitoria de las quimeras L1/L2 (Figura 2). Las quimeras típicamente desplegaron niveles de expresión máximos a los 3-5 dpi sin la presencia de supresores de silenciamiento viral. Sin embargo, la co-expresión con NSs desplegó un incremento prolongado en la expresión de las quimeras, mientras que los niveles de expresión se incrementaron hasta 16 veces y alcanzaron picos a los 5-7 dpi .

El uso de un vector BeYDV de auto-replicación Los rendimientos de la Ll de VPH-16 citoplásmica se mejoraron al 50% utilizando a un vector pRIC de auto-replicación (Regnard et al., 2010). Como resultado, un vector pRIC3 de tercera generación se examinó como una estrategia potencial para mejorar los rendimientos quiméricos. Se examinaron tres quimeras L1/L2: L1/L2 ( 108-120) , L1/L2 (56-81) y L1/L2 (17-36) . Todas las quimeras demostraron niveles superiores de expresión utilizando pRIC3 (vector de auto-replicación) , en comparación con pTRAc (vector sin replicación) , sugiriendo que la amplificación del transgen mejora los rendimientos L1/L2 en el citoplasma de la planta (Figuras 3a y b) . Sin embargo, la orientación al cloroplasto fue más efectiva en la acumulación de alto nivel de las quimeras L1/L2 (Figura 3b) y se observó necrosis visible del tejido foliar en hojas infiltradas con pRIC3, sugiriendo que la auto-replicación del vector afecta negativamente la salud de la planta.

Orientación al cloroplasto de las quimeras Ll Las quimeras Ll se orientaron al cloroplasto utilizando el vector pTRAkc-rbcsl-cTP . El péptido de tránsito al cloroplasto (cTP) se fusiona a la quimera expresada y se escinde por la peptidasa de procesamiento estromal (SPP) del cloroplasto después de ingresar en el organelo (Robinson y Ellis, 1984). Existen diversos factores responsables para la acumulación de alto nivel de proteina en cloroplastos : (a) protección de las proteasas celulares, (b) maquinaria para hidrolización de proteínas diferentes en los plastidios y (c) chaperonas especificas del plásmido de protección que ayudan en el doblez correcto de Ll y de este modo mejoran la estabilidad de la proteina (Fernández-San Millán et al., 2008). En este estudio, la orientación al cloroplasto fue altamente efectiva e incremento los rendimientos quiméricos L1/L2 de 40 a 80 veces en comparación con las quimeras orientadas al citoplasma (Figura 3a) .

Las quimeras orientadas al cloroplasto detectadas en las bandas producidas por transferencias Western anti-Ll de ~56 kDa (Figura 2), sugieren que el péptido de señal se eliminó efectivamente de la proteina acumulada. Aunque L1/L2 ( 108-120 ) opera por arriba de las otras quimeras en la transferencia western (Figura 2), este fenómeno no es provocado por la escisión insuficiente del péptido de señal, como la L1/L2 (108-120) ubicada en el citoplasma y expresada con pTRAc, y la L1/L2 (108-120) expresada en células de insecto analizada en paralelo (datos no mostrados), mostraron un patrón de bandas similar.

Las bandas de alto peso molecular de ~65 kDa se detectaron para las quimeras L1/L2 (17-36) (Figura 2), posiblemente como resultado de la glicosilación o desnaturalización insuficiente de las quimeras. Una forma glicosilada de Ll de VPH-16 producida en células renales de hámster bebé (BHK) como se describe por McLean et al. (1990), mientras que CamVirl detectó 2 bandas para Ll: La banda mayor de Ll de 56 kDa y una banda menor de ~64 kDa . La banda adicional se eliminó posteriormente a partir de Usados celulares cuando se infectaron en presencia de tunicamicina inhibidora de la N-glicosilación . Aunque las plantas contienen rutas de glicosilación (Rybicki, 2009) , las transferencias western posteriores desplegaron una sola banda de ~56 kDa, sugiriendo que las quimeras L1/L2 (17-36) se desnaturalizaron parcialmente en los experimentos iniciales en lugar de las glicosiladas (Figura 3a) .

Comparación directa de vectores de expresión vegetal Dos estrategias tuvieron rendimientos de Ll incrementados expresados en plantas a un máximo de 530 - 550 mg/kg (i) orientar la proteina al cloroplasto (Maclean et al., 2007) o (ii) el uso de un vector de expresión derivado de BeYDV de auto-replicación suministrado por agroinfiltración (Regnard et al., 2010). Este fue el primer estudio en el cual se compararon directamente estas estrategias utilizando las quimeras a base de Ll. Los niveles de expresión quimérica utilizando el vector pRIC3 de expresión vegetal (auto-replicación, vector orientado al citoplasma) se compararon directamente con pTRAkc-rbcsl-cTP . La expresión utilizando el pTRAc (vector orientado al citoplasma, sin replicación) se incluyó para propósitos comparativos y se utilizó Ll de VPH-16 como un control positivo (Figuras 3a y b) .

La orientación al cloroplasto produjo los mayores rendimiento para la mayoría de las quimeras (Figuras 3a y b) y mejoró la expresión de la quimera L1/L2 hasta por 7 veces en relación con pRIC3, y 28 veces en relación con pTRAc, ambas de las cuales orientaron la proteína expresada al citoplasma (Figura 3b) . El análisis estadístico reveló que los rendimientos de L1/L2 orientados al cloroplasto fueron significativamente mayores que los rendimientos de L1/L2 orientados al citoplasma (p < 0.01). Sin embargo, las diferencias de rendimiento entre las quimeras orientadas al cloroplasto y las quimeras expresadas utilizando el vector pRIC3 de auto-replicación sólo fueron significativas para L1/L2 ( 56-81 ) . Estos resultados proporcionan evidencia de que pTRAkc-rbcsl-cTP es el mejor vector para utilizarse para la producción de alto nivel de las quimeras de VPH.

Expresión de las quimeras L1/L2 Quimeras L1/L2 altamente expresadas que contienen los epítopos L2 de VPH-16 Las quimeras L1/L2 (108-120) , L1/L2 (56-81) y L1/L2 (17-36) se expresaron altamente, con rendimientos hasta 20 veces mayores que las otras quimeras (Tabla 4). Como resultado, estas tres quimeras L1/L2 se seleccionaron como antigenos de vacunas para los estudios de inmunogenicidad en ratones .

Las quimeras L1/L2 orientadas al cloroplasto demostraron de modo consistente los mayores rendimientos quiméricos de ~ 1200 mg/kg de tejido vegetal (2-3% de PST) . Aunque Ll de VPH-16 demostró mayores rendimientos que las quimeras L1/L2, las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Figura 3b) . Esto indica que los epítopos L2 no afectaron significativamente la expresión y acumulación de proteína de VPH en los cloroplastos. Además, los rendimientos quiméricos fueron ~2 veces mayores que los rendimientos de Ll de VPH-16 publicados, producidos utilizando un sistema de expresión en el tabaco mediado por Agrobacterium (Maclean et al., 2007; Regnard et al., 2010) y la producción de estas quimeras es comercialmente viable (>1% de PST; Fischer et al., 2004) .

El ensamble en las estructuras de orden superior se asocia con una baja susceptibilidad a la proteólisis (Chen et al., 2000) y se ha hecho la hipótesis de que la alta acumulación de L1/L2 puede ser como resultado del ensamble. El MAb H16.V5 específico de la conformación se une a la proteína ensamblada (Christensen et al., 1996) y puede utilizarse para detectar el ensamble en estructuras de orden superior (Cárter et al., 2003; Wang et al., 2003; Ryding et al., 2007). Todas las quimeras L1/L2 expresadas en plantas y el control Ll de VPH-16 parecen contener una baja proporción de la proteína ensamblada (<20% de PST), sugiriendo que la mayoría de la proteína existe como monómeros de Ll sin ensamblar. Sin embargo, tanto las quimeras L1/L2 (56-81) como las L1/L2 (17-36) contienen secuencias de L2 que solapan los aminoácidos 428-483 de la región C-terminal de Ll mostrados por ser críticos para la unión de H16.V5 (Varsani et al., 2006b) , sugiriendo que este MAb no puede ser adecuado para la detección del ensamble quimérico y no puede utilizarse para una cuantificación comparable.

Inestabilidad de la quimera L1/L2 con el epítopo de aminoácidos 1-88 L2 de VPB La quimera L1/L2 de VPB (1-88) tuvo bajos niveles de expresión en comparación con las quimeras que contienen los epítopos L2 de VPH-16 (Figura 2) . Los niveles de expresión estimados por cuantificación ELISA fueron similares al control negativo NSs, aunque L1/L2 de VPB(l-88) se detectó en las transferencias western probadas con el MAb de H16.J4 y mostraron bajos rendimientos de 40 mg/kg de tejido vegetal ( Figura 2, datos ELISA no mostrados). Además, el L1/L2 de VPB(l-88) orientado al cloroplasto se degradó parcialmente (Figura 2D) , que ha sido descrito previamente en diversos estudios de expresión de Ll de VPH (Hagensee et al., 1993; Sasagawa et al., 1995; Li et al., 1997; Kohl et al., 2007).

Estos resultados proporcionan evidencia de que L1/L2 de VPB(l-88) no es bien expresado, ni es estable en el presente sistema de expresión vegetal. La quimera L1/L2 de VPB(l-88) contiene el remplazo de secuencia L2 más largo y el epitopo del residuo 88 remplaza toda la región C-terminal de Ll (Tabla 1). La región C-terminal de Ll de VPH juega un papel en el ensamble de las VLP (Zhou et al., 1991b; Varsani et al., 2006b; Bishop et al., 2007), y supresión de la región C-terminal que evita el ensamble a estructuras de orden superior que son menos susceptibles a la degradación (Chen et al., 2000). El remplazo de secuencias de la región C-terminal de la Ll con secuencias de epitopo extraño no es una estrategia efectiva para la expresión quimérica de VPH y las plantas no son un sistema viable para la expresión de L1/L2 de VPB (1-88) .

EJEMPLO 2: PURIFICACIÓN Y ENSAMBLE DE ANTÍGENOS DE VPH MÉTODOS Y MATERIALES Expresión transitoria a gran escala y extracción de antigenos Se infiltraron al vacio plantas de N. benthamiana (2-4 semanas de edad) con LBA4404 (pBIN-NSs) de A. tumefaciens que codifica la proteina supresora de silenciamiento NSs y la cepa GV3101 de Agrobacterium que codifica Ll de VPH-16 o las quimeras L1/L2, como se describe por Maclean et al. (2007). Las plantas se cultivaron durante 5 días en 16 hr de luz, 8 hr de oscuridad, a 22°C.

Las hojas infiltradas se cosecharon, se pesaron y se molieron en nitrógeno liquido utilizando un mortero y pistilo. El amortiguador de extracción PBS, que contiene NaCl al 0.5M e inhibidor de proteasa (EDTA libre Completo de Roche), se agregó en una relación de 1:4 (p/v) y las muestras se homogenizaron en una mezcladora Waring durante 10 min en hielo. El homogenado se sometió a tratamiento con ultrasonido en hielo durante intervalos de 6x 20 s de tratamiento con ultrasonido y reposo (tratamiento con ultrasonido Macrotip; Nivel 8; Heat Systems - Ultrasonics, Inc. Modelo W-225 R de Sonicador Disruptor Celular) , y el lisado se filtró a través de una doble capa de Miracloth (CALBIOCHEM) . El extracto sin purificar se aclaró dos veces por centrifugación a 13,000 rpm durante 10 min. Los gránulos se resuspendieron en 1 mi de PBS y se almacenaron a -70°C. El sobrenadante y los gránulos se examinaron por transferencia western para comprobar la ubicación del antigeno de VPH en el sobrenadante.

