CN103492414B - 抗hepcidin抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了选择性结合人hepcidin-25的单克隆抗体，其特征是具有与人hepcidin-25的高亲和力，和强的中和人hepcidin的性质。发明的抗体治疗性的用于增加人体内的血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白，和/或血细胞比容，以及用于在人类受试者中治疗和诊断成熟hepcidin促进性障碍，例如贫血。

Description

抗HEPCIDIN抗体及其用途
本发明属于医药领域，特别是抗人成熟的hepcidin的抗体领域。更特别地，本发明涉及hepcidin-25选择性单克隆抗体，其能够中和人成熟的hepcidin生物活性，并且因此用于增加人体内的血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白，和/或血细胞比容，目的是治疗或预防人成熟的hepcidin-促进性疾病、病症或障碍，例如贫血。
目前，用于贫血或用于慢性疾病贫血的合适且有效的疗法是有限的。特别地，施用促红细胞生成素仅在约50％的总患者中有效，并且与不理想的副作用相关。此外，由于污染、感染和铁超负荷的风险，输血是不理想的。
人hepcidin，一种主要由肝细胞表达的多肽，被认为是重要的铁调节蛋白，其负调节肠的铁吸收、巨噬细胞的铁再循环，和铁从肝的铁储存的移动。Hepcidin的过度产生在贫血和/或慢性疾病贫血的病理生理学中似乎扮演了主要的角色。
人hepcidin被编码为84个氨基酸编码的前肽原(prepropeptide)，其含有典型的N末端24个氨基酸的内质网靶向信号序列，和35个氨基酸的原区域(proregion)，该区域具有共同的弗林蛋白酶切割位点，并直接连接了C末端25个氨基酸的生物活性铁调节激素，人hepcidin-25(SEQIDNO：1)。还已知在体内形成多种N末端截短形式的人hepcidin-25，例如人hepcidin-20(即，SEQIDNO：1的氨基酸6-25)和人hepcidin-22(即，SEQIDNO：1的氨基酸4-25)。
虽然以前已经报道过人hepcidin的抗体(参见例如，U.S.专利申请公开2004/0096990和2007/0224186，以及PCR国际专利申请公开号WO2008/097461)，但是本领域仍然迫切的需要其它药物，来治疗与贫血相关的疾病和障碍，它们包括慢性疾病贫血，例如癌症贫血和炎症贫血。由于hepcidin-25是人体内最生理学相关的hepcidin形态(即使其不是惟一的形态)，因此，相比靶向不生理学相关的hepcidin多肽的抗体，特别需要选择性靶向人hepcidin-25的抗体。因此，本发明提供了抗人hepcidin-25的选择性的、高亲和力的、改造的治疗性抗体，在治疗或诊断与成熟hepcidin水平升高相关的障碍(例如，贫血)中具有许多优点。例如，这些抗体对人体内的hepcidin的生理学相关形态是高亲和力、中和性、人体工程化和高选择性的，可以降低副作用的风险，以及降低有效治疗需要给药的临床剂量和频率。本发明还包括编码优选的选择性hepcidin-25抗体的优选核酸，其中核酸已经过改造，去除了隐藏的切割位点，所述位点导致哺乳动物宿主细胞表达时一些本发明的抗体不理想的聚集。因此，本发明的其它优点包括改良的具有理想纯度的抗体产物的产量，从而削减了生产成本，以及更高程度的所施用的抗体产物的临床效率和安全性。
此外，可商购的人hepcidin免疫测定不能区分人hepcidin的活性的、生理学相关的形态和无活性的、生理学不相关的hepcidin种类(参见例如，Kemna，E.H.等人，Haematologica，93(1)：90-7(2008))。目前，选择性检测hepcidin-25的大部分方法涉及LC/MS(液相色谱/质谱)或类似的需要分离不同形态hepcidin的繁琐方法(参见例如，Gutierrez，J.A.等人，BioTechniques，38：S13-S17(2005)，Murphy等人，Blood，110：1048-54(2007)和Kemna，E.H.等人，Clin.Chem.53：620-8(2007))。虽然这些检测可能是正确且精准的，但是它们的复杂性、成本和所需要的高水平操作专业人员阻止了它们的常规应用。因此，仍然非常需要对其应用具有高亲和力的结合人成熟hepcidin的其它抗体，在相对简单、快速和强大的免疫测定中用于特异性检测或测量成熟形态的人hepcidin，进行诊断和/或预后性的应用。
本发明提供了结合人hepcidin-25的抗体，在25℃通过表面等离振子共振(SPR)确定所述抗体的结合亲和力(KD)为约800pM或更少。优选的，在25℃通过SPR确定，所述抗体具有与人hepcidin-25的解离速率(Koff)在约8.5×10-3s-1和约1.8×10-4s-1之间。更优选的，在25℃通过SPR确定，所述抗体具有与人hepcidin-25的KD在约400pM至约30pM之间。甚至更优选的，在25℃通过SPR确定，所述抗体具有与人hepcidin-25的KD在约200pM至约30pM之间。甚至更优选的，在hepcidin-25生物活性的体内测定中，抗体具有IC50在约100nM至约25nM之间，优选的，其中测定测量了IL-6诱导的血清铁水平的降低。甚至更优选的，在hepcidin-25生物活性的体外测定中，抗体具有IC50在约100nM至约50nM之间，优选的，其中测定测量了hepcidin诱导的膜铁转运蛋白(ferroportin)的内化作用和/或降解。甚至更优选的，抗体包括至少一个CDR，选自i)具有SEQIDNO：75所示氨基酸序列的HCDR3，和ii)具有SEQIDNO：62所示氨基酸序列的LCDR3。
本发明包括这样的抗体，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约800pM或更低的KD，并包括重链可变区(“HCVR”)多肽和轻链可变区(“LCVR”)多肽，其中(i)HCVR和LCVR多肽分别具有SEQIDNO：148和SEQIDNO：126所示的氨基酸序列；(ii)HCVR和LCVR多肽分别具有SEQIDNO：128和SEQIDNO：127所示的氨基酸序列；(iii)HCVR和LCVR多肽分别具有SEQIDNO：151和SEQIDNO：125所示的氨基酸序列；或(iv)HCVR和LCVR多肽分别具有SEQIDNO：150和SEQIDNO：124所示的氨基酸序列。
本发明包括这样的抗体，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约800pM或更低的KD，并包括重链多肽和轻链多肽，其中(i)重链和轻链多肽分别具有SEQIDNO：6和SEQIDNO：14所示的氨基酸序列；(ii)重链和轻链多肽分别具有SEQIDNO：7和SEQIDNO：15所示的氨基酸序列；(iii)重链和轻链多肽分别具有SEQIDNO：9和SEQIDNO：17所示的氨基酸序列；或(iv)重链和轻链多肽分别具有SEQIDNO：8和SEQIDNO：16所示的氨基酸序列。
本发明包括这样的抗体，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约800pM或更低的KD，并包含LCVR多肽，所述LCVR多肽包含3个共同存在于本文表1列举的Fab中的CDR序列，并且所述CDR序列存在于抗体中的位置与表1所示的CDR位置相同。优选的，此类抗体包含的LCVR多肽具有选自SEQIDNO：101-127的氨基酸序列。
本发明包括这样的抗体，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约800pM或更低的KD，并包含HCVR多肽，所述HCVR多肽包含3个共同存在于本文表2列举的Fab中的CDR序列，并且所述CDR序列存在于抗体中的位置与表2所示的CDR位置相同。优选的，此类抗体包含的HCVR多肽具有选自SEQIDNO：128-151的氨基酸序列。
本发明包括这样的抗体，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约800pM或更低的KD，并且包含i)LCVR多肽，所述LCVR多肽包含3个共同存在于表1列举的Fab中的CDR，所述CDR存在于抗体中的位置与表1所示的CDR位置相同，和ii)HCVR多肽，所述HCVR多肽包含3个共同存在于表2列举的Fab中的CDR，并且所述CDR存在于本发明抗体中的位置与表2所示的CDR位置相同。优选的，此类抗体包含6个共同存在于本文表3列举的Fab中的CDR，并且所述CDR存在于抗体中的位置与表3所示的CDR位置相同。
本发明包括这样的抗体，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约200pM或更低的KD，并且包含i)具有选自SEQIDNO：101-127的氨基酸序列的LCVR多肽，和ii)具有选自SEQIDNO：128-151的氨基酸序列的HCVR多肽。
本发明还包括这样的抗体，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约200pM或更低的KD，并且包含两条重链多肽和两条轻链多肽，其中每条重链多肽具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列，且每条轻链多肽具有SEQIDNO：16所示的氨基酸序列。
在其它方面，本发明提供了编码发明的抗体的分离的核酸分子；包含编码发明的抗体的核酸分子的载体，所述核酸分子任选的与用载体转化的宿主细胞识别的控制序列有效的连接；包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码发明的抗体的核酸分子；生产发明的抗体的方法，包括培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码发明的抗体的核酸分子，从而核酸被表达并且任选的从宿主细胞培养基中回收抗体。
在另一个方面，发明提供了药物组合物，包含发明的抗体和可药用的载体或稀释剂。优选的，药物组合物包括同质(homogeneous)的或基本同质的发明抗体的群体，以及可药用的载体或稀释剂。
在另一个实施方案中，发明提供了这样的抗体用于治疗，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约800pM或更低的KD。发明还提供了这样的抗体用于在受试者中治疗或预防贫血，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约800pM或更低的KD。
本发明包括了这样的抗体的用途，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约800pM或更低的KD，其用于制备治疗贫血的药物，所述贫血包括慢性疾病贫血和癌症贫血。发明还包括了这样的抗体的用途，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约800pM或更低的KD，用于制备增加动物中，优选的哺乳动物物种中，更优选的人受试者中的血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白，和/或血细胞比容的药物。
本发明包括增加血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白，和/或血细胞比容的方法，包括向需要其的人受试者施用有效量的抗体，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约800pM或更低的KD。
在另一个方面，发明提供了在患者中治疗成熟的hepcidin促进性障碍的方法，所述障碍受益于血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白，和/或血细胞比容的增加，包括但不限于贫血，如由于感染、炎症、慢性疾病和/或癌症导致的贫血，其中所述方法包括向需要其的患者施用有效量的发明的hepcidin-25选择性抗体。
本发明还提供了选择性针对人成熟hepcidin的免疫测定。方法包括：首先，获得用于人成熟hepcidin待测定的样品，在适合结合并允许所存在的任何人成熟hepcidin形成抗原-抗体复合体的条件下将样品与发明的抗体接触；然后，检测复合体的存在或缺失；和/或通过免疫测定方法确定样品中复合体的量。
本发明还提供了在患者中诊断人成熟hepcidin促进性病症的方法，通过确定来自患者的生物学流体样品中的人成熟hepcidin的水平，并且比较样品中的人成熟hepcidin的水平与来自一个或多个对照个体的生物学流体样品中的人成熟hepcidin的水平或参照标准相比较。
还提供了在患者中监控成熟hepcidin促进性障碍的方法。方法包括在第一时间点确定来自患者的生物学流体样品中的成熟hepcidin的水平，所述患者患有成熟hepcidin促进性障碍或者处于所述障碍的风险中；在一个或多个不同时间点，确定来自患者的一个或多个生物学流体样品中的成熟hepcidin的水平；比较不同时间点确定的成熟hepcidin的水平，从而监控成熟hepcidin促进性障碍。发明还提供了用于实施免疫测定的试剂盒，包括发明的抗体和合适的容器。
附图说明
图1描述了分离自人血清的多种形态的人hepcidin的MALDI-TOF质谱。信号1具有与完整的人hepcidin-25的预期质量一致的质量(mass)。信号2、3和4具有与人成熟hepcidin(hepcidin-24、hepcidin-22和hepcidin-20)的N末端截短形态一致的质量。质谱是在使用正价铁的MALDI-TOF质谱上产生的，如下文实施例5所述，使用a-氰基-4-羟基肉桂酸(肽基质)作为样品基质的线性模式方法。
图2描述了图1中相同样品的MALDI-TOF质谱，使用3，5-二甲基-4-羟基肉桂酸(芥子酸基质)作为样品基质。信号1表示完整的人hepcidin-25。未观察到前-hepcidin。质谱是在使用正价铁的质谱上产生的，线性模式方法如下文实施例5所述。
图3A显示了具有散开的CDR的完全人轻链框架O2的氨基酸序列。四个框架区标记为FRL1、2、3和4(分别是SEQIDNO：39、40、96和97)。
图3B显示了具有散开的CDR的人重链框架VH1-69的氨基酸序列。四个框架区标记为FRH1-4(分别是SEQIDNO：35-38)。
图4A显示了具有散开的CDR的人轻链框架O18的氨基酸序列。四个框架区标记为FRL1、2、3和4(分别是SEQIDNO：154、40、156和97)。
图4B显示了具有散开的CDR的人重链框架VH1-18的氨基酸序列。四个框架区标记为FRH1、2、3和4(分别是SEQIDNO：157、36、158和38)。
图5A显示了具有散开的CDR的人轻链框架L12的氨基酸序列。四个框架区标记为FRL1、2、3和4(分别是SEQIDNO：159、40、160和97)。
