WO2020111814A1 - 광견병 예방용 백신 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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송재영
우인옥
조수동
박세연
강병술
양동군
김하현
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    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a rabies virus glycoprotein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a vaccine composition for preventing rabies comprising the glycoprotein as an active ingredient, and the like.
  • Rabies is a disease caused by an animal that has the rabies virus, and because not only various animals living in the wild, but also pet animals have the rabies virus, so many people are exposed to the rabies virus, and more than 70,000 people each year There have been reports of deaths from rabies. In recent years, the incidence of rabies caused by pet animals has been drastically reduced by regularly vaccinating pet animals, but forest-borne propagation caused by wild animals such as raccoons and badgers is still maintained.
  • vaccines for preventing such rabies cannot use bacteria due to problems such as protein folding and glycosylation, and are mainly produced using animal cells.
  • the method for producing a vaccine using animal cells is not easy to manufacture because the cost of expanding the equipment for mass production is not easy, and the price of the vaccine is most expensive.
  • inactivated rabies virus vaccines made using animal cells are not only easy to store, but also have the disadvantage that they are highly likely to be contaminated with viruses that can infect animals.
  • unlike plants in the case of plants, it is very unlikely to be contaminated with viruses that can infect animals, and mass production is possible at any time if only a cultivated area is secured, and long-term storage is possible through plants. Production is expected to be possible (Republic of Korea Patent Publication 10-2013-0111581).
  • the present invention has been derived to solve the problems in the prior art as described above, as well as efficient production using plants, recombinant rabies virus glycoprotein showing high immunogenicity and virus neutralizing ability, vaccine composition comprising the same,
  • An object of the present invention is to provide a method for producing the glycoprotein and the like.
  • the present invention provides a rabies virus glycoprotein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the rabies virus glycoprotein is a functional equivalent of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is included in the scope of the present invention, and the functional equivalent is at least 60 with the amino acid sequence as a result of addition, substitution, or deletion of amino acids. % Or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and most preferably 90% or more of sequence homology, which exhibits substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 It means, if the amino acid sequence of the rabies virus glycoprotein that can be stably produced using a plant is not limited thereto.
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing rabies and a feed composition for preventing rabies, comprising the rabies virus glycoprotein as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating rabies by administering the rabies virus glycoprotein to an individual.
  • the present invention provides a rabies prevention or treatment use of the rabies virus glycoprotein.
  • the present invention provides a rabies virus glycoprotein expression vector comprising a polynucleotide encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide is preferably a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the vector may be sequentially linked to be operable in the order of the promoter gene and the polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the promoter is 35S promoter derived from cauliflower mosaic virus, 19S RNA promoter derived from cauliflower mosaic virus, plant actin protein promoter, ubiquitin protein promoter, CMV (Cytomegalovirus) promoter, SV40 (Simian virus 40) promoter, RSV (Respiratory syncytial virus) promoter, EF-1 ⁇ (Elongation factor-1 alpha) promoter, pEMU promoter, MAS promoter, histone promoter, Clp promoter, etc., but is not limited thereto. Does not.
  • the recombinant expression vector encodes a polynucleotide encoding a Caperone binding protein (BiP), a gene encoding a His-Asp-Glu-Leu (HDEL) peptide, and four or more consecutive histidines It may further include a gene to be said.
  • BiP Caperone binding protein
  • HDEL His-Asp-Glu-Leu
  • the present invention provides a transformant transformed with the vector.
  • the transformant is preferably microorganisms such as E. coli, Bacillus, Salmonella, yeast, etc., insect cells, animal cells including humans, mice, rats, dogs, monkeys, pigs, horses, cattle Animals such as, Agrobacterium tumefaciens, plants and the like, more preferably, food crops including rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, wheat, red beans, oats, and sorghum; Vegetable crops including Arabidopsis, Chinese cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, and carrot; Special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanut, and rapeseed; And fruit trees including apple, pear, jujube, peach, grape, citrus, persimmon, plum, apricot, and banana; And flowers, including roses, carnations, chrys
  • the present invention (a) culturing the transformant; And (b) separating and purifying the rabies virus glycoprotein from the transformant or the culture medium.
  • the transformant may preferably be a cell itself, a plant, or a culture containing cells, and the culture medium may be a culture medium in which cells are removed after culturing the cells, but the recombinant rabies virus sugar of the present invention If it contains a protein, it is not limited thereto.
  • the rabies virus glycoprotein according to the present invention is not only effectively expressed in plants, but also has high solubility and is easy to separate and purify, it is possible to mass-produce the rabies virus glycoprotein at a low cost. It is expected to be widely used in various fields where proteins are used. In addition, since it shows remarkable immunogenicity and virus neutralization ability in the body, it can be used as a novel rabies vaccine composition.
  • FIG. 1 is a diagram showing the arrangement of genes for expression of recombinant rabies virus glycoprotein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing the results of confirming the solubility of recombinant rabies virus glycoprotein according to an embodiment of the present invention by Western blotting.
  • FIG. 3 is a view showing the results confirmed by SDS-PAGE after separating and purifying the recombinant rabies virus glycoprotein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a view showing the results of confirming whether or not the glycation of the recombinant rabies virus glycoprotein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a view showing the results of confirming the immunogenicity of the recombinant rabies virus according to an embodiment of the present invention.