Purificación piloto de antígenos de VPH Diversos métodos se examinaron para la purificación de antigenos de vacuna Ll expresados en plantas. Se probaron los métodos basados en tamaño tales como microfiltración y ultracentrifugación de flujo cruzado utilizando gradientes de densidad de sacarosa cloruro de cesio, asi como la cromatografía de intercambio catiónico y heparina de una sola etapa para la purificación rápida de las quimeras Ll y a base de Ll. La proteína Ll extraída en PBS que contuvo NaCl 0.5 M se diluyó lOx en PBS de baja salinidad (PBS LS: PBS con NaCl 10 p??, pH 7.4) antes de la cromatografía, para permitir la unión de Ll a las columnas. La ultrafiltración se utilizó para concentrar antígenos y las fracciones cromatográficas desalinizadas para su aplicación corriente abajo en estudios de inmunogenicidad en ratones.

En general, la purificación utilizando cromatrografía con heparina y la diafiltración utilizando tubos de centrifugación para ultrafiltración Macrosep® fueron las mejores estrategias para obtener quimeras Ll parcialmente purificadas y a base de Ll, y estos métodos se utilizaron para preparar los antígenos de vacuna para experimentos inmunológicos posteriores en ratones.

Purificación de antígenos de vacuna Preparación de Muestras Las quimeras Ll de VPH-16 y a base de Ll se expresaron en N. benthamiana y se extrajeron como se describe en lo anterior en el Ejemplo 1 utilizando PBS LS como el regulador de extracción. El sobrenadante sin purificar doblemente aclarado para L1/L2 ( 108-120) , L1/L2 (56-81) , L1/L2 (17-35) , Ll de VPH-16 y el extracto vegetal infiltrado con NSs (Vacunas 1-5 respectivamente) se filtraron a través de un filtro Millipore de 0.22 µ? antes de la cromatografía para eliminar cualquier residuo.

Cromatrografía con heparina La cromatrografía se realizó utilizando un ÁKTA Explorer System 10. El procedimiento se siguió como se recomendó en el manual de instrucciones de la columna GE Healthcare y se mantuvo una tasa de flujo de 0.5 ml/min. La columna se equilibró con 10 volúmenes de columna (cv) del amortiguador de lavado de baja salinidad (PBS LS: PBS con NaCl 10 mM) antes de cargar la muestra. El extracto sin purificar (10-20 mi) se cargó en una columna de intercambio catiónico con 1 mi de Heparina HiTrap pre-empacada (GE Healthcare, Amersham Biosciences AB, Suecia) y la columna se lavó con 10 cv de amortiguador de lavado de PBS LS. El perfil de elución para cada antígeno de VPH se optimizó en un experimento piloto utilizando un gradiente de fuerza iónica lineal, en el cual 10 cv de 0-100% de un regulador de elución de PBS de alta salinidad (PBS HS) que contuvo NaCl 1.5 M se aplicó a la columna. Una vez que se estableció que todos los antigenos se eluyeron cuando se aplicó <50% de PBS HS a la columna, se aplicó una etapa al 50% de gradiente de elución (NaCl 0.75 M) para la purificación de los antigenos de vacuna. La etapa del gradiente de elución fue de 10 cv de PBS HS al 50%, seguido por 10 cv de PBS HS al 100%. La columna se lavó finamente con 5 cv de agua destilada y 5 cv de etanol al 20%. Las fracciones (1 mi) se recolectaron y se analizaron por transferencias de mancha western.

Detección de transferencias de mancha western de antígenos de VPH purificados Se realizaron transferencias en mancha como se describe en lo anterior en el Ejemplo 1. Se utilizó CamVirl (1:10000) para detectar Ll y se utilizó Cervarix como un control positivo. Las fracciones eluidas que contuvieron una alta concentración del antigeno purificado se agruparon y almacenaron a -70°C. Para el extracto vegetal infiltrado con NSs (V5: control negativo), las fracciones que correspondieron con el pico de proteina eluida se agruparon y probaron en la transferencia de mancha de vacuna (V4) del control positivo Ll, para confirmar si no contenia Ll.

Desalinízación de muestras del antígeno purificado por ultrafiltración Los antigenos purificados en el regulador de elución de PBS HS al 50% (NaCl 0.75 M) , se desalinizaron antes de las vacunaciones del ratón. Se utilizaron tubos de centrifugación para ultrafiltración con un filtro MWCO de 10 kDa (Dispositivos de Centrifugación Macrosep®, 10 K Omega, PALL Life Sciences) para concentrar y desalinizar las fracciones Ll purificadas rápidamente al centrifugar las muestras a 7000 g durante 15-30 min. El volumen retenido que contenía los antígenos Ll se diluyó en PBS LS y se reconcentró por ultrafiltración varias veces por instrucciones del fabricante hasta que las muestras contuvieron una concentración de NaCl similar a la encontrada en el PBS comercial (NaCl ~0.15M). Se examinaron tanto el volumen retenido como las fracciones filtradas.

Análisis de pureza del antígeno Tinción de Coomassie y detección por transferencia western de antígenos de VPH para evaluar la purificación El extracto sin purificar y la muestra purificada para cada uno de los antígenos de vacuna se comparó por tinción de Coomassie y análisis por transferencia western. Las muestras se prepararon como se describe en el Ejemplo 1 anterior y se cargaron volúmenes iguales en dos geles de proteína SDS-PAGE al 10%. Un gel se tiñó con una solución de Coomassie durante la noche a temperatura ambiente y se destiñó 2x 2 horas a 37°C. El otro gel se sometió a transferencia sobre una membrana de nitrocelulosa y se probó con CamVirl .

Cuantificación de la proteína soluble total La vacuna de control negativo (V5: Extracto vegetal infiltrado con NSs) no pudo cuantificarse por transferencia western anti-Ll. Como resultado, la cantidad de proteína soluble total (PST) se determinó para cada antígeno de vacuna utilizando el ensayo de proteína Lowry de Biorad (descrito en lo anterior en el Ejemplo 1) para confirmar que el PST fue similar para todas las vacunas.

Detección de Antlgenos de VPH por ELISA de captura para determinar el enriquecimiento del antígeno en relación con el PST Se realizó un ELISA de captura como se describió en el Ejemplo 1, utilizando el anticuerpo monoclonal (MAb) específico del epítopo lineal H16J4. Los rendimientos del antígeno de VPH determinados por ELISA se compararon con los rendimientos de PST correspondientes tanto en las muestras sin purificar como en las purificadas para determinar el enriquecimiento del antígeno.

Cuantificación por transferencia western de los antigenos de vacuna purificados Una serie de diluciones de la vacuna Cervarix (que contenia 40 ug/ml de Ll de VPH-16 producida con células de insecto) se utilizó para cuantificar los antigenos de VPH (Vl-4) producidos por plantas. Diversas diluciones del antigeno se analizaron para asegurar la cuantificación que ocurrió dentro del margen lineal de la curva estándar. Volúmenes iguales de antigenos purificados y diluciones de Cervarix se cargaron en geles SDS-PAGE al 10%, las proteínas se sometieron a transferencia sobre una membrana de nitrocelulosa y los antígenos de VPH se detectaron con CamVirl (1: 10000) .

Se utilizó densitometría (GeneTools, Syngene, Synoptics Ltd) para cuantificar los antígenos (como se hizo por Aires et al., 2006; Bazan et al., 2009) y la cantidad de proteína de VPH presente en las muestras se determinó utilizando la curva estándar generada por la serie de diluciones Cervarix. Los antígenos de VPH cuantificados se almacenaron a -70°C.

Expresión citoplásmica y extracción de antigenos Para establecer si pequeños virus similares a partículas también se forman cuando las proteínas L1/L2 de VPH quimérico se orientan al citoplasma, cuando son opuestas a los cloroplastos, se infiltraron plantas de N. benthamiana con cosechas pRIC de L1/L2 (108-120); L1/L2 (56-81) y L1/L2 (17-36) de Agrobacterium recombinante junto con el supresor de silenciamiento NSs utilizando los métodos descritos en lo anterior. Después de 3 a 5 días, las hojas infiltradas se cosecharon, se trituraron y el residuo celular se eliminó por centrifugación .

Análisis estructural por microscopía electrónica de transmisión Las alícuotas de los antígenos de vacuna purificados se pre-trataron como si se prepararan vacunaciones para ratón. Los antígenos se descongelaron durante la noche a 4°C, se resuspendieron en PBS a la concentración requerida y se incubaron a 37 °C durante 30 min.

Para determinar el efecto de purificación, los antígenos purificados pre-tratados y los extractos vegetales sin purificar para cada antígeno se diluyeron lOx en PBS, se inmunoatraparon utilizando CamVirl (1:1000), un anticuerpo Ll de VPH-16 específico del epítopo lineal que se une tanto a los monómeros Ll como se a la proteína Ll ensamblada (McLean et al., 1990), y se captura en rejillas de cobre recubiertas con carbono de descarga luminiscente. Las proteínas se tiñeron de modo negativo con acetato de uranilo al 2% y se observaron en un Zeiss 912 Omega Cryo EFTEM.

RESULTADOS Purificación de los antigenos de VPH expresados en plantas Detección de antígenos de VPH en el extracto aclarado La ubicación de Ll y las quimeras L1/L2 en el sobrenadante aclarado se confirmó por análisis de transferencia western. El gel de proteina teñido con Coomassie indicó la presencia abundante de Rubisco en el sobrenadante y la eliminación de diversas proteínas contaminantes presentes en el gránulo (datos no mostrados) .

Purificación piloto de antígenos de VPH La purificación utilizando técnicas a base de tamaño no fue exitosa en gran medida y no pudo reproducirse entre los antígenos de vacuna, cuando las quimeras L1/L2 aparecen para ensamblarse en una variedad de estructuras en contraste con Ll . Además, se detectó una degradación de proteínas y de este modo la purificación utilizando cromatografía que se examinó como un método alternativo.

Aunque la cromatrografia de intercambio catiónico utilizando la columna SPFF de HiTrap o POROS 50HS no fue exitosa en la purificación de las quimeras a base de Ll, una cromatografía de afinidad a heparina purificó todos los antígenos de vacuna. La concentración y eliminación de sal en las fracciones cromatográficas se examinaron utilizando dos métodos basados en ultrafiltración, ya sea por filtración de flujo cruzado o centrifugación por columnas de centrifugado. Aunque la ultrafiltración de flujo cruzado fue efectiva, el método fue costoso con respecto al tiempo y se detectó degradación significativa de la proteína, resultando en el uso preferente de las columnas de centrifugado. De este modo, la cromatografía con heparina y ultrafiltración por centrifugación se consideraron las mejores estrategias para purificar los antígenos de vacuna para experimentos inmunológicos posteriores en ratones.

Purificación utilizando cromatografía con heparina Los antígenos de vacuna se purificaron a partir del sobrenadante vegetal sin purificar aclarado por cromatografía con heparina utilizando un gradiente de NaCl alto para elución de los antígenos de VPH. La etapa del gradiente de elución se optimizó para cada antígeno de VPH utilizando un gradiente lineal de NaCl 1.5 M al 0-100%. Todos los antígenos de VPH se eluyeron entre NaCl 0.45 - 0.75 M (datos no mostrados) . Como resultado, se utilizó un gradiente en etapas al 50% (NaCl 0.75 M) para purificar los antígenos de vacuna para el estudio de inmunogenicidad en ratones. La detección de los antígenos de VPH purificados en las fracciones de eluato se determinaron utilizando transferencias de mancha CamVi 1.

Se detectó un pico de absorbancia cuando el regulador de elución de PBS HS se aplicó a la columna y estas fracciones contuvieron los antigenos de VPH purificados. Los cromatogramas para los otros antigenos de vacuna fueron similares, incluyendo la gráfica para el extracto vegetal infiltrado con NSs (control negativo) . Esto indica que los antigenos de VPH se co-purificaron con otras proteínas vegetales contaminantes.

Las fracciones que contuvieron los antígenos de VPH parcialmente purificados (o proteínas vegetales co-eluidas para el control negativo) se combinaron y entonces se desalinizaron utilizando una ultrafiltración de las columnas de centrifugado. Las transferencias de mancha western indicaron que los antígenos de VPH se retuvieron y concentraron exitosamente (datos no mostrados) .

Pureza de ios antigenos de vacuna La pureza de los antígenos de vacuna se examinó al comparar la muestra purificada para el extracto vegetal sin purificar. Esto se hizo utilizando la tinción de Coomassie, para indicar la proteína total presente en las muestras (Figura 5A) , un análisis de transferencia western, para detectar los antígenos de VPH e indicar la pérdida en rendimiento del antígeno (Figura 5B) . Observe que la quimera L1/L2 ( 108-120 ) (VI) opera por arriba de las otras quimeras L1/L2 (V2-3) y el control Ll (V4).

