JP2001289859A - 多発性硬化症の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液試料中のヒトメダラシン量を正確に
測定し、その測定値を用いることにより多発性硬化症を
診断する簡便な多発性硬化症の診断方法を提供する。 【解決手段】 ヒト血液試料中のヒトメダラシン量を免
疫学的方法を用いて特異的にかつ高感度に測定し、その
測定値の大小及び／又は増減により多発性硬化症の発症
及び／又は病勢を検出する簡便な多発性硬化症の診断方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、多発性硬化症の診
断方法に関するものであり、更に詳しくは、血液中のヒ
トメダラシン量から多発性硬化症を簡便に診断する方法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】セリンプロテアーゼの一種であるメダラ
シンは顆粒球等に存在し、炎症、特に慢性炎症の発現を
含めて広く生体防御機構において重要な役割を演じてい
ると考えられる。顆粒球メダラシンは多くの慢性炎症性
疾患の増悪期で増大し、寛解期で正常化するが、多発性
硬化症の患者では増悪する数日前に著増し、寛解に先行
して正常化することが認められている。多発性硬化症
は、中枢神経系の白質に限局性の脱髄巣とグリオーシス
の出現を特徴とし、寛解と悪化を繰り返しながら進行
し、多くは、10〜15年の経過で死亡すると云う慢性炎症
性の難病であり、原因については、未だはっきりとは解
明されていないが、ウィルスや細菌が免疫系を刺激して
抗体が自らの神経組織を攻撃する自己免疫疾患の一種で
はないかと考えられている。また、その診断法はなかな
か難しく、核磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）や骨髄液の検査
等によって行なわれているのが現状であるが、ＭＲＩは
非常に大がかりな装置を用い、測定操作も熟練を要し、
経費もかかる方法であり、骨髄液を検査する方法は患者
に大きな苦痛を与える等の問題点があり、簡便な検査で
病気の診断、病勢の把握、予後の推定等が行なえる方法
が種々模索され、血液中の顆粒球メダラシン量による診
断の可能性が提唱されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、血液中
のメダラシン量で多発性硬化症が診断できるか否かにつ
いては、相当量の臨床データを検証して判断することが
必要であるが、今までにはそのようなデータは存在せ
ず、また、血液中の顆粒球メダラシン量の測定値はバラ
ツキが大きく正確な測定値が得にくいことから正しい診
断が行い難く、血液中のメダラシン量で多発性硬化症が
診断できるか否かについては確証がないのが実状であっ
た。本発明は上記事情に鑑みなされたもので、血液中の
メダラシン量を正確に測定し、その測定値の大小及び／
又は増減により多発性硬化症の診断を行う簡便な方法を
提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究を行なった結果、ヒト血液試
料中のヒトメダラシン量を測定し、その測定値の大小及
び増減が多発性硬化症の発症及びその病勢等と密接に関
係していることを見い出し、これらの知見に基づいて本
発明の完成に到達したものである。

【０００５】従って、本発明の第一は、ヒト血液試料中
のヒトメダラシン量を免疫学的方法を用いて正確に測定
し、その測定値の大小及び／又は増減により多発性硬化
症の発症及び／又は病勢を診断することを特徴とする多
発性硬化症の診断方法に関するものである。

【０００６】また、本発明の第二は、ヒト血液試料を浸
透圧が 250mOsm/kg・H₂O より低い水性液体又は 310mOsm
/kg・H₂O より高い水性液体で処理して白血球を完全に破
壊した後に、抗ヒトメダラシン抗体を用いてヒトメダラ
シンを測定し、その測定値の大小及び／又はその増減に
より多発性硬化症の発症及び／又は病勢を診断すること
を特徴とする多発性硬化症の診断方法に関するものであ
る。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明について更に詳しく
説明する。本発明の多発性硬化症の診断方法に用いられ
るヒト血液試料中のヒトメダラシンの大部分は、血液中
に存在する白血球成分の一つである顆粒球の内部に存在
しているので、顆粒球を完全に破壊してヒトメダラシン
を全て細胞外に放出させてから測定することが正確な測
定値を得るための必須要件である。従って、この必須要
件が完全に満たされない場合には測定値はバラツキが大
きく、再現性の乏しいデータしか得られない。