  • the rabies virus glycoprotein of the present invention is expected to be able to provide a cheap and stable rabies vaccine because it is capable of stable and efficient mass production.
  • antigen refers to all substances that cause an immune response in the body, preferably viruses, compounds, bacteria, pollen, cancer cells, shrimp, etc., or some peptides or proteins thereof, or in the body In the case of substances that can cause an immune response, it is not limited thereto.
  • rabies virus is the most well-known pathogen among Rhabdoviridae and belongs to Lyssavirus, and the genome of Rhabdoviridae consists of about 11 to 15 kb of non-segment negative single-stranded RNA, Five genes are composed of 3'-N (nucleoprotein)-P (phosphoprotein)-M (matrix protein)-G (glycoprotein)-L (polymerase)-5'.
  • the rabies virus has a bullet-shaped envelope, and the envelope portion is composed of a bilayer lipid membrane including glycoprotein (G) and matrix protein (M).
  • the glycoprotein is preferably represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the glycoprotein of the present invention includes the variants of SEQ ID NO: 1 within the scope of the present invention.
  • the gene may include a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, and most preferably 90% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • vaccine is a biological agent containing an antigen that causes an immune response in a living body, and refers to an immunogen that immunizes a living body by injection or oral administration to a person or animal for the prevention of infectious diseases.
  • the animal is a human or non-human animal, and the non-human animal refers to pigs, cows, horses, dogs, goats, sheep, and the like, but is not limited thereto.
  • expression vector refers to a vector capable of expressing a peptide or protein encoded by a heterologous nucleic acid inserted into a vector, and preferably, a pig Fc fragment is fused. It means a vector prepared to express the target antigen.
  • the "vector” refers to any medium for introduction and/or transfer of a base into a host cell in vitro, in vivo, or in vivo, and a replication unit capable of binding to other DNA fragments to obtain replication of the bound fragment ( replicon), and "replicating units” are any genetic units (eg, plasmids, phages, cosmids) that function as autologous units of DNA replication in vivo, that is, are replicable by their own control. Chromosome, virus, etc.).
  • the recombinant expression vector of the present invention is preferably a transcription initiation factor to which RNA polymerase binds, a promoter, any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and termination of transcription and translation. It may include a sequence, a terminator, etc., more preferably, the 5'UTR region gene of M17 to increase the amount of protein synthesis, the BiP gene for moving the target protein into the vesicle, and the protein is stable in the vesicle.
  • HDEL gene to minimize the degradation of the protein to be maintained as it may further include, and more preferably, a tag gene for easily separating a recombinant protein, an antibiotic resistance gene for selecting a transformant, etc.
  • the marker gene for selection may be further included.
  • the tag gene is, for example, Avi tag, Calmodulin tag, polyglutamate tag, E tag, FLAG tag, HA tag, His tag, Myc tag, S tag, SBP tag, IgG-Fc tag, CTB tag, Softag 1 tag, Softag 3 tag, Strep tag, TC tag, V5 tag, VSV tag, Xpress tag, etc.
  • the selectable marker gene may include, for example, a herbicide resistant gene such as glyphosate or phosphinothricin.
  • the promoter includes, for example, the pEMU promoter, MAS promoter, histone promoter, Clp promoter, 35S promoter derived from cauliflower mosaic virus, 19S RNA promoter derived from cauliflower mosaic virus, plant actin protein promoter, ubiquitin protein promoter, CMV (Cytomegalovirus) Promoter, SV40 (Simian virus 40) promoter, RSV (Respiratory syncytial virus) promoter, EF-1 ⁇ (Elongation factor-1 alpha) promoter, etc.
  • the terminator is, for example, nopaline synthase (NOS), rice amyl The Lase RAmy1 A terminator, the Paseoolin terminator, the Agrobacterium toumafaciens octopine gene terminator, the E. coli rrnB1/B2 terminator, etc., but the examples are not limited thereto.
  • NOS nopaline synthase
  • rice amyl The Lase RAmy1 A terminator the Paseoolin terminator
  • the Agrobacterium toumafaciens octopine gene terminator the E. coli rrnB1/B2 terminator, etc., but the examples are not limited thereto.
  • transformation collectively refers to the change in the genetic properties of the organism by the injected DNA, "transformants (transgenic organism)” by injecting an external gene by molecular genetic method
  • a prepared living organism it is preferably a living organism transformed by the recombinant expression vector of the present invention, and the living organism is not limited if it is a living organism such as a microorganism, eukaryotic cell, insect, animal, plant, and preferably E. coli, Salmonella, Bacillus, yeast, animal cells, mice, rats, dogs, monkeys, pigs, horses, cows, Acrobacterium tumefaciens, plants, and the like, but is not limited thereto.
  • the transformants include transformation, transfection, Agrobacterium-mediated transformation methods, particle gun bombardment, sonication, and electroporation.