图5B显示了具有散开的CDR的人重链框架VH1-46的氨基酸序列。四个框架区标记为FRH1、2、3和4(分别是SEQIDNO：157、36、161和38)。
本文中使用下列缩写：ACN：乙腈，BSA：牛血清白蛋白，DTT：二硫苏糖醇，EDTA：乙二胺四乙酸，ELISA：酶联免疫吸附测定，IMAC：固定化金属亲和层析，IPTG：异丙基-β-D-l-硫代吡喃半乳糖苷，Mab：单克隆抗体，Mabs：单克隆抗体，MALDI-TOF：基质相关激光解吸离子化-飞行时间，PBS：磷酸缓冲盐溶液，SPR：表面等离振子共振，TFA：三氟乙酸。本公开文本中使用的所有氨基酸缩写都是美国专利商标局接受的，并陈述在37C.F.R.§1.822(B)(2)中。
当在本文中使用时，术语“hepcidin”指已知存在于哺乳动物中的任何形态的hepcidin蛋白。当在本文中使用时，术语“成熟hepcidin”指哺乳动物中表达的任何成熟的、生物活性形态的hepcidin蛋白。当在本文中使用时，术语“人hepcidin”指人中存在的任何形态的hepcidin蛋白。当在本文中使用时，术语“人hepcidin-25”指具有SEQIDNO：1所述氨基酸序列的成熟形态的人hepcidin。
除非另外指出，术语“抗体”涉及发明的抗hepcidin抗体(或简而言之，“发明的抗体”)时，如本文中使用的，指人体工程化(humanengineered)的单克隆抗体或完全人单克隆抗体。优选的，发明的抗体是人体工程化抗体。可以使用例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(如，CDR移植)或此类技术的组合，或者本领域容易已知的其它技术，来生产发明的抗体。
“单克隆抗体”指抗体而非生产抗体的方法，所述抗体源自单个拷贝或克隆，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆。本文中使用的抗体可以是完整的抗体(包括完整的或全长Fc区)，或者是包含抗原结合部分的抗体的一部分或片段，例如人体工程化的或完全人抗体的Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。优选的发明的抗体的抗原结合片段保留了在体内或在体外抑制或中和成熟形态的哺乳动物hepcidin的一种或多种生物活性特征的能力。例如，在一个实施方案中，发明的抗体的抗原结合部分可以抑制人hepcidin-25与一种或多种受体(例如，人膜铁转运蛋白(SEQIDNO：25))的相互作用，和/或可以抑制hepcidin诱导的膜铁转运蛋白的内化作用。
此外，“发明的抗体”或简而言之本文中使用的“抗体”可以是单链Fv片段，通过用接头序列将编码LCVR和HCVR的DNA连接而产生的。
(参见Pluckthun，ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，NewYork，pp269-315，1994)。可以理解，除非另外指出，否则不论是否说明了抗原结合片段或部分，本文中使用的术语“抗体”都包括此类片段或部分以及单链形态。
本文中使用的术语“选择的”或“选择地”当分别涉及抗hepcidin-25抗体或其结合时，指选择性结合hepcidin-25的抗体，其如在25℃通过SPR测量的，具有比该抗体结合已知在相同的哺乳动物物种中形成的、至少一种前体形态的hepcidin-25和/或至少一种成熟hepcidinN末端截短种类低约1000-、500-、200-、100-、50-、10-或约5-倍的KD。此外，或可选的，通过本领域技术人员使用的免疫测定和/或MALDI-TOF质谱方法确定的，发明的hepcidin-25选择性抗体结合hepcidin-25，但不结合或最低程度的结合已知在相同的哺乳动物物种中形成的，至少一种前体形态的hepcidin-25和/或至少一种成熟hepcidinN末端截短种类，所述方法包括但不限于本文实施例5中描述的测定。优选的，本发明的抗hepcidin-25选择性抗体结合人hepcidin-25，在25℃通过SPR测量时，具有比该抗体结合人前-hepcidin，优选地，具有SEQIDNO：34中所示的氨基酸序列的人前-hepcidin和/或至少一种人成熟hepcidin的N末端截短形态低约1000-、500-、200-、100-、50-、10-或约5-倍的KD。此外或可选的，通过本领域技术人员使用的免疫测定和/或MALDI-TOF质谱方法确定，发明的抗hepcidin-25选择性抗体结合人hepcidin-25，但不结合或最低程度的结合已知在相同的哺乳动物物种中形成的、人前-hepcidin，优选的具有SEQIDNO：34中所示的氨基酸序列的人前-hepcidin，和/或至少一种成熟hepcidin的N末端截短种类，所述方法包括但不限于本文实施例5中描述的测定。更优选的，本发明的抗hepcidin-25选择性抗体结合人hepcidin-25，在25℃通过SPR测量时，具有比该抗体结合人前-hepcidin和至少一种人成熟hepcidin的N末端截短形态低约1000-、500-、200-、100-、50-、10-或约5-倍的KD，所述人前-hepcidin具有SEQIDNO：34中所示的氨基酸序列。此外或可选的，通过本领域技术人员使用的免疫测定和/或MALDI-TOF质谱方法确定，发明的抗hepcidin-25选择性抗体结合人hepcidin-25，但不结合或最低程度的结合人前-hepcidin(SEQIDNO：34)，和已知在相同的哺乳动物物种中形成的、至少一种成熟hepcidin的N末端截短种类，所述方法包括但不限于本文实施例5中描述的测定。最优选的，在25℃通过SPR测量时，本发明的抗hepcidin-25选择性抗体i)结合人hepcidin-25，具有比该抗体结合人前-hepcidin(SEQIDNO：34)低约1000-、500-、200-、100-、50-、10-或约5-倍的KD，和ii)结合人hepcidin-25，具有比该抗体结合人hepcidin-20(即，SEQIDNO：1的氨基酸6-25)和/或人hepcidin-22(即，SEQIDNO：1的氨基酸4-25)低约1000-、500-、200-、100-、50-、10-或约5-倍的KD。此外或可选的，通过本领域技术人员使用的免疫测定和/或MALDI-TOF质谱方法确定的，发明的抗hepcidin-25选择性抗体结合人hepcidin-25，但不结合或最低程度的结合i)人前-hepcidin(SEQIDNO：34)，和ii)人hepcidin-20和/或人hepcidin-22，所述方法包括但不限于本文实施例5中描述的测定。
术语“检测”的各种语态使用最广泛的含义，包括靶分子的定量的、半定量的或定性的测量。在一个方面，本文中描述的方法可以只确定生物学样品中特定hepcidin多肽的存在或缺失，因此，通过方法确定，样品中的hepcidin多肽是可检测的，或可选的，不可检测的。
术语“表位”指在抗体的一个或多个抗原结合区，能够被抗体识别和结合的分子部分。
术语“生物活性”当涉及发明的抗体时，包括但不限于表位或抗原结合亲和力，抗体的体内和/或体外稳定性，抗体的免疫原性性质(例如当施用给人类受试者时)，和/或在体内或体外中和或拮抗hepcidin的生物活性的能力，包括但不限于抑制炎症中的血清铁水平失调，例如IL-6、激惹测定，如本文实施例4中所述。可以使用本领域已知的技术观察或测量上述性质或特征，包括但不限于，闪烁亲近测定法，ELISA，ORIGEN免疫测定(IGEN)，荧光淬灭，荧光ELISA，竞争性ELISA，SPR分析(包括但不限于使用BIAcore生物传感器的SPR分析)，不受限制的体外和体内中和测定(参见例如，国际公开号WO2006/062685)，受体结合，和使用不同来源的组织切片的免疫组织化学，包括人、灵长类或任何其它需要的来源。
术语“生物活性”当涉及成熟hepcidin(包括hepcidin-25)时，包括但不限于成熟hepcidin与另一种蛋白质(包括但不限于它的受体膜铁转运蛋白)的特异性结合，成熟hepcidin的一种或多种膜铁转运蛋白介导的功能，例如成熟hepcidin诱导的膜铁转运蛋白的内化作用和/或降解(参见例如，Nemeth，E.等人，HepcidinRegulatesIronEffluxbyBindingtoFerroportinandInducingItsInternalization，Science306，2090-2093，(2004))，人体内膜铁转运蛋白介导的铁流出、血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的成熟hepcidin调节，蛋白质稳定性(即，在体内或体外受成熟hepcidin影响的另一种蛋白质的水平或活性)，和hepcidin表达水平和/或组织分布。
本文中使用的术语“抑制”或“中和”当涉及发明抗体的生物活性时，意指基本上拮抗、阻止、预防、限制、减慢、干扰、消除、中止、降低或逆转人成熟hepcidin的生物活性的能力，包括但不限于，本文实施例3或4中测量的人成熟hepcidin的生物活性。
本发明的抗体的特征是，在25℃通过SPR确定，对人hepcidin-25具有低于约1000pM的KD，优选的，低于约800pM，更优选的，低于约400pM，甚至更优选的，低于约200pM，甚至更优选的，低于约100pM，甚至更优选的，低于约75pM，或最优选的，低于约50pM。优选的，在25℃通过SPR确定，抗体选择性结合人hepcidin-25，具有低于约800pM，优选的，低于约400pM，更优选的，低于约200pM，甚至更优选的，低于约100pM，甚至更优选的，低于约75pM，或最优选的，低于约50pM的KD，还选择性地结合至少一种另一物种的hepcidin-25，所述另一物种例如猕猴(cynomolgous)hepcidin-25。更优选的，在25℃通过SPR确定，此类抗体选择性结合猕猴hepcidin-25，具有低于约800pM的KD，甚至更优选的，低于约400pM，甚至更优选的，低于约200pM，甚至更优选的，低于约100pM，甚至更优选的，低于约75pM，或最优选的，低于约50pM。
本发明的抗体包括抗hepcidin-25选择性抗体，在25℃通过SPR确定，所述抗体对人hepcidin-25具有在约800pM和约30pM之间的KD，优选的，在约400pM和约30pM之间，更优选的，在约200pM和约30pM之间，甚至更优选的，在约100pM和约30pM之间，甚至更优选的，在约75pM和约30pM之间，或最优选的，在约50pM和约30pM之间。优选的，在25℃通过SPR确定，此类抗体还对猕猴hepcidin-25具有在约800pM和10pM之间的KD，更优选的，在约400pM和约10pM之间，甚至更优选的，在约200pM和约10pM之间，甚至更优选的，在约100pM和约10pM之间，甚至更优选的，在约75pM和10pM之间，或最优选的，在约50pM和10pM之间。
本发明的抗体还包括这样的抗体，在25℃通过SPR确定，所述抗体具有对人hepcidin-25和/或猕猴hepcidin-25的KD，低于对小鼠hepcidin-25和/或大鼠hepcidin-25的抗体KD，至少约20-倍，至少约30-倍，至少约40-倍，至少约50-倍，至少约60-倍，至少约70-倍，至少约80-倍，至少约90-倍，至少约100-倍，或至少200-倍。
本发明的抗体还包括这样的抗体，在25℃通过SPR确定，所述抗体与人hepcidin-25的Koff速率在约1×10-2s-1和约1.8×10-4s-1之间，优选的，在约8.5×10-3s-1和约1.8×10-4s-1之间，更优选的，在约7.7×10-4s-1和约1.8×10-4s-1之间，甚至更优选的，在约6.5×10-4s-1和约1.8×10-4s-1之间，或最优选的，在约5.5×10-4s-1和约2.0×10-4s-1之间。优选的，此类抗体还选择性结合人hepcidin-25，在25℃通过SPR确定，具有在约800pM和30pM之间的KD，甚至更优选的，在约400pM和约30pM之间，甚至更优选的，在约200pM和约30pM之间，甚至更优选的，在约100pM和约30pM之间，甚至更优选的，在约75pM和50pM之间，或最优选的，在约50pM和30pM之间。
本发明还包括结合人hepcidin-25的抗体，优选的选择性的，具有约200pM或更低的KD，在体外或体内中和或拮抗人成熟hepcidin的至少一种生物活性。优选的，发明的抗体在成熟hepcidin的生物活性的体外或体内测定中，具有低于约200nM的IC50，更优选的，低于约100nM，甚至更优选的，低于约75nM，或最优选的，低于约50nM，如例如本文实施例3或4所述。
本发明的抗体还包括抗人hepcidin-25结合的，优选的选择性结合的抗体，所述抗体在猕猴测定中显著抑制IL-6诱导的血清铁降低，如本文实施例4所述。优选的，在用5μg/kg剂量的人IL-6诱导的猕猴中，在接受约10mg/kg的静脉抗体概要约6小时中，此类抗体抑制血清铁降低至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，或至少约100％
在成熟hepcidin-诱导的膜铁转运蛋白内化作用测定(如本文实施例3所述)中，本发明的抗体具有低于约200nM的IC50，优选的，低于约100nM，更优选的，低于约75nM，甚至更优选的，低于约50nM，或最优选的，低于约25nM。优选的，在成熟hepcidin-诱导的膜铁转运蛋白内化作用测定(如本文实施例3所述)中，本发明的抗体具有在约200nM和约25nM之间的IC50，更优选的，在约100nM和约50nM之间，更优选的，在约100nM和约25nM之间，甚至更优选的，在约75nM和约25nM之间，或最优选的，在约75nM和约50nM之间。
在另一个实施方案中，在hepcidin-诱导的膜铁转运蛋白内化作用测定(如本文实施例3所述)中，本发明的抗体具有在约200nM和约25nM之间的IC50，优选的，在约100nM和约50nM之间，更优选的，在约100nM和约25nM之间，甚至更优选的，在约75nM和约25nM之间，或最优选的，在约75nM和约50nM之间；在25℃通过SPR确定，所述抗体与人hepcidin-25的Koff速率在约1×10-2s-1和约1.8×10-4s-1之间，优选的，在约8.5×10-3s-1和约1.8×10-4s-1之间，更优选的，在约7.7×10-4s-1和约1.8×10-4s-1之间，甚至更优选的，在约6.5×10-4s-1和约1.8×10-4s-1之间，或最优选的，在约5.5×10-4s-1和约2.0×10-4s-1之间；并且所述抗体选择性结合人hepcidin-25，在25℃通过SPR确定，具有在约800pM和30pM之间的KD，优选的，在约400pM和约30pM之间，更优选的，在约200pM和约30pM之间，甚至更优选的，在约100pM和约30pM之间，甚至更优选的，在约75pM和50pM之间，或最优选的，在约50pM和30pM之间。
如本文中使用的，术语“Kabat编号”是本领域已知的，指编号氨基酸残基的系统，所述氨基酸残基比抗体的重链和轻链区域中的其它氨基酸残基更易变(即，超变的)(Kabat等人，Ann.NYAcad.Sci.190：382-93(1971)；Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，NIHPublicationNo.91-3242(1991))。