【０００８】血液試料中の顆粒球を完全に破壊する方法
としては、血液と異なる浸透圧を有する水性液体で処理
する方法が最も簡便で実用的である。ヒト血液の浸透圧
は約280〜290mOsm/kg・H₂O の範囲にあるので、250〜310
mOsm/kg・H₂O の範囲の水性液体では血液中に存在する顆
粒球を完全に破壊することは難しい。従って、ヒト血液
中の顆粒球の完全な破壊は浸透圧が 250mOsm/kg・H₂O よ
り低い水性液体、又は310mOsm/kg・H₂O より高い水性液
体で血液を稀釈することで達成することができる。この
ような水性液体としては、水混和性有機溶媒を含んでい
てもよい精製水、無機酸塩、有機酸塩、糖類、糖アルコ
ール類、アミノ酸類、及び蛋白質等の水溶性物質からな
る溶質の濃度が非常に高い水溶液、又はこれらの溶質の
濃度が非常に低い水溶液等の水性液体であり、顆粒球を
完全に破壊し得る浸透圧を有する水溶液及び緩衝液など
を用いることができる。また、該水性液体の使用量は、
血液試料に対して容積単位で50〜10万倍、好ましくは10
0〜1万倍、特に好ましくは500〜2千倍である。

【０００９】このようにして得られた顆粒球を完全に破
壊したヒト血液試料の水性稀釈液を試料とするヒトメダ
ラシンの免疫学的測定方法は、測定試料を、標識化した
抗原又は抗体の存在下に抗ヒトメダラシン抗体と接触さ
せ、抗原抗体反応により標識化免疫複合体として捕捉す
る免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中
に存在する標識物質を用いて測定する検出段階とからな
る。免疫反応段階における抗原抗体反応の方法は任意で
あるが例えば、次に掲げる方法を非限定的に用いること
ができる。

【００１０】不溶性担体に結合した抗体に試料中の測
定すべき抗原を捕捉させた後に標識抗体を反応させるサ
ンドイッチ法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、更にこの抗体に対する標識した第
二抗体を反応させる二抗体法、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる
競合法、 測定すべき抗原を含有する試料にこれらと特異的に反
応する標識抗体を作用させて凝集沈殿させた後、遠心分
離により分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝
集沈殿法、及び ビオチン標識抗体に標識アビジンを反応させるビオチ
ン−アビジン法等。

【００１１】本発明の多発性硬化症の診断方法に有用な
メダラシンの免疫学的測定において不溶性担体を用いる
場合には、不溶性担体としては、例えば、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポ
リアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、
ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、
金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられ
る。また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ
状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイク
ロプレート、試験管等の種々の形状で用いることができ
る。更に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化
方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオ
ン結合法等を用いることができる。

【００１２】尚、本発明におけるメダラシンの免疫学的
測定のために用いられる抗体類の免疫グロブリンクラス
は任意であるが、IgG クラスの抗体が好適に用いられ
る。また、抗体はモノクローナル抗体及びポリクローナ
ル抗体のいずれを使用することも可能であるが、モノク
ローナル抗体が好ましい。また、それらの形態としては
全抗体又は F(ab')₂、Fab 等の断片を用いることができ
る。抗体の起源は任意であり、特に限定されるものでは
ないが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来す
る抗体が好適に用いられる。

【００１３】次いで、このようにして捕捉されたヒトメ
ダラシンの標識化免疫複合体を検出段階で測定するため
の標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放
射性物質等を使用するのが好適である。酵素としては、
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ等、蛍光物質としては、フルオレッセ
インイソシアネート、フィコビリプロテイン等、発光物
質としては、ルミノール類、ジオキセタン類、アクリジ
ニウム塩類等、また、放射性物質としては ¹²⁵Ｉ、 ¹³¹
Ｉ、 ¹¹¹Ｉｎ、 ^99mＴｃ等を非限定的に挙げることがで
きる。標識物質が酵素である場合には、その活性を測定
するために基質、必要により発色剤、蛍光剤及び発光剤
等が用いることができる。酵素としてペルオキシダーゼ
を用いる場合には基質として過酸化水素等を用い、発色
剤として2,2'−アジノジ[3−エチルベンズチアゾリンス
ルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、 5−アミノサ
リチル酸、ｏ−フェニレンジアミン、 4−アミノアンチ
ピリン、 3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン等、蛍光
剤としては 4−ヒドロキシフェニル酢酸、 3−(4−ヒド
ロキシフェニル）プロピオン酸等、発光剤としてはルミ
ノール類、ルシゲニン電荷移動錯体等、酵素としてアル
カリホスファターゼを用いる場合には、基質として 4−
ニトロフェニルホスフェート、 4−メチルウムベリフェ
リルホスフェート、コルチゾール−21−ホスフェート
等、酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合
には、 2−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、 4
−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド、 3
−（2'−スピロアダマンタン）−4−メトキシ− 4(3''
−β−Ｄ−ガラクトシルオキシフェニル）−1,2 −ジオ
キセタン（ＡＭＰＧＤ）等を用いることができる。

