PT2209806E - Anticorpos anti-hepcidina e as suas utilizações - Google Patents

Description

ΡΕ2209806 1 DESCRIÇÃO "ANTICORPOS ΑΝΤΙ—HEPCIDINA E AS SUAS UTILIZAÇÕES" A presente invenção está no campo da medicina, em particular no campo dos anticorpos contra hepcidina madura humana. Mais especificamente, a invenção refere-se anticorpos monoclonais selectivos para hepcidina-25 que são capazes de neutralizar bioactividade de hepcidina madura humana e são portanto úteis para aumentar niveis séricos de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou hematócrito num ser humano para fins de tratamento ou prevenção de uma doença, estado ou patologia promovida por hepcidina madura humana como anemia.

Presentemente, as tearpêuticas adequadas e eficazes para anemia, ou para a anemia de doença crónica, são limitadas. Especificamente, a administração de eritropoie-tina é eficaz em apenas cerca de 50% de todos os doentes e está associada a efeitos secundários indesejáveis. Além disso, as transfusões são indesejáveis devido aos riscos de contaminação, infecção e sobrecarga de ferro.

Crê-se que a hepcidina humana, um polipéptido expresso predominantemente por hepatócitos, é uma importante proteina reguladora de ferro que regula negativamente a absorção de ferro intestinal, a reciclagem de ferro por 2 ΡΕ2209806 macrófagos e a mobilização de ferro a partir de reservas de ferro hepáticas. A sobreprodução de hepcidina parece desempenhar um papel fundamental na patofisiologia da anemia e/ou anemia de doença crónica. A hepcidina humana é codificada como um prepro-péptido de 84 aminoácidos contendo uma sequência de sinal direccionada ao retículo endoplasmático com um N-terminal de 24 aminoácidos típico, e uma pró-região de 35 aminoácidos com um sítio consensual de clivagem de furina imediatamente seguido pela hormona reguladora de ferro bio-activa com 25 aminoácidos C-terminal, hepcidina-25 humana (SEQ ID N0:1). Várias formas truncadas no N-terminal de hepcidina-25 humana, como hepcidina-20 humano (i.e., os aminoácidos 6-25 da SEQ ID N0:1) e hepcidina-22 humana (aminoácidos 4-25 da SEQ ID N0:1) também são conhecidas por se formarem in vivo.

Embora tenham sido descritos anteriormente anticorpos da hepcidina humana (ver, e.g., publicações dos pedidos de patente U.S. 2004/0096990 e 2.007/0224186, e publicação do pedido de patente internacional PCT WO 2008/097461), ainda permanece uma grande necessidade na arte de fármacos adicionais para tratar doenças e patologias associadas a anemia, incluindo anemia de doença crónica, como anemia de cancro e anemia de inflamação.

Dado que a hepcidina-25 é a mais, se não a única, forma de hepcidina humana fisiologicamente relevante de 3 ΡΕ2209806 hepcidina em seres humanos, os anticorpos direccionados selectivamente à hepcidina-25 humana, em comparação com polipéptidos de hepcidina que não são fisiologicamente relevantes, são especialmente necessários. Portanto, a presente invenção proporciona anticorpos terapêuticos de engenharia genética, selectivos, de alta afinidade contra hepcidina-25 humana que têm numerosas vantagens no tratamento ou diagnóstico de patologias associadas a níveis elevados de hepcidina madura, como anemia. Por exemplo, estes anticorpos, tendo afinidade elevada, neutralizantes, de engenharia humana e altamente selectivos para as formas fisiologicamente relevantes da hepcidina em seres humanos, vão reduzir o risco de efeitos secundários e a dose clínica e a frequência de administração necessárias para um tratamento eficaz. A presente invenção também inclui ácidos nucleicos preferidos que codificam anticorpos de hepcidina-25 selectivos preferenciais em que os ácidos nucleicos foram concebidos para remover locais de splicing crípticos que resultam em agregação indesejável de certos anticorpos da invenção por expressão por células hospedeiras de mamíferos. Assim, vantagens adicionais derivadas da presente invenção incluem rendimento melhorado do produto anticorpo de um grau desejável de pureza, cortando assim os custos de produção, bem como um maior grau de eficácia clínica e segurança para o produto anticorpo administrado.

Além disso, os imunoensaios disponíveis comercialmente para hepcidina humana não diferenciam as formas relevantes fisiologicamente activas da hepcidina humana das 4 ΡΕ2209806 espécies de hepcidina fisiologicamente não relevantes, inactivas (ver, por exemplo, Kemna, E. H. et al., Haematologica, 93(1):90-7 (2008)). Presentemente, a maioria dos métodos para ensaio selectivo de hepcidina-25 envolvem LC/MS (cromatografia liquida/espectrometria de massa) ou métodos morosos semelhantes que requerem a separação das várias formas da hepcidina (ver, por exemplo, (Gutierrez, J. A. et al., BioTechniques, 38:S13-S17 (2005), Murphy et al., Blood, 110: 1048-54. (2007) e Kemna, E. H. et al., Clin. Chem. 53:620-8 (2007)).

Embora estes ensaios possam ser exactos e precisos, a sua complexidade, custo, e alto nivel de pericia necessária do operador inibem a sua implementação em rotina. Por conseguinte, há também uma grande necessidade de anticorpos adicionais que se ligam a hepcidina madura humana com elevada afinidade para sua aplicação em imunoensaio relativamente simples, rápido e robusto para a detecção especifica ou de medição de formas maduras de hepcidina humana para aplicações de diagnóstico e/ou prognóstico. A presente invenção proporciona um anticorpo isolado que se liga a hecidina-25 humana com uma KD de 800 pM ou menos determinada por ressonância plasmónica de superfície (SPR) a 25°C e compreende seis CDR seleccionados do grupo que consiste em: (i) LCOR1, LCOR2, LCOR3, HCOR1, HCOR2 e HCDR3 5 ΡΕ2209806

tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 52, 60, 62, 65, 71 e 75, respectivamente; (ii) LCOR1, LCOR2, LCOR3, HCOR1, HCOR2 e HCDR3

tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 42, 76, 62, 79, 87 e 46, respectivamente; (iii) LCORl, LCOR2, LCOR3, HCORl, HCOR2 e HCDR3

tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 41, 53, 31, 63, 84 e 46, respectivamente; (iv) LCORl, LCOR2, LCOR3, HCORl, HCOR2 e HCOR3

tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 43, 30, 31, 32, 44 e 46, respectivamente; (v) LCORl, LCOR2, LCOR3, HCORl, HCOR2 e HCOR3

tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 43, 53, 61, 63, 85 e 46, respectivamente; e (vi) LCORl, LCOR2, LCOR3, HCORl, HCOR2 e HCOR3 tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 43, 57, 61, 63, 84 e 46, respectivamente.

Noutros aspectos, a invenção proporciona moléculas isoladas de ácido nucleico que codificam anticorpos da invenção; vectores que compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos da invenção, opcionalmente, ligados operativamente a sequências de controlo reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o 6 PE2209806 vector; células hospedeiras compreendendo vectores compreendendo moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos da invenção; um processo para a produção de um anticorpo da invenção que compreende a cultura de células hospedeiras compreendendo vectores que compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos da invenção de modo que o ácido nucleico é expresso e, opcionalmente , a recuperação do anticorpo do meio de cultura das células hospedeiras.

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da invenção e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Preferencialmente, a composição farmacêutica compreende uma população homogénea ou substancialmente homogénea de um anticorpo da invenção e um veiculo ou diluente farmaceu-ticamente aceitável.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona um anticorpo que se liga selectivamente hepcidina-25 humana com uma KD de cerca de 800 pM ou menos para utilização em terapêutica. A invenção também proporciona um anticorpo que se liga selectivamente a hepcidina-25 humana com uma KD de cerca de 800 pM ou menos para utilização no tratamento ou prevenção de anemia num indivíduo. A presente invenção inclui a utilização de um anticorpo que se liga selectivamente a hepcidina-25 humana com uma KD de cerca de 800 pM ou menos para a preparação de ΡΕ2209806 um medicamento para o tratamento de anemia, incluindo anemia de doença crónica e anemia de cancro. A invenção inclui ainda a utilização de um anticorpo que se liga selectivamente a hepcidina-25 humana com uma KD de cerca de 800 pM ou menos para a preparação de um medicamento para aumentar os niveis séricos de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou hematócrito num animal, preferencialmente uma espécie de mamifero, mais preferencialmente um indivíduo ser humano . A presente invenção inclui um método de aumentar os níveis séricos de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou hematócrito, que compreende a administração a um indivíduo ser humano dela necessitado de uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga selectivamente a hepcidina-25 humana com uma KD de cerca de 800 pM ou menos.

Num outro aspecto, a invenção proporciona um método para o tratamento num doente de uma doença promovida por hepcidina madura que beneficia de um aumento dos níveis séricos de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou hematócrito, incluindo, mas não limitada a anemia, e.g., anemia resultante de infecção, inflamação, doença crónica e/ou cancro em que o referido método compreende a administração de uma quantidade eficaz de um anticorpo selectivo de hepcidina-25 da invenção a um doente dele necessitado. ΡΕ2209806 A presente invenção proporciona ainda um imunoensaio selectivo para hepcidina madura humana. 0 método inclui: primeiro, obter uma amostra a ser ensaiada quanto a hepcidina madura humana e fazer contactar a amostra com um anticorpo da invenção em condições adequadas para ligação e permitir que qualquer hepcidina madura humana presente forme um complexo antigénio-anticorpo; em seguida, detectar a presença ou ausência do complexo; e/ou determinar a quantidade do complexo na amostra por um método de imunoensaio. A presente invenção proporciona ainda métodos de diagnóstico de uma patologiaa promovida por hepcidina madura humana num doente por determinação do nivel de hepcidina madura humana numa amostra de um fluido biológico do doente e comparação do nivel de hepcidina madura humana na amostra com o nivel de hepcidina madura humana numa amostra de fluido biológico de um ou mais indivíduos de controlo ou com um padrão de referência.

Também é proporcionado um método de monitorização de uma doença promovida por hepcidina madura num doente. 0 método inclui a determinação do nivel de hepcidina madura numa amostra de um fluido biológico de um doente que sofre de, ou em risco de, uma doença promovida por hepcidina madura num primeiro ponto de tempo; determinação do nivel de hepcidina madura numa ou mais amostras do fluido biológico do doente num ou mais pontos de tempo diferentes; 9 ΡΕ2209806 comparando dos níveis de hepcidina madura determinados em pontos de tempo diferentes e, assim, monitorização da doença promovida por hepcidina madura. A invenção proporciona ainda um kit para a realização de um imunoensaio, incluindo um anticorpo da invenção e um recipiente adequado.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra um espectro de massa MALDI-TOF de múltiplas formas de hepcidina humana isoladas de soros humanos. 0 sinal 1 tem uma massa que é consistente com a massa esperada de hepcidina-25 humana intacta. Os sinais 2, 3 e 4 têm massas que são consistentes com as formas truncadas no terminal N de hepcidina madura humana (hepcidina-24, hepcidina-22 e hepcidina-20). 0 espectro de massa foi gerado num espectrómetro de massa MALDI-TOF, utilizando um método de modo linear, de iões positivos com ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico (matriz do péptido) como matriz da amostra, como descrito no Exemplo 5 adiante. A Figura 2 representa um espectro de massa MALDI-TOF da mesma amostra que na Figura 1 utilizando ácido 3,5-dimetil-4-hidroxicinâmico (matriz de ácido sinapínico) como matriz da amostra. 0 sinal 1 representa hepcidina-25 humana intacta. Não foi observado nenhum sinal de pró-hepcidina. 0 espectro de massa foi gerada num espectrómetro de massa utilizando um método de modo linear, de iões positivos como descrito no Exemplo 5 adiante. 10 ΡΕ2209806 A Figura 3A mostra as sequências de aminoácidos da estrutura da cadeia leve humana completa 02 com CDRs intercaladas. As quatro regiões estruturais estão marcadas como FRL1, 2, 3 e 4 (SEQ ID NOs: 39, 40, 96 e 97, respectivamente). A Figura 3B mostra a sequência de aminoácidos do da estrutura da cadeia pesada humana VH1-69 com CDRs intercaladas. As quatro regiões estruturais estão marcadas como FRH1-4 (SEQ ID NOs: 35-38, respectivamente). A Figura 4A mostra as sequências de aminoácidos da estrutura da cadeia leve humana 018 com CDRs intercaladas. As quatro regiões estruturais estão marcadas como FRL1, 2, 3, e 4 (SEQ ID NOs: 154, 40, 156 e 97, respectivamente). A Figura 4B mostra a sequência de aminoácidos da estrutura da cadeia pesada humana VH1-18 com CDRs intercaladas. As quatro regiões estruturais estão marcadas como FRH1, 2, 3, e 4 (SEQ ID NOs: 157, 36, 158 e 38, respectivamente). A Figura 5A mostra as sequências de aminoácidos da estrutura da cadeia leve humana L12 com CDRs intercaladas. As quatro regiões estruturais estão marcadas como FRL1, 2, 3, e 4 (SEQ ID NOs: 159, 40, 160 e 97, respectivamente). 11 ΡΕ2209806 A Figura 5B mostra a sequência de aminoácidos da estrutura da cadeia pesada humana VH1-46 com CDRs intercaladas. As quatro regiões estruturais estão marcadas como FRH1, 2, 3, e 4 (SEQ ID NOs: 157, 36, 161 e 38, respectivamente). São aqui utilizadas as seguintes abreviaturas: ACN: acetonitrilo, BSA: albumina de soro bovino, DTT: ditiotreitol, EDTA: ácido etilenodiamina tetraacético, ELISA: ensaio de imunoadsorção enzimática, IMAC: croma-tografia de afinidade com metal imobilizado, IPTG: iso-propil β-D-l-tiogalactopiranosido, Mab: anticorpo monoclo-nal, Mabs: anticorpos monoclonais, MALDI-TOF: tempo de vôo com ionização por desorção de laser assistida pela matriz, PBS: soro fisiológico tamponado com fosfato, SPR: ressonância plasmónica de superfície, TFA: ácido trifluoro-acético. Todas as abreviaturas de aminoácidos utilizada nesta descrição são as aceites pelo United States Patent and Trademark Office conforme estabelecido em 37 C.F.R. § 1.822 (B) (2) .

Quando aqui utilizado, o termo "hepcidina" refere-se a qualquer forma da proteína hepcidina conhecida por estar presente em mamíferos. Quando aqui utilizado, o "hepcidina madura" refere-se a qualquer forma madura, bioactiva da proteína hepcidina expressa em mamíferos. Quando utilizada neste documento, a frase "hepcidina humana" refere-se a qualquer forma da proteína hepcidina 12 ΡΕ2209806 presente em seres humanos. Quando aqui utilizada, a frase " hepcidina-25 humana" refere-se à forma madura da hepcidina humana possuindo a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 1. 0 termo "anticorpo" em referência a um anticorpo anti-hepcidina da invenção (ou simplesmente "anticorpo da invenção"), tal como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo monoclonal humano modificado ou um anticorpo monoclonal totalmente humano, salvo indicação em contrário. Preferencialmente, os anticorpos da invenção são anticorpos humanos modificados. Os anticorpos da invenção podem ser produzidos utilizando e.g. tecnologias recombinantes, tecnologias de expressão em fagos, tecnologias sintéticas, e.g., enxerto de CDRs, ou combinações dessas tecnologias ou outras tecnologias prontamente conhecidas na arte. "Anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de uma única cópia ou clone, incluindo, e.g., qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago, e não o método pelo qual é produzido. Um anticorpo, tal como aqui utilizado, pode ser um anticorpo intacto (compreendendo uma região Fc completa ou de comprimento total), ou uma porção ou fragmento de um anticorpo compreendendo uma porção de ligação ao antigénio, e.g., um fragmento Fab, fragmento Fab' ou fragmento F(ab')2 de um anticorpo humano modificado ou totalmente humano. Os fragmentos de ligação ao antigénio preferidos de um anticorpo da invenção retêm a capacidade de inibir ou neutralizar uma ou mais bioactividades caracteristicas de uma forma madura de uma hepcidina de 13 ΡΕ2209806 mamífero in vivo ou in vitro. Por exemplo, numa forma de realização, uma porção de ligação ao antigénio de um anticorpo da invenção podem inibir a interacção de hepcidina-25 humana com um ou mais receptores, e.g., ferroportina humana (SEQ ID NO: 25) e/ou pode inibir a internalização de ferroportina induzida por hepcidina.

Além disso, um "anticorpo da invenção" ou simplesmente "anticorpo", tal como aqui utilizado, pode ser um fragmento Fv de cadeia única que pode ser produzido unindo o DNA que codifica a LCVR e HCVR com uma sequência ligante. (ver, Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, páginas 269-315, 1994). Entende-se que, independentemente de serem especificados fragmentos ou porções de antigénio de ligação, o termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, inclui esses fragmentos ou porções bem como formas de cadeia única, salvo indicação em contrário.

Os termos "selectivo" ou "selectivamente" é aqui utilizado em referência a um anticorpo anti-hepcidina-25 ou à sua ligação, respectivamente, referem-se a um anticorpo que se liga selectivamente a hepcidina-25 com uma KD de 1000, 500 , 200, 100, 50, 10 ou 5 vezes menor do que aquela com que o anticorpo se liga a pelo menos uma forma precursora de hepcidina-25 e/ou pelo menos uma espécie truncada no terminal N de hepcidina madura conhecida por se formar na mesma espécie de mamíferos, medida por SPR a 25°C. Adicionalmente, ou alternativamente, um anticorpo ΡΕ2209806 selectivo para hepcidina-25 da invenção liga-se a hepcidina-25 mas não se liga, ou liga-se minimamente, a pelo menos uma forma precursora de hepcidina-25 e/ou pelo menos uma espécie truncada no terminal N de hepcidina madura conhecida por se formar na mesma espécie de mamifero, determinado por imunoensaio e/ou métodos de espectrometria de massa MALDI-TOF utilizados pelos especialistas na matéria, incluindo, mas não limitados ao ensaio aqui descrito no Exemplo 5. Preferencialmente, um anticorpo selectivo anti-hepcidina-25 da presente invenção liga-se a hepcidina-25 humana com uma KD 1000, 500, 200, 100, 50, 10 ou 5 vezes menor do que o anticorpo se liga a pró-hepcidina humana, preferencialmente pró-hepcidina humana tendo a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 34, e/ou pelo menos uma forma truncada no terminal N de hepcidina madura humana, medida por SPR a 25 °C. Adicionalmente, ou alternativamente, um anticorpo selectivo anti-hepcidina-25 da invenção liga-se a hepcidina-25 humana mas não se liga, ou liga-se minimamente, a pró-hepcidina, preferencialmente pró-hepcidina humana que tem a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 34, e/ou pelo menos uma espécie truncada no terminal N de hepcidina madura conhecida por formar na mesma espécie de mamifero, como determinado por imunoensaio e/ou métodos de espectrometria de massa de MALDI-TOF utilizados pelos especialistas na matéria, incluindo, mas não limitados ao ensaio aqui descrito no Exemplo 5. Mais preferencialmente, um anticorpo selectivo anti-hepcidina-25 da presente invenção liga-se a hepcidina-25 humana com uma KD 1000 , 500, 200, 100, 50, 10 ΡΕ2209806 ou 5 vezes mais baixa do que o anticorpo se liga a pró-hepcidina humana tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 34 e pelo menos uma forma truncada no terminal-N de hepcidina madura humana, medida por SPR a 25°C. Adicionalmente, ou alternativamente, um anticorpo selectivo anti-hepcidina-25 da invenção liga-se a hepcidi-na-25 humana mas não se liga, ou liga-se minimamente, a pró-hepcidina humana (SEQ ID NO: 34) e pelo menos uma espécie truncada no terminal N de hepcidina madura conhecida por se formar na mesma espécie de mamífero, determinada por imunoensaio e/ou métodos de espectrometria de massa MALDI-TOF utilizados pelos especialistas na matéria, incluindo, mas não limitados ao ensaio aqui descrito no Exemplo 5. Ainda mais preferencialmente, um anticorpo selectivo anti-hepcidina-25 da presente invenção i) liga-se a hepcidina-25 humana com uma KD 1000, 500, 200, 100, 50, 10 ou 5 vezes menor do que o anticorpo se liga a pró-hepcidina humana (SEQ ID NO: 34) e ii) liga-se a hepcidina-25 humana com uma KD de 1000, 500, 200, 100, 50, 10 ou 5 vezes menor do que o anticorpo se liga a hepcidina-20 humana (i.e., os aminoácidos 6-25 da SEQ ID NO: 1) e/ou hepcidina-22 humana (aminoácidos 4-25 de SEQ ID NO: 1), medido por SPR a 25°C. Adicionalmente, ou alternativamente, um anticorpo selectivo anti-hepcidina-25 da invenção liga-se a hepcidina-25 humana mas não se liga, ou liga-se minimamente, a i) pró-hepcidina humana (SEQ ID NO: 34) e ii) hepcidina-20 humana e/ou hepcidina-22 humana, determinado por imunoensaio e/ou métodos de espectrometria de massa MALDI-TOF utilizadas pelos especialistas na matéria, 16 ΡΕ2209806 incluindo, mas não limitados ao ensaio aqui descrito no Exemplo 5. 0 termo "detectar" ou "detecção" é utilizado no sentido mais amplo para incluir determinações quantitativas, semi-quantitativas ou qualitativas de uma molécula alvo. Num aspecto, os métodos aqui descritos podem apenas determinar a presença ou ausência de um determinado polipéptido hepcidina numa amostra biológica e, assim, que o polipéptido hepcidina é detectável ou, alternativamente, indetectável na amostra, determinado pelo método. 0 termo "epitopo" refere-se à porção de uma molécula capaz de ser reconhecida por e ligada a um anticorpo numa ou mais regiões de ligação ao antigénio do anticorpo. 0 termo "bioactividade", em referência a um anticorpo da invenção, inclui, mas não está limitado a afinidade de ligação ao epitopo ou antigénio, à estabilidade do anticorpo in vivo e/ou in vitro, às propriedades imunogénicas do anticorpo, e.g., quando administrado a um indivíduo ser humano e/ou a capacidade de neutralizar ou antagonizar uma bioactividade de hepcidina, in vivo ou in vitro, incluindo, mas não limitada à inibição da desre-gulação do nível sérico de ferro numa inflamação, e.g. IL-6, ensaio de desafio, e.g. como aqui descrito no Exemplo 4.

As propriedades ou características acima mencionadas podem ser observadas ou medidas utilizando técnicas 17 ΡΕ2209806 reconhecidas na arte, incluindo mas não limitadas a ensaios de cintilação por proximidade, ELISA, imunoensaio ORIGEN (IGEN), extinção da fluorescência, ELISA com fluorescência, ELISA competitivo, análise por SPR, incluindo, mas não se limitando a, análise por SPR utilizando um biosensor BIAcore, ensaios de neutralização in vitro e in vivo sem limite (ver, por exemplo, Publicação Internacional N° WO 2006/062685), ligação a receptores e imuno-histoquímica com secções de tecido de diferentes fontes, incluindo ser humano, primata ou qualquer outra fonte consoante necessário . O termo "bioactividade" em referência a hepcidina madura incluindo hepcidina-25 inclui, mas não está limitado à ligação especifica de hepcidina madura a outra proteína, incluindo, mas não limitada ao seu receptor ferroportina, um ou mais funções mediadas por ferroportina de hepcidina madura, como a internalização induzida por hepcidina madura e/ou degradação de ferroportina (ver, e.g. Nemeth, E. et al., Hepcidin Regulates Iron Efflux by Binding to Ferroportin and Inducing Its Internalization, Science 306, 2090-2093, (2004)), regulação por hepcidina madura do efluxo de ferro mediado por ferroportina, níveis séricos de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou hematócrito num ser humano, estabilidade da proteína, i.e., hepcidina madura que afecta os níveis de actividade de outra proteína in vivo ou in vitro, e os níveis de expressão e/ou distribuição nos tecidos da hepcidina. 18 ΡΕ2209806 0 termo "inibir" ou "neutralizar", tal como aqui utilizado em relação a uma bioactividade de um anticorpo da invenção, significa a capacidade de substancialmente antagonizar, proibir, impedir, restringir, retardar, interromper, eliminar, parar, reduzir ou inverter a bioactividade de hepcidina madura humana, incluindo, mas não limitada a uma bioactividade de hepcidina madura humana medida como aqui no Exemplo 3 ou 4.

Os anticorpos da presente invenção são carac-terizados por terem uma KD para hepcidina-25 humana inferior a 1000 pM, preferencialmente inferior a 800 pM, mais preferencialmente inferior a 400 pM, ainda mais preferencialmente inferior a 200 pM, ainda mais preferencialmente inferior a 100 pM, ainda mais preferencialmente inferior a 75 pM ou mais preferencialmente inferior a 50 pM, determinada por SPR a 25°C. Preferencialmente, o anticorpo liga-se selectivamente a hepcidina-25 humana com uma KD inferior a 800 pM, preferencialmente inferior a 400 pM, mais preferencialmente inferior a 200 pM, ainda mais preferencialmente inferior a 100 pM, ainda mais preferencialmente inferior a 75 pM ou mais preferencialmente inferior a 50 pM, determinada por SPR a 25°C também se liga selectivamente a pelo menos uma hepcidina-25 de uma outra espécie, como hepcidina-25 de macaco cynomolgous. Mais preferencialmente, esses anticorpos ligam-se selectivamente a hepcidina-25 de macaco cynomolgous com uma KD inferior a 800 pM, ainda mais preferencialmente inferior a 400 pM, 19 ΡΕ2209806 ainda mais preferencialmente inferior a 200 pM, ainda mais preferencialmente inferior a 100 pM, ainda mais preferencialmente inferior a 75 pM ou mais preferencialmente ainda inferior a 50 pM, determinada por SPR a 25°C.

