CN102238962B - 抗膜铁转运蛋白1单克隆抗体及其用途 - Google Patents

抗膜铁转运蛋白1单克隆抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供单克隆抗体及其抗原结合片段，其与人FPN1结合且抑制人FPN1的活性，并且可以有效地维持或增加铁向哺乳动物细胞外的转运，和/或在体内维持或增加受试者的血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容。

Description

抗膜铁转运蛋白1单克隆抗体及其用途
技术领域
本发明涉及结合膜铁转运蛋白1(ferroportin 1，FPN1)的抗体及其在治疗贫血中的用途。 
背景技术
铁是众多细胞功能所需的必需微量元素。在哺乳动物中，调节铁对机体的供应，以使机体的铁需求与由十二指肠的肠细胞的铁吸收水平匹配。跨肠细胞的基底外侧质膜的铁转运被认为由膜铁转运蛋白1(也称为铁调节转运蛋白1(IREG-1)、金属转运蛋白1(MTP1)和SLC40A1)介导，下文被称为FPN1。 
FPN1目前已知是铁调素(hepcidin)的受体，铁调素是由肝脏响应铁储备和炎症而制造的多肽激素。成熟铁调素与FPN1的结合导致FPN1内在化和降解，阻止细胞铁输出，并且它是全身性铁体内稳态的主要控制因素。 
美国专利号7,166,448尤其公开了编码人FPN1蛋白质的核苷酸序列、具有铁转运功能的人FPN1蛋白质、和针对人FPN1的C末端19个氨基酸组成的肽生成的兔多克隆抗血清。PCT国际专利申请公开号WO2009/094551描述了膜铁转运蛋白Mabs和使用其用于治疗铁体内稳态紊乱的方法。更具体而言，WO2009/094551描述了针对人FPN1蛋白质的各种表位的啮齿类和全人单克隆抗体。 
发明内容
考虑到FPN1牵涉到铁转运和FPN1突变与铁体内稳态疾病的关系，存在对如下治疗上有用的FPN1拮抗剂的需要，所述FPN1拮抗剂以高亲 和力与FPN1的细胞外表位结合，并且在结合后，抑制成熟铁调素介导的FPN1内在化，从而维持或增强铁从细胞内储备的向外输出。另外，为了抑制成熟铁调素与FPN1的细胞外表位的结合，用Mab或其抗原结合片段在治疗上靶向FPN1时必须足够精确地完成，以便抗体在与其靶结合后不显著干扰细胞铁的流出和/或诱导内在化。另外，旨在用于在人医学治疗中的抗FPN抗体必须显示足够的药代动力学和药效学特征，包括体内稳定性和/或清除半衰期，以允许其治疗应用。本文公开的一种或多种抗人FPN1抗体特异性结合人FPN1，包括选自下述的其至少一个肽片段： 
a.403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422(SEQ ID NO：12)； 
b.406EDIRSRFIQGESIT419(SEQ ID NO：13)； 
c.409RSRFIQGESITPTK422(SEQ ID NO：14)； 
d.403SPFEDIRSRFIQG415(SEQ ID NO：15)； 
e.409RSRFIQGESIT419(SEQ ID NO：16)；和 
f.409RSRFIQG415(SEQ ID NO：95). 
阻断铁调素与膜铁转运蛋白的结合，在体外有力地抑制铁调素活性，在体内以剂量依赖性方式升高血清铁水平，并且具有可接受的可溶性、体内稳定性和清除半衰期特征，这使得其成为用于治疗和/或预防贫血的有用试剂，可以通过静脉内输注或甚至可能地皮下注射而施用给需要此类治疗的受试者。 
因此，在其各个方面，本发明提供了： 
单克隆抗体或其抗原结合片段，其在表位上与由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列组成的人膜铁转运蛋白1特异性结合，所述表位包含位于选自下述的一个或多个氨基酸序列中的氨基酸： 
a.403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422(SEQ ID NO：12)； 
b.406EDIRSRFIQGESIT419(SEQ ID NO：13)； 
c.409RSRFIQGESITPTK422(SEQ ID NO：14)； 
d.403SPFEDIRSRFIQG415(SEQ ID NO：15)； 
e.409RSRFIQGESIT419(SEQ ID NO：16)；和 
f.409RSRFIQG415(SEQ ID NO：95). 
