KR20120107145A - 항-헵시딘 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하고, 인간 헵시딘-25에 대하여 고도의 친화성과, 강력한 인간의 성숙한 헵시딘 중화 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 치료학적으로 인간에서 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈 및/또는 적혈구 용적률을 증가시키는데 있어서, 그리고 인간 대상체에서 빈혈과 같이 성숙한 헵시딘으로 조장된 질병을 치료 및 진단하는데 있어서 유용하다.

Description

항-헵시딘 항체 및 그의 용도{ANTI-HEPCIDIN ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본 발명은 의약 분야, 특히, 인간의 성숙한 헵시딘에 대한 항체 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 인간의 성숙한 헵시딘 생체활성을 중화시킬 수 있고, 이로써, 인간의 성숙한 헵시딘으로 조장된 질환, 병태, 또는 질병, 예로서, 빈혈을 치료하거나 예방하기 위한 목적으로 인간에서 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률을 증가시키는데 유용한, 헵시딘-25 선택성 모노클로날 항체에 관한 것이다.

현재는, 빈혈, 또는 만성 질환으로 인한 빈혈에 대하여 적합하고 유효한 치료법이 제한되어 있다. 특히, 에리트로포이에틴을 투여하는 것은 전체 환자 중 단지 약 50％에서만 유효성을 띠고, 이는 바람직하지 못한 부작용과도 관련이 있다. 추가로, 수혈은 오염, 감염, 및 철분 과부하의 위험이 있기 때문에 바람직하지 못하다.

주로 간세포에 의해 발현된 폴리펩티드인 인간 헵시딘은, 장내 철분 흡수, 대식세포에 의한 철분 재생, 및 간에 저장된 철분으로부터의 철분 동원을 음성적으로 조절하는 중요한 철분 조절 단백질인 것으로 여겨진다. 헵시딘의 과생산은 빈혈 및/또는 만성 질환으로 인한 빈혈의 병태생리에서 중요한 역할을 하는 것으로 보여진다.

인간 헵시딘은, 전형적인 N-말단의 24개의 아미노산으로 이루어진 소포체-표적 신호 서열과, 공통 퓨린-절단 영역을 포함하는 35개의 아미노산으로 이루어진 프로영역(proregion) 바로 다음의, C-말단의 25개의 아미노산으로 이루어진 생체활성의 철분-조절 호르몬인 인간 헵시딘-25 (서열 번호: 1)를 함유하는, 84개의 아미노산으로 이루어진 프리프로펩티드로서 코딩된다. 인간 헵시딘-25의 각종 N-말단 절단된 형태, 예로서, 인간 헵시딘-20 (즉, 서열 번호: 1의 아미노산 6-25) 및 인간 헵시딘-22 (서열 번호: 1의 아미노산 4-25) 또한 생체내에서 형성되는 것으로 알려져 있다.

인간 헵시딘에 대한 항체가 앞서 보고된 바 있지만 (예로서, 미국 특허 출원 공보 2004/0096990 및 2007/0224186, 및 PCT 국제 특허 출원 공보 WO 2008/097461 참조), 예로서, 암으로 인한 빈혈 및 염증으로 인한 빈혈과 같은, 만성 질환으로 인한 빈혈을 비롯한 빈혈과 관련된 질환 및 질병을 치료하기 위한 추가의 약물을 위해서 당업계에서는 여전히 크게 요구되고 있다. 유일한 것은 아니지만 헵시딘-25가 인간에서 생리학적으로 관련성이 가장 큰 형태의 헵시딘이기 때문에, 생리학적으로 관련이 없는 헵시딘 폴리펩티드와 비교하여 인간 헵시딘-25를 선택적으로 표적하는 항체가 특히 요구된다. 따라서, 본 발명은 성숙한 헵시딘의 수준이 상승된 것과 관련된 질병, 예로서, 빈혈의 치료 또는 진단에 있어서 많은 장점을 가지고 있는, 인간 헵시딘-25에 대하여 선택성이고 고친화성인, 조작된 치료학적 항체를 제공한다. 예를 들면, 고친화성의 중화 항체로서, 인간의 조작된 것이며, 인간에서의 생리학적으로 관련된 형태의 헵시딘에 대하여 고도로 선택성인 이들 항체는 부작용의 위험성을 감소시킬 것이며, 효과적인 치료를 위해 필요한 임상 투여량 및 투약 빈도를 감소시킬 것이다. 본 발명은 또한 바람직한 선택성 헵시딘-25 항체를 코딩하는 바람직한 핵산으로서, 포유동물 숙주 세포에 의한 발현시에 본 발명의 특정 항체가 바람직하지 못하게 응집되게 하는 잠재 스플라이스 영역이 공학처리로 제거된 것인 핵산을 포함한다. 따라서, 본 발명으로부터 도출된 추가의 이점으로는 바람직한 순도의 항체 생성물 수율 개선과 그에 따른 생산 비용 절감 뿐만 아니라, 더 큰 정도의 임상적 유효성 및 투여되는 항체 생성물에 대한 안전성을 포함한다.

추가로, 인간 헵시딘에 대한 임상적으로 이용가능한 면역분석법은 활성의, 생리학적으로 관련된 형태의 인간 헵시딘을 비활성의, 생리학적으로 관련이 없는 헵시딘 종 (예를 들면, 문헌 [Kemna, E.H., et al., Haematologica, 93(1):90-7 (2008)] 참조)과 구별하지 못한다. 현재, 헵시딘-25에 대하여 선택적으로 분석하는 대부분의 방법은 LC/MS (액체 크로마토그래피/질량 분광분석법) 또는 다양한 형태의 헵시딘을 분리하는데 필요한 유사의 복잡한 방법을 포함한다 (예를 들면, 문헌 ([Gutierrez, J.A., et al., BioTechniques, 38:S13-S17 (2005)], [Murphy, et al., Blood, 110: 1048-54 (2007)] 및 [Kemna, E.H., et al., Clin. Chem. 53:620-8 (2007)]) 참조). 이러한 분석법이 정확하고 정밀할 수는 있지만, 상기 분석법의 복잡성, 비용, 및 조작자에게 필요한 고수준의 전문적인 기술로 인하여 상기 분석법의 통상적인 실행이 이루어지지 못한다. 따라서, 진단용 및/또는 예후용의, 성숙한 형태의 인간 헵시딘에 대한 특이적인 검출 또는 측정을 위한 것으로서, 상대적으로 간단하고, 신속하며, 견실한 면역분석법에서 적용될 수 있는, 고친화성으로 인간의 성숙한 헵시딘에 결합하는 추가의 항체 또한 크게 요구되고 있다.

본 발명은 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정시 약 800 pM 이하의 결합 친화성 (K_D)으로 인간 헵시딘-25에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직하게, 항체는 25℃에서 SPR에 의해 측정시 인간 헵시딘-25에 대하여 약 8.5 x 10^-3s^-1 내지 약 1.8 x 10^-4s^-1의 해리 속도 (k_오프)를 갖는다. 더욱 바람직하게, 항체는 25℃에서 SPR에 의해 측정시 인간 헵시딘-25에 대하여 약 400 pM 내지 약 30 pM의 K_D를 갖는다. 더욱더 바람직하게, 항체는 25℃에서 SPR에 의해 측정시 인간 헵시딘-25에 대하여 약 200 pM 내지 약 30 pM의 K_D를 갖는다. 더욱더 바람직하게, 항체는 헵시딘-25 생체활성에 관한 생체내 분석법에서, 바람직하게는, IL-6에 의해 유도된 혈청 철분 수치 감소를 측정하는 것인 상기 분석법에서 약 100 nM 내지 약 25 nM의 IC₅₀을 갖는다. 더욱더 바람직하게, 항체는 헵시딘-25 생체활성에 관한 시험관내 분석법에서, 바람직하게는, 헵시딘에 의해 유도된 페로포틴의 내재화 및/또는 분해를 측정하는 것인 상기 분석법에서 약 100 nM 내지 약 50 nM의 IC₅₀을 갖는다. 더욱더 바람직하게, 항체는 i) 서열 번호: 75에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 HCDR3, 및 ii) 서열 번호: 62에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR 중 적어도 하나를 포함한다.

본 발명은 약 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하며, 중쇄 가변 영역 ("HCVR") 폴리펩티드 및 경쇄 가변 영역 ("LCVR") 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 (i) HCVR 및 LCVR 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 148 및 126에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (ii) HCVR 및 LCVR 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 128 및 127에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (iii) HCVR 및 LCVR 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 151 및 125에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (iv) HCVR 및 LCVR 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 150 및 124에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 것인, 항체를 포함한다.

본 발명은 약 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하며, 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 (i) 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 6 및 14에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (ii) 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 7 및 15에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; (iii) 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 9 및 17에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나; 또는 (iv) 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 각각 서열 번호: 8 및 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 것인, 항체를 포함한다.

본 발명은 약 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하며, 본원 표 1에 열거된 Fab 중에 함께 존재하고, 항체 중, 표 1에 나타낸 것과 동일한 CDR 위치에 존재하는 것인 3개의 CDR 서열을 포함하는 LCVR 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 바람직하게, 상기 항체는 서열 번호: 101-127로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 약 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하며, 본원 표 2에 열거된 Fab 중에 함께 존재하고, 항체 중, 표 2에 나타낸 것과 동일한 CDR 위치에 존재하는 것인 3개의 CDR 서열을 포함하는 HCVR 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 바람직하게, 상기 항체는 서열 번호: 128-151로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCVR 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 약 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하며, i) 본원 표 1에 열거된 Fab 중에 함께 존재하고, 항체 중, 표 1에 나타낸 것과 동일한 CDR 위치에 존재하는 것인 3개의 CDR을 포함하는 LCVR 폴리펩티드, 및 ii) 본원 표 2에 열거된 Fab 중에 함께 존재하고, 항체 중, 표 2에 나타낸 것과 동일한 CDR 위치에 존재하는 것인 3개의 CDR을 포함하는 HCVR 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 바람직하게, 상기 항체는 본원 표 3에 열거된 Fab 중에 함께 존재하고, 항체 중, 표 3에 나타낸 것과 동일한 CDR 위치에 존재하는 것인 6개의 CDR을 포함한다.

본 발명은 약 200 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하며, (i) 서열 번호: 101-127로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR 폴리펩티드, 및 (ii) 서열 번호: 128-151로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCVR 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.

본 발명은 또한 약 200 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하며, 2개의 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 각각의 중쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 8에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 각각의 경쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 것인, 항체를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자; 임의로는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터; 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포; 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키고, 임의로는 숙주 세포 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 바람직하게, 제약 조성물은 균질한 또는 실질적으로 균질한 본 발명의 항체 군집 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한, 약 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에서 빈혈을 치료 또는 예방하기 위한, 약 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명은 만성 질환으로 인한 빈혈 및 암으로 인한 빈혈을 비롯한, 빈혈 치료용 약제의 제조를 위한, 약 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 항체의 용도를 포함한다. 본 발명은 추가로 동물, 바람직하게, 포유동물 종, 더욱 바람직하게, 인간 대상체에서 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률 증가용 약제의 제조를 위한, 약 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 그를 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량의, 약 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률을 증가시키는 방법을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 환자에게 유효량의, 본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 빈혈, 예로서, 감염, 염증, 만성 질환, 및/또는 암으로부터 유발된 빈혈을 포함하나, 이에 한정되지 않는 질병으로서, 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률을 증가시키는 것이 도움이 되는 것인 성숙한 헵시딘으로 조장된 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 인간의 성숙한 헵시딘에 대해 선택성을 가지는 면역분석법을 제공한다. 상기 방법은 먼저 인간의 성숙한 헵시딘에 대하여 분석하고자 하는 샘플을 수득하고, 결합하기에 적합하며 항원-항체 복합체를 형성하도록 인간의 성숙한 헵시딘을 존재하게 하는데 적합한 조건하에서 상기 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계; 이어서, 복합체의 존재 여부를 검출하는 단계; 및/또는 면역분석 방법에 의해서 샘플 중에 존재하는 복합체의 양을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명은 추가로 환자로부터 유래된 생물학적 체액 샘플 중 인간의 성숙한 헵시딘의 수준을 측정하고, 샘플 중 인간의 성숙한 헵시딘의 수준을 하나 이상의 대조군 개체로부터 유래된 생물학적 체액 샘플 중 인간의 성숙한 헵시딘의 수준과 또는 기준 표준과 비교하여, 환자에서 인간의 성숙한 헵시딘으로 조장된 병태를 진단하는 방법을 제공한다.

환자에서 성숙한 헵시딘으로 조장된 질병을 모니터링하는 방법 또한 제공한다. 본 방법은 제1 시점에 성숙한 헵시딘으로 조장된 질병을 앓고 있거나, 그에 걸릴 위험이 있는 환자로부터 유래된 생물학적 체액 샘플 중 성숙한 헵시딘의 수준을 측정하고; 하나 이상의 다른 시점에서 환자로부터 유래된 하나 이상의 생물학적 체액 샘플 중 성숙한 헵시딘의 수준을 측정하고; 다른 시점에서 측정된 성숙한 헵시딘의 수준을 비교하여 성숙한 헵시딘으로 조장된 질병을 모니터링하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 항체 및 적합한 용기를 포함하는, 면역분석법 실시용 키트를 제공한다.

도 1은 인간 혈청으로부터 단리된 다중 형태의 인간 헵시딘에 관한 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 도시한 것이다. 신호 1은 무손상 인간 헵시딘-25의 질량 예측치와 일치하는 질량을 갖는다. 신호 2, 3, 및 4는 N-말단이 절단된 형태의 인간의 성숙한 헵시딘 (헵시딘-24, 헵시딘-22, 및 헵시딘-20)과 일치하는 질량을 갖는다. 하기 실시예 5에 기술된 바와 같이, 샘플 매트릭스로서 a-시아노-4-하이드록시신남산 (펩티드 매트릭스)과 함께 양이온을 사용하여 선형 모드 방법으로 MALDI-TOF 질량 분광분석기 상에서 질량 스펙트럼을 작성하였다.
도 2는 샘플 매트릭스로서 3,5-디메틸-4 하이드록시신남산 (시나핀산 매트릭스)을 사용하여, 도 1과 동일한 샘플에 관한 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 도시한다. 신호 1은 무손상 인간 헵시딘-25를 나타낸다. 프로-헵시딘에 대해서는 어떤 신호도 관찰되지 않았다. 하기 실시예 5에 기술된 바와 같이, 양이온을 사용하여 선형 모드 방법으로 질량 분광분석기 상에서 질량 스펙트럼을 작성하였다.
도 3A는 CDR이 산재되어 있는 전체 인간 경쇄 프레임워크 O2의 아미노산 서열을 나타낸다. 4개의 프레임워크 영역을 FRL1, 2, 3, 및 4 (각각 서열 번호: 39, 40, 96, 및 97)로 표지하였다.
도 3B는 CDR이 산재되어 있는 인간 중쇄 프레임워크 VH1-69의 아미노산 서열을 나타낸다. 4개의 프레임워크 영역을 FRH1-4 (각각, 서열 번호: 35-38)로 표지하였다.
도 4A는 CDR이 산재되어 있는 인간 경쇄 프레임워크 O18의 아미노산 서열을 나타낸다. 4개의 프레임워크 영역을 FRL1, 2, 3, 및 4 (각각 서열 번호: 154, 40, 156, 및 97)로 표지하였다.
도 4B는 CDR이 산재되어 있는 인간 중쇄 프레임워크 VH1-18의 아미노산 서열을 나타낸다. 4개의 프레임워크 영역을 FRH1, 2, 3, 및 4 (각각, 서열 번호: 157, 36, 158, 및 38)로 표지하였다.
도 5A는 CDR이 산재되어 있는 인간 경쇄 프레임워크 L12의 아미노산 서열을 나타낸다. 4개의 프레임워크 영역을 FRL1, 2, 3, 및 4 (각각 서열 번호: 159, 40, 160, 및 97)로 표지하였다.
도 5B는 CDR이 산재되어 있는 인간 중쇄 프레임워크 VH1-46의 아미노산 서열을 나타낸다. 4개의 프레임워크 영역을 FRH1, 2, 3, 및 4 (각각, 서열 번호: 157, 36, 161, 및 38)로 표지하였다.