  • PEG Polyethylen glycol
  • solubility means the degree to which a target protein or peptide can be dissolved in a solvent suitable for administration to the human body. Specifically, it may indicate that the solute is saturated for a given solvent at a specific temperature. Solubility can be measured by determining the saturation concentration of a solute, for example, by adding an excessive amount of solute to a solvent, stirring and filtering it, the concentration can be measured using a UV spectrometer or HPLC, but is not limited thereto. , High solubility is advantageous for the separation and purification of the recombinant protein, and aggregation of the recombinant protein is suppressed, and thus has the advantage of maintaining the physiological or pharmacological activity of the recombinant protein.
  • prevention refers to all actions that inhibit or delay the onset of rabies by administration of the recombinant rabies virus glycoprotein according to the present invention.
  • “individual” refers to a subject to which the recombinant rabies virus glycoprotein of the present invention can be administered, and the subject is not limited.
  • the “vaccine composition” of the present invention may be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, and sterile injectable solutions, according to a conventional method.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, and sterile injectable solutions, according to a conventional method.
  • it may be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc.
  • solid preparations include at least one excipient in the lecithin-like emulsifier, for example, starch, calcium carbonate, sucrose It can be prepared by mixing (sucrose) or lactose, gelatin, and the like. It is also possible to use lubricants, such as magnesium stearate, in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral administration may include suspending agents, intravenous solutions, emulsions, syrups, etc.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives are included. Can be.
  • Formulations for non-oral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous agents, suspensions, emulsions, and lyophilized preparations.
  • Non-aqueous preparations, suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • it may further include a conventionally known "immunoantigen adjuvant (adjuvant)".
  • the adjuvant may be used without limitation as long as it is known in the art, but may further increase immunity, for example, further comprising Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant.
  • the vaccine composition or pharmaceutical composition of the present invention is formulated in the form of an oral dosage form such as a powder, a granule, a tablet, a capsule, a suspension, an emulsion, a syrup, an aerosol, an external preparation, a suppository, or a sterile injection solution, respectively, according to a conventional method.
  • an oral dosage form such as a powder, a granule, a tablet, a capsule, a suspension, an emulsion, a syrup, an aerosol, an external preparation, a suppository, or a sterile injection solution, respectively, according to a conventional method.
  • the route of administration of the vaccine composition according to the present invention is not limited to these, but is oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, This includes sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral as used herein includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, synovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the vaccine composition of the present invention can also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the dosage of the vaccine composition or pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of the age, weight, sex, and physical condition of the individual.
  • the amount required to induce an immune protective response in an individual without significant side effects may vary depending on the presence of recombinant proteins and excipients used as immunogens.
  • each dose contains 0.1 to 1000 ⁇ g of protein, preferably 0.1 to 100 ⁇ g per ml of sterile solution of the recombinant protein of the present invention.
  • repeated initial stimulation can be performed after the initial dose.
  • immunoadjuvant generally refers to any substance that increases the humoral and/or cellular immune response to an antigen.
  • the "feed composition" of the present invention is a feed containing the recombinant rabies virus glycoprotein of the present invention, which includes by-products such as pork, beef, chicken, corn, rice, common rice straw, herb, grass, and anne There are ridges, hay, and wild grass, but are not limited thereto, and there are no restrictions if the feed is used for breeding livestock.
  • a method of adding and combining the recombinant rabies virus glycoprotein of the present invention to such a feed there are methods such as mechanical mixing, adsorption, and occlusion, but are not limited thereto.
  • Example 1 Preparation of vector for expression of recombinant rabies virus glycoprotein
  • a polynucleotide encoding a chaperone binding protein (BiP) protein between the CaMV 35S promoter gene of the pCAMBIA1300 vector and the NOS terminator (SEQ ID NO: 3)
  • An expression vector was constructed.
  • transient expression of inoculating the leaves of transformed Agrobacterium tumefaciens into Nicotiana benthamiana leaves was conducted. More specifically, the recombinant rabies virus glycoprotein expression vector was transformed into Agrobacteria LBA4404 using electrophoration. The transformed agrobacteria were inoculated in 5 mL of YEP liquid medium (10 g of yeast extract, 10 g of peptone, 5 g of NaCl, 50 mg/L of kanamycin, and 25 mg/L of rifampicin), followed by 16 at 28°C.
  • the protein was extracted from the leaves of Nicotiana Ventamiana expressing the recombinant rabies virus protein and centrifuged to remove the recombinant protein (S) contained in the aqueous solution fraction and the recombinant protein (P) contained in the pellet fraction. Acquired and subjected to Western blotting.
  • a 20 mM Sodium phosphate (pH 7.3) solution containing 0.1% Triton X-100, 20 mM Imidazole (pH 7.5) and 300 mM NaCl was used.
  • each protein fraction obtained is mixed with an SDS sample buffer, heated, and electrophoresed on a 10% SDS-PAGE gel to separate proteins by size, and the isolated protein is After transfer to the PVDF membrane, after 5% skim milk (blocking step) using a skim milk, after binding with 6 His-reactive antibodies, and treated with ECL solution according to the method provided by the manufacturer, the recombinant rabies virus sugar Protein was identified. The results are shown in FIG. 2.
  • the recombinant rabies virus glycoprotein expression vector of the present invention can effectively express the recombinant rabies virus glycoprotein in plants, and the recombinant rabies virus glycoprotein prepared using the vector has high solubility. Since it has, it was confirmed that separation and purification is easy, and aggregation of the recombinant protein is suppressed, and thus effective in maintaining the physiological or pharmacological activity of the recombinant protein.