在一些实施方案中，本发明提供了Mabs或其抗原结合片段，其包括分别地包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，该Mabs或抗原结合片段在如下表位上与由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN 1结合，其中所述表位包含定位于SEQ ID NO：12所示氨基酸序列区域中的一个或多个氨基酸，其中通过表面等离子体共振(SPR)测定，优选地对于Mabs在25℃并且对于Fabs在37℃进行测定，KD为约100nM或更小。 
在一些实施方案中，Mab或其抗原结合片段包括选自下述的6个CDRs： 
(i)分别包括SEQ ID NOs：20、32、33、30、31和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(ii)分别包括SEQ ID NOs：42、32、33、30、43和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(iii)分别包括SEQ ID NOs：42、27、22、23、41和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(iv)分别包括SEQ ID NOs：42、32、33、23、41和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(v)分别包括SEQ ID NOs：20、21、22、17、18和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(vi)分别包括SEQ ID NOs：20、27、29、23、24和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(vii)分别包括SEQ ID NOs：37、27、22、23、41和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(viii)分别包括SEQ ID NOs：170、171、172、182、173和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(ix)分别包括SEQ ID NOs：37、127、22、23、116和19中所示氨 基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(x)分别包括SEQ ID NOs：37、125、22、23、110和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(xi)分别包括SEQ ID NOs：37、122、22、23、110和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(xii)分别包括SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(xiii)分别包括SEQ ID NOs：37、128、22、105、41和119中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(xiv)分别包括SEQ ID NOs：37、174、22、175、176和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(xvi)分别包括SEQ ID NOs：37、128、22、105、117和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3； 
(xvii)分别包括SEQ ID NOs：37、177、22、23、112和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且在表位上与由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN 1结合，其中通过SPR测定，优选地对于Mabs在25℃并且对于Fabs在37℃，KD小于约100nM，其中所述表位由定位于选自以下的氨基酸序列区域中的一个或多个氨基酸组成或基本上由之组成： 
a.403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422(SEQ ID NO：12)； 
b.406EDIRSRFIQGESIT419(SEQ ID NO：13)； 
c.409RSRFIQGESITPTK422(S EQ ID NO：14)； 
d.403SPFEDIRSRFIQG415(SEQ ID NO：15)； 
e.409RSRFIQGESIT419(SEQ ID NO：16)；和 
f.409RSRFIQG415(SEQ ID NO：95). 
在特定实施方案中，本发明的Mabs或其抗原结合片段抑制铁调素诱导的人FPN1内在化和/或降解，从而在受试者优选地人受试者中，与在不存在所述Mab或其抗原结合片段的情况下的受试者比较，维持或增加1) 铁向细胞外的转运、2)血清铁水平、3)网织红细胞计数、4)红细胞计数、5)血红蛋白、和/或6)血细胞比容至少约10％。 
在另一个方面，提供了包括编码本发明的抗人FPN1 Mabs或其抗原结合片段的核苷酸序列的多核苷酸。 