본원에서는 하기 약어가 사용된다: ACN: 아세토니트릴, BSA: 소 혈청 알부민, DTT: 디티오트레이톨, EDTA: 에틸렌디아민 테트라아세트산, ELISA: 효소 결합 면역흡착 분석법, IMAC: 고정화된 금속-친화성 크로마토그래피, IPTG: 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드, Mab: 모노클로날 항체, Mabs: 모노클로날 항체들, MALDI-TOF: 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화-비행 시간, PBS: 인산염 완충처리된 염수, SPR: 표면 플라즈몬 공명, TFA: 트리플루오로아세트산. 본 개시에서 사용된 모든 아미노산 약어는 37 C.F.R. $ 1.822 (B)(2)에 기재된 바와 같이, 미국 특허 상표청(United States Patent and Trademark Office)으로부터 승인받은 것이다.

본원에서 사용되는 경우, "헵시딘"이라는 용어는 포유동물에 존재하는 것으로 알려져 있는 임의 형태의 헵시딘 단백질을 의미하는 것이다. 본원에서 사용되는 경우, "성숙한 헵시딘"이라는 용어는 포유동물에서 발현된, 임의의 성숙한 생체활성 형태의 헵시딘 단백질을 의미하는 것이다. 본원에서 사용되는 경우, "인간 헵시딘"이라는 어구는 인간에 존재하는 임의 형태의 헵시딘 단백질을 의미하는 것이다. 본원에서 사용되는 경우, "인간 헵시딘-25"라는 어구는 서열 번호: 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는, 성숙한 형태의 인간 헵시딘을 의미하는 것이다.

본원에서 사용되는 바, 본 발명의 항-헵시딘 항체 (또는 간단하게 "본 발명의 항체")와 관련하여 "항체"라는 용어는 달리 명시하지 않는 한, 인간의 조작된 모노클로날 항체 또는 전체 인간 모노클로날 항체를 의미한다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 인간의 조작된 항체이다. 본 발명의 항체는 예로서, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술, 예로서, CDR-이식, 또는 상기 기술 또는 당업계에서 쉽게 알 수 있는 기타 다른 기술의 조합을 사용하여 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 예로서, 임의의 진핵성, 원핵성 카피나 클론을 비롯한, 단일의 카피 또는 클론, 또는 파지 클론으로부터 유래된 항체, 및 그를 생산한 방법이 아닌 다른 방법으로부터 유래된 항체를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 항체는 무손상 항체 (완전한 또는 전장의 Fc 영역 포함), 또는 항원 결합부를 포함하는 항체의 일부 또는 단편, 예로서, 인간의 조작된 또는 전체 인간 항체의 Fab 단편, Fab' 단편, 또는 F(ab')₂ 단편일 수 있다. 본 발명의 항체의 바람직한 항원-결합 단편은 생체내 또는 시험관내에서 성숙한 형태의 포유동물 헵시딘의 특징이 되는 하나 이상의 생체활성을 저해하거나 중화시킬 수 있는 능력을 보유한다. 예를 들면, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체의 항원 결합부는 인간 헵시딘-25와 하나 이상의 수용체, 예로서, 인간 페로포틴 (서열 번호: 25)의 상호작용을 저해할 수 있고/거나, 헵시딘으로 유도된 페로포틴의 내재화를 저해할 수 있다.

추가로, 본원에서 사용되는 바, "본 발명의 항체" 또는 간단하게, "항체"는 LCVR 및 HCVR을 코딩하는 DNA를 링커 서열로 연결시킴으로써 제조될 수 있는 단일 쇄 Fv 단편일 수 있다 (문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994] 참조). 항원-결합 단편 또는 항원 결합부가 구체화되었는지와는 상관없이, 본원에서 사용되는 바, 달리 명시하지 않는 한, "항체"라는 용어는 상기 단편이나 영역 뿐만 아니라, 단일 쇄 형태를 포함한다는 것을 이해하여야 한다.

본원에서 사용되는 바, 항-헵시딘-25 항체 또는 그의 결합부와 관련하여 "선택성" 또는 "선택적으로"라는 용어는 각각 25℃에서 SPR에 의해 측정시 항체가 같은 포유동물 종에서 형성되는 것으로 알려져 있는 헵시딘-25의 적어도 하나의 전구체 형태 및/또는 성숙한 헵시딘의 적어도 하나의 N-말단 절단형 종에 결합하는 것보다 약 1000-, 500-, 200-, 100-, 50-, 10-, 또는 약 5배 더 낮은 K_D로 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 항체를 의미하는 것이다. 추가로, 또는 별법으로, 본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체는 본원 실시예 5에 기술된 분석법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업자에 의해 사용되는 면역분석법 및/또는 MALDI-TOF 질량 분광분석 방법에 의해 측정시 헵시딘-25에는 결합하지만, 같은 포유동물 종에서 형성되는 것으로 알려져 있는 헵시딘-25의 적어도 하나의 전구체 형태 및/또는 성숙한 헵시딘의 적어도 하나의 N-말단 절단형 종에는 결합하지 않거나, 최소로 결합한다. 바람직하게, 본 발명의 항-헵시딘-25 선택적 항체는 25℃에서 SPR에 의해 측정시 항체가 인간 프로-헵시딘, 바람직하게, 서열 번호: 34에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 프로-헵시딘, 및/또는 인간의 성숙한 헵시딘의 적어도 하나의 N-말단이 절단된 형태에 결합하는 것보다 약 1000-, 500-, 200-, 100-, 50-, 10-, 또는 약 5배 더 낮은 K_D로 인간 헵시딘-25에 결합한다. 추가로, 또는 별법으로, 본 발명의 항-헵시딘-25 선택적 항체는 본원 실시예 5에 기술된 분석법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업자에 의해 사용되는 면역분석법 및/또는 MALDI-TOF 질량 분광분석 방법에 의해 측정시 인간 헵시딘-25에는 결합하지만, 인간 프로-헵시딘, 바람직하게, 서열 번호: 34에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 프로-헵시딘, 및/또는 같은 포유동물 종에서 형성되는 것으로 알려져 있는 성숙한 헵시딘의 적어도 하나의 N-말단 절단형 종에는 결합하지 않거나, 최소로 결합한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 항-헵시딘-25 선택적 항체는 25℃에서 SPR에 의해 측정시 항체가 서열 번호: 34에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 프로-헵시딘, 및 인간의 성숙한 헵시딘의 적어도 하나의 N-말단이 절단된 형태에 결합하는 것보다 약 1000-, 500-, 200-, 100-, 50-, 10-, 또는 약 5배 더 낮은 K_D로 인간 헵시딘-25에 결합한다. 추가로, 또는 별법으로, 본 발명의 항-헵시딘-25 선택적 항체는 본원 실시예 5에 기술된 분석법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업자에 의해 사용되는 면역분석법 및/또는 MALDI-TOF 질량 분광분석 방법에 의해 측정시 인간 헵시딘-25에는 결합하지만, 인간 프로-헵시딘 (서열 번호: 34), 및 같은 포유동물 종에서 형성되는 것으로 알려져 있는 성숙한 헵시딘의 적어도 하나의 N-말단 절단형 종에는 결합하지 않거나, 최소로 결합한다. 가장 바람직하게, 본 발명의 항-헵시딘-25 선택적 항체는 25℃에서 SPR에 의해 측정시 i) 항체가 인간 프로-헵시딘 (서열 번호: 34)에 결합하는 것보다 약 1000-, 500-, 200-, 100-, 50-, 10-, 또는 약 5배 더 낮은 K_D로 인간 헵시딘-25에 결합하고, ii) 항체가 인간 헵시딘-20 (즉, 서열 번호: 1의 아미노산 6-25) 및/또는 인간 헵시딘-22 (서열 번호: 1의 아미노산 4-25)에 결합하는 것보다 약 1000-, 500-, 200-, 100-, 50-, 10-, 또는 약 5배 더 낮은 K_D로 인간 헵시딘-25에 결합한다. 추가로, 또는 별법으로, 본 발명의 항-헵시딘-25 선택적 항체는 본원 실시예 5에 기술된 분석법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업자에 의해 사용되는 면역분석법 및/또는 MALDI-TOF 질량 분광분석 방법에 의해 측정시 인간 헵시딘-25에는 결합하지만, i) 인간 프로-헵시딘 (서열 번호: 34) 및 ii) 인간 헵시딘-20 및/또는 인간 헵시딘-22에는 결합하지 않거나, 최소로 결합한다.

"검출하다" 또는 "검출하는"이라는 용어는 본원에서 최대로 광범위하게 사용되는데, 이는 표적 분자의 정량적, 반-정량적 또는 정성적 측정을 포함한다. 하나의 측면에서, 본원에 기술된 방법은 단지 생물학적 샘플 중의 특정 헵시딘 폴리펩티드 존재 여부만을 측정할 수 있고, 따라서, 상기 헵시딘 폴리펩티드는 본 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중에서 검출할 수 있거나, 별법으로는 검출할 수 없다.

"에피토프"라는 용어는 하나 이상의, 항체의 항원 결합 영역에서 항체에 의해 인식되고, 항체와 결합을 할 수 있는 분자의 일부분을 의미한다.

본 발명의 항체와 관련하여 "생체활성"이라는 용어는 에피토프 또는 항원 결합 친화성, 항체의 생체내 및/또는 시험관내 안정성, 예로서, 인간 대상체에게 투여되었을 때에 나타내는 항체의 면역원성 특성, 및/또는 생체내 또는 시험관내에서 헵시딘의 생체활성을 중화시키거나 길항시킬 수 있는 능력 (예로서, 본원 실시예 4에 기술된 것과 같은 IL-6 시험 감염 분석법에서와 같이 염증에서 혈청 철분 수치 조절이상을 저해할 수 있는 능력)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 언급한 특성 또는 특징들은, 섬광 근접 측정법, ELISA, ORIGEN 면역분석법 (IGEN), 형광 소광법, 형광 ELISA, 경쟁적 ELISA, SPR 분석법 (비아코어(BIAcore) 바이오센서를 사용하는 SPR 분석법을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 제한없이 시험관내 및 생체내 중화 분석법 (예를 들면, 국제 공보 번호 WO 2006/062685 참조), 수용체 결합, 및 인간, 영장류, 또는 필요에 따라 임의의 기타 다른 공급원을 비롯한 상이한 공급원으로부터 유래된 조직 절편을 사용하는 면역조직화학법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에서 공인받은 기법을 사용하여 관찰할 수 있거나 측정할 수 있다.

헵시딘-25를 비롯한 성숙한 헵시딘과 관련하여 "생체활성"이라는 용어는 성숙한 헵시딘과 (그의 수용체인 페로포틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는) 또다른 단백질의 특이적인 결합, 하나 이상의 페로포틴에 의해 매개되는 성숙한 헵시딘의 기능, 예로서, 성숙한 헵시딘에 의해 유도된 페로포틴의 내재화 및/또는 분해 (예로서, 예로서, 문헌 [Nemeth, E., et al., Hepcidin Regulates Iron Efflux by Binding to Ferroportin and Inducing Its Internalization, Science 306, 2090-2093, (2004)] 참조), 성숙한 헵시딘의, 페로포틴에 의해 매개되는 인간에서의 철분 유출, 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률 조절, 단백질 안정성, 즉, 생체내 또는 시험관내에서 또다른 단백질의 수준 또는 활성에 영향을 미치는 성숙한 헵시딘, 및 헵시딘 발현 수준 및/또는 조직 분포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, 본 발명의 항체의 생체활성과 관련하여 "저해하다" 또는 "중화시키다"라는 용어는 본원 실시예 3 또는 4에서 측정되는 것과 같은 인간의 성숙한 헵시딘 생체활성을 포함하나, 이에 한정되지 않는 인간의 성숙한 헵시딘의 생체활성을 실질적으로 길항시키거나, 금지시키거나, 막거나, 저지하거나, 저속화시키거나, 파괴시키거나, 제거하거나, 중단시키거나, 감소시키거나, 또는 역전시킬 수 있는 능력을 의미한다.

본 발명의 항체는 25℃에서 SPR에 의해 측정시 인간 헵시딘-25에 대한 K_D가 약 1000 pM 미만, 바람직하게, 약 800 pM 미만, 더욱 바람직하게, 약 400 pM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 200 pM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 100 pM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 75 pM 미만, 또는 가장 바람직하게, 약 50 pM 미만인 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 항체는 25℃에서 SPR에 의해 측정시 약 800 pM 미만, 바람직하게, 약 400 pM 미만, 더욱 바람직하게, 약 200 pM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 100 pM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 75 pM 미만, 또는 가장 바람직하게, 약 50 pM 미만의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합한다. 항체는 또한 또다른 종의 적어도 하나의 헵시딘-25, 예로서, 사이노몰거스 원숭이 헵시딘-25에 선택적으로 결합한다. 더욱 바람직하게, 상기 항체는 25℃에서 SPR에 의해 측정시 약 800 pM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 400 pM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 200 pM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 100 pM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 75 pM 미만, 또는 가장 바람직하게, 약 50 pM 미만의 K_D로 사이노몰거스 원숭이 헵시딘-25에 선택적으로 결합한다.

본 발명의 항체는 25℃에서 SPR에 의해 측정시 인간 헵시딘-25에 대한 K_D가 약 800 pM 내지 약 30 pM, 바람직하게, 약 400 pM 내지 약 30 pM, 더욱 바람직하게, 약 200 pM 내지 약 30 pM, 더욱더 바람직하게, 약 100 pM 내지 약 30 pM, 더욱더 바람직하게, 약 75 pM 내지 약 30 pM, 또는 가장 바람직하게, 약 50 pM 내지 약 30 pM인 항-헵시딘-25 선택적 항체를 포함한다. 바람직하게, 상기 항체는 또한 25℃에서 SPR에 의해 측정시 사이노몰거스 원숭이 헵시딘-25에 대한 K_D가 약 800 pM 내지 10 pM, 더욱 바람직하게, 약 400 pM 내지 약 10 pM, 더욱더 바람직하게, 약 200 pM 내지 약 10 pM, 더욱더 바람직하게, 약 100 pM 내지 약 10 pM, 더욱더 바람직하게, 약 75 pM 내지 10 pM, 또는 가장 바람직하게, 약 50 pM 내지 10 pM이다.

본 발명의 항체는 또한 25℃에서 SPR에 의해 측정시 인간 헵시딘-25 및/또는 사이노몰거스 원숭이 헵시딘-25에 대한 K_D가 마우스 헵시딘-25 및/또는 래트 헵시딘-25에 대한 항체의 K_D보다 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 또는 적어도 200배 더 낮은 항체를 포함한다.

본 발명의 항체는 또한 25℃에서 SPR에 의해 측정시 인간 헵시딘-25로부터의 k_오프 속도가 약 1 x 10^-2s^-1 내지 약 1.8 x 10^-4s^-1, 바람직하게, 약 8.5 x 10^-3s^-1 내지 약 1.8 x 10^-4s^-1, 더욱 바람직하게, 약 7.7 x 10^-4s^-1 내지 약 1.8 x 10^-4s^-1, 더욱더 바람직하게, 약 6.5 x 10^-4s^-1 내지 약 1.8 x 10^-4s^-1, 또는 가장 바람직하게, 약 5.5 x 10^-4s^-1 내지 약 2.0 x 10^-4s^-1인 항체를 포함한다. 바람직하게, 상기 항체는 또한 25℃에서 SPR에 의해 측정시 약 800 pM 내지 30 pM, 더욱더 바람직하게, 약 400 pM 내지 약 30 pM, 더욱더 바람직하게, 약 200 pM 내지 약 30 pM, 더욱더 바람직하게, 약 100 pM 내지 약 30 pM, 더욱더 바람직하게, 약 75 pM 내지 50 pM, 또는 가장 바람직하게, 약 50 pM 내지 30 pM의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합한다.

본 발명은 또한 바람직하게는 약 200 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하고, 시험관내 또는 생체내에서 적어도 하나의 인간의 성숙한 헵시딘 생체활성을 중화시키거나 길항시키는 항체를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 예를 들면, 본원 실시예 3 또는 4에 기술된 바와 같이, 성숙한 헵시딘 생체활성에 관한 시험관내 또는 생체내 분석법에서 약 200 nM 미만, 더욱 바람직하게, 약 100 nM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 75 nM 미만, 또는 가장 바람직하게, 약 50 nM 미만의 IC₅₀을 갖는다.