  • Example 3 Isolation and purification of recombinant rabies virus glycoprotein
  • Protein extraction solution 50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole, 0.1% Triton X-100, and 1X proteolytic enzyme
  • 40 g of Nicotiana Ventamia obtained in the same manner as in Example 2
  • inhibitor proteolytic enzyme
  • the protein extract was obtained by centrifuging at 13,000 rpm for 20 minutes at 4°C.
  • affinity chromatography was performed using a column filled with Ni-NTA agarose resin.
  • the column was filled with 5 mL of resin and then equilibrated using 50 mL of a washing solution (50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl, and 20 mM Imidazole). After injecting the protein extract into the equilibrated column and removing unbound proteins using 100 mL of the washing solution, elution solution (elution buffer: 50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl, and 300 mM Imidazole) was added. The recombinant rabies virus glycoprotein was eluted.
  • a washing solution 50 mM sodium phosphate (pH 8.0), 300 mM NaCl, and 20 mM Imidazole.
  • the eluted solution was replaced with a phosphate buffered saline (PBS) using a filter having a size of 30 kD, and the protein was concentrated to obtain a recombinant rabies virus glycoprotein.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the obtained protein was confirmed by protein electrophoresis (SDS-PAGE) and coomassie staining. The results are shown in FIG. 3.
  • an Endo H glycosidase N-glycosylation removal assay was performed. More specifically, after adding 10X denatured buffer (denaturation buffer: 5% SDS and 0.4 M DTT) to 1 ⁇ g of the recombinant rabies virus glycoprotein, it is heated at 100° C. for 10 minutes, and sodium is used so that the final concentration of the recombinant protein is 50 mM. citrate buffer (pH 5.5) was added. And 50 U of endo H glycosidase was added and reacted at 37°C for 1 hour.
  • 10X denatured buffer denaturation buffer: 5% SDS and 0.4 M DTT
  • Example 3 In order to confirm whether the recombinant rabies virus glycoprotein obtained in the same manner as in Example 3 has an immunogenicity by inducing an antibody in vivo as an antigen, an experiment was conducted using a 6-week-old male C57BL/6J mouse. More specifically, 10 ⁇ g of recombinant rabies virus glycoprotein was administered twice (6 weeks and 8 weeks) to the experimental group mice, and a phosphate buffer solution was administered to the negative control mice. When the recombinant rabies virus glycoprotein was administered, the same amount of Freund's adjuvant was mixed, the first was a complete adjuvant, and the second was an incomplete adjuvant.
  • Recombinant rabies virus glycoprotein was administered twice and blood was collected two weeks later to confirm whether a specific antibody against the administered antigen was generated using an ELISA plate coated with the recombinant rabies virus glycoprotein.
  • Experiments were conducted using 4 negative controls (CT) and 5 experimental groups (RVGe), and the results are shown in FIG. 5.
  • the antibody formed through the administration of the rabies virus glycoprotein of the present invention has the ability to neutralize the rabies virus. More specifically, 100 ⁇ L of DMEM medium was dispensed into four wells per sample in a 96 well plate, and 50 ⁇ L of serum to be diluted was added to the first well. Then, three-fold serial dilution was performed using the remaining three wells in which the medium was dispensed.
  • OIE standard open serum diluted to a concentration of 0.5 IU (International units)/mL was used as a standard positive serum, and a negative control serum was used as an antibody negative serum. Prepared by non-synchronization.
  • the antibody value of each sample was quantified using the ImageJ program for fluorescence images obtained using a fluorescence microscope, and then the antibody value of each sample was calculated using standard positive serum results.
  • the neutralizing antibody value was determined to be positive when 0.5 IU/mL or higher, and negative when it was less than 0.5 IU/mL. Table 1 shows the results.
  • the recombinant rabies virus glycoprotein of the present invention is not only effectively expressed in plants, but also has high solubility, so that it is easy to separate and purify, and protein activity can be stably maintained.
  • it can be used as a novel rabies vaccine composition because it acts as an antigen in the body and shows high immunogenicity and virus neutralization ability.
  • the above ingredients are mixed and filled in an airtight fabric to prepare a powder.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional tablet manufacturing method.
  • the above ingredients are mixed and filled into a gelatin capsule to prepare a capsule.
  • Each component is added and dissolved in purified water according to the manufacturing method of a conventional liquid preparation, and the appropriate amount of lemon scent is added, and then the above components are mixed.
  • the feed is prepared by mixing the ingredients according to a conventional feed preparation method.
  • the present invention comprises a rabies virus glycoprotein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, an expression vector for producing the glycoprotein, a transformant transformed with the expression vector, and the glycoprotein as an active ingredient Regarding the vaccine composition for rabies prevention, etc.
  • the rabies virus glycoprotein of the present invention is not only effectively expressed in plants, but also has high solubility, so it is easy to separate and purify, thereby enabling mass production of rabies virus glycoprotein at low cost. It is expected to do.

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Abstract

본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 광견병 바이러스 당단백질, 상기 당단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 및 상기 광견병 바이러스 당단백질을 포함하는 백신 조성물 등에 관한 것이다.