Os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos selectivos anti-hepcidina-25 tendo uma KD para hepcidina-25 humana entre 800 pM e 30 pM, preferencialmente entre 400 pM e 30 pM, mais preferencialmente entre 200 pM e 30 pM, ainda mais preferencialmente entre 100 pM e 30 pM, ainda mais preferencialmente entre cerca de 75 pM e 30 pM, ou mais preferencialmente ainda entre 50 pM e 30 pM, determinada por SPR a 25°C. Preferencialmente, esses anticorpos também têm uma KD para hepcidina-25 de macaco Cynomolgus entre 800 pM e 10 pM, mais preferencialmente entre 400 pM e 10 pM, ainda mais preferencialmente entre 200 pM e 10 pM, ainda mais preferencialmente entre 100 pM e 10 pM, ainda mais preferencialmente entre cerca 75 pM e 10 pM ou mais preferencialmente ainda entre 50 pM e 10 pM, determinada por SPR a 25°C.

Os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos tendo uma KD para hepcidina-25 humana e/ou hepcidina-25 de macaco cinomolgo que é pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes ou pelo menos 200 vezes menor do que a KD do anticorpo para hepcidina-25 de murganho e/ou hepcidina-25 de rato, determinada por SPR a 25°C. ΡΕ2209806

Os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos tendo uma constante de dissociação de hepcidina-25 humana entre 1 x 10”2 s_1 e 1,8 x 10”4 s”1, preferen cialmente entre cerca 8,5 x 10“3 s_1 e 1,8 x 10”4 s_1, mais preferencialmente entre 7,7 x 10“4 s_1 e 1,8 x 10“4 s_1, ainda mais preferencialmente entre 6,5 x 10~4 s_1 e cerca de 1,8 x 10-4 s-1 ou mais preferencialmente entre 5,5 x 10”4 s”1 e 2,0 x 10“4 s"1, determinada por SPR a 25°C. Pre ferencialmente, esse anticorpo também se liga selec-tivamente a hepcidina-25 humana com uma KD entre 800 pM e 30 pM, ainda mais preferencialmente entre 400 pM e 30 pM, ainda mais preferencialmente entre 200 pM e 30 pM, mais preferencialmente ainda entre 100 pM e 30 pM, ainda mais preferencialmente entre 75 pM e 50 pM, ou mais preferen cialmente ainda entre 50 pM e 30 pM, determinada por SPR a 25 °C. A presente invenção também inclui anticorpos que se ligam a hepcidina-25 humana, preferencialmente selec-tivamente, com uma KD de 200 pM ou menos e neutraliza ou antagoniza pelo menos uma bioactividade de hepcidina madura humana in vitro ou in vivo. Preferencialmente, um anticorpo da invenção tem uma IC50 inferior a 200 nM, mais preferencialmente inferior a 100 nM, ainda mais preferencialmente inferior a 75 nM, ou mais preferencialmente inferior a 50 nM num ensaio in vitro ou in vivo de bioactividade de hepcidina madura como aqui descrito, por exemplo, no Exemplo 3 ou 4. 21 ΡΕ2209806

Um anticorpo da invenção também inclui ligação anti-hepcidina-25 humana, preferencialmente ligando-se selectivamente a anticorpos que inibem significativamente diminuições de ferro sérico induzidos por IL-6 num ensaio em macaco cynomolgus como aqui descrito, por exemplo, no Exemplo 4. Preferencialmente, esses anticorpos inibem diminuições de ferro sérico num macaco cynomolgus induzidas por uma dose de 5 pg/kg de IL-6 humana pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 100% dentro de cerca de 6 horas de receber uma dose intravenosa do anticorpo a cerca de 10 mg/kg.

Um anticorpo da invenção tem uma IC50 inferior a cerca de 200 nM, preferencialmente inferior a 100 nM, mais preferencialmente inferior a 75 nM, ainda mais preferencialmente inferior a 50 nM, ou mais preferencialmente ainda inferior a 25 nM no ensaio de internalização de ferro-portina induzida por hepcidina madura aqui descrito no Exemplo 3. Preferencialmente, um anticorpo da invenção tem uma IC50 entre 200 nM e 25 nM, mais preferencialmente entre 100 nM e 50 nM, mais preferencialmente entre 100 nM e 25 nM, ainda mais preferencialmente entre 75 nM e 25 nm, ou mais preferencialmente ainda entre 75 nM e 50 nM no ensaio de internalização de ferroportina induzida por hepcidina madura aqui descrito no Exemplo 3. um anticorpo da

Noutra forma de realização 22 ΡΕ2209806 invenção tem uma IC5o entre 200 nM e 25 nM, preferencialmente entre 100 nM e 50 nM, mais preferencialmente entre 100 nM e 25 nM, ainda mais preferencialmente entre 75 nM e 25 nm, ou mais preferencialmente ainda entre 7 5 nM e 50 nM no ensaio de internalização de ferroportina induzida por hepcidina descrito no Exemplo 3, uma constante de dissociação da hepcidina-25 humana entre 1 x 10“2 s”1 e 1,8 x 10”4 s”1, preferencialmente entre 8,5 x 10”3 s”1 e 1,8 x 10” 4, mais preferencialmente entre 7,7 x 10’4 s’1 e 1,8 x 10’4 s”1, ainda mais preferencialmente entre 6,5 x 10”4 s”1 e 1,8 x 10”4 s”1 ou mais preferencialmente entre 5,5 x 10”4 s”1 e 2,0 x 10”4 s”1, determinado por SPR a 25°C, e liga-se selectivamente a hepcidina-25 humana com uma KD entre 800 pM e 30 pM, preferencialmente entre 400 pM e 30 pM, mais preferencialmente entre 200 pM e 30 pM, ainda mais preferencialmente entre 100 pM e 30 pM, ainda mais preferencialmente entre 75 pM e 50 pM, ou mais preferencialmente ainda entre 50 pM e 30 pM, como determinado por SPR a 25°C. O termo "numeração de Kabat" tal como aqui utilizado é reconhecido na arte e refere-se a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos que são mais variáveis (i.e., hipervariáveis) do que outros resíduos de amino ácidos nas regiões da cadeia pesada e leve de um anticorpo (Kabat et al., Ann. NY Acad. Sei. 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human

Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)). ΡΕ2209806

Um polinucleotido está "ligado operativamente" quando é posto numa relação funcional com outro polinucleotido. Por exemplo, um promotor ou potenciador está ligado operativamente a uma sequência de codificação se afectar a transcrição da sequência.

Os termos "indivíduo" e "doente" aqui utilizados indiferentemente, referem-se a um mamífero, preferencialmente um ser humano. Em certas formas de realização, o doente tem uma doença que beneficiaria de um nível diminuído de hepcidina-25, uma diminuição da bioactividade de hepcidina-25 e/ou um aumento do nível sérico de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou hematócrito. 0 termo "vector" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi operativamente ligada incluindo, mas não se limitada a plasmídeos e vectores virais. Certos vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos enquanto outros vectores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira por introdução na célula hospedeira e assim são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vectores são capazes de direccionar a expressão de genes aos quais estão ligados operativamente. Esses vectores são aqui referidos como "vectores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vectores de expressão"). Vectores exemplificativos são bem conhecidos na arte. 24 ΡΕ2209806

Tal como aqui utilizados, os termos "célula" e "célula hospedeira" são utilizados indiferentemente e referem-se a qualquer célula procariótica (e.g., células bacte-rianas como E. coli) ou preferencialmente célula eucarió-tica (e.g., células de leveduras, células de plantas, células de insectos ou células de mamíferos como células CHO) quer localizadas in vitro quer in vivo. Uma célula hospedeira inclui células transformadas, transduzidas, transfectadas ou infectadas com um ou mais vectores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotido que codifica um anticorpo da invenção. Uma célula hospedeira pode estar localizado in vitro ou in vivo. Por exemplo, as células hospedeiras podem estar localizadas num animal transgénico ou numa planta transgénica.

Cada cadeia pesada de um anticorpo de comprimento completo é constituída por uma região variável da cadeia pesada N-terminal (aqui "HCVR") e uma região constante da cadeia pesada C-terminal. Cada cadeia leve de um anticorpo de comprimento completo é constituída por uma da região variável da cadeia leve N-terminal (aqui "LCVR") e uma região constante da cadeia leve C-terminal. As HCVRs e LCVRs podem ser ainda subdivididas em regiões de hiper-variabilidade, chamadas regiões determinantes de complementaridade ("CDR"), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais ("FR"). A capacidade funcional de um anticorpo para se ligar um antigénio específico ou epitopo é grandemente influenciada 25 ΡΕ2209806 pelas seis CDRs presentes na região variável do anticorpo. Cada HCVR e LCVR é composta por três CDR (HCDR1, HCDR2 e HCDR3 na HCVR e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 na LCVR) e quatro regiões estruturais, dispostos a partir do terminal amino para o terminal carboxilo pela ordem seguinte: LRF, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Por conseguinte, o termo "CDR" ou "região determinante de complementaridade", tal como aqui utilizado, pretende significar os sitios de combinação do antigénio não contíguos encontrados dentro da região variável dos polipéptidos tanto de cadeia pesada como leve. Estas regiões particulares foram descritas por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977), Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest (1991) e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) e por MacCallum et al., J. Mol. Bio., 262:732-745 (1996) em que as definições incluem sobreposição de resíduos ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparadas umas contra as outras. Na presente descrição, a atribuição de aminoácidos a cada domínio é feita de acordo com convenções bem conhecidas (e.g., Kabat (1991) e/ou Chothia (1987)). As CDR contêm a maioria dos resíduos que formam interacções específicas com o antigénio.

As Tabelas 1 e 2 adiante mostram as sequências de aminoácidos e as sequências de consenso de aminoácidos que codificam CDR preferenciais para anticorpos da presente invenção. ΡΕ2209806

Tabela 1 _ LCPRl r LCDR2 LCDR3 —| SÀSSSVSSTYLH ÍSEO ÍD NO:: 26) RTSTLAS ÍSEO ID NO: 30) QQWSGYPFT (SEOIDNO: 31) 3ΪΒ2 SÀSSSVSSTYLH (SEQ ÍD NO: 26) RTSTLAS ÍSEO IDNO: 30) qowIgypft Ί (SEOIDNO: 30 Mu22 SASSRVSSTYLF fSEO IO NO: 4.3) RTSTLAS (SEO ID NO: 30) QQWSGYPFT ( SEO ID NO: 31} h ” SLSSRVSSTYLF ÍSEO 10 NO: 47) RTSTLAS (SEO ID NO: 30) QQWSGYPFT ÍSEO ÍD NO; 31) 2 SISSRV SSTYLF f$EO IO NO : 48) RTSTLAS (SEO ID NO: 30) QQWSGYPFT ^ (SEO IDNO: 3!) 3 SWSSRVSSTYLF fSBQIDNO: 49) RTSTLAS ÍSEO ID NO: 30} : QQWSGYPFT (SÉQ ID NO: 31) 4 SACSRVSSTYLF ÍSEO 1D NO: SOI RTSTLAS (SEO ID NO: 30} QQWSGYl¥f''n ÍSEO IDNO: 31) 5 sassrwstyíf ÍSEQ IDNO: 51} RTSTLAS ÍSIO ID NO: 30) QQWSGYPFT CSEQ ID NO: 31) ê SASSRVSSTYLF RTSPLAS QQWSGYPFT ÍSEO ID NO: 43) ÍSEO ID NO: 53) ÍSEO ID NO: 31) 7 SÃSSRVSSTYLV ÍSEQ ID NO: 43) RTSA.LAS ÍSEO ID NO: 54) qqwsgypfF| ÍSEO I.DNO: 31) 8 SASSRVSSTYLF ÍSEO ID NO: 43) RTSWLÃS (SEO ID NO: 55) QQWSGYPFT (SEO ID NO: 3 í} SASSRVSSTYLF (SEO ID NO: 43) RTSTGAS (SEQIDNO: 56) QQWSGYPFT Í$EQ ID NO: 31) ! i§ SASSRVSSTYLF (SEO IDNO: 43) RTSTLTS (SEO ID NO: 57) QQWSGYPFT I ÍSEQ ÍD NO: 3 í) i fu 1 SÀ^RVSSTYLF ÍS1QIDNO: 43) RTSTLVS (SEO ID NO: 58) QQWSGYPFT ÍSEQ IDNO: 31) SASSRVSSTYLF ÍSEO IDNO: 43) RTSTLLS ÍSEO ÍD NO: 59) QQWSGYPFT ÍSEQ ÍD NO: 31) 13 SASSRVSSTYLF ÍSEO IDNO: 43} RTSTLAS ÍSEO ID NO: 30) QQWSGYPFV ÍSIQ ÍD NO: 61) | Consenso 1 SX,X3SXiVSSTYLF...... RTSXDWS QQWSGYPFX? ÍSEO ÍD NO: 52) (SEO ID NO; 60) (SEQ ID NO: 62}

*Xi é A, L, I ou W; X2 é S ou G; X3 é R ou S; X4 é T, P, A ou W; X5 é L ou G; X6 é A, T, V ou L; X7 é T ou V ΡΕ2209806 27

Tabela 2 : .Fab HCDRi HCOR2 HCDR3 I j mm άΫΤπΐΥΡΙΕ (SEOID NO; 271 NFHPYNGDTNYNEKFKG ÍSEQ ID NO: 28) GGTGSFDY (SEOID NO: 46) |3I&2 GYTFYIYPJS ÍSEQ ID HO: 29) NFHPYKG LTNYN EKFKG (SEOIDNO: 33) GGTGSFDY j (SEOID NO: 46) | mn GYTFTTYRS (SEOID HO: 32) NFHPYLODTNYRE^FKO ÍSEQ ID NO: 44) GGTGSFDY | (SEOIDNO: 46) j 1.4 OYTFLíYPiS (SEQ ID NO: 63) NFMPYLGDTNYWEKFKG ÍSEQ ID NO: 44) GGTGSFDY | (SEOIDNO:46) ! ; is gytfwíypís ÍSEQ ID NO: 64) .NFH.PYy3DTNYNEKF.K6 GGTGSFDY ÍSEQ ID NO: 46) j u GYTFTIYPJS ÍSEQ ID NO: 321 NFHPYiQTTNYNEKJFKG (SEOID NO: 66) GGTGSFDY | (SEOID NO: 46) 1 17 OYTrriYPÍS (SEOID NO: 321 NFHPYLOLTNYNEKFKG (SEOIDNO: 67) GGTGSFDY | (SEOIDNO:46) j j 18 OYTrriYPis (SEOID NO: 32) NFMFYLGVTNYN EKFKG (SEOID NO: 68) GGTGSFDY 1 (SEQ ID NO: 46}..... 1$ GYTFTtYPIS ÍSEQ ID NO: 32) NFHPYLOMTNYNEKFKQ GGTGSFDY (SEOID NO: 46) 1 \Ú GYTFTlYPiS (SEQ ID NO; 321 NFHPYLGDANYNEKFKO (SEOIDNO: 70) GGTGSFDY (SEOIDNO:46) ... 21 GYTrsrms ÍSEQ ID NO; 32) NFHPYLGDTN YN EKFKG ÍSEQ ID NO; 44) GGFGSFDY (SEOIDNO: 72) 22 GYTFT1YP1S ÍSEQ ÍD NO: 32) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEO ID NO: 44) GGTGAFDY \ (SEOIDNO: 73) 23 OYTFtíYm ÍSEQ ID NO: 32) NFHPYLODTNYNEKFKG (SEOID NO: 44) ÒGTGSFPY \ ÍSEO ID NO: 74) • Consenso GYTFXslYPI Xo (SEQ Í.D NQ: 65) NFRPYLGXseXj jNYNEKFKÒ (SEQ ID NQ; 7Í) GGXj^XíJXhYI (SEQ ID NO: 75) [ * X8 é T, W, Y ou L; X9 é S ou E; Xio é D Xn é T ou A; X12 é T ou F; X13 é S ou A; Xl4

As SEQ ID NOs das sequências de aminoácidos e as sequências de consenso de aminoácidos que codificam CDR mais preferidas para anticorpos da presente invenção estão apresentadas na Tabela 3 adiante. ΡΕ2209806 28

Tabela 3

Fab LCQRI SEQ1D NO: LCPR2 SEQ m NO: ECDE3 SEQ II) NO: HCDR1 SEQ ΪΡ NCh WCDR2 : SEQ 1D NO: HCDR3 SEQ IP NÓí *3 43 57 61 ! 63 80 46 1,7 43 58 61 32 m 46 1.10 43 53 61 1 63 82 46 1.13 43 57 61 | 63 83 46 1*15 43 3» 61 ! 63 82 46 3,2 43 53 61 63 84 46 M 43 53 61 32 84 46 3*7 57 61 63 85 46 3J 43 53 31 63 84 46 43 53 61 63 86 46 3 ΛΖ ....... 43.......... 57 61 63 84 46 43 53 61 63 85 46 43 30 .....31........... 32 44 46 1,1.5 — 4! 53 31 63 84 46 1ÍM ..........43 53 31 78 84 46 i * _ Consenso 42 76 62 19 87 46

As regiões constantes da cadeia leve humanas são classificados como kapa ou lambda e caracterizada por uma região constante especifica como é conhecido na arte. As rregiões constantes da cadeia pesada humanas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, épsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente, e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4. Cada tipo de cadeia pesada tem uma região constante especifica com uma sequência prontamente conhecida na arte. A região constante de cadeia leve kapa e as regiões constantes de cadeia pesada de IgGi, IgG2 e IgG4 são regiões constantes preferidas nos anticorpos da invenção. Regiões constantes da cadeia pesada humanas preferidas para os ΡΕ2209806 anticorpos da presente invenção são as sequências de aminoácidos da região constante da cadeia pesada indicadas nas SEQ ID NOs: 90-94 e qualquer variante sua com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou cerca de 15 alterações de aminoácidos (incluindo substituições, inserções ou deleções). Mais preferencialmente, regiões constantes de cadeia pesada humana dos anticorpos da presente invenção são as sequências de aminoácidos da região constante de cadeia pesada como indicado nas SEQ ID NOs: 93 e 94. Mais preferencialmente, a região constante de cadeia pesada humana dos anticorpos da presente invenção é a sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada indicada na SEQ ID NO: 93. Regiões constantes de cadeia leve humanas preferidas dos anticorpos da presente invenção são a sequência de aminoácidos da região constante kapa de cadeia leve indicada na SEQ ID NO: 89 e qualquer variante sua com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9 ou cerca de 10 alterações de aminoácidos (incluindo substituições, inserções ou deleções). Mais preferencialmente, a região constante de cadeia leve humana dos anticorpos da presente invenção é a sequência de aminoácidos da região constante kapa de cadeia leve indicada na SEQ ID NO: 89.

Tal como aqui utilizado, a "região de ligação ao antigénio" ou "porção de ligação ao antigénio" refere-se à porção de uma molécula de anticorpo, no seio da região variável, que contém os residuos de aminoácidos que interactuam com um antigénio e conferem ao anticorpo a sua especificidade e afinidade para o antigénio. Esta porção do 30 ΡΕ2209806 anticorpo inclui a estrutura de residuos de aminoácidos necessária para manter a conformação adequada dos residuos de ligação ao antigénio. A presente invenção inclui um anticorpo que se liga selectivamente a hepcidina-25 com uma KD de 800 pM ou menos determinada por SPR a 25 °C e em que o anticorpo compreende pelo menos uma CDR seleccionada do grupo que consiste em i) uma HCDR3 tendo a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 75 e ii) uma LCDR3 tendo a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 62. Preferencialmente, esse anticorpo compreende seis CDR compreendendo sequências de aminoácidos e/ou de aminoácidos de consenso seleccionadas do grupo que consiste em: (i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NO: 52, 60, 62, 65, 71 e 75, respectivamente e (ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NO: 42, 76, 62, 79, 87 e 46, respectivamente. Mais preferencialmente, um anticorpo da presente invenção compreende seis CDR seleccionadas do grupo que consiste em: (i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NO: 41, 53, 31, 63, 84 e 46, respectivamente, (ii) LCDRl, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NO: 43, 30, 31, 32, 44 e 46 , respectivamente, (iii) LCDRl, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 43, 53, 61, 63, 85 e 46, respectivamente e (iv) 31 ΡΕ2209806 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NO: 43, 57, 61, 63, 84 e 46, respectivamente. Ainda mais preferencialmente, o anticorpo da invenção compreende dois poli-péptidos de cadeia pesada e dois polipéptidos de cadeia leve, e em que cada um dos polipéptidos de cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 9 e cada um dos polipéptidos de cadeia leve tem a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 17. Ainda mais preferencialmente, o anticorpo tem uma IC5o entre 100 nM e 50 nM no ensaio de internalização de ferroportina induzida por hepcidina descrito no Exemplo 3, uma velocidade de dissociação de hepcidina-25 humana entre 5,5 x 10“4 s’1 e 2,0 x 10~4 s”1, determinada por SPR a 25°C, e liqa-se selectivamente a hepcidina-25 humana com uma KD entre 100 pM e 50 pM. Mais preferencialmente ainda, o anticorpo da invenção compreende dois polipéptidos de cadeia pesada e dois polipéptidos de cadeia leve, e em que cada um dos polipéptidos de cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 8 e cada um dos polipéptidos de cadeia leve tem a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 16, em que o anticorpo tem uma IC5o entre 100 nM e 50 nM no ensaio de internalização de ferroportina induzida por hepcidina descrito no Exemplo 3, uma velocidade de dissociação de hepcidina-25 humana entre cerca de 5,5 x 10”4 s”1 e 2,0 x 10~4 s”1, determinada por SPR a 25°C, e liga-se selectivamente a hepcidina-25 humana com uma KD entre cerca 100 pM e 50 pM. 32 ΡΕ2209806

Outros anticorpos preferidos da invenção compreendem uma LCVR tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 124, 125, 126 e 127. Mais preferencialmente, um anticorpo da invenção compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 148, 128, 150 e 151. Ainda mais preferencialmente, um anticorpo da invenção compreende uma LCVR de SEQ ID NO: 12 6 e uma HCVR de SEQ ID NO: 148. Ainda mais preferencialmente, um anticorpo da invenção compreende uma LCVR de SEQ ID NO: 127 e uma HCVR de SEQ ID NO: 128. Ainda mais preferencialmente, um anticorpo da invenção compreende uma LCVR de SEQ ID NO: 125 e uma HCVR de SEQ ID NO: 151. Um anticorpo mais preferido da invenção compreende uma LCVR de SEQ ID NO: 124 e uma HCVR de SEQ ID NO: 150. Essas LCVR estão preferencialmente ligadas a uma região constante da cadeia leve de origem humana ou derivada de uma região constante da cadeia leve de origem humana, preferencialmente uma cadeia kapa humana e mais preferencialmente uma cadeia kapa de SEQ ID NO: 89. Essas HCVR estão preferencialmente ligadas a uma região constante da cadeia pesada de origem humana ou derivada de uma região constante da cadeia pesada de origem humana, preferencialmente IGGi, IgG2 ou IgG^, mais preferencialmente uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93 e 94, e mais preferencialmente uma região constante de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93. Preferencialmente, o anticorpo tem uma IC50 entre 100 nM e 50 nM no ensaio de internalização de ferroportina 33 ΡΕ2209806 induzida por hepcidina descrito no Exemplo 3, uma velocidade de dissociação de hepcidina-25 humana entre 5,5 x IO”4 s”1 e 2,0 x 10”4 s”1, determinada por SPR a 25°C, e liga-se selectivamente a hepcidina-25 humana com uma KD entre 100 pM e 50 pM.

Um anticorpo da invenção pode compreender um polipéptido de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 6 e um polipéptido de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 14. Um polipéptido de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 6 pode ser codificado por uma sequência de poli-nucleótidos de SEQ ID NO: 2. Um polipéptido de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 14 pode ser codificado por um polinucleótido tendo a sequência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 10.

Um anticorpo da invenção compreende um polipéptido de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 7 e um polipéptido de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 15. Um polipéptido de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 7 pode ser codificado por uma sequência de polinucleotídicos de SEQ ID NO: 3. Um polipéptido de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 15 pode ser codificado por um polinucleótido tendo a sequência de ácidos nucleicos indicada na SEQ ID NO: 11. 34 ΡΕ2209806

Um anticorpo da invenção também compreende um polipéptido de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 8 e um polipéptido de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 16. Um polipéptido de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 8 pode ser codificada por uma sequência de poli-nucleótidos como indicado na SEQ ID NO: 4. Um polipéptido de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 16 pode ser codificado por um polinucleótido tendo a sequência de ácidos nucleicos como indicado na SEQ ID NO: 12.

Noutra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende uma polipéptido de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 9 e um polipéptido de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 17. Um polipéptido de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 9 pode ser codificado por uma sequência de polinucleótidos de SEQ ID NO: 5. Um polipéptido de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 17 pode ser codificado por um polinucleótido tendo a sequência de ácidos nucleicos como indicado na SEQ ID NO: 13.

Os anticorpos humanos modificados preferidos da invenção são aqui referidos como Mabs L1.5, Hu22, 3.12, e 3.23. As SEQ ID NO das sequências de aminoácidos que 35 ΡΕ2209806 codificam as cadeias pesadas, as cadeias leves, as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, e as CDRs para os Mabs L1.5, Hu22, 3.12, 3.23 estão apresentadas na Tabela 4 adiante.