当多核苷酸置于与其它多核苷酸的功能性关联中时，其为“有效的连接的”。例如，如果其影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列是有效的连接的。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换的使用，指哺乳动物，优选的指人。在一些实施方案中，患者具有这样的障碍，所述障碍受益于降低的hepcidin-25水平，hepcidin-25生物活性的降低，和/或血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的增加。
术语“载体”指能够转运另一核酸的核酸分子，所述核酸分子与该另一核酸已经有效的连接，包括但不限于质粒和病毒载体。一些载体能够在它引入的宿主细胞内自主复制，而其它载体在引入宿主细胞后，可以整合到宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组一起复制。此外，一些载体能够指导其有效的连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简而言之，“表达载体”)。示例性的载体是本领域普遍已知的。
如本文中使用的，表述“细胞”和“宿主细胞”是可互换使用的，指任何原核细胞(例如，细菌细胞如大肠杆菌)或，优选的真核细胞(例如，酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，如CHO细胞)，不论其位于体外或体内。宿主细胞包括用一种或多种重组表达载体转化、转导、转染或感染的细胞，所述载体包含编码本发明的抗体的多核苷酸。宿主细胞可以位于体外或体内。例如，宿主细胞可以位于转基因动物或转基因植物内。
全长抗体的各重链包含N末端重链可变区(本文中为“HCVR”)和C末端重链恒定区。全长抗体的各轻链包含N末端轻链可变区(本文中为“LCVR”)和C末端轻链恒定区。HCVR和LCVR可以进一步再分为超变区，称为互补决定区(“CDR”)，其间散布着更保守的区域，称为框架区(“FR”)。抗体结合特定抗原或表位的功能性能力很大程度上受抗体可变区中存在的6个CDR的影响。每个HCVR和LCVR包括3个CDR(HCVR中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，LCVR中的LCDR1、LCDR2和LCDR3)和4个框架区，按以下顺序从氨基末端向羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
因此，如本文中使用的，术语“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区中发现的不连续的抗原结合位点。Kabat等人，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)，Kabat等人，Sequencesofproteinofimmunologicalinterest，(1991)，和Chothia等人，J.MoI.Biol.196：901-917(1987)以及MacCallum等人，J.MoI.Biol.，262：732-745(1996)已经描述了上述特定的区域，其中，所述定义包括了彼此相比较时氨基酸残基的重叠或子集。在本公开文本中，各结构域分配的氨基酸符合普遍已知的习惯(例如，Kabat，(1991)和/或Chothia(1987))。CDR含有大部分与抗原形成特异性相互作用的残基。
下表1和2描述了编码本发明的抗体的优选CDR的氨基酸序列和共有氨基酸序列。
表1
表1
Fab LCDR1 LCDR2 LCDR3
JXB7 SASSSVSSTYLH(SEQ ID NO：26) RTSTLAS(SEQ ID NO：30) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
31B2 SASSSVSSTYLH(SEQ ID NO：26) RTSTLAS(SEQ ID NO：30) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
Hu22 SASSRVSSTYLF(SEQ ID NO：43) RTSTLAS(SEQ ID NO：30) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
1 SLSSRVSSTYLF(SEQ ID NO：47) RTSTLAS(SEQ ID NO：30) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
2 SISSRVSSTYLF(SEQ ID NO：48) RTSTLAS(SEQ ID NO：30) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
3 SWSSRVSSTYLF(SEQ ID NO：49) RTSTLAS(SEQ ID NO：30) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
4 SAGSRVSSTYLF(SEQ ID NO：50) RTSTLAS(SEQ ID NO：30) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
5 SASSRVVSTYLF(SEQ ID NO：51) RTSTLAS(SEQ ID NO：30) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
6 SASSRVSSTYLF(SEQ ID NO：43) RTSPLAS(SEQ ID NO：53) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
7 SASSRVSSTYLF(SEQ ID NO：43) RTSALAS(SEQ ID NO：54) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
8 SASSRVSSTYLF(SEQ ID NO：43) RTSWLAS(SEQ ID NO：55) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
9 SASSRVSSTYLF(SEQ ID NO：43) RTSTGAS(SEQ ID NO：56) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
10 SASSRVSSTYLF(SEQ ID NO：43) RTSTLTS(SEQ ID NO：57) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
11 SASSRVSSTYLF(SEQ ID NO：43) RTSTLVS(SEQ ID NO：58) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
12 SASSRVSSTYLF(SEQ ID NO：43) RTSTLLS(SEQ ID NO：59) QQWSGYPFT(SEQ ID NO：31)
13 SASSRVSSTYLF(SEQ ID NO：43) RTSTLAS(SEQ ID NO：30) QQWSGYPFV(SEQ ID NO：61)
*共有 SX1X2SX3VSSTYLF(SEQ ID NO：52) RTSX4X5X6S(SEQ ID NO：60) QQWSGYPFX7(SEQ ID NO：62)
*X1是A，L，I，或W；X2是S或G；X3是R或S；X4是T，P，A，或W；X5是L或G；X6是A，T，V，或L；X7是T或V
表2
Fab HCDR1 HCDR2 HCDR3
JXB7 GYTFTIYPIE(SEQ ID NO：27) NFHPYNGDTNYNEKFKG(SEQ ID NO：28) GGTGSFDY(SEQ ID NO：46)
31B2 GYTFYIYPIS(SEQ ID NO：29) NFHPYKGLTNYNEKFKG(SEQ ID NO：33) GGTGSFDY(SEQ ID NO：46)
Hu22 GYTFTIYPIS(SEQ ID NO：32) NFHPYLGDTNYNEKFKG(SEQ ID NO：44) GGTGSFDY(SEQ ID NO：46)
14 GYTFLIYPIS(SEQ ID NO：63) NFHPYLGDTNYNEKFKG(SEQ ID NO：44) GGTGSFDY(SEQ ID NO：46)
15 GYTFWIYPIS(SEQ ID NO：64) NFHPYLGDTNYNEKFKG(SEQ ID NO：44) GGTGSFDY(SEQ ID NO：46)
16 GYTFTIYPIS(SEQ ID NO：32) NFHPYLGTTNYNEKFKG(SEQ ID NO：66) GGTGSFDY(SEQ ID NO：46)
17 GYTFTIYPIS(SEQ ID NO：32) NFHPYLGLTNYNEKFKG(SEQ ID NO：67) GGTGSFDY(SEQ ID NO：46)
18 GYTFTIYPIS(SEQ ID NO：32) NFHPYLGVTNYNEKFKG(SEQ ID NO：68) GGTGSFDY(SEQ ID NO：46)
19 GYTFTIYPIS(SEQ ID NO：32) NFHPYLGMTNYNEKFKG(SEQ ID NO：69) GGTGSFDY(SEQ ID NO：46)
20 GYTFTIYPIS(SEQ ID NO：32) NFHPYLGDANYNEKFKG(SEQ ID NO：70) GGTGSFDY(SEQ ID NO：46)
21 GYTFTIYPIS(SEQ ID NO：32) NFHPYLGDTNYNEKFKG(SEQ ID NO：44) GGFGSFDY(SEQ ID NO：72)
22 GYTFTIYPIS(SEQ ID NO：32) NFHPYLGDTNYNEKFKG(SEQ ID NO：44) GGTGAFDY(SEQ ID NO：73)
23 GYTFTIYPIS(SEQ ID NO：32) NFHPYLGDTNYNEKFKG(SEQ ID NO：44) GGTGSFPY(SEQ ID NO：74)
*共有 GYTFX8IYPIX9(SEQ ID NO：65) NFHPYLGX10X11NYNEKFKG(SEQ ID NO：71) GGX12GX13FX14Y(SEQ ID NO：75)
*X8是T，W，Y，或L；X9是S或E；X10是D，T，L，V，或M；X11是T或A；X12是T或F；X13是S或A；X14是D或P
下表3中提供了编码本发明抗体的更优选CDR的氨基酸序列和共有氨基酸序列的SEQIDNO。
表3
Fab LCDR1SEQ IDNO： LCDR2SEQ IDNO： LCDR3SEQ IDNO： HCDR1SEQ IDNO： HCDR2SEQ IDNO： HCDR3SEQ IDNO：
1.5 43 57 61 63 80 46
1.7 43 58 61 32 81 46
1.10 43 53 61 63 82 46
1.13 43 57 61 63 83 46
1.15 43 30 61 63 82 46
3.2 43 53 61 63 84 46
3.6 43 53 61 32 84 46
3.7 43 57 61 63 85 46
3.8 43 53 31 63 84 46
3.9 43 53 61 63 86 46
3.12 43 57 61 63 84 46
3.23 43 53 61 63 85 46
Hu22 43 30 31 32 44 46
L1.5 41 53 31 63 84 46
H1.39 43 53 31 78 84 46
＊共有 42 76 62 79 87 46
人轻链恒定区分为κ或λ，由本领域已知的特定恒定区来表征。人重链恒定区分为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，其中一些还可以进一步分成亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。各重链类型具有有本领域容易已知序列的特定恒定区。轻链恒定区κ和重链恒定区IgG1、IgG2和IgG4是本发明抗体的优选的恒定区。本发明抗体的优选的人重链恒定区是SEQIDNO：90-94中所示重链恒定区氨基酸序列，及其任何具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或约15个氨基酸改变(包括取代、插入或缺失)的变体。更优选的，本发明抗体的人重链恒定区是SEQIDNO：93和94中所示重链恒定区氨基酸序列。最优选的，本发明抗体的人重链恒定区是SEQIDNO：93所示的重链恒定区氨基酸序列。本发明抗体的优选的人轻链恒定区是SEQIDNO：89所示的轻链恒定区κ氨基酸序列，及其任何具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或约10个氨基酸改变(包括取代、插入或缺失)的变体。最优选的，本发明抗体的人轻链恒定区是SEQIDNO：89中所示的轻链恒定区κ氨基酸序列。
如本文中使用的，“抗原结合区”或“抗原结合部分”指抗体分子在可变区内的部分，其含有与抗原相互作用的氨基酸残基，并产生抗体对抗原的特异性和亲和力。该抗体部分包括维持抗原结合残基的正确构象所必需的框架氨基酸残基。