Description

광견병 예방용 백신 조성물 및 이의 제조 방법
본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 광견병 바이러스 당단백질, 상기 당단백질을 유효성분으로 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 등에 관한 것이다.
광견병(rabies)은 광견병 바이러스를 가지고 있는 동물에게 물려서 발생되는 질환으로서, 야생에서 생활하는 다양한 동물들뿐만 아니라 애완용 동물 또한 광견병 바이러스를 가지고 있기 때문에, 수많은 사람들이 광견병 바이러스에 노출되며, 매년 7만명 이상 광견병으로 인한 사망자들이 보고되고 있는 실정이다. 최근에는 애완용 동물에게 정기적으로 백신을 접종함으로써 애완용 동물로 인한 광견병 발생률은 급격히 감소되었으나, 너구리, 오소리 등 야생동물에 의해 발생하는 산림형 전파는 여전히 유지되고 있다.
한편, 이러한 광견병을 예방하기 위한 백신들은 단백질의 접힘(folding), 당화과정(glycosylation) 등의 문제로 인하여 박테리아를 이용하지 못하고, 주로 동물 세포를 이용하여 생산되고 있다. 그러나 동물 세포를 이용한 백신 생산 방법은 대량 생산을 위한 설비 확충에 큰 비용이 소요되기 때문에 제조가 용이하지 않고, 백신의 가격이 고가인 경우가 대부분이다. 또한, 동물 세포를 이용하여 제조된 비활성 광견병 바이러스 백신들은 저장이 용이하지 않을 뿐만 아니라, 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 높다는 단점을 가지고 있다. 그러나 식물의 경우에는 동물 세포와 달리 동물에게 감염 가능한 바이러스에 오염될 가능성이 매우 낮고, 경작 면적만 확보되면 언제든지 대량 생산이 가능할 뿐만 아니라, 식물체를 통하여 장기 보관이 가능하기 때문에, 안정적으로 저렴한 백신의 생산이 가능할 것으로 기대된다(대한민국 공개특허 10-2013-0111581).
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로, 식물체를 이용하여 효율적인 생산이 가능할 뿐만 아니라, 높은 면역원성 및 바이러스 중화능을 나타내는 재조합 광견병 바이러스 당단백질, 이를 포함하는 백신 조성물, 상기 당단백질의 제조 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 광견병 바이러스 당단백질을 제공한다. 상기 광견병 바이러스 당단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 기능성 동등물도 본 발명의 권리범위에 포함되며, 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 아미노산 서열과 적어도 60 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로서, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미하며, 식물체를 이용하여 안정적으로 생산될 수 있는 광견병 바이러스 당단백질의 아미노산 서열이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 광견병 바이러스 당단백질을 유효성분으로 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 및 광견병 예방용 사료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 광견병 바이러스 당단백질을 개체에 투여함으로써 광견병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 광견병 바이러스 당단백질의 광견병 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 광견병 바이러스 당단백질 발현용 벡터를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 벡터는 프로모터 유전자 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 순서로 작동가능하도록 순차적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 등이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 BiP(Chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 유전자, 4 개 이상의 연속된 히스티딘을 코딩하는 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 바람직하게는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 광견병 바이러스 당단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 광견병 바이러스 당단백질의 생산 방법을 제공한다. 상기 형질전환체는 바람직하게는 세포 자체, 식물체, 또는 세포를 포함하는 배양물일 수 있으며, 상기 배양액은 바람직하게는 세포를 배양한 후, 세포를 제거한 배양액일 수 있으나, 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 당단백질을 포함하고 있다면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 광견병 바이러스 당단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 용해성을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하기 때문에 저렴한 비용으로 광견병 바이러스 당단백질의 대량 생산을 가능하게 할 수 있기 때문에, 광견병 바이러스 당단백질이 사용되는 다양한 분야에 폭넓게 사용가능할 것으로 기대된다. 또한, 체내에서 현저한 면역원성 및 바이러스 중화능을 나타내므로 신규한 광견병 백신 조성물로도 사용가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 발현을 위한 유전자의 배열을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 용해성을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 광견병 바이러스 당단백질을 분리 및 정제한 후, SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 당화 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 광견병 바이러스의 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 광견병 바이러스 당단백질 유전자를 이용하면, 식물체에서도 높은 면역원성 및 중화능을 가지는 광견병 바이러스 당단백질을 효율적으로 생산 및 분리가 가능하다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 광견병 바이러스 당단백질은 안정적이고 효율적인 대량 생산이 가능하기 때문에, 저렴하며 안정적인 광견병 백신을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
본 명세서에 있어서, “항원(antigen)”이란 체내에서 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 총칭하며, 바람직하게는 바이러스, 화합물질, 세균, 꽃가루, 암세포, 새우 등 또는 이들의 일부 펩타이드 또는 단백질이나, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “광견병 바이러스(rabies virus)”는 Rhabdoviridae 중에서 가장 잘 알려진 병원체로서 Lyssavirus 속에 속하며, Rhabdoviridae의 유전체는 약 11 내지 15 kb의 비분절(non-segment) 음성 단일가닥 RNA로 이루어져 있으며, 5 개의 유전자가 3'-N(nucleoprotein)-P(phosphoprotein)-M(matrix protein)-G(glycoprotein)-L(polymerase)-5'의 순서로 구성되어 있다. 광견병 바이러스는 총알 모양의 외피막을 가지고 있으며, 상기 외피막 부분은 당단백질(glycoprotein; G) 및 매트릭스 단백질(matrix protein; M)을 포함한 이중층의 지질막으로 구성된다. 상기 당단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시된다. 