La Figura 5 muestra las muestras purificadas que se enriquecieron con Ll como resultado del procedimiento de purificación. El gel teñido con Coomassie mostró una gran reducción en la proteina total en las muestras purificadas, mientras que los resultados de transferencia western indicaron que existe sólo una pequeña reducción en el rendimiento del antigeno después de la purificación. El antigeno Ll no se detectó en el control negativo (V5: extracto vegetal infiltrado con NSs) .

Las muestras solo se purificaron parcialmente, cuando se detectaron bandas adicionales de proteina teñida con Coomassie en la Figura 5A para los antigenos purificados VI y V3 (más concentrados que V2 y V ) , demostrando de este modo que las muestras purificadas contienen diversas proteínas vegetales contaminantes. También, aunque el control negativo NSs (V5) no se detectó en la transferencia western, diversas bandas de Coomassie similares se observaron en la muestra NSs purificada.

Enriquecimiento de antígenos de VPH en muestras purificadas El PST de los antígenos purificados se determinó para: (a) asegurar que el PST fue similar para el control negativo NSs (que contiene proteínas vegetales que se co- purificaron con los antigenos de VPH) en comparación con otros antigenos de vacuna, y (b) para determinar el enriquecimiento del antigeno de VPH después de la purificación. La PST para los antigenos de vacuna (Vl-4) de VPH purificados fue similar, sin embargo, el PST para el control negativo (V5) del extracto vegetal NSs fue al menos 2 veces mayor, posiblemente como resultado de más fracciones de eluato que se combinaron o una concentración de ultrafiltración mayor (datos no mostrados). Como resultado, ésta se diluyó en consecuencia en lx de PBS.

El ELISA de captura, utilizando el MAb de H16.J4 especifico lineal se utilizó para estimar la cantidad de antigeno de VPH presente en las muestras sin purificar y purificadas. Para determinar el efecto de purificación en el PST y el enriquecimiento de antigenos de VPH, el rendimiento de VPH detectado por H16.J4 se comparó directamente con el rendimiento del PST tanto para muestras sin purificar como purificadas (Figura 6) .

La Figura 6 demuestra que la purificación de los extractos vegetales redujo tanto el PST como la proteina de VPH total, como se esperaba. Sin embargo, en relación con el PST, fue un enriquecimiento hasta de 5 veces de antigeno de VPH en muestras purificadas (Vl-4), sugiriendo que la cromatografía con heparina es efectiva en eliminar una gran proporción de proteina contaminante. El extracto vegetal (V5) infiltrado con NSs mostró una reducción similar en PST con purificación y la cantidad de PST en el control negativo "purificado" se encontró dentro de los niveles obtenidos para los antigenos de vacuna de VPH (Vl-4) .

Cuantificación de la transferencia western de los antigenos de VPH purificados Los antigenos de VPH se cuantificaron por transferencia western utilizando densitometria y la vacuna comercial Cervarix como el estándar (datos no mostrados). Parte degradación de la proteina Ll, visible como una banda de -45 kDa, se detectó en algunos lotes del antigeno purificado, en particular después de diversos ciclos de congelación-descongelación. Sin embargo, solo la banda de Ll de 56 kDa de longitud completa se cuantificó en las muestras preparadas para estudios de inmunogenicidad en ratones.

Análisis estructural de antigenos de vacuna purificados Se analizó el ensamble estructural de Ll y las quimeras L1/L2 producidas en los cloroplastos de plantas tanto en muestras sin purificar como purificadas por microscopía electrónica de transmisión de inmunocaptura (Figura 7). El ensamble estructural de las quimeras L1/L2 producidas en el citoplasma se analizó por microscopía electrónica de transmisión de inmunocaptura a partir de muestras sin purificar (Figura 8) . La purificación del antigeno resultó en la eliminación de la proteina de fondo contaminante, en particular para L1/L2 ( 108-120 ) y el control negativo (Figuras 7A y E respectivamente) . En comparación con el control negativo (extracto vegetal infiltrado con NSs) , todos los antigenos de VPH parecieron contener estructuras de VPH secundarias, ya sea capsómeros (~10 nm) , agregados de capsómero, VLP pequeñas (~30 nm) o las VLP de tamaño completo (55 nm) .

Las L1/L2 (108-120) purificadas ensambladas en pequeñas VLP quiméricas (cVLP) fueron regulares en forma pero variaron en tamaño (-30 nm) , mientras que L1/L2 (56-81) sólo pareció contener capsómeros y algunos agregados, aunque estructuras similares a VLP fueron visibles en el extracto sin purificar. La L1/L2 (17-36) purificada que contuvo una población mezclada de cVLP amorfas y una alta proporción de agregados de capsómero en contraste con el extracto sin purificar, sugirió que la purificación promueve la formación de estructuras de orden superior. El control positivo Ll de VPH, de la V4 purificada, se ensambla en distintas VLP (~50 nm) , como se describe en estudios previos (Biemelt et al., 2003; Maclean et al., 2007) .

DISCUSIÓN La purificación severa es necesaria para la producción comercial de vacunas, aunque la estabilidad de Ll se afecta de modo negativo por múltiples etapas de purificación. La cromatrografia de afinidad a heparina puede utilizarse para purificar selectivamente la Ll ensamblada, y una estrategia de purificación utilizando un método cromatográfico de una etapa podría ser ideal para la producción rápida y efectiva en costo de las vacunas para VPH. Este estudio informa la purificación de Ll de VPH-16 expresado en plantas y tres quimeras L1/L2 utilizando cromatografía con heparina para estudios de inmunogenicidad posteriores en ratones.

Optimización de la purificación de la quimera L1/L2 Las quimeras Ll de VPH-16 y a base de Ll se ubicaron en el sobrenadante del extracto sin purificar y se purificaron utilizando una variedad de métodos. Aunque los métodos de purificación dependientes del tamaño se han utilizado para purificar Ll de VPH expresada en plantas (Biemelt et al., 2003; Maclean et al., 2007; Fernández-San Millán et al., 2008), estos métodos fueron eficientes para la purificación de la quimera L1/L2 y no pudieron reproducirse entre los antígenos. Las quimeras a base de Ll se detectaron ampliamente en diversas fracciones utilizando la ultracentrifugación del gradiente de densidad tanto para sacarosa como para CsCl, indicando que las quimeras L1/L2 ensambladas en estructuras de orden superior heterólogas, tales como capsómeros, agregados y las VLP. Además, el grado de ensamble parece diferir entre quimeras y el control positivo Ll . Esto se confirmó por microscopía electrónica de transmisión (Figura 7), la cual mostró diferencias distintas entre las quimeras L1/L2 diferentes y el control Ll .

La cromatrografía fue la siguiente estrategia para purificar de modo selectivo Ll de VPH; ya sea en la base de la carga de superficie, o por afinidad para el proteoglicano con heparina. El uso de una cromatografía de intercambio catiónico para la purificación de Ll de VPH expresada por levaduras se ha demostrado utilizando fosfocelulosa P-ll (Kim et al., 2009, 2010) o una columna POROS 50HS (Cook et al., 1999) . En contraste, las quimeras L1/L2 expresadas en plantas no se purificaron de modo eficiente utilizando cualquiera de la columna SPFF de HiTrap de intercambio catiónico fuerte o la columna POROS 50HS. La mayoría de proteínas L1/L2 no se unió ya sea a la columna, aunque una pequeña proporción de la proteína se enlazó fuerte e irreversiblemente a la resina POROS 50HS. Este fenómeno ha sido descrito por Cook et al. (1999), mientras que 10% de la Ll de VPH-11 no se unió a la resina y 45-65% no pudo recuperarse sin separar la columna POROS 50HS utilizando NaOH 0.5 M.

Como resultado, no se buscó más la cromatografía de intercambio catiónico, aunque la razón de la deficiente purificación de las quimeras L1/L2 no es clara. Existen dos regiones C-terminales básicas de Ll de VPH-16 que contuvieron residuos cargados positivamente: aminoácidos 473-488 y 492-505 (Zhou et al., 1991b; Sun et al., 1995, 2010). Las inserciones de secuencia L2 no solaparon las regiones básicas mayores en el C-terminal de Ll y remplazaron un máximo de 26 residuos en los aminoácidos 414-439. Una posible explicación es que se afectó la carga de superficie general de Ll, ya sea por la composición de aminoácidos de los epitopos L2 insertados, o por diferencias en el ensamble de proteínas, además, el extracto vegetal sin purificar puede contener diversas proteínas contaminantes que se enlazan más fuertemente a las columnas y se unen a Ll de VPH de refuerzo.

Purificación de los antigenos de vacuna Los antígenos de vacuna se purificaron utilizando cromatografía con heparina (descrita por Joyce et al., 1999; Bazan et al., 2009; Johnson et al., 2009; Kim et al., 2009, 2010) para estudios de inmunogenicidad posteriores en ratones. El enlace de modo reversible a la heparina tanto para Ll como para las quimeras L1/L2 fue de manera similar (datos no mostrados) , y todos los antígenos se eluyeron con NaCl 0.75 M. esto puede compararse con otros estudios donde la Ll de VPH-16 enlazada a heparina se eluyó entre NaCl 0.5 -1.2 M (Bazan et al., 2009; Kim et al., 2010; Baek et al., 2011) .

La heparina purifica de modo selectivo la proteina Ll ensamblada al unirse a un motivo de conformación que no se encuentra presente en el C-terminal de Ll (Fleury et al., 2009) y no se afecta por los remplazos de secuencia L2. En particular, esto es benéfico para la producción de vacunas, cuando la Ll desnaturalizada no provoca la producción de anticuerpos neutralizantes (Kirnbauer et al., 1992; Suzich et al., 1995; Breitburd et al., 1995). Además, Kim et al. (2010) demostraron que la purificación de Ll de VPH-16 utilizando cromatografía con heparina dio altos rendimientos de recuperación (-60%) y produjeron las VLP inmunogénicas (25-65 nm de diámetro) .

La pureza de las muestras purificadas con heparina se examinó por tinción de Coomassie y detección por transferencia estern de Ll utilizando CamVirl (Figura 5) . Las muestras purificadas se enriquecieron con Ll o quimeras L1/L2, cuando tuvieron una reducción significativa en la proteína total con una reducción relativamente pequeña en el rendimiento del antígeno cuando se compararon con las muestras sin purificar. Esto se confirmó por los ensayos de ELISA de captura y PST para H16.J4 (Figura 6) .

Las muestras se purificaron parcialmente y contuvieron diversas proteínas vegetales contaminantes (VI y V2, Figura 5A) , también presentes en el control negativo purificado (V5, Figura 5A) . También se observaron contaminantes en la purificación de Ll DE VPH-16 expresado por levaduras utilizando cromatografía con heparina (Kim et al., 2010). Como resultado, un método de una etapa simple utilizando cromatografía con heparina no es suficiente para obtener Ll de VPH y quimeras L1/L2 altamente purificadas. Kim et al. (2010) demostraron que las proteínas contaminantes co-purificadas a partir de levaduras no se eliminaron completamente por las etapas de cromatrografía de interacción hidrofóbica y de intercambio catiónico adicional, sugiriendo que muchos de los contaminantes tuvieron puntos isoeléctricos similares y perfiles de hidrofobicidad para Ll. Además, las etapas cromatográficas adicionales redujeron la recuperación de Ll a ~10%. Sin embargo, se obtuvo Ll de VPH-16 pura por precipitación de sulfato de amonio de la Ll de VPH-16 expresada por levaduras antes de la cromatografía con heparina, un método que debe examinarse en estudios de purificación adicional utilizando proteínas a base de Ll de VPH expresadas en plantas.

Cuantificación de antigenos por transferencia western Los antígenos purificados se cuantificaron por análisis de transferencia western (discutido por Heidebrecht et al., 2009) utilizando densitometría para medir la intensidad de las bandas Ll detectadas por CamVirl y la vacuna comercial Cervarix como el estándar Ll de VPH-16 (datos no mostrados) .