Tabela 4 Mí>6 H«mv> Cfraitt Ligfct CíMin HCVR HC &>Ri HC C»R2 HC CBR3 LCV R LC CDRI LC anu LC i omí LI.5 6 14 148 63 84 46 126 4f 53 31 H»22 7 15 128 n 44 46 127 43 30 31 3.12 $ 16 ISO 63 M 46 124 43 57 61 1 3.23 9 1? 151 £3 85 46 125 43 53 61 São utilizadas técnicas correntes de biologia molecular para preparar o vector de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, seleccionar linhas de células hospedeiras isoladas, transformantes, produtoras de um anticorpo da invenção, cultura destas células hospedeiras e recuperação do anticorpo do meio de cultura. A presente invenção também é dirigido a células hospedeiras que expressam um anticorpo anti-hepcidina da invenção. Uma grande variedade de sistemas de expressão hospedeiros conhecidos na arte pode ser utilizada para expressar um anticorpo da presente invenção, incluindo sistemas de expressão procarióticos (bacterianos) e eucarióticos (como células de leveduras, baculovirus, de plantas, de mamíferos e de outros animais, animais transgénicos e células de hibridoma), bem como sistemas de expressão em fagos. 36 ΡΕ2209806

Um anticorpo da invenção pode ser preparado por expressão recombinante de genes de cadeia leve e pesada de imunoglobulina numa célula hospedeira. Para expressar um anticorpo recombinante, uma célula hospedeira é transformada, transduzidas, infectada ou outra semelhante com um ou mais vectores de expressão recombinantes portadores de fragmentos de DNA que codificam as cadeias leve e/ou pesada de imunoglobulina do anticorpo tal modo que as cadeias leve e/ou pesada são expressas na célula hospedeira. A cadeia pesada e a cadeia leve podem ser expressas independentemente a partir de promotores diferentes aos quais estão operativamente ligadas num vector ou, alternativamente, a cadeia pesada e da cadeia leve podem ser expressas independentemente a partir de promotores diferentes aos quais estão operativamente ligadas em dois vectores - um que expressa a cadeia pesada e um que expressa a cadeia leve. Opcionalmente, a cadeia pesada e a cadeia leve podem ser expressas em células hospedeiras diferentes.

Além disso, o vector de expressão recombinante pode codificar um péptido de sinais que facilita a secreção da cadeia leve e/ou pesada do anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene da cadeia leve e/ou pesada do anticorpo pode ser clonado no vector de tal modo que o péptido de sinais fica operativamente ligado em fase ao terminal amino do gene da cadeia de anticorpo. 0 péptido de sinais pode ser um péptido de sinais de imunoglobulina ou ΡΕ2209806 um péptido de sinais heterólogo. Preferencialmente, os anticorpos recombinantes são segregados para o meio no qual as células hospedeiras são cultivadas, a partir do qual os anticorpos podem ser recuperados ou purificados.

Um DNA isolado que codifica uma HCVR pode ser convertido num gene de cadeia pesada de comprimento completo por ligação operativamente do DNA que codifica a HCVR a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada. As sequências de genes de regiões constantes de cadeia pesada de seres humanos, bem como de outros mamíferos, são conhecidas na arte. Os fragmentos de DNA que incluem estas regiões podem ser obtidos por exemplo, por amplificação por PCR corrente. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de qualquer tipo, (e.g., IgG, IgA, IgE, IgM ou IgD) , classe (e.g., IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4) ou subclasse e qualquer sua variante alotipica como descrito em Kabat (supra) .

Um DNA isolado que codifica uma região LCVR pode ser convertido num gene de cadeia leve de comprimento total (bem como num gene de cadeia leve Fab) por ligação operativamente do DNA que codifica LCVR a outra molécula de DNA que codifica uma região constante de cadeia leve. As sequências de genes de regiões constantes de cadeia leve de seres humanos, bem como de outros mamiferos, são conhecidas na arte. Os fragmentos de DNA que incluem estas regiões podem ser obtidos por amplificação por PCR corrente. A 38 ΡΕ2209806 região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kapa ou lambda.

Além do ou dos genes de cadeia pesada e/ou leve do anticorpo, um vector de expressão recombinante da invenção transporta sequências reguladoras que controlam a expressão do ou dos genes das cadeias do anticorpo numa célula hospedeira. 0 termo "sequência reguladora" pretende incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controlo da expressão (e.g., sinais de poliadenilação) , consoante necessário, que controlam a transcrição ou tradução do ou dos genes das cadeias do anticorpo. A concepção do vector de expressão, incluindo a selecção de sequências reguladoras, pode depender de factores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão da proteina desejado. As sequências reguladoras preferidas para a expressão de células hospedeiras de mamifero incluem elementos virais que dirigem altos niveis de expressão da proteina em células de mamíferos, como promotores e/ou potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) , virus simio 40 (SV40), adenovirus (e.g., o promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP)) e/ou virus polioma.

Além disso, os vectores de expressão recombi-nantes da invenção podem transportar sequências adicionais, como sequências que regulam a replicação do vector em células hospedeiras (e.g., origens de replicação) e um ou mais genes marcadores seleccionáveis. O gene marcador seleccionável facilita a selecção de células hospedeiras em 39 ΡΕ2209806 que o vector foi introduzido. Por exemplo, tipicamente o gene marcador seleccionável confere resistência a fármacos, como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vector foi introduzido. Genes marcadores seleccionáveis preferidos incluem o gene de di-hidrofolato redutase (dhfr) (para utilização em células hospedeiras menos dhrf com selecção/amplificação de metotrexato),O gene neo (para selecção de G418) e glutamina sintetase (GS) numa linha celular negativa a GS (como NSO) para selecção/amplificação.

Para a expressão de cadeias leves e/ou pesadas, o vector, ou vectores, de expressão que codifica as cadeias pesadas e/ou leves é introduzido numa célula hospedeira por técnicas correntes, e.g., electroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção em DEAE-dextrano, trans-dução, infecção e outras semelhantes. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, são preferidas as células eucarióticas e mais preferencialmente células hospedeiras de mamífero, porque essas células são mais propensos a agregar-se e segregar um anticorpo correctamente dobrado e imunologicamente activo. As células hospedeiras de mamífero preferidas para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem de células de ovário de cobaio chinês (células CHO) [incluindo células CHO menos dhfr, como descrito em Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-20, 1980, utilizadas com um marcador seleccionável DHFR, e.g., como descrito em Kaufman 40 ΡΕ2209806 e Sharp, J. Mol. Biol., 159:601-21, 1982], células de mieloma NSO, células COS e células SP2/0. Quando vectores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpos são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos por cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferencialmente, a secreção do anticorpo para o meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas em condições apropriadas conhecidas na arte. Os anticorpos podem ser recuperados a partir da célula hospedeira e/ou do meio de cultura através de métodos de purificação correntes.

As células hospedeiras também podem ser utilizadas para produzir porções, ou fragmentos, de anticorpos intactos, e.g., fragmentos Fab ou moléculas scFv por técnicas que são convencionais. Por exemplo, pode ser desej ável transfectar uma célula hospedeira com DNA que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada de um anticorpo desta invenção. A tecnologia de DNA recombinante também pode ser utilizada para remover alguns ou todo o DNA que codifica uma ou ambas as cadeias leve e pesada que não é necessário para a ligação a hepcidina-25 humana. As moléculas expressas a partir dessas moléculas de DNA truncadas também estão abrangidas pelos anticorpos da invenção. A invenção proporciona uma célula hospedeira 41 ΡΕ2209806 compreendendo uma molécula de ácido nucleico da presente invenção. Preferencialmente, uma célula hospedeira da invenção compreende um ou mais vectores ou construções compreendendo uma molécula de ácido nucleico da presente invenção. Por exemplo, uma célula hospedeira da invenção é uma célula em que foi introduzido um vector da invenção, compreendendo o referido vector um polinucleótido que codifica uma LCVR de um anticorpo da invenção e/ou um polinucleótido que codifica uma HCVR da invenção. A invenção também proporciona uma célula hospedeira em que foram introduzidos dois dos vectores da invenção; uma compreendendo um polinucleótido que codifica uma LCVR de um anticorpo da invenção e uma compreendendo um polinucleótido que codifica uma HCVR presente num anticorpo da invenção e cada um ligado operativamente a elementos reguladores potenciadores/promotores (e.g., derivados de SV40, CMV, adenovirus e outros semelhantes, como um elemento regulador promotor de CMV/intensificador de AdMLP ou um elemento regulador promotor de SV40/intensificador de AdMLP) para provocar altos niveis de transcrição dos genes.

Uma vez expressos, os anticorpos intactos, Formas de imunoglobulina Uma vez expressa, os anticorpos intactos, cadeias leves e pesadas individuais, ou outras formas de imunoglobulinas da presente invenção, podem ser purificados de acordo com procedimentos correntes na arte, incluindo precipitação com sulfato de amónio, permuta iónica, afinidade (e.g., Proteína A), cromatografia em coluna de interacção hidrófoba, de fase inversa, cromatografia de 42 ΡΕ2209806 hidroxilapatite, electroforese em gel e outros semelhantes. Os procedimentos correntes para purificação de anticorpos terapêuticos estão descritos, por exemplo, por Feng Li, Joe X. Zhou, Xiaoming Yang, Tim Tressel e Brian Lee, num artigo intitulado "Current Therapeutic Antibody Production and Process Optimization" (BioProcessing Journal, Sept./Oct. 2005), por exemplo. Além disso, as técnicas correntes para a remoção de virus de preparações de anticorpos expressos recombinantemente são também conhecidas na arte (ver, por exemplo, Gerd Kern e Mani Krishnan, "Virai Removal by Filtration: Points to Consider" (Biopharm International, Oct. 2006)). A eficácia da filtração para remover virus de preparações de anticorpos terapêuticos é conhecida por ser, pelo menos em parte, dependente da concentração de proteína e/ou do anticorpo na solução a ser filtrada. O processo de purificação para anticorpos da presente invenção pode incluir um passo de filtração para remover vírus da corrente principal de uma ou mais operações de croma-tografia. Preferencialmente, antes da filtração através de um nano filtro de qualidade farmacêutica para remover vírus, uma corrente principal de cromatografia contendo um anticorpo da presente invenção é diluída ou concentrada para dar uma concentração de proteína total e/ou concentração de anticorpo total de 1 g/L a cerca de 3 g/L. Ainda mais preferencialmente, o nanofiltro é um nanofiltro DV20 (e.g., Pall Corporation; East Hills, NY) . São preferidas imunoglobulinas substancialmente puras de pelo menos 90%, cerca de 92%, cerca de 94% ou cerca de 96% de homogeneidade, e ainda mais preferidas com cerca de 98 a 43 ΡΕ2209806 cerca de 99% ou mais de homogeneidade, para utilizações farmacêuticas. Uma vez purificados, parcialmente ou até à homogeneidade, consoante desejado, os anticorpos estéreis podem então ser utilizados terapeuticamente, como aqui indicado.

Tendo em conta a discussão anteriormente mencionada, a presente invenção é ainda dirigida a um anticorpo que pode ser obtido por um processo compreendendo os passos de cultura de uma célula hospedeira, incluindo, mas não limitada a uma célula de mamífero, planta, bactéria, animal transgénico ou planta transgénica que foi transformada por um polinucleótido ou um vector compreendendo moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos da invenção de modo que o ácido nucleico é expresso e, opcionalmente, recuperando o anticorpo do meio de cultura da célula hospedeira. Preferencialmente, a célula hospedeira compreende um vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NOs: 14, 15, 16 ou 17. Mais preferencialmente, a célula hospedeira compreende um vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico como ilustrado na SEQ ID NO: 12 ou 13. Ainda mais preferencialmente, a célula hospedeira transformada é uma célula de ovário de cobaio chinês, de mieloma NSO, COS, ou SP2/0. A presente invenção é ainda dirigida a um método de produção de um anticorpo da invenção compreendendo os ΡΕ2209806 passos de transformação de uma célula hospedeira, incluindo, mas não se limitada a uma célula de mamífero, planta, animal, bacteriana, animal transgénica ou planta transgénica com um polinucleótido ou um vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo da invenção de modo que o ácido nucleico é expresso e recuperando o anticorpo do meio de cultura da célula hospedeira. Preferencialmente, a célula hospedeira é transformada com um vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos indicada nas SEQ ID NOs: 14, 15, 16 ou 17. Mais preferencialmente, a célula hospedeira foi transformada com um vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico como ilustrado na SEQ ID NO: 12 ou 13. Ainda mais preferencialmente, a célula hospedeira é uma célula de ovário de cobaio chinês, mieloma NSO, COS, ou SP2/0. 0 termo "polinucleótido isolado" tal como aqui utilizado significa um polinucleótido de origem genómica, cDNA ou sintética ou alguma combinação sua que, em virtude da sua origem, o polinucleótido isolado (1) não está associado à totalidade ou a uma porção de um polinucleótido em que o polinucleótido isolado é encontrado na natureza, (2) está ligado a um polinucleótido ao qual não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. 0 termo "proteína isolada" aqui referido 45 ΡΕ2209806 significa que uma proteína de um indivíduo (1) está livre de pelo menos algumas outras proteínas com as quais seria normalmente encontrada, (2) está essencialmente livre de outras proteínas da mesma fonte, e.g., da mesma espécie, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separada de pelo menos cerca de 50 por cento de polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com os quais está associada na natureza, (5) não está associada (por interacção covalente ou não covalente) com porções de uma proteína com a qual a "proteína isolada" está associado na natureza, (6) está operativamente associada (por interacção covalente ou não covalente) a um polipéptido ao qual não está associado na natureza, ou (7) não ocorre na natureza. Essa proteína isolada pode ser codificada por DNA genómico, cDNA, mRNA ou outro RNA, de origem sintética, ou qualquer combinação sua. Preferencialmente, a proteína isolada é substancialmente purificada a partir de proteínas ou polipéptidos ou outros contaminantes que são encontrados no seu ambiente natural que possam interferir com a sua utilização (terapêutica, de diagnóstico, profilática, de investigação ou outra).

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que iriam interferir com as utilizações de diagnóstico ou terapêuticas do anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em formas de realização preferidas, um anticorpo vai ser purificado (1) até mais do que 95% em 46 ΡΕ2209806 peso de anticorpo, determinado pelo método de Lowry e mais preferencialmente mais dp que 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou sequência de aminoácidos interna por utilização de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE em condições não redutoras ou reduzindo utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, coloração de prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ no seio de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não vai estar presente.

Tal como aqui utilizado, "substancialmente puro" ou "substancialmente purificado" significa um composto ou espécies que é a espécie predominante presente (i.e., numa base molar é mais abundante do que quaisquer outras espécies individuais da composição). Em certas formas de realização, uma composição substancialmente purificada é uma composição em que a espécie compreende pelo menos 50 por cento (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em certas formas de realização, uma composição substancialmente pura vai conmpreender mais do que 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de todas as espécies macromolares presentes na composição. Em certas formas de realização, a espécie é purificada até à homogeneidade essencial (as espécies contaminantes não podem ser detec-tadas na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente numa única espécie macromolecular. 47 ΡΕ2209806 A presente invenção proporciona ainda um poli-nucleótido isolado que codifica a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 124, 125, 126, 127, 128, 148, 150 e 151.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona um vector de expressão recombinante compreendendo polinucleótido que codifica a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 124, 125, 126, 127, 128, 148, 150 e 151. A frase "anticorpos humanos geneticamente modificados" tal como aqui utilizada refere-se a um anticorpo em que pelo menos uma porção é de origem humana. Além disso, tal como aqui utilizada, a frase "anticorpos humanos geneticamente modificados" refere-se aos anticorpos específicos aqui descritos, bem como a anticorpos adicionais que têm propriedades funcionais semelhantes de acordo com a invenção como os anticorpos aqui descritos e têm regiões estruturais que são substancialmente humanas ou totalmente humanos circundantes das CDRs que são derivadas de um anticorpo não humano. Estruturas substancialmente humanas são as que têm pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência da estrutura da linha germinal humana conhecida. Preferencialmente, as estruturas substancialmente humanas têm pelo menos 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99% de identidade de sequência com uma sequência da estrutura da linha germinal humana conhecida. 48 ΡΕ2209806

Mais preferencialmente, os anticorpos humanos geneticamente modificados da presente invenção contêm uma sequência minima derivada de um anticorpo não humano.

Por exemplo, o anticorpo humano geneticamente modificado pode compreender porções derivadas de um anticorpo de origem não humana, como um murganho, e porções derivadas de um anticorpo de origem humana, unidas umas à outras, e.g., quimicamente por técnicas convencionais (e.g., sintéticas) ou preparado como um polipéptido contigua utilizando técnicas de engenharia genética. Tal como aqui utilizado, o termo "estrutura" quando utilizado em referência a uma região variável do anticorpo é inserido para significar todos os resíduos de aminoácidos fora das CDRs no seio da região variável de um anticorpo. Tal como aqui utilizado, o termo "região estrutural" pretende significar cada domínio da estrutura que está separado pelas CDRs. As regiões estruturais para a cadeia leve são igualmente separadas por cada uma das CDRs das regiões variáveis da cadeia leve. Preferencialmente, a região variável da cadeia leve e/ou a região variável da cadeia pesada compreende uma estrutura ou pelo menos uma porção de uma região estrutural (e.g., contendo 2 ou 3 subregiões, como FR2 e FR3) . Mais preferencialmente pelo menos FRL1, FRL2, FRL3 ou FRL4 é totalmente humana ou pelo menos FRH1, FRH2, FRH3 ou FRH4 é totalmente humana. Ainda mais preferencialmente pelo menos FRL1, FRL2, FRL3 ou FRL4 é uma sequência da linha germinal (e.g., da linha germinal humana) ou compreende sequências de consenso humanas para a 49 ΡΕ2209806 estrutura particular conhecida na arte e/ou pelo menos FRH1, FRH2, FRH3 ou FRH4 é uma sequência da linha germinal (e.g., da linha germinal humana) ou compreende sequências de consenso humanas para a estrutura particular. Em formas de realização preferidas, um anticorpo do presente invenção compreende sequências de estrutura de cadeia leve da linha germinal humana e sequências de estrutura de cadeia pesada da linha germinal humana (ver, e.g., PCT WO 2005/005604).

Mais preferencialmente, as estruturas da cadeia leve da linha germinal humana são seleccionadas do grupo que consiste em: All, A17, A18, AI 9, A20, A27 , A30, Ll, Ll 1, L12, L2, L5, L6, L8, 012 , 018, 02 e 08. Ainda mais preferencialmente, a estrutura da cadeia leve da linha germinal humana é 02 ou 018. Mais preferencialmente ainda, a estrutura da cadeia leve da linha germinal humana é 02. Além disso, as estruturas da cadeia pesada de linha germinal humana preferidas são seleccionadas do grupo que consiste em: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-24, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, VH5-51, VH3-73, VH1-58, VH1-3 e VH1-2. Ainda mais preferencialmente, a estrutura da cadeia pesada da linha germinal humana é VH1-69 ou VH1-18. Mais preferencialmente ainda, a estrutura da cadeia pesada da linha germinal humana é VH1-69

Anticorpos humanos modificados geneticamente para além dos aqui descritos que se ligam selectivamente a hepcidina-25 humana com as propriedades funcionais de ΡΕ2209806 acordo com a invenção podem ser gerados utilizando várias abordagens diferentes. Os anticorpos específicos aqui descritos podem ser usados como um modelo ou anticorpo parental para fazer anticorpos adicionais. Numa abordagem as CDRs do anticorpo parental são enxertadas numa estrutura humana que tem uma elevada identidade de sequência com a estrutura do anticorpo parental. A identidade de sequência da nova estrutura vai ser geralmente de pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90% com a estrutura correspondente no anticorpo parental. Este enxerto pode resultar numa redução da afinidade de ligação em comparação com o anticorpo parental. Se for este o caso, a estrutura pode ser retromutada à estrutura progenitora em certas posições com base em critérios específicos publicados por Queen et al. A identificação de resíduos a considerar para retromutação pode ser realizada como se segue: Quando um aminoácido cai na categoria seguinte, o aminoácido da estrutura da sequência germinal humana que está a ser utilizada (estrutura aceitadoras) é substituído por um aminoácido da estrutura de uma estrutura do anticorpo progenitor (estrutura doadora): (a) o aminoácido da estrutura humana da estrutura aceitadora é invulgar para estruturas humanas nessa posição, enquanto que o correspondente aminoácido na imunoglobulina doadora é típico de estruturas humanos nessa posição; (b) a posição do aminoácido é imediatamente adjacente a uma das CDRs; ou 51 ΡΕ2209806 (c) qualquer átomo da cadeia lateral de um aminoácido da estrutura está dentro de 5-6 angstroms (centro-a-centro) de qualquer átomo de um aminoácido da CDR num modelo tridimensional da imunoglobulina [Queen, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 2869 (1991)].

Quando cada um dos aminoácidos na estrutura humana da estrutura aceitadora e um correspondente aminoácido na estrutura doadora é genericamente invulgar para estruturas humanas nessa posição, esse aminoácido pode ser substituido por um aminoácido típico para estruturas humanas nessa posição. Este critério de retromutação permite recuperar a actividade do progenitor.

Outra abordagem seria a mutação aleatória das CDRs enxertadas sem alterar a estrutura e rastrear esse anticorpos quanto à afinidade de ligação que é tão bom ou melhor do que o anticorpo progenitor. Além disso, é possível uma combinação de ambas estas abordagens. Após o enxerto, regiões estruturais específicas podem ser retromutadas, além de se fazer alterações nas CDRs. Esta metodologia geral está descrita por Wu et ai. (1999), "Humanization of a murine monoclonal antibody by simultaneous optimization of framework and CDR residues", J. Mol. Biol., 294: 151-162.

Tal como aqui utilizado, o termo "doador" pretende significar uma molécula de anticorpo progenitor ou 52 ΡΕ2209806 um seu fragmento a partir do qual uma porção é derivada, dada ou contribui para a outra molécula de anticorpo ou um seu fragmento, de modo a conferir tanto uma caracteristica estrutural como funcional da molécula progenitora à molécula receptora. Para o exemplo especifico de enxerto de CDR, a molécula progenitora a partir da qual as CDRs enxertadas são derivadas é uma molécula doadora. As CDRs de doadores conferem afinidade de ligação da molécula progenitora à molécula receptora. Deve ser entendido que uma molécula doadora não tem de ser de uma espécie diferente da molécula receptora de seu fragmento. Em vez disso, é suficiente que o doador seja uma molécula separada e distinta.

Tal como aqui utilizado, o termo "aceitador" pretende significar uma molécula de anticorpo ou um seu fragmento que vai receber a porção doada pelo progenitor ou molécula de anticorpo doador ou seu fragmento. Uma molécula de anticorpo aceitador ou um seu fragmento fica, portanto, com a caracteristica estrutural ou funcional da porção doada da molécula progenitora. Para o exemplo especifico do enxerto de CDR, a molécula receptora para a qual as CDRs são enxertadas é uma molécula aceitadora. A molécula ou fragmento de anticorpo aceitador fica com a afinidade de ligação das CDRs doadoras ou molécula progenitora. Tal como acontece com uma molécula de doador, entende-se que uma molécula aceitadora não tem de ser de uma espécie diferente da doadora. 53 ΡΕ2209806

Uma "região variável" quando utilizada em referência a um anticorpo ou uma sua cadeia pesada ou leve pretende significar a porção terminal amino de um anticorpo que confere ligação a antigénio à molécula e que não é a região constante. 0 termo pretende incluir os seus fragmentos funcionais que mantêm alguma de toda a função de ligação da totalidade da região variável. Portanto, o termo "fragmentos de ligação da região variável heteromérica" pretende significar pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de cadeia leve ou fragmentos funcionais seus agregados num complexo heteromérico. Os fragmentos de ligação da região variável heteromérica incluem, por exemplo, fragmentos funcionais, tais como Fab, F(ab)2, Fv, Fv de cadeia única (scFv) e outros semelhantes. Esses fragmentos funcionais são bem conhecidos pelos especialistas na matéria. Consequentemente, a utilização destes termos na descrição de fragmentos funcionais de uma região variável heteromérica pretende corresponder às definições bem conhecidos pelos especialistas na matéria. Esses termos estão descritos em, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22: 189-224 (1993 ) ; Pluckthun e Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) and in Day, E.D. , Advanced

Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). 54 ΡΕ2209806

Preferencialmente, um anticorpo humano de engenharia genética tem CDRs que têm origem ou são derivadas de um anticorpo progenitor, i.e., um anticorpo não humano, preferencialmente um anticorpo de murganho ou um seu fragmento, como o Fab JXB7 de murganho, enquanto a estrutura e a região constante, na medida em que estiver presente, (ou uma sua porção significativa ou substancial, i.e., pelo menos cerca de 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) são codificadas por informação de sequência de ácido nucleico que ocorre na região da imunoglobulina a linha germinal humana (ver, e.g., a Base de Dadoos International ImMunoGeneTics) ou em formas recombinadas ou mutadas suas quer os referidos anticorpos sejam ou não produzidos numa célula humana. Preferencialmente pelo menos dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs de um anticorpo humano de engenharia genética são optimizados a partir das CDRs de um anticorpo progenitor não humano a partir do qual o anticorpo humano de engenharia genética foi derivado, para gerar uma propriedade desejada, e.g. especificidade, afinidade ou neutralização melhoradas, que pode ser identificada por um ensaio de rastreio, e.g. um ensaio ELISA. Preferencialmente, um anticorpo da invenção compreende uma HCDR3 idêntica à HCDR3 do murganho Fab JXB7 progenitor (i.e., SEQ ID NO: 46) e HCDRq, HCDR2, LCDRq, LCDR2 e LCDR3 compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com a presente no murganho Fab JXB7 progenitor. Certas substituições de aminoácidos nas CDRs de anticorpos humanos de engenharia da invenção em 55 ΡΕ2209806 comparação com as de Fab JXB7 de murganho progenitor diminuem a probabilidade de instabilidade do anticorpo (e.g., a remoção de um ou mais residuos de CDR Asn) ou diminuem a probabilidade de imunogenicidade do anticorpo quando administrado a um indivíduo ser humano (e.g., como previsto por tecnologia de IMMUNOFILTER™ (Xencor, Inc., Monrovia, CA)).