본 발명의 항체는 또한 예를 들면, 본원 실시예 4에 기술된 바와 같이, 사이노몰거스 원숭이 분석법에서 IL-6에 의해 유도된 혈청 철분 감소를 유의적으로 저해시키는, 항-인간 헵시딘-25 결합성의, 바람직하게는, 선택적 결합성의 항체를 포함한다. 바람직하게, 상기 항체는 약 10 mg/kg의 항체를 정맥내로 투여한 후 6시간이 경과하기 이전에, 5 ㎍/kg 용량의 인간 IL-6에 의해 유도된 사이노몰거스 원숭이에서의 혈청 철분 감소를 적어도 약 30％, 적어도 약 40％, 적어도 약 50％, 적어도 약 60％, 적어도 약 70％, 적어도 약 80％, 적어도 약 90％, 또는 적어도 약 100％ 만큼 저해시킨다.

본 발명의 항체는 본원 실시예 3에 기술된, 성숙한 헵시딘에 의해 유도된 페로포틴 내재화 분석법에서 약 200 nM 미만, 바람직하게, 약 100 nM 미만, 더욱 바람직하게, 약 75 nM 미만, 더욱더 바람직하게, 약 50 nM 미만, 또는 가장 바람직하게, 약 25 nM 미만의 IC₅₀을 갖는다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 본원 실시예 3에 기술된, 성숙한 헵시딘에 의해 유도된 페로포틴 내재화 분석법에서 약 200 nM 내지 약 25 nM, 더욱 바람직하게, 약 100 nM 내지 약 50 nM, 더욱 바람직하게, 약 100 nM 내지 약 25 nM, 더욱더 바람직하게, 약 75 nM 내지 약 25 nM, 또는 가장 바람직하게, 약 75 nM 내지 약 50 nM의 IC₅₀을 갖는다.

또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 실시예 3에 기술된, 헵시딘에 의해 유도된 페로포틴 내재화 분석법에서 약 200 nM 내지 약 25 nM, 바람직하게, 약 100 nM 내지 약 50 nM, 더욱 바람직하게, 약 100 nM 내지 약 25 nM, 더욱더 바람직하게, 약 75 nM 내지 약 25 nM, 또는 가장 바람직하게, 약 75 nM 내지 약 50 nM의 IC₅₀을 갖고, 25℃에서 SPR에 의해 측정시 약 1 x 10^-2s^-1 내지 약 1.8 x 10^-4s^-1, 바람직하게, 약 8.5 x 10^-3s^-1 내지 약 1.8 x 10^-4s^-1, 더욱 바람직하게, 약 7.7 x 10^-4s^-1 내지 약 1.8 x 10^-4s^-1, 더욱더 바람직하게, 약 6.5 x 10^-4s^-1 내지 약 1.8 x 10^-4s^-1, 또는 가장 바람직하게, 약 5.5 x 10^-4s^-1 내지 약 2.0 x 10^-4s^-1의, 인간 헵시딘-25로부터의 k_오프 속도를 갖고, 25℃에서 SPR에 의해 측정시 약 800 pM 내지 30 pM, 바람직하게, 약 400 pM 내지 약 30 pM, 더욱 바람직하게, 약 200 pM 내지 약 30 pM, 더욱더 바람직하게, 약 100 pM 내지 약 30 pM, 더욱더 바람직하게, 약 75 pM 내지 50 pM, 또는 가장 바람직하게, 약 50 pM 내지 30 pM의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합한다.

본원에서 사용되는 바, "카바트 번호 매김(Kabat numbering)"은 당업계에서 공인된 것이며, 이는 항체의 중쇄 및 경쇄 영역에 있는 기타 다른 아미노산 잔기보다 더욱더 가변성이 큰 (즉, 초가변성인) 아미노산 잔기를 번호 매김하는 체계를 의미한다 (문헌 ([Kabat, et al., Ann . NY Acad . Sci. 190:382-93 (1971)]; [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)])).

폴리뉴클레오티드는 또다른 폴리뉴클레오티드와 기능상 관계를 갖게 될 때 "작동가능하게 연결"된 것이다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 "대상체" 및 "환자"라는 용어는 포유동물, 바람직하게, 인간을 의미한다. 특정 실시태양에서, 환자는 헵시딘-25 수준의 감소, 헵시딘-25 생체활성의 감소, 및/또는 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률을 증가시키는 것이 도움이 되는 질병을 앓고 있다.

"벡터"라는 용어는 작동가능하게 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것으로서, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 벡터는 자신이 도입된 숙주 세포 내에서 자기 복제할 수 있고, 또다른 벡터들은 숙주 세포 내로의 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 자신이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게 "발현 벡터")로 지칭된다. 예시적인 벡터는 당업계에 주지되어 있다.

본원에서 사용되는 바, "세포" 및 "숙주 세포"라는 표현은 상호교환적으로 사용되며, 이는 시험관내 또는 생체내 위치하건 간에, 임의의 원핵 세포 (예로서, 세균 세포, 예로서, E. 콜라이(E. coli)) 또는, 바람직하게, 진핵 세포 (예로서, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포, 예로서, CHO 세포)를 의미한다. 숙주 세포는 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질전환되거나, 형질도입되거나, 형질감염되거나, 감염된 세포를 포함한다. 숙주 세포는 시험관내 또는 생체내 존재할 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포는 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물에 위치할 수 있다.

전장 항체의 각 중쇄는 N-말단 중쇄 가변 영역 (본원에서 "HCVR") 및 C-말단 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 전장 항체의 각 경쇄는 N-말단 경쇄 가변 영역 (본원에서 "LCVR") 및 C-말단 경쇄 불변 영역으로 구성된다. HCVR 및 LCVR은 추가로 보다 보존적인 영역 (프레임워크 영역 ("FR")로 명명) 사이에 배치되어 있는 초가변성 영역 (상보성 결정 영역 ("CDR")로 명명)으로 세분화될 수 있다. 특정 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 기능적인 능력은 대개 항체 가변 영역 중에 존재하는 6개의 CDR에 의해 영향을 받는다. 각 HCVR 및 LCVR은 3개의 CDR (HCVR 중 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 LCVR 중 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)과, 아미노-말단에서부터 카르복시-말단으로 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 정렬되어 있는 4개의 프레임워크 영역으로 구성되어 있다.

따라서, 본원에서 사용되는 바, "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"이라는 용어는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드, 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 비인접 항원 결합 영역을 의미하는 것으로 한다. 이러한 특정 영역은 문헌 ([Kabat, et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)], [Kabat, et al., Sequences of protein of Immunological interest, (1991)], 및 [Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)] 및 [MacCallum, et al., J. Mol. Biol, 262:732-745 (1996)])에 기재되어 있는데, 여기서, 정의는 아미노산 잔기가 서로에 대하여 비교될 경우, 아미노산 잔기의 중복부 또는 하위세트를 포함한다. 본 개시에서, 아미노산을 각 도메인으로 지정하는 것은 주지된 방식에 따른다 (예로서, 문헌 [Kabat, (1991) 및/또는 Chothia (1987)]). CDR은 항체와 특이적인 상호작용을 형성하는 잔기 대부분을 포함한다.

하기 표 1 및 2에는 본 발명의 항체에 대한 바람직한 CDR을 코딩하는 아미노산 서열 및 공통 아미노산 서열을 나타낸다.

<표 1>

<표 2>

본 발명의 항체에 대해 더욱 바람직한 CDR을 코딩하는 아미노산 서열 및 공통 아미노산 서열에 대한 서열 번호는 하기 표 3에서 제공한다.

<표 3>

인간 경쇄 불변 영역은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 카파 또는 람다로 분류되며, 이는 특정 불변 영역을 특징으로 한다. 인간 중쇄 불변 영역은 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE로 정의하며, 이중 몇몇은 추가로 하위부류, 예로서, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄로 분류될 수 있다. 각각의 중쇄 유형은 당업계에서 쉽게 알 수 있는 서열을 포함하는 특정 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역 카파 및 중쇄 불변 영역 IgG₁, IgG₂, 및 IgG₄가 본 발명의 항체에서 바람직한 불변 영역이다. 본 발명의 항체에 대하여 바람직한 인간 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 90-94에 나타낸 중쇄 불변 영역 아미노산 서열 및 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 약 15개의 아미노산 변화 (치환, 삽입, 또는 결실 포함)를 갖는 상기 중쇄 불변 영역 아미노산 서열의 임의의 변이체이다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 항체의 인간 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 93 및 94에 나타낸 중쇄 불변 영역 아미노산 서열이다. 가장 바람직하게, 본 발명의 항체의 인간 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 93에 나타낸 중쇄 불변 영역 아미노산 서열이다. 본 발명의 항체의 바람직한 인간 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 89에 나타낸 경쇄 불변 영역 카파 아미노산 서열 및 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 약 10개의 아미노산 변화 (치환, 삽입, 또는 결실 포함)를 갖는 상기 경쇄 불변 영역 카파 아미노산 서열의 임의의 변이체이다. 가장 바람직하게, 본 발명의 항체의 인간 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 89에 나타낸 경쇄 불변 영역 카파 아미노산 서열이다.

본원에서 사용되는 바, "항원-결합 영역" 또는 "항원-결합부"는 항원과 상호작용하고 항원에 대한 특이성 및 친화성을 항체에 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는, 가변 영역 내에 있는 항체 분자의 부분을 의미한다. 이러한 항체 부분은 항원-결합 잔기의 적절한 구조를 유지하기 위해 필요한 프레임워크 아미노산를 포함한다.

본 발명은 25℃에서 SPR에 의해 측정시 약 800 pM 이하의 K_D로 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 여기서, 항체는 i) 서열 번호: 75에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 HCDR3, 및 ii) 서열 번호: 62에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 바람직하게, 상기 항체는 (i) 각각 서열 번호: 52, 60, 62, 65, 71 및 75에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 (ii) 각각 서열 번호: 42, 76, 62, 79, 87 및 46에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 및/또는 공통 아미노산 서열을 포함하는 6개의 CDR을 포함한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 항체는 (i) 각각 서열 번호: 41, 53, 31, 63, 84 및 46에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; (ii) 각각 서열 번호: 43, 30, 31, 32, 44 및 46에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; (iii) 각각 서열 번호: 43, 53, 61, 63, 85 및 46에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 (iv) 각각 서열 번호: 43, 57, 61, 63, 84 및 46에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 6개의 CDR을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 항체는 2개의 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는데, 여기서, 각각의 중쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 9에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 각각의 경쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 17에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 더욱더 바람직하게, 항체는 실시예 3에 기술된, 헵시딘에 의해 유도된 페로포틴 내재화 분석법에서 약 100 nM 내지 약 50 nM의 IC₅₀을 갖고, 25℃에서 SPR에 의해 측정시 약 5.5 x 10^-4s^-1 내지 약 2.0 x 10^-4s^-1의, 인간 헵시딘-25로부터의 k_오프 속도를 갖고, 약 100 pM 내지 약 50 pM의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합한다. 가장 바람직하게, 본 발명의 항체는 2개의 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는데, 여기서, 각각의 중쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 8에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 각각의 경쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 16에 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 여기서, 항체는 실시예 3에 기술된, 헵시딘에 의해 유도된 페로포틴 내재화 분석법에서 약 100 nM 내지 약 50 nM의 IC₅₀을 갖고, 25℃에서 SPR에 의해 측정시 약 5.5 x 10^-4s^-1 내지 약 2.0 x 10^-4s^-1의, 인간 헵시딘-25로부터의 k_오프 속도를 갖고, 약 100 pM 내지 약 50 pM의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합한다.

본 발명의 기타 다른 바람직한 항체는 서열 번호: 124, 125, 126, 및 127로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCVR을 포함한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 항체는 서열 번호: 148, 128, 150, 및 151로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 항체는 서열 번호: 126의 LCVR 및 서열 번호: 148의 HCVR을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 항체는 서열 번호: 127의 LCVR 및 서열 번호: 128의 HCVR을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 본 발명의 항체는 서열 번호: 125의 LCVR 및 서열 번호: 151의 HCVR을 포함한다. 본 발명의 가장 바람직한 항체는 서열 번호: 124의 LCVR 및 서열 번호: 150의 HCVR을 포함한다. 상기 LCVR은 바람직하게는 인간 기원의 경쇄 불변 영역, 또는 인간 기원의 경쇄 불변 영역, 바람직하게, 인간 카파 쇄, 및 가장 바람직하게는 서열 번호: 89의 카파 쇄로부터 유래된 경쇄 불변 영역에 연결되어 있다. 상기 HCVR은 바람직하게는 인간 기원의 중쇄 불변 영역, 또는 인간 기원의 중쇄 불변 영역, 바람직하게 IgG₁, IgG₂, 또는 IgG₄, 더욱 바람직하게, 서열 번호: 90, 91, 92, 93, 및 94로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역, 및 가장 바람직하게, 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역으로부터 유래된 중쇄 불변 영역에 연결되어 있다. 바람직하게, 항체는 실시예 3에 기술된, 헵시딘에 의해 유도된 페로포틴 내재화 분석법에서 약 100 nM 내지 약 50 nM의 IC₅₀을 갖고, 25℃에서 SPR에 의해 측정시 약 5.5 x 10^-4s^-1 내지 약 2.0 x 10^-4s^-1의, 인간 헵시딘-25로부터의 k_오프 속도를 갖고, 약 100 pM 내지 약 50 pM의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합한다.

본 발명의 항체는 서열 번호: 6에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 번호: 14에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 서열 번호: 6에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 서열 번호: 14에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 10에 나타낸 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

본 발명의 항체는 서열 번호: 7에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 번호: 15에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 서열 번호: 7에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 서열 번호: 15에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 11에 나타낸 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

본 발명의 항체는 서열 번호: 8에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 번호: 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 서열 번호: 8에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 4의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 서열 번호: 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 12에 나타낸 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 서열 번호: 9에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 번호: 17에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 서열 번호: 9에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 5의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 서열 번호: 17에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드는 서열 번호: 13에 나타낸 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.

본 발명의 바람직한 인간의 조작된 항체는 본원에서 Mab L1.5, Hu22, 3.12, 및 3.23으로 지칭된다. Mab L1.5, Hu22, 3.12, 및 3.23에 대한 중쇄, 경쇄, 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및 CDR을 코딩하는 아미노산 서열의 서열 번호는 하기 표 4에서 제공한다.

<표 4>

표준 분자 생물학 기법을 사용하여 재조합 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선별하고, 본 발명의 항체를 생산하는 숙주 세포주를 단리시키고, 이들 숙주 세포를 배양하고, 항체를 배양 배지로부터 회수한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항-헵시딘 항체를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 원핵성 (세균) 및 진핵성 발현 시스템 (예로서, 효모, 바큘로바이러스, 식물, 포유동물 및 기타 다른 동물 세포, 트랜스제닉 동물, 및 하이브리도마 세포) 뿐만 아니라, 파지 디스플레이 발현 시스템을 비롯한, 당업계에 공지된 매우 광범위한 숙주 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 항체를 발현시킬 수 있다.

본 발명의 항체는 숙주 세포에서의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 재조합에 의해 항체를 발현시키기 위해, 경쇄 및/또는 중쇄가 숙주 세포 내에서 발현되도록 항체의 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 DNA 단편을 수반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환, 형질도입, 감염 등을 시킨다. 중쇄 및 경쇄는 하나의 벡터 내의 이들이 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있거나, 별법으로, 중쇄 및 경쇄는 하나는 중쇄를 발현하고 또다른 하나는 경쇄를 발현하는 2개의 벡터 내의 이들이 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 임의로, 중쇄 및 경쇄가 상이한 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다.

추가로, 재조합 발현 벡터는 항체 경쇄 및/또는 중쇄가 숙주 세포로부터 분비되는 것을 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 경쇄 및/또는 중쇄 유전자는 신호 펩티드가 프레임내에서 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 작동가능하게 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드일 수 있다. 바람직하게, 재조합 항체는 숙주 세포가 배양된 배지로 분비되고, 그러한 배지로부터 항체는 회수되거나 정제될 수 있다.