Se detectó la degradación de Ll en algunos de los lotes del antigeno purificado, en particular después de diversos ciclos de congelación-descongelación. Esto se observó en altas concentraciones de VI, V2 y V4. Sin embargo, la mayoría de las proteínas de antígeno no se degradaron y sólo la banda Ll de 56 kDa de tamaño completo se cuantificó para asegurar que los ratones se inmunizaron con dosis similares del antígeno de longitud completa. Otros grupos han reportado patrones de degradación de Ll de VPH-16 similares cuando se expresan en células de insecto (Kirnbauer et al., 1992), levaduras (Cook et al., 1999) y bacterias (Zhang et al., 1998). Una consideración para estudios de purificación futuros es la concentración de sal de los reguladores de extracción y diafiltración, cuando ocurre el desensamble de VLP en condiciones de baja salinidad (Murata et al., 2009). Al incrementar la concentración de sal de NaCl a 0.5 o 1 M, pueden estabilizarse las VLP (Mach et al., 2006) y reducir la degradación observada en las muestras purificadas.

Ensamble de los antigenos de vacuna El ensamble de Ll de VPH-16 derivada de plantas y las quimeras L1/L2 producidas en los cloroplastos de las células de la planta se analizaron utilizando microscopía electrónica de inmunocaptura (Figura 7). La purificación pareció eliminar algunas proteínas antecesoras y todas las quimeras L1/L2 expresadas en plantas y el control positivo de Ll ensamblado en las estructuras de orden superior tales como agregados de capsómero y las VLP.

Las VLP de Ll de VPH-16 expresadas en plantas típicamente son de ~55 nm de diámetro cuando se ubican en los cloroplastos del tabaco (Maclean et al., 2007/ Fernández-San Millán et al., 2008; Lenzi et al., 2008). En este estudio, Ll de VPH-16 se ensambla en las VLP de tamaño completo (~50 nm, Figura 7 Dii) .

El ensamble de las quimeras en las VLP parece afectarse por la longitud del epítopo L2, con L1/L2 ( 108-120 ) , L1/L2 (17-36) y L1/L2 (56-81) que contienen 13, 20 y 26 remplazos en el residuo del epítopo, respectivamente. La Ll/L2(108- 120) expresada en plantas, con el epítopo L2 más corto, se ensambló exitosamente en distintas cVLP de alrededor de ~30 nm de diámetro, que son más pequeñas que las VLP de Ll ( (Chen et al., 2000) Figura 7A) . En contraste, L1/L2 (17-36) formó de modo predominante agregados de capsómero, aunque la presencia de estructuras similares a VLP amorfas más largas sugieren que puede ser un ensamble parcial de cVLP pequeñas (Figura 7C) . Finalmente, L1/L2 (56-81) con el epítopo L2 más largo se ensambla de modo predominante en capsómeros (Figura 7B) .

L1/L2 ( 108-120) también se ha expresado en células de insecto y la quimera purificada por CsCl mostró ensamblarse en las VLP amorfas y agregados de capsómero (Varsani et al., 2003a), en lugar de las cVLP discretas de ~30 nm de diámetro.

Las quimeras dirigidas al citoplasma como resultado de la infiltración de plantas utilizando el vector de expresión pRlC resultó en la formación de las VLP Ll/L2(56-81) detectables (Figura 8). Esto indica que las VLP quiméricas descritas en la presente también pueden formarse en el citoplasma de las plantas.

EJEMPLO 3: INMUNOGENICIDAD DE LAS QUIMERAS L1/L2 En este estudio, se inmunizaron ratones con Ll derivado de plantas y tres candidatos a vacunas quiméricas L1/L2 que contuvieron los aminoácidos 108-120, 56-81 y 17-36 de los epitopos L2 por neutralización cruzada. Se analizó la inmunogenicidad de las quimeras con respecto al ensamble de quimera y su capacidad para provocar un NAb de protección y anti-Ll, anti-L2 contra el VPH-16 homólogo y VPH-18 heterólogo, de los PsV 45 y 52.

MÉTODOS Y MATERIALES Inmunización de Ratones Ratones hembra C57/BL6 de la Unidad de Animales Productora de Vacunas de Sudáfrica ( Johannesburgo, Sudáfrica) se mantuvieron bajo condiciones de Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2) en la Unidad de Animales en la Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Cape Town. El permiso para este estudio se otorgó por el Comité de Ética e Investigación, Universidad de Cape Town (AEC 008/037) .

Los ratones (de 7-8 semanas de edad) se inmunizaron para las respuestas del anticuerpo humoral de prueba para los candidatos a vacuna L1/L2 de VPH-16 derivadas de plantas. Los controles incluyeron la Ll de VPH-16 expresada en plantas (control positivo) y el extracto vegetal infiltrado con NSs (control negativo) . La quimera L1/L2 ( 108-120 ) (publicada como SAF; Varsani et al., 2003a) se ha mostrado por el laboratorio para respuestas ilícitas anti-Ll y de este modo sirven como un control positivo adicional. Los detalles de la vacunación se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5: Antioenos de vacuna derivados de lantas utilizados en el estudio de inmuno enicidad * número de ratones t TSP = proteína soluble total Los antígenos de vacuna purificados se ajustaron para contener una dosis de 10 \iq en 100 µ? de PBS de Dulbecco (DPBS; Sigma) . La proteína soluble total (PST) en cada vacuna se evaluó utilizando un ensayo de proteina de Bradford como se discutió en el Ejemplo 1 anterior para asegurar el control de vacuna negativo que contiene una PST similar en comparación con las otras vacunas de VPH (Tabla 5) . La vacuna se preparó por homogenización del antigeno de vacuna en un Adyuvante Incompleto de Freund (FIA) en una relación de volumen 1:1 utilizando la técnica de extrusión de jeringa (Koh et al. , 2006) .

Los ratones se dividieron hasta en 2 grupos de 5 ratones por vacuna y se inyectaron subcutáneamente en el flanco derecho, flanco izquierdo o en el sitio inguinal. Las pre-purgas se tomaron 12 días antes de la vacunación (Día 0) y los ratones se reforzaron en el Día 13, 27, 41 y 48 (aproximadamente cada 2 semanas, excepto para el Día 48 cuando se decidió aumentar en lugar de obtener una purga de prueba) antes de obtener las purgas finales en el Día 62 ( ~9 semanas post-vacunación) . El suero se aisló y almacenó a -70°C.

Detección ELISA de anticuerpos anti-Ll en sueros de ratón Preparación de la Ll de VPH-16 producida con célula de insecto La Ll de VPH-16 producida con células de insecto se utilizó como un antígeno ELISA para detectar anticuerpos anti-Ll en los sueros de ratón. La Ll expresada en células de insecto se utilizó en vez de la Ll expresada en plantas para evitar la detección de fondo de anticuerpos contra las proteínas vegetales contaminantes. Se cultivaron células de Spodoptera frugiperda (Sf-9) agitándose en un medio libre de suero SF90011 (Gibco) a 27°C y se infectaron en una multiplicidad de infecciones (MOI) de 1.0 y una densidad celular de lxlO6 células/ml. Las células se cosecharon después de 96 horas por centrifugación (1000 x g durante 5 minutos) y los gránulos se lavaron con DPBS y se almacenaron a -70°C.

Se extrajo la Ll de VPH-16 al resuspender las células a 4 x 106 células/ml en PBS de alta salinidad (NaCl 0.8 lx de PBS) gue contiene un inhibidor de proteasa (EDTA libre Completo de Roche) y se sometieron a un tratamiento por ultrasonido en hielo por intervalos de 5x 20 s de un tratamiento por ultrasonido y reposo (tratamiento por ultrasonido Microtip; Nivel 5; Heat Systems - Ultrasonics, Inc. Modelo W-225 R de Sonicador Disruptor Celular) . El lisado celular se aclaró por centrifugación (5000 g durante 5 min) para eliminar residuos celulares y la etapa de centrifugación se repitió utilizando el sobrenadante. La vacuna comercial Cervarix (20 ug de Ll de VPH-16) se utilizó como un estándar Ll de VPH-16 para la cuantificación de la transferencia western de Ll de VPH-16 (como se describe en lo anterior) y la Ll se detectó con CamVirl (1:10000; Abcam®) .

Detección ELISA de anticuerpos anti-Ll El título del anticuerpo anti-Ll se determinó por ELISA directo. Se recubrió una placa de microtitulación de pozos axisorp de 96 pozos (Nunc) con 100µ1/???? (30 ng) del antígeno Ll de VPH-16 producido con células de insecto diluido en 1 x PBS e incubado durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon con amortiguador de bloqueo (leche descremada al 1% en lx PBS; 200 ul / pozo) durante 2 horas a temperatura ambiente y después se lavaron 4x con PBS.

Los sueros de ratón se combinaron en las vacunas (10 ratones / vacuna) para su análisis. Los sueros de ratón de purga final se diluyeron en un amortiguador de bloqueo en series de 4 veces por triplicado, que oscilan de una dilución de 1:50 a 1:51200, Los sueros pre-purgados combinados se probaron a una dilución 1:50 y sirvieron como un control negativo. Los sueros diluidos se agregaron a los pozos (100 µ? / pozo) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pozos de controles positivos contuvieron la dilución 1:50 de los anticuerpos anti-Ll; ambos CamVirl (Abcam®) , que se unen tanto a los epítopos lineales como a los de conformación (McLean et al., 1990), y MAb de H16.V5, que se une específicamente a los epítopos de conformación (Christensen et al., 1996). Los pozos en blanco sin anticuerpo se incluyeron como un control de fondo.

Después de una etapa de lavado de 4x PBS, el conjugado de peroxidasa de rábano picante anti-ratón de cabra (1:2000; Sigma) se diluyó en un amortiguador de bloqueo que se agregó a los pozos (100 ul / pozo) y se incubó durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavaron 4x con PBS (200 µ? / pozo) y se agregaron 100 ul de diclorhidrato de O-fenilendiamina (OPD) (DAKO; Dinamarca) por pozo. Las places se desarrollaron en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente, la reacción se detuvo con H2SO4 0.5 M y se detectó la absorbancia a 490 nm. Los títulos de unión anti-Ll se expresaron como un recíproco de la dilución de suero máxima que produce altas lecturas de absorbancia que aquellas del suero pre-purgado correspondiente diluido a 1:50.

Análisis Estadístico Se utilizó una prueba t no pareada de dos colas para calcular la significancia estadística de la purga final de la respuesta anti-Ll, como se compara con la vacuna de control negativo (p = 0.01). El Análisis de Varianza de una vía (ANOVA) se utilizó para comparar las vacunas y las pruebas de Fisher LSD, Turkey HSD y Bonferroni se utilizaron para determinar la significancia (p = 0.01).

Detección de transferencia Western de los anticuerpos anti-L2 Preparación de L2 de VPH-16 producida por E. coli La proteina L2 DE VPH-16 etiquetada con His utilizando el vector htb del pProEX en E. coli (proporcionado por David Mutepfa) se utilizó para la detección por transferencia western de anticuerpos anti-L2 en sueros de ratón. Los cultivos de E. coli se cultivaron agitando a 37°C para una ??ß?? de 0.6 y entonces se indujeron por la adición de 0.6 mM iso-propil-p-tiogalactósido (IPTG). Después de 3 horas, las células se cosecharon por centrifugación (3800 g durante 15 min a 4°C) y el gránulo se retuvo y se pesó.

Los cuerpos de inclusión se extrajeron por resuspensión de las células en 4 volúmenes de regulador de lisis (Tris 50 mM, pH 8.5, ß-mercaptoetanol 5 mM) y fluoruro de fenilmetansulfonilo (PMSF) y se agregó lisozima (Roche) a una concentración final de 0.4 mM y 0.08 g/µ? respectivamente. Las células se incubaron en hielo durante 20 min, se agregó Triton-X al 1% y las células además se incubaron durante 20 min a 37 °C hasta que la solución se hizo viscosa, se agregaron DNasa y RNasa a 4 µ?/p?? y 40 µg/ml respectivamente y las células se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente hasta que se aclaró la viscosidad.