Os anticorpos humanos de engenharia podem ser submetidos a mutagénese in vitro utilizando métodos de rotina usados na arte e, assim, as sequências de aminoácidos da região estrutural da região das HCVRs e LCVRs dos anticorpos recombinantes humanos de engenharia são sequências que, embora derivadas das relacionadas com as sequências de HCVR e LCVR linha germinal humana, podem não existir naturalmente no repertório da linha germinal do anticorpo humano in vivo. Está contemplado que essas sequências de aminoácidos das estruturas HCVR e LCVR dos anticorpos recombinantes humanos de engenharia são pelo menos 85%, cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 98% ou, mais preferencialmente, pelo menos 99% ou, mais preferencialmente ainda, 100% idênticas a uma sequência da linha germinal humana. Em conformidade, os anticorpos humanos de engenharia podem compreender residuos que não se encontram nem no anticorpo receptor nem na CDE ou nas sequências da estrutura importadas do anticorpo progenitor.

Existem vários métodos disponíveis na arte para 56 ΡΕ2209806 gerar anticorpos humanos de engenharia (ver, e.g., publicação do pedido de patente internacional PCT N° WO2006/06046935; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2869 (1991); Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); e Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988)). Por exemplo, anticorpos humanos de engenharia podem ser produzidos por obtenção de sequências de ácidos nucleicos que codificam a HCVR e LCVR de um anticorpo progenitor (por exemplo, um anticorpo murino ou anticorpo feito por um hibridoma) que se liga selectivamente a hepcidina-25, identificando as CDRs na referida HCVR e LCVR (não humanas) e enxertando essas sequências de ácidos nucleicos que codificam CDR em sequências de ácidos nucleicos que codificam estruturas humanas seleccionadas. Opcionalmente, uma região CDR pode ser optimizada por mtagenização aleatória ou em locais específicos para substituir um ou mais aminoácidos da CDR por um aminoácido diferente antes do enxerto da região CDR na estrutura. Alternativamente, uma região CDR pode ser optimizada a seguir à inserção na estrutura humana utilizando métodos disponíveis a um especialista na matéria.

Depois de as sequências de codificação de CDR serem enxertadas em sequências de codificação de estruturas humanas seleccionadas, as sequências de DNA resultantes que codificam sequências pesadas e leves variáveis de engenharia humanas são então expressos para produzir um anticorpo humano de engenharia que se liga selectivamente a hepcidina-25. A HCVR e LCVR humanas de engenharia podem ser 57 ΡΕ2209806 expressas como parte de uma molécula inteira de anticorpo anti-hepcidina-25, i.e., como uma proteína de fusão com sequências de domínio constante humanas. No entanto, as sequências de HCVR e LCVR também podem ser expressas na ausência de sequências constantes para produzir um Fv ou Fab selectivo anti-hepcidina-25 humano de engenharia, por exemplo (ver, e.g., Watkins, J. et al., Anal. Biochem., 253:37-45 (1997) e Watkins, J. et al., Anal. Biochem., 256: 169-177 (1998)) .

Entender-se-á que por aplicação dos ensinamentos da presente invenção, o especialista na matéria pode utilizar técnicas correntes, e.g. mutagénese dirigida ao sítio, para substituir, adicionar ou eliminar aminoácidos no seio das sequências de CDR e de estrutura específicas aqui descritas e, ao fazê-lo, gerar mais sequências de aminoácidos da região variável derivadas das sequências aqui proporcionadas. Até um total dos 21 aminoácidos de ocorrência natural alternativos podem ser introduzidos num sítio de substituição específico. Finalmente, tecnologias de rastreio in vitro ou in vivo, como as aqui descritas no Exemplo 2, estão disponíveis ao técnico para a selecção das sequências de aminoácidos da região variável para fragmentos Fab tendo a afinidade de ligação desejada a polipéptidos hepcidina. Deste modo podem ser identificados fragmentos Fab adicionais que são adequados para a preparação de um anticorpo anti-hepcidina de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, a substituição, adição e supressão de aminoácidos no seio da estrutura está 58 ΡΕ2209806 restringida a uma, duas, três ou quatro posições no seio de uma ou de cada uma das sequências das regiões estruturais (isto é, FRL1, FRL2, FRL3, FRL4, FRH1, FRH2, FRH3, FRH4) aqui descritas. Preferencialmente, a substituição, adição e supressão de aminoácidos no seio das CDRs está restringida a uma a três posições no seio de uma ou cada CDR, mais preferencialmente é realizada a substituição, adição e supressão numa ou duas posições de aminoácidos no seio de uma ou de cada CDR. Uma substituição, adição e supressão de aminoácidos adicional preferida é realizada numa ou duas posições de aminoácidos nas CDRs da região variável da cadeia pesada. Mais preferencialmente a substituição, adição e supressão de aminoácidos adicional é realizada numa ou duas posições de aminoácidos no seio da CDRH2.

As sequências de DNA resultantes que codificam as sequências pesada variável e leve variável humanas de engenharia são então expressas para produzir um anticorpo humano de engenharia que se liga selectivamente a hepcidina-25 humana com afinidade elevada. A HCVR e LCVR humana de engenharia podem ser expressas como parte de uma molécula inteira de anticorpo anti-hepcidina-25, i.e., como uma proteína de fusão com sequências de domínio constante humanas.

Outro aspecto da invenção proporciona métodos de utilização dos anticorpos da invenção em imunoensaios relativamente simples, mas altamente sensíveis e selectivos para a detecção e medição de hepcidina madura em tecidos e 59 ΡΕ2209806 fluidos biológicos humanos para fins de diagnóstico e prognóstico.

Os anticorpos da presente invenção proporcionam os meios para detectar ou determinar com exactidão as quantidades de hepcidina madura num tecido ou fluido biológico de um ser humano para a avaliação de predisposições a doenças promovidas por hepcidina madura e para a detecção e diagnóstico dessas doenças em doentes que delas sofrem. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem ser incorporados em imunoensaios sensíveis e fiáveis, como ELISA, RIA, ensaios de imuno-difusão ou ensaios de imuno-detecção, como ensaios por SPR. Analogamente, os anticorpos da presente invenção também são úteis para ensaios de imuno-histoquimica (IHC) e imunofluorescência (IF) de amostras de tecidos ou fluidos biológica. Essas análises podem ser utilizadas para detectar os niveis aberrantes de hepcidina-25 e, portanto, para diagnosticar doenças promovidas por hepcidina-25. Mais especificamente, a presente invenção proporciona métodos de diagnóstico de uma doença humana promovida por hepcidina madura num doente por determinação do nivel de hepcidina madura humana numa amostra de tecido ou de um fluido biológico do doente e comparação do nivel de hepcidina madura humana na amostra com o nivel de hepcidina madura humana numa amostra correspondente de um ou mais indivíduos de controlo ou com um padrão de referência, detectando assim uma doença associada a niveis elevados de hepcidina madura humana. 0 estado patológico pode compreender um ou mais de uma doença 60 ΡΕ2209806 genética ou não genética associada a niveis séricos diminuídos de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou hematócrito. Preferencialmente, o estado patológico pode compreender uma ou mais de uma doença associada a anemia.

Também é proporcionado um método de monitorização de uma doença, estado ou patologia promovida por hepcidina madura humana num doente. O método inclui a determinação do nível de hepcidina madura humana numa amostra de um tecido ou fluido biológico de um doente que sofre ou está em risco de uma doença, estado ou patologia promovida por hepcidina madura humana num primeiro ponto de tempo; determinação do nível de hepcidina madura humana numa ou mais amostras de tecido ou fluido biológico do doente num ou mais pontos de tempo diferentes; comparação dos níveis de hepcidina madura humana determinados em pontos de tempo diferentes e, assim, monitorização da doença ou patologia promovida por hepcidina madura humana.

Os anticorpos selectivos para hepcidina madura humana da presente invenção são particularmente úteis quando aplicados em métodos de alta produtividade. Esses métodos incluem métodos de micro-chip e micro-matriz, de modo que muitas amostras podem ser testadas numa microplaca ou lâmina, ou outros ensaios de substratos conhecidos na arte. A presença de hepcidina madura humana ou os seus 61 ΡΕ2209806 níveis numa amostra biológica podem ser estabelecidos por combinação da amostra biológica com, e.g., um anticorpo da invenção em condições adequadas para formar um complexo antigénio-anticorpo. 0 anticorpo é directamente ou, mais preferencialmente, indirectamente marcado com uma unidade detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. Uma grande variedade de métodos de detecção de formação de imunocomplexos são bem conhecidos na arte, por exemplo, ELISA, RIA, imunotransferência (e.g., transferência por gota ("dot blot"), transferência de poço ("slot blot") , transferência de Western ("western blot"), etc.), técnicas e métodos de imunofluorescência indirectos que se baseiam na detecção de alterações em parâmetros físicos, como, por exemplo, SPR e outros semelhantes. Estas aplicações incluem métodos que utilizam um anticorpo selectivo para hepcidina-25 da invenção conjugado com uma unidade detectável para detectar hepcidina numa amostra biológica, e.g., num fluido biológico ou numa célula ou extracto de tecido humano. Os anticorpos da invenção podem ser utilizados nesses ensaios com ou sem modificação com uma unidade detectável. Se modificados com uma unidade detectável, os anticorpos da invenção podem ser modificados por ligação covalente ou não covalente da unidade detectável. Tal como aqui utilizado, o termo "detectável" descreve uma característica de uma substância (um conjugado, composto ou unidade) que permite a identificação ou localização da substância por um detector, usando técnicas analíticas conhecidas. Exemplos representativos de unidades detectáveis incluem, sem limitação, cromóforos, unidades fluorescentes, unidades fosforescentes, unidades luminescentes, unidades radioactivas, várias enzimas (como fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano), unidades magnéticas (e.g., materiais diamagnéticos, parama-gnéticos e ferromagnéticos) e aglomerados de metais pesados, 62 ΡΕ2209806

bem como quaisquer outras unidades detectáveis conhecidas. A quantidade de um complexo anticorpo-antigénio corrente formado pode ser quantificada por vários métodos conhecidos na arte como, e.g., meios fotométricos ou colorimétricos. Preferencialmente, os anticorpos da invenção são utilizados sem modificação, i.e. marcados indirectamente, de acordo com métodos bem conhecidos na arte. A invenção abrange um método para a detecção da proteina hepcidina madura humana numa amostra biológica, compreendendo incubar um anticorpo da invenção com uma amostra biológica em condições e durante um tempo suficiente para permitir ao referido anticorpo ligar-se a proteínas hepcidinas humanas maduras e detectar a referida ligação. A presente invenção também proporciona composições, métodos e kits para rastreio de amostras suspeitas de conterem polipéptidos hepcidina madura humana. Esse rastreio pode ser realizada em amostras de doentes, ou amostras de laboratório suspeitas de conterem ou produzirem esse polipéptido. Um kit pode conter um anticorpo selectivo para hepcidina-25 da presente invenção. 0 kit pode conter um tampão adequado e reagentes para a detecção de uma interacção entre uma amostra e um anticorpo selectivo para hepcidina-25 da presente invenção. 0 reagente fornecido estar radiomarcado, marcado fluorescentemente ou marcado enzimaticamente capaz de se ligar ou interagir com um anticorpo da presente invenção tal como um anticorpo anti-IgG de murganho. 63 ΡΕ2209806 0 reagente do kit pode ser fornecido como uma solução liquida, ligado a um suporte sólido ou como um pó seco. Quando o reagente é fornecido numa solução liquida, preferencialmente a solução liquida é uma solução aquosa. Preferencialmente, quando o reagente fornecido está acoplado a um suporte sólido, o suporte sólido pode ser meios cromatográficos, uma placa de teste tendo uma pluralidade de poços ou uma lâmina de microscópio. Quando o reagente fornecido é um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado, que também pode ser fornecido no kit. 0 kit da invenção é fornecido num recipiente que geralmente inclui um frasco em que pode ser colocado o anticorpo, antigénio ou reagente de detecção preferencialmente adequadamente dividido em alíquotas. Os kits da presente invenção tipicamente vão também incluir um meio para conter o anticorpo, o antigénio e recipientes para reagentes para venda comercial. Esses recipientes podem incluir recipientes de plástico em que os frascos desejados são retidos e um ou mais produtos químicos necessários, como material de cromatografia, solventes e eluentes, tubos de ensaio, detergentes, anticorpos e produtos químicos para a reacção de detecção.

Um anticorpo da invenção pode ser utilizado para diagnosticar uma patologia ou doença associada à actividade de hepcidina madura. De um modo semelhante, o anticorpo da 64 ΡΕ2209806 invenção pode ser utilizado num ensaio para monitorizar os niveis de hepcidina madura num indivíduo a ser tratado a um estado, doença ou patologia promovida por hepcidina madura. Estas aplicações incluem métodos que utilizam um anticorpo da invenção e um marcador para detectar hepcidina madura numa amostra biológica, e.g., num fluido corporal humano ou numa célula ou extracto de tecido. Os anticorpos da invenção podem ser utilizados com ou sem modificação, e podem ser marcados por ligação covalente ou não covalente a uma unidade detectável.

Uma variedade de protocolos convencionais para determinar os níveis de proteína numa amostra biológica, incluindo, e.g., ELISAs, RIAs e FACS, são conhecidos na arte e proporcionam uma base para o diagnóstico de níveis alterados ou anormais de expressão de hepcidina madura. Níveis de hepcidina normais ou padrão presentes numa amostra são estabelecidos utilizando qualquer técnica conhecida, e.g. por combinação de uma amostra compreendendo um polipéptido hepcidina madura com, e.g., um anticorpo da invenção em condições adequadas para formar um complexo de antigénio:anticorpo. 0 anticorpo é marcado directamente ou indirectamente com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. As substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioactivos. A quantidade de um complexo padrão formada é quantificada por vários métodos, tais como, e.g., meios fotométricos. Quantidades de 65 ΡΕ2209806 polipéptido hepcidina madura presentes em amostras são então comparadas com os valores padrão. Um anticorpo preferido para utilização em diagnóstico, prognóstico e/ou ensaios de monitorização, kits e métodos tem (i) um polipéptido de cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 6 e um polipéptido de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 14; (ii) um polipéptido de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 7 e um polipéptido de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 15, (iii) um polipéptido de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 9 e um polipéptido de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 17; ou (iv) um polipéptido de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 8 e um polipéptido de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 16.

Um anticorpo selectivo para hepcidina-25 isolado pode ser utilizado em terapêutica, preferencialmente em terapêutica humana.

Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo da invenção pode ser utilizada para aumentar os níveis séricos de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou hemató-crito num ser humano, quando uma quantidade eficaz é administrado a um indivíduo ser humano dela necessitado. ΡΕ2209806

Além disso, um anticorpo da invenção pode ser útil para o tratamento de estados, doenças ou patologias em que a presença de hepcidina-25 causa ou contribui para efeitos patológicos indesejáveis ou um decréscimo dos niveis de hepcidina-25 ou bioactividade da hepcidina-25 tem uma vantagem terapêutica em seres humanos. Essas condições, doenças ou patologias incluem, mas não estão limitadas a anemia, incluindo, mas não limitada a anemia resultante de infecção, inflamação, doença crónica e/ou cancro. Os indivíduos podem ser homens ou mulheres. A presente invenção inclui um método de aumentar os níveis séricos de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou hemató-crito, que compreende a administração a um indivíduo ser humano dela necessitado de uma quantidade eficaz de um anticorpo da presente invenção, que se liga selectivamente a hepcidina-25 humana com uma KD de 800 pM ou menos. Adicionalmente, ou alternativamente, a presente invenção inclui um método para o tratamento de uma doença, estado ou patologia, num indivíduo ser humano, que beneficia de um aumento dos níveis séricos de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou do hematócrito, incluindo, mas não limitada a anemia, e.g., anemia resultante de infecção, inflamação, doença crónica, e/ou cancro. Preferencialmente, o indivíduo tem ou está em risco de ter um nível sérico de ferro indese-javelmente baixo, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou hematócrito baixos. 67 ΡΕ2209806

Mais preferencialmente, o indivíduo está em risco de, ou sofre de anemia, incluindo, mas não limitada a anemia resultante de infecção, inflamação, doença crónica e/ou cancro. Ainda mais preferencialmente, o anticorpo compreende uma LCVR compreendendo: i) uma LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 41 e 43, ii) uma LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 30, 53, 56, 57, 58 e 76, e iii) uma LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 31, 61 e 60, e uma HCVR compreendendo: i) uma HCDRl tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 32, 63, 78 e 79; ii) uma HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 44, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 e 87, e iii) uma HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 46.

Ainda mais preferencialmente, o anticorpo ΡΕ2209806 compreende um polipéptido de cadeia pesada e de cadeia leve tendo (i) as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID Nos: 6 e 14, respectivamente; (ii) as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 7 e 15, respectivamente; (iii) as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 9 e 17, respectivamente; ou (iv) sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID NOs: 8 e 16, respectivamente. Mais preferencialmente ainda, o anticorpo compreende um polipéptido de cadeia pesada e de cadeia leve tendo as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID NOs: 8 e 16, respectivamente.

Adicionalmente, está contemplada a utilização de um anticorpo da invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento da anemia ou pelo menos uma das doenças anteriormente referidas. Preferencialmente, o anticorpo compreende uma LCVR compreendendo: i) uma LCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 41 e 43; ii) uma LCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 30, 53, 56, 57, 58 e 76, e iii) uma LCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 31, 61 e 60, e uma HCVR compreendendo: 69 ΡΕ2209806 i) uma HCDR1 tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 32, 63, 78 e 79; ii) uma HCDR2 tendo uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 44, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 e 87; e iii) uma HCDR3 tendo uma sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 46.

Mais preferencialmente, o anticorpo compreende um polipéptido uma cadeia pesada e de cadeia leve tendo(i) as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 6 e 14, respectivamente; (ii) as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 7 e 15, respectivamente; (iii) as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 9 e 17, respectivamente, ou (iv) sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID NOs: 8 e 16, respectivamente. Mais preferencialmente ainda, o anticorpo compreende um péptido de cadeia pesada e de cadeia leve tendo as sequências de aminoácidos indicadas nas SEQ ID NOs: 8 e 16, respectivamente. O termo "tratar", ou "tratamento" e "tratar", pretendem referir-se a todos os processos em que pode haver uma desaceleração, interrupção, suspensão, controlo ou paragem da progressão das doenças aqui descritas, mas não indica necessariamente uma eliminação total de todos os 70 ΡΕ2209806 sintomas da doença. "Tratamento", tal como aqui utilizado, inclui a administração de um composto da presente invenção para o tratamento de uma doença ou patologia num mamífero, particularmente num ser humano, e inclui: (a) inibição da progressão adicional da doença, i.e., suspensão do seu desenvolvimento, e (b) alívio da doença, i.e., causando a regressão da doença ou patologia ou aliviando os seu sintomas ou complicações. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar a resposta óptima desejada (e.g., uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um bolus único, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. O termo "prevenção" (ou "prevenir" ou "prevenção") significa proibir, restringir ou inibir a incidência ou ocorrência de um sintoma, patologia, estado ou doença. Podem ser tratados e evitados eventos agudos e doenças crónicas. Num evento agudo, um anticorpo da invenção é administrado no início de um sintoma, patologia, estado ou doença, e é descontinuada quando o evento agudo termina. Em contraste, um sintoma, doença, estado ou patologia crónica é tratado ao longo de um período de tempo mais prolongado.

Uma "patologia" é qualquer situação que possa beneficiar de um tratamento de acordo com a invenção. Os termos "patologia", "estado" e "doença" são aqui utilizados indistintamente e incluem doenças crónicas e agudas 71 ΡΕ2209806 promovidas por hepcidina madura, incluindo, mas não limitado a anemia, incluindo mas não limitada a anemia de doença crónica, incluindo, mas não limitada a anemia resultante de infecção, inflamação e/ou cancro.

Um anticorpo da invenção pode ser incorporado numa composição farmacêutica adequada para administração a um indivíduo ser humano. Um anticorpo da invenção pode ser administrado a um indivíduo ser humano por si só ou em combinação com um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável em doses individuais ou múltiplas. Essas composições farmacêuticas são concebidas para ser apropriadas para o modo de administração seleccionado, e diluentes farmaceuticamente aceitáveis, veículo e/ou excipientes como agentes dispersantes, tampões, agentes tensoactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de isotonicidade incluindo mas não limitados a cloreto de sódio, agentes estabilizantes e outros semelhantes são utilizados consoante apropriado. As referidas composições podem ser concebidas de acordo com técnicas convencionais descritas em, e.g., Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, que é um compêndio de técnicas de formulação como são genericamente conhecidas pelos profissionais. Os veíiculos adequados para composições farmacêuticas incluem qualquer material que, quando combinado com um anticorpo da invenção, retém a actividade da molécula e é não reactivo com o sistema imunitário do indivíduo. Em certas formas de realização, uma composição farmacêutica da presente ΡΕ2209806 invenção compreende i) um anticorpo da invenção, ii) um tampão citrato e iii) cloreto de sódio. Preferencialmente, o anticorpo está presente numa concentração que varia de cerca de 1 mg/mL a cerca de 35 mg/mL, o citrato está presente numa concentração que varia de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM, o cloreto de sódio está presente numa concentração que varia de cerca de 100 mM a cerca de 300 mM e o pH da composição está entre 5,0 a cerca de 7,2. Mais preferencialmente, o anticorpo está presente numa concentração que varia de cerca de 5 mg/mL a cerca de 30 mg/mL, o citrato está presente numa concentração que varia de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, o cloreto de sódio está presente numa concentração que varia de cerca de 150 mM a cerca de 300 mM e o pH da composição está entre cerca de 5,5 a cerca de 6,5. Ainda mais preferencialmente, o anticorpo está presente numa concentração variando de cerca de 5 mg/mL a cerca de 25 mg/mL, o citrato está presente a cerca de 10 mM, o cloreto de sódio está presente numa concentração variando de cerca de 200 m M a cerca de 300 mM e o pH da composição está entre cerca de 5,5 a cerca de 6,5.

Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-hepcidina-25 da presente invenção pode ser administrada a um indivíduo em risco de ou que apresenta patologias como as aqui descritas, por exemplo, doenças anémicas, utilizando técnicas de administração correntes. A frase "quantidade eficaz" tal como aqui utilizada refere-se a uma quantidade necessária (em 73 PE2209806 dosagens e durante períodos de tempo e para o meio de administração) para atingir o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade eficaz do anticorpo pode variar de acordo com factores como o estado patológico, idade, género e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo para eliciar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade eficaz é também uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo, são compensados pelos efeitos terapeuticamente vantajosos.

Uma quantidade eficaz é pelo menos a quantidade mínima, mas menos do que uma quantidade tóxica, de um agente activo que é necessária para conferir vantagem terapêutica a um indivíduo. Dito de outra maneira, uma quantidade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção é uma quantidade que em mamíferos, preferencialmente seres humanos, (i) aumenta os níveis séricos de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina e/ou hematócrito, ou (ii) trata uma doença em que a presença de hepcidina madura causa ou contribui para um efeito patológico indesejável ou (iii) uma diminuição dos níveis de hepcidina madura ou da bioactividade de hepcidina madura resulta num efeito terapêutico vantajoso num mamífero, preferencialmente um ser humano, incluindo, mas não se limitado a anemia, incluindo, mas não limitado a anemia de doença crónica, incluindo mas não limitada a anemia resultante de infecção, inflamação e/ou cancro. Uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção pode ser administrada numa dose 74 ΡΕ2209806 individual ou em doses múltiplas. Além disso, uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção pode ser administrada em doses múltiplas de quantidades que seriam menos do que uma quantidade eficaz se não fosse administrada mais do que uma vez.

Como é bem conhecido nas artes médicas, as dosagens para um qualquer indivíduo dependem de muitos factores, incluindo o tamanho do doente, a área de superfície corporal, idade, o composto específico a ser administrado, género, momento e via de administração, estado de saúde geral e outros fármacos que estão a ser administrados concomitantemente. A dose pode ainda variar dependendo do tipo e da gravidade da doença. Uma dose típica pode estar, por exemplo, na gama de cerca de 1 mg a cerca de 200 mg; preferencialmente, cerca de 2 mg a cerca de 200 mg; mais preferencialmente, cerca de 5 mg a cerca de 200 mg; ainda mais preferencialmente, cerca de 5 mg a cerca de 50 mg; mais preferencialmente ainda, cerca de 5 mg a cerca de 25 mg, ainda mais preferencialmente, cerca de 5 mg a cerca de 20 mg; ainda mais preferencialmente, cerca de 5 mg a cerca de 15 mg; no entanto, estão contempladas doses abaixo ou acima desta gama exemplificativa, especialmente considerando os factores acima referidos.

Um regime de dosagem parentérica diária pode ser de cerca de 10 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, preferencialmente de cerca de 25 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, mais preferencialmente de cerca de 50 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, 75 ΡΕ2209806 ainda mais preferencialmente, de cerca de 100 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, ainda mais preferencialmente de cerca de 200 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, ainda mais preferencialmente, de cerca de 300 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, ainda mais preferencialmente, de cerca de 400 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, ainda mais preferencialmente de cerca de 500 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, de cerca de 600 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, de cerca de 700 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, de cerca de 800 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, de cerca de 900 yg/kg a cerca de 20 mg/kg, ainda mais preferencialmente, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, ainda mais preferencialmente, de cerca de 2 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, ainda mais preferencialmente, de cerca de 3 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, ainda mais preferencialmente, de cerca de 4 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, ainda mais preferencialmente, de cerca de 5 mg/kg a cerca 20 mg/kg, ainda mais preferencialmente, de cerca de 6 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, ainda mais preferencialmente, de cerca de 7 mg/kg a cerca de 20 mg/kg e ainda mais preferencialmente, de cerca de 8 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. O progresso pode ser monitorizado por avaliação periódica e a dose ajustada em conformidade.