在另一个方面，提供了药物组合物，其包括本文描述的任何Mabs或其抗原结合片段和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。还提供：1)本文公开的Mabs或其抗原结合片段在治疗，优选地用于治疗或预防贫血的治疗中，的用途，2)本文公开的Mabs或其抗原结合片段在联合疗法中，优选地用于治疗或预防贫血的联合疗法中，的用途，3)本文公开的Mabs或其抗原结合片段用于在受试者优选地人中治疗或预防贫血，维持或增加血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容的用途，4)本文公开的Mabs或其抗原结合片段用于制造药物的用途，所述药物用于在受试者优选地人中治疗或预防贫血，维持或增加血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容，和5)本文公开的Mabs或其抗原结合片段在制造用于在联合疗法中使用的药物的用途，所述联合疗法用于在人中治疗或预防贫血，增加血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容，其中所述药物待与一种或多种ESA或其他治疗剂或治疗处理组合施用，所述其他治疗剂或治疗处理照常规用于在人中治疗贫血，维持或增加血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容。 
在另外一个方面，提供了方法：1)用于维持或增加受试者优选地人中的血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容的方法，其包括给有此需要的受试者施用有效量的本文公开的Mab或其抗原结合片段；2)用于治疗或预防贫血，包括但不限于慢性病性贫血、癌症性贫血、和炎症性贫血的方法，其包括给有此需要的受试者优选地人施用有效量的本文公开的Mab或其抗原结合片段，3)用于治疗或预防贫血，包括但不限于慢性病性贫血、癌症性贫血、和炎症性贫血的方法，其包括给有此需要的受试者优选地人患者施用有效量的本文公开的Mabs或其抗原结合片段的组合、或本文公开的至少一种Mab和至少一种抗原结合片段的混合物，和4）前述方法1-3中的任何一个，进一步包括给所述人患者施用ESA或其他治疗剂或治疗处理，其施用于维持或增加人中的血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容。
在另外一个方面，提供了用于抑制由成熟铁调素诱导的FPN1内在化和降解的方法，其包括使所述FPN1与有效量的本文公开的至少一种Mab或其抗原结合片段接触。 
还提供：降低成熟人铁调素与人FPN1结合的方法，其包括使所述人FPN1与有效量的本文公开的至少一种Mab和/或其抗原结合片段接触。 
还提供：降低被表达FPN1蛋白质的细胞内在化的FPN1蛋白质的量的方法，其包括给有此需要的人患者施用有效量的本文公开的至少一种Mabs和/或其抗原结合片段。 
附图说明
图1描述了包括用于产生抗FPN1抗体的免疫原的片段的各种肽的序列(SEQ ID NOs:96-102)，和使用这些肽确定抗FPN1Mab34A9的表位的肽-抗体结合实验的结果。有下划线的氨基酸指示实际膜铁转运蛋白序列。Mab34A9与肽FpnE3a(SEQ ID NO:96)、060719Z(SEQ ID NO:97)、0708L4C(SEQ ID NO:101)和0708L4D(SEQ ID NO:102)结合，其都包含RSRFIQG（SEQ ID NO:95）的共同氨基酸序列。 
图2A显示全人轻链构架O2的氨基酸序列及散布其间的CDRs。4个构架区标记为FRL1、2、3和4（分别为SEQ ID NOs：74、75、76和77）。 
图2B显示人重链构架VH1-69的氨基酸序列及散布其间的CDRs。4个构架区标记为FRH1-4（分别为SEQ ID NOs：78-81）。 
图3A显示人轻链构架O18的氨基酸序列及散布其间的CDRs。4个构架区标记为FRL1、2、3和4（分别为SEQ ID NOs：74、75、82和77）。与O2残基不同的残基是粗体和有下划线的。 
图3B显示人重链构架VH1-18的氨基酸序列及散布其间的CDRs。4个构架区标记为FRH1、2、3和4（分别为SEQ ID NOs：83、79、84和81)。与VH1-69残基不同的残基是粗体和有下划线的。 
图4A显示人轻链构架L12的氨基酸序列及散布其间的CDRs。4个构架区标记为FRL1、2、3和4(分别为SEQ ID NOs：85、75、86和77)。与O2残基不同的残基是粗体和有下划线的。 
图4B显示人重链构架VH1-46的氨基酸序列及散布其间的CDRs。4个构架区标记为FRH1、2、3和4(分别为SEQ ID NOs：83、79、87和81)。与VH1-69残基不同的残基是粗体和有下划线的。 
图5显示人轻链构架L1的氨基酸序列及散布其间的CDRs。4个构架区标记为FRL1、2、3和4(分别为SEQ ID NOs：74、168、76和169)。与O2残基不同的残基是粗体和有下划线的。人轻链构架L12的FR1区的种系序列如SEQ ID NO：85中所示；在本发明的特定实施方案中考虑其中人轻链构架L1的FR1区的氨基酸序列为SEQ ID NO：74中所示序列的变异。 
图6显示在对照鼠IgG1或鼠Mab 1G9作为30mg/kg的单次I.V.剂量施用后，在雄性食蟹猴(cynomolgus monkey)中的血清铁调素水平的曲线图。数据来自个体动物。 
图7显示在施用对照鼠IgG1或鼠Mab 1G9作为30mg/kg的单次I.V.剂量施用后，在雄性食蟹猴中的血清铁水平的曲线图。数据来自个体动物。 
图8显示本发明抗体及其抗原结合片段的优选重链可变区的氨基酸序列和共有氨基酸序列。句点(.)指出在那个位置的氨基酸等同于序列号1的相应氨基酸。对于序列号1，CDRs是有下划线和粗体的。 
图9显示本发明抗体及其抗原结合片段的优选轻链可变区的氨基酸序列和共有氨基酸序列。句点(.)指出在那个位置的氨基酸等同于序列号1的相应氨基酸。对于序列号1，CDRs是有下划线和粗体的。 
图10描述在0.3、1.0或3.0mg/kg的单次i.v.推注剂量后，在食蟹猴中Mab 4A10-3和Mab Combi11的血清浓度。在0.3mg/kg剂量，MabCombi11的血清浓度低于试验的检测限(＜20ng/mL)。数据是平均值±SD。 