Los cuerpos de inclusión se recolectaron por centrifugación a 13,000 rpm en una microcentrifuga durante 15 min a 4°C y el gránulo se resuspendió en 1 mi de regulador de lisis (Tris 2.5 mM, pH 8.0, ß-mercaptoetanol 3.125 mM, EDTA 0.2 mM, Triton-X al 0.0025%) y se dejó lisar durante 10 min a temperatura ambiente. La muestra se centrifugó a 13,000 rpm durante 15 min a 4°C y los gránulos se lavaron 4x con PBS . El gránulo se resuspendió en 1 volumen de PBS del peso del gránulo, se cuantificó por tinción de Coomassie utilizando una albúmina de suero bovino (BSA) estándar y se almacenó a -20°C.

Detección de anticuerpos anti-L2 por transferencia western El antigeno L2 de VPH-16 producido por E. coli se incubó a 95 °C durante 5 min en un regulador de carga 5x y se cargó en un gel SDS-PAGE al 10%. En vez de utilizar un peine de 10 pozos, se utilizó un peine de 2 pozos: un pozo pequeño para el marcador de proteina y un pozo grande que consiste de los 9 pozos fusionados juntos, produciendo de este modo un solo pozo ancho que permite a la proteina para propagarse de igual modo a través del ancho.

El antigeno L2 de VPH-16 etiquetado con His expresado en E. coli (2.5 mg) se separó en un gel SDS-PAGE al 10% (Sambrook et al., 1989) y se transfirió sobre una membrana de nitrocelulosa por electrotransferencia semi-seca como se describe en el Ejemplo 1 anterior. El protocolo de transferencia western entonces se modificó, por lo que la proporción de la membrana entre 55-130 kDa que contiene la proteina L2 (~80 kDa) se dividió en 12 tiras de tamaño similar para probar con diferentes sueros. Las tiras de membrana se transfirieron en pozos individuales en una placa para cultivo de tejidos de 25 pozos y se incubaron en un amortiguador de bloqueo durante 4 horas a temperatura ambiente .

Los sueros de ratón de pre-purga individuales y de purga final se agruparon en vacunas (10 ratones por vacuna) y las tiras de membrana se probaron con el anticuerpo de ratón anti-His de control positivo (1:2000, Serotech) o los sueros de ratón se agruparon diluidos 1:100 en un amortiguador de bloqueo. Los sueros se agregaron a diferentes pozos y se incubaron con agitación durante la noche a temperatura ambiente. Las tiras entonces se lavaron 4x 10 min con amortiguador de bloqueo y se probaron con un anticuerpo de IgG anti-ratón de cabra secundario conjugado para fosfatasa alcalina (1:5000; Sigma) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las tiras individuales se lavaron otra vez durante 4x 10 min con un amortiguador de lavado y entonces se desarrollaron con NBT/BCIP (Roche) .

Se utilizó densitometria (GeneTools, Syngene, Synoptics, Ltd) para medir la intensidad de absorbancia para cada banda L2. Los valores se normalizaron para una absorbancia de fondo no especifica utilizando el valor asociado con la vacuna de control negativo. Los sueros con bandas L2 que tuvieron valores de absorbancia >2x el valor observado en las purgas finales de Ll de VPH-16 provocaron una respuesta anti-L2.

Ensayos de neutralización del pseudovirión de VPH Preparación para los ensayos de neutralización Los protocolos utilizados para los ensayos de neutralización del pseudovirión (PsV) de VPH se tomaron de los archivos técnicos del Laboratorio de Oncología Celular del Dr. John Schiller y los plásmidos pSheLL de L1/L2 de VPH y el plásmido reportero pYSEAP se proporcionaron amablemente por el Dr. John Schiller.

El plásmido pYSEAP se comprobó utilizando una digestión de la enzima de restricción de Salí y Bamtil (como se describe en el Ejemplo 1 anterior) . Los plásmidos pSheLL de L1/L2 de VPH fueron similares en tamaño y tuvieron sitios de enzima de restricción similares, de este modo los plásmidos se secuenciaron para confirmar su identidad utilizando dos conjuntos de cebadores específicos al vector pSheLL que se une corriente arriba y corriente debajo de los genes Ll y L2 de VPH (Tabla 6) . Las secuencias se alinearon con la secuencia del plásmido pSheLL de L1/L2 de VPH y las secuencias del gen Ll o L2 de VPH utilizando el software de análisis de secuencias DNAMAN.

Tabla 6: cebadores de secuenciación específicos al vector pSheLL El plásmido de ADN libre de endotoxina (NucleoBond® Xtra Midi EF, Macherey-Nagel ) se preparó a partir de cultivos de E. coli cultivados bajo la selección de antibióticos apropiada tanto para el plásmido pYSEAP como los plásmidos pSheLL de VPH-16, 18, 45 y 52 (Tabla 7) y el ADN se almacenó a -70°C.

Transfección de Células HEK293TT La linea celular HEK293TT se proporcionó amablemente por el Dr. John Schiller. Los PsV para VPH se produjeron como se describe en el protocolo "Producción de Vectores Papilomavirales ( Pseudovirus ) " revisado en junio de 2010.

Las células HEK293TT se cultivaron en un medio Eagle Modificado de Dulbecco (cDMEM) de alta glucosa que contuvo GlutaMAX™ (Gibco) al 1% y suero de ternera fetal (Gibco) al 10%. El medio cDMEM se suplemento con aminoácidos no esenciales (Gibco) al 1%, 100 unidades/ml de penicilina (Gibco) , 100 ig/ l de estreptomicina (Gibco) , 10 ]ig/ml de Fungin™ (InvivoGen) y 250 ug/ml de Higromicina B (Roche) para seleccionar el antigeno TT (cDME -Ab) . La descongelación y pasaje de las células se hizo como se describe en el protocolo .

Las células se sembraron previamente en placas en cDMEM (sin antibióticos o Higromicina B) en un matraz de 175 cm2 para alcanzar 50-70% de confluencia al día siguiente. En el día de la transíección, se agregó cDMEM fresco a las células y las alícuotas del plásmido de ADN libre de endotoxina se congelaron en hielo. La mezcla de la transfección se preparó como sigue: se agregaron 175 ul de FuGene6 (Roche) a 5.7 mi de DMEM con GlutaMAX (medio libre de suero) en tubos cónicos con tapón blanco (Sterilin) y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente. Se agregó un total de 40 ug de ADN (20 ug de cada plásmido) , La mezcla se incubó además durante 30 min a temperatura ambiente y luego se agregó por goteo a las células. Los matraces se incubaron durante 40-48 horas a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5% y el medio se cambió 6 horas post-transfección (cDMEM) .

Extracción de pseudoviriones Los pseudoviriones se cosecharon 40-48 horas post-transfección . Las células se recolectaron por tripsinización con Tripsina-EDTA (Gibco) al 0.05% y se inactivaron por la adición de cDMEM. Las células se transfirieron a un tubo Sterilin de poliestireno de fondo cónico (cuando los pseudoviriones se adsorben no específicamente a los tubos de polipropileno) , se contaron y se centrifugaron a 1200 rpm x 8 min. El gránulo se lavó con 0.5 mi de DPBS (Invitrogen) y se resuspendió en 1.5 volúmenes de gránulos en DPBS-Mg (DPBS con un gCl2 9.5 mM adicional) para lograr una alta densidad celular de >100 x 106 células/ml.

Se agregó Brij-58 (Sigma) al 10% al gránulo resuspendido para una concentración final de 0.5% (p/v) y se agregaron tanto Benzonasa (Sigma) como DNasa (Epicentre) dependiente de ATP Plasmid-Safe™ a 0.5% (v/v) y 0.2% (v/v) , respectivamente. Utilizando el protocolo de Chris Buck "Maduración Mejorada de VPH y Poliomavirus", se agregó sulfato de amonio estéril (1 M, pH 9.0) a una concentración final de 25 mM para promover la formación de enlaces disulfuro Ll intermolecular. La mezcla se incubó a 37°C durante 15 min para permitir la lisis y luego se transfirió a la temperatura preferida para la maduración de pseudoviriones durante la noche (25°C para VPH-16 y 18, 37°C para VPH-45 y 52) .

El lisado madurado se enfrió en hielo durante 5 min y la concentración de NaCl final del lisado se ajustó a 850 mM y se incubó en hielo por otros 10 min. El lisado se aclaró por centrifugación 3000 x g durante 10 min a 4°C. El sobrenadante se recolectó y el gránulo se re-extrajo al resuspenderlo en un volumen de gránulo igual de DPBS de alta salinidad (NaCl 0.8 M) y se re-centrifugó. Los sobrenadantes se agruparon, re-centrifugaron y transfirieron en tubos de poliestireno con tapón blanco y se mantuvieron en hielo.

Purificación de pseudoviriones Los PsV se purificaron por centrifugación del gradiente de densidad Optiprep. Se diluyó Optiprep (solución de iodixanol al 60% p/v; Sigma) en DPBS en una solución madre Optiprep al 46% (p/v), y se suplemento con NaCl 0.625 M a una concentración final de NaCl 0.8 M, CaCl2 a 0.9 mM, MgCl2 a 0.5 mM y KC1 a 2.1 mM. Se utilizó DPBS de alta salinidad (NaCl 0.8 M) para diluir la solución madre Optiprep a 27%, 33% y 39%, y se preparó el gradiente en 3 etapas al poner una subcapa de las diluciones Optiprep (27 -39%) en etapas de 1.5 mi en tubos de ultracentrifuga de polialómero de pared delgada de 5ml (Beckman) . Al gradiente se le dejó difundirse a temperatura ambiente durante 4 horas . El sobrenadante celular doble clarificado se depositó sobre el gradiente Optiprep linealizado y se centrifugó en un rotor Beckman SW55ti a 50, 000 rpm (234,000 x g) durante 3.5 horas a 16°C. El fondo del tubo se puncionó con una aguja de jeringa y se recolectaron las fracciones en tubos de poliestireno con tapón blanco: la primera fracción fue de ~0.75 mi, las fracciones 2-11 fueron de ~0.25 mi cada una y la fracción 12 contuvo el resto del gradiente.

El protocolo para seleccionar las fracciones se modificó para detectar la presencia de Ll de VPH, la mayor proteina presente en la cápside (Buck et al., 2008), utilizando transferencias de mancha anti-Ll de tipo especifico al VPH. Cada fracción se manchó sobre una membrana de nitrocelulosa (0.5 µ?) y Cervarix (Ll de VPH-16) , L2 de VPH-16 etiquetado con His producido por E. coli, o los sobrenadantes de VPH-16, 18, 45 ó 52 clarificado cargado inicialmente sobre el gradiente se utilizaron como controles positivos .

Las membranas se bloquearon en un amortiguador de bloqueo durante 30 min a temperatura ambiente y luego se probaron durante la noche a temperatura ambiente con un anticuerpo anti-Ll primario apropiado diluido en un amortiguador de bloqueo. Se utilizó CamVirl (1:5000; Abcam) para detectar VPH-16. Además, los sueros anti L2 de VPH-16 de conejo estuvieron disponibles y se utilizaron para detectar L2 en las fracciones de VPH-16 (1:2000). Los MAb H16.123, H45.N5, H52.C1 y H52.D11 que se proporcionaron amablemente por el Dr. Neil Christensen se utilizaron para detectar VPH-18, 45 y 52, respectivamente {1:2000; Christensen et al., 1996) . Las membranas se probaron con el anticuerpo secundario 1:10,000 (IgG anti-ratón de cabra conjugada a fosfatasa alcalina o conjugado de fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra; Sigma) , se lavaron y se desarrollaron como se describe en lo anterior. Las fracciones pico que contuvieron una alta concentración de Ll se agruparon en tubos de poliestireno y se almacenaron a -70°C para su titulación.

Microscopía electrónica de los pseudoviriones Los PsV para VPH purificados se analizaron utilizando microscopía electrónica. Los PsV (1:1000) se atraparon en rejillas de cobre recubiertas de carbono descargadas por fluorescencia, se tiñeron con acetato de uranilo al 2% y se observaron utilizando un Zeiss EM 912 CRYO EFTEM.