HCVR-코딩 DNA를, 중쇄 불변 영역을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 HCVR을 코딩하는 단리된 DNA를 전장의 중쇄로 전환시킬 수 있다. 인간 뿐만 아니라, 기타 다른 포유동물의 서열인 중쇄 불변 영역 유전자는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 예로서, 표준 PCR 증폭에 의해서 수득할 수 있다. 문헌 [Kabat, 상기 문헌 동일]에 기재되어 있는 바와 같이, 중쇄 불변 영역은 임의의 유형 (예로서, IgG, IgA, IgE, IgM 또는 IgD), 부류 (예로서, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 및 IgG₄) 또는 하위부류 불변 영역 및 그의 임의의 동종이형 변이체일 수 있다.

LCVR-코딩 DNA를, 경쇄 불변 영역을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 LCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA를 전장의 경쇄 유전자 (뿐만 아니라, Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 뿐만 아니라, 기타 다른 포유동물의 서열인 경쇄 불변 영역 유전자는 당업계에 공지되어 있다. 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해서 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.

항체 중쇄 및/또는 경쇄 유전자(들) 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자(들)의 발현을 제어하는 조절 서열을 수반한다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자(들)의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 필요한 경우, 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 한다. 조절 서열을 선택하는 것을 비롯한, 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 포유동물 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열로는 포유동물 세포에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예로서, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 시미안(Simian) 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예로서, 아데노바이러스 주요 후발 프로모터 (AdMLP)) 및/또는 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다.

추가로, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예로서, 숙주 세포에서의 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기원) 및 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자를 수반할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다. 예를 들면, 전형적으로 선별가능한 마커 유전자는 약물, 예로서, G418, 하이그로마이신, 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을, 벡터가 도입된 숙주 세포에 부여한다. 바람직한 선별가능한 마커 유전자에는 디하이드로폴레이트 리덕타제 (dhfr) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭과 함께 dhfr-마이너스 숙주 세포에서 사용하기 위한 것), neo 유전자 (G418 선별을 위한 것), 및 선별/증폭을 위한 GS-음성 세포주 (예로서, NSO)에서의 글루타민 신테타제 (GS)를 포함한다.

경쇄 및/또는 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기법, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염, 형질도입, 감염 등에 의해 숙주 세포 내로 도입한다. 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론적으로는 가능하지만, 진핵 세포가 바람직하고, 가장 바람직한 것은 포유동물 숙주 세포인데, 이는 상기 세포가 조립 가능성이 더 크고, 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 분비할 수 있는 가능성이 더 크기 때문이다. 본 발명의 재조합 항체를 발현시키는데 바람직한 포유동물 숙주 세포로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, 문헌 [Kaufman and Sharp, J. Mol . Biol . 159:601-21, 1982]에 기재된 바와 같이 DHFR 선별가능한 마커와 함께 사용되는 문헌 [Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 77:4216-20, 1980]에 기재된 dhfr 마이너스 CHO 세포 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포, 및 SP2/0 세포를 포함한다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되면, 항체가 숙주 세포 내에서 발현되도록, 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장된 배양 배지 내로 항체가 분비되도록 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 당업계에 공지된 적절한 조건하에서 배양함으로써 항체를 생산한다. 항체는 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 표준 정제 방법을 사용하여 회수할 수 있다.

또한, 종래 기법에 의해, 무손상 항체의 일부 또는 단편, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하는데에도 숙주 세포를 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 DNA로 숙주 세포를 형질전환시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한 재조합 DNA 기술을 사용하여 인간 헵시딘-25에 대한 결합에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 하나 또는 그 둘 모두를 코딩하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 그러한 절단형 DNA 분자로부터 발현된 분자 또한 본 발명의 항체에 포함된다.

본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터 또는 작제물을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 숙주 세포는, 본 발명의 항체의 LCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 HCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 벡터가 도입된 세포이다. 본 발명은 또한 하나의 벡터는 본 발명의 항체의 LCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 하나의 벡터는 본 발명의 항체 내에 존재하는 HCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 각각은 인핸서/프로모터 조절 요소 (예로서, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유래된 것, 예로서, CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소)에 작동가능하게 연결되어 고수준의 유전자의 전사를 일으키는 것인, 본 발명의 벡터 2개가 도입된 숙주 세포를 제공한다.

일단 발현되면, 무손상 항체, 개별적인 경쇄 및 중쇄, 또는 본 발명의 기타 다른 면역글로불린 형태는 황산암모늄 침전, 이온 교환, 친화성 (예로서, 단백질 A), 역상, 소수성 상호작용 칼럼 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 비롯한 당업계의 표준 방법에 따라 정제될 수 있다. 치료학적 항체를 정제하는 표준 방법은 예를 들면, 문헌 ([Feng Li, Joe X. Zhou, Xiaoming Yang, Tim Tressel], 및 [Brian Lee in an article entitled "Current Therapeutic Antibody Production and Process Optimization" (BioProcessing Journal, Sept./Oct. 2005)])에 기재되어 있다. 추가로, 재조합에 의해 발현된 항체 시료로부터 바이러스를 제거하는 표준 기법 또한 당업계에 알려져 있다 (예를 들면, 문헌 [Gerd Kern and Mani Krishnan, "Viral Removal by Filtration: Points to Consider" (Biopharm International, Oct. 2006)] 참조). 치료학적 항체 시료로부터 바이러스를 제거하기 위해 실시되는 여과의 효과는 적어도 부분적으로는 용액 중 여과하고자 하는 단백질 및/또는 항체의 농도에 따라 달라질 수 있다는 것이 알려져 있다. 본 발명의 항체를 정제하는 방법은 하나 이상의 크로마토그래피 작동의 주류로부터 바이러스를 제거하기 위한 여과 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게, 제약 등급의 나노필터를 통해 여과시켜 바이러스를 제거하기 이전에, 본 발명의 항체를 함유하는 크로마토그래피 주류를 희석시키거나 농축시켜 총 단백질 및/또는 총 항체 농도가 약 1 g/L 내지 약 3 g/L가 되게 한다. 더욱더 바람직하게, 나노필터는 DV20 나노필터 (예로서, 뉴욕주 이스트 힐즈 소재의 팔 코포레이션(Pall Corporation))이다. 제약 용도를 위해서는 균질성이 적어도 약 90％, 약 92％, 약 94％ 또는 약 96％인 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 약 98 내지 약 99％ 이상의 균질성을 갖는 것이 가장 바람직하다. 일단 부분적으로나, 또는 원하는 균질성을 갖도록 정제되고 나면, 이어서 본원에서 지시하는 바에 따라 멸균 항체를 치료학적으로 사용할 수 있다.

상기 언급한 논의에 비추어, 본 발명은 추가로 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포 (포유동물, 식물, 세균, 트랜스제닉 동물, 또는 트랜스제닉 식물 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않음)를 배양하여 핵산이 발현될 수 있도록 하는 단계, 및 임의로 항체를 숙주 세포 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득할 수 있는 항체에 관한 것이다. 바람직하게, 숙주 세포는 서열 번호: 14, 15, 16, 또는 17에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 더욱 바람직하게, 숙주 세포는 서열 번호: 12 또는 13에 나타낸 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 더욱더 바람직하게, 형질전환된 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소, NSO 골수종, COS, 또는 SP2/0 세포이다.

본 발명은 추가로 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 숙주 세포 (포유동물, 식물, 세균, 트랜스제닉 동물, 또는 트랜스제닉 식물 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않음)를 형질전환시켜 핵산이 발현될 수 있도록 하는 단계, 및 항체를 숙주 세포 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 숙주 세포는 서열 번호: 14, 15, 16, 또는 17에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된다. 더욱 바람직하게, 숙주 세포는 서열 번호: 12 또는 13에 나타낸 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환되었다. 더욱더 바람직하게, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소, NSO 골수종, COS, 또는 SP2/0 세포이다.

본원에서 사용되는 바, "단리된 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 일부 조합으로서, 그의 기원에 의해 단리된 폴리뉴클레오티드는 (1) 자연 상태에서 단리된 폴리뉴클레오티드가 발견되는 폴리뉴클레오티드 모두 또는 그 일부와 회합된 상태로 존재하지 않거나, (2) 자연 상태에서는 연결되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드와 연결되어 있거나, (3) 자연 상태에서는 그보다 큰 서열의 일부로서는 존재하지 않는 것인 폴리뉴클레오티드를 의미하여야 한다.

본원과 관련하여 "단리된 단백질"이라는 용어는, 대상체 단백질이 (1) 보통은 그와 함께 발견되는 적어도 몇몇의 기타 다른 단백질을 포함하지 않거나, (2) 본질적으로는 동일한 공급원, 예로서, 동일한 종으로부터 유래된 기타 다른 단백질을 포함하지 않거나, (3) 다른 종으로부터 유래된 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연 상태에서는 그와 회합하고 있는 폴리뉴클레오티드, 지질, 당질, 또는 기타 다른 물질 중 적어도 50％로부터 단리되었거나, (5) 자연 상태에서는 "단리된 단백질"과 회합하고 있는 단백질 중 일부와도 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해 이루어지는) 회합도 하지 않은 상태로 존재하거나, (6) 자연 상태에서는 그와 회합하지 않은 폴리펩티드와 작동가능하게 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 회합하고 있거나, (7) 자연 상태에서는 존재하지 않는 것을 의미하는 것이다. 그러한 단리된 단백질은 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 기타 다른 RNA, 또는 그의 임의 조합에 의해 코딩될 수 있다. 바람직하게, 단리된 단백질은 그의 용도 (치료용, 진단용, 예방용, 연구용 등)를 방해할 수 있는 것으로서 상기 단백질이 존재하는 천연 환경하에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 기타 다른 오염물질로부터 실질적으로 정제된 것이다.

"단리된" 항체는 상기 항체가 존재하는 천연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수될 수 있는 항체이다. 상기 항체가 존재하는 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단학적 또는 치료학적 용도를 방해하는 물질이며, 그러한 오염 성분으로는 효소, 호르몬, 및 기타 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체를 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 항체 95중량％ 초과, 및 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과로 정제하거나, (2) 회전형 컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제시키거나, (3) 쿠마시에 블루(Coomassie blue), 또는 바람직하게는, 은 염색법을 사용하여 환원성 또는 비환원성 조건하에 SDS-PAGE함으로써 균질하도록 정제할 것이다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 상기 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다.

본원에서 사용되는 바, "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 정제된"이란, 종이 우세하게 존재하고 있는 것인 종 (즉, 몰 기준으로 조성물 중에 존재하는 임의의 기타 다른 개개의 종보다 더욱 풍부하게 존재하는 것인 종)인 화합물 또는 종을 의미하는 것이다. 특정 실시태양에서, 실질적으로 정제된 조성물이란 상기 종은 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50％ (몰 기준)를 포함하는 조성물이다. 특정 실시태양에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 중에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80％, 85％, 90％, 95％, 또는 99％ 초과를 포함할 것이다. 특정 실시태양에서, 종은 본질적인 동질성이 되도록 정제되어 본질적으로 조성물이 단일 거대분자 종으로 구성된다 (즉, 오염물 종은 종래 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없다).

본 발명은 추가로 서열 번호: 124, 125, 126, 127, 128, 148, 150, 및 151로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 번호: 124, 125, 126, 127, 128, 148, 150, 및 151로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본원에서 사용되는 바, "인간의 조작된 항체"라는 어구는 적어도 하나의 영역이 인간 기원인 항체를 의미한다. 추가로, 본원에서 사용되는 바, "인간의 조작된 항체"라는 어구는 본원에 개시된 특이 항체 뿐만 아니라, 본원에 개시된 항체와 유사한, 본 발명에 따른 기능적 특성을 갖고, 실질적으로 인간의 것인 프레임워크 영역 또는 비인간 항체로부터 유래된 전장의 인간 주위 CDR을 갖는 추가의 항체를 의미한다. 실질적으로 인간 프레임워크는 공지된 인간 생식계열 프레임워크 서열과 적어도 80％의 서열 동일성을 갖는 것이다. 바람직하게, 실질적으로 인간 프레임워크는 공지된 인간 생식계열 프레임워크 서열과 적어도 약 85％, 약 90％, 약 95％, 또는 약 99％의 서열 동일성을 갖는다. 가장 바람직하게, 본 발명의 인간의 조작된 항체는 비인간 항체로부터 유래된 최소의 서열을 포함한다.

예를 들면, 인간의 조작된 항체는 예로서, 종래 기법 (예로서, 합성 기법)에 의해 화학적으로 함께 결합되어 있거나, 유전 공학 기법의 사용으로 인접한 폴리펩티드로서 제조된, 비인간 기원, 예로서, 마우스의 항체로부터 유래된 부분, 및 인간 기원의 항체로부터 유래된 부분을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 항체 가변 영역과 관련하여 사용될 때 "프레임워크"라는 용어는 항체 가변 영역내 존재하는 CDR 바깥쪽의 모든 아미노산 잔기를 의미하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 바, "프레임워크 영역"이라는 용어는 CDR에 의해 분리되는 프레임워크의 각 도메인을 의미하는 것으로 한다. 경쇄의 프레임워크 영역은 각 경쇄 가변 영역 CDR에 의해 유사하게 분리되어 진다. 바람직하게, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역은 프레임워크 또는 프레임워크 영역의 적어도 일부 (예로서, 2 또는 3개의 하위영역, 예로서, FR2 및 FR3 포함)를 포함한다. 더욱 바람직하게, 적어도 FRL1, FRL2, FRL3, 또는 FRL4는 전체적으로 인간의 것이거나, 적어도 FRH1, FRH2, FRH3, 또는 FRH4는 전체적으로 인간의 것이다. 더욱더 바람직하게, 적어도 FRL1, FRL2, FRL3, 또는 FRL4는 생식계열 서열 (예로서, 인간 생식계열)이거나, 당업계에 공지된 특정 프레임워크에 대한 인간 공통 서열을 포함하고/거나, 적어도 FRH1, FRH2, FRH3, 또는 FRH4는 생식계열 서열 (예로서, 인간 생식계열)이거나, 특정 프레임워크에 대한 인간 공통 서열을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 인간 생식계열 경쇄 프레임워크 서열 및 인간 생식계열 중쇄 프레임워크 서열을 포함한다 (예로서, PCT WO 2005/005604 참조). 더욱 바람직하게, 인간 생식계열 경쇄 프레임워크는 A11, A17, A18, A19, A20, A27, A30, L1, L11, L12, L2, L5, L6, L8, O12, O18, O2, 및 08로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱더 바람직하게, 인간 생식계열 경쇄 프레임워크는 O2 또는 O18이다. 가장 바람직하게, 인간 생식계열 경쇄 프레임워크는 O2이다. 추가로, 바람직한 인간 생식계열 중쇄 프레임워크는 VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VH1-24, VH1-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VH1-18, VH1-69, VH3-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-3O, VH3-48, VH4-39, VH4-59, VH5-51, VH3-73, VH1-58, VH1-3, 및 VH1-2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱더 바람직하게, 인간 생식계열 중쇄 프레임워크는 VH1-69 또는 VH1-18이다. 가장 바람직하게, 인간 생식계열 중쇄 프레임워크는 VH1-69이다.

본원에 개시된 것 이외에도, 본 발명에 따른 기능적 특성을 갖고 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 인간의 조작된 항체는 수개의 다른 접근법을 사용함으로써 생성될 수 있다. 본원에 개시된 특이 항체는 추가의 항체를 제조하는데 있어 주형 또는 모체 항체로서 사용될 수 있다. 하나의 접근법에서, 모체 항체 CDR를, 모체 항체 프레임워크와의 서열 동일성이 높은 인간 프레임워크 내로 이식시킨다. 모체 항체 중 상응하는 프레임워크와 새로운 프레임워크의 서열 동일성은 적어도 80％, 적어도 85％, 또는 적어도 90％가 될 것이다. 이러한 이식을 통해서 결합 친화성은 모체 항체와 비교하여 감소될 수 있다. 이러한 경우라면, 프레임워크는 퀸(Queen) 등에 의해 공개된 특정 기준에 기초하여 특정 위치에서 모체 프레임워크로 역-돌연변이화될 수 있다. 역-돌연변이화를 위해 고려되는 잔기 동정은 하기와 같이 수행될 수 있다: 아미노산이 하기 카테고리에 포함되는 경우, 사용되는 인간 생식 계열 서열의 프레임워크 아미노산 (수용자 프레임워크)은 모체 항체의 프레임워크로부터 유래된 프레임워크 아미노산 (공여자 프레임워크)로 대체된다:

(a) 수용자 프레임워크의 인간 프레임워크 중에 있는 아미노산은 상기 위치에 있는 인간 프레임워크에 대해서는 그와 다른 것인 반면, 공여자 면역글로불린 중의 상응하는 아미노산은 상기 위치에 있는 인간 프레임워크에 대해서는 전형적인 것이거나;

(b) 아미노산 위치가 CDR 중 하나에 바로 인접해 있거나;

(c) 3차원 면역글로불린 모델에서 프레임워크 아미노산의 임의의 측쇄 원자가 CDR 아미노산의 임의의 원자와 거리 (중심에서부터 중심까지의 거리) 약 5-6 Å 이내에 존재한다 (문헌 [Queen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)]).