Estas quantidades sugeridas de anticorpo estão sujeitas muita discrição terapêutica. O factor chave na selecção de uma dose apropriada e programação é o resultado obtido. Factores para consideração neste contexto incluem a doença especifica a ser tratada, o estado clinico do doente individual, a causa da doença, o sitio de administração do anticorpo, o tipo especifico de anticorpo, o método de 76 ΡΕ2209806 administração, o programa de administração e outros factores conhecidos pelos profissionais médicos. A via de administração de um anticorpo da presente invenção pode ser oral, parentérica, por inalação, ou tópica. Preferencialmente, os anticorpos da invenção podem ser incorporados numa composição farmacêutica adequada para administração parentérica. 0 termo parentérico tal como aqui utilizado, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, rectal, vaginal ou intraperito-neal. É preferida a administração parentérica por injecção intravenosa ou intraperitoneal ou subcutânea. A injecção subcutânea é a mais preferida. Os veículos adequados para essas injecções são bem conhecidos na arte. A composição farmacêutica tipicamente tem de ser estéril e estável nas condições de fabrico e armazenagem no recipiente fornecido, incluindo, por exemplo, um frasco selado, seringa ou outro dispositivo de administração, e.g., uma caneta. Portanto, as composições farmacêuticas podem ser filtradas estéreis depois de feita a formulação, ou de outra forma tornadas microbiologicamente aceitáveis.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção de hepcidin-25 humana A hepcidina-25 humana pode ser obtida de fontes comerciais (e.g., Peptide International (Louisville, 77 ΡΕ2209806

Kentucky)) ou produzida por uma variedade de técnicas sintéticas ou recombinantes conhecidas na arte. Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo os vinte e cinco aminoácidos da sequência da hepcidina-25 humana e tendo a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO: 95 é expressa em E. coli. Os corpos de inclusão são isolados a partir de 3 litros de E. coli que exprime a proteína de fusão de hepcidina humana após 3-6 horas de indução horas com 1 mM de IPTG a 37 °C. Os corpos de inclusão são solubilizados em tampão A (Tris 50 mM e ureia 8 M (pH 8,0)). O sobrenadante é passado numa coluna de IMAC (20 mL de resina) . A coluna é lavada com tampão A até a absor-vência retornar à linha de base e os polipéptidos ligados são eluídos em descontínuo da coluna por imidazole 0,5 M em tampão A. A proteína de fusão da hepcidina-25 humana é combinada e reduzida com DTT 50 mM. Esta proteína de fusão é então reenrolada por diluição do material combinado em ureia 2 M, cisteína 3 mM, Tris 50 mM (pH 8,0) até uma concentração final de proteína inferior a 50 yg/mL. Este material é agitado à temperatura ambiente e oxidado ao ar durante 48 horas. Os pol ipéptidos oxidados são passados através de uma coluna de IMAC (20 mL) a um caudal de 5 mL/min e ; a proteína de fusão de hepcidina- -25 humana é eluída em descontínuo da coluna por imidazole 0,5 M em tampão A. As fracções combinadas que contêm a proteína de fusão de hepcidina-25 humana são concentradas e passadas através de uma coluna de dimensionamento Superdex 75 (GE Healthcare, XK26/60) equilibrada com Tris 50 mM, ureia 4 M, pH 8,0, a um caudal de 3 mL/min. A proteína de fusão 78 ΡΕ2209806 monomérica é combinada e em seguida diluída para Tria 50 mM, ureia 2 M, CaCÍ2 5 mM, pH 8,0 e depois é clivada com enteroquinase para produzir hepcidina-25 humana de SEQ ID NO: 1. A proteína de fusão de hepcidina-25 humana não clivada é removida por cromatografia de IMAC passiva (como descrito acima) . O fluxo através da coluna de IMAC é em seguida passado por uma coluna C-18 de fase inversa a um caudal de 4,0 mL/minuto. A coluna é lavada com TFA a 0,1% em água até a absorvência retornar à linha de base e os polipéptidos ligados são eluídos da coluna com um gradiente linear de ACN de 20% a 40% com TFA a 0,1% a uma velocidade de 0,5%/min. As fracções que contêm o polipéptido hepcidina-25 humana são combinadas e analisadas por sequenciação de aminoácidos do N-terminal e espectrometria de massa com dessorção de laser/ionização assistida pela matriz (MALDI-MS). Polipéptidos que codificam hepcidina-25 de rato, murganho e macaco cynomolgous e várias formas truncadas N-terminalmente de hepcidina-25 humana, incluindo hepcidina-22 e hepcidina-20, foram obtidas comercialmente (e.g., Peptide Internacional).

Exemplo 2: Determinações da afinidade de ligação do Fabs e Mabs anti-hepcidina-25

Um biossensor de ressonância plasmónica de superfície, como o BIAcore® T100, pode ser utilizado para medir a cinética de ligação e afinidade dos anticorpos aqui descritos. O sistema BIAcore® utiliza as propriedades ópticas de SPR para detectar alterações na concentração de 79 ΡΕ2209806 proteína de moléculas que interactuam no seio de uma matriz biossensora de dextrano. Excepto como mencionado, todos os reagentes e os materiais são adquiridos a BIAcore® AB (Upsala, Suécia). Todas as determinações são realizadas a 25°C. As amostras são dissolvidas em tampão HBS-EP (cloreto de sódio 150 mM, EDTA 3 mM, tensoactivo P-20 a 0,05% (p/v) e HEPES 10 mM, pH 7,4). Para capturar Fabs com kapa humana, anti-kapa humana de cabra é imobilizada em células de fluxo 1 a 4 de um chip sensor CM5 a um nível de 5000-10000 unidades de resposta (Rus) utilizando um kit de acoplamento de amina. Para capturar Mabs com IgGl de murganho, anti-Fcgama de murganho de cabra é imobilizado em células de fluxo 1 a 4 de um chip sensor CM5 a um nível de 5000-10000 Rus utilizando um kit de acoplamento de amina. Para capturar anticorpos com IgG4 humana, proteína A é imobilizada em células de fluxo 1 a 4 de um chip sensor CM4 a um nível de 400-700 Rus utilizando um kit de acoplamento de amina. Fabs preparado a partir de periplasma de E. coli e Mabs preparado a partir de cultura de células de mamíferos são avaliados utilizando vários ciclos analíticos. Cada ciclo consiste nos passos seguintes: 0,3-2 minutos de injecção de um Fab ou um Mab a ~10 pL/minutos tendo em vista uma captura de 200-1000 Rus, injecção de 2 minutos a 50 pL/minuto de várias concentrações de hepcidina-25 humana (de 600 nM a 0,1 nM) obtida como descrito no Exemplo 1 acima seguida por 2-10 minutos para dissociação, e regeneração utilizando 30 pL de cloridrato de glicina 10 mM pH, 1,5. As medições são obtidas a 25°C e as velocidades de associação e de dissociação para cada 80 ΡΕ2209806 ciclo são avaliadas utilizando um modelo de ligação "1:1 com transferência de massa" no software BIAevaluation.

Os parâmetros de ligação da hepcidina-25 humana de Fab JXB7 de murganho e de certos Fabs anti-hepcidina humanos de engenharia estão apresentados na Tabela 5. A afinidade de ligação a hepcidina-25 humana (KD) dos outros Fabs humanos de engenharia listados na Tabela 3 foi determinada como sendo entre cerca de 214 pM e cerca de 54 pM, com cada um tendo uma velocidade Koff de hepcidina-25 humana entre cerca de 7,68 x 10“4 s_1 e cerca de 2,22 x 10‘4 s_1. Portanto, foram identificados Fabs anti-hepcidina humanos de engenharia tendo uma KD para hepcidina-25 humana até 52 vezes mais baixa do que a de Fab JXB7 de murganho. Os Fabs anti-hepcidina humanos de engenharia indicados na Tabela 5 estruturas de cadeia leve e pesada da linha germinal humana e estruturas de cadeia pesada 02 e VH1-69, respectivamente.

Tabela 5: Propriedades de ligação a hepcidina-25 humana

Fab Kon (M-1, s-1) K0ff (s"1) KD (M) JXB7 2,49E+06 6,98E-03 2,80E-9 Hu22 7,0 5E + 06 4,56E-03 6, 47E-10 1.7 3,80E+06 1,48E-03 4,22E-10 3.12 3,94E+06 3,47E-04 8,83E-11 3.23 3,53E + 0 6 2,78E-04 7,88E-11

Os parâmetros de ligação a hepcidina-25 humana do Mab JXB7 de murganho e certos Mabs anti-hepcidina humanos 81 ΡΕ2209806 de engenharia estão apresentados na Tabela 6. Portanto, foram identificados Mabs anti-hepcidina humanos de engenharia tendo uma afinidade de ligação (KD) para hepcidina-25 humana até cerca de 33 vezes menor do que a do Mab JXB7 de murganho. As regiões constantes de cadeia pesada para Mabs JXB7 e 31B2 são IgGl de murganho. As regiões constantes de cadeia pesada para os outros Mabs da Tabela 6 foram IgG4 humana (SEQ ID NO: 94).

Tabela 6: Ligação a hepcidina-25 humana

Mab Kon (M-1, s"1) K0ff (s"1) KD cinética (M) JXB7 3,70E+07 7,37E-03 1,99E-9 31B2 1,89E+06 1,27E-04 7,52E-11 Hu22 1,09E+07 8,64E-03 7,64E-10 3.23 6,20E+06 6,59E-04 9,94E-11 3.8 5,58E+06 7,68E-04 1,05E-10 LI. 5 5,31E+06 1,82E-04 3,42E-11 3.12 3,68E+06 2,20E-04 5,99E-11 os parâmetros de ligação a hepcidina-25 de macaco cynomolgs e a hepcidina-25 de murganho de vários Mabs anti-hepcidina humanos de engenharia estão apresentados nas Tabelas 7 e 8, respectivamente. A ligação a hepcidina-25 de rato foi indetectável para os Mabs Hu22, 3.23 e 3.8. Geralmente, demonstrou-se que os Mabs Hu22 e 3.23 têm uma KD para hepcidina madura de macaco cynomolgus que era comparável à para hepcidina-25 humana. No entanto, o Mab 3.8 mostrou ter uma KD para hepcidina-25 de macaco cynomolgous mais de 10 vezes mais baixa do que para 82 ΡΕ2209806 hepcidina-25humana. Por outro lado, os Mabs Hu22, 3.23 e 3.8 mostraram ter uma KD muito menor para hepcidina-25 humana do que para hepcidina-25 de murganho.

Tabela 7: Ligação a hepcidina-25 de macaco cynomolgus

Mab Kon (M_1, s-1) K0ff (s"1) KD cinética (M) Hu22 8,13E+06 8,16E-03 9,86E-10 3.23 6,51E+06 5,77E-04 8,88E-11 3.8 7,07E+07 6,60E-04 9,33E-12

Tabela 8: Ligação a hepcidina-25 de murganho

Mab Kon (M-1, s-1) K0ff (s_1) KD cinética (M) Hu22 1,62E+06 1,26E-01 7,76E-08 3.23 3,83E+06 1,92E-01 5,01E-08 3.8 3,57E + 0 6 1,24E-01 3,46E-08

Exemplo 3: Ensaio à base de células quanto à internalização e degradação de ferroportina induzida por hepcidina

Pode ser utilizado um ensaio à base de células in vitro para medir a actividade de neutralização de Mabs dirigida contra hepcidina humana. Um ensaio à base de células in vitro útil para medir a actividade de neutralização dos anticorpos da presente invenção baseia-se internalização e degradação induzida por hepcidina do seu receptor, a ferroportina. Resumidamente, é preparada uma linha celular estável HEK 293 que permite a expressão ΡΕ2209806 indutível de ferroportina (FPN). FPN é fundida C-terminalmente com proteína verde fluorescente (GFP) para fins de rastreio. A expressão indutível da molécula FPN-GFP é controlada utilizando o sistema de T-Rex, um sistema de expressão regulado por tetraciclina disponível comercialmente sem transactivadores virais (Invitrogen, Carlsbad, CA). A sequência de codificação de FPN-GFP é clonada no vector pCDNA4/T0, que contém um promotor indutível e um marcador de resistência a Zeocin. A construção resultante é transfectada em células T-REx-293 que expressam a proteína reguladora necessária para a expressão indutível de doxiciclina. Clones resistentes a Zeocin são testados quanto à expressão indutível de FPN-GFP. As condições de crescimento de células são essencialmente como descritas no manual do utilizador do fabricante para o Sistema de T-REx. Resumidamente, as células são cultivadas em DMEM, FBS dialisado a 10%, FAC (citrato de amónio férrico) 20 μΜ, mais 5 yg/mL de penicilina-estreptomicina. A selecção é mantida com 100 yg/mL de Zeocin e 5 yg/mL de Blasticidina. As células são plaqueadas em placas pretas/transparentes com 96 poços que estão revestidas com poli-D-lisina. É utilizado um leitor de placas fluorescentes de alta resolução para a leitura da fluorescência total por poço.

Essencialmente, o ensaio é realizado como se segue: após tripsinização , uma placa de ensaios com 96 poços é semeada com 90 0 0 células/poço utilizando a linha celular estável FPN-GFP/TREx 293. O volume de cultura por poço é de 80 yL. Deixa-se que as células se fixem de um dia 84 ΡΕ2209806 para o outro. Cedo na manhã seguinte, 9 yL de doxiciclina a 30 ng/mL são adicionados a cada poço para induzir a expressão de FPN-GFP expressão. Deixa-se que esta indução decorra durante 8 horas. Após a indução, o meio é aspirado e os poços são cuidadosamente lavados com 120 yL/poço de PBS. É importante remover todo o liquido de cada poço uma vez que qualquer meio remanescente continuará a induzir a expressão de FPN-GFP.

Os tratamentos desejados são montados num formato de 96 poços para adição rápida a uma placa de ensaio após a lavagem. O volume final do ensaio por poço é de 45 yL. Imediatamente após a adição dos tratamentos, a placa de ensaio é lido utilizando o leitor de placas fluorescentes de alta resolução (regulado para 550 volts no canal 1). Esta leitura é a leitura às 0 horas e é utilizada para normalizar quanto ao número de células por poço, que se correlaciona com a FLU total por poço. A hepcidina-25 humana induziu internalização máxima e degradação de ferroportina a 0,5 yM. A IC5o para hepcidina-25 humana é de aproximadamente 8 nM. Para ensaios de neutralização de anticorpo anti-hepcidina, a concentração de hepcidina-25 humana é mantida a 100 nM e os anticorpos anti-hepcidina são testados a diluições de 2x a partir de 0,5 yM a 8 nM. As placas são incubadas durante 24 horas, após o que são novamente lidas, e os dados são gerados como a proporção das unidades de fluorescência totais (FLU) por poço às 24 horas dividida pela FLU total por poço às 0 horas. 85 ΡΕ2209806

Neste ensaio In vitro, a bioactividade da hepcidina-25 humana foi neutralizada com vários Mabs anti-hepcidina com uma IC5o com os valores indicados na Tabela 9.

Tabela 9. Actividade de neutralização in vitro de anti-_hepcidina-25 humana de engenharia_

Mab IC50 (nM) ± Erro padrão (η Ξ> 4) 3.23 59, 1 ± 1,2 3.12 62,2 ± 5,9 3.6 54,5 ± 1,5 3.9 51,1 ± 1,8 Hu22 163 ± 12,4

Exemplo 4: A administração de anticorpos mono-clonais anti-hepcidina aumentam os níveis séricos de ferro em macacos cynomolgus tratados por via subcutânea com interleucina-6 A actividade de anticorpos anti-hepcidina na desregulação de ferro sérico induzida por IL-6 em macacos cynomolgus pode ser determinada como descrito adiante.

Resumidamente, anticorpos anti-hepcidina são administrados a macacos cynomolgus machos a 1 e 10 mg/kg como um bolus i.v. Aproximadamente uma hora após a administração dos anticorpos, os animais recebem uma única administração subcutânea de IL-6 humana a 5 yg/kg. Amostras de sangue são recolhidas à -1 hora (antes da administração 86 ΡΕ2209806 do anticorpo), às 0 horas (imediatamente antes da administração de IL-6) e à 1, 3, 6, 12, 24, 48, 96, 168, 336, 504 e 672 horas após o tratamento com IL-6.

Preferencialmente, cada grupo de tratamento consiste em pelo menos 3 animais. Os niveis séricos de ferro podem ser medidos por qualquer método conhecido na arte que seja genericamente considerado entre a comunidade médica como sendo um método aceitável de medição dos niveis séricos de ferro.

Tabela 10. Inibição por Mab anti-hepcidina de reduções induzidas por IL-6 dos niveis séricos de ferro em macacos cynomolgus

Grupo # de machos Artigos de teste/ controlo Dose Via Nivel da dose alvo Concentração da dose alvo Volume da dose alvo (mL/kg) 1 3 IX PBS IX PBS com rHSA I .V. S.C. 0 mg/kg 0 pg/kg 0 mg/kg 0 pg/kg 3, 3 1 2 3 IX PBS IL-61 I .V. S.C. 0 mg/kg 5 pg/kg 0 mg/kg 5 pg/kg 3,3 1 3 3 Hu22 IL-61 I .V. S.C. 1 mg/kg 5 pg/kg 0,3 mg/kg 5 pg/kg 3,3 1 4 3 Hu22 IL-61 I .V. S.C. 10 mg/kg 5 pg/kg 3 mg/kg 5 pg/kg 3,3 1 5 3 3.23 IL-61 I .V. S.C. 1 mg/kg 5 pg/kg 0,3 mg/kg 5 pg/kg 3,3 1 6 3 3.23 IL-61 I .V. S.C. 10 mg/kg 5 pg/kg 3 mg/kg 5 pg/kg 3,3 1 1

Todas as doses de IL-6 são administradas num veiculo consistindo em IX PBS contendo 0,1 mg/mL de albumina de soro humano recombinante. S.C. Injecção subcutânea; administrada através de 1 sitio de injecção IV. Intravenosa; administrada como uma injecção através da veia safena. 87 ΡΕ2209806

Em comparação com o grupo controlo de PBS, o tratamento com IL-6 humana produz uma redução transitória dos níveis séricos de ferro, atingindo um nadir às 12 horas pós-tratamento com IL-β. A administração intravenosa de Hu22 e 3.23 a 10 mg/kg aproximadamente 1 hora antes da dose de IL-β humana impede a queda dos níveis de ferro devida ao tratamento com IL-6 tratamento e resulta num aumento do ferro sérico de aproximadamente 52% e 108%, respec-tivamente, às 3 a 6 horas após o tratamento com IL-6. Depois de atingir os níveis de pico, as concentrações séricas de ferro subsequentemente diminuem nestes dois grupos e atingem níveis semelhantes aos de outros grupos às 24 horas. Tanto Hu22 (p <0,01, 3 e 6 horas) como 3.23 (p <0,01, 3, 6 e 12 horas) a 10 mg/kg produzem aumentos estatisticamente significativos das concentrações séricas de ferro em relação ao grupo de IL-6 com pré-tratamento com PBS. Em contraste, nem Hu22 nem 3.23 a 1 mg/kg resultaram em diferenças estatisticamente significativas nos níveis séricos de ferro em comparação com o controlo. Portanto, estes resultados demonstram que os anticorpos da presente invenção serão úteis no tratamento de anemia resultante de bioactividade de hepcidina madura.

Exemplo 5: Determinação da selectividade de anticorpos anti-hepcidina utilizando MALDI-TOF O diagnóstico de rotina clínica de biomarcadores ΡΕ2209806 baseia-se principalmente em técnicas imunológicas quantitativas - e.g., ELISA. Estes métodos frequentemente não são aplicáveis para antigénios pequenos ou para isoformas de antigénios (Sparbier, K., International Meeting of the Association of Biomolecular Resource Facilities, Salt Lake City, UT, Póster V28-S, (2008); e Gutierrez, J. A. et al., (2005)).

Mab 31B2 anti-hepcidina humana é conjugado com resina Sheparose 6MB activada com CNBr (GE healthcare, Piscataway, NJ) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, a resina Sepharose foi lavada com HC1 1 mM três vezes e o anticorpo foi diluído em tampão de acoplamento (NaHCCk 100 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,3). Utilizou-se aproximadamente 1,7 mg de anticorpo para a conjugação a 4°C de um dia para o outro para cada mg de resina. O anticorpo em excesso foi removido por lavagem com tampão acetato 0,1 M, pH 4. Aproximadamente 100 mL de amostra de soro humano foram incubados com 0,8 mL desta resina Sepharose-31B2 a 4°C. Após incubação de um dia para o outro, a mistura de resina/soro foi empacotada numa coluna e lavada com 10-20 volumes de coluna de fosfato de sódio 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,4. A coluna foi lavada com 5-10 volumes de coluna de fosfato de sódio 10 mM pH 7,4 sem NaCl. Finalmente, a coluna foi eluida com TFA a 0,2%. As fracções eluídas foram analisadas quanto aos pesos moleculares num instrumento de STR Voyager-DE (Applied Biosystems, Foster City, CA) no modo linear. 89 ΡΕ2209806

Para pesos moleculares inferiores ao da hepcidina-25 humana, o espectro de massa foi gerado utilizando uma matriz de péptido. Foi identificado um pico dominante correspondente à hepcidina-25 humana (2790 Dalton). Também eram detectáveis picos menos dominantes para várias formas truncadas de hepcidina, a saber, hepcidina-24 (2674 Dalton), hepcidina-22 (2436 Dalton) e hepcidina-20 (2192 Dalton).

Para pesos moleculares superiores ao da hepcidina-25 humana, o espectro de massa foi gerado utilizando uma matriz de proteina. Foi ainda identificado um pico dominante correspondente a hepcidina-25 humana (25 aa, 2790 Dalton), mas não foi detectável nenhum pico correspondente a prepro-hepcidina (84 aa, 9400 Dalton) ou pró-hepcidina (60 aa, 6929 Dalton).

Assim, imunoensaios utilizando o Mab 31B2 e versões humanos de engenharia suas são selectivos para hepcidina-25 humana, a forma activa mais fisiologicamente relevante de hepcidina no soro humano em comparação com formas precursoras e/ou truncadas no seu terminal N conhecidas por existirem em soro humano.

Exemplo 6: Correcção da excisão críptica de mRNA que codifica anticorpo anti-hepcidina 25 por expressão em células CHO 90 ΡΕ2209806

Pode utilizar-se técnicas de biologia molecular correntes para preparar os vectores de expressão recombinantes, transfectar as células hospedeiras, seleccionar transformantes, isolar linhas de células hospedeiras capazes de expressar um anticorpo da invenção, cultivar as células hospedeiras e recuperar os anticorpos expressos do meio de cultura. Surpreendentemente, por produção dos Mabs 3.12 e 3.23 por culturas em suspensão de células de ovário de cobaio chinês (CHO) utilizando um sistema de expressão de glutamina sintetase (GS) recombinante (Lonza Biologics, Inc., Slough, Reino Unido), foi observado um nivel anormalmente elevado de agregação de anticorpo-proteina (~15% e -30%, medido por cromatografia de exclusão de tamanhos, respectivamente). No entanto, um nivel elevado de agregação não foi observado quando os dois Mabs foram transitoriamente expressos em células HEK-293 de origem humana. Um exame do mRNA de cada uma das duas linhas de células CHO revelou a presença de transcritos de tamanhos inesperados, sugerindo que as sequências de nucleótidos que codificam as proteínas de anticorpos dos Mabs 3.12 e 3.23 eram susceptíveis de eventos de excisão crípticos. Além disso, um exame das amostras de proteínas agregadas revelou a presença de truncagem na proteína de cadeia leve. A sequenciação de cDNA preparado a partir de mRNA isolado a partir de células CHO que expressam Mabs 3.12 e 3.23 confirmou a presença de intrões crípticos nos 91 ΡΕ2209806 genes de cadeia leve. 0 doador de excisão estava contido nos codões que codificam os resíduos de aminoácidos R/VS de LC CDR1 (aminoácido 5-7 da SEQ ID NO: 43 e "/" denota a junção exão-intrão, em fase). Além disso, um ponto de ramificação provável foi encontrado nos codões que codificam os resíduos de aminoácidos LI de FRL2 (SEQ ID NO: 40) com um estiramento de poli-pirimidina provável nos codões que codificam os resíduos dos aminoácidos STL e SPL na LCDR2 de Mab 3.12 e 3.23, respectivamente. E, finalmente, os sítios aceitadores foram identificados nos codões que codificam os resíduos de aminoácidos C/Q/Q na LCDR3 de ambos os Mabs 3.12 e 3.23 (aminoácidos 1-3 da SEQ ID NO: 61; "/" denota as junções exão-intrão prováveis).

As sequências de DNA originais que codificam as cadeias leves de Mabs 3,12 e 3,23 (SEQ ID NOs: 153 e 155, respectivamente), foram subsequentemente modificadas para eliminar sequências que conferem o doador de corte, ponto de ramificação, aceitador e tracto de polipirimidina ao intrão críptico. Mais especificamente, o sítio dador foi mudado de CGC GTA AGT para AGA GTC CTP (SEQ ID NO: 45). O ponto de ramificação foi mudado de CTG CTC ATC ATC para (SEQ ID NO: 162); o tracto de polipirimidina de TCC ACC AGC CTG para ACA CTG (SEQ ID NO: 77) e de TCC CCC CAG CTG para CCA CTG (SEQ ID NO: 78) em 3.12 e 3.23, respectivamente; e os aceitadores de TGT CAG CAG TGG TGC CAA CAA para TGG (SEQ ID NO: 100). 92 ΡΕ2209806

Por conseguinte, a expressão subsequente das cadeias leves dos Mabs 3.12 e 3.23 foi efectuada por vectores de expressão recombinantes portadores das sequências de DNA modificadas como se mostra nas SEQ ID NOs: 12 e 13, respectivamente. A quantidade de anticorpo agregado produzido por expressão das sequências de ácidos nucleicos modificadas em células CHO foi determinada como sendo de 1% ou menos para ambos os Mabs 3.12 e 3.23.