Titulación de pseudoviriones Las titulaciones de PsV y los ensayos de neutralización se basaron en el protocolo "Ensayo de neutralización Papilomavirus", con la excepción de que no se incluyeron NAb en la titulación. Los PsV madre se titularon antes de los ensayos de neutralización para determinar la cantidad mínima de PsV requeridos para una señal robusta en el ensayo de SEAP.

Las células HEK293TT se cultivaron en cDMEM-Ab a una confluencia de 70-80%, se recolectaron como se describe, se lavaron con DPBS y se diluyeron a 3.0 x 105 células/ml en un medio de neutralización (cDMEM de alta glucosa con HEPES y sin rojo fenol o piruvato de sodio, suplementado con suero de ternera fetal al 10%; Gibco) . Las células se sembraron previamente en placas, en placas para el tratamiento de cultivos de tejido de 96 pozos (Corning Costar) con 100 µ? de suspensión celular en cada pozo interno y 150 µ? de DMEM con rojo fenol en las paredes externas para evitar la evaporación de la parte interna de los pozos. Las células se incubaron durante 3-4 horas a 37°C antes de la adición de los PsV.

Las diluciones en serie de los PsV se prepararon en un medio de neutralización (diluciones dobles de 1:250 a 1:64000) en placas de poliestireno de 96 pozos estériles no tratadas (Nunc) y se probaron por triplicado. Las diluciones de PsV se agregaron a las células sembradas previamente en placas (100 µ? / pozo) como se indica en el protocolo de Schiller, y cada placa contuvo 6 pozos de control negativo pozos sin pseudoviriones (control celular) . . Las placas se incubaron durante 72 horas a 37 °C en una incubadora humidificada con C02.

La actividad de SEAP se detectó utilizando el Kit 2.0 de Quimioluminiscencia SEAP Great EscAPe™ (Clontech Laboratories, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del manual, excepto que los volúmenes se ajustaron a 0.6 volúmenes de aquellos proporcionados en el protocolo del fabricante (como se hicieron en el protocolo revisado de Schiller) . El sobrenadante (125 µ?) se transfirió en placas de poliestireno de 96 pozos sin tratar estériles (Nunc) y se centrifugó a 1000 x g durante 5 min. El sobrenadante aclarado (15 µ?) se transfirió en Optiplate blancas de 96 pozos (placas blancas para luminómetro Maxisorb 96F; Nunc), se agregaron 45 µ? lx de regulador de dilución a cada pozo y las placas se incubaron a 65°C durante 30 min. Las placas se enfriaron durante 5 min en hielo y entonces se agregaron 60 µ? de sustrato por pozo y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 min. La producción de SEAP se detectó utilizando un luminómetro de microplacas (Digene D L 2000) . La dilución de PsV seleccionada para el ensayo de neutralización fue una que utilizó la cantidad mínima de los PsV que ocurrieron dentro del margen lineal de la curva de titulación. Como el título de VPH-52 fue muy bajo, éste se retituló a partir de 1:125 a 1:4000.

Ensayo de neutralización del pseudovirión Se utilizó un ensayo de neutralización in vitro para detectar las respuestas del anticuerpo específico para VPH en sueros de ratón y para determinar los criterios de valoración de los títulos de neutralización.

Los controles incluyeron: (a) Control celular (control negativo de la infección) : Las células se incubaron sólo con un medio de neutralización (sin sueros o pseudoviriones ) para dar una lectura de fondo del sobrenadante del cultivo celular. Los valores luminiscentes asociados con este control representaron 0% de neutralización del PsV. (b) Control de PsV (control positivo de la infección por PsV) : Los PsV se pre-incubaron en un regulador de neutralización antes de la infección celular. Los valores asociados con este control representaron el 100% de neutralización del PsV. (c) MAb o antisueros conocidos por neutralizar el PsV tipo VPH utilizado en el ensayo (control positivo del ensayo de neutralización) : Los PsV se pre-incubaron con 6 diluciones que deben abarcar el título de neutralización predeterminado (0- 100% de neutralización) . (d) Pre-purgas : Los PsV se pre-incubaron con pre-purgas agrupadas de ratón (control negativo) .

Los controles positivos de NAb (Tabla 8) se titularon antes del ensayo de neutralización de los sueros de prueba para determinar el margen de dilución por neutralización para utilizarse en el ensayo de neutralizaciones en el PsV. Los controles de neutralización para VPH-16, 45 y 52 fueron los Ab de H16.V5, H45.N5, H52.C1 y H52.D11. Los controles para VPH-18 fueron sueros de anti-Cervarix de conejo de nuestro laboratorio.

Tabla 8: Anticuerpos neutralizantes específicos para el tipo de VPH Los sueros a partir de ratones inmunizados con los candidatos a vacunas quiméricas de VPH-16 se agruparon (10 ratones/vacuna) y se probaron para la neutralización del VPH-16, asi como para VPH-18, 45 y 52. Los sueros de vacuna agrupados se diluyeron 4 veces por triplicado en el margen de 1:50 a 1:12800. Las pre-purgas también se agruparon y probaron por triplicado como un control negativo en la dilución más baja de 1:50. Las diluciones en serie de los sueros se prepararon en placas para cultivo de tejidos de 96 pozos sin tratar (1:10 a 1:2560).

Los PsV se diluyeron en un regulador de neutralización a la concentración predeterminada en el ensayo de titulación. En otra placa de 96 pozos sin tratar, se diluyeron 100 µ? de los PsV que se agregaron en cada pozo y se agregaron 25 µ? de sueros diluidos (o regulador de neutralización para el control de PsV en los pozos) a los pozos por triplicado, resultando en una dilución adicional de 1:5 de los sueros pre-diluidos . Los PsV y sueros se incubaron a 4°C durante 1 hora para permitir la neutralización de los PsV infecciosos, y entonces se agregaron 100 µ? a cada pozo en la placa HEK-293TT previamente sembradas en la placa (regulador de neutralización para los pozos de control celular) . Las placas se incubaron durante otras 72 horas en una incubadora humidificada con CO2 a 37 °C.

El sobrenadante se cosechó como se describe en lo anterior y se sometió a ensayo para la presencia de SEAP. El titulo de neutralización se estableció como la dilución de suero máxima reciproca que reduce la actividad de SEAP por al menos 50% en comparación con la muestra control no pre-incubada con suero.

RESULTADOS Respuesta inmuno-humoral contra Ll de VPH-16 La detección de anticuerpos provocados contra Ll de VPH-16 se hizo por ELISA directo, utilizando Ll de VPH-16 expresado en células de insecto como el antigeno de recubrimiento (Figura 9). Los títulos anti-Ll se expresaron como el recíproco de la dilución de suero máxima que contuvo las mayores lecturas de absorbancia que aquellas del suero pre-purgado correspondiente a 1:50.

Ninguna respuesta anti-Ll se detectó para la quimera L1/L2 (56-81) y vacuna de control negativo (V2 y V5; Figura 9A) asi como en las pre-purgas de la vacuna (Figura 9C) . En comparación, los MAb con ELISA (H16.V5, CamVirl, Figura 9B) y los controles positivos Ll derivados de plantas (V4, Figura 9A) mostraron una buena respuesta y ambas quimeras L1/L2 (17-36) y L1/L2 ( 108-120 ) derivadas de plantas provocaron títulos anti-Ll de 200 y 12800, respectivamente (V3 y VI, Figura 9A) . Aunque Ll de VPH-16 provocó los mayores títulos de anti-Ll (12800-51200), L1/L2 ( 108-120 ) mostró una respuesta similar (V4 y VI respectivamente, Figura 9A) , sugiriendo que la inserción del epítopo de aminoácidos 108-120 de la L2 tuvo menos de un efecto en la inmunogenicidad de Ll en comparación con las otras quimeras. Además, la respuesta anti-Ll de L1/L2 ( 108-120 ) y Ll de VPH-16 fue estadísticamente significativa a partir de sus pre-purgas correspondientes y el extracto vegetal infiltrado con NSs (p = 0.01) .

Respuesta humoral inmune contra los epitopos L2 de VPH-16 Se determinó la respuesta anti-L2 contra la proteína L2 de VPH-16 etiquetada con His producida por E. coli utilizando transferencia western. Los sueros individuales de ratón se agruparon para cada una de las vacunas y se analizaron para respuestas anti-L2 (Figura 10).

Se detectó una banda no específica similar a la banda L2 de ~80 kDa tanto en los antisueros del control de vacuna negativo (V5; extracto vegetal) como en el control de vacuna Ll (V4; Ll de VPH-16 expresado en plantas) que sirve como un control L2 negativo adicional en este experimento (Figura 10) . Todas las vacunas de quimera (Vl-3) parecieron dar una respuesta anti-L2, como bandas L2 fuertes detectadas utilizando los antisueros de quimera (Figura 10) . Sin embargo, solo las quimeras L1/L2 ( 108-120 ) y Ll/L2(17- 36) (VI y V3 respectivamente) dieron una respuesta anti-L2 definitiva, con bandas L2 >2X la intensidad de Ll de VPH-16 (V4) .

Ensayos de neutralización Análisis de plásmido Se confirmó la identidad de los plásmidos pYSEAP y los pSheLL L1/L2 de VPH-16, 18, 45 y 52 utilizando una digestión de la enzima de restricción y secuenciación (datos no mostrados ) .

Purificación Optiprep y detección de PsV del VPH en fracciones purificadas Los PsV del VPH se purificaron a partir del sobrenadante celular aclarado por ultracentrifugación del gradiente de densidad en un gradiente lineal Optiprep al 27-39%. Una banda gris claro fue débilmente visible en una tercera parte de su recorrido por arriba del gradiente y las fracciones se recolectaron del fondo del tubo.

Las fracciones se seleccionaron por la presencia de los PsV utilizando transferencias de mancha CamVirl anti-Ll especificas para el tipo de VPH y se utilizaron antisueros de conejo contra L2 de VPH-16 para detectar Ll y L2 de VPH-16, utilizando Cervarix y L2 de VPH-16 etiquetada con His producida por E. coli como controles. Los Ab de H16.I23, H45.N5, H52.C1 y H52.D11 se utilizaron para detectar VPH-18, 45 y 52 respectivamente, utilizando el sobrenadante celular inicialmente aclarado como el control especifico del tipo de VPH (datos no mostrados) .

El VPH-16 se detectó en la fracción 3-5 utilizando H16.V5 y se detectó débilmente con los antisueros L2 de VPH-16, como la proteina L2 que se ubica internamente para la superficie del cápside Ll en las VLP de L1/L2 co-ensambladas (Buck et al., 2008). Las Ll de VPH-18, 45 y 52 se detectaron fuertemente en las fracciones 5-7, 4-6 y 6-10, respectivamente. Las fracciones de PsV se agruparon, se examinaron por microscopía electrónica y se utilizaron en los ensayos de neutralización.

Análisis por microscopía electrónica Las muestras de PsV agrupadas se examinaron por microscopía electrónica de transmisión para determinar su ensamble, morfología y purificación (datos no mostrados) . Todos los tipos de VPH se ensamblaron en los PsV esféricos (55 nm) . Los PsV de VPH-45 parecieron existir exclusivamente como partículas de PsV totalmente ensambladas. Los PsV para VPH-16 y 18 se encontraron predominantemente ensamblados, aunque fueron visibles algunos capsómeros y agregados. Los PsV de VPH-52 contuvieron una gran proporción de agregados de capsómero y PsV parciales, posiblemente como resultado de una baja expresión de Ll y L2 de VPH-52 en las células HEK293TT.

Titulación de PsV para VPH Los PsV purificados se titularon para determinar la dilución de PsV a utilizarse para los ensayos de neutralización. La dilución utilizada fue la cantidad mínima de los PsV que dieron una señal robusta dentro del margen lineal de la curva de titulación.

Para los PsV para VPH-16 y 18, el margen lineal de la curva de titulación ocurrió entre las diluciones de 1:250 a 1:1000 (datos no mostrados), y de este modo se seleccionó 1:500 para los ensayos de neutralización. Los PsV de VPH-45 tuvieron el mayor título, con el margen lineal que ocurrió entre las diluciones de 1:500 y 1:2000, de este modo se seleccionó 1:1000 para un trabajo adicional (datos no mostrados). Los PsV de VPH-52 tuvieron que retitularse utilizando diluciones más bajas. El margen lineal ocurrió entre las diluciones de 1:125 a 1:250 (datos no mostrados), y se utilizó una dilución de 1:200 en el ensayo de neutralización para VPH-52.