【００１４】本発明の多発性硬化症の診断方法において
ヒトメダラシンの免疫学的測定に使用することができる
ポリクローナル抗体は、従来公知の方法でヒトメダラシ
ンを抗原として動物に免疫して得られる抗ヒトメダラシ
ン抗血清の抗体成分として分離精製されたものが好まし
い。なかでも例えば、山羊抗ヒトメダラシン−ポリクロ
ーナル抗体、兎抗ヒトメダラシン−ポリクローナル抗体
等が好適に用いられる。また、本発明に使用することが
できるモノクローナル抗体及びその製造方法について
は、先に出願された特開平11−151085号公報に詳細に説
明されている。

【００１５】即ち、多発性硬化症の診断に有用なヒトメ
ダラシンの免疫学的測定に使用することのできる抗ヒト
メダラシンモノクローナル抗体は、健常人血液から分離
した顆粒球より抽出したヒトメダラシンで免疫した動物
から採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融
合により調製されるハイブリドーマを培地上で培養する
か、又は動物腹腔内に投与して腹水内で増殖させた後、
該培養物又は腹水から採取することにより製造すること
ができる。

【００１６】抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマは、抗原としてメダラシンを用い
て免疫した動物から採取した抗体産生細胞をミエローマ
細胞と融合させることにより得られるハイブリドーマを
選択的に増殖させ、該ハイブリドーマから検索しクロー
ニングにより製造することができる。

【００１７】上記の抗体産生細胞としては、例えばヒト
メダラシン又はこれを含有する組成物又は細胞を投与し
て免疫した動物から得られる脾臓細胞、リンパ節細胞、
Ｂ−リンパ球等が挙げられる。免疫する動物としてはマ
ウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げら
れる。免疫は、例えばヒトメダラシンをそのまま又は適
当なアジュバントと共に動物の皮下、筋肉内又は腹腔内
に約 1μg〜1mg／回を1〜2回／月、1〜6ケ月間投与する
ことにより行なわれる。抗体産生細胞の分離は、最終免
疫から 2〜4日後に免疫動物から採取することにより行
なわれる。ミエローマ細胞としては、マウス、ラット由
来のもの等を使用することができる。抗体産生細胞とミ
エローマ細胞とは同種動物由来であることが好ましい。

【００１８】細胞融合の方法は任意であるが、例えばダ
ルコッペ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地中で抗
体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコー
ル等の融合促進剤の存在で混合することにより行なうこ
とができる。細胞融合終了後、ＤＭＥＭ等で適当に希釈
し、遠心分離し、沈殿をＨＡＴ培地等の選択培地に懸濁
して培養することによりハイブリドーマを選択する。次
いで、培養上清を用いて酵素抗体法により抗体産生ハイ
ブリドーマを検索し、限界希釈法等によりクローニング
を行ない、抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを得ることができる。

【００１９】このようにして得られた抗体産生ハイブリ
ドーマを培地中又は生体内で培養しモノクローナル抗体
を培養物から採取する。モノクローナル抗体を大量に製
造するには、該ハイブリドーマをミエローマ細胞の由来
細胞と同種の動物の腹腔内に投与し、その腹水中にモノ
クローナル抗体を蓄積させ、腹水から採取する方法を採
ればよい。