As modificações das sequências de DNA que codificam as cadeias leves de vários outros anticorpos da presente invenção seria igualmente de esperar que seja de grande vantagem uma vez que o doador de excisão, tracto de polipirimidina e aceitadores de excisão são codão que codifica LCDRs que conferem especificidade ao anticorpo. 0 ponto de ramificação está em FRL2 e a sequência LLIY é altamente conservada em estruturas de cadeia leve. Além disso, o motivo QQ, cuja sequência de nucleótidos de codificação abrange a região aceitadora de excisão identificada, é conservada no seio da LCDR3 de muitos dos mAbs anti-hepcidina da invenção. Genericamente, muitas sequências da linha germinal de cadeia leve contêm um ou ambos estes codões Q (CAG) que podem servir como o aceitador de potenciais intrões crípticos. ΡΕ2209806

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS «110> Cai, &„

Gately, Danais P,

He, ianong Laung, DoMisane

Luan, Peng Swan-son, Barbara &> Mítcber, Oerriek

<120> ANTICORPOS ANTI-HEPCIDINA E AS SUAS UTILIZAÇÕES <I3G> X-17737 <150> ¢0/384910 <15I> 2007-1.1-02 <X60> .162 <170> Patentln versão 3.4 <210> 1 <2U> 25

<2I2> PRT

<213> HOMO SAP.ISNS <40O> 1

Asp fhr His Bhe Pro He Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg 1 5 10 15

Ser Lys Cy.s <31 y Met Cys Cys Lys Thr 20 25

<210> 2 <211> 1329 <212> DNA <213> SINTÉTICA <40Q> 2 caggtgcage Lggcgcagtc tggggctgag gtçaagaagc ct.gggt.cctc agtgaaggfcfc 60 tcctgcaagg catetggcta eaccttcctg atttatccaa taagetgçgt gcgâcaggcc 120 cetggacaag ggettgagtg gatgggaaat tttcatcctt acctgggfcgt eactaactac 180 ctgga&aagt tca&gggcag agtcaççatt accgcggaca aateeaogag cacagcctac 240 afcggagctga gcagcctgag atctgaggae acggccgtgt attactgtgc gcgcgççggg 300 actgggtcet ttgâctactg gggccaagga accacggtca ccgtctcctc agcctccacc 300 AAgggcccât cggtcttcoc gctagcgccc fcgctccagga gcacctccga gagcocagcc 420 gccotgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaeegg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggetgtcc tacagtcctc aggaetetae 540 tccctoagca gçgtggtgac cgtgccctee ageagcttgg geacgaagac ctacaccfcgc 600 94 ΡΕ2209806 aacgtagâte acaageecag caacaeoaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 çccccatgcc caccctçecc agcacoigag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccccaaaar. ççaaggacac tctcatgafcc tcccggacc-C ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga geeaggaags ccccgaggfcc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtçcataatg eçaagaeaaa gccçcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900 acjcgtcctca ccgfceefcgea ccaggsctgg ctgaacggca aggagtacaa gtçcaaggfcc 960 tceáaeaâag gccteecgtc ctccatcgag aaaaqçatct ceãããgceaa aággcagccc 1020 egagagccac aggtgtacac cctgcccccá tcecaggagg agatgaccaa gaaccaggfcc 1080 agcctgacct gcctggteaa aggcttctac cccagegaca tcgccgtgga gtgggaaage 1140 aatgggcagc cggagaacaa cfcacaâgacc acgcctcccg tgctggacfcc ççacggctee .1200 ttcttcctct aeagesggct aacegtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaátgtcttc 1260 t cstgctccg tgatgc atga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320 tctctgggt 1329 <210> 3 <211> 1329 <212> DNA <213> SINTÉTICA <400> 3 caggtgcagc tggtgcagtc tggggct%&g gtgaagaagc; ctgggtcctc agtgaaggtfc 60 tcctgc&&qç cãtctggcta. CãGCttCãCt atttatccaa taagctgggt gcgacaggcc 120 cctqq&c.ããç ggcttgagtg gatgggaaafc tttcatccfct acctgggtga cactaactac 180 âatgaaaagt rcaaggçcag agteaecatt accgcggaca aatcçacgag ciacagcctâfi 240 atgg&gctga gc&geetgag atçfcgagçac acggcegtgt attaetgtgc gcgcggggg-g 300 actgggtcct ttgactactc gggccaagga accacggtca ccgtctcctc agcctccacc 360 aagggcccat cggtcttccc gctagcgccc tgctccagga gescctcega gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttcr cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccatga ccagcggcgt ge&c&cettc ccggctgtoc tacagtccte aggactctac 540 tccctcâgea gcgtggtgac cgtgccctcc ageagcttgg gcaeg&agac ctacacctgc 600 aacgtagatç acsagcceag eaacaeeaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 ccccoafcgcc caccctgccc agcacctgag ttectggggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccecaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccgcaccc ctg&ggteae gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggaagâ ccccgaggtc eagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 95 ΡΕ2209806 gtcjcataatg ccaagacaaa geegcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900 agcgteetca . ccgtcctgea ccaggactgg ctgaacggca aggagtaeaa gtgcaaggtc 960 tcçaacaaag gectcccgtc etccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020 cgagagccac : aggtçf.acac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaecâggte 1080 agcctgacct . gcctggtcaa aggettcfcac eecagcgaca tegecgtgga gtgggaaagc 1140 aafcgggcagc cggagaacaa ctaeaagaee aegcctcecg tgctggaccc çgacggctcc 1200 ttcttcctct ; acagcagget aaccgtggac aagagcaggt ggeaggaggg gaatgtcttc 1260 tcatgctccg í tgatgcatga ggctctgcac aaeeaetaca cacagàaga^ cctctccctg 1320 tctctgggt 1320 <210> 4 <211> 1329 <212> DNA <213> SINTÉTICA <40G> 4 caggtgeagc tggtgcagte tggggctgag gtgaagaagc ctgggtccte ag tgaaggtt. 60 tcctgc&agg catctggcta caccttcctg atttatcçaa Laagctgggt gcgacagqcc ' 120 cctggacaag ggcttgagtg gatçggaaat ttfcGStGCtt acctgggtgt cactaactaç 180 ctggaaaagt tcaagggcag agtcãccatt; accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag afcctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcgggggg 300 actgggtcct ttgactactg gggçcaagga accacggtca cegtctcctc agcctccacc 360 aagggcGcat cggtcttccc G t· S Ç[ ·ί^ íj1w w £» tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420 gccctggget gcctggtcaa ggaetaettc cccg&accgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ceagcggcgt gcacaccttc ccggetgtcc tacagtcetc agg&etctac 540 fcceetcagea. gcgtggtgac cgtgccctec ageagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600 áácgtagate âcâãgcccag caaeaceaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 GCÇCCatgGG caccctgcce aqcacctgag fctccfcggggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccccaaaac ccaaggacac tcfccatgatc tcceggaeec ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgt.ga gccêsggâagã ccccgaggtc cagttcaacfc ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gcegcgggag gageagttca acagcacgta ccgtgtggtc SOÚ agcgtcctca ccgtcclgca çcaggactgg ctgaacggca aggagtacas gtgeaaggtc 960 tccâácaaag gcctcecgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagecaa agggcagceo 1020 cgagagecac aggtgtacac cctgceecca tcccaggagg agafcgaccaa gaaccaggtc 1080 96 ΡΕ2209806 agcctgacct gccfcggfcc*a aggcttctac cçcagcgaca tegccgtgga gtgggaaagc 1140 aatgggeags eggagaacaa ctaeaagsce acgcctcccg tgctggactc cgacggcfccc 1.200 ttott.cet.efc aeageagget aaccgtggac aagagcaggt ggçaggaggg gaatgtcttc 1260 fccatgctecg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cetctccctg 1320 tctctgggt 1329 <210> 5 <211> 1329 <212> DNA <213> SINTÉTICA <408> 5 caçgtgc&gc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagç e Çggg fceefcç agtgaaggtt 60 tccfcgessgg catctggcta caccttcctg atttatc-caa fcaagcfcgggt qcqacaggcc 120 ccfcggaceag ggcttgagtg çatggga&at tttc&tcctt acctgggtgt. cactaactac ISO gtggaâ.aa.gt tesagggcag agtcacc&tt accgcggaca aatceaegag cacagectac 240 atggagcfcga geagectg&g atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcgggggg 300 acfcgggtcct t tgactaetg gggecsagga accacggtca ccgtctcctc- agcctccacc 360 aagggcccat oggfccttocc gctagcgccc tgc.tcc.agg a gcaccfcccga gagcacagec 420 geeefcgggefc gcctggtcaa ggactaettc ccogaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggegecctga ccagcggcgt ^GâCâCCwtG ccggc tgt.cc tacagtcctc aggactctdc S40 tccetcsgca çcgtggtgae cgtgeecfcce agcagcctgg qcâcgaagac ctacacetge 600 aacgtagafcc acaagcccaq caacacc&ag gtggacaaga gagttgagic caaatstggt 660 cccccatgcc caccctgccc agcacctgag ttcctggggg gaccat.eagt cttcctgtfce '720 cceccaaaac ccaaggaeac tetcafcgafcc tcccggaccc ctgaggteac gtgcgtggfcg 780 gtggacgtga gecaygaaga ccccgaggfcc eagtteaact ggt.acgtgga tgyegfcggag 840 gtgcafcaatg a aa gccgcgggag gsgcagttca acagcaegfca ccg fcg fc.gg fce 900 agcgtcctca ccgtcctgca ccaçgactgg ctgaacyçea aggagfcaeaa gtgcãaggfce 960 tccaacaa&g gOCtCCCgtC ctccatcgag aaaaccatct CC&aagccaa agggcagccc 1020 cgagagccae aggtgtacac c c t gc cccca tcccaggagg agatgaccãã gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtyga gtgggaaagc 1140 aatgggcage eggagaacaa ctc.caag.scc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct aeageaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgt.ct.tc 1260 tcatgctccg tgafcgcaíiga ggctctgcac aaccactaca eacagaagag cctctccctg 1320 1329ΡΕ2209806 97 tctetgggt <210> 6 <211> 443 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 6 Gin Vâl Gin Leu Vai Gin Ser Gly 1 5

Ser Vâl Lys Vâl Ser Cys Lyg Ala 20

Pro He Ser Trp Vai Arg Gin Ala 35 ‘ 40 <51y Asn Ph« Sis Pro Tyr Leu Glv 50 55

Lys Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala 65 70 tàet Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Ala Arg Gly Gly The Gly Ser Phe 100

Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr 115 120

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 130 ’ 135 Lítu. Vai Ly& A*p Tyr Phe Pr o Glu 145 150

Gly Ai a Leu Thr Ssr Gly Vâl His 165

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser ISO

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 195 200

Glu Vâl Lys Lys Pro Gly Sss* 10 10 Gly Tyr Thr Phe Leu He Tyr 30 Gly Gin Gly Leu Glu Trp Het 45 Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Phe 60 Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 80 Asp Thr Vai Tyr Tyr Cys âo 95 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr .110 Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu 125 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 140 Vai Thr Vâl. Ser Trp Asn Ser 155 160 Phe Fro Ala Val teu Gin Ser 1?0 175 Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser 190 Vai Asp His Lys Pro Ser A$n 205 98 ΡΕ2209806

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val no 215 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 225 230 Pro Pro Lys Pro Lys 245 Asp Thr Thr Cys Val Val. Val ASP Val 260 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser 23Q 295 Vai Leu Bis Gin Asp Trp Leu 305 310 Ser Asn Lys Gly Leu 325 Pro Ser Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 340 Glu Glu È4ec Thr Lys Asn Gin 355 Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala 370 375 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 405 Gly Asn val Phe Ser Cys Ser 420 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 220 Gly Gly Pro Ser Val Fhe Leu Phe 235 240 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 2S0 255 Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe 265 270 val Hís Asn Ala Lys Thr Lys Pro 285 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 309 Gly Lys Gru Tyr Lys Cys Lys Val 315 320 11 e Glu Lys Thr ile Ser Lys Ala 330 335 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin 345 350 Ser Leis Thr Cys Leu Val Lys Gly 365 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 3SQ Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 3S5 400 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu. 410 415 Met Hís Glu Ala Leu Hís Asn His 425 430 Ser Leu Gly 435 99 ΡΕ2209806

<210> 7 <211> 443 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4ΰΰ> 7

Gin Va,l Qln Leu vai Gi» Ser Giy Ala Giu Vai Lys .Lys» P*o Gly Ser 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cya Lys Ala Ser <31 y Tyr Thr Phe Th* Ile Tyr 20 25 30

Pro ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Giy Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 gQ

Lys Gly Arç Vai Thr Ile Thr Ala Aap Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 ÔÕ

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 65 90 55

Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Aap Tyr Trp Gly Gin Giy Thr Thr 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu 115 120 ' 125

Ala Pro Cvs Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 * 135 140

Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Set Trp Asn Ser 145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser 165 170 1T5

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr V&.1 Pro Ser Ser Ser 130 IBS 150

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205

Thr Lys Vai Asp Lys Arg Vai Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 100 ΡΕ2209806 ϊ 10

2lS 220

Pro Cys Pro Ala Pr o Glu Ph.e Leu Gly Gly Pr o Ser Vai phe Leu Phe 225 230 235 240

Pro Pro Lys Prc Lys Asp Thr Leu Hat lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai 245 2S0 255

Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro Glu Vai Gin Phe 260 265 270

Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu vai Kie Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285

Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 280 235 300

Vai Leu. Kis Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai 305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ssr Ser Ile Glu Lys Thr Xle Ser Lys Ala 325 330 335

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin 340 345 350

Glu Glu Hat Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 355 360 365

Phe Tyr Pro Ser í 370 IIa Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 37S 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 ,3S0 335 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu 405 410 415

Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai «st Ris Glu Ala Leu His Asn Ris 420 425 430

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210 S <211> 443 101 ΡΕ2209806

<212> PRT <213> SINTÉTICA <400> Β

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai 20 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 25 30

Pro Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Asrs Phe His 50 Pro Tyr Leu Gly Vai Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Phe 55 60 Lys Gly Arg Vai 65 Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 70 15 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Âsp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Vai Thr vai Ser 115 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu 120 125 Ala Pro Cys Ser 130 Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 135 140 Lsu Vai Lys Asp 145 Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser 150 155 160 Gly Ala Lexs Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr 180 Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser 185 190 Leu Gly Thr Lys 195 Thr Tyr Thr Cys Asn vai Asp His Lys Pro Ser Asn 200 205

Pro Cys Pro

Thr Lys Vai Asp lys Arg Vai Glu Ser Lys Tyr Gly Frc 210 215 220 102 ΡΕ2209806

Pro Cys Pr ο Ma Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe 225 230 233 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pr© Glu Vai 245 250 255

Thr Cys Val Vai Vai Aap Vai Ser Gin Glu Asp Pro Glu Vai Glu Phe 260 ‘ 265 270

Asa Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 230 285

Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val. .Leu Thr 290 295 300

Val Leu Eis Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 ' 320

Sex Asn Lys Gly 'Leu Pro Ser Ser Jle Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 325 330 335

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin 340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys .Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365

Fhe Tyr Pro Ser Asp ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 37Q 375 380

Glu Asrs Asn Tyr Lys Thr Thr P‘ro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 "* 400

Fhe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu 4Q5 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His A$n Hi$ 420 425 430

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440

<210> 9 <211> 443 <212> PRT <213> SINTÉTICA 103 ΡΕ2209806 <4 00>

Gin Vai G1r Leu 1 Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly §er 5 10 ' 15 Ser Vai Lys Vai 20 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 25 30

Pro Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Giy Leu Glu Trp 35 40 45 Glv Agn Phe His 50 Pro Tyr Leu Gly Vai Thr Asn Tyr Vai Glu Lys p^e-55 ' 60 Lys Gly Arg Vai 65 Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 70 75 sq Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp -Thr Ala Vai Tyr Tyr Çys 85 90 05

Ala Arg Giy Gly Thr Gly Ser Phe Agp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Giy Pro Ser Vai Phe Pro Leu 115 120 125

Ala Pro Cy» Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cye 130 135 140 Leu Vai Lys Asp 145 Tyr Phe Pro Glu .Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Se*-150 155 16Ô Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr 180 Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser 185 190 Leu Gly Thr Lys 135 Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn 200 205 Thr Lys Vai Asp 210 Lys Arg Vai Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 215 220 Pro Cys Pro Ala 225 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe 230 235 240 104 ΡΕ2209806

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai 255 250

Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser Gin Giu Asp Pro Glu Vai Gin Phe 26Q 255 270

Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai ais Asn Ala Lys The Ly$ Pro 275 280 285

Arg Glu Glu Gin A$n Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 290 295 300

Vai Lsu ttis Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai 305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr Xle Ser Lys Ala 325 330 335

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pra Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin 340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai. Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 355 360 365

Fbe Tyr Pro Ser Asp He Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu 405 410 115

Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai. fciet His Glu Ala Leu Ris Asn His 420 425 430

Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440

<210> 10 <211> 645 <212> DNA <213> SINTÉTICA <4QQ> 10 gacatceaga tgacccagtc tccatectcc ctgtetgcat etgfcaggaga cagagtcacc 105 ΡΕ2209806 atcacttgca gtgeegagtc acgcgtssgt tccacttact tgttctggta tcagcaeaaa 1,20 ccagggaaag eccctaaget cetgatetat aggacatccc ccctggcttc fcggagtccca 180 fccaaggttca gtggcagtgg átctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 240 cctgaagatt ttgcaactta efcatfcgteag cagtggagtg gt-tacccatt cacgttcggc 300 ggagggacga aggtggagat caaacggact gtggctgcac eatcigtctt catcttcccg 360 ccstctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttç tgfcgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aaçcagacta egagaa&cae aaagtctacg cctgegaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcecgtcac aaagagcttc aacaggggag agfcgc 645

<210> 11 <211> 645 <212> DNA <213> SINTÉTICA <4Õ0> 11 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc etgtcfcgcat ctgt&ggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gtgccagctc acgcgtaagt tccacttact tgtfcctggta tcagcagaaa 120 ecsgggaaag ceeetaagct cctgatctat agg&catcca ecctggcttc tggagtccca 180 tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 240 cctgaagatt ttgcaactta ctattgtcag cagtggagfcg gtfcacccatt cacgttcggc 300 ggagggacca aggtgg&gat caaacggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atcfcggaact gcctctgttg tgtgccfcgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataaeg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagágtg teacsgagea ggacagcasg gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca sagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcecgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgc 645

<210> 12 <211> 645 <212> DNA <213> SINTÉTICA <4 Q0> 12 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gtgccagctc aagagtcfccc tccacttact tgttctggta tcagcagaas. 120 180 ceagggataag cccctaagct cctcatctat sggacaagca cactgácctc tggagtccca 106 ΡΕ2209806

te&aggttca gtggcagtgg atetgggaca gattteactc tcaccatcag cagtcfcgcaa 24Q cctgaagatt fctgcaactta ctafctgeeaa caatggagtg gttacceatt cgtgfcfccggc 300 ggagggaeca aggtggagat caaacggact gtggctgcae catctgtctt catettceeg 360 ccatctgatg ageagttgaa atctggaaet gcctctgttg fcgtgccfcgct gaataaefctc 420 tstcccagag aggeeaaagfc acagtggaag gtggata&cg eectceaafce gggtaaetcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gaeagcacct acagctfceag cagcaccctg 540 acgctgagca a&gcagacta cgsgaaacac aaagtetacg cctgcgaagfc eacccatcag 600 ggcc.tgagct cgeccgfccae aaagagcttc aacaggggag agtgc 84 5

<210> 13 <211> 645 <212> DNA <213> SINTÉTICA <40Q> 13 gacatceaga tgacccagtc tccatcetcc ctgfcctgcafc cfcgtaggaga c:a.gagtcacc 60 atcacttgca gtgacagctc aagagtctcc tccacttact tgttctggta tcagcagaaa 120 ceagggaaaç çccctaagct ecfccatctat aggacsagcc cactggcctc tggagtccsa 180 fcea&ggttca gtggcagtgg atctgggaea gatttcactc teaccatcag cagtctgcaa 240 cctgaagatt ttgcaactta ctattgccaa caatggagtg gttacceatt cgtgttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaacggact gtggctgcae catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataaette 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataaeg ccetccaatc gggtaaetcc 480 caçgagagto tcacagagca ggacagcaag gacagcacot acagccfccag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggccfcgagct cgeecgtcae aaagagcttc aacaggggag agtgc 64 S

<210> 14 <211> 215 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 14

Asp Ile Gin Met Tht Gin Ser Pto Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai GXy I 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Ser Ala Glu Ser Arcj Vai Ser Ser Thr ΡΕ2209806 107

Tyr Leu Phe Trp Tyr Gin Gin Lys 35 40 Ile Tyr Arg Thr Ser Fro Leu Ala 50 55 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 Pro Glu Asp Phe Ala 85 Thr Tyr Tyr Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro 115 120 Gly Thr Âlã Ser Vai Vai Cys Leu 130 135 Al® Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp 145 150 Gin G1.U Ser Vai Thr Glu Gi n Asp 165 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys ISO Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin 135 200 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 21 0 215 <210> 15 <211> 215 <212> PRT <213> SINTÉTICA «00> 15

Pr<s Gly Lys Ala Fro Lys Leu Leu 45

Ser Gly Vai Fro Ser Arg Fhe Ser €0

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin 75 ao

Cys Gin Gin Trp Ser Giy Tyr Fro 90 95

Vai Glu II® Lys Arg Thr Vai Ala 105 110

Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser 125

Leu Asn Asa Phe Tyr Fro Arg Glu 140

Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser 155 160

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 170 * '17 5

Ala Asp Tyr Glu Lys Mis Lys Vai 185 190

Gly Leu Ser Ser Fro Vai Thr Lys 205

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Fro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 IS

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Vai Ser Ser Thr ΡΕ2209806 108 20 25 30

Tyr Leu Phs Trp Tyr Gin Gin Lys 35 40

Pm Gly Lys Ala Pr o Lys Leu Leu 45

Ile Tyr bxq Thr Ser Thr Leu Ma 50 55

Ser* Gly Vai Prc Ser Arg Phe Ser 60

Gly Ser Giy Ser C51y Thr Asp Phe 65 10

Thr Leu Thr 11$ Ser Ser Leu Gin 75 6Q

Prc Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 85

Cys Gin Gin Trp Ser Gly 'Tyr Pro 90 " 95

Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu X1e Lys Arg Thr Vai Ala 100 105 110

Ala Pro Ser Vai Phs Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser 115 120 125

Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140

Ala. Lys Vai Gin Trp Lys Vai Aap Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160

Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Aap Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lya Ala A.sp Tyr Glu Lys His Lys Vai 160 185 190

Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys 195 200 205

Ser Phe Asn Arg Giy Glu Cys 210 215

<210> 16 <211> 215 <212> PRT <213> SINTÉTICA <40G> 16

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 109 ΡΕ2209806

Asp Arg Vai Thr He Th* Cys Ser Ala Ser Ser Arg Vai Ser Ser Thr 20 25 30

Tyr Leu Fhe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

Sle Tyr Arg Thr Ser Thr Leu Thr Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser 30 55 60

Giy Ser Giy Ser Giy Thr Asp Çhe Thr Leu Thr II© Ser Ser Leu Gin 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Tyr Pro 85 ' * 30 95

Phe Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu l'le Lys Arg Thr Vai Ala 100 “ 105 HO

Ala Pro Ser Vai Phe Tle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser ilS 120 125

Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn As.n Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140

Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160

Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ssr Leu 165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai 180 185 150

Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Giy Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys 195 200 ' 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 17 <211> 215 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4O0> 17

Asp lis Gin 5>tet Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 110 ΡΕ2209806 ι 5 10 15

Asp Arg Vai Thr 11¾ Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Vai Ser Ser Thr 20 25 30

Tyr Leu Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Arg Thr Ser Pro Leu Ala Ser Giy Vai Pro Ser Arg Phe Ser 50 ' 55 60

Giy Ser Giy Ser Giy Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Giy Tyr Pro 85 80 95

Phe Vai Phe Giy Giy Giy Thr Lys Vai Glu IXe Lys Arg Thr Vai Ala 100 105 110

Ala Pro Ser Vai Phe 11c Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser 115 120 125

Giy Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140

Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Sly Asn Ser 145 ISO 155 160

Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 1?5

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai 180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Vai The His GIr Giy Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys 195 200 205

Ser Phe Asn Arg Giy Glu Cys 210 215

<210> 18 <211> 25 <212> PRT <213> VACA <4Q0> 18 111 ΡΕ2209806

Asp Thr His Phe Pro Ile Cys Ile Phã Cys Cys Giy Cys Cys Arg Lys 1 5 10 15

Gly Tht: Cys Gly Met Cys Cys Arg Thr 20 25

<210> 19 <211> 25 <212> PRT <213> PORCO <^00> 1:9

Asp Thr His Phe Pro Ile Cys Ile Eh®· Cys Cys Gly Cys Cys Arg Lys 1 5 10 15 ALa lie Cys Gly Mst Cys Cys Lys Thr 20 25