또한, 본 발명의 당단백질은 서열번호 1의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "백신(vaccine)"이란 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “발현용 벡터(expression vector)”란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 돼지의 Fc 단편이 융합된 목적 항원을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, "복제 단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 단백질의 합성량을 증가시키기 위한 M17의 5' UTR 부위 유전자, 목적 단백질을 소포체로 이동시키기 위한 BiP 유전자, 단백질이 소포체 내에서 안정적으로 유지될 수 있도록 단백질의 분해를 최소화하기 위한 HDEL 유전자 등을 추가로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 재조합 단백질을 용이하게 분리하기 위한 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 태그용 유전자는 일례로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그,VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있으며, 상기 선별용 마커 유전자에는 일례로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 일례로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 일례로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이나, 상기 예는 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “형질전환(transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체(transgenic organism)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아크로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다. 상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
본 명세서에 있어서, “용해성(solubility)”이란 목적 단백질 또는 펩타이드가 인체에 투여하기 적합한 용매에 용해될 수 있는 정도를 의미한다. 구체적으로는 특정 온도에서 주어진 용매에 대하여 용질이 포화된 정도를 나타내는 것일 수 있다. 용해성은 용질의 포화 농도를 결정함으로써 측정할 수 있으며, 예컨대 용매에 용질을 과량으로 첨가하고 이를 교반하고 여과한 다음, 농도를 UV 분광기 또는 HPLC 등을 사용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 높은 용해성은 재조합 단백질의 분리정제에 유리하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 장점을 가진다.
본 명세서에 있어서, “예방(prevention)”이란 본 발명에 따른 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 투여에 의해 광견병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에 있어서, “개체(individual)”란 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 당단백질이 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.
본 발명의 “백신 조성물”은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 또한, 추가로 기존에 알려져 있는 “면역항원보강제(adjuvant)”를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보강제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약학적 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역 보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 재조합 단백질의 멸균용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000 ㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎍을 함유한다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “면역항원보강제(adjuvant)”란 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭한다.
본 발명의 “사료 조성물”은 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 당단백질을 포함하는 사료로서, 상기 사료로는 돼지고기, 소고기, 닭고기 등의 부산물을 비롯하여, 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시 리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료라면 제한이 없다. 이러한 사료에 본 발명의 재조합 광견변 바이러스 당단백질을 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 재조합 광견병 바이러스 당단백질 발현용 벡터 제조
식물체에서 재조합 광견병 바이러스 당단백질(Rabies virus glycoprotein; RVGe)을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 제조하기 위하여, 일차적으로 광견병 바이러스 당단백질의 공개되어 있는 유전자 서열들을 확보한 후에 식물체에서 단백질의 발현을 최적화할 수 있도록 연구한 결과, 서열번호 1의 광견병 바이러스 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 획득하였다. 그리고 pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 BiP(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 3), 광견병 바이러스 당단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 1), 6개의 연속된 히스티딘(Histidin)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 5)를 순서대로 클로닝하여 재조합 광견병 바이러스 당단백질 발현용 벡터를 제작하였다.
실시예 2: 재조합 광견병 바이러스 당단백질 발현 확인
실시예 1과 동일한 방법으로 제작된 벡터의 재조합 단백질 발현을 확인하기 위하여, 형질전환된 아그로박테리움 튜머패시언스(Agrobacterium tumefaciens)를 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 잎에 접종하는 일과성 발현(transient expression) 실험을 실시하였다. 보다 자세하게는, 재조합 광견병 바이러스 당단백질 발현용 벡터를 전기충격법(electrophoration)을 이용하여 아그로박테리아 LBA4404에 형질전환시켰다. 형질전환된 아그로박테리아는 5 mL의 YEP 액체 배지(효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 및 리팜피신 25 mg/L)에 접종한 후에, 28 ℃의 조건에서 16 시간 동안 진탕 배양(shaking incubation)하였다. 그리고 배양액 1 mL을 다시 50 mL의 새로운 YEP 배지에 접종하여 28 ℃의 조건에서 6 시간 동안 다시 진탕 배양한 후에, 획득된 배양액 50 mL을 4 ℃에서 7,000 rpm으로 5 분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그리고 획득된 균체를 인필트레이션 버퍼(Infiltration buffer: 10 mM MES(pH 5.7), 10 mM MgCl 2, 및 200 μM 아세토시링곤)에 OD600 nm = 1.0이 되도록 현탁시키고, 현탁된 아그로박테리아는 주사 바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 실시하였다.