각각의, 수용자 프레임워크의 인간 프레임워크 중의 아미노산과 공여자 프레임워크 중의 상응하는 아미노산은 일반적으로 상기 위치에 있는 인간 프레임워크에 대해서 그와 다른 것일 경우, 상기 아미노산은 상기 위치에 존재하는 인간 프레임워크에 대해 전형적인 아미노산으로 대체될 수 있다. 이러한 역-돌연변이 기준을 통해 모체 활성을 회복할 수 있다.

또다른 접근법은, 프레임워크를 변화시키지 않으면서 이식된 CDR을 무작위적으로 돌연변이화시키고, 결합 친화성이 모체 항체와 유사하거나 그보다 우수한지에 대해 상기 항체를 스크리닝하는 것이 될 것이다. 추가로, 이들 접근법 둘 모두를 조합하는 것도 가능하다. 이식시킨 후, CDR을 변화시키는 것 이외로 특정 프레임워크 영역을 역-돌연변이화시킬 수 있다. 이러한 일반 방법론은 문헌 [Wu, et al., (1999), "Humanization of a murine monoclonal antibody by simultaneous optimization of framework and CDR residues", J. Mol. Biol, 294: 151-162]에 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 바, "공여자"라는 용어는 또다른 항체 분자 또는 그의 단편으로 제공되거나, 그에 기여하는 경우에, 모체 분자의 구조적 또는 기능적 특징을 수용 분자에 부여하는 것인, 모체 항체 분자 또는 일부가 그로부터 유래된 것인 그의 단편을 의미하는 것으로 한다. CDR 이식에 관한 특이적인 일례로, 이식되는 CDR이 유래되는 모체 분자가 공여자 분자이다. 공여자 CDR은 모체 분자의 결합 친화성을 수용 분자에 부여한다. 공여자 분자는 그의 단편의 수용 분자와 상이한 종으로부터 유래된 것일 필요는 없음을 이해하여야 한다. 대신 공여자는 별도의 상이한 분자면 충분하다.

본원에서 사용되는 바, "수용자"라는 용어는 모체 또는 공여자 항체 분자 또는 그의 단편으로부터 공여부를 받게 되는 항체 분자 또는 그의 단편을 의미하는 것으로 한다. 따라서, 수용자 항체 분자 또는 그의 단편은 모체 분자의 공여부의 구조적 또는 기능적 특징을 제공받게 된다. CDR 이식에 관한 특이적인 일례로, CDR을 이식받게 되는 수용 분자가 수용자 분자이다. 수용자 항체 분자 또는 단편은 공여자 CDR 또는 모체 분자의 결합 친화성을 제공받게 된다. 공여자 분자의 경우와 마찬가지로, 수용자 분자는 공여자와 상이한 종으로부터 유래된 것일 필요는 없음을 이해하여야 한다.

항체, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄와 관련하여 사용될 때, "가변 영역"은 항원 결합을 분자에 부여하며, 불변 영역은 아닌, 항체의 말단부를 의미하는 것으로 한다. 상기 용어는 전체 가변 영역의 모든 결합 기능 중 일부를 유지하는 그의 기능적 단편을 포함하는 것으로 한다. 따라서, "헤테로머성 가변 영역 결합 단편"이라는 용어는 헤테로머성 복합체로 조립되는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역 및 적어도 하나의 경쇄 가변 영역 또는 그의 기능적 단편을 의미하는 것으로 한다. 헤테로머성 가변 영역 결합 단편으로는 예를 들면, 기능적 단편, 예로서, Fab, F(ab)2, Fv, 단일 쇄 Fv (scFv) 등을 포함할 수 있다. 상기 기능적 단편은 당업자에게 주지되어 있다. 따라서, 헤테로머성 가변 영역의 기능적 단편을 설명할 때 상기 용어의 용도는 당업자에게 주지되어 있는 정의와 일치하는 것으로 한다. 그러한 용어는 예를 들면, 문헌 ([Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)]; [Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.)]; [Huston et al., Cell Biophysics, 22: 189-224 (1993)]; Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol, 178:497-515 (1989)] 및 [Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990)])에 기재되어 있다.

바람직하게, 인간의 조작된 항체는 모체 항체, 즉, 비인간 항체, 바람직하게, 마우스 항체 또는 그의 단편, 예로서, 마우스 Fab JXB7로부터 기원하거나, 그로부터 유래된 것인 CDR을 갖는 반면, 프레임워크 및 불변 영역은 그가 존재하는 정도까지 (또는 그의 상당부 또는 실질부, 즉, 적어도 약 90％, 92％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％)는 상기 항체가 인간 세포에서 생산되든 아니든 간에, 인간 생식계열 면역글로불린 영역 (예로서, 인터내셔널 이뮤노제네티스 데이타베이스(International ImMunoGeneTics Database) 참조) 또는 그의 재조합된 형태 또는 돌연변이화된 형태에서 일어나는 핵산 서열 정보에 의해 코딩된다. 바람직하게, 인간의 조작된 항체의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR은 인간의 조작된 항체의 유래가 되는 비인간 모체 항체의 CDR로부터 최적화됨으로써 원하는 특성, 예를 들면, 특이성, 친화성 또는 중화가 개선될 수 있는데, 이는 예로서, ELISA 분석법과 같은 스크리닝 분석법에 의해 확인될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 모체 마우스 Fab JXB7 (즉, 서열 번호: 46)의 HCDR3과 동일한 HCDR3을 포함하고, 및 HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3은 모체 마우스 Fab JXB7에 존재하는 것과 비교하였을 때 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 모체 마우스 Fab JXB7과 비교하여 본 발명의 인간의 조작된 항체의 CDR 중의 특정 아미노산 치환은 항체가 불안정해질 수 있는 가능성을 감소시키거나 (예로서, 하나 이상의 CDR Asn 잔기 제거), 인간 대상체에게 투여되었을 때, 항체의 면역원성의 가능성을 감소시킨다 (예로서, 이뮤노필터™ 테크놀로지(IMMUNOFILTER™ Technology) (캘리포니아주 몬로비아 소재의 크센코르 인크.(Xencor, Inc.))에 의해 예측).

당업계에서 통상 사용되는 방법을 사용하여 인간의 조작된 항체를 시험관내에서 돌연변이유발을 일으킬 수 있고, 따라서, 인간의 조작된 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR의 프레임워크 영역 아미노산 서열은, 인간 생식계열 HCVR 및 LCVR 서열에 관련된 것들로부터 유래되면서, 생체내에서 인간 항체 생식계열 레파토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 인간의 조작된 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 프레임워크의 상기 아미노산 서열은 인간 생식계열 서열과 적어도 약 85％, 약 90％, 약 92％, 약 94％, 약 95％, 약 96％, 약 98％ 또는 더욱 바람직하게, 적어도 약 99％ 또는 가장 바람직하게는 100％ 동일한 것으로 생각된다. 따라서, 인간의 조작된 항체는 수혜자 항체에서도, 모체 항체로부터 유입된 CDR이나 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다.

당업계에는 이용할 수 있는 인간의 조작된 항체 제조 방법이 다수 존재한다 (예로서, PCT 국제 특허 출원 공보 번호 WO 2006/06046935; 문헌 [Queen, et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 88:2869 (1991)]; [Jones et al., Nature, 321 :522 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; 및 [Verhoeyen et al., Science , 239: 1534 (1988)]참조). 예를 들면, 인간의 조작된 항체는, 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 모체 항체 (예로서, 뮤린 항체 또는 하이브리도마에 의해 제조된 항체)의 HCVR 및 LCVR을 코딩하는 핵산 서열을 수득하고, 상기 HCVR 및 LCVR (비인간) 중 CDR을 확인하고, 상기 CDR-코딩 핵산 서열을 선택된 인간 프레임워크-코딩 핵산 서열로 이식시킴으로써 수득할 수 있다. 임의로, CDR 영역을 프레임워크 내로 이식시키기 전에 CDR 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키기 위해서 무작위적으로 또는 특정 위치에서 돌연변이유발을 일으켜 CDR 영역을 최적화시킬 수 있다. 별법으로, 당업자가 이용할 수 있는 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내로 삽입한 후에 CDR 영역을 최적화시킬 수 있다.

CDR-코딩 서열을 선택된 인간 프레임워크 코딩 서열로 이식시킨 후, 이어서, 인간의 조작된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 코딩하는 생성된 DNA 서열을 발현시켜 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 인간의 조작된 항체를 생산한다. 인간의 조작된 HCVR 및 LCVR은 전체 항-헵시딘-25 항체 분자의 일부로서, 즉, 인간 불변 도메인 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 그러나, HCVR 및 LCVR 서열은 또한 불변 서열의 부재하에서도 발현됨으로써 예를 들면, 인간의 조작된 항-헵시딘-25 선택성 Fv 또는 Fab를 생산할 수도 있다 (예로서, 문헌 [Watkins, J., et al., Anal. Biochem., 253:37-45 (1997)] 및 [Watkins, J., et al., Anal. Biochem. 256: 169-177, (1998)]) 참조).

본 발명의 교시를 적용시키면서, 당업자는 일반 기법, 예로서, 영역 지정 돌연변이유발법을 사용함으로써 본원에 개시된 특정 CDR 및 프레임워크 서열 내에 있는 아미노산을 치환, 부가 또는 결실시킬 수 있고, 이렇게 함으로써 본원에서 제공하는 서열로부터 유래된 가변 영역 아미노산 서열을 추가로 생성할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 총 21개 이하의 대체되는 천연적으로 발생된 아미노산이 특정 치환 영역에 도입될 수 있다. 최종적으로, 헵시딘 폴리펩티드에 대하여 바람직한 결합 친화성을 갖는 Fab 단편에 대한 가변 영역 아미노산 서열을 선별하는 경우, 당업자는 시험관내 또는 생체내 스크리닝 기술, 예로서, 본원 실시예 2에 기술되어 있는 스크리닝 기술을 이용할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 항-헵시딘 항체를 제조하는데 적합한 추가의 Fab 단편을 확인할 수 있다. 바람직하게, 프레임워크 내의 아미노산 치환, 부가 및 결실은 본원에 개시된 하나의 또는 각각의 프레임워크 영역 서열 (즉, FRL1, FRL2, FRL3, FRL4, FRH1, FRH2, FRH3, FRH4) 내 1, 2, 3, 또는 4개의 위치로 제한된다. 바람직하게, CDR 내의 아미노산 치환, 부가 및 결실은 하나의 또는 각각의 CDR 내 1 내지 3개의 위치로 제한되며, 더욱 바람직하게는, 하나의 또는 각각의 CDR 내 1개 또는 2개의 아미노산 위치에서 치환, 부가 및 결실이 실시된다. 추가로 바람직한 아미노산 치환, 부가 및 결실은 중쇄 가변 영역의 CDR 중 1개 또는 2개의 아미노산 위치에서 실시된다. 가장 바람직하게, 아미노산 치환, 부가 및 결실은 CDRH2 내 1개 또는 2개의 아미노산 위치에서 실시된다.

이어서, 인간의 조작된 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 코딩하는 생성된 DNA 서열을 발현시켜 고친화성으로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 인간의 조작된 항체를 제조한다. 인간의 조작된 HCVR 및 LCVR은 전체 항-헵시딘-25 항체 분자의 일부로서, 즉, 인간 불변 도메인 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 진단 및 예후 목적으로 인간 조직 및 생물학적 체액 중 성숙한 헵시딘을 검출 및 측정하는 것으로, 상대적으로는 간단하지만 고감도의 선택성을 갖는 면역분석법에서 본 발명의 항체를 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항체는 성숙한 헵시딘으로 조장된 질병에 걸릴 수 있는 소질 평가, 및 상기 질병을 앓는 환자에서 질병에 대한 검출 및 진단을 위해, 인간으로부터 유래된 조직 또는 생물학적 체액 중에 존재하는 성숙한 헵시딘의 양을 정확하게 검출하거나 측정하는 수단을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 예로서, ELISA, RIA, 면역확산 분석법, 또는 면역-검출 분석법, 예로서, SPR 분석법과 같이, 고감도의 신뢰성이 있는 면역분석법에 도입될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 항체는 또한 조직 또는 생물학적 체액 샘플의 면역조직화학적 분석법 (IHC) 및 면역형광 (IF) 분석법에 유용하다. 상기와 같은 분석법을 사용함으로써 비정상적인 헵시딘-25 수준을 검출할 수 있고, 이로써 헵시딘-25로 조장된 질병을 진단할 수 있다. 더욱 특히, 본 발명은 환자로부터 유래된 조직 또는 생물학적 체액 샘플 중 인간의 성숙한 헵시딘의 수준을 측정하고, 샘플 중 인간의 성숙한 헵시딘의 수준을 하나 이상의 대조군 개체로부터 유래된 상응하는 샘플 중 인간의 성숙한 헵시딘의 수준과 또는 기준 표준과 비교하여 인간의 성숙한 헵시딘의 수준이 상승된 것과 관련된 질병을 검출함으로써 환자에서 인간의 성숙한 헵시딘으로 조장된 질병을 진단하는 방법을 제공한다. 질병 병태는 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률 감소와 관련된 유전적 또는 비유전적 질환들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게 질병 병태는 빈혈과 관련된 질병들 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

환자에서 인간의 성숙한 헵시딘으로 조장된 질환, 질병 또는 병태를 모니터링하는 방법 또한 제공한다. 본 방법은 제1 시점에 인간의 성숙한 헵시딘으로 조장된 질환, 질병 또는 병태를 앓고 있거나, 그에 걸릴 위험이 있는 환자로부터 유래된 조직 또는 생물학적 체액 샘플 중 인간의 성숙한 헵시딘의 수준을 측정하고; 하나 이상의 다른 시점에서 환자로부터 유래된 하나 이상의 조직 또는 생물학적 체액 샘플 중 인간의 성숙한 헵시딘의 수준을 측정하고; 다른 시점에서 측정된 인간의 성숙한 헵시딘의 수준을 비교하여 인간의 성숙한 헵시딘으로 조장된 질환 또는 병태를 모니터링하는 것을 포함한다.

본 발명의 인간의 성숙한 헵시딘 선택적 항체는 특히 고효율 방법에 적용될 때에 유용하다. 상기 방법은 다수의 샘플이 마이크로플레이트 또는 슬라이드, 또는 당업계에 공지된 기타 다른 분석용 기판 상에서 시험될 수 있도록 마이크로칩 및 마이크로어레이 방법을 포함한다.