<210> 20 <211> 25 <212> PRT <213> MACACO <4 0G> 20

Asp Thr Sis Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg 1 5 10 15

Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Arg Thr 20 " 25

<210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> CÃO <4 00> 21

Asp Thr His Phe Pro Ile Cys XI© Phe Cys Cys Gly Cys Cys Lys Thr 15 10 15

Pro Lys Cys Gly Leia Cys Cys Lys Thr 20 25

<210> 22 <211> 25 <212> PRT <213> MURGANHO <40Ô> 22 112 ΡΕ2209806

Asp Thr Asn Ph« Pre Ile Cys Ile Ph© Cya €yâ Lys Cys Cys Asn Asn 1 5 10 15

Ser Gin Cys GXy lie Cys Cys Lys Thr 20 25

<210> 23 <211> 25 <212> PRT <213> RATO <400> 23

Asp Thr Asn Pbe Pro 11© Cys Leu Phts Cys Cys Lys Cys Cys Cys Asn 1 5 10 15

Ser Ser Cys Gly Leu Cys Cys Ile Thr 20' ' 25

<210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 24

Asp 'Thr Phe Fro lie Cys Ile Fhe Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys 1 5 10 15

Thr

<210> 25 <211> 571 <212> PRT <213> HUMANA <400> 25

Mst Thr Arg Ala Gly Asp His Asn Arg Gin Arg Gly Cys Cys Gly Ser 1 S ’ 10 15

Leu Ala Asp Tyr Leu Thr Ser Ala Lys Phe Leu Leu Tyr Leu Gly Hís 20 25 30

Ser Leu Ser Thr Trp Gly Asp Arg ffefc Trp His Phe Ala Vai Ser Vai 35 40' 45

Tyr

Phe Leu vai Glu Leu Tyr Gly Asn Ser Leu Leu Leu Thr Ala Vai 50 55 60 113 ΡΕ2209806

Gly Leu. Vai Vai Ala Gly Ser Vai Leu Vai Leu Gly Ala lie 21e Gly 65 70 75 80

Asp Trp vai Asp Lys Asn Ala Arg Leu Lys Vai Ala Gin Thr Ser Leu 85 90 95

Vai vai Gin Asn Vai Ser Vai He Leu Cys Gly lie Ile Leu Mat Met ioo 105 no

Val Phe Leu His Lys His Glu Leu Leu Thr Met Tyr His Gly Trp Vai 115 120 125

Leu Thr Ser Cys Tyr Ile Leu Ile Ile Thr lie Ala Asn lie Ala Asn 130 135 140

Leu Ala Ser Thr Ala Thr Ala Ile Thr Ile Gin Arg Asp Trp Ile Vai 1^5 ISO 155 160

Vai Vai Ala Gly Glu Asp Arg Ser Lys Leu Ala Asn Met Asa Ala Thr 165 170 175

Ile Arg Arg ile Aep Gin Leu Thr Aen Ile Leu Ala Pro Met Ala Vai ISO 1S5 190

Gly Gin Ile Met Thr Phe Gly Ser Pro Vai Ile Gly Cys Gly Phe lie 19â 200 205

Ser Gly Trp Aen Leu Vai Ser Met Cys Vai Glu Tyr Vai Leu Leu Trp 210 215 220

Gly Leu Lys 240

Lys Vai Tyr Gin Lys Thr Pro Ala Leu Ala Vai Lys Al 225 230 235

Glu Glu Glu Thr Glu Leu Lys Gin Leu Asn Leu His Lys Asp Thr Glu 245 250 255

Pro Lys Pro Leu Glu Gly Thr His Leu Met Gly Vai Ly» Asp Ser Asn 260 265 270

Ile His Glu Leu Glu His Glu Gin Glu Pro Thr Cys Ala Ser Gin Met 275 280 285

Ala Glu Pro Phe Arg Thr Phe Arg Asp Gly Trp Vai Ser Tyr Tyr Asm 290 295 300 114 ΡΕ2209806 305 310 315 320

Vai Leu Gly Phe Asp Cys Ile Thr Thr Gly Tyr Ala Tyr Thr Gin Gly 325 330 335

Leu Ser Gly Ser Ile Lsu Ser Ile Leu Met Gly Ala Ser Ala lie Thr 340 345 350

Gly Ile Met Gly Thr Vai Ala Phe Thr Trp Leu Arg àrg Lys Cys Gly 355 360 365

Leu Vai Arg Thr Gly Leu Ile Ser Gly Leu Ala Gin Leu Ser Cys Leu 370 375 3SO

Ile Leu Cys Vai Ile Ser Vai Phe Met Pro Gly Ser Pro Leu Asp Leu 385 390 335 400

Ser Vai Ser Pro Phe Glu Asp Ile Arg Ser Arg' Phe Ile Gin Gly Glu 405 410 415

Ser Ile Thr Pro Thr Lys He Pro Glu He Thr Thr Glu Ile Tyr Met 420 425 430

Ser Asn Gly Ser Asn Ser Ala Asn Ile Vai Pro Glu Thr Ser Pro Glu 435 440 445

Ser Vai Pro Ile Ile Ser Vai Ser Leu Leu Phe Ala Gly Vai Ile Ala 450 455 460

Ala Arg Ile Gly Leu Trp Ser Phe Aap Leu Thr Vai Thr Gin Leu Leu 465 470 475 480

Gin Glu Asn Vai Ile Glu Ser Glu Arg Gly II® ile Asn Gly Vai Gin 485 430 495

Asn Ser Met Asn Tyr Leu Leu Asp Leu Leu His Phe Ile Met Vai lie 500 505 510

Leu Ala Pro Asn Pro Glu Ala Phe Gly Leu Leu Vai Leu Ile Ser Vai 515 520 525

Set Phe Vai Ala Met Gly His II® Met Tyr Phe Arg Phe Ala Gin Asn 530 535 540

Thr Leu Gly Asn Lys Leu Phe Ala Cys Gly Pro Aso .Ala Lys Glu Vai 545 550 555 560 115 ΡΕ2209806

Arg Lys Gl« Asa Gin Ala Asa Thr Ser Vai Yal 565 570

<210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4Q0> 26

Ser Ala Ser Ser Ser Vai Ser Ser Thr Tyr Leu Bis 15 10

<210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4 00 27

Gly Tyr Thr Ph e Thr 1 ls Tyr Pr o lie Giu 1 5 10

<210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400 2 8

Asa Phe His Pro Tyr &$rt Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 ’ 10 15 'jl y

<210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4Q0> 29

Gly Tyr Thr Phe Tyr lie Tyr Prõ Ilê Ser 1 5 10

<210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4Ô0> 30 116 ΡΕ2209806

Arg Thr Ser Thr Leu Ala. Ser 1 5

<210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 31

Gin Gin Trp Ser Gly Tyr Pxo Phe Thr "5 Cl JL --?

<210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4QQ> 32

Gly Tvr Thr Phe Thr Ilfâ Tvr Pro Xle Ser 1 “ 5 10

<210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 33

Asn Phe His Pro Tyr Lys Gly Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys X 5 10 15

Gly

<210> 34 <211> 61 <212> PRT <213> HUMANA <400> 34

Gj.y Ser Vai Phe Pro Gin Gin Thr Gly Uin Leu Ãlâ Glu Leu Gin Pro I 5 10 15

Gin. Asp Arg Ala Gly Ala Arg Ala Sor Trp Ket Pro Mot Phe Gin Arg 20 25 30 Ârg Arg Arg Arg Asp Thr His rhe Prõ Ile Cys Ile Phe Cys Cy® Gly 35 40 45

Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Mefc Cys Cys Lys Thr 117 ΡΕ2209806 50 55 60

<210> 35 <211> 25 <212> PRT <213> HUMANA <400> 35

Gin vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <21 o> 36 <211> 14 <212> PRT <213> HUMANA <400> 36

Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu. Glu Trp Het Gly l ' ' 5 10

<210> 37 <211> 32 <212> PRT <213> HUMANA <400> 37

Arq Vai Thr Ile Thr Ala Asp Lvs Ser Thr Ser Thr Ala Tyr ífcet Glu I 5 10 15 leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> HUMANA <400> 38

Trp Gly Gin. Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 1 * 5 10

<210> 39 <211> 23 <212> PRT <213> HUMANA <4GQ> 39 118 ΡΕ2209806

Asp He Gin Mefc Thx Gin Ser Pr o Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai G i y 1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr He Thr Çys 20

<210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> HUMANA <400> 40

Trp Tyr Gin Glu Lys Fro Gly Lys Ala Fro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5' 10 15

<210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4 0t» 41

Ser Ala Glu Ser Arg Vai Ser Ser Thr Tyr Leu Phe 1 5 10

<210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICA <22 0> <211> CARACTERÍSTICA DIVERSA <212> (3) . . . (3) <213> Xaa na posição 3 = Glu ou Ser <400> 42

Ser Ala Xaa Ser Arg Vai Ser Ser Thr Tyr Leu Fhe 1 5 10

<210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICA <40Q> 43

Ser Ala Ser Ser Arg Vai Ser Ser Thr Tyr Leu Phe 1 5 10 <210> 44 <211> 17 119 ΡΕ2209806

<212> PRT <213> SINTÉTICA <40Ο> 44

Asn Fhe His Pro Tyr Leu Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

X 5 10 IS

Gly <210> 45 <211> 9 <212> DNA <213> SINTÉTICA <400> 45 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> SINTÉTICA sgagtçtcç § <400> 46

Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5

<210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 4?

Ser Leu Ser Ser Arg Vai Ser Ser Thr Tyr Leu Phe 1 5 10

<210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4Ô0> 48

Ser Ile Ser Ser &rg Vai Ser Ser Thr Tyr Leu Phe 1 5 10

<210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 49 120 ΡΕ2209806

Ser Trp Ser Ser &rg Vai Ser Ser Thr Tyr Leu Phe 1 5 IO

<210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 50

Ser Ala Qly Ser Arg Vai Ser Ser Thr Tyr Leu Phe 15 10

<210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4QQ> 51

Ser Ala Ser Ser Arg Vai Vai Ser Thr Tyr Leu Fha 1 5 10

<210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICA <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (2)...(2) <223> Xaa na posição 2 = Ala, Leu ou Ile <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (3)...(3) <223> Xaa na posição 2 = Ser ou Gly <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (5)...(5) <223> Xaa na posição 5 = Arg ou Ser <400> 52

Ser Xaa Xaa Ser Kaâ Vai Ser Ser Thr Tyr Leu Fhe 1 5 10

<210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> SINTÉTICA <40Q> 53 Àrg Thr Ser Pro Leu Aia Ser 1 5 <210> 54 121 ΡΕ2209806

<211> 7 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 54

Arg Thr Ser Ala Leu Ala Ser 1 S

<210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4 00> 55

Arg Thr Ser Trp Leu Ala Ser 1 ' 5

<210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 56

Arg Thr Ser Thr Gly Ala Ser 1 5

<210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 57

Arg Thr Ser Thr Leu Thr Ser 1 5

<210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> SINTÉTICA

<400> 5S

Arg Thr Ser Thr Leu Vai Ser 1 5

<210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> SINTÉTICA 122 ΡΕ2209806 <400> 59

Arg The Ser Thr Leu Leu Ser 1 5

<210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> SINTÉTICA <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (4)...(4) <223> Xaa na posição 4 = Thr, Pro ou Ala <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (5)...(5) <223> Xaa na posição 5 = Leu ou Gly <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (6)...(6) <223> Xaa na posição 6 = Ala, Thr ou Vai <4Q0> m

Arg Thr Ser Xaa Xaa Xaa Ser 1 5

<210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> SINTÉTICA

<400> SI

Gin Gin T.rp Ser Gly Tyr Pro Phs Vai $ i $ 5 #

<210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> SINTÉTICA <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (9)...(9) <223> Xaa na posição 9 = Thr ou Vai <40G> 62

Gin Gin Trp Ser Gly Tyr Pro Pbe Xaa 123 ΡΕ2209806

<210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 63

<31 y Tyr TJi* Bh.e Lsa lie Tyr Pr* H9 Ser .1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4D0> 64

Gly Tyy Thr Phe Trp 11® Tyr lie Ser t 5 10

<210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICA <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (5)...(5) <223> Xaa na posição 5 = Thr, Trp, Tyr ou Leu <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (10)...(10) <223> Xaa na posição 10 = Ser ou Glu <400> 65

Gly Tyr Thr P&a Xaa Xis Tyr Oro 11« Xãâ 1 5 10

<210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4DD> 66

Asn Fhè H:is Ft:ò Tyr Leu Gly Thr Thr Agra Tyr Asrs Glu Lys Phs Lys 1 5 10 IS

Gly 124 ΡΕ2209806

<210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> §7

Asn Fhe His Pro Tyr tea Sly teu Thr Asn Ίγι Aen Glu hys Phe Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA -=--1 00> 68

Asa PA® His Frô· Ty* Leo Gly Vai Thr Asa fyr Asn Glu Lys Phe Lys I 5 ’ 10 15

Gly

<210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <40P> S9

Asn Phe Mis Pro Ty.c Gly Wet ^hr Asn Tyr Asa Glu Lys Phe Lys 1 5 ' 10 IS

Gly

<210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <AOO> 70

Asn Phe Bis Pro Tyr Leu Gly Asp Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 S 10 15

Gly 125 ΡΕ2209806 <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (8) . . . (8) <223> Xaa na posição 8 = Asp, Thr, Leu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (9) . . . (9) <223> Xaa na posição 9 = Thr ou Ala <4m> τι

Asn fhe Sis Ty* La» Gly Xaa Xaa Aa» Tyr As» Glu Lys fhe Lys 1 5 ' 10 15 Ôl.y

<210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> SINTÉTICA <-40G> 12

Gly Gly Pfa» Gly Ser t»hô Aap Tyr

1 S

<210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 73

Gly Gly fh* Gly Ala Aap Syx 1 s

<210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4D0> 74

Gly Gly fhr Gly Ser Fhe Pr» Tyr 1 5 <210> 75 <211> 8 126 ΡΕ2209806 <212> PRT <213> SINTÉTICA <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (3) . . . (3) <223> Xaa na posição 3 = Thr OU Phe <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (5) . . . (5) <223> Xaa na posição 5 = Ser ou Ala <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (7) . . . (7) <223> Xaa na posição 7 = Asp ou Pro <400> 75 Gly β: l y Xa a c-sl.y X a a Rhe Xaa Tyr 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> SINTÉTICA <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (4) . . . (4) <223> Xaa na posição 4 = Pro OU Thr <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (6) . . . (6) <223> Xaa na posição 6 = Ala , Thre ou 7€ Arg Τ 1 hr Ser Xaa Leu 5 Xaa Ser <210> 77 <211 > 9 <212> DNA <213> SINTÉTICA <400 > '77 •agcr.sc ãetg

<210> 78 <211> 9 <212> DNA <213> SINTÉTICA 127 ΡΕ2209806 <4QQ> 78 agcceiictg

<210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> SINTÉTICA <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (3)...(3) <223> Xaa na posição 3 = Thr ou Glu <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (5)...(5) <223> Xaa na posição 5 = Leu ou Thr <4GG> 79 6iy Tyr Xaa £he Xaa He Tyx Pru lié I s

<210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 80

Asa Phe His Pro tyr Leu Qly ûp Thr Lygs Tyr Vai Glu Lya Phe L 1 5 10 15 01 y

<210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4$G> 81

Asa Phe His Pro Tvr Leu Gly Asp Thr Axg Tyr Vai Glu Lys Phe L 1 5* 10 15

Gly

<210> 82 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA 128 ΡΕ2209806 <4 00 > 82

Mn Fhes His Pro Tyr Leu Giy Vai Thr Lys Tyr Lm Glu I»ys Fh® Lys l 5 10 15

Gly

<210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <490> 83

Mn Phe 8is Pr o Ty* Leu Gly Vai Thr Lys fyr Vai Glu hys Ph® Lys 1 5 10 15 siy

<210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 84

Asa. ph® Bis pjfo Tyr L&u Gly Vai Thr Aa» Tyr Laií Gly. Ly® Phe JLys 1 5 10 1.5 i'

Gl

<210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA «5DQ> 85

Asn Pfee Mis Pro Tyr leu Qiy Vai Thr Aso Tyr Vai Siu &ys Ph® Lys I 5 * 1.0 15

Gly <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 86 129 ΡΕ2209806

Asr Phe Hi$ Pro Tyr Lsu Gly asj> Thr Asn Tyy teu Glu l>ys Ph« I»ys

1 5 19 IS

Gly

<210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> SINTÉTICA <22 0>

<221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (8)...(8) <223> Xaa na posição 8 = Vai ou Asp <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (10)...(10) <223> Xaa na posição 10 = Asn, Lys ou Arg <22 0> <221> CARACTERÍSTICA DIVERSA <222> (12) ... (12) <223> Xaa na posição 12 = Vai, Leu ou Asn «490> 87

Asn Phe Hia Pr© Tyr Lee Gly Xaa Th* Xaa Tyr Xaa Glu Lys Phe Lys I S ’ 10 ' 15

<210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> SINTÉTICA

<40Ô> BB

Gin Gin Trp Ser Gly Tyr Pr© Fh© Thr 1 5

<210> 89 <211> 107 <212> PRT <213> HUMANA c400> 89 àrg Thr Vai AI& Ma Pro Ser Vai Ph® He Phe Pr o Pre Ser Âsp i s 10 15 130 ΡΕ2209806

Gin iéu lys Ser Gly Th* Âla Ser Vai Vai Cys Leu tett Asa Asa Phá 20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lya Vai 61» Trp hys Vai Aap Asn Ala Leu 61r 33 40 45

Ser 61 y asa Seat Sln 61 u Ser Vai Thr Glu Gin &sp Ser Lys Asp Ser

50 55 SO

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Th* te a Thr Leu Ser Lys Ala Aap Tyr Glir 55 7Õ 75 80 hvs Hi« Lys Vai Tyr ftla Cvs 61a Vai Thr Kis Slrs Gly teu. Ser Ser S5 90 ^5

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asa &rg Gly 61u Cys 100 105

<210> 90 <211> 329 <212> PRT <213> HUMANA <400> 90

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Ph* Pro teu Ala Pto Ser Ser Lys 1 “ 5 10 13

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala teu Gly Cys teu Vai Lys Asp Tyr 20 25 30

Ph® Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu ?l»t Ser 35 40 45

Gly Vai 50

Leu Ser 6S

Tyr Ile

Lya Vai

Mis Thr Phe Pro Ais Vai Leu Gin Ser Ser Gly L*u Tyr Ser 55 60 Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 70 75 50 Cys Asu Vai Asa Eia Lys Pro Ser Asn Thr Lya Vai Aap Lya 35 §0 95 61« Pro Lya $er Cys Aap Lya Thr Mis Thr Cys Pro Pro Cys 100 ' 105 110

Pro Ma Pro Giu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro ΡΕ2209806 131 11$ 121 125

Lys Bro Lyg 130

Thr teu Mefc He Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cya 135 140 v&l Vál Vai 145

Vai Ser His Glu Asp Pre 61» Vai tys Phe Asn Trp 150 155 160

Tyr Vai

Gly Vai Glu vai Bis Asa A,la Lys Thr tys Pr<s Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asa Ser Thr Tyr Arg Vai Va.1 Ser VAX Leu 'Th?: Vai Leu ISO IBS 150

Bis Gin Asp Trp Leu Asa Gly Lys Glu Tyr Lya Cy$ Lys Vai $er Aan 155 2:00 205

Lys Ale Leu Pro Ala. Pr© He Glu Lya Thr Ile Ser tys Ala Lya Gly 210 220

Gin Pr© Arg Glu Pro Gin V*l Tyr Thr Leu Pr© Fr© Ser Arg Asp Glu 225 230 235 * 240

Leu Th* Lys Aan Gin Vai Ser Leu thr Cya Leu Vai Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Se* Asp He Ala Vai 260

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 265 ' 270 sn Tyr Lys Thr Thr Pro Pr© Vai Leu 27S 280 » Ser Asp Gly Ser Phe Phe 26$

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 2½ ‘ 255 300

Vai Ph» Sar Cya Ser Vai Het: Mis Glu 305 310

Leu His Aan His Tyr Thr 31$ 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325

<210> 91 <211> 329 <212> PRT <213> HUMANA <400> Ml ΡΕ2209806 - 132 -

Ala Ser Thr Lys Gly Pr© Ser Val Fhe Pro l.B&íi Ala Pr© Sé r Ser Ly« 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ma Leu Gly Cys Leu Vai Ly© Asp Tyr 20 2$ 30 P.he Fr© Glu Pr© Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Sly Vai Bis Thr Phe Pro Ala Vai Leu Glr* Ser Ser Gly IíSíí Tyr Ser 38 55 60 Leu Sé r Set Vai vai Thr Vai Pt© Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 lyr Oe Cye As» Va.1, Ãsn Bis Lys Pr <3 Ser Ase Thr Lys Vai Asp Lys 65 90 95 Arg Vai Glu Fr© Lys Ser Cys Asp iy® Thr Sis Thr Cys Fr© Fro Cys 100 105 110 Pr© Ma Pro Glu Leu Leu Gly 01 y P£Q Ser Vai Phe Leu Fhe Fto Fr o 115 120 125 Lys Lys Asp Thr !<®u Mefc 1 lê Ser Arg Thr Pr© Glu Val Thr Cya 130 135 140 Vai Vai Vsl Asp Vai Ser Eis Glu A»P Pr© Glu Vai Lys Phe As π Trp 145 ISO 155 160 Tyr Vai, A.tsp Gly Vai Glu Vai His Α&ϊΐ Ala Lya Thr Ly.® Pr© Arg Glu 165 170 17 5 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Set Vai Leu Thr Val Leu 180 185 190 Mis Asp Trp Leu Asn 61 y Lya GlU Tyr :iye cys Lys Vai Ser A«n 195 200 205 Lys Ala Leu Pr© &l.£i. Pr© 11© Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly 2IÒ 215 220 Glu Prô A.tg Glu Frc Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pr© Ser Arg SlU Glu 22 S 230 235 240 133 ΡΕ2209806

Met, ®hx Lys Asn Gin Vai L^si thϊ Cys Leu Vai Lys Gly £>hg -Tyr 24$ 250 25$

Pr© Ser Aap II® Ala. Vai Glu frp Glu Ser Asn Gly Gin Pr© Gla Asm 260 265 2?0 Âan fyr í>ya fhr Thr Pro Pro vai x*e« Asp Ser A»p Gly Ser Eh# Fhe 215 2SÔ 285

Lau yyr Ser Lye Leu Thr Yal Asp Lys Seu Arg trp Gin Gin. Gly Asm 2S0 255 30b

Vai ffee Ser Cys Ser Vai M®t H.is Glu àk Leu His Asn sis Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 92 <211> 325

<212> PRT <213> HUMANA <400> $2

Ala Ser $hr Lys Gly Pro Ser vai Pfc® Pro %mt Ala Pro Cys Ser Arg l " 5 10 15

Sar <?fcr Ser Glu Ser Thr Ala Ala. Leu GXy Cys Gei* Vai Lye Asp fyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Vai fhx Vai Ser frp As» Ser Giy Ala Leu fhr Ser 35 40 45

Gly Vai His ’íh.r Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser vai Vai fhr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin *hr 80 70

Tyr Thr Cya Asn Vai Asp His Lys Pro $sr Asn Thr Lys Vai Asp Lye 85 S0 S$ thr Vai Glu Arg Ly» Cys €ys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 108 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro ty$ Aap ns 120 1.25 134 ΡΕ2209806

Thr Leu Met II® Ser Arç Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vsl Vai Vai ftsp 130 135 140

Vai Ser His Glu Asp Pr© Gla Vsl Gia Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly 145 150' 155 150

Met Glu Vai Kie Asn Ala Lys Thr Lys ?ro Ar<j Glu 61a Gin Pb® Asn 155 ' ' 170 175

Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser vai Leu Thr vai Vai His Gla Asp Trp

18Ò 185 ISO

Leu Asn Gly Lya Glu Tyr Ly» Cys Lys Vai Ser As» Lya Gly Leu Pr© 155 200 205

Ala Fr© 11® Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 61a Pr© Árg Glu 210 215 ' £20

Fr© Gin Vai Tyr Thr Leu Pr© Pr© Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Aen 22S 230 ' 23$ " 240

Glu vai Ser Leu Thr Cya Leu Vai Lya Gly Fhe Tyr Pr© Ser Asp ila 24$ 250 * 255

Ala Vai õla Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pr© Glu As» Asa Tyr Lys Thr 260 265 270

Thr Fr© Fr© «et Leu Asp Ser Asp Giy ser Fhe Phe Leu Tyr Ser Lys 27$ 260 285

Leu Thr Vsl Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly As» Vai Fhe Ser Cye 2S0 295 3og

Ser Vai «et Hía Glu Ala Leu His Aan His Tyr Thr Gin Lya Ser Leu 30$ 310 31$ 320

Ser Leu Ser Pr© 61y .325

<210> 93 <211> 326 <212> PRT <213> SINTÉTICA <40S> 93 135 ΡΕ2209806

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai l 5

Fhs Pre Leu Ala Pró Cys Ser Arg 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 20

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 25 30

Phe Pr© Glu Pro Vai Thr Vai B*x 35 30

Trp A$n Ser Gly Ais .Leu Thr Ser 45

Gly Vai His Thr ghô Fro Ala Vai SQ 55

Leu Gin Ser Ser Gly Lee Tyr Ser éO

Le« Ser Ser val vai Thr Vai Pro m is

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 75 30

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 35

Pre Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys §0 95 Ãrg Vai Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 100