그리고 재조합 광견병 바이러스 단백질이 발현된 니코티아나 벤타미아나 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심분리하여, 수용액 분획에 포함되어 있는 재조합 단백질(S)과 펠릿(pellet) 분획에 포함되어 있는 재조합 단백질(P)을 획득하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 단백질 추출 시에는 0.1 % Triton X-100, 20 mM의 Imidazole(pH 7.5) 및 300 mM의 NaCl이 첨가된 20 mM Sodium phosphate(pH 7.3) 용액을 사용하였다. 웨스턴 블롯팅을 위하여, 획득된 각각의 단백질 분획 30 μL를 SDS 시료 버퍼(sample buffer)와 혼합한 후에 가열하고, 10 % SDS-PAGE gel에 전기영동하여 크기별로 단백질을 분리하고, 분리된 단백질은 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5 % 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 후에, 6개의 His와 반응하는 항체와 결합시키고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 광견병 바이러스 당단백질을 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 발현된 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 대부분은 수용성 분획(S)에서 확인되었으며 소량의 재조합 광견병 바이러스 당단백질만이 펠릿 분획(P)에서 관찰되었다. 상기 결과를 통하여, 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 당단백질 발현용 벡터는 식물체에서 재조합 광견병 바이러스 당단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있으며, 상기 벡터를 이용하여 제조된 재조합 광견병 바이러스 당단백질은 높은 용해성(solubility)을 가지고 있기 때문에, 분리정제가 용이하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 분리 및 정제
실시예 2와 동일한 방법으로 획득된 니코티아나 벤타미아 40 g에 단백질 추출 용액(50 mM sodium phosphate(pH 8.0), 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole, 0.1 % Triton X-100, 및 1X 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitor)) 200 mL을 첨가하고 블랜더로 조직을 파쇄한 후에 4 ℃에서 13,000 rpm으로 20 분간 원심분리하여 단백질 추출액을 획득하였다. 그리고 단백질 추출액으로부터 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 분리 및 정제를 위하여, Ni-NTA 아가로스 레진이 충진된 컬럼을 이용하여 친화크로마토그래피를 실시하였다. 보다 자세하게는, 컬럼에 레진 5 mL을 충진시킨 후에 세척 용액(washing buffer: 50 mM sodium phosphate(pH 8.0), 300 mM NaCl, 및 20 mM Imidazole) 50 mL을 이용하여 평형화시켰다. 평형화된 컬럼에 단백질 추출액을 주입하고, 세척 용액 100 mL을 이용하여 결합되지 않은 단백질들을 제거한 후에, 용출 용액(elution buffer: 50 mM sodium phosphate(pH 8.0), 300 mM NaCl, 및 300 mM Imidazole)을 이용하여 재조합 광견병 바이러스 당단백질을 용출하였다. 그리고 용출된 용액은 30 kD 크기의 필터를 사용하여 인산염완충용액(phosphate buffered saline; PBS)으로 교체하며, 단백질을 농축시켜 재조합 광견병 바이러스 당단백질을 획득하였다. 획득된 단백질은 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 및 쿠마시 염색법(coomassie staining)을 통해 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 약 51 Kd의 크기를 가진 재조합 광견병 바이러스당단백질이 정제된 것을 확인하였다.
실시예 4: 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 당화 여부 확인
실시예 3과 동일한 방법으로 획득된 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 당화 여부를 확인하기 위하여, 엔도 H 글라이코시데이즈 N-당화 제거 분석을 실시하였다. 보다 자세하게는, 재조합 광견병 바이러스 당단백질 1 μg에 10X 변성 버퍼(denaturation buffer: 5 % SDS 및 0.4 M DTT)를 첨가한 후에 100 ℃에서 10 분간 가열하고, 재조합 단백질의 최종 농도가 50 mM이 되도록 sodium citrate 버퍼(pH 5.5)를 첨가하였다. 그리고 50 U의 엔도 H 글라이코시데이즈를 첨가하고 37℃ 에서 1 시간 동안 반응시켰다. 대조군으로는 엔도 H 글라이코시데이즈 대신 동량의 증류수를 첨가하고 실험을 진행하였다. 반응이 종료된 후에는 실시예 2와 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하여 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 N-당화 제거에 따른 분자량 변화를 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 엔도 H 글라이코시데이즈에 의하여 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 분자량이 감소되는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 식물체를 이용하여 획득된 재조합 광견병 바이러스 당단백질은 정상적으로 N-당화되었다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 면역원성 확인 실험
실시예 3과 동일한 방법으로 획득된 재조합 광견병 바이러스 당단백질이 항원으로서 생체 내에서 항체를 유도하여 면역원성을 가지는지 확인하기 위하여, 6주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 이용하여 실험을 진행하였다. 보다 자세하게는, 실험군 마우스에 재조합 광견병 바이러스 당단백질 10 μg을 2 회(6 주령 및 8 주령) 투여하였고, 음성 대조군 마우스에는 인산염완충용액을 투여하였다. 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 투여 시에는 동량의 프로인트 면역항원보강제(Freund's adjuvant)를 혼합하여 투여하였고, 1 차에는 완전 보조제(complete adjuvant)를, 2 차에는 불완전 보조제(incomplete adjuvant)를 투여하였다. 재조합 광견병 바이러스 당단백질을 2 회 투여하고 이주일 후에 채혈하여 재조합 광견병 바이러스 당단백질이 코팅된 엘라이자(ELISA) 플레이트를 이용하여 투여 항원에 대한 특이항체의 생성 여부를 확인하였다. 음성 대조군(CT) 4 마리와 실험군(RVGe) 5 마리를 이용하여 실험을 진행하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 재조합 광견병 바이러스 당단백질을 투여하기 전의 혈청 시료(pre)와 음성 대조군의 인산염완충용액 투여 후의 혈청 시료(post)에서는 반응성이 전혀 관찰되지 않았으나, 재조합 광견병 바이러스 당단백질 투여 후의 혈청 시료에서는 높은 반응성을 나타내는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 당단백질이 항원으로 작용하여, 효과적으로 항체를 생성할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 재조합 광견병 바이러스 당단백질의 바이러스 중화능 확인 실험