생물학적 샘플 중 인간의 성숙한 헵시딘의 존재 또는 그의 수준은 항원-항체 복합체를 형성하는데 적합한 조건하에서 생물학적 샘플을 예로서, 본 발명의 항체와 조합함으로써 확립될 수 있다. 항체를 직접적으로, 또는 더욱 바람직하게는 간접적으로 검출가능한 영역으로 표지시켜 결합된 항체 또는 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 한다. 면역복합체 형성을 검출하는 매우 다양한 방법이 당업계에 주지되어 있으며, 예를 들면, ELISA, RIA, 면역블롯 (예로서, 도트 블롯, 슬롯 블롯, 웨스턴 블롯 등), 간접 면역형광 기법, 및 예로서, SPR과 같이 물리적인 파라미터의 변화를 검출하는데 의존하는 방법 등이 있다. 그러한 적용은 검출가능한 부분과 접합되어 있는 본 발명의 헵시딘-25 항체를 사용하여 생물학적 샘플, 예로서, 인간 생물학적 체액 또는 세포 또는 조직 추출물 중의 헵시딘을 검출하는 것인 방법을 포함한다. 상기 분석법에서 본 발명의 항체는 검출가능한 부분으로 변형된 상태 또는 변형되지 않고 사용될 수 있다. 검출가능한 부분으로 변형이 되는 경우, 본 발명의 항체는 검출가능한 부분의 공유 또는 비공유 부착에 의해 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "검출가능한"이라는 용어는 공지된 분석 비법을 사용함으로써 검출기에 의해 물질을 확인되거나 추적할 수 있도록 하는 물질 (접합체, 화합물, 또는 부분)의 특징을 기술한다. 검출가능한 부분에 대한 대표적인 일례로는 제한없이, 발색단, 형광성 부분, 인광성 부분, 발광성 부분, 방사성 부분, 각종 효소 (예로서, 알칼리성 포스파타제, 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제), 자성 부분 (예로서, 반자성, 상자성 및 강자성 물질), 및 중금속 클러스터 뿐만 아니라, 임의의 기타 다른 공지의 검출가능한 부분을 포함한다. 형성된 항체-항원 표준 복합체의 양은 당업계에 공지된 각종 방법, 예로서, 광도 측정 또는 비색 측정 수단에 의해서 정량할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 변형되지 않은 상태로, 즉, 당업계에 주지된 방법에 따라 간접적으로 표지된 상태로 사용된다.

본 발명은 본 발명의 항체가 인간의 성숙한 헵시딘 단백질에 결합할 수 있기에 충분한 시간 동안, 그리고 그러한 조건하에서 상기 항체를 생물학적 샘플과 함께 인큐베이션시키는 단계, 및 상기 결합을 검출할 수 있는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플 중 인간의 성숙한 헵시딘 단백질을 검출하는 방법을 구현한다.

본 발명은 또한 인간의 성숙한 헵시딘 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 스크리닝하기 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 그러한 스크리닝은 상기 폴리펩티드를 함유하거나, 생산하는 것으로 의심되는 환자 샘플, 또는 실험실용 샘플 상에서 실시될 수 있다. 키트는 본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체를 함유할 수 있다. 키트는 샘플과 본 발명의 헵시딘-25 선택적 항체 사이의 상호작용을 검출하는데 적합한 완충액 및 시약을 함유할 수 있다. 제공되는 시약은 본 발명의 항체, 예로서, 항-마우스 IgG 항체와 결합할 수 있거나 상호작용할 수 있는, 방사선표지된, 형광 표지된, 또는 효소로 표지된 제제일 수 있다.

*키트용 시약은 고체 지지체에 부착된 액체 용액으로서, 또는 건식 분말로서 제공될 수 있다. 시약이 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 수용액인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 제공되는 시약이 고체 지지체에 부착된 경우, 고체 지지체는 크로마토그래피 매질, 다수의 웰이 있는 시험 플레이트, 또는 현미경 슬라이드일 수 있다. 제공되는 시약이 건식 분말인 경우, 분말은, 키트 중에 함께 제공될 수 있는 적합한 용매의 첨가로 재구성될 수 있다.

본 발명의 키트는 일반적으로 항체, 항원 또는 검출 시약이 그 안에 놓여질 수 있고, 바람직하게는, 적절히 분취될 수 있는 용기 내에 존재하는 상태로 제공된다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 상업적 시판을 위해 항체, 항원, 및 시약 용기를 함유하는 수단을 포함할 것이다. 그러한 용기는 그 안에 원하는 바이알을 보유하고 있는 플라스틱 용기와, 하나 이상의 필요한 화학물질, 예로서, 크로마토그래피 물질, 용매, 및 용리제, 시험관, 계면활성제, 항체 및 검출 반응용 화학물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는 성숙한 헵시딘의 활성과 관련이 있는 질병 또는 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 본 발명의 항체는 성숙한 헵시딘으로 조장된 병태, 질환, 또는 질병에 대해 치료받고 있는 대상체에서 성숙한 헵시딘의 수준을 모니터링하는 분석법에서 사용될 수 있다. 그러한 적용은 본 발명의 항체와, 생물학적 샘플, 예로서, 인간 체액 중, 또는 세포 또는 조직 추출물 중 성숙한 헵시딘을 검출하기 위한 표지를 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명의 항체는 변형되어, 또는 변형되지 않고 사용될 수 있고, 이는 검출가능한 부분과의 공유 또는 비공유 부착에 의해 표지될 수 있다.

예로서, ELISA, RIA, 및 FACS를 비롯한, 생물학적 샘플 중 단백질 수준을 측정하기 위한 각종의 통상적인 프로토콜이 당업계에 공지되어 있고, 성숙한 헵시딘 발현의 변경된 수준 또는 비정상적인 수준을 진단하기 위한 기초를 제공한다. 임의의 공지 기법을 사용함으로써, 예를 들면, 성숙한 헵시딘 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 항원:항체 복합체를 형성하기에 적합한 조건하에서 예로서, 본 발명의 항체와 조합함으로써 샘플 중에 존재하는 정상 또는 표준 헵시딘 수준을 확립한다. 항체를 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 물질로 표지시켜 결합된 항체 또는 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 한다. 적합한 검출가능한 물질로는 각종 효소, 보결분자단, 형광성 물질, 발광성 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 형성된 표준 복합체의 양을 예를 들어 광도 측정 수단과 같은 다양한 방법에 의해 정량한다. 이어서, 샘플 중에 존재하는 성숙한 헵시딘 폴리펩티드의 양을 표준 값과 비교한다. 진단, 예후, 및/또는 모니터링 분석법, 키트, 및 방법에 사용하기에 바람직한 항체는 (i) 서열 번호: 6에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 번호: 14에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드; (ii) 서열 번호: 7에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 번호: 15에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드; (iii) 서열 번호: 9에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 번호: 17에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드; 또는 (iv) 서열 번호: 8에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 폴리펩티드 및 서열 번호: 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 단리된 헵시딘-25 선택적 항체는 요법, 바람직하게, 인간 요법에 사용될 수 있다.

*본 발명의 항체를 포함하는 제약 조성물은 유효량으로 그를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여되었을 때에 인간 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률을 증가시키기는데 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체는, 헵시딘-25의 존재가 바람직하지 못한 병적 효과를 유발하거나 그에 원인이 되거나, 또는 헵시딘-25 수준 또는 헵시딘-25 생체활성의 감소가 인간 대상체에서 치료학적으로 유익한 것인 병태, 질환 또는 질병 치료에 유용할 수 있다. 그러한 병태, 질환 또는 질병으로는 감염, 염증, 만성 질환, 및/또는 암으로부터 유발된 빈혈을 비롯한 빈혈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다.

본 발명은 그를 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량의, 약 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 선택적으로 결합하는 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률을 증가시키는 방법을 포함한다. 추가로, 또는 별법으로, 본 발명은 감염, 염증, 만성 질환, 및/또는 암으로부터 유발된 빈혈을 비롯한 빈혈을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률을 증가시키는 것이 도움이 되는 질환, 병태, 또는 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 바람직하게, 대상체는 바람직하지 못하게 낮은 혈청 철분 수치, 낮은 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률을 갖거나, 가질 위험이 있다. 더욱 바람직하게, 대상체는 감염, 염증, 만성 질환, 및/또는 암으로부터 유발된 빈혈을 비롯한 빈혈에 걸릴 위험이 있거나, 그러한 빈혈을 앓고 있다. 더욱더 바람직하게, 항체는

i) 서열 번호: 41 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR1;

ii) 서열 번호: 30, 53, 56, 57, 58, 및 76으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및

iii) 서열 번호: 31, 61, 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 LCVR; 및

i) 서열 번호: 32, 63, 78, 및 79로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR1;

ii) 서열 번호: 44, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 및 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; 및

iii) 서열 번호: 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 HCVR을 포함한다. 더욱더 바람직하게, 항체는 (i) 각각 서열 번호: 6 및 14로 나타낸 아미노산 서열; (ii) 각각 서열 번호: 7 및 15로 나타낸 아미노산 서열; (iii) 각각 서열 번호: 9 및 17로 나타낸 아미노산 서열; 또는 (iv) 각각 서열 번호: 8 및 16으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 가장 바람직하게, 항체는 각각 서열 번호: 8 및 16으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.

추가로, 빈혈 또는 상기 언급한 질병들 중 적어도 하나에 대한 치료용의 약제 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도도 주시된다. 바람직하게, 항체는

i) 서열 번호: 41 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR1;

ii) 서열 번호: 30, 53, 56, 57, 58, 및 76으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및

iii) 서열 번호: 31, 61, 및 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 LCVR; 및

i) 서열 번호: 32, 63, 78, 및 79로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR1;

ii) 서열 번호: 44, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 및 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; 및

iii) 서열 번호: 46으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 HCVR을 포함한다. 더욱 바람직하게, 항체는 (i) 각각 서열 번호: 6 및 14로 나타낸 아미노산 서열; (ii) 각각 서열 번호: 7 및 15로 나타낸 아미노산 서열; (iii) 각각 서열 번호: 9 및 17로 나타낸 아미노산 서열; 또는 (iv) 각각 서열 번호: 8 및 16으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 가장 바람직하게, 항체는 각각 서열 번호: 8 및 16으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.

"치료하는" (또는 "치료" 및 "치료하다")라는 용어는, 본원에 기술된 질병이 진행되는 것을 저속화시키거나, 저지시키거나, 중단시키거나, 제어하거나, 정지시킬 수는 있는 모든 과정을 의미하는 것인데, 그러나, 반드시 질병 증상 모두를 완전하게 제거하여야 한다는 것을 의미하는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 바, "치료"라는 것은 포유동물, 특히, 인간에서 질환 또는 병태의 치료를 위한 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하며, 이는 (a) 질환이 추가로 진행되는 것을 저해시키는 것, 즉, 질환이 발생되는 것을 중단시키는 것; 및 (b) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환 또는 질병을 퇴행시키거나, 증상 또는 그의 합병증을 경감시키는 것을 포함한다. 투약 요법은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 개로 분할된 용량이 장기간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 치료적 상황의 요건에 의해 지시되는 대로 용량이 비례적으로 감소하거나 증가될 수 있다.

"예방하는" (또는 "예방하다" 또는 "예방")이라는 용어는 증상, 질병, 병태, 또는 질환의 발병 또는 발생을 방해하거나, 억제시키거나, 저해시키는 것을 의미한다. 급성 사례 및 만성 병태가 치료 및 예방될 수 있다. 급성 사례의 경우, 본 발명의 항체는 증상, 질병, 병태, 또는 질환의 발병시에 투여되며, 급성 사례가 종료되면 투여를 중단한다. 대조적으로, 만성 증상, 질병, 병태, 또는 질환은 보다 장기간의 시간 일정으로 치료된다.

"질병"은 본 발명에 따른 치료가 도움이 되는 임의의 병태이다. "질병," "병태" 및 "질환"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 만성 및 급성의, 성숙한 헵시딘으로 조장된 질병으로서, 이는 빈혈 (감염, 염증, 및/또는 암으로부터 유발된 빈혈을 포함하나, 이에 한정되지 않는 만성 질환으로 인한 빈혈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항체는 인간 대상체에게 투여하기에 적합한 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다. 본 발명의 항체는 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체 및/또는 희석제와 함께 조합되어 단일 또는 다중 용량으로 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 제약 조성물은 선택된 투여 방식에 적절하도록 디자인되고, 제약상 허용되는 희석제, 담체 및/또는 부형제, 예로서, 분산제, 완충제, 계면활성제, 방부제, 가용화제, 등장화제 (염화나트륨을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 안정화제 등이 적절하게 사용된다. 상기 조성물은, 예를 들어, 진료의에게 일반적으로 공지된 제형 기법의 개요를 제공하는 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19^th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995]에 개시된 통상적인 기법에 따라 디자인될 수 있다. 제약 조성물에 적합한 담체로는, 본 발명의 항체와 함께 조합되었을 때에 분자의 활성은 유지하면서, 대상체의 면역계와는 비반응성인 임의의 물질을 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 제약 조성물은 i) 본 발명의 항체, ii) 시트르산염 완충액, 및 iii) 염화나트륨을 포함한다. 바람직하게, 항체는 약 1 mg/ml 내지 약 35 mg/ml 범위의 농도로 존재하고, 시트르산염은 약 5 mM 내지 약 20 mM 범위의 농도로 존재하고, 염화나트륨은 약 100 mM 내지 약 300 mM 범위의 농도로 존재하고, 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 7.2이다. 더욱 바람직하게, 항체는 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/ml 범위의 농도로 존재하고, 시트르산염은 약 5 mM 내지 약 15 mM 범위의 농도로 존재하고, 염화나트륨은 약 150 mM 내지 약 300 mM 범위의 농도로 존재하고, 조성물의 pH는 약 5.5 내지 약 6.5이다. 더욱더 바람직하게, 항체는 약 5 mg/ml 내지 약 25 mg/ml 범위의 농도로 존재하고, 시트르산염은 약 10 mM로 존재하고, 염화나트륨은 약 200 mM 내지 약 300 mM 범위의 농도로 존재하고, 조성물의 pH는 약 5.5 내지 약 6.5이다.

본 발명의 항-헵시딘-25 항체를 포함하는 제약 조성물은 표준 투여 기법을 사용하여 본원에 기술된 병상, 예로서, 빈혈 질병에 걸릴 위험이 있거나, 상기 질병을 보이는 대상체에게 투여될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "유효량"이라는 어구는 치료적 결과를 달성하기에 (투여량으로, 및 일정 기간 동안 및 투여 수단을 위해) 필요한 양을 의미한다. 항체의 유효량은 예로서, 질병 병태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에게서 원하는 반응을 이끌어내는 항체 또는 항체 부분의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한 치료학적으로 이로운 효과가 항체의 임의의 독성 또는 불리한 효과를 능가하는 것이다.

유효량은 대상체에게 치료학적 이점을 부여하기 위해 필요한 활성제의 적어도 최소의 용량이지만 독성 용량보다 적다. 다시 말해, 본 발명의 항체의 유효량 또는 치료학적 유효량은 포유동물, 바람직하게 인간에서 (i) 혈청 철분 수치, 망상적혈구 계수, 적혈구 계수, 헤모글로빈, 및/또는 적혈구 용적률을 증가시키거나, (ii) 성숙한 헵시딘의 존재가 바람직하지 못한 병적 효과를 유발하거나 그에 원인이 되는 질병을 치료하거나, (iii) 성숙한 헵시딘 수준 또는 성숙한 헵시딘 생체활성을 감소시켜 포유동물, 바람직하게 인간에서 빈혈 (감염, 염증, 및/또는 암으로부터 유발된 빈혈을 포함하나, 이에 한정되지 않는 만성 질환으로 인한 빈혈을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 대하여 유익한 치료학적 효과를 제공하는 것인 양이다. 유효량의, 본 발명의 항체는 단일 용량으로, 또는 다회분량으로 투여될 수 있다. 추가로, 유효량의, 본 발명의 항체는 수회에 걸쳐 투여되는 것이 아니라면, 유효량보다 적은 양으로 구성된 다회분량으로 투여될 수 있다.

의학 업계에 주지된 바와 같이, 임의의 한 대상체에 대한 투여량은 환자의 사이즈, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강 상태, 및 함께 투여되는 기타 약물을 비롯한, 많은 인자에 따라 달라진다. 추가로, 투여량은 질환 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다. 전형적인 투여량은 예를 들면, 약 1 mg 내지 약 200 mg; 바람직하게, 약 2 mg 내지 약 200 mg; 더욱 바람직하게, 약 5 mg 내지 약 200 mg; 더욱더 바람직하게, 약 5 mg 내지 약 50 mg, 더욱더 바람직하게, 약 5 mg 내지 약 25 mg; 더욱더 바람직하게, 약 5 mg 내지 약 20 mg; 더욱더 바람직하게, 약 5 mg 내지 약 15 mg 범위일 수 있지만; 특별히 상기 언급한 인자들을 고려하면, 상기 예시적인 범위보다 적거나 많은 투여량도 포함된다. 1일 비경구 투여량 요법은 약 10 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 바람직하게 약 25 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱 바람직하게 약 50 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게, 약 100 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게 약 200 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게, 약 300 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게, 약 400 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게 약 500 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 600 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 700 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 800 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 900 ㎍/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게, 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게, 약 2 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게, 약 3 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게, 약 4 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게, 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게, 약 6 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 더욱더 바람직하게, 약 7 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 및 더욱더 바람직하게, 약 8 mg/kg 내지 약 20 mg/kg일 수 있다. 주기적인 평가에 의해 진행을 모니터링할 수 있고, 그에 따라 투여량을 조정할 수 있다.