本发明包括这样的抗体，所述抗体选择性结合hepcidin-25，在25℃通过SPR确定，具有约800pM或更低的KD，并且其中抗体包括至少一个CDR，其选自：i)具有SEQIDNO：75所示氨基酸序列的HCDR3，和ii)具有SEQIDNO：62所示氨基酸序列的LCDR3。优选的，此类抗体包括含有选自以下的氨基酸和/或共有氨基酸序列的6个CDR：(i)分别具有SEQIDNO：52、60、62、65、71和75所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；和(ii)分别具有SEQIDNO：42、76、62、79、87和46所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。更优选的，本发明的抗体包括6个CDR，选自：(i)分别具有SEQIDNO：41、53、31、63、84和46所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；(ii)分别具有SEQIDNO：43、30、31、32、44和46所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；(iii)分别具有SEQIDNO：43、53、61、63、85和46所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；和(iv)分别具有SEQIDNO：43、57、61、63、84和46所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。甚至更优选的，发明的抗体包括两条重链多肽和两条轻链多肽，其中，每条重链多肽具有SEQIDNO：9中所示的氨基酸序列，每条轻链多肽具有SEQIDNO：17中所示的氨基酸序列。甚至更优选的，抗体在实施例3描述的hepcidin-诱导的膜铁转运蛋白内化作用测定中，具有在约100nM和约50nM之间的IC50；在25℃通过SPR确定，与人hepcidin-25的Koff速率在约5.5×10-4s-1和约2.0×10-4s-1之间；以及选择性的结合人hepcidin-25，具有在约100pM和约50pM之间的KD。最优选的，发明的抗体包括两条重链多肽和两条轻链多肽，其中，每条重链多肽具有SEQIDNO：8中所示的氨基酸序列，每条轻链多肽具有SEQIDNO：16中所示的氨基酸序列，其中，抗体在实施例3描述的hepcidin-诱导的膜铁转运蛋白内化作用测定中，具有在约100nM和约50nM之间的IC50；在25℃通过SPR确定，与人hepcidin-25的Koff速率在约5.5×10-4s-1和约2.0×10-4s-1之间；以及选择性的结合人hepcidin-25，具有在约100pM和约50pM之间的KD。
发明的其它优选的抗体包括具有选自SEQIDNO：124、125、126和127的氨基酸序列的LCVR。更优选的，发明的抗体包括具有选自SEQIDNO：148、128、150和151的氨基酸序列的HCVR。甚至更优选的，发明的抗体包括SEQIDNO：126的LCVR和SEQIDNO：148的HCVR。甚至更优选的，发明的抗体包括SEQIDNO：127的LCVR和SEQIDNO：128的HCVR。甚至更优选的，发明的抗体包括SEQIDNO：125的LCVR和SEQIDNO：151的HCVR。发明的最优选的抗体包括SEQIDNO：124的LCVR和SEQIDNO：150的HCVR。此类LCVR优选的连接轻链恒定区，所述轻链恒定区是人来源的或源自人来源的轻链恒定区，优选的是人κ链，最优选的是SEQIDNO：89的κ链。此类HCVR优选的连接重链恒定区，所述重链恒定区是人来源的或源自人来源的重链恒定区，优选的是IgG1、IgG2或IgG4，更优选的是包含选自SEQIDNO：90、91、92、93和94的氨基酸序列的重链恒定区，最优选的是包含SEQIDNO：93的氨基酸序列的重链恒定区。优选的，抗体在实施例3描述的hepcidin-诱导的膜铁转运蛋白内化作用测定中，具有在约100nM和约50nM之间的IC50；在25℃通过SPR确定，与人hepcidin-25的Koff速率在约5.5×10-4s-1和约2.0×10-4s-1之间；以及选择性的结合人hepcidin-25，具有在约100pM和约50pM之间的KD。
发明的抗体可以包括具有SEQIDNO：6所示的氨基酸序列的重链多肽，和具有SEQIDNO：14所示的氨基酸序列的轻链多肽。具有SEQIDNO：6所示的氨基酸序列的重链多肽可以由SEQIDNO：2的多核苷酸序列编码。具有SEQIDNO：14所示的氨基酸序列的轻链多肽可以由具有SEQIDNO：10所示的核酸序列的多核苷酸编码。
发明的抗体包括具有SEQIDNO：7所示的氨基酸序列的重链多肽，和具有SEQIDNO：15所示的氨基酸序列的轻链多肽。具有SEQIDNO：7所示的氨基酸序列的重链多肽可以由SEQIDNO：3的多核苷酸序列编码。具有SEQIDNO：15所示的氨基酸序列的轻链多肽可以由具有SEQIDNO：11所示的核酸序列的多核苷酸编码。
发明的抗体还包括具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列的重链多肽，和具有SEQIDNO：16所示的氨基酸序列的轻链多肽。具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列的重链多肽可以由SEQIDNO：4所示的多核苷酸序列编码。具有SEQIDNO：16所示的氨基酸序列的轻链多肽可以由具有SEQIDNO：12所示的核酸序列的多核苷酸编码。
在另一个实施方案中，发明的抗体包括具有SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的重链多肽，和具有SEQIDNO：17所示的氨基酸序列的轻链多肽。具有SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的重链多肽可以由SEQIDNO：5的多核苷酸序列编码。具有SEQIDNO：17所示的氨基酸序列的轻链多肽可以由具有SEQIDNO：13所示的核酸序列的多核苷酸编码。
本发明优选的人体工程化的抗体在本文中指MabsL1.5、Hu22、3.12和3.23。下表4中提供了编码MabsL1.5、Hu22、3.12和3.23的重链、轻链、重链和轻链可变区，以及CDR的氨基酸序列的SEQIDNO。
表4
Mab 重链 轻链 HCVR HCCDR1 HCCDR2 HCCDR3 LCVR LCCDR1 LCCDR2 LCCDR3
L1.5 6 14 148 63 84 46 126 41 53 31
Hu22 7 15 128 32 44 46 127 43 30 31
3.12 8 16 150 63 84 46 124 43 57 61
3.23 9 17 151 63 85 46 125 43 53 61
使用标准分子生物学技术制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化体，分离生产发明抗体的宿主细胞系，培养这些宿主细胞并从培养基中回收抗体。
本发明还针对表达发明的抗hepcidin抗体的宿主细胞。本领域已知多种宿主表达系统可用于表达本发明的抗体，包括原核的(细菌)和真核的表达系统(例如，酵母、杆状病毒、植物、哺乳动物和其它动物细胞、转基因动物和杂交瘤细胞)，以及噬菌体展示表达系统。
可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白的轻链和重链基因来制备本发明的抗体。为了重组表达抗体，用一个或多个具有DNA片段(其编码抗体的免疫球蛋白轻链和/或重链)的重组表达载体对宿主细胞进行转化、转导、感染等等，从而使得轻链和/或重链在宿主细胞中表达。可在一个载体中从与重链和轻链有效连接的不同的启动子独立地表达重链和轻链，或可选择地，可在两个载体(一个表达重链，一个表达轻链)中从与重链和轻链有效连接的不同的启动子独立地表达重链和轻链。任选地可在不同的宿主细胞中表达重链和轻链。
此外，重组表达载体可以编码有利于抗体轻链和/或重链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体轻链和/或重链基因可以克隆到载体中，使信号肽有效的符合读框地连接到抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源的信号肽。优选的，重组抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中，从中可以回收或纯化抗体。
通过将HCVR-编码DNA与编码重链恒定区的另一DNA分子有效的连接，可以将编码HCVR的分离的DNA转变为全长重链基因。人以及其它哺乳动物的重链恒定区基因的序列是本领域已知的。可以通过例如标准PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是任何类型(例如，IgG、IgA、IgE、IgM或IgD)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或亚类恒定区，及其任何的同种异型变体，如Kabat(上文)中所述。
通过将LCVR-编码DNA与编码轻链恒定区的另一DNA分子有效的连接，可以将编码LCVR区的分离的DNA转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人以及其它哺乳动物的轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。通过标准PCR扩增可以获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
除了抗体的重链和/或轻链基因外，本发明的重组表达载体还携带控制宿主细胞中抗体链基因的表达的调控序列。术语“调控序列”希望包括启动子、增强子和当需要时控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。表达载体的设计(包括调控序列的选择)可以依赖于这样的因素例如待转化的宿主细胞的选择、希望的蛋白质的表达水平。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来自细胞巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和/或多瘤病毒的启动子和/或增强子。
此外，本发明的重组表达载体可具有额外的序列，例如在宿主细胞中调控载体的复制的序列(例如，复制起点)和一个或更多个选择标记基因。选择标记基因有助于已导入载体的宿主细胞的选择。例如，通常选择标记基因在已导入载体的宿主细胞中提供对药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(用于使用氨甲蝶呤进行选择/扩增的dhfr负型宿主细胞)、neo基因(用于G418选择)和在GS阴性细胞系(例如NS0)中用于选择/扩增的谷氨酰胺合成酶(GS)。
为了表达轻链和/或重链，通过标准的技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染、转导、感染等将编码重链和/或轻链的表达载体导入宿主细胞。尽管理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但真核细胞是优选的，最优选哺乳动物宿主细胞，因为此类细胞更可能装配和分泌正确折叠的和具有免疫活性的抗体。优选的用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)[包括Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-20，1980中描述的、与例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159：601-21，1982中描述的DHFR选择标记一起使用的dhfr负型CHO细胞]、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2/0细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过一段时间培养宿主细胞来产生抗体，所述时间足以允许抗体在宿主细胞中表达或更优选允许抗体分泌入其中宿主细胞在本领域已知的适当条件下生长的培养基中。可使用标准的纯化方法从宿主细胞和/或培养基回收抗体。
还可通过常规的技术将宿主细胞用于产生完整抗体的部分或片段例如Fab片段或scFv分子。例如，可能希望用编码本发明的抗体的轻链或重链的DNA转染宿主细胞。也可以使用重组DNA技术除去一些或所有编码对于结合人hepcidin-25不是必需的轻链或重链之一或轻链和重链二者的DNA。本发明的抗体也包括从此类截短的DNA分子表达的分子。
发明提供了包含本发明的核酸分子的宿主细胞。优选的，发明的宿主细胞包括一种或多种载体或构建体，所述载体或构建体包含本发明的核酸分子。例如，发明的宿主细胞是已经引入了发明的载体的细胞，所述载体包含编码发明抗体的LCVR的多核苷酸和/或编码发明的HCVR的多核苷酸。发明还提供了其中已经引入了两个发明载体的宿主细胞；一种包含编码发明抗体的LCVR的多核苷酸，一种包含编码存在于发明抗体中的HCVR的多核苷酸，各自有效的连接增强子/启动子调控元件(例如，源自SV40、CMV、腺病毒等，如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)，来驱动基因的高水平转录。
一旦表达，就可以根据本领域标准程序纯化本发明的完整抗体、单独的轻链和重链，或其他的免疫球蛋白形态，所述程序包括硫酸铵沉淀、离子交换、亲和(例如，蛋白A)、反相、疏水相互作用柱层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳等。用于治疗性抗体纯化的标准程序描述在，例如FengLi，JoeX.Zhou，XiaomingYang，TimTressel和BrianLee在名为“CurrentTherapeuticAntibodyProductionandProcessOptimization”的文中描述的(BioProcessingJournal，Sept./Oct.2005)。此外，从重组表达的抗体制品中去除病毒的标准技术也是本领域已知的(参见例如，GerdKern和ManiKrishnan，“ViralRemovalbyFiltration：PointstoConsider”(BiopharmInternational，Oct.2006))。已知从治疗性抗体制品中过滤去除病毒的效率至少部分的取决于过滤溶液中蛋白质和/或抗体的浓度。本发明抗体的纯化过程可以包括从一次或多次层析操作的主流中过滤去除病毒的步骤。优选的，在通过药品级纳米滤膜过滤去除病毒前，稀释或浓缩含有本发明抗体的层析主流，产生约1g/L至约3g/L的总蛋白和/或总抗体浓度。甚至更优选的，纳米滤膜是DV20纳米滤膜(例如，PallCorporation；EastHills，NY)。对于制药用途，具有至少约90％、约92％、约94％或约96％的均质性(homogeneity)的基本纯的免疫球蛋白是优选的，约98％至约99％或更高均质性是最优选的。一旦纯化，不论是部分的或达到理想的均质性，无菌的抗体都可进行治疗性应用，如本文中所述，
根据上述讨论，本发明还针对通过这样的方法可获得的抗体，所述方法包括培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞包括但不限于已经用包含编码发明抗体的核酸分子的多核苷酸或载体转化的哺乳动物、植物、细菌、转基因动物或转基因植物细胞，从而表达核酸，以及任选的，从宿主细胞培养基中回收抗体。优选的，宿主细胞包括含有核酸分子的载体，所述核酸分子编码具有如SEQIDNO：14、15、16或17所示氨基酸序列的轻链多肽。更优选的，宿主细胞包括含有核酸分子的载体，所述核酸分子如SEQIDNO：12或13所示。甚至更优选的，转化的宿主细胞是中国仓鼠卵巢、NS0骨髓瘤、COS或SP2/0细胞。