실시예 5와 동일한 방법으로 획득된 혈청을 이용하여, 본 발명의 광견병 바이러스 당단백질 투여를 통해 형성된 항체가 광견병 바이러스 중화능을 가지는지 확인하였다. 보다 자세하게는, 96 웰 플레이트(well plate)에 각 시료(sample) 당 네 개의 웰에 DMEM 배지를 100 μL씩 분주한 후에, 희석할 혈청을 첫 번째 웰에 각각 50 μL씩 첨가하였다. 그리고 배지가 분주되어 있는 나머지 세 개의 웰을 이용하여 3 배 계단희석(serial dilution)을 실시하였다. 혈청 희석이 완료된 마지막 웰에 100 TCID(tissue culture infectious dose) 50 /μL의 농도로 희석된 표준고정주 바이러스(CVS11)를 각각 50 μL씩 첨가하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후에, 10 % 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 4 X 10 5 cells/mL의 농도로 희석한 BHK/T7 세포를 각 웰에 50 μL씩 접종하고 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하며 바이러스를 감염시켰다. 그리고 감염시킨 세포를 형광 현미경으로 관찰하기 위하여, 배양액을 제거하고 80 % 아세톤을 이용하여 세포를 고정시킨 후에 형광이 결합되어있는 광견병 특이 항체를 이용하여 형광 염색을 실시하였다. 중화능 확인을 위한 시료는 표준양성혈청으로는 0.5 IU(International units)/mL의 농도로 희석된 OIE 표준 개혈청을 이용하였고, 항체음성혈청으로는 음성 대조군 혈청을 이용하였고, 그 외의 실험용 혈청은 비동화하여 준비하였다. 각 시료의 항체가는 형광 현미경을 이용하여 획득된 형광 이미지를 ImageJ 프로그램을 이용하여 형광값을 정량화한 후에, 표준양성혈청 결과를 이용하여 각 시료의 항체가를 계산하였다. 중화항체가는 0.5 IU/mL 이상은 양성으로, 0.5 IU/mL 미만이면 음성으로 판정하였다. 그 결과는 표 1에 나타내었다.
항원 개체번호 중화항체가
RVGe 1 4.56 IU/ml
2 1.51 IU/ml
3 13.77 IU/ml
4 0.87 IU/ml
5 23.93 IU/ml
음성 > 0.5 IU/ml
표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 당단백질을 2회 투여한 실험군 개체 모두에서 높은 역가의 바이러스 중화능을 나타내는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 재조합 광견병 바이러스 당단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 용해성을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하고, 단백질의 활성 또한 안정적으로 유지될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 체내에서 항원으로 작용하여 높은 면역원성 및 바이러스 중화능을 나타내므로 신규한 광견병 백신 조성물로 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
이하 본 발명의 약학적 조성물 및 사료 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 조성물의 제조
1.1. 산제의 제조
재조합 광견병 바이러스 당단백질 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1.2. 정제의 제조
재조합 광견병 바이러스 당단백질 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1.3. 캡슐제의 제조
재조합 광견병 바이러스 당단백질 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1.4. 주사제의 제조
재조합 광견병 바이러스 당단백질 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2,974 mg
Na 2HPO 42H 2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1.5. 액제의 제조
재조합 광견병 바이러스 당단백질 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적정량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음, 정제수를 가하여 전체를 100 mL로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 2. 사료 조성물의 제조
재조합 광견병 바이러스 당단백질 100 mg
비타민 E 0.7 mg
L-카르니틴 0.7 mg
통상의 사료 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하여 사료를 제조한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 광견병 바이러스 당단백질, 상기 당단백질을 생산하기 위한 발현용 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 당단백질을 유효성분으로 포함하는 광견병 예방용 백신 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명의 광견병 바이러스 당단백질은 식물체에서도 효과적으로 발현될 뿐만 아니라, 높은 용해성을 가지고 있어 분리 및 정제가 용이하기 때문에 저렴한 비용으로 광견병 바이러스 당단백질의 대량 생산을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 광견병 바이러스 당단백질.
  2. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 광견병 바이러스 당단백질을 유효성분으로 포함하는, 광견병 예방용 백신 조성물.
  3. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 광견병 바이러스 당단백질을 유효성분으로 포함하는, 광견병 예방용 사료 조성물.
  4. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 광견병 바이러스 당단백질을 개체에 투여함으로써 광견병을 예방 또는 치료하는 방법.
  5. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 광견병 바이러스 당단백질 발현용 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 벡터는 BiP(Chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 벡터는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환된, 형질전환체.
  9. (a) 제 8 항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 광견병 바이러스 당단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 광견병 바이러스 당단백질의 생산 방법.
  10. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 광견병 바이러스 당단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 광견병 예방 또는 치료 용도.
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