CN104945497B - 一种新型抗菌肽Hep‑W及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型抗菌肽Hep‑W，所述抗菌肽Hep‑W氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明在分析猪抗菌肽(Hepcidin)理化性质、空间结构的基础上，通过分子设计对Hepcidin进行分子改建，获得了在抗菌活性及细胞毒性方面表现俱佳、且具有独特膜作用机制的改建抗菌肽Hep‑W。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物工程技术领域，特别是，涉及一种新型抗菌肽Hep-W及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽是动物体内极为重要的先天免疫物质，是一种具有广谱抗菌、抗病毒甚至抗寄生虫活性的阳离子短肽。关于抗菌肽的作用机制，目前普遍认可的是抗菌肽的膜攻击学说，即通过正负电荷相吸原理作用于细菌细胞膜，引起膜通透性改变，或在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，最后导致细菌内容物外泄而死亡。由于其独特的作用机制，如果细菌要产生耐药性，必须改变细胞膜结构，而这种结构的改变对细菌本身有着更大的生命威胁，因此细菌产生耐药性的可能微乎其微。因此，抗菌肽自发现以来就被认为是传统抗生素的最佳替代品，可广泛应用于医药卫生、农业生产、食品工业等领域。
然而，天然抗菌肽并非完美无缺，大部分天然抗菌肽的抗菌活性不高，部分抗菌肽在与细胞膜相互作用的过程中对真核细胞产生的细胞毒性也限制了抗菌肽在临床上的应用。因此，在寻找活性更强，无溶血或细胞毒作用的抗菌肽的同时也开始致力于对原有的天然抗菌肽进行结构改造或重新设计，抗菌肽分子设计是基于抗菌肽的结构与功能的关系，通过一系列生物信息学方法，实现对天然抗菌肽的定向改造或全新设计，以获得更加符合人们需要的抗菌肽类抗生素。
来自猪体内的抗菌肽(Hepcidin)是一种富含半胱氨酸的小分子多肽，既具有一定的抑菌活性，又具有调节机体铁代谢的功能，其潜在的医用价值成为近年来研究的一个热点。但通过化学合成或从组织中提取获得该抗菌肽的成本太高，得率低且工序繁琐，因此，利用生物技术在体外获得大量抗菌肽成为当前的一个首选方法。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统作为近几年新兴的外源蛋白表达系统，已表现出相当大的潜力，弥补了原核系统的一些缺陷。有研究表明直接从猪的肝脏中提取出天然抗菌肽(Ifepcidin)基因，与pGAPZαA载体相连后转入到毕赤酵母中，虽然抗菌肽目的基因导入验证成功，可是却没有发现其抑菌活性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型抗菌肽Hep-W及其制备方法和应用，在分析猪抗菌肽(Hepcidin)理化性质、空间结构的基础上，通过分子设计对Hepcidin进行分子改建，获得了在抗菌活性及细胞毒性方面表现俱佳、且具有独特膜作用机制的改建抗菌肽Hep-W。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种新型抗菌肽Hep-W，所述抗菌肽Hep-W氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述新型抗菌肽Hep-W核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一种新型抗菌肽Hep-W的制备方法，包括以下步骤：
1)新型抗菌肽Hep-W基因的设计与合成：参照毕赤巴斯德酵母的偏好密码子，对猪成熟肽Hepcidin的基因进行改造，改造并合成新型抗菌肽Hep-W基因；
2)新型抗菌肽Hep-W表达载体的构建与鉴定；将新型抗菌肽Hep-W基因序列与pGAPZαA相连接获得的表达载体pGAPZαA-Hep-W在感受细胞内表达，对表达后的表达载体pGAPZαA-Hep-W进行PCR和双酶切鉴定，获得测序正确的表达载体；
3)新型抗菌肽Hep-W真核表达载体的构建：将测序正确的表达载体pGAPZαA-Hep-W转入毕赤巴斯德酵母，获得重组酵母菌，对重组酵母菌进行鉴定；
4)新型抗菌肽Hep-W的获得：将鉴定正确的重组酵母菌培养后进行灭活、破碎并纯化，即获得新型抗菌肽Hep-W。
进一步，所述步骤2)、3)中鉴定过程采用的引物对上下游引物序列分别为SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4。
进一步所述步骤3)中表达载体pGAPZαA-Hep-W通过电转化法转入毕赤巴斯德酵母。