本发明还针对生产发明的抗体的方法，包括转化宿主细胞的步骤，所述细胞包括但不限于具有包含编码发明抗体的核酸分子的多核苷酸或载体的哺乳动物、植物、细菌、转基因动物或转基因植物细胞，从而表达核酸，并从宿主细胞培养基中回收抗体。优选的，用包含这样的核酸分子的载体转化宿主细胞，所述核酸分子编码具有如SEQIDNO：14、15、16或17所示氨基酸序列的轻链多肽。更优选的，用包含如SEQIDNO：12或13所示的核酸分子的载体转化宿主细胞。甚至更优选的，宿主细胞是中国仓鼠卵巢、NS0骨髓瘤、COS或SP2/0细胞。
如本文中使用的，术语“分离的多核苷酸”应该意指基因组的多核苷酸、cDNA或合成来源的，或其一些组合，根据其来源，分离的多核苷酸(1)与在其中天然发现所述分离的多核苷酸的全部或部分多核苷酸不相关，(2)与其天然不连接的多核苷酸相连，或(3)天然的不作为较大序列的一部分而存在。
术语“分离的蛋白质”在本文中意指这样的主题蛋白质，所述主题蛋白质(1)不含至少一些通常会发现的其它蛋白质，(2)基本不含来自同一来源的其它蛋白质，如来自相同物种的，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已经与至少约50％的其天然相关的多核苷酸、脂类、碳水化合物或其它材料分离，(5)与“分离的蛋白质”(通过共价或非共价的相互作用)天然相关的部分蛋白质不相关，(6)与其天然不相关的多肽(通过共价或非共价的相互作用)有效的关联，或(7)天然不存在。此类分离的蛋白质可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA，合成来源的，或其任意的组合来编码。优选的，分离的蛋白质是从在其天然环境中发现的蛋白质或多肽或其它污染物中基本纯化的，所述蛋白质或多肽或其它污染物会干扰它的(治疗性、诊断性、预防性、研究或其它)应用。
“分离的”抗体是已鉴定的，并从其天然环境的组分中分离和/或回收的。其天然环境的污染组分是可以干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，可包括酶、激素和其它蛋白的或非蛋白的溶质。在优选的实施方案中，抗体可以纯化至(1)通过Lowry方法确定，以抗体重量计大于95％，最优选的，以重量计大于99％，(2)通过使用旋转杯序列分析仪(spinningcupsequenator)足以获得至少15个残基的N末端或中间的氨基酸序列的程度，或(3)在还原或非还原条件下的SDS-PAGE中是均质性，使用考马斯兰或优选的银染。分离的抗体包括在重组细胞原位的抗体，因为抗体的天然环境中的至少一种组分是不存在的。
如本文中使用的，“基本纯的”或“基本纯化的”意指化合物或种类是存在的主导种类(即，基于摩尔数是比组合物中任何其它单个种类更丰富的)。在一些实施方案中，基本纯化的组合物是这样的组合物，其中种类包括所有存在的大分子种类的至少约50％(基于摩尔数)。在一些实施方案中，基本纯的组合物将包括组合物中存在的所有大分子种类的多于约80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，种类纯化至基本均质的(通过常规的检测方法不能在组合物中检测到污染物)，其中组合物基本上由单个大分子种类组成。
本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码选自SEQIDNO：124、125、126、127、128、148、150和151的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含多核苷酸的重组表达载体，所述多核苷酸编码选自SEQIDNO：124、125、126、127、128、148、150和151的氨基酸序列。
如本文中使用的，词组“人体工程化的抗体”指至少一部分是人来源的抗体。此外，如本文中使用的，词组“人体工程化的抗体”指本文中公开的特定抗体，以及其它的抗体，所述其它抗体是根据发明与本文公开的抗体具有相似的功能性质，并且具有基本上人或完全人的框架区，围绕源自非人抗体的CDR。基本上人的框架是与已知的人种系框架序列具有至少80％序列同一性的框架。优选的，基本上人的框架与已知的人种系框架序列具有至少约85％、约90％、约95％或约99％的序列同一性。最优选的，本发明的人体工程化的抗体含有最少的序列源自非人抗体。
例如，人体工程化的抗体可以包括源自非人来源(例如小鼠)的抗体的部分，以及源自人来源的抗体的部分，(两部分)相互连接，例如通过常规技术化学连接(例如合成)，或使用遗传工程技术作为连续多肽来制备。如本文中使用的，当术语“框架”涉及抗体可变区使用时，成为表示在抗体可变区内CDR外的所有氨基酸残基。如本文中使用的，术语“框架区”意在表示由CDR分隔的框架的各个结构域。相似地，轻链框架区由各轻链可变区CDR分隔。优选的，轻链可变区和/或重链可变区包括框架或至少一部分框架区(例如，含有2个或3个亚区，如FR2和FR3)。更优选的，至少FRL1、FRL2、FRL3或FRL4是完全人的，或至少FRH1、FRH2、FRH3或FRH4是完全人的。甚至更优选的，至少FRL1、FRL2、FRL3或FRL4是种系序列(例如，人种系)，或包括本领域已知的特定框架的人共有序列，和/或至少FRH1、FRH2、FRH3或FRH4是种系序列(例如，人种系)，或包括特定框架的人共有序列。在优选的实施方案中，本发明的抗体包括人种系轻链框架序列和人种系重链框架序列(参见例如，PCTWO2005/005604)。更优选的，人种系轻链框架选自：A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、L1、L11、L12、L2、L5、L6、L8、O12、O18、O2和O8。甚至更优选的，人种系轻链框架是O2或O18。最优选的，人种系轻链框架是O2。此外，优选的人种系重链框架选自：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VH1-24、VH1-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VH1-18、VH1-69、VH3-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59、VH5-51、VH3-73、VH1-58、VH1-3和VH1-2。甚至更优选的，人种系重链框架是VH1-69或VH1-18。最优选的，人种系重链框架是VH1-69。
可以使用一些不同的方法来产生除本文公开以外的人体工程化抗体，所述抗体选择性的结合人hepcidin-25，具有根据本发明的功能性质。本文公开的特定抗体可用作模板或亲代抗体来产生其他抗体。在一种方法中，将亲代抗体CDR移植到与亲代抗体框架具有高序列同一性的人框架上。新框架与亲代抗体中的相应框架的序列同一性通常是至少80％、至少85％、或至少90％。该移植可以导致结合亲和力低于亲代抗体。如果是这样的情况，根据Queen等人公开的特定规则，可以在一些位置将框架回复突变(back-mutated)为亲代框架。鉴别考虑回复突变的残基可以如下进行：当氨基酸落入以下类别时，用来自亲代抗体框架(供体框架)的框架氨基酸取代所使用的人种系序列的框架氨基酸(受体框架)：
(a)受体框架的人框架中的氨基酸对人框架的该位置是不常见的，而在供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对人框架的该位置是典型的；
(b)氨基酸的位置紧邻CDR之一；或
(c)在三维免疫球蛋白模型中[Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，2869(1991)]，框架氨基酸的任何侧链原子都位于CDR氨基酸的任何原子的约5-6埃(中心至中心)范围内。
当受体框架的人框架中的各氨基酸和供体框架中相应的氨基酸对人框架的该位置是不常见的时，可以通过人框架的该位置典型的氨基酸来取代此类氨基酸。该回复突变规则使抗体恢复亲代的活性。
另一种方法可以是随机突变移植的CDR而不改变框架，筛选此类抗体中结合亲和力类似或优于亲代抗体的。此外，可以组合上述两种方法。在移植后，除了造成CDR改变以外，可以回复突变特定的框架区。该常规方法描述在Wu等人，(1999)，“HumanizationofamurinemonoclonalantibodybysimultaneousoptimizationofframeworkandCDRresidues”，J.Mol.Biol.，294：151-162中。
如本文中使用的，术语“供体”意在表示亲代抗体分子或其片段，从中来源的一部分给予或作用于另一种抗体分子或其片段，从而使接受的分子产生亲代分子的结构或功能特征。对于CDR移植的特殊示例，移植CDR来源的亲代分子就是供体分子。供体CDR使接受的分子产生亲代分子的结合亲和力。可以理解，供体分子不需要来自与接受分子或其片段不同的物种。但是，供体必须是分离的和不同的分子。
如本文中使用的，术语“受体”意在表示这样的抗体分子或其片段，其接受了来自亲代或供体抗体分子或其片段的贡献部分。因此，受体抗体分子或其片段被赋予了亲代分子的贡献部分的结构或功能特征。对于CDR移植的特殊示例，移植CDR的接受分子就是受体分子。受体抗体分子或片段被赋予了供体CDR或亲代分子的结合亲和力。类似供体分子，可以理解，受体分子不需要来自与供体不同的物种。
当“可变区”涉及抗体或其重链或轻链使用时，意在表示抗体的氨基端部分，其使分子产生抗原结合，且不是恒定区。术语意在包括其功能性片段，所述片段保留了完整可变区的全部结合功能的一部分。因此，术语“异聚(heteromeric)可变区结合片段”意在表示装配成异聚复合体的至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区或其功能性片段。异聚可变区结合片段包括例如，功能性片段如Fab、F(ab)2、Fv、单链Fv(scFv)等。此类功能性片段是本领域技术人员已知的。因此，使用上述术语描述异聚可变区的功能性片段意在对应本领域技术人员已知的定义。此类术语描述在例如，Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork(1989)；Molec.BiologyandBiotechnology：AComprehensiveDeskReference(Myers，R.A.(编著)，NewYork：VCHPublisher，Inc.)；Huston等人，CellBiophysics，22：189-224(1993)；和Skerra，Meth.Enzymol.，178：497-515(1989)和Day，E.D.，AdvancedImmunochemistry，第2版，Wiley-Liss，Inc.，NewYork，NY(1990)。
优选的，人体工程化的抗体具有起源或源自亲代抗体的CDR，即，非人抗体，优选的小鼠抗体或其片段，如小鼠FabJXB7，而框架和恒定区以其存在的程度(或其显著的或主要的部分，即至少约90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)由存在于人种系免疫球蛋白区域的核酸序列信息(参见例如，国际ImMunoGeneTics数据库)编码，或以其重组的或突变的形式，不论所述抗体是否在人细胞中生产。优选的，人体工程化的抗体的至少2、3、4、5或6个CDR是从衍生人体工程化抗体的非人亲代抗体的CDR优化的，来产生理想的性质，例如改善的特异性、亲和力或内化作用，所述性质可以通过筛选测定来鉴别，例如ELISA测定。优选的，发明的抗体包含与亲代小鼠FabJXB7(即，SEQIDNO：46)的HCDR3相同的HCDR3，以及HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2和LCDR3，与亲代小鼠FabJXB7中存在的CDR相比，包含至少1个氨基酸取代。与亲代小鼠FabJXB7相比，发明的人体工程化抗体的CDR中的一些氨基酸取代降低了抗体不稳定性的可能性(例如，去除一个或多个CDRAsn残基)，或降低了抗体施用于人受试者时的免疫原性的可能性(例如，通过IMMUNOFILTERTMTechnology(Xencor，Inc.，Monrovia，CA)预测的)。
人体工程化抗体可以使用本领域常规使用的方法进行体外突变，因此，人体工程化重组抗体的HCVR和LCVR的框架区氨基酸序列是这样的序列，所述序列源自与人种系HCVR和LCVR序列相关的序列，可以不天然的存在于体内的人抗体种系库中。认为人体工程化的重组抗体的HCVR和LCVR框架的此类氨基酸序列与人种系序列至少约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约98％，或更优选的至少约99％，或最优选的100％相同。因此，人体工程化的抗体可以包括在受体抗体和亲代抗体输入的CDR或框架序列中都未发现的残基。
本领域有多种方法可用于产生人体工程化的抗体(参见例如，PCT国际专利申请公开号WO2006/06046935；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：2869(1991)；Jones等人，Nature，321：522(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；和Verhoeyen等人，Science，239：1534(1988))。例如，可以通过获得编码亲代抗体(例如，小鼠抗体或杂交瘤产生的抗体)的HCVR和LCVR的核酸序列，所述亲代抗体选择性结合hepcidin-25，鉴别所述(非人)HCVR和LCVR中的CDR，将此类CDR-编码核酸序列移植到选定的人框架编码核酸序列上，来生产人体工程化的抗体。任选的，在将CDR区移植到框架之前，可以通过随机地或在特定位置进行突变来用不同的氨基酸取代CDR中的一个或多个氨基酸，从而优化CDR区。可选的，利用本领域技术人员可获得的方法，可以在插入到人框架之后，优化CDR区。
在将CDR-编码序列移植到选定的人框架编码序列上之后，表达所获得的编码人体工程化的可变重链和可变轻链序列的DNA序列，来生产选择性结合hepcidin-25的人体工程化抗体。人体工程化的HCVR和LCVR可以作为完整的抗hepcidin-25抗体分子的一部分表达，即，作为具有人恒定结构域序列的融合蛋白。然而，HCVR和LCVR序列也可以在缺少恒定序列的条件下表达，例如生产人体工程化的抗hepcidin-25选择性Fv或Fab(参见例如，Watkins，J.等人，Anal.Biochem.，253：37-45(1997)和Watkins，J.等人，Anal.Biochem.256：169-177，(1998))。
可以理解，运用本发明教导的内容，本领域技术人员可以使用常规技术(例如，定点诱变)来取代、添加或删除本文公开的特定CDR和框架序列中的氨基酸，如此产生源自本文提供的序列的其它可变区氨基酸序列。在特定的取代位点，可以引入高至总计21种可选的天然存在的氨基酸。最终，技术人员可运用体外或体内筛选技术，如本文实施例2中描述的，来选择具有与hepcidin多肽理想的结合亲和力的Fab片段的可变区氨基酸序列。以该方式，还可以鉴别其它适合制备根据本发明的抗hepcidin抗体的Fab片段。优选的，在框架内的氨基酸取代、添加和缺失限于本文公开的1个或各个框架区序列(即，FRL1、FRL2、FRL3、FRL4、FRH1、FRH2、FRH3、FRH4)中的1、2、3或4个位置。优选的，CDR内的氨基酸取代、添加和缺失限于1个或各个CDR中的1至3个位置，更优选的，在1个或各个CDR中的1或2个氨基酸位置实施取代、添加和缺失。更优选的，在重链可变区的CDR中的1或2个氨基酸位置实施氨基酸的取代、添加和缺失。最优选的，在CDRH2中的1或2个氨基酸位置实施氨基酸的取代、添加和缺失。