【００２０】培養物又は腹水からのモノクローナル抗体
の分離は、IgG 精製に通常使用される硫安分画法、陰イ
オン交換体又はプロテインＡ、Ｇ等のカラムによるクロ
マトグラフィーによって行なうことができる。このよう
にして得られた抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体
は、これを産生するハイブリドーマの種類により3F03、
3G03、2E04、及び1G12の４種類存在する。これらのモノ
クローナル抗体は、いずれもグロブリンクラスは IgG
で、サブクラスは IgG₁ であり、いずれの抗体も抗原で
あるヒトメダラシンと特異的に反応し、多発性硬化症の
診断のためのヒトメダラシンの免疫学的測定には有用で
ある。

【００２１】本発明の多発性硬化症の診断方法として
は、測定された血液試料中のヒトメダラシン濃度、及び
同じ血液試料を用いて測定した血液試料中の顆粒球数か
ら10⁸個の顆粒球中のヒトメダラシン量を算出し、その
値のカット・オフ値（健常人の平均値±２ＳＤ（標準偏
差））との大小を比較して多発性硬化症の発症を判断す
るか、又は経時測定の値の増減を比較して病勢の経時変
化を判断する方法等が好ましく用いられる。

【００２２】この方法により測定した多発性硬化症患者
112名のうち、85名のメダラシン値がカット・オフ値以
上の陽性であり、その陽性率は75.8％と高く、対照の種
々の非炎症性神経性疾患患者80名のうち、カット・オフ
値以上の陽性者は13名でその陽性率は16.3％と低く、血
液中のヒトメダラシン値による多発性硬化症の診断は非
常に信頼性の高い診断方法であることが認められる。
尚、健常人のメダラシン値の陽性率は 0％であった(表
１及び図２参照。)。また、多発性硬化症患者のメダラ
シン値の水準の男女による差(図３参照。)及び年齢によ
る差(図４参照。)は認められないことが判った。

【００２３】

【実施例】以下、参考例と共に実施例を示し本発明を具
体的に説明する。もっとも、本発明は下記の実施例等に
より限定されるものではない。

【００２４】〔参考例１〕 精製ヒトメダラシンの調製 健常人血液 400mlに、デキストラン（分子量200,000〜3
00,000）の６％生理食塩水溶液を血液：デキストラン水
溶液＝２：１の割合で混合し、ガラス棒等で軽くかき混
ぜてから、4℃〜8℃の温度で約１時間静置した後、沈殿
した赤血球を上清と分離し、この上清を 15,000rpmで遠
心分離して沈殿を採取して白血球を得た。次に、この白
血球に1mM エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム塩（Ｅ
ＤＴＡ）、1mM ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣ
ＭＢ）を含む pH7.0の1Mリン酸カリウム緩衝液（ＰＫ
Ｂ）からなる抽出用液を加えて、撹拌下に37℃の温度で
20分間インキュベートした後、15秒間超音波破砕機にか
けて完全に細胞を破砕し、更に、37℃の温度で20分間イ
ンキュベートしてから、４℃の温度において12,000rpm
で10分間遠心分離して上清を採取し、この上清を蒸留水
に対して透析し、沈渣は上記と同様の操作を数回繰り返
して抽出を行なった。次いで、この抽出液を 50mM ＰＫ
Ｂ (pH6.0)で平衡化したＣＭ−セファロースゲルカラム
に通した後、同じ緩衝液で洗浄してから、 1M ＰＫＢ
(pH6.0)で吸着物を溶出し、溶出液を蒸留水に対して一
晩透析して脱塩してから、コロジオン膜で濃縮すること
により、精製ヒトメダラシン 1.5mgが得られた。

【００２５】〔参考例２〕 抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体の調製 (1)抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合によるハ
イブリドーマの調製 参考例１でヒト顆粒球から抽出、精製したヒトメダラシ
ンを、フロイント完全アジュバントで乳化し、７週齢の
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に50μg/匹の量で投与した。
そして、４週間後にこのマウスに初回と同様の方法で追
加免疫を行ない、７日後に血中に抗体量が増大したこと
を確認した後、更に、その７日後に最終免疫として抗原
を腹腔に50μg/匹の量で投与した。一方、20％の牛胎児
血清を添加したダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培
地中で、マウスミエローマ細胞 P3-X63-Ag8-U1（Ｐ３Ｕ
１）を維持培養しておき、最終免疫の３日後、このマウ
スから脾臓細胞を採取して、これをポリエチレングリコ
ール4000を用いてＰ３Ｕ１と細胞融合させ、96穴マイク
ロプレートに撒いた。細胞融合後、培地を100μMヒポキ
サンチン、 0.4μM アミノプテリン、16μM チミジンを
添加したＤＭＥＭ（ＨＡＴ培地）に置換して、２〜３週
間選択培養することにより脾臓細胞とミエローマ細胞と
の融合体であるハイブリドーマが得られた。