항체의 이러한 제안된 양은 많은 치료적 판단에 영향을 받기 쉽다. 적절한 투여량 및 스케줄 선택에 있어서 주요 인자는 수득되는 결과이다. 이러한 상황에서 고려할 요소로는 치료될 특정 질병, 개별적인 환자의 임상 병태, 질병의 원인, 항체의 전달 영역, 항체의 특정 유형, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 진료의에게 공지된 기타 요소를 포함한다.

본 발명의 항체의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입, 또는 국소적일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 비경구 투여에 적합한 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 비경구라는 용어는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 또는 복강내 투여를 포함한다. 정맥내 또는 복강내 또는 피하 주사에 의한 비경구 전달이 바람직하다. 피하 주사가 가장 바람직하다. 상기 주사에 적합한 비히클은 당업계에 주지되어 있다.

제약 조성물은 전형적으로 무균성이어야 하고, 제조 및 보관 조건하에 예로서, 밀봉 바이알, 주사기 또는 기타 다른 전달 장치, 예로서, 펜을 비롯한, 제공되는 용기 내에서 안정적이어야 한다. 따라서, 제약 조성물은 제형의 제조 후에 무균 여과될 수 있거나, 또는 다르게는 미생물학적으로 허용가능하게 제조될 수 있다.

하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 인간 헵시딘 -25 제조

인간 헵시딘-25는 상업적 공급원 (예로서, 펩티드 인터내셔날(Peptide International) (켄터키주 루이빌 소재))으로부터 입수할 수 있거나, 당업계에 공지된 다양한 합성 또는 재조합 기법에 의해 제조될 수 있다. 별법으로, 인간 헵시딘-25 서열의 25개의 아미노산을 포함하고, 서열 번호: 95에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 E. 콜라이에서 발현시킨다. 37℃에서 1 mM IPTG를 사용하여 유도한 후 3-6시간이 경과한 후에 인간 헵시딘 융합 단백질을 발현하는 3 ℓ의 E. 콜라이로부터 봉입체를 단리시킨다. 봉입체를 완충액 A (50 mM 트리스 및 8 M 우레아 (pH 8.0)) 중에 가용화시킨다. 상등액을 IMAC 칼럼 (20 mL 수지) 상에 통과시킨다. 흡광도가 기준선으로 되돌아 갈때까지 완충액 A를 사용하여 칼럼을 세척하고, 결합된 폴리펩티드는 완충액 A 중 0.5 M 이미다졸에 의해서 칼럼으로부터 배취식으로 용리시킨다. 인간 헵시딘-25 융합 단백질을 풀링시키고, 50 mM DTT로 환원시킨다. 이어서, 풀링된 물질은 최종 단백질 농도가 50 ㎍/mL 미만이 되도록 2 M 우레아, 3 mM 시스테인, 50 mM 트리스 (pH 8.0)에 희석시켜 상기 융합 단백질을 리폴딩시킨다. 상기 물질을 실온에서 교반시키고, 48시간 동안 대기 산화시켰다. 산화된 폴리펩티드를 5 mL/분의 유속으로 IMAC 칼럼 (20 mL) 상에 통과시키고, 인간 헵시딘-25 융합 단백질을 완충액 A 중 0.5 M 이미다졸에 의해서 칼럼으로부터 배취식으로 용리시킨다. 인간 헵시딘-25 융합 단백질을 함유하는 풀링된 분획을 농축시키고, 50 mM 트리스, 4 M 우레아 (pH 8.0)로 평형화된 칼럼이 크기순으로 배열된 수퍼덱스 75(Superdex 75) (GE 헬쓰케어(GE Healthcare), XK26/60) 상에 3 mL/분의 유속으로 통과시킨다. 단량체 융합 단백질을 풀링시키고, 이어서, 50 mM 트리스, 2M 우레아, 5 mM CaCl₂ (pH 8.0)로 희석시킨 후, 엔테로키나제로 절단하여 서열 번호: 1의 인간 헵시딘-25를 제조한다. 절단되지 않은 인간 헵시딘-25 융합 단백질은 (상기에서 개요된 바와 같은) 수동 IMAC 크로마토그래피에 의해 제거한다. 이어서, IMAC 칼럼으로부터의 유량을 4.0 mL/분의 유속으로 C-18 역상 칼럼 상에 통과시킨다. 흡광도가 기준선으로 되돌아 갈 때까지 물 중 0.1 ％ TFA를 사용하여 칼럼을 세척하고, 결합된 폴리펩티드는 0.5％/분의 속도로 0.1％ TFA를 사용하여 20％에서부터 40％까지의 ACN의 선형 구배로 칼럼으로부터 용리시킨다. 인간 헵시딘-25 폴리펩티드를 함유하는 분획을 풀링시키고, N-말단 아미노산 서열 분석 및 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화를 이용한 질량 분광분석법 (MALDI-MS)에 의해서 분석을 한다. 래트, 마우스, 및 사이노몰거스 원숭이 헵시딘-25, 및 헵시딘-22 및 헵시딘-20을 비롯한, 인간 헵시딘-25의 각종 N-말단 절단된 형태를 코딩하는 폴리펩티드는 상업적으로 수득하였다 (예로서, 펩티드 인터내셔날).

실시예 2: 항- 헵시딘 -25 Fab 및 Mab 의 친화성 결합 측정

표면 플라즈몬 공명 바이오센서, 예로서, 비아코어® T100을 사용하여 본원에 개시된 항체의 결합 동력학적 특성 및 친화성을 측정할 수 있다. 비아코어® 시스템은 덱스트란 바이오센서 매트릭스 내에 존재하는 상호작용 분자의 단백질 농도 변경을 검출하는 SPR의 광학적 성질을 이용한다. 언급하는 것을 제외하면, 모든 시약과 물질은 비아코어® AB (스웨덴 웁살라 소재)로부터 구입한다. 모든 측정은 25℃에서 실시한다. 샘플을 HBS-EP 완충액 (150 mM 염화나트륨, 3 mM EDTA, 0.05％ (w/v) 계면활성제 P-20, 및 10 mM HEPES (pH 7.4)) 중에 용해시킨다. 인간 카파로 Fab를 포획하기 위해 아민 커플링 키트를 사용하여 5000-10000 반응 유니트 (Rus) 수준으로 CM5 센서 칩의 유동 셀 1 내지 4 상에 염소-항-인간 카파를 고정시킨다. 마우스 IgG1로 Mab를 포획하기 위해 아민 커플링 키트를 사용하여 5000-10000 Rus 수준으로 CM5 센서 칩의 유동 셀 1 내지 4 상에 염소-항-마우스 Fc 감마를 고정시킨다. 인간 IgG4로 항체를 포획하기 위해 아민 커플링 키트를 사용하여 400-700 Rus 수준으로 CM4 센서 칩의 유동 셀 1 내지 4 상에 단백질 A를 고정시킨다. 다중 분석 사이클을 사용하여 주변 세포질로부터 제조된 Fab 및 포유동물 세포 배양물로부터 제조된 Mab를 평가한다. 각 사이클은 하기 단계로 구성된다: 포획량이 200-1000 Rus가 되도록 Fab 또는 Mab를 약 10 ㎕/분으로 0.3-2분간 주사, 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 수득된 인간 헵시딘-25를 다양한 농도로 (600 nM 내지 0.1 nM) 50 ㎕/분으로 2분간 주사한 후, 2-10분 동안 해리, 및 30 ㎕의 10 mM 글리신 하이드로클로라이드 (pH 1.5)를 사용하여 재생. 25℃에서 측정하고, BIA이벨루에이션(BIAevaluation) 소프트웨어에서 "질량 이동에 따른 1:1(1:1 with mass transfer)" 결합 모델을 사용하여 각 사이클당 결합 및 해리 속도를 평가한다.

마우스 Fab JXB7 및 특정 인간의 조작된 항-헵시딘 Fab의 인간 헵시딘-25 결합 파라미터를 표 5에 제시한다. 표 3에 열거된, 기타 다른 인간의 조작된 Fab의 인간 헵시딘-25 결합 친화성 (K_D)은 약 214 pM 내지 약 54 pM인 것으로 측정되었으며, 각각의, 인간 헵시딘-25로부터의 k_오프 속도는 약 7.68 x 10^-4s^-1 내지 약 2.22 x 10^-4s^-1였다. 따라서, 인간 헵시딘-25에 대한 K_D가 마우스 Fab JXB7보다 52배 이하로 더 낮은, 인간의 조작된 항-헵시딘 Fab를 확인하였다. 표 5에 나타낸 인간의 조작된 항-헵시딘 Fab는 각각 인간 생식계열 경쇄 및 중쇄 프레임워크 O2 및 VH1-69을 포함한다.

<표 5>

마우스 Mab JXB7 및 특정 인간의 조작된 항-헵시딘 Mab의 인간 헵시딘-25 결합 파라미터를 표 6에 나타낸다. 그러므로, 인간 헵시딘-25에 대한 결합 친화성 (K_D)이 마우스 Mab JXB7의 것보다 약 33배 더 낮은 인간의 조작된 항-헵시딘 Mab를 확인하게 되었다. Mab JXB7 및 31B2에 대한 중쇄 불변 영역은 마우스 IgG1이다. 표 6 중의 기타 다른 Mab에 대한 중쇄 불변 영역은 인간 IgG4 (서열 번호: 94)였다.

<표 6>

각종 인간의 조작된 항-헵시딘 Mab의 사이노몰거스 원숭이 헵시딘-25 및 마우스 헵시딘-25 결합 파라미터를 각각 표 7 및 8에 나타낸다. Mab Hu22, 3.23, 및 3.8에 대한 래트 헵시딘-25에의 결합은 검출불가능하였다. 일반적으로, Mab Hu22 및 3.23의 경우, 성숙한 사이노몰거스 원숭이 헵시딘에 대한 K_D가 인간 헵시딘-25에 대한 K_D와 유사한 것으로 나타났다. 그러나, Mab 3.8의 경우, 사이노몰거스 원숭이 헵시딘-25에 대한 K_D가 인간 헵시딘-25에 대한 K_D보다 10배 초과로 더 낮은 것으로 나타났다. 한편, Mab Hu22, 3.23, 및 3.8의 경우, 인간 헵시딘-25에 대한 K_D가 마우스 헵시딘-25에 대한 K_D보다 훨씬 더 낮은 것으로 나타났다.

<표 7>

<표 8>

실시예 3: 헵시딘에 의해 유도된 페로포틴의 내재화 및 분해에 대한 세포-기반 분석법

시험관내 세포-기반 분석법을 사용하여 인간 헵시딘에 대한 Mab의 중화 활성을 측정할 수 있다. 본 발명의 항체의 중화 활성을 측정하는데 유용한 하나의 시험관내 세포-기반 분석법은 헵시딘에 의해 유도된, 그의 수용체인 페로포틴의 내재화 및/또는 분해에 기초한다. 간략하면, 페로포틴 (FPN)의 유도가능한 발현을 허용하는 HEK 293 안정한 세포주를 제조한다. FPN은 C-말단이 추적 목적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)과 융합되어 있다. 바이러스 전사 활성화 인자를 포함하지 않는, 임상적으로 이용가능한 테트라사이클린 조절형 발현 시스템인 T-REx 시스템 (캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))을 사용하여 FPN-GFP 분자의 유도가능한 발현을 제어한다. 유도가능한 프로모터 및 제오신(Zeocin) 내성 마커를 함유하는 pCDNA4/TO 벡터 내로 FPN-GFP 코딩 서열을 클로닝시킨다. 독시사이클린 유도가능한 발현에 필요한 조절 단백질을 발현하는 T-REx-293 세포로 생성된 작제물을 형질감염시킨다. FPN-GFP의 유도가능한 발현에 대하여 제오신 내성 클론을 시험한다. 세포 성장 조건은 본질적으로 T-REx 시스템에 대해 제조사 제공 사용자 매뉴얼에 기재되어 있는 바와 같다. 간략하면, 세포를 DMEM, 10％ 투석된 FBS, 20 μM FAC (시트르산 철분 암모늄) + 5 ㎍/mL 페니실린-스트렙토마이신 중에서 성장시킨다. 100 ㎍/mL 제오신 및 5 ㎍/mL 블라스티시딘(Blasticidin)을 사용하여 계속하여 선별한다. 폴리-D-리신이 코팅된 96-웰 블랙/투명 플레이트 상에 세포를 플레이팅한다. 고해상 형광 플레이트 판독기를 사용하여 웰마다 전체 형광을 판독한다.

본질적으로는 하기와 같이 분석을 실시한다: 트립신 처리 후, FPN-GFP/TREx 293 안정한 세포주를 사용하여 9,000개의 세포/웰로 96-웰 분석플레이트에 시딩한다. 각 웰당 시딩량은 80 ㎕이다. 밤새도록 세포가 부착될 수 있도록 한다. 그 다음날 아침 일찍 9 ㎕의 30 ng/mL 독시사이클린을 각 웰에 첨가하여 FPN-GFP 발현을 유도한다. 8시간 동안 이러한 유도가 일어날 수 있도록 한다. 유도 후, 배지를 흡입하여 흡입된 배지로 만들고, 120 ㎕/웰 PBS를 사용하여 웰을 주의를 기울여 세척한다. 임의의 잔재하는 배지는 계속하여 FPN-GFP의 발현을 유도할 수 있기 때문에 각 웰로부터 모든 액체를 제거하는 것이 중요하다.

세척 후에 신속하게 분석 플레이트에 첨가하기 위해서 96-웰 포맷으로 원하는 처리군을 설정한다. 웰당 최종 분석 부피는 45 ㎕이다. 추가의 처리를 한 후에 즉시 고해상 형광 플레이트 판독기 (채널 1에서 550 볼트로 설정)를 사용하여 분석 플레이트를 판독한다. 이 판독값을 0시간째의 판독값으로 하고, 이를 사용하여 웰당 세포의 갯수 (이는 웰당 전체 FLU와 상관관계에 있다)로 정규화한다. 인간 헵시딘-25는 0.5 μM에서 페로포틴의 최대 내재화 및 분해를 유도하였다. 인간 헵시딘-25에 대한 IC₅₀은 대략 8 nM이다. 항-헵시딘 항체 중화 분석법에서는 인간 헵시딘-25 농도를 100 nM로 유지시키고, 0.5 μM 내지 8 nM로 2x 희석하여 항-헵시딘 항체를 전개시킨다. 플레이트를 24시간 동안 인큐베이션시킨 후, 다시 판독하고, 24시간째의 각 웰당 전체 형광 유니트 (FLU)를 0시간째의 각 웰당 전체 FLU로 나눈 비로 데이타를 작성한다.

상기 시험관내 분석법에서, 인간 헵시딘-25 생체활성은 다양한 항-헵시딘 Mab로 중화되었으며, IC₅₀ 측정치는 표 9에 나타낸 바와 같다.

<표 9>

실시예 4: 항- 헵시딘 모노클로날 항체 투여가 피하를 통해 인터루킨-6으로 처리된 사이노몰거스 원숭이에서의 혈청 철분 수치를 상승시킨다.

사이노몰거스 원숭이에서 IL-6에 의해 유도된 혈청 철분 조절이상에 대한 항-헵시딘 항체의 활성은 하기 기술하는 바와 같이 측정할 수 있다.

간략하면, 1 및 10 mg/kg의 항-헵시딘 항체를 i.v. 볼루스로 수컷 사이노몰거스 원숭이에 투여한다. 항체 투여 후 대략 1시간이 경과하였을 때에 동물에게 인간 IL-6을 5 ㎍/kg으로 단일 피하 투여한다. -1시간 (항체 투약 전), 0시간 (IL-6 투약 직전) 및 IL-6 처리 후 1, 3, 6, 12, 24, 48, 96, 168, 336, 504, 및 672시간 경과시에 혈액 샘플을 수집한다. 바람직하게, 각 처리군은 적어도 3마리의 동물로 구성된다. 일반적으로 의료계에서 공인된 혈청 철분 수치 측정 방법으로서 간주되는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해서 혈청 철분 수치를 측정할 수 있다.