新型抗菌肽Hep-W作为畜禽饲料添加剂或制备畜禽疾病预防和治疗的药物的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明中新型抗菌肽Hep-W在抗菌活性及细胞毒性方面表现俱佳、且具有独特膜作用机制；
2、本发明中抗菌肽Hep-W具有良好的抑菌活性及热稳定性，并且溶血性低，即使是高浓度的杂合抗菌肽对红细胞也几乎没有破坏作用，安全性得到大大提高；
3、本发明中抗菌肽Hep-W对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性大大提高；
4、本发明中抗菌肽Hep-W制备方法简单，易纯化，成本低，利于大规模生产。
附图说明
图1为本发明中组成型表达载体pGAPZαA-Hep-W的构建示意图；
图2为本发明中组成型表达载体pGAPZαA-Hep-W的鉴定电泳图；
其中，M为DL5000 DNA Marker(宝生物工程(大连)有限公司)，1-7为重组pGAPZαA-Hep-W质粒PCR产物。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1
新型抗菌肽Hep-W的制备方法
1)新型抗菌肽Hep-W基因的设计与合成
根据GenBank中猪(Sus scrofa)Hepcidin成熟肽基因序列。保持了原猪Hepcidin成熟肽的二硫键和扭曲β折叠结构，将第8位和18位的Ile替换为Trp，以增加芳香族氨基酸Trp的含量设计而成，试图提高其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，最后设计的抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
对设计新型抗菌肽Hep-W氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成新型抗菌肽Hep-W基因序列(如SEQ ID NO:2所示)，并在其N端引入Kex 2酶切位点，在C端引入终止密码子。两端引入EcoR I和Xba I酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中。另设计合成一对引物，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上下游引物P1、P2核苷酸序列分别如SEQ IDNO:3、4所示。
2)新型抗菌肽Hep-W表达载体的构建与鉴定
将含新型抗菌肽Hep-W基因的载体和酵母表达载体均用EcoR I和Xba I双酶切，酶切产物经胶回收纯化后连接，连接反应采用10uL的反应体系，连接酶反应缓冲液1uL，T4DNA连接酶1-5U，载体DNA(100ng)与外源DNA的摩尔比为1:3-10，16℃水浴连接过夜。然后将连接产物导入感受态细胞中培养后进行PCR和双酶切鉴定，将鉴定结果为阳性的重组质粒送南京金斯瑞进行测序。
3)重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
将测序鉴定正确的重组质粒和空载体用限制性内切酶BlnI单酶切线性化后加入毕赤巴斯德酵母PichiapastorisX-33感受态细胞悬液中。电转化后获得重组酵母菌，并均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDZ选择平板上，30℃孵育2-3天，待YPDZ平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL的YPDZ选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
提取可能的高拷贝重组酵母基因组DNA。以P1、P2为引物进行PCR反应，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察，能扩增出大约138bp的条带重组子定为阳性转化子。
4)阳性克隆的诱导表达
真核表达载体pGAPZαA属于组成型表达载体，不需要诱导。直接挑取pGAPZαA-Hep-W转化成功的重组酵母菌阳性单菌落接种于含有100μg/mL Zeocin的10mlYPD液体培养基中，30℃，250rpm过夜培养。取0.1mL菌液转接于50mL YPD中，于250mL锥形瓶中摇床培养。取1mL培养96h的菌液置于1.5mL灭菌离心管中，12000rpm离心2min取上清，置于液氮中迅速凝固，于-80℃保存，用于检测表达量以及进行抑菌活性的测定。
5)重组酵母菌表达上清液的Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳检测