【００２６】(2)抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリ
ドーマのスクリーニング 次に、このハイブリドーマの培養液中の抗体活性を、Ｅ
ＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）でス
クリーニングした。即ち、ヒトメダラシンをＥＬＩＳＡ
用のマイクロプレートに吸着させ、pH7.4 の10mMリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に２％の牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を添加した溶液でブロッキング処理を行なっ
た後、ハイブリドーマ培養液50μl をこのマイクロプレ
ートに添加して１時間放置してから、ハイブリドーマ培
養液を除去して洗浄し、これにペルオキシダーゼ標識山
羊抗マウス IgG-Fc 特異抗体の 2μg/mlＰＢＳ溶液 100
μlを添加し、37℃で１時間反応させた。次いで、この
酵素標識抗体溶液を除去し洗浄した後、0.05％ＡＢＴＳ
及び 0.0034％過酸化水素を含む 0.1Mリン酸クエン酸緩
衝液(pH4.6) を 200μl 添加して発色させることにより
抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマを選別し
た。

【００２７】(3)抗体産生株のクローニング及びモノク
ローナル抗体の調製 この抗ヒトメダラシン抗体産生性ハイブリドーマ培養液
を採取し、限界希釈法によるクローニングを行なって最
終的に単一クローンのハイブリドーマ４種類を得た。こ
のハイブリドーマを、夫々、プリスタン投与ＢＡＬＢ／
Ｃマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクローナル抗
体を含む腹水を得た。次いで、得られた腹水に50％飽和
硫安を加えて抗体を沈殿させ、この沈殿を分離してＰＢ
Ｓに溶解させ、3M NaCl 含有50mMトリス−塩酸緩衝液
(pH7.8)に対して透析してから、プロテインＡ−セファ
ロースＣＬ４Ｂカラム（ファルマシア社製）にかけた
後、吸着した抗体を0.1Mグリシン−塩酸緩衝液 (pH5.0)
で溶出し中和して精製することにより3F03、3GO3、2E0
4、及び1G12からなる４種類のモノクローナル抗体を得
た。

【００２８】(4)モノクローナル抗体の性質 〔ウェスタンブロッティング法〕モノクローナル抗体に
特異的な抗原をウェスタンブロッティング（Westernblo
tting ）法を用いて固定した。先ず、ヒト顆粒球由来メ
ダラシンをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけた後、電解液バッファーに25mMグリシン及び20％メ
タノールを含む溶液を用い、電圧傾斜が７Ｖ／cm、２時
間の条件でスラブゲルから蛋白をニトロセルロースシー
トへ移した。次に、ニトロセルロースシートの各レーン
を切り離し、一方のシートをアミドブラックで蛋白染色
し、他方は次の様な酵素免疫アッセイを行なった。即
ち、２％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング処理した後、１
次抗体としてマウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗
体を加え、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識山羊抗
マウス IgG-Fc 特異抗体を加えて反応させ、洗浄してか
ら、0.04％ 3,3'-ジアミノベンジジン及び0.0034％過酸
化水素を含むＰＢＳからなる基質溶液を加えて発色させ
ることにより、４種のマウス抗ヒトメダラシンモノクロ
ーナル抗体は、ヒト顆粒球由来メダラシンを認識するこ
とが確認された。

【００２９】〔インヒビション・アッセイ法〕ＥＬＩＳ
Ａ用マイクロプレートに固定したヒトメダラシンに対し
て、ビオチン化した第一の抗体と非標識の第二の抗体を
共存させて反応させた後、アビジン化ペルオキシダーゼ
を反応させ、次いで、このペルオキシダーゼを基質溶液
の添加により発色させてビオチン化抗体の反応量を測定
するインヒビション・アッセイ（Inhibition assay）法
により、いずれの２つの組み合わせにおいてもビオチン
化抗体の反応量に変化がないことより、４種のモノクロ
ーナル抗体はいずれも互いに異なるエピトープ（抗原部
位）を認識することが確認された。