Titulación del control positivo de los anticuerpos neutralizantes Los controles positivos NAb se probaron antes de los ensayos de neutralización con antisueros de ratón, para comprobar su capacidad neutralizante y para determinar un margen de dilución adecuado. Todos los controles positivos de los anticuerpos se neutralizaron y mostraron una relación lineal dentro del margen de dilución probado (Tabla 9) .

Ensayos de neutralización de PsV para VPH Los sueros a partir de ratones inmunizados con Ll de VPH-16 producido con plantas y quimeras L1/L2 se probaron para una neutralización homologa de los PsV para VPH-16 y protección cruzada heteróloga contra los PsV para VPH-18, 45 y 52 (Figuras 10-13) . Todos los controles positivos para NAb neutralizaron exitosamente los PsV para VPH-16, 18, 45 y 52 (Figuras 10-13F) , demostrando que los resultados del ensayo de neutralización fueron válidos. El titulo de neutralización se definió como la mayor dilución de suero que reduce la actividad de SEAP por >50% en comparación con la muestra control, que no se trató con suero.

VPH-16 Los resultados de los ensayos de neutralización de PsV para VPH-16 se muestran en la Figura 11. Los sueros Ll de VPH-16 derivados de plantas (V4; Figura 11D) imitaron el control positivo de H16.V5 (Figura 11F) y neutralizaron fuertemente el PsV para VPH-16, seguidos por L1/L2 ( 108-120 ) con una curva de neutralización similar (VI; Figura 11A) . Tanto L1/L2 (56-81) como L1/L2 (17-36) no parecieron provocar el NA de VPH-16 (V2-3; Figuras 11B-C) mostrando curvas de neutralización similares al control negativo (V5; Figura HE) .

VPH-18 Los antisueros de todas las vacunas no neutralizaron el PsV de VPH-18 (Figura 12). Las quimeras L1/L2 (56-81) y L1/L2 (17-36) (V2-3, Figuras 12B-C) produjeron curvas de neutralización similares a la vacuna Ll de VPH-16 especifica del tipo y al control negativo (V4-5, Figuras 12D-E) . La L1/L2 ( 108-120 ) pareció tener cierta actividad neutralizante, con diluciones de sueros reciprocas de <800 lecturas luminiscentes reducidas por debajo de aquellas del control de PsV para VPH-18 pre-purgadas y sin neutralizar (VI; Figura 12A) , Sin embargo, la quimera no redujo los niveles de SEAP por >50%.

VPH-45 Los resultados del ensayo de neutralización del PsV para VPH-45 (Figura 13) sugieren que ninguna de las vacunas quiméricas L1/L2 (VI, V2 y V3; Figuras 13A-C) provocó títulos significativos del NAb de VPH-45, con curvas de neutralización similares a Ll de VPH-16 y al control de vacuna negativo (V4-5; Figuras 13D-E) .

VPH-52 Los ensayos de neutralización de PsV para VPH-52 (Figura 14) proporcionaron evidencia de que los sueros L1/L2 (56-81) no neutralizaron el VPH-52 (L2; Figura 14C) , como se observó para Ll de VPH-16 y el suero de control negativo (V4-5; Figuras 14D-E) . Las vacunas quiméricas L1/L2 (108-120) y L1/L2 (17-36) parecieron tener alguna actividad neutralizante a bajas diluciones recíprocas (50-200) , reduciendo los niveles de SEAP por >50% en comparación con el control PsV para VPH-52 PsV sin neutralizar (VI y V3; Figuras 14A y C) .

Aunque el ensayo fue exitoso, como se muestra por el control del NAb para H52.C1 (Figura 14F) , hubo una gran cantidad de variación entre las muestras por triplicado y fue difícil establecer las líneas de tendencia. Esto pudo atribuirse a la purificación parcial y baja concentración de los PsV para VPH-52 que pudieron tener pequeñas diferencias exageradas entre las réplicas. Los valores del control de infección del PsV para VPH-52 difieren entre las vacunas cuando se analizan VI, V2 y V4 (Figuras 14A-B y D) en una placa diferente de V3, V5 y H52.C1 (Figuras 14C y E-F) . Los tiempos de restricción evitaron que se repitiera este ensayo.

La Tabla 10 resume los títulos del anticuerpo de neutralización del PsV para VPH-16, 18, 45 y 52 provocados por las vacunas derivadas de plantas. La L1/L2 ( 108-120 ) provocó el NAb para VPH-16 homólogo y los antisueros de PsV para VPH-52 heterólogo por neutralización cruzada, lo que sugiere que esta vacuna tiene el mayor potencial para protección. Las quimeras L1/L2 (17-36) provocaron bajos niveles de NAb de VPH-52 por neutralización cruzada, pero no se detectó el NAb de VPH-16 homólogo, sugiriendo que puede comprometerse la inmunogenicidad contra Ll de VPH-16. La L1/L2 (56-81) no provocó NAb. Ninguna de las vacunas para VPH provocó anticuerpos por neutralización cruzada contra los tipos de VPH 18 y 45 relacionados filogenéticamente .

Tabla 10: Resumen de los títulos de neutralización para los candidatos a vacunas quiméricas L1 y L1/L2 derivadas Descripción general de la inmunogenicidad de las vacunas El ensamble estructural (véase Ejemplo 2 anterior) , las respuestas humorales anti-Ll y L2 y el NAb para el tipo de VPH detectado en los antisueros quiméricos L1/L2 se resumen en la Tabla 11. El ensamble en las VLP parece asociarse con mayores títulos de neutralización de anti-Ll y PsV para VPH-16, lo que sugiere que el ensamble se asocia con la inmunogenicidad de Ll .

Tabla 11 : respuestas de anticuerpo para las vacunas quiméricas L1 y L1/L2 ' Ensamble del antígeno TEM: C = capsómeros, CA = agregados de capsómero, VLP = partículas similares "* Detección ELISA de anticuerpos anti-L1. Y = sí, N = no.

¦** Detección c-or transferencia western de anticuerpos anti-L2.

DISCUSIÓN Las quimeras a base de Ll de VPH-16 (Maclean et al., 2007; Fernández-San Millán et al., 2008) y Ll (Paz De la Rosa et al., 2009) derivadas de plantas se ensamblan en las VLP inmunogénicas y provocan la producción de anticuerpos neutralizantes (NAb) . En este estudio, se analizó la inmunogenicidad de las tres quimeras L1/L2 derivadas de plantas que contienen los epitopos de aminoácidos 108-120, 56-81 ó 17-36 de la L2 de VPH-16 por neutralización cruzada en la región h4 de la Ll de VPH-16. Los ratones se inmunizaron subcutáneamente con 10 µ? del antigeno derivado de plantas en un adyuvante incompleto de Freund, y recibieron 4 vacunaciones de refuerzo a las 7 semanas.

Respuestas inmunes humorales Se analizaron en este estudio, las respuestas anti-Ll y L2 humorales provocadas por las quimeras L1/L2 derivadas de plantas para determinar si los péptidos L2 se despliegan y si las inserciones L2 comprometen la inmunogenicidad Ll .

La detección de anticuerpos Ll y L2 en antisueros de ratón se hizo por ELISA directo (Figura 9) y transferencia western (Figura 10) respectivamente, utilizando ya sea Ll de VPH-16 expresada en células de insecto o un antigeno L2 etiquetado con His expresado en E. coll. La Ll de VPH-16 derivada de plantas sirvió como el control positivo de anti- Ll en el estudio y provocó una mayor respuesta de anti-Ll, con títulos de 12800 - 51200 (Figura 9A) . Estos resultados fueron similares a otros estudios de inmunogenicidad en ratones utilizando las VLP derivadas de plantas para Ll de VPH-16 parcialmente purificadas (Títulos = 20000 - 40960; aclean et al., 2007; Fernández-San Millán et al., 2008).

La vacuna de control negativo (V5: extracto vegetal infiltrado con NSs) y las pre-purgas de vacunas (Vl-5 PB) no proporcionaron respuestas anti-Ll (Figura 9) . Sin embargo, los antisueros de los controles negativos (V4-5, Figura 10) detectaron el antígeno L2 de VPH-16 etiquetado con His expresado por E. coli, demostrando de este modo la presencia de anticuerpos no específicos en los sueros, los cuales se enlazan a la proteína L2 etiquetada con His. Esto se debe posiblemente a la purificación parcial de antígenos, que resultan en las vacunas que contienen proteínas vegetales contaminantes. Sin embargo, las bandas del control negativo fueron menos distintas que las bandas para las quimeras L1/L2 (108-120) y L1/L2 ( 17-36) , sugiriendo que estas quimeras L1/L2 provocaron una respuesta anti-L2.

La L1/L2 (108-120) ensamblada en las cVLP -30 nm distintivas fue la vacuna quimérica más exitosa (Tabla 11) , que provocó la mayor respuesta anti-Ll con títulos de ~12800 (Figura 9A) y una respuesta anti-L2 (Figura 10) . Además, solo los antisueros L1/L2 ( 108-120 ) y Ll de VPH-16 demostraron respuestas significativas anti-Ll (p = 0.01) en comparación con las pre-purgas y el extracto vegetal infiltrado con NSs (control negativo). La quimera L1/L2 ( 108-120) expresada en células de insecto analizada por Varsani et al. (2003a) provocó mayores títulos anti-Ll (> 204800) en comparación con la quimera derivada de plantas, sin embargo, se utilizó una dosis lOx mayor (100 µg vs . 10 µg) . Tomadas juntas, existió una fuerte evidencia de que el péptido de los aminoácidos 108-120 de L2 se desplegó efectivamente en la superficie de las cVLP de Ll .

La vacuna L1/L2 (17-36) provocó una respuesta anti-Ll relativamente débil con títulos de ~200 (Figura 9A) pero provocó una respuesta anti-L2 fuerte (Figura 10), sugiriendo que el péptido L2 se desplegó en la superficie de Ll ensamblada. De modo similar, la fusión del péptido con los aminoácidos 20-38 de L2 a tiorredoxina (Trx) bacteriana provocó respuestas anti-L2 fuertes en comparación con otros péptidos de L2-Trx que comprenden de los aminoácidos 56-120 (Rubio et al., 2009) y el MAb RG-1 dirigido contra el péptido con los aminoácidos 17-36 de L2 de VPH-16 que ha mostrado detectar L2 en la transferencia estern y ELISA (Gambhira et al. , 2007) .

La vacuna capsomérica L1/L2 (56-81) no provocó una respuesta anti-Ll que pudiera detectarse en la dilución de sueros más baja de 1:50 (Figura 9A) y la respuesta anti-L2 no fue concluyente (Figura 10), con ambas respuestas de anti-Ll y L2 similares a las pre-purgas de la vacuna (Vl-5 PB) y los controles negativos (Figuras 9-10) . Como resultado, la L1/L2 (56-81) derivada de plantas no pareció ser inmunogénica, a menos para los péptidos de fusión Trx-L2 expresados en E. coli (Rubio et al., 2009) y las quimeras L1/L2 expresadas en células de insecto que contienen epitopos L2 similares en el bucle DE de las VLP de Ll para VPB-1 (Slupetzkey et al., 2007; Schellenbacher et al., 2009).

Ensayos de neutralización de pseudoviriones Las quimeras L1/L2, que contienen los aminoácidos 108-120, 56-81 y 17-36 de los epitopos L2, se examinaron para su capacidad de provocar anticuerpos que neutralizaran los PsV para VPH-16, 18, 45 y 52. Todos los epitopos L2 analizados en este estudio mostraron provocar anticuerpos que neutralizan el VPH-16 homólogo y el VPH-52 por neutralización cruzada (Kawana et al., 2003; Slupetzky et al., 2007; Kondo et al., 2007, 2008; Gambhira et al., 2007; Schellenbacher et al., 2009). Adicionalmente , los aminoácidos 56-81 de la L2 de VPH-18 por neutralización cruzada y los aminoácidos 17-36 de la L2 de ambos de VPH-18 y 45 por neutralización cruzada (Gambhira et al., 2007; Kondo et al., 2007, 2008; Alphs et al., 2008; Schellenbacher et al., 2009; Rubio et al., 2009).