Pro Cys Pre Pro Cys Pro Ala Pró 105 UQ

Gla Phe Lsa Gly SXy Pro Ser Val 115 120

Phe Leu ?h® Pro Pro Lys Pro Lys 125

Asp Thr Leu Hat He Ser Arg Thr 130 135

Pro Glu val Thr Cys val val Val 140

Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu 13 5 .150

Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp 155 150

Gly Val Glu Val Ais Ase Ala 2»y* 168

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin PH® 170 175

Asa Ssr Thr Tyr Ãrg Val Val Ser ISO

Val Lou Thr Vui Leu His Gin Asp 165 19G

Trp Leu Aon Gly Lys Glu Tyr Lys 1S5 200

Cys Lys Val Sor Asn Lys Siy Leu 205

Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie 2:10 215

Ser Lyo Ala Lys Gly Gin Pro Arg 220

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 225 ' 250

Pro Ser Gin Glu Glu Mel The Lys 235 240

Asn Gin val Ser Leu Thr Cys Leu

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp ΡΕ2209806 136 250 24$

Ile Ala Vai Glu Trp 61« Ser Asa 61y 265 61« Pro Glu Asrs Asn Tyr Lys 260 270 Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp 61 y Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 21$ 2Ô0 285 Arg Leu Thr Vai Asp Ly» Ser Arg Trp Gin Glu Gly A'3 Γ; Va 1 Phe Ser 2$8 2SS 300 Cys Ser Vai 5-tet Hia Glu Ala Leu His Asn Bis Tyr Thr Gin Lys Ser 3ÕS 310 315 320 Leu Ser Leu Ser 'Leu 32 S fiiy <210> 94 <211> 326 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4 0Q> M

Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 λϊβ Ser Thr hy& 01 y Pro Se* Vai Ph-e Pro 1 5 10

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ma -Leu 01 y Oye i*e« Vai tya ãsjs $y« 20 35 30

Phe Pró 01« Pro vai Thr Vai Ser Trp asa Ser 01 y M.& Leu Thr' Ser 35 40 45

Gly Vai Bis Thr Phe Pro Ala Vai leu <31 λ Ser Ser Gly Leu *yr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pr o Ser ser Ser Leu 61 y Thr Ly* 'Thr' S5 '10 15 SO

Tvr Thr Cvs Asn Vai Asp Bis Lys Pro Ser Asa fhr hy» Vai Aap &¥* m oo os

Arg Vai Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala 10S 110

Glu Ala Ala Oly Gly Pro Ser ¥al Phe Leu. Pho Pro Pro Ly« Prv Lys 115 120 125 ΡΕ2209806 137

Asp Thr Lsu Met He Ser A.tg Thr Pr» Glu Val Thr Cys Val Val Vai 130

Asp Vai Ser Gin Glu Asp Pro 61a Vsl Gin Ph« Asn Trp Tyg Val Asp 145 ISO 155 ISO GXy Vai 01¾ Vai H.is As». Ala Lys Thr Lys Pr» 165 1?0 cg GI» Glu Gin Fhe AS» Ser TAr líyr Arg Vai Vál Ser Vai Leu Thr Vai Lêu Ris Gin Asp 180 185 130 T:rp Lea As» 61 y Lya Glu Tyst Lys Cys Lys Vai Ser As» Lys Oly La» 195 200 205

Pr o Ser Ser Ile Glo Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lva Oly 61» Pr© Arg a10 tis 22Q GXu Sre 01» Vai Tyr Tbr Leu Prõ Fxe Ser Ola GXu Glu Hefc TAr Lys 225 230 235 240

Asa 61» Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Oly Phe Tyr Fr o Ser Asp 245 250 255

Ile Ala Val 01u Trp Olu Ser Asa Oly SI» Pr© CUv Asn Asn Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Fro val Leu ftsp Ser Asp Gly Ser Fbe phe Leu Tyr Ser 275 " 280 ' 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 01 n 61» Oly Asn Val Ph@ Sar 290 295 300

Cys Ser Val «et Bis Olu Ala Lau Mis Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320

Leu Ser Lets Ser Leu Oly 32 S <210> 95 <211> 97 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4ÕQ> 95 i»tet Gly Ser s«r His His Bis His His His Ser Ser Gly Leu Val Pra 10 10 138 ΡΕ2209806 bsq Gly Ser Bis Ma Ser Mat Tfer Gly Gly Glrt Gin Met Gly As?g 20 25 30

Gly Ser Ala Vai Tyr li® Ala Trp 2to Lô» SIn Gly Trp Gia Mã Thr 35 ' ¢0 45

Ptee Gly Gly Gly Asp Bis Pre Pro Lys Ser Asp teu 11® Gl» Gly Axg 50 ’ 55 00

Gly Ile L®u Asp Asp Asp Asp l»y« Asp Thr Mis Phe P.r® Ile Cys II® 65 70 75 80

Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser &ys Cys Gly M®fc Cys Cys Lya 5S 9Ô 95

Thr

<210> 96 <211> 32 <212> PRT <213> HUMANA <400> 96

Gly Vai Pr® Ser Arg Phe Ser Gly Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 is‘ 19

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pre Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 2Ò 25 30

<210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> HUMANA <4O0> 97

Phe Giy Giy Gly Thr kys Vai Glu Ile Lys 1 5 10

<210> 98 <211> 117 <212> PRT <213> MURGANHO «400> m

Gl« Vai ISiiS leis GIr. Gin ser Gly Ala Gla Leu Vai Lys Pr® Gly Ala 15 15 139 ΡΕ2209806 1 Ser v-sl Pr© li# G1 y A.sn 50

Lys Mefc Ser Cys Lys Ais Phe Ôiy Tyr Th,r Phe Thr lie tyr 20 25 30

Glu Trg> Lys GIss Asn His Qíy Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 ‘ 45

Phe Hls Bxo Tyr ft.sís. Giy Asp Thr Asa Tyr Aan Glu Ly® Phe 55 60

Lys Gly 85

Leu GIu

Ly» Ala Lys Leu Thr Vai Glu Lya Ser Ser Ser Thr Vai Tyr 70 75 m

Leu Ser &xg Leu Thr Ser Aap Aap Ser ÂL.& Vai Tyr Tyr Cys 85 39' 95

Ala Arg

Gly Gly Thr Gly Ser Fhe &sp Tyr Tsp Gly Gin Sly Thr 5er '3 Ωβ 10» 110

Leu Thr Vãl Ser Sés

<210> 99 <211> 108 <212> PRT <213> MURGANHO <499> 99

Glu Thr fhr í ^.<X' “Thr Gin Ser Pre Ala lie Met Ala Ala Sar Leu Sly 1 A 10 15 G1h Lys Va.1 Thr Ket thr Cys Ser Ala Ssjc Ser Ss:ií Và,l S^sâr Ser Thr 20 2 5 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gin Glrs Lys Ser Gly Alé Ser Pr© Lys Pr© Lsu 35 40 45 Ils Tyr Arg Thr Ser Thr Leu ftlé Ser Gly Vai Pr o Ala Phe Se r 50 55 m Gly Ser Gly Ser Gly Th r S©r Tyx Ser Leis. Thr Uê Ser Smr Vai G1m §5 70 7 5 BQ Ala Glu Asp .ftsp A.la Thr Tyr Tyr Cys Gin. Gin Trp Ser Gly Tyr Pro 55 90 $5 140 ΡΕ2209806

Phe Thr Phe G1 y Ser Gly Thr Arg Leu 01 u lis Lys 100 105

<210> 100 <211> 12 <212> DNA <213> SINTÉTICA <400 100 tfccaacaafc gg 12

<210> 101 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400 101

Aap ile ein Met Thr ΟΙλ Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai GXy 1 5 10 15

Asp As:g vai

Tyr Leu 2he 35

He Tyr Arg S0

Gly Ser Giy OS

Pro Giu Asp

Th.r lie Thr Cye Ser Leu Ser Ser Arg vai Ser Ser Thr 20 25 30

Trp Tyr Gin Gin Lye Pre Gly Lys Ala Pro Lys teu Leu 4S 45

Thr Ser Thr Leu Ala Ser Sly Vai Pro Ser Arg Pfce Ser 55 §Õ

Ser Gly Thr Âsp Phe Thr Leu Thr Ilt Ser Ser Leu Gin 70 '?§ 80

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cy;s GXn Gl« rxp Ser Sly Tyr Pr® 85 90 95

Phe Thr Ph« Slv Sly Gly Thr Lys Vai <31 u Ile Lys 100 105

<210> 102 <211> 107 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400 102 Açp He Gin. Mete Thr Gin Ssr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 A$p Arg Vai Thr lie Tht Cys Ser lie Ser Ser Arg Vai Ser Ser Thr ΡΕ2209806 141 20

Tys Leu Phe Xxp Tyr Gin Gin .Lys -¾.¾ 40

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 45

Ser Gly Vai Fro Ser Fhe Ser 60

Gly Ssr Gly Ser ©Xy TTsr *®P 65 τϋ

Thr Leu Thr ile Ser Ser Leu 61« 75 30 »ro Glu &sp wh» bl» tbr Tyr Tyr 85

Cy* Gin Gin Trp Sèr Gly Tyr Pr O 90 »5

Vai Sl5J. Π6 105

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Fhe Th.r Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100

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Pro Slu Asp phô Ais Tbr Tyr Tyr 85

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15 Ala <31 γ Ser Arg Vai Ser Ser Thr 25 30 Pro Glv Lys Ala Pro Lys Leu Leu 45 Ser Gip Vai Pro m Ser Arg Ph© Ser Thr Leu. Thr XI© Ser S-g-r Leu Glã 7 5 80 Cys Gin Gin Trp Ser Sly Tyr Fro

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Fhe Thr Leu Thr li§ Ser Ser Leu Gin 65:" 70 75 $0

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<210> 107 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400 107

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Fro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly l 5 19 15

Asp Arg Vai Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Vei Ser Ser Thr 20 25 30

Tyr Leu Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pr© Gly Lys Ala Fr© Lys Leu Leu 45 11« Tyr Arg Thr Ser Ala Leu Ala Ser Gly V&l Pr© Ser Arg Phe Ser 144 ΡΕ2209806 58 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Th.r Asp Ph« Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 61 n S5 70 75 80

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Phe Thr Phe Gly Gly Gly TAr l*ys Vai GXu lie Lye 100 105

<210> 108 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 108

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<210> 109 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 105

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Ser Ala Ser Ser Arg Vai ãer 25 30

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Gly (Sly Gly Thr Lys Vai Glu 11 & Lys 10S 105 <210> 111 <211> 108 146 ΡΕ2209806

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Phe Thr Pha Gly Gly Gly Thr Lys Vai Gla Ue Lys 100 105

<210> 112 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <<?Q0> 112

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I 5 10 IS

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Tyr Leu Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pxo Gly Lys Ais Pro Lys Leu Leu 35 40 45 ile Tyr Arg Thr Ser Thr Leu Leu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Ph® Ser 50 ’ 55 60

Gly Ser Gly Ser Giy Thr Asp Ph® The Leu Thr Ile Ser Ser Leu <31 a 55 70 75 SÓ

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Phe Thr Fhe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Gin II# Lys 100 105 <210> 113 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <40 0> 113

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Asp Arg Vai Thr Ila Thr €ys Ser Ala Ser Ssr Arg Vai Ser Ser Thr

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Lssa Gin §5 70 75 §0

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Vai Glu Ile Lyg 105

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Tyr; Leu. Phe Trp Tyr G.iis Gl-h Lys 35 40

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Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15

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<210> 116 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 116

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Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gl« Gin Trp Ser Gly Ty.r Pro SS " 90 95

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp The Thr Leu Thr íia Ser Ser Leu Gl» €5 70 75 m

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Gly Ser Giy Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gia 65 70 75 80 ΡΕ2209806 151

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<210> 121 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 121

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Asp Arg Val Thr lie fhr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Vai Ser Ser Thr 20 25 * 30

Tyr Leu Fhe Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Lye Ala Pro Lys Leu Le» 35 40 4.5 ΡΕ2209806 152

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp fhe Thr Leu Thr Ik Ser Ser Leu Gin &5 ' 10 15 80

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Asp Arg Vai Thr 11« Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Vai Ser Ser Thr 20 25 30

Tyr Leu Ph® Trp Tyr Sln Gin Lys Pro Gly Ly« Ala Pr» Lys Leu Leu 35 40 45 11« Tyr Arg Thr Ser Pr» Leu Ala Ser <3iy vai Pro 50 55 S0 X Ar» fha Ser GXy Ser Gly Ser Gly Thr Asp Fh© Thr 65' 70

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Pro Giu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Gly Tyr Pro 85 30 95

Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 <210> 123 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400 123 Asp ile Gin «et Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai. Gly 1 5 10 15 ΡΕ2209806 153

Asp Ara Vai l'hr lie Th.r Cys Ser 20 Tyr Lee Fhe Trp fyr G1 π G1n Lys 35 40 lie Tyr Arg Thr Ser Fro Leu Ala 50 55 Sly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Fh<s 65 70 Fro Glu Asp Fhe Ã,i.3. Thr Tyr Tyr as Fhe Val Fhe Gly Giy Gly Thr Lys 100 <210> 124 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <40Q> 124 Asp lia Gin M®t Thr Gin Ser Fr a 1 5 Asp Arg Vai Thr 20 He Thr Cys Ser Tyr Leu Fhe Trp Tyr Gin Gin Lys 35 40 11® Tyr Arg Thr Sí) $®r Thr Lpu 55 Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 * -y- Fro Glu Asp Fh® Ala Thr Tyr Tyr 85 Php Vai Fhe Gly Gly Gly Thr Lys 100 Vai GLe lie lye 1.05 Vai Glu ile Lys 105

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Ala Ser Ser Arg Vai Ser Ser Thr 25 ' 30

Fro Gly Lys Ala Fro Lys Leu leu 45

Ser Gly Vai Fro Ser Arg Fh® Ser δ0

Thr Leu TAr ile Ser Ser Leu Gin 75 80

Cys Gin Gin Trp Ser Gly Tyr Fro 90 95 154 ΡΕ2209806

<210> 125 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4ÔS> 125

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Fso Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Sér Gly Tyr Pro 85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 1ÕÒ 103

<210> 127 <211> 108 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4D0> 127 11« Gin Met Thr Gla Ssr Pro Ssr Ser teu Ser Ais Ser Vai Gly 1 3 10 15

Asp â.e«s Vai Thr Ile Thr Cy» Ser Ala Ser Ser Arg Vai Ser Ser Thr· .20 25 30

Tyr Leu Phe Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly tys Ala Pro Lys Leu Leu 35 <?& 3$ lie Tyr hxg Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly vai pro Ser Arg Phe Ser SQ: 55 69

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin 65 " 79 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Glo Trp Ser Gly Tyr Pr* 85 " 90 95

Phe Yh.r Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu He Lys 190 105

<210> 128 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA <490> 128

Gin Vai Gin teu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai tys Lys Pro Gly Ser I 5 10 IS*

Ser Vai Lys Vai Ser Çy® Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr lie Tyr 20 “ 25 39

Pro 11« Ser Trp Vai Arg Gin Ala Fr© Gly Gin Gly Leu Glu Trp mt 156 ΡΕ2209806

Gly Aen PHe H is Fre Tyr he« Gly Asp Thr Asn Tyr Aan 61» Lys fhe 50 55 m 'Lys Gly Arg VAX Thr iie fhr AI a Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr €5 "?0 75 80

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Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Fhs Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr The lâb 105 no

Vai Thr Vai Ser S«r

<210> 129 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 129

Gin Vai Gin Leu Vai 61n Ser Gly Ala Glat Vai Lys Lys Fre Gly Ser I 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr fhe Leu íle Tyr 20 25 30

Pre lie Ser Trp Vai Arg Gin Ala Fro Gly Gin 6iy Leu Glu Trp t$et 35 40 45

Gly Aaa Fha ais Fre Tyr Leu Gly Asp Thr Aan Tyr Asπ Glu Lys Fhe 50 5 5 80

Lys 61.y Arg Vai Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr .Ala Tyr 65 ' 70 75 80

Mat 61u Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Tfer Ala Vai Tyr Tyr Cys 8.5 30 35

Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser ISO

Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 105 110

Vai Thr Vai 3·.?r Ssr 115 157 ΡΕ2209806

<210> 130 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA dn Vai CU η. ι

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<210> 131 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 131

Gin vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala <31 u Vai Lys Lys Pró Gly Ser 1 5 10 ’ 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cye Lys Ma 3©r Giy Tyr Thr Fhe Thr lie Tyr 20 25 l' 30

Pro Lis Ser Trp Vai Arg Gi» Ala í?ro Gly Gin Gly Leu Gls ftp Met 35 40 " 45

Gly Mn Phe Hi« Pro- Tyr Leu Gly Thr Thr Asn Tyr Asn GLu Lys i?he 50 55 ®0 158 ΡΕ2209806

Lys Gly Arg Vsl Thr II© Thr Ala &sp tys Ser 1¾ t Ser 7ftr TVr 65 70 75 89

Met GIu Leu Ser Ser teu Arg Ser Gly Aap Thr Ala. vai Tyr 7yr CYS 85 90 55

Ala Arg Gly Gly thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gl» Gly Thr Thr 100 105 11^

Vai Thr Vai Ser Ser 115

<210> 132 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA <40õ> 132

Gin Vai Gin L©« Vai Gin Ser Gly Ma Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Se* Cys Cys Ala Ser Gly Tyr Thr £%© Thr Ile Tyr 20 25 ' 30

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Gly Asn Phe Kia Pto Tyr Leu Gly Leu Thr Aan Tyr Asm Sl» l»ya Phe 50 55 60

Lys Gly ώ '

Vai Thr Ile Thr Ala Asp Ly» Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 70 75 $0

Met Glu teu Ser Se* Leu Asg Ser Glu Aep Thr Ala Vai Tyr Tvr Cys 85 90 g|

Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 61» Gly Thr Thr ISO 105 110

Vai Thr Va.l Ser Ser 115

<210> 133 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA 159 ΡΕ2209806 <4Ó0> 133

Gin ¥âl Gin .Lôtt Vai Gin Ser Gly Ms Glu Vai l*ys Lys Pr» Gly Ser 15 10 13

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ais Ser Gly Tyr Thr Pha Thr Ila Tyr 20 25 " 30

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Ser Vãl Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr lie Tyr 20 25 30

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Met 61 u Leu Ser Ser Leu. Ârg Ssr 61u Asp Thr Ala Vai Tyr Tyt Cys 85 Mi 95

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Vai Thr Vai Ser Ser 115

<210> 135 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA

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Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 138 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA <mn> ias Gin Vai Gin. 1 vai Gin Ser Gly Ala Glu vai hys Lyss Pro Gly Ser 5 10 15

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Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 80 95

Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Ph© Pr» Tyr Trp Gly Gin Gly Th 100 105 110 Vai Thr Vai Ser Ser 115

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<210> 139 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 1.39 Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly âer 1 S 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Cys Ala. Ser Gly Tyr Glu Fhe L&a lie Tyr 20 * 2S 30 163 ΡΕ2209806

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Ala. Arg <51 y Sly Thr Sly Ser Ph« Aap Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 V&Í Thr Vai $ar Ser 115 <210> 140 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400> 140 <31» Vai Gin tea Vsl Sis 1 5 Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys fro Gly Ser 1Ô 15 Ser Vai Lys Vai S©r Cys· Lys Ais Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 " 30 Pro lie Ser Trp Vai Arg 35 Gin Ais Pro Gly 61» Gly Leu Glu Trp Hat 40 45 Sl.y As» Pha fíis Pro Tyr 50 Lau Gly A«p Thr Lys Tyr Vai Glu Lys Fh« 55 6Q Lys G1.y Arg Vai Thr Ile 65 1 70 Thr Ala Àsp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu 55 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95 Ârg õly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Tr» Gly Gin Gly Thr Th»

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<210> 141 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400 141 GIn Vai Gin Leis Vai Gls S®r Gly Al a Glg Vai Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys vai Ser Cys Lys Ala S®r Gly Tyr Thr Ph® Thr 1.1® Tyr 20 25 30 Pr o na Ser Trp Vai Arg Gin Ala. Sxv Gly Gin Gly Leu Giu Trp Met: 35 40 45 Gly Agn Fhe His Pro Tyr Lets Gly Agp Thr Arg Tyr Ve 1 Glv Lys Fhe 50 55 60 Lys Gly Ãrg Vâl Thr -ív Thr Ala Asp Lya Ser Thr Ser Thi* Ala Tyr 65 70 7 5 SO 34®t GI si Leu Ser Ser Lee. Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90' 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Fhe Asp Tyr Trp Gly "5 Λ Gly Thr Thr 100 105 110 V'al Thr Vai Ser Ser 115

<210> 142 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400 142

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Gin Vai Gin Lee Vai Gin Ser Gly Ma <3iti Vai Lys X*y» ?r© Gly S«j

1 3 10 IS

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Vai Thr Vai Ser Ser 115

<210> 145 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA <400 145

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys lys Xro Gly Ser 1 S 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ais Ser Gly Tyr Thr 3?he Leu Ile Tyr 20 ' 25 ' 30

Fr© lie Ser fsp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Mst 35 40 45

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65 " ' ?Ú ?$ SS 167 ΡΕ2209806 tist δία I*ew Ser S«r Lê» Arg Ser Gl» A&p Thr Ala Vai Tyr Tyr Cya 85 80 ' 95

Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser P&e Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser 115

<210> 146 <211> 117 <212> PRT <213> SINTÉTICA <4Q0> 14é GXw Vai Gin I Ser Vai Lya Tro lie Ser 35 Gly Asn Phe 50 Lya Gly Arg 65 &et Glu Seu

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<210> 161 <211> 32 <212> PRT <213> HUMANA <400> 161

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Lisboa, 26 de Setembro de 2012

Claims (19)

1. ΡΕ2209806 1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo isolado que se liga a hepcidina-25 humana com uma KD de 800 pM ou menos determinada por ressonância plasmónica de superfície (SPR) a 25°C e compreendem seis CDR seleccionadas do grupo que consiste em: (i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID NOs: 52, 60, 62, 65, 71 e 75, respectivamente; (ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID NOs: 42, 76, 62, 79, 87 e 46, respectivamente; (iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID NOs: 41, 53, 31, 63, 84 e 46, respectivamente; (iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID NOs: 43, 30, 31, 32, 44 e 46, respectivamente; (v) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 tendo as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID NOs: 43, 53, 61, 63, 85 e 46, respectivamente; e (vi) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 ΡΕ2209806 possuindo as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID NOs: 43, 57, 61, 63, 84 e 46, respectivamente.
2. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 em que o anticorpo tem uma KD para hepcidina-25 humana entre 400 pM a 30 pM determinada por SPR a 25°C.
3. 3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 em que o anticorpo tem uma KD para hepcidina-25 humana entre 200 pM a 30 pM determinada por SPR a 25°C.
4. 4. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 em que o anticorpo tem uma IC5o entre 100 nM e 50 nM num ensaio in vitro de actividade de hepcidina-25, em que o referido ensaio mede a internalização e/ou degradação da ferroportina induzida pela hepcidina.
5. 5. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 em que o anticorpo tem uma IC50 entre 100 nM e 25 nM num ensaio in vitro de actividade de hepcidina-25, em que o referido ensaio mede um abaixamento dos niveis séricos de ferro induzido por IL-6.
6. 6. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 em que o anticorpo é um anticorpo humano de engenharia.
7. 7 . Anticorpo de acordo com qualquer das reivin- 3 ΡΕ2209806 dicações 1 a 6 em que a estrutura da região variável da cadeia leve é seleccionada de 02, 018 ou L12.
8. 8. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7 em que a estrutura da região variável da cadeia pesada é seleccionada de VH1-69, VH1-18 ou VH1-46.
9. 9. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 que compreende uma região variável da cadeia pesada (HCVR) e uma região variável da cadeia leve (LCVR) em que (i) a HCVR e a LCVR têm as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID Nos: 148 e 126, respectivamente; (ii) a HCVR e a LCVR têm as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID Nos: 128 e 127, respectivamente; (iii) a HCVR e a LCVR têm as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID Nos: 150 e 124, respectivamente; ou (iv) a HCVR e a LCVR têm as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID Nos: 151 e 125, respectivamente.
10. 10. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9 que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve tendo (i) as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID Nos: 6 e 14, respectivamente; (ii) as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID Nos: 7 e 15, respectivamente; (iii) as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID Nos: 9 e 17, respectivamente; ou (iv) as sequências de aminoácidos como indicado nas SEQ ID Nos: 8 e 16, respectivamente. 4 ΡΕ2209806
11. 11. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10 que compreende dois polipéptidos de cadeia pesada e dois polipéptidos de cadeia leve e em que cada um dos polipéptidos de cadeia pesada tem a sequência de amino-ácidos como indicado na SEQ ID NO: 8 e cada um dos polipéptidos de cadeia leve tem a sequência de aminoácidos como indicado na SEQ ID NO: 16.
12. 12. Polinucleótido compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11.
13. 13. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 12 compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica uma polipéptido de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos como indicado nas SEQ ID NOs: 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 .
14. 14. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, e um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
15. 15. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11 para utilização em terapêutica.
16. 16. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11 para utilização no tratamento e/ou prevenção de anemia. 5 ΡΕ2209806
17. 17. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11 para utilização no aumento dos niveis séricos de ferro, contagem de reticulócitos, contagem de glóbulos vermelhos, hemoglobina ou hematócrito num indivíduo .
18. 18. Ensaio imunológico compreendendo a) a obtenção de uma amostra a ser testada quanto a hepcidina madura humana; b) a colocação da amostra em contacto com um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11 em condições adequadas para ligação ao anticorpo e deixar qualquer hepcidina madura humana presente formar um complexo com o anticorpo; e c) a detecção da presença ou ausência do complexo; e/ou determinação da quantidade do complexo na amostra por um método de imunodetecção.
19. 19. Ensaio imunológico de acordo com a reivindicação 18, em que o método de imunodetecção é um ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), um ensaio de imuno-histoquimica (IHC), um ensaio de imunofluorescência (IF), um ensaio de aglutinação, um ensaio de transferência de Western, um ensaio de transferência por gota, um ensaio de transferência de poço ou um método de detecção da resistência plasmónica de superfície. Lisboa, 26 de Setembro de 2012