然后表达所获得的编码人体工程化的可变重链和可变轻链序列的DNA序列，产生以高亲和力选择性结合人hepcidin-25的人体工程化抗体。人体工程化的HCVR和LCVR可以作为完整的抗hepcidin-25抗体分子的一部分表达，即，作为具有人恒定结构域序列的融合蛋白。
发明的另一方面提供了在相对简单但高灵敏度和选择性的免疫测定中使用发明的抗体的方法，用于诊断和预后的目的，在人组织和生物学流体中检测和测量成熟hepcidin。
本发明的抗体提供了精确地检测或确定在人的组织或生物学流体中成熟hepcidin的量的方式，用于评估对于成熟hepcidin促进性障碍的易感性，以及用于在患有此类障碍的患者中检测和诊断此类障碍。例如，发明的抗体可以与灵敏且可信的免疫测定结合，例如ELISA、RIA、免疫扩散测定或免疫检测测定(如SPR检测)。相似的，本发明的抗体还可用于组织或生物学流体样品的免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)测定。此类分析可用于检测hepcidin-25的异常水平，从而诊断hepcidin-25促进性障碍。更特别地，本发明提供了在患者中诊断人成熟hepcidin促进性障碍的方法，通过确定患者的组织或生物学流体样品中人成熟hepcidin的水平，以及将样品中的人成熟hepcidin的水平与来自一个或多个对照个体的相应样品中的人成熟hepcidin的水平或与标准参照进行比较，从而检测与升高的人成熟hepcidin水平相关的障碍。疾病状态可以包括与降低的血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容相关的一种或多种遗传的或非遗传的疾病。优选的，疾病状态可以包括一种或多种与贫血相关的障碍。
还提供了在患者中监控人成熟hepcidin促进性疾病、障碍或病症的方法。方法包括在第一时间点确定患者的组织或生物学流体样品中人成熟hepcidin的水平，所述患者是患有人成熟hepcidin促进性疾病、障碍或病症或有所述疾病、爱或病症风险的患者；在一个或多个不同的时间点，确定患者的一个或多个组织或生物学流体样品中人成熟hepcidin的水平；比较在不同时间点确定的人成熟hepcidin的水平，从而监控人成熟hepcidin促进性疾病或病症。
当用于高通量方法时，本发明的人成熟hepcidin的选择性抗体是特别有效的。此类方法包括微芯片和微阵列方法，从而多个样品可以在微量培养板或载玻片或其它本领域已知的测定底物上进行测试。
通过在适合形成抗原-抗体复合物的条件下，将生物学样品与例如本发明的抗体结合，可以确定生物学样品中人成熟hepcidin的存在或其水平。用可检测的部分直接或更优选的，间接的标记抗体，有利于检测结合的或未结合的抗体。多种免疫复合体形成的检测方法是本领域熟知的，例如ELISA、RIA、免疫印迹(例如，点渍法、狭线印迹、western印迹等)、间接免疫荧光技术和依赖于检测物理参数改变的方法，例如SPR等。此类应用包括使用与可检测部分缀合的发明的hepcidin-25选择性抗体检测生物学样品中的hepcidin的方法，例如在人生物学流体中，或在细胞或组织提取物中。此类测定可以使用用可检测部分修饰或未修饰的发明的抗体。如果用可检测的部分修饰，则可以通过可检测部分的共价或非共价连接来修饰发明的抗体。如本文中使用的，术语“可检测的”描述了物质(缀合物、化合物或部分)的特征，所述特征允许使用已知的分析技术，通过检测仪鉴别或追踪物质。可检测部分的代表性实例包括但不限于：生色团、荧光部分、发磷光部分、发光部分、放射性部分、多种酶(例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)、磁性部分(例如抗磁性、顺磁性和铁磁性(ferromagnetic)材料)以及重金属聚簇，以及任何其它已知的可检测部分。可以通过本领域已知的各种方法定量所形成的抗体-抗原标准复合物的量，例如，光度或比色的方法。优选的，根据本领域熟知的方法，所使用的发明抗体没有修饰，即，是间接标记的。
发明包括在生物学样品中检测人成熟hepcidin蛋白的方法，包括在一定条件下将发明的抗体与生物学样品孵育一段时间(所述时间足以使所述抗体结合人成熟hepcidin蛋白)，以及检测所述结合。
本发明还提供了用于筛选怀疑含有人成熟hepcidin多肽的样品的组合物、方法和试剂盒。此类筛选可以实施于患者样品，或怀疑含有或产生此类多肽的实验室样品。试剂盒可以包括本发明的hepcidin-25选择性抗体。试剂盒可以包括合适的缓冲液和试剂，用于检测在样品和本发明的hepcidin-25选择性抗体之间的相互作用。所提供的试剂可以是放射性标记的、荧光标记的或酶标记的物质，其能够与本发明的抗体，例如抗小鼠IgG抗体，结合或相互作用。
试剂盒的试剂可以以液体溶液、与固体支持物连接或作为干燥粉末的形式提供。当在液体溶液中提供试剂时，优选的，液体溶液是水溶液。优选的，当提供的试剂与固体支持物连接时，固体支持物可以是层析基质、具有多个孔的测试平板，或显微镜载玻片。当提供的试剂是干燥粉末时，所述粉末可以通过添加合适的溶剂来重建，所述溶剂也可以由试剂盒提供。
在容器中提供发明的试剂盒，所述容器通常包括装入抗体、抗原或检测试剂的小瓶，优选的是适量等分的。本发明的试剂盒还可以通常包括容纳抗体、抗原和试剂容器供商业出售的工具。此类容器可以包括塑料容器，其中保存着所需要的小瓶和一种或多种必需的化学品，例如层析材料、溶剂和洗脱剂、试管、去垢剂、抗体和用于检测反应的化学品。
发明的抗体可用于诊断与成熟hepcidin的活性相关的障碍或疾病。以相似的方式，发明的抗体可以在测定中使用来监控受试者中的成熟hepcidin水平，所述受试者是被治疗成熟hepcidin促进的病症、疾病或障碍。此类应用包括这样的方法，所述方法使用发明的抗体和标记来检测生物学样品中的成熟hepcidin，例如在人体流体中或在细胞或组织提取物中。可以在修饰或不修饰的条件下使用发明的抗体，其可以通过共价或非共价连接可检测部分来标记。
本领域已知多种用于测量生物学样品中的蛋白质水平的常规程序，包括例如ELISA、RIA和FACS，为诊断改变或异常的成熟hepcidin表达水平提供了基础。利用任何已知技术确定样品中存在的正常或标准的hepcidin水平，例如通过在适合形成抗原：抗体复合物的条件下，将含有成熟hepcidin多肽的样品与例如发明的抗体结合。抗体用可检测的物质直接或间接的标记，以有利于检测结合或未结合的抗体。合适的可检测的物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。通过多种方法定量所形成的标准复合物的量，例如光度法。然后，将样品中存在的成熟hepcidin多肽的量与标准值比较。在诊断、预后和/或监控性的测定、试剂盒和方法中使用的优选的抗体具有(i)具有SEQIDNO：6所示的氨基酸序列的重链多肽，和具有SEQIDNO：14所示的氨基酸序列的轻链多肽；(ii)具有SEQIDNO：7所示的氨基酸序列的重链多肽，和具有SEQIDNO：15所示的氨基酸序列的轻链多肽；(iii)具有SEQIDNO：9所示的氨基酸序列的重链多肽，和具有SEQIDNO：17所示的氨基酸序列的轻链多肽；或(iv)具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列的重链多肽，和具有SEQIDNO：16所示的氨基酸序列的轻链多肽。
分离的发明的hepcidin-25选择性抗体可用于疗法，优选的，人疗法。
当向需要其的人类受试者施用有效量时，包含发明的抗体的药物组合物可用于增加人体内的血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容。此外，发明的抗体可用于病症、疾病或障碍的治疗，其中hepcidin-25的存在导致或促使不理想的病理学效应，或者，hepcidin-25水平或hepcidin-25生物活性的降低在人类受试者中具有治疗性收益。此类病症、疾病或障碍包括但不限于贫血，包括但不限于由感染、炎症、慢性病和/或癌症导致的贫血。受试者可以是雄性或雌性。
本发明包括增加血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的方法，所述方法包括向需要其的人类受试者施用有效量的本发明的抗体，所述抗体选择性结合人hepcidin-25，具有约800pM或更低的KD。此外，或可选的，本发明包括用于治疗人类受试者的疾病、病症或障碍的方法，所述疾病、病症或障碍受益于血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容的增加，包括但不限于贫血，例如由感染、炎症、慢性病和/或癌症导致的贫血。优选的，受试者患有或有风险具有不理想的低血清铁水平、低网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容。更优选的，受试者有风险或已患有贫血，包括但不限于由感染、炎症、慢性病和/或癌症导致的贫血。甚至更优选的，抗体包含下述LCVR和下述HCVR，所述LCVR包含：
i)具有选自SEQIDNO：41和43的氨基酸序列的LCDR1；
ii)具有选自SEQIDNO：30、53、56、57、58和76的氨基酸序列的LCDR2；和
iii)具有选自SEQIDNO：31、61和60的氨基酸序列的LCDR3；
所述HCVR包含：
i)具有选自SEQIDNO：32、63、78和79的氨基酸序列的HCDR1；
ii)具有选自SEQIDNO：44、80、81、82、83、84、85、86和87的氨基酸序列的HCDR2；和
iii)具有SEQIDNO：46所示的氨基酸序列的HCDR3。甚至更优选的，抗体包括重链和轻链多肽，所述重链和轻链多肽分别具有：(i)SEQIDNO：6和14所示的氨基酸序列；(ii)SEQIDNO：7和15所示的氨基酸序列；(iii)SEQIDNO：9和17所示的氨基酸序列；或(iv)SEQIDNO：8和16所示的氨基酸序列。最优选的，抗体包括重链和轻链多肽，所述重链和轻链多肽分别具有SEQIDNO：8和16所示的氨基酸序列。
此外，可以考虑发明的抗体的用途，用于制备治疗贫血或至少一种上述障碍的药物。优选的，抗体包含LCVR和HCVR，所述LCVR包含：
i)具有选自SEQIDNO：41和43的氨基酸序列的LCDR1；
ii)具有选自SEQIDNO：30、53、56、57、58和76的氨基酸序列的LCDR2；和
iii)具有选自SEQIDNO：31、61和60的氨基酸序列的LCDR3；所述HCVR包含：
i)具有选自SEQIDNO：32、63、78和79的氨基酸序列的HCDR1；
ii)具有选自SEQIDNO：44、80、81、82、83、84、85、86和87的氨基酸序列的HCDR2；和
iii)具有SEQIDNO：46所示的氨基酸序列的HCDR3。更优选的，抗体包括重链和轻链多肽，所述重链和轻链多肽分别具有：(i)SEQIDNO：6和14所示的氨基酸序列；(ii)SEQIDNO：7和15所示的氨基酸序列；(iii)SEQIDNO：9和17所示的氨基酸序列；或(iv)SEQIDNO：8和16所示的氨基酸序列。最优选的，抗体包括重链和轻链多肽，所述重链和轻链多肽分别具有SEQIDNO：8和16所示的氨基酸序列。
术语“治疗(treating)”(或“治疗(treatment)”和“治疗(treat)”)意在指其中具有减慢、中断、阻止、控制或中止本文描述的障碍的进展的所有过程，但并不必定表示完全消除了所有的障碍症状。如本文中使用的，“治疗”包括施用本发明的化合物，用于治疗哺乳动物，特别是人的疾病或病症，包括：(a)抑制疾病的进一步进展，即，阻止其发展；和(b)减轻疾病，即，引起疾病或障碍的减退，或缓和其症状或并发症。可以调整给药方案，提供最佳的预期反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注(singlebolus)，随时间施用多次分份剂量，或根据治疗情况的紧急程度所示，按比例减少或增加剂量。
术语“预防(preventing)”(或“预防(prevent)”或“预防(prevention)”)意指阻止、遏制或抑制症状、障碍、病症或疾病的发生或出现。可以治疗和预防急性事件和慢性病症。在急性事件中，在症状、障碍、病症或疾病发作时施用发明的抗体，当急性事件结束时终止。相反，治疗慢性症状、障碍、病症或疾病花费更长的期限。
“障碍”是可以受益于根据本发明的治疗的任何病症。术语“障碍”、“病症”和“疾病”在本文中可互换的使用，包括慢性和急性的成熟hepcidin促进性障碍，包括但不限于贫血，所述贫血包括但不限于慢性病贫血，所述慢性病贫血包括但不限于由感染、炎症和/或癌症导致的贫血。
发明的抗体可以掺入到适合向人类受试者施用的药物组合物中。发明的抗体可以以单剂量或多剂量，单独向人类受试者施用，或与可药用的载体和/或稀释剂组合施用。设计此类药物组合物，使其适合选定的施用模式，并根据需要使用可药用的稀释剂、载体和/或赋形剂，例如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂(包括但不限于氯化钠)、稳定剂等。可以根据例如提供执业医生普遍已知的配方技术纲要的Remington，TheScienceandPracticeofPharmacy，第19版，Gennaro编著，MackPublishingCo.，Easton，PA1995中公开的常规技术来设计所述组合物。用于药物组合物的合适的载体包括任何材料，当其与发明的抗体组合时，保留了分子活性并且不与受试者的免疫系统反应。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包括i)发明的抗体，ii)柠檬酸盐缓冲液，和iii)氯化钠。优选的，存在抗体的浓度范围是约1mg/ml至约35mg/ml，存在柠檬酸盐的浓度范围是约5mM至约20mM，存在氯化钠的浓度范围是约100mM至约300mM，组合物的pH在约5.0至约7.2之间。更优选的，存在抗体的浓度范围是约5mg/ml至约30mg/ml，存在柠檬酸盐的浓度范围是约5mM至约15mM，存在氯化钠的浓度范围是约150mM至约300mM，组合物的pH在约5.5至约6.5之间。甚至更优选的，存在抗体的浓度范围是约5mg/ml至约25mg/ml，存在柠檬酸盐约10mM，存在氯化钠的浓度范围是约200mM至约300mM，组合物的pH在约5.5至约6.5之间。
利用标准的施用技术，可以向有风险的或表现出如本文所述病理症状的受试者施用包含本发明的抗hepcidin-25抗体的药物组合物，例如贫血障碍。