El VPH-16 se seleccionó como la Ll de VPH-16 que es la estructura principal de los candidatos a vacunas quiméricas y esto provocó la mayoría de cánceres cervicales, seguidos por los VPH-18 y VPH-45 filogenéticamente relacionados. Los VPH-16, 18 y 45 se asociaron con 48%, 23% y 10% de los cánceres cervicales en África, y 61%, 10% y 6% de los cánceres cervicales a nivel mundial (de Sanjosé et al., 2010) . Aunque el VPH-52 sólo se clasifica como el 5o en África (3%) y como 6o a nivel mundial (6%), se ha mostrado que el VPH-52 es altamente prevalente en lesiones cervicales de bajo y alto grado en las mujeres sudafricanas y de este modo, la neutralización cruzada del VPH-52 es de significancia local (Alian et al., 2008).

Neutralización del VPH-16 homólogo Las L1/L2 (56-81) y L1/L2 (17-36) derivadas de plantas no provocaron títulos de NAb para VPH-16 que pudieran detectarse, dando resultados similares a las pre-purgas y al extracto vegetal infiltrado con NSs (Figura 11) . El trabajo previo ha mostrado que las quimeras L1/L2 que contienen los aminoácidos 17-36, 18-38, 56-75 ó 69-81 de los péptidos L2 de VPH-16 ubicados en las regiones superficiales de VPB-1 o la Ll de VPH-16 se provocan por el NAb de VPH-16 (Slupetzkey et al., 2007/ Kondo et al., 2008; Schellenbacher et al., 2009); sin embargo, los sitios de inserción difieren de aquellos utilizados en este estudio y de las quimeras ensambladas en las cVLP. Además, se encontró que el MAb dirigido contra los aminoácidos 73-84 de la L2 de VPH-16 no es neutralizante y no neutraliza el PsV para VPH-16 (Gambhira et al., 2007), similar a los resultados obtenidos para la quimera Ll/L2(56-81) en este estudio.

En este estudio, solo L1/L2 (108-120) y Ll de VPH-16 neutralizaron el PsV para VPH-16 de manera similar a H16.V5 (control positivo de la neutralización), proporcionando títulos de 50-500 y 500-5000, respectivamente (Tabla 10) . Estos resultados son consistentes con otros estudios de inmunogenicidad en ratones utilizando antígenos Ll de VPH derivados de plantas. Una dosis similar o mayor de las VLP de Ll de VPH-16 derivadas de plantas provocaron títulos del NAb para VPH-16 de 400-1600 (Maclean et al., 2007; Fernández-San Millán et al., 2008) y las cVLP de L1/E6/E7 derivadas de plantas provocaron títulos del NAb para VPH-16 de -400 utilizando un ensayo de hemaglutinación (Paz De la Rosa et al., 2009). Además, la inmunización de humanos con el péptido con los aminoácidos 108-120 de la L2 de VPH-16 mostró provocar títulos del NAb para VPH-16 de 100-1000 (Kawana et al., 2003) y los antisueros de ratón a partir de las quimeras L1/L2 que contuvieron los aminoácidos 108-120 de los epítopos L2 (Slupetzkey et al., 2007) o los aminoácidos 75-112 y 115-154 de L2 ( Schellenbacher et al., 2009) neutralizaron los PsV para VPH-16 homólogo con títulos <1000. Por lo tanto, los títulos obtenidos en el estudio se encuentran dentro del margen reportado por las vacunas quiméricas L1/L2 producidas en otros sistemas de expresión.

Neutralización de los VPH-18, 45 y 52 heterologos La actividad neutralizante contra el PsV de VPH-18 y 45 relacionados filogenéticamente no se detectó en todas las vacunas para VPH (Figuras 12-13) . De modo similar, los antisueros L1/L2 (56-81) no neutralizaron el PsV para VPH-52 (Figura 14). Aunque L1/L2 ( 108-120 ) y L1/L2 (17-36) parecieron provocar bajos títulos del NAb para VPH-52 (50-200), no hubo mayor variación en el ensayo, posiblemente debido a la purificación de los PsV parcialmente ensamblados, y el ensayo tuvo que repetirse para confirmar los resultados.

El trabajo previo ha demostrado que las quimeras L1/L2 que contienen el péptido con los aminoácidos 56-81 de L2 neutralizan de forma cruzada tanto el VPH-18 como el 52 (Kondo et al., 2008). Sin embargo, las quimeras que se ensamblaron en las cVLP diferentes de L1/L2 (56-81) , sugieren que el ensamble de VLP es importante para inducir la producción de altos títulos de NAb. Además, la quimera L1/L2 que contiene los aminoácidos 17-36 ó 18-36 de L2 (Kondo et al., 2008; Schellenbacher et al., 2009) provocó el NAb contra VPH-18, 45 y 52. Sin embargo, los péptidos L2 se insertaron en el bucle DE (Schellenbacher et al., 2009) y la dosificación no se estableció para el estudio conducido por Kondo et al. (2008) . En este estudio, los bajos títulos del NAb para VPH-52 provocados por L1/L2 (17-36) derivado de plantas en ratones fueron comparables con los títulos provocados por la quimera L1/L2 similar expresada en células de insecto (Schellenbacher et al., 2009), sugiriendo que el sistema de expresión no afecta la capacidad del antígeno para neutralizar de modo cruzado el VPH-52.

La quimera L1/L2 ( 108-120 ) derivada de plantas pareció provocar el NAb para VPH-52 y pudo tener potencial como una vacuna para VPH de protección cruzada, soportada por la evidencia de que el péptido L2 con los aminoácidos 108-120 ha mostrado provocar títulos de NAb para VPH-52 de 50-1000 respectivamente en humanos (Kawana et al., 2003). No existe evidencia de que los aminoácidos 108-120 de la L2 de VPH-16 neutralicen de forma cruzada al VPH-45, sin embargo, las quimeras L1/L2 que contienen los epítopos con los aminoácidos 96-115 ó 75-112 similares a la L2 de VPH-18 filogenéticamente relacionada por neutralización cruzada (Kondo et al., 2008; Schellenbacher et al., 2009). Sin embargo, los títulos de NAb reportados en los estudios fueron bajos (<100) y es posible que provoquen un NAb para VPH-18 muy bajo para detectarlo en los antisueros L1/L2 (108-120) .

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Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Una partícula similar al virus (VLP) del virus del papiloma humano (VPH) quimérico que tiene un diámetro de alrededor de 30 nm, la VLP del VPH quimérico caracterizada porque comprende un polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano, el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico que además comprende un polipéptido Ll de VPH 16 que incluye un péptido L2 de VPH de entre alrededor de 13 aminoácidos a alrededor de 26 aminoácidos insertados a partir del residuo 414 del polipéptido Ll del VPH 16, y en donde los aminoácidos del péptido L2 del VPH insertado remplaza los aminoácidos correspondientes del polipéptido Ll del VPH 16.

2. La VLP del VPH quimérico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido L2 del VPH insertado se selecciona del grupo que consiste de: (i) un péptido de 13 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano de la SEQ ID NO: 7; (ii) un péptido de 20 aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano de la SEQ ID NO: 9; y (iii) un péptido de 26 aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano de la SEQ ID NO: 8.

3. La VLP del VPH quimérico de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano que codifica el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico se modifica para tener una señal deficiente de ubicación nuclear.

4. La VLP del VPH quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

5. La VLP del VPH quimérico de conformidad con la reivindicación 4 caracterizada porque el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico se codifica por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28.

6. La VLP del VPH quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico se expresa en y se recupera a partir de una planta.

7. La VLP del VPH quimérico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico se dirige a un cloroplasto de la planta.

8. Un método para producir una VLP del VPH quimérico que tiene un diámetro de alrededor de 30 nm, el método caracterizado porque comprende las etapas de: (i) proporcionar una secuencia quimérica de nucleótidos optimizada por un codón de humano que codifica un polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico, el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico comprende un polipéptido Ll de VPH 16 que tiene un péptido L2 de VPH de entre alrededor de 13 aminoácidos a alrededor de 26 aminoácidos insertados a partir del residuo 414 del polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico, en donde los aminoácidos del péptido L2 del VPH insertado remplaza los aminoácidos correspondientes del polipéptido Ll del VPH 16; (ii) clonar la secuencia quimérica de nucleótidos optimizada por un codón de humano en un vector de expresión adaptado para expresar un polipéptido en una planta; (üi) transformar o infiltrar una célula vegetal con el vector de expresión de la etapa (ii) ; (iv) expresar el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico en la célula vegetal de la etapa (iii) de modo que el polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico expresado se ensamble en una VLP del VPH quimérico que tiene un diámetro de alrededor de 30 nm; y (v) recuperar la VLP del VPH quimérico a partir de la célula vegetal.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el vector de expresión de la etapa (ii) además incluye dirigir secuencias que codifican un polipéptido en dirección del polipéptido L1/L2 del VPH 16 quimérico expresado del citoplasma a un cloroplasto de la célula vegetal.

10. El método de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el vector de expresión incluye promotores y otros reguladores o similares, unidos operativamente a la secuencia de codificación del vector de expresión .

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado además porque incluye además la etapa de co-infiltración o co-transformación de la célula vegetal con una proteina supresora adaptada para inhibir el silenciamiento génico post-transcripción en una planta .

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la proteina supresora es la proteina NSs del virus del bronceado del tomate o el pl9 del virus del enanismo arbustivo del tomate.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque el péptido L2 del VPH insertado se selecciona del grupo que consiste de: (i) un péptido de 13 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano de la SEQ ID NO: 7; (ii) un péptido de 20 aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano de la SEQ ID NO: 9; y (iii) un péptido de 26 aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 codificado por una secuencia de nucleótidos optimizada por un codón de humano de la SEQ ID NO: 8.

14. Un método para prevenir o tratar La infección por VPH o cáncer cervical en un sujeto, el método caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la VLP del VPH quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 al sujeto .

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende una etapa de provocar una respuesta inmune en el sujeto.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la respuesta inmune es una respuesta de anticuerpo neutralizante o una respuesta de linfocito T citotóxico .

17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la respuesta inmune es una respuesta inmune de protección cruzada a tipos múltiples de VPH presentes en el sujeto.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque el sujeto es un humano.

19. Una VLP del VPH quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en un método para prevenir o tratar la infección por VPH o cáncer cervical en un sujeto, el método caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la VLP del VPH quimérico al sujeto.

20. La VLP del VPH quimérico de conformidad con la reivindicación 19, el método caracterizado además porque comprende una etapa de provocar una respuesta inmune en el su eto .

21. La VLP del VPH quimérico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la respuesta inmune es una respuesta de anticuerpo neutralizante o una respuesta de linfocito T citotóxico.

22. La VLP del VPH quimérico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la respuesta inmune es una respuesta inmune de protección cruzada a tipos múltiples de VPH presentes en el sujeto.

23. La VLP del VPH quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizada porque el sujeto es un humano.

24. El uso de una VLP del VPH quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la fabricación de un medicamento para su uso en un método para prevenir o tratar la infección por VPH o cáncer cervical en un sujeto, el método además comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del medicamento al sujeto.

25. El uso de conformidad con la reivindicación 24, el método comprende una etapa de provocar una respuesta inmune en el sujeto.

26. El uso de conformidad con la reivindicación 25, en donde la respuesta inmune es una respuesta de anticuerpo neutralizante o una respuesta de linfocito T citotóxico.

27. El uso de conformidad con la reivindicación 25, en donde la respuesta inmune es una respuesta inmune de protección cruzada a tipos múltiples de VPH presentes en el suj eto .

28. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en donde el sujeto es un humano.

29. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una VLP del VPH quimérico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con partículas similares al virus (VLP) del virus del papiloma humano (VPH) quimérico que tienen un diámetro de alrededor de 30 nm. La invención además se relaciona con métodos de tratamiento y/o profilaxis de infección por VPH y/o cáncer cervical por la administración de las VLP del VPH quimérico de la invención a un sujeto.