【００３０】〔実施例１〕 ヒトメダラシン測定用検量線の作成 (1) モノクローナル抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径 6mm）をよく洗浄してか
ら、マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F0
3）10μg/mlを含むＰＢＳ(pH7.4) 溶液中に４℃の温度
で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ水溶
液に４℃の温度で１昼夜放置してブロッキング処理を施
すことによりモノクローナル抗体固定化ビーズが得られ
た。

【００３１】(2) ペルオキシダーゼ標識モノクローナル
抗体の調製 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（2E04)1.0
mg/ml を含むＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息
香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の 10m
g/mlの濃度のジメチルホルムアミド溶液0.1ml を添加
し、25℃の温度で30分間反応させる。次いで、この反応
混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラムを用
い、0.1Mリン酸緩衝液（pH 6.O）でゲル濾過を行ない、
マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分
離した。一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラデ
ィッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の1.0mg/mlのＰ
ＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル− 3−(2−ピリジル
チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の 10mg/mlの濃度の
エタノール溶液を添加し、25℃の温度で30分間反応させ
る。次いで、この反応混合液をセファデックスＧ−25を
充填したカラムを用い、10mM酢酸緩衝液(pH4.5）でゲル
濾過して精製、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有す
る画分を採取し、これをコロジオンバック中において氷
冷下に約10倍に濃縮する。次に、これに0.1Mジチオスレ
イトールを含有する0.1M酢酸緩衝生理食塩水(pH 4.5)1m
l を添加して、25℃の温度で30分間撹拌してＨＲＰ分子
中に導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、こ
の反応混合液をセファデックスＧ−25を充填したカラム
を用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分
が得られた。次に、マレイミド化モノクローナル抗体と
チオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用い
て氷冷下に4mg/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、 4℃で一昼
夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ44（SEPRACOR社）を
充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ
酵素標識モノクローナル抗体が得られた。

【００３２】(3) ヒトメダラシンのサンドイッチ酵素免
疫測定方法 マウス抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体（3F03）を
固定化したビーズ各１個と、精製したヒトメダラシン
（標準物質）0,1,10,100,200ng/ml の濃度で含有する 2
％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液 50μlと2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ
溶液 350μlとを加え37℃の温度で30分間インキュベー
トし、次いで試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食
塩水で洗浄してからＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシン
モノクローナル抗体（2E04) を0.2μg/ml の濃度で含有
する 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液400μlを試験管に充填し
て37℃の温度で30分間インキュベートした。次に、試験
管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で洗浄してか
ら、0.05％ＡＢＴＳ、及び0.0034％過酸化水素を含む0.
1Mリン酸クエン酸緩衝液(pH4.6）を 400μl ずつ各試験
管内に加え、37℃の温度で30分間インキュベートした
後、反応停止剤として0.1Nシュウ酸水溶液を１mlずつ加
えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液を分光光
度計を用いて 420nmの波長の吸光度を測定し、これを標
準物質濃度に対してプロットすることにより、図１に示
されるような濃度依存性の良い検量線が得られた。

【００３３】〔実施例２〕 血液試料中のヒトメダラシン値の算出及び疾患の診断 健常人、多発性硬化症患者及び非炎症性神経性疾患患者
の血液をそれぞれ採取して凍結保存した試料を室温に戻
して融解させ、その10μl を採取して精製水（浸透圧＝
0mOsm/kg・H₂O)2ml中に加えボルテックスミキサーを用い
て十分混合して検体溶液とした後、その10μl を試験管
に添加し、これに 2％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(pH7.4)390μl
を加えて希釈した。次に、この試験管にマウス抗ヒトメ
ダラシンモノクローナル抗体（3F03）を固定化したビー
ズ各１個を加え37℃の温度で30分間インキュベートし、
次いで試験管内の溶液を吸引除去した後、生理食塩水で
洗浄してからＨＲＰ標識マウス抗ヒトメダラシンモノク
ローナル抗体(2E04) 0.2μg/mlの濃度で含有する 2％Ｂ
ＳＡ含有ＰＢＳ溶液 400μl を試験管に充填して37℃の
温度で30分間インキュベートした。次に、前述の検量線
を作成する場合と全く同じ操作により、洗浄、酵素反応
及び反応停止を行なった後、分光光度計を用いて 420nm
の波長の吸光度を測定し、検量線よりヒトメダラシン濃
度を求めた。得られたヒトメダラシン濃度及び各血液試
料を用いて測定した顆粒球数から10 ⁸ 個の顆粒球中のメ
ダラシン量を示すヒトメダラシン値（μg/10⁸ 顆粒球）
を算出し、図２に示す。