采用在线ExPASy网站对Hep-W基因表达产物的分子量进行预测，预测结果显示该成熟肽分子大小约为2.90kDa，等电点为8.22。采用分离小分子蛋白效果较好的Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳，结果显示新型抗菌肽Hep-W蛋白分子量与预期结果相符，说明工程菌构建成功。
实施例2
重组蛋白的抑菌效果
采用改良微量肉汤稀释法对新型抗菌肽Hep-W的杀菌活性进行检测，以评价本发明中新型抗菌肽Hep-W的杀菌活性。将冻存于-80℃的菌株置于冰中解冻，用接种环划线于MH琼脂平板，于37℃培养形成单菌落；单菌落接种于新鲜MH肉汤培养基中，37℃恒温震荡过夜培养活化；取上述过夜培养菌悬液按1:100的比例转接至新鲜MH肉汤培养基中，37℃下250rpm恒温震荡培养至OD600nm＝0.5；取OD600nm＝0.5的菌悬液10μL至10mL新鲜MH肉汤培养基中涡旋混匀，调整细菌数为105～106CFU/mL，用于最小抑菌浓度(MinimumInhibitoryConcentration，MIC)的测定。向无菌96孔圆底培养板中的第一到第八孔各加入90μL制备好的菌悬液，第十一孔加入100μL菌悬液，第十二孔加100μL MH肉汤培养基设为阴性对照孔；从第一孔到第八孔逐一加入10μL系列稀释的新型抗菌肽Hep-W，第十一孔作为阳性对照孔，不加抗菌物质；将培养板置于37℃下保湿静置培养18～24h；培养后观察各孔底部是否有细菌沉淀产生，无肉眼可见细菌沉淀的最小浓度可判定为抗菌肽的MIC。本发明中新型抗菌肽Hep-W对革兰氏阳性菌的抗菌效果更好，且该抗菌肽对常见的细菌的最小抑菌浓度均达到微克级，具有极强的抑菌活力(如下表1所示)。
表1抗菌肽Hep-W对几种细菌的最小抑菌浓度(MIC)
实施例3
新型抗菌肽Hep-W10L规模发酵罐生产和制剂制备
1)新型抗菌肽Hep-W将筛选得到的阳性重组子活化后按1％-10％接种量接种于三角瓶，30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5％-20％接种量接入10L发酵罐(实装培养基6L)，温度30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM(1L发酵液1min通入的氧气量)，溶氧>20％情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50％甘油4h，整个发酵持续72-96h。
2)发酵结束后原罐蒸汽100℃灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为新型抗菌肽Hep-W半成品。
3)新型抗菌肽Hep-W制剂
新型抗菌肽Hep-W半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂。
上述新型抗菌肽Hep-W作为畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗，具有显著的疗效。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种新型抗菌肽Hep-W，其特征在于，所述抗菌肽Hep-W氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述新型抗菌肽Hep-W，其特征在于，所述新型抗菌肽Hep-W核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述新型抗菌肽Hep-W的制备方法，包括以下步骤：
1)新型抗菌肽Hep-W基因的设计与合成：参照毕赤巴斯德酵母的偏好密码子，对猪成熟肽Hepcidin的基因进行改造，改造并合成新型抗菌肽Hep-W基因；
2)新型抗菌肽Hep-W表达载体的构建与鉴定；将新型抗菌肽Hep-W基因序列与pGAPZαA相连接获得的表达载体pGAPZαA-Hep-W在感受细胞内表达，对表达后的表达载体pGAPZαA-Hep-W进行PCR和双酶切鉴定，获得测序正确的表达载体；
3)新型抗菌肽Hep-W真核表达载体的构建：将测序正确的表达载体pGAPZαA-Hep-W转入毕赤巴斯德酵母，获得重组酵母菌，对重组酵母菌进行鉴定；
4)新型抗菌肽Hep-W的获得：将鉴定正确的重组酵母菌培养后进行灭活、破碎并纯化，即获得新型抗菌肽Hep-W。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)、3)中鉴定过程采用的引物对上下游引物序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中表达载体pGAPZαA-Hep-W通过电转化法转入毕赤巴斯德酵母。
6.权利要求1-5任一项所述新型抗菌肽Hep-W作为畜禽饲料添加剂或制备畜禽疾病预防和治疗的药物的应用。
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