如本文中使用的，词组“有效量”指实现理想治疗结果所必须的量(对剂量、时间和施用方式而言)。抗体的有效量可以根据多种因素而改变，例如疾病状态、年龄、性别和个体体重，以及抗体或抗体部分在个体中诱发理想反应的能力。有效量也是抗体的治疗有益效果超过其任何毒性或有害作用的量。
有效量至少是赋予受试者治疗性益处所必需的活性剂的最小量，但低于毒性剂量。换言之，发明的抗体的有效量或治疗有效量是这样的量，所述量在哺乳动物中，优选的在人中，(i)增加血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白和/或血细胞比容，或(ii)治疗障碍，在所述障碍中成熟hepcidin的存在引起或促进不理想的病理学效应，或(iii)成熟hepcidin水平或成熟hepcidin生物活性的降低，在哺乳动物，优选的在人中导致有益的治疗效果，包括但不限于贫血，所述贫血包括但不限于慢性病的贫血，包括但不限于由感染、炎症和/或癌症导致的贫血。可以单剂量或多剂量施用发明抗体的有效量。此外，可以下述量的多次给药的施用发明抗体的有效量，所述量如果不施用一次以上，则低于有效量。
如医药领域熟知的，用于任一受试者的剂量依赖于多种因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、所施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、总体健康状况和同时施用的其它药物。剂量还可以根据疾病的类型和严重程度改变。典型的剂量可以是，例如在约1mg至约200mg的范围内；优选的，约2mg至约200mg；更优选的，约5mg至约200mg；甚至更优选的，约5mg至约50mg；甚至更优选的，约5mg至约25mg；甚至更优选的，约5mg至约20mg；甚至更优选的，约5mg至约15mg；然而，低于或高于该示例性范围的剂量也是可以想象的，特别是考虑到上述因素时。每日肠胃外给药方案可以是从约10μg/kg至约20mg/kg，优选的从约25μg/kg至约20mg/kg，更优选的从约50μg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的从约100μg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的从约200μg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的从约300μg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的从约400μg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的从约500μg/kg至约20mg/kg，从约600μg/kg至约20mg/kg，从约700μg/kg至约20mg/kg，从约800μg/kg至约20mg/kg，从约900μg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的，从约1mg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的，从约2mg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的，从约3mg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的，从约4mg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的，从约5mg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的，从约6mg/kg至约20mg/kg，甚至更优选的，从约7mg/kg至约20mg/kg，以及甚至更优选的，从约8mg/kg至约20mg/kg。可以通过周期性评估监控进展，并相应的调节剂量。
上述建议量的抗体经历大量的治疗判断。选择合适剂量和安排时的关键因素是所获得的结果。在本文中考虑的因素包括所治疗的特定障碍、个体患者的临床病症、障碍的起因、抗体递送的位点、抗体的特定类型、施用方法、施用的进度安排，以及执业医师已知的其它因素。
施用本发明的抗体的途径可以是口服、肠胃外的、通过吸入或局部的。优选的，发明的抗体可以掺入到适合肠胃外施用的药物组合物中。如本文中使用的，术语肠胃外的包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道或腹膜内施用。通过静脉或腹膜内或皮下注射的肠胃外递送是优选的。皮下注射是最优选的。用于此类注射的合适载体是本领域熟知的。
通常，在生产回头所提供的容器中储存的条件下药物组合物必须是无菌且稳定的，所述容器包括例如密封瓶、注射器或其它递送装置，如笔(pen)。因此，可以在生产制剂后将药物组合物无菌过滤，或者另外使其是微生物学可接受的。
提供下列实施例仅用于示例性的目的，并非意在限制本发明的范围。
实施例
实施例1：生产人hepcidin-25
可以从商业来源(例如，PeptideInternational(Louisville，Kentucky))获得人hepcidin-25，或通过多种本领域已知的合成或重组技术来生产。可选的，在大肠杆菌中表达这样的融合蛋白，所述融合蛋白包含人hepcidin-25序列的25个氨基酸，并具有如SEQIDNO：95所示氨基酸序列。在用1mMIPTG在37℃诱导3-6小时后，从3升表达人hepcidin融合蛋白的大肠杆菌中分离包含体。将包含体溶解在缓冲液A(50mMTris和8M尿素(pH8.0))中。将上清液通过IMAC柱(20mL树脂)。用缓冲液A洗涤柱直至吸光度回到基线，通过含有0.5M咪唑的缓冲液A从柱上分批洗脱结合的多肽。收集人hepcidin-25融合蛋白，并用50mMDTT还原。然后，通过将收集的材料在2M尿素、3mM半胱氨酸、50mMTris(pH8.0)中稀释，至终蛋白质浓度低于50μg/mL，使上述融合蛋白再折叠。在室温搅拌该材料，空气氧化48小时。氧化的多肽以5mL/分的流速通过IMAC柱(20mL)，通过含有0.5M咪唑的缓冲液A从柱上分批洗脱人hepcidin-25融合蛋白。浓缩含有人hepcidin-25融合蛋白的合并的级分，并通过用50mMTris、4M尿素、pH8.0平衡的Superdex75(GEHealthcare，XK26/60)分筛柱(sizingcolumn)，流速为3mL/分。收集单体融合蛋白，在50mMTris、2M尿素、5mMCaCl2、pH8.0中稀释，然后用肠激酶切割生产SEQIDNO：1的人hepcidin-25。通过被动IMAC层析(如上述)去除未切割的人hepcidin-25融合蛋白。然后，将流过IMAC柱的液流通过C-18反相柱，流速为4.0mL/分。用含0.1％TFA的水洗涤柱，直至吸光度回到基线，用含有0.1％TFA的20％至40％线性梯度的ACN，以0.5％/分的速度，从柱上洗脱结合的多肽。合并含有人hepcidin-25多肽的级分，通过N末端氨基酸测序和基质辅助激光解吸/离子化质谱(MALDI-MS)进行分析。编码大鼠、小鼠和猕猴hepcidin-25以及多种N端截短形式的人hepcidin-25的多肽，包括hepcidin-22和hepcidin-20都是可商购的(例如，PeptideInternational)。
实施例2：抗hepcidin-25Fab和Mab的亲和力结合测量
可以使用表面等离振子共振生物传感器(例如，T100)来测量本文公开的抗体的结合动力学和亲和力。系统使用SPR的光学性质来检测葡聚糖生物传感器基质中相互作用的分子的蛋白质浓度的改变。除上述外，所有试剂和材料都购自AB(Upsala，Sweden)。所有测量都在25℃实施。样品溶解在HBS-EP缓冲液(150mM氯化钠，3mMEDTA，0.05％(w/v)表面活性剂P-20和10mMHEPES，pH7.4)中。为了捕获具有人κ的Fab，使用胺偶联试剂盒，以5000-10000响应单位(Rus)的水平，将山羊-抗-人κ固定在CM5传感芯片的流动室(flowcell)1-4上。为了捕获具有小鼠IgG1的Mab，使用胺偶联试剂盒，以5000-10000Rus的水平，将山羊-抗-小鼠Fcγ固定在CM5传感芯片的流动室1-4上。为了捕获具有人IgG4的抗体，使用胺偶联试剂盒，以400-700Rus的水平，将蛋白A固定在CM4传感芯片的流动室1-4上。利用多重分析循环，评估从大肠杆菌周质制备的Fab和从哺乳动物细胞培养物中制备的Mab。每个循环由以下步骤组成：以～10μL/分注射Fab或Mab0.3-2分钟，达到捕获为200-1000Rus，以50μL/分注射2分钟不同浓度(从600nM到0.1nM)的如上述实施例1所述获得的人hepcidin-25，然后解离2-10分钟，使用30μL的10mM盐酸甘氨酸，pH1.5再生。在25℃获得测量结果，使用BIAevaluaiont软件中的“1∶1质量转移”结合模型评估每个循环的结合和解离速率。
表5中显示了小鼠FabJXB7和一些人体工程化的抗hepcidinFab的人hepcidin-25结合参数。表3中列举的其它人体工程化的Fab的人hepcidin-25结合亲和力(KD)确定在约214pM和约54pM之间，均具有与人hepcidin-25在约7.68×10-4s-1和约2.22×10-4s-1之间的Koff速率。因此，鉴别了这样的人体工程化的抗hepcidinFab，其对人hepcidin-25的KD低于小鼠FabJXB7的KD多达52倍。表5中显示的人体工程化的抗hepcidinFab分别包括人种系轻链和重链框架O2和VH1-69。
表5：与人Hepcidin-25的结合性质
Fab Kon(M-1，s-1) Koff(s-1) KD(M)
JXB7 2.49E+06 6.98E-03 2.80E-9
Hu22 7.05E+06 4.56E-03 6.47E-10
1.7 3.80E+06 1.48E-03 4.22E-10
3.12 3.94E+06 3.47E-04 8.83E-11
3.23 3.53E+06 2.78E-04 7.88E-11
表6中显示了小鼠MabJXB7和一些人体工程化的抗hepcidinMab的人hepcidin-25结合参数。因此，鉴别了这样的人体工程化的抗hepcidinMab，其具有与人hepcidin-25的结合亲和力(KD)低于小鼠MabJXB7的KD多达约33倍。MabJXB7和31B2的重链恒定区是小鼠IgG1。表6中的其它Mab的重链恒定区是人IgG4(SEQIDNO：94)。
表6：与人Hepcidin-25的结合
Mab Kon(M-1，s-1) Koff(s-1) 动力KD(M)
JXB7 3.70E+07 7.37E-03 1.99E-9
31B2 1.89E+06 1.27E-04 7.52E-11
Hu22 1.09E+07 8.64E-03 7.64E-10
3.23 6.20E+06 6.59E-04 9.94E-11
3.8 5.58E+06 7.68E-04 1.05E-10
L1.5 5.31E+06 1.82E-04 3.42E-11
3.12 3.68E+06 2.20E-04 5.99E-11
表7和8中分别显示了猕猴hepcidin-25和小鼠hepcidin-25与多种人体工程化的抗hepcidinMab的结合参数。MabHu22、3.23和3.8对大鼠hepcidin-25的结合是不可检测的。通常，MabHu22和3.23显示出对成熟猕猴hepcidin的KD和对人hepcidin-25的KD相当。然而，Mab3.8显示出与猕猴hepcidin-25的KD比与人hepcidin-25的KD低超过10倍。另一方面，MabHu22、3.23和3.8显示出与人hepcidin-25的KD比与小鼠hepcidin-25的KD低得多。
表7：与猕猴Hepcidin-25的结合
Mab Kon(M-1，s-1) Koff(s-1) 动力KD(M)
Hu22 8.13E+06 8.16E-03 9.86E-10
3.23 6.51E+06 5.77E-04 8.88E-11
3.8 7.07E+07 6.60E-04 9.33E-12
表8：与小鼠Hepcidin-25的结合
Mab Kon(M-1，s-1) Koff(s-1) 动力KD(M)
Hu22 1.62E+06 1.26E-01 7.76E-08
3.23 3.83E+06 1.92E-01 5.01E-08
3.8 3.57E+06 1.24E-01 3.46E-08
实施例3：hepcidin诱导的膜铁转运蛋白内化作用和降解的基于细胞的测定
可以使用体外基于细胞的测定来测量Mab针对人hepcidin的中和活性。一种可用于测量本发明抗体的中和活性的体外基于细胞的测定是基于hepcidin诱导的自身受体——膜铁转运蛋白的内化作用和降解。简而言之，制备允许诱导表达膜铁转运蛋白(FPN)的HEK293稳定细胞系。出于追踪的目的，FPN与绿色荧光蛋白(GFP)融合。使用T-REx系统控制FPN-GFP分子的诱导性表达，T-REx系统是可商购的没有病毒反式激活子的四环素-调控型表达系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)。将FPN-GFP编码序列克隆到pCDNA4/TO载体中，所述载体含有可诱导的启动子和Zeocin抗性标记物。将获得的构建体转染到T-REx-293细胞内，所述细胞表达多西环素诱导表达所需要的调控蛋白。测试Zeocin抗性克隆的FPN-GFP的诱导表达。细胞生长条件基本如生产商的T-REx系统用户手册所述。简而言之，细胞生长在添加了5μg/mL青霉素-链霉素的DMEM，10％透析FBS，20μMFAC(柠檬酸铁铵)中。用100μg/mLZeocin和5μg/mL杀稻瘟菌素维持选择。将细胞铺板在用多聚D-赖氨酸包被的96孔黑色/透明平板上。使用高分辨率荧光平板读板器读取每个孔的总荧光。
测定基本如下进行：在胰酶消化后，用FPN-GFP/TREx293稳定细胞系按9000细胞/孔接种96孔测定板。每孔接种体积是80μl。允许细胞贴壁过夜。第二天大早，将9μl的30ng/mL多西环素添加到各孔中，诱导FPN-GFP表达。允许该诱导进行8小时。在诱导后，吸去培养基，用120μL/孔FBS小心地洗涤孔。从各孔去除所有液体是重要的，因为任何遗留培养基都可以继续诱导FPN-GFP的表达。
按96孔板模式配制所需要的处理物，用于在洗涤后向测定平板中快速添加。最终的每孔测定体积是45μL。在添加处理物后，使用高分辨率的荧光平板读数器(在通道1设定550V)读取测定平板。该读数是0小时读数，用于归一化每孔的细胞数，其与总FLU/孔相关。人hepcidin-25在0.5μM诱导膜铁转运蛋白最大程度的内化和降解。人hepcidin-25的IC50是约8nM。对于抗hepcidin抗体中和测定，保持人hepcidin-25浓度在100nM，按2x稀释从0.5μM至8nM运行抗hepcidin抗体。孵育平板24hr，其后，再次读取，按第24小时的总荧光单位(FLU)/孔除以第0小时的总FLU/孔的比例产生数据。
在该体外测定中，用不同的抗hepcidinMab中和人hepcidin-25生物活性，测量的IC50如表9中所示。