【００３４】図２は、健常人、多発性硬化症患者及び非
炎症性神経性疾患患者のそれぞれのメダラシン値の比較
を示す。同図より、次の結果を得た。 多発性硬化症患者 ：355 ± 117（ｎ＝112） 非炎症性神経疾患患者：233 ± 66（ｎ＝80） 健常人 ：213 ± 34（ｎ＝25）

【００３５】上記の結果をカット・オフ値(281μg/10⁸
顆粒球）と比較して陽性・陰性に分類してその数及び陽
性率を表１に示した。

【表１】 以上の結果より、血液中のヒトメダラシン値による多発
性硬化症の診断は非常に信頼性の高い診断方法であるこ
とが認められた。

【００３６】多発性硬化症患者のメダラシン値の水準を
男女別に分類したところ次の結果を得た（図３参
照。）。 多発性硬化症患者 女性： 351 ± 107（ｎ＝78） 男性： 367 ± 143（ｎ＝34） 健常人 214 ± 34（ｎ＝24） また、多発性硬化症患者のメダラシン値の水準を年齢別
に分類した結果は次の通りである（図４参照。）。 多発性硬化症患者 10代： 421 ± 154（ｎ＝ 9） 20代： 329 ± 94（ｎ＝26） 30代： 357 ± 104（ｎ＝30） 40代： 330 ± 157（ｎ＝17） 50代以上： 375 ± 125（ｎ＝21） 健常人 213 ± 34（ｎ＝25） これらの結果によると、男女による差及び年齢による差
は認められないことが判った。

【００３７】

【発明の効果】 本発明の多発性硬化症の診断方法によ
り、特別の装置を必要とせずに患者等の被検者から採取
した血液を分析対象とし、被検者に大きな苦痛を与える
ことなく、安価かつ容易に多発性硬化症の発症及び／又
は病勢を診断することが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１記載の酵素免疫測定方法を用いて
ヒトメダラシン（標準物質）を測定し、その吸光度を抗
原濃度の関数としてプロットして作成したヒトメダラシ
ン測定用の検量線である。

【図２】 血液試料中のヒトメダラシン値（μg/10⁸
顆粒球）を健常人、多発性硬化症及び非炎症性神経性疾
患患者別にプロットしたものである。

【図３】 血液試料中のヒトメダラシン値（μg/10⁸
顆粒球）を多発性硬化症患者の男女別にプロットしたも
のである。

【図４】 血液試料中のヒトメダラシン値（μg/10⁸
顆粒球）を多発性硬化症患者の年齢別にプロットしたも
のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 樹由 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4H045 AA11 CA42 DA76 EA50 FA72 GA06 GA10 GA22

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト血液試料中のヒトメダラシン
   量を免疫学的方法を用いて正確に測定し、その測定値の
   大小及び／又は増減により多発性硬化症の発症及び／又
   は病勢を診断することを特徴とする多発性硬化症の診断
   方法。
2. 【請求項２】 ヒト血液試料を浸透圧が 250mOsm
   /kg・H₂O より低い水性液体又は 310mOsm/kg・H₂O より高
   い水性液体で処理して白血球を完全に破壊した後に、抗
   ヒトメダラシン抗体を用いてヒトメダラシンを測定し、
   その測定値の大小及び／又は増減により多発性硬化症の
   発症及び／又は病勢を診断することを特徴とする多発性
   硬化症の診断方法。
3. 【請求項３】 前記抗ヒトメダラシン抗体の少な
   くとも一つが抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体であ
   る請求項２に記載の多発性硬化症の診断方法。