<표 10>

PBS 대조군과 비교하여, 인간 IL-6으로 처리하면 혈청 철분 수치는 일시적으로 감소하게 되고, IL-6 처리 후 12시간 경과시에는 최하점에 도달하게 된다. 인간 IL-6을 투약하기 대략 1시간 전에 Hu22 및 3.23을 10 mg/kg으로 정맥내 투여하면 IL-6 처리로 인한 철분 수치 강하를 막을 수 있고, 이를 통해 IL-6 처리 후 3 내지 6시간째에 혈청 철분은 각각 대략 52％ 및 108％ 증가하게 된다. 피크 수준에 도달한 후에 혈청 철분 농도는 이들 두 군에서 순차적으로 감소하였고, 24시간째에는 기타 다른 군의 수준과 유사한 수준에 도달하게 되었다. 10 mg/kg의 Hu22 (p<0.01, 3 및 6시간) 및 3.23 (p<0.01, 3, 6, 및 12시간), 둘 모두는 PBS 전처리된 IL-6 군과 비교하여 혈청 철분 농도를 통계학상 유의적으로 증가시킨다. 대조적으로, 1 mg/kg의 Hu22 및 3.23, 두가지 모두 대조군과 비교하여 혈청 철분 수치에 있어 통계학상 유의적인 차이를 가져오지 못했다. 따라서, 이러한 결과는 본 발명의 항체가 성숙한 헵시딘 생체활성으로부터 유발된 빈혈을 치료하는데 유용할 것이라는 것을 입증한다.

실시예 5: MALDI - TOF 를 사용하여 항- 헵시딘 항체의 선택성 측정

바이오마커에 대한 통상의 임상적 진단은 주로 예로서, ELISA와 같은 면역학적인 정량 기법에 기초한다. 이러한 방법은 대체 작은 항원이나 항원 이소형에는 적용이 될 수 없다 (문헌 ([Sparbier, K., International Meeting of Association of Biomolecular Resource Facilities, Salt Lake City, UT, Poster V28-S, (2008)]; 및 [Gutierrez, J.A., et al., (2005)])).

제조사의 프로토콜에 따라, 항-인간 헵시딘 Mab 31B2를 CNBr 활성화된 세파로스 6MB 수지 (뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 GE 헬쓰케어)에 접합시킨다. 간략하면, 세파로스 수지를 1 mM HCl로 3회에 걸쳐 세척하고, 항체를 커플링 완충액 (100 mM NaHCO₃, 0.5 M NaCl (pH 8.3))으로 희석시켰다. 수지 1 mg당 대략 1.7 mg의 항체를 사용하여 4℃에서 밤새도록 접합시켰다. 0.1 M 아세트산염 완충액 (pH 4)에 의해 과량의 항체를 세척하였다. 대략 100 ml의 인간 혈청 샘플을 4℃에서 0.8 ml의 상기 세파로스-31B2 수지와 함께 인큐베이션시켰다. 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 수지/혈청 혼합물을 칼럼 내로 패킹하고, 10-20 칼럼 부피의 10 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl (pH 7.4)로 세척하였다. NaCl을 포함하지 않는, 5-10 칼럼 부피의 10 mM 인산나트륨 (pH 7.4)을 사용하여 칼럼을 세척하였다. 최종적으로, 칼럼을 0.2％ TFA로 용리시켰다. 보이저-DE STR 기기(Voyager-DE STR instrument) (캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어프라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 상에서 선형 모드로 분자량에 대하여 용리된 분획을 분석하였다.

분자량이 인간 헵시딘-25보다 작은 경우, 펩티드 매트릭스를 사용하여 질량 스펙트럼을 작성하였다. 인간 헵시딘-25에 상응하는, 우세한 피크 (2790 달톤)를 확인하였다. 다양한 절단된 형태의 헵시딘, 즉, 헵시딘-24 (2674 달톤), 헵시딘-22 (2436 달톤), 및 헵시딘-20 (2192 달톤)에 대한, 상기보다는 덜 우세한 피크 또한 검출할 수 있었다.

분자량이 인간 헵시딘-25보다 큰 경우, 단백질 매트릭스를 사용하여 질량 스펙트럼을 작성하였다. 인간 헵시딘-25에 상응하는, 우세한 피크 (25 aa, 2790 달톤)를 확인하였지만, 프리프로-헵시딘 (84 aa, 9400 달톤) 또는 프로-헵시딘 (60 aa, 6929 달톤)에 상응하는 피크는 검출할 수 없었다.

따라서, 31B2 Mab 및 그의 인간의 조작된 변형체를 사용한 면역분석법은 인간 혈청에 존재하는 것으로 알려져 있는 헵시딘의 전구체 및/또는 N-말단 절단형과 비교하여, 인간 혈청 중의 활성을 띠며 가장 생리학적으로 관련된 형태의 헵시딘인 인간 헵시딘-25에 대하여 선택성을 갖는다.

실시예 6: CHO 세포에서의 발현시 항- 헵시딘 -25 항체-코딩 mRNA 의 잠재 스플라이싱의 보정

표준 분자 생물학 기법을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있고, 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있고, 형질전환체를 선별할 수 있고, 본 발명의 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포주를 단리시킬 수 있고, 숙주 세포를 배양할 수 있고, 배양 배지로부터 발현된 항체를 회수할 수 있다. 놀랍게도, 재조합 글루타민 신테타제 (GS) 발현 시스템 (영국 슬라우 소재의 론자 바이올로직스 인크.(Lonza Biologics, Inc.)를 사용하여 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 현탁액을 배양함으로써 Mab 3.12 및 3.23을 제조하였을 때, 매우 높은 수준의 항체-단백질 응집이 관찰되었다 (각각 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정시 약 15％ 및 약 30％). 그러나, 두 Mab가 인간 기원의 HEK-293 세포에서 일시적으로 발현된 경우에는 고수준의 응집이 관찰되지 않았다. 2개의 CHO 세포주 각각으로부터 얻은 mRNA를 조사한 결과, 예측하지 못했던 크기를 갖는 전사체가 존재하는 것으로 나타났고, 이는 Mab 3.12 및 3.23의 항체 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서 잠재적인 스플라이싱 이벤트가 일어날 수 있다는 것을 제안한다. 추가로, 응집된 단백질 샘플을 조사한 결과, 경쇄 단백질 중에서 절단이 일어났다는 것이 밝혀졌다. Mab 3.12 및 3.23을 발현하는 CHO 세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조된 cDNA를 서열 분석함으로써 경쇄 유전자 중 잠재 인트론이 존재한다는 것을 확인하게 되었다. 스플라이스 공여자는 LC CDR1의 아미노산 잔기 R/VS (프레임내, 서열 번호: 43의 아미노산 5-7이고 "/" 표시는 프레임내 스플라이스 연접부를 나타낸다)를 코딩하는 코돈내 포함되어 있었다. 추가로, 각각 Mab 3.12 및 3.23의 LCDR2 중 아미노산 잔기 STL 및 SPL을 코딩하는 코돈 중에 개연성이 있는 폴리-피리미딘 신장부을 포함하는 FRL2 (서열 번호: 40)의 아미노산 잔기 LI를 코딩하는 코돈에서 개연성이 있는 분기점이 발견되었다. 그리고 마지막으로, 수용자 영역은 Mab 3.12 및 3.23, 둘 모두의 LCDR3 중 아미노산 잔기 C/Q/Q (서열 번호: 61의 아미노산 1-3; "/" 표시는 개연성이 있는 스플라이스 연접부를 나타낸다)를 코딩하는 코돈에서 확인되었다.

이어서, Mab 3.12 및 3.23의 경쇄를 코딩하는 원래의 DNA 서열 (각각 서열 번호: 153 및 155)를 변형시켜, 잠재 인트론에 스플라이스 공여자, 분기점, 수용자 및 폴리-피리미딘 구역을 부여하는 서열을 제거하였다. 더욱 특히, 공여자 영역은 CGC GTA AGT로부터 AGA GTC TCC (서열 번호: 45)로 변형시켰다. 분기점은 CTG ATC로부터 CTC ATC (서열 번호: 162)로 변형시키고; 폴리-피리미딘 구역은 3.12 및 3.23에서 각각 TCC ACC CTG로부터 AGC ACA CTG (서열 번호: 77)로, 및 TCC CCC CTG로부터 AGC CCA CTG (서열 번호: 78)로 변형시키고; 수용자는 TGT CAG CAG TGG로부터 TGC CAA CAA TGG (서열 번호: 100)로 변형시켰다.

이에, 각각 서열 번호: 12 및 13으로 나타낸, 변형된 DNA 서열을 수반하는 재조합 발현 벡터에 의해서 Mab 3.12 및 3.23의 경쇄를 이어서 발현시켰다. CHO 세포에서의 변형된 핵산 서열 발현시에 생산된 응집 항체의 양은 3.12 및 3.23 Mab, 두가지 모두에서 1％ 이하인 것으로 측정되었다.

스플라이스 공여자, 폴리-피리미딘 구역, 및 스플라이스 수용자는 항체에 대하여 특이성을 제공하는 LCDR을 코딩하는 코돈으로부터 유래한다는 이유에서 각종의 기타 다른 본 발명의 항체의 경쇄를 코딩하는 DNA 서열에 대해 이루어지는 변형도 역시 매우 이로울 것으로 예측할 수 있다. 분기점은 FRL2에 있고, LLIY 서열은 경쇄 프레임워크 중에서 고도로 보존된다. 또한, 그의 코딩 뉴클레오티드 서열은 확인된 스플라이스 수용자 영역에 놓여있는 QQ 모티프는 본 발명의 항-헵시딘 Mab 다수의 LCDR3 내에서 보존된다. 일반적으로 다수의 경쇄 생식계열 서열은 가능성을 지닌 잠재 인트론의 수용자로서의 역할을 할 수 있는 이들 Q 코돈 (CAG) 중 하나 또는 그 둘 모두를 함유한다.

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> ANTI-HEPCIDIN ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> X17737 <150> 60/984910 <151> 2007-11-02 <150> PCT/US2008/081493 <151> 2008-10-29 <160> 162 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Thr His Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg 1 5 10 15 Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr 20 25 <210> 2 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggcta caccttcctg atttatccaa taagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaaat tttcatcctt acctgggtgt cactaactac 180 ctggaaaagt tcaagggcag agtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcgggggg 300 actgggtcct ttgactactg gggccaagga accacggtca ccgtctcctc agcctccacc 360 aagggcccat cggtcttccc gctagcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 cccccatgcc caccctgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggaaagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320 tctctgggt 1329 <210> 3 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggcta caccttcact atttatccaa taagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaaat tttcatcctt acctgggtga cactaactac 180 aatgaaaagt tcaagggcag agtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcgggggg 300 actgggtcct ttgactactg gggccaagga accacggtca ccgtctcctc agcctccacc 360 aagggcccat cggtcttccc gctagcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 cccccatgcc caccctgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggaaagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320 tctctgggt 1329 <210> 4 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggcta caccttcctg atttatccaa taagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaaat tttcatcctt acctgggtgt cactaactac 180 ctggaaaagt tcaagggcag agtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcgggggg 300 actgggtcct ttgactactg gggccaagga accacggtca ccgtctcctc agcctccacc 360 aagggcccat cggtcttccc gctagcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 cccccatgcc caccctgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggaaagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320 tctctgggt 1329 <210> 5 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggcta caccttcctg atttatccaa taagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaaat tttcatcctt acctgggtgt cactaactac 180 gtggaaaagt tcaagggcag agtcaccatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gcgcgggggg 300 actgggtcct ttgactactg gggccaagga accacggtca ccgtctcctc agcctccacc 360 aagggcccat cggtcttccc gctagcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 cccccatgcc caccctgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggaaagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag 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atcacttgca gtgccgagtc acgcgtaagt tccacttact tgttctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag cccctaagct cctgatctat aggacatccc ccctggcttc tggagtccca 180 tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 240 cctgaagatt ttgcaactta ctattgtcag cagtggagtg gttacccatt cacgttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaacggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgc 645 <210> 11 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gtgccagctc acgcgtaagt tccacttact tgttctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag cccctaagct cctgatctat aggacatcca ccctggcttc tggagtccca 180 tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 240 cctgaagatt ttgcaactta ctattgtcag cagtggagtg gttacccatt cacgttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaacggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgc 645 <210> 12 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gtgccagctc aagagtctcc tccacttact tgttctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag cccctaagct cctcatctat aggacaagca cactgacctc tggagtccca 180 tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 240 cctgaagatt ttgcaactta ctattgccaa caatggagtg gttacccatt cgtgttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaacggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgc 645 <210> 13 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gtgccagctc aagagtctcc tccacttact tgttctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag cccctaagct cctcatctat aggacaagcc cactggcctc tggagtccca 180 tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 240 cctgaagatt ttgcaactta ctattgccaa caatggagtg gttacccatt cgtgttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaacggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgc 645 <210> 14 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Glu Ser Arg Val Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Thr Ser Pro Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala 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Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 137 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 137 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 138 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 138 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 139 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 139 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 140 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 140 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Asp Thr Lys Tyr Val Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 141 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 141 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Val Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 142 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 142 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Lys Tyr Leu Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 143 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 143 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Lys Tyr Val Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 144 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 144 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Lys Tyr Leu Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 145 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 145 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 146 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 146 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 147 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 147 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Asn Tyr Val Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 148 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 148 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 149 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 149 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Asp Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 150 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 150 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 151 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 151 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Asn Tyr Val Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 152 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 152 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Leu Ile Tyr 20 25 30 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Leu Gly Val Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 153 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 153 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gtgccagctc acgcgtaagt tccacttact tgttctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag cccctaagct cctgatctat aggacatcca ccctgacctc tggagtccca 180 tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 240 cctgaagatt ttgcaactta ctattgtcag cagtggagtg gttacccatt cgtgttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaacggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgc 645 <210> 154 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 155 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 155 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gtgccagctc acgcgtaagt tccacttact tgttctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag cccctaagct cctgatctat aggacatccc ccctggcctc tggagtccca 180 tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 240 cctgaagatt ttgcaactta ctattgtcag cagtggagtg gttacccatt cgtgttcggc 300 ggagggacca aggtggagat caaacggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgc 645 <210> 156 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 157 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 158 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 159 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 160 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 161 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 162 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 162 ctcatc 6

Claims (8)

1. 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정시 800 pM 이하의 K_D로 인간 헵시딘-25에 결합하고,
   (i) 각각 서열 번호: 52, 60, 62, 65, 71 및 75에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3;
   (ii) 각각 서열 번호: 42, 76, 62, 79, 87 및 46에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및
   (iii) 각각 서열 번호: 41, 53, 31, 63, 84 및 46에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3
   으로 이루어진 군으로부터 선택되는 6개의 CDR을 포함하는 항체.
2. 제1항에 있어서, 25℃에서 SPR에 의해 측정시 인간 헵시딘-25에 대해 200 pM 내지 30 pM의 K_D를 갖는 항체.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 헵시딘-25 생체활성에 관한 시험관내 분석법에서 100 nM 내지 25 nM의 IC₅₀을 갖는 항체.
4. 제3항에 있어서, 분석법이 헵시딘에 의해 유도된 페로포틴의 내재화 및/또는 분해를 측정하는 것인 항체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 빈혈 치료용 제약 조성물.
6. a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체와, 인간으로부터 얻은 조직 또는 생물학적 체액 샘플을, 항체가 결합하기에 적합하고 존재하는 임의의 인간 성숙형 헵시딘이 상기 항체와 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 접촉시키는 단계, 및 b) 면역검출 방법에 의해 샘플 중에서 상기 복합체의 존재 또는 부존재를 검출하는 단계 및/또는 상기 복합체의 양을 측정하는 단계를 포함하는 면역분석법.
7. 제6항에 있어서, 면역검출 방법이 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA), 면역조직화학적(IHC) 분석법, 면역형광(IF) 분석법, 응집(agglutination) 분석법, 웨스턴 블롯 분석법, 도트 블롯 분석법, 슬롯 블롯 분석법 또는 표면 플라즈몬 공명 검출법인 면역분석법.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 면역분석법을 수행하기 위한 키트.

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