表9：抗hepcidin-25人体工程化的Mab的体外中和活性
Mab IC50(nM)±标准误差(n≥4)
3.23 59.1±1.2
3.12 62.2±5.9
3.6 54.6±1.5
3.9 51.1±1.8
Hu22 163±12.4
实施例4：施用抗hepcidin单克隆抗体提高用白介素-6皮下处理的猕猴体内的血清铁水平
可以如下确定抗hepcidin抗体对猕猴体内IL-6诱导的血清铁失调的活性。
简而言之，以1和10mg/kg静脉内推注向雄性猕猴施用抗hepcidin抗体。在抗体施用约1小时后，动物接受5μg/kg的人IL-6的单次皮下给药。收集在-1小时(施用抗体前)、0小时(在施用IL-6前即刻)和在IL-6处理后1、3、6、12、24、48、96、168、336、504和672小时的血液样品。优选的，各处理组由至少3只动物组成。可以通过本领域已知的任何方法测量血清铁水平，所述方法是医学领域常规认为可接受的测量血清铁水平的方法。
表10：抗hepcidinMab抑制猕猴体内IL-6诱导的血清铁水平的降低
组 雄性编号 测试/对照物品 给药途径 目标剂量水平 目标剂量浓度 目标剂量体积(mL/kg)
1 3 1X PBS含有rHSA的1X PBS I.V.S.C. 0mg/kg0μg/kg 0mg/mL0μg/mL 3.31
2 3 1X PBSIL-6* I.V.S.C. 0mg/kg5μg/kg 0mg/kg5μg/mL 3.31
3 3 Hu22IL-6* I.V.S.C. 1mg/kg5μg/kg 0.3mg/mL5μg/mL 3.31
4 3 Hu22IL-6* I.V.S.C. 10mg/kg5μg/kg 3mg/mL5μg/mL 3.31
5 3 3.23IL-6* I.V.S.C. 1mg/kg5μg/kg 0.3mg/mL5μg/mL 3.31
6 3 3.23IL-6* I.V.S.C. 10mg/kg5μg/kg 3mg/mL5μg/mL 3.31
＊施用的所有IL-6剂都在由含有0.1mg/mL重组人血清白蛋白的1XPBS构成的载体中。
S.C.皮下注射；经由1个注射位点给药
I.V.静脉内；通过隐静脉注射给药
与PBS对照组相比，人IL-6处理产生血清铁水平的短暂降低，在IL-6处理后12小时达到最低点。在人IL-6给药约1小时前，静脉内施用10mg/kg的Hu22和3.23，阻止了由于IL-6处理产生的铁水平降低，在IL-6处理后3和6小时后，分别导致血清铁增加约52％和108％。在达到峰值水平后，在上述两组中血清铁浓度随后降低，并达到与其它组在24小时的相似水平。10mg/kg的Hu22(p＜0.01，3和6小时)和3.23(p＜0.01，3、6和12小时)相对于用PBS预处理的IL-6组，都产生血清铁浓度的统计学显著的增加。相反，1mg/kg的Hu22和3.23，相对于对照都没有产生血清铁水平的统计学显著的差异。因此，上述结果证实，本发明的抗体可用于治疗由成熟hepcidin的生物活性导致的贫血。
实施例5：使用MALDI-TOF确定抗hepcidin抗体的选择性
生物标记物的临床常规诊断大部分基于免疫学、定量技术——例如ELISA。这些方法通常不可用于小抗原或抗原同种型(Sparbier，K.，InternationalMeetingoftheAssociationofBiomolecularResourceFacilities，SaltLakeCity，UT，PosterV28-S，(2008)；和Gutierrez，J.A.等人，(2005))。
根据生产商的规程，将抗人hepcidinMab31B2与CNBr活化的琼脂糖6MB树脂(GEhealthcare，Piscataway，NJ)缀合。简而言之，用1mMHCl洗涤琼脂糖树脂3次，并将抗体在偶联缓冲液(100mMNaHCO3，0.5MNaCl，pH8.3)中稀释。每毫克树脂使用约1.7mg的抗体在4℃缀合过夜。用0.1M乙酸缓冲液pH4洗去多余的抗体。约100ml人血清样品在4℃用0.8ml上述琼脂糖-31B2树脂孵育。孵育过夜后，将树脂/血清混合物装入柱内，并用10-20柱体积的10mM磷酸钠，0.5MNaCl，pH7.4洗涤。用5-10柱体积的不含NaCl的10mM磷酸钠，pH7.4洗涤。最后，用0.2％TFA洗脱柱。在Voyager-DESTR仪器(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)上以线性模式分析洗脱级分的分子量。
对于小于人hepcidin-25的分子量，用肽基质生成质谱。鉴别相应于人hepcidin-25的主峰(2790道尔顿)。还可以检测到对各种截短形式的hepciding的较低主峰，即hepcidin-24(2647道尔顿)、hepcidin-22(2436道尔顿)和hepcidin-20(2192道尔顿)。
对于大于人hepcidin-25的分子量，用蛋白质基质生成质谱。仍然鉴别了相应于人hepcidin-25的主峰(25aa，2790道尔顿)，但没有检测到对应原前-hepcidin(prepro-hepcidin)(84aa，9400道尔顿)或前-hepcidin(60aa，6929道尔顿)的峰。
因此，使用31B2Mab及其人体工程化版的免疫测定对人hepcidin-25是选择性的，而与已知存在于人血清中前体和/或其N末端截短形式相比，所述人hepcidin-25是人血清中活性的、最生理学相关的hepcidin形式。
实施例6：校正基于CHO细胞表达的抗hepcidin-25抗体编码mRNA的隐蔽剪接
可以使用标准的分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选自转化体、分离能够表达发明抗体的宿主细胞系、培养宿主细胞和从培养基中回收表达的抗体。令人惊讶的，使用重组谷氨酰胺合成酶(GS)表达系统(LonzaBiologics，Inc.，Slough，UK)，通过中国仓鼠卵巢(CHO)细胞悬浮培养生产Mab3.12和3.23时，观察到不寻常的高水平的抗体-蛋白质聚集(通过尺寸排阻层析分别测量为～15％和～30％)。然而，当两种Mab在人源的HEK-293细胞中瞬时表达时，没有观察到高水平的聚集。检查来自两种CHO细胞系中每个的mRNA，发现存在非预期大小的转录物，提示编码Mab3.12和3.23的抗体蛋白质的核苷酸序列对隐蔽剪接事件是敏感的。此外，对聚集的蛋白质样品的检查揭示了轻链蛋白质中截短的存在。对分离自CHO细胞表达Mab3.12和3.23的mRNA所制备的cDNA进行测序，证实在轻链基因中存在隐蔽的内含子。在编码LCCDR1的氨基酸残基R/VS的密码子(SEQIDNO：43的氨基酸5-7，“/”表示剪接连接，符合读框)中含有剪接供体。此外，在编码FRL2(SEQIDNO：40)的氨基酸残基LI的密码子中，发现了可能的分支点，以及分别在编码Mab3.12和3.23的LCDR2的氨基酸残基STL和SPL的密码子中具有可能的聚嘧啶一段。最后，在编码Mab3.12和3.23的LCDR3的氨基酸残基C/Q/Q的密码子中(SEQIDNO：61的氨基酸1-3，“/”表示剪接连接)鉴别了受体位点。
然后，修饰编码Mab3.12和3.23轻链的起始DNA序列(分别是SEQIDNO：153和155)，消除赋予隐蔽内含子剪接供体、分支点、受体和聚嘧啶束的序列。更特别地，供体位点从CGCGTAAGT改变至AGAGTCTCC(SEQIDNO：45)。分支点从CTGATC改变至CTCATC(SEQIDNO：162)；在3.12和3.23中，聚嘧啶束分别从TCCACCCTG改变至AGCACACTG(SEQIDNO：77)和从TCCCCCCTG改变至AGCCCACTG(SEQIDNO：78)；受体从TGTCAGCAGTGG改变至TGCCAACAATGG(SEQIDNO：100)。
因此，通过重组表达载体实施Mab3.12和3.23的轻链的后续表达，所述载体含有修饰的DNA序列，分别如SEQIDNO：12和13所示。对于3.12或3.23Mab，在CHO细胞中表达修饰的核酸序列而生成的聚集抗体的量确定为1％或更低。
通常，预期对编码本发明的多种其它抗体轻链的DNA序列的修饰也同样极有好处，因为剪接供体、聚嘧啶束和剪接受体来自编码产生抗体特异性的LCDR的密码子。分支点位于FRL2中，LLIY序列在轻链框架中是高度保守的。此外，QQ基序的编码核苷酸序列跨越了所鉴别的剪接受体区，在发明的多个抗hepcidinmAb的LCDR3中是保守的。通常，含有一个或两个上述Q密码子(CAG)的多条轻链种系序列可以作为潜在的隐蔽内含子的受体作用。

Claims (35)

1.分离的结合人hepcidin-25的抗体，其通过在25℃表面等离振子共振(SPR)确定，具有约800pM或更低的KD，并包括6个CDR，所述6个CDR选自：
(i)分别具有SEQIDNO：41、53、31、63、84和46所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；
(ii)分别具有SEQIDNO：43、30、31、32、44和46所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；
(iii)分别具有SEQIDNO：43、53、61、63、85和46所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
(iv)分别具有SEQIDNO：43、57、61、63、84和46所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。
2.权利要求1的抗体，其中通过在25℃SPR确定，抗体具有与人hepcidin-25的KD在约400pM至约30pM之间。
3.权利要求1或2的抗体，其中通过在25℃SPR确定，抗体具有与人hepcidin-25的KD在约200pM至约30pM之间。
4.权利要求1或2的抗体，其中，在hepcidin-25生物活性的体外测定中，抗体具有IC50在约100nM和约50nM之间。
5.权利要求1或2的抗体，其中，在hepcidin-25生物活性的体内测定中，抗体具有IC50在约100nM和约25nM之间。
6.权利要求4的抗体，其中测定测量hepcidin诱导的膜铁转运蛋白的内化作用和/或降解。
7.权利要求5的抗体，其中测定测量IL-6诱导的血清铁水平的降低。
8.权利要求1或2的抗体，其中抗体是人体工程化的抗体。
9.权利要求1或2的抗体，其中抗体包括重链恒定区，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG4的重链恒定区及其变体，其中所述变体具有少于15个氨基酸的取代、缺失或添加。
10.权利要求1或2的抗体，其包括重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中(i)HCVR和LCVR分别具有SEQIDNO：148和126所示的氨基酸序列；(ii)HCVR和LCVR分别具有SEQIDNO：128和127所示的氨基酸序列；(iii)HCVR和LCVR分别具有SEQIDNO：150和124所示的氨基酸序列；或(iv)HCVR和LCVR分别具有SEQIDNO：151和125所示的氨基酸序列。
11.权利要求1或2的抗体，其包括重链和轻链，所述重链和轻链具有：(i)分别如SEQIDNO：6和14所示的氨基酸序列；(ii)分别如SEQIDNO：7和15所示的氨基酸序列；(iii)分别如SEQIDNO：9和17所示的氨基酸序列；或(iv)分别如SEQIDNO：8和16所示的氢基酸序列。
12.权利要求1或2的抗体，其包括两条重链多肽和两条轻链多肽，其中每条重链多肽具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列，每条轻链多肽具有SEQIDNO：16所示的氨基酸序列。
13.权利要求1或2的抗体，其中轻链可变区框架和重链可变区框架是完全人的。
14.权利要求1或2的抗体，其中轻链可变区框架与完全人的轻链可变区框架02相比，具有少于5个氨基酸的取代、添加和缺失。
15.权利要求1或2的抗体，其中重链可变区框架与完全人的重链可变区框架VH1-69相比，具有少于7个氨基酸的取代、添加和缺失。
16.权利要求1或2的抗体，其中轻链可变区框架选自O2、O18或L12。
17.权利要求1或2的抗体，其中重链可变区框架区选自VH1-69、VH1-18或VH1-46。
18.多核苷酸，其包含编码根据权利要求1-17中任一项的抗体的核苷酸序列。
19.权利要求18的多核苷酸，其包含编码轻链多肽的核苷酸序列，所述轻链多肽具有SEQIDNO：14、15、16或17所示的氨基酸序列。
20.权利要求19的多核苷酸，其包括SEQIDNO：12或13所示的核苷酸序列。
21.重组表达载体，其包括根据权利要求18-20中任一项的多核苷酸。
22.用根据权利要求18-20中任一项的多核苷酸或根据权利要求21的载体转化的宿主细胞。
23.根据权利要求22的宿主细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢、NS0骨髓瘤、COS或SP2/0细胞。
24.权利要求1或2的抗体，其用于治疗。
25.权利要求1或2的抗体，其用于贫血的治疗。
26.权利要求1或2的抗体，其用于制备药物。
27.权利要求1-17中任一项的抗体的用途，其用于制备在受试者中治疗和/或预防贫血的药物。
28.权利要求1或2的抗体，其用于在受试者中增加血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白或血细胞比容。
29.权利要求1-17中任一项的抗体的用途，其用于制备在受试者中增加血清铁水平、网织红细胞计数、红血细胞计数、血红蛋白或血细胞比容的药物。
30.生产抗体的方法，其包括步骤(i)在适合允许所述抗体表达的条件下，培养根据权利要求22或23的宿主细胞；和(ii)回收表达的抗体。
31.通过权利要求30的方法可获得的抗体。
32.药物组合物，其包括权利要求1-17或31中任一项的抗体，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
33.非诊断免疫测定，其包括a)获得待被针对人成熟hepcidin进行测定的样品；b)在抗体结合和允许所存在的任何人成熟hepcidin与抗体形成复合物的合适条件下，将样品与根据权利要求1-17或31中任一项的抗体接触；和c)检测复合物的存在或缺失；和/或通过免疫检测方法确定样品中的复合物的量。
34.根据权利要求33的非诊断免疫测定，其中免疫检测方法是酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫组织化学(IHC)测定、免疫荧光(IF)测定、凝集测定、Western印迹测定、点渍法测定、狭线印迹测定或表面等离振子抗性检测方法。
35.用于实施免疫测定的试剂盒，其包括根据权利要求1-17或31中任一项的抗体。
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