图11描述在3.0mg/kg的单次i.v.推注剂量后，在Sprague Dawley大 鼠中Mab 4A10-3和Mab Combi11的血清浓度。数据是平均值±SD。 
发明详述 
下述缩写在本文中使用：BCA：二辛可宁酸，BSA：牛血清白蛋白，CDR：互补决定区，DTT：二硫苏糖醇，DMEM：达尔贝科改良伊格尔培养基，D-PBS：达尔贝科磷酸盐缓冲盐水，EDTA：乙二胺四乙酸，ELISA：酶联免疫吸附测定，ESA：红细胞生成刺激剂，FAC：柠檬酸铁铵，FBS：胎牛血清，Fe:NTA：次氮基三乙酸铁，FLU：荧光单位，GFP：绿色荧光蛋白，I.V.：静脉内，IPTG：异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷，IMAC：固定化金属离子亲和层析，Mab：单克隆抗体，Mabs：多种单克隆抗体，OPD：邻苯二胺二盐酸盐，PBS：磷酸盐缓冲盐水，PBST：磷酸盐缓冲盐水Tween-20，SDS：十二烷基硫酸钠，TBS：Tris缓冲盐水，Tris：三(羟甲基)氨基甲烷，Triton-X：4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇聚乙二醇叔辛基苯基醚，Tween-20：聚山梨酸酯20。 
本发明的Mabs或其抗原结合片段结合这样的表位，所述表位包括一个或多个氨基酸、或主要由之组成、或由之组成，其中所述氨基酸定位于人FPN1多肽(具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列)的氨基酸403-422(SEQ ID NO：12)内。在优选实施方案中，这些抗体或其抗原结合片段抑制成熟人铁调素诱导的人FPN1内在化和/或降解，从而在体外和体内增加铁向细胞外的转运以及在体内升高血清铁水平。例如，在优选实施方案中，本发明的抗体在体外显著降低由成熟铁调素诱导的铁蛋白在Caco-2细胞内的累积，所述Caco-2细胞是内源表达FPN1的人肠细胞系(参见实施例5)。 
天然存在的全长抗体是包括通过二硫键互联的2条重链和2条轻链的免疫球蛋白分子。每条链的氨基端部分包括约100-110或更多个氨基酸的可变区，可变区经由其中包含的CDRs而主要负责抗原识别。每条链的羧基端部分规定主要负责效应子功能的恒定区。 
如本文使用的，术语“CDR”意指在重和轻链多肽的可变区内存在的非 连续抗原结合位点。这些特定区域已由Kabat，等人，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)，Kabat，等人，Sequences of protein of immunological interest，(1991)，和Chothia，等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)和MacCallum，等人，J.Mol.Biol.，262：732-745(1996)描述，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或亚组。 
CDRs散布在更保守、称为构架区(“FR”)的区域中。轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)各由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDRs被称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”，并且重链的3个CDRs被称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。CDRs包含与抗原形成特异性相互作用的残基中的大多数。在LCVR和HCVR区域内的CDR氨基酸残基的编号和定位依照众所周知的约定(例如，Kabat、(1991)和/或Chothia(1987))。 
如本文使用的，短语“Kabat编号”是本领域公认的，指编号氨基酸残基的系统，所述氨基酸残基比抗体重和轻链区域中的其他氨基酸残基更可变(即高变)(Kabat，等人，Ann.NY Acad.Sci.，190：382-93(1971)；Kabat，等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242(1991))。 
如本文使用的，术语“单克隆抗体”(Mab)指源自单拷贝或单克隆(包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而非指产生其的方法。本发明的Mabs优选以同质或基本上同质的群体存在。完全Mabs包含2条重链和2条轻链。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR移植或此类技术的组合、或本领域已知的其他技术生产。 
如本文使用的，短语Mabs的“抗原结合片段”包括例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和单链Fv片段。 
除非另有说明，否则术语“抗体”或其语法形式指Mabs、其抗原结合 片段、以及其组合，包括例如Fabs的组合、以及Mabs和Fabs的组合。显示与根据本发明的抗体具有相似功能性质的另外抗体可以通过常规方法生成。例如，可以用例如FPN1表达细胞、FPN1或其片段免疫小鼠，所得到的抗体可以进行回收且纯化，并可以通过本文下文实施例3-14中公开的方法进行评估，以确定它们是否具有与本文公开的抗体相似或相同的结合、药代动力学和功能性性质。还可以通过本领域众所周知的常规方法制备抗原结合片段。用于产生和纯化抗体和抗原结合片段的方法也是本领域众所周知的。 
如本文使用的，短语“特异性结合”指本发明的抗体与特定的多肽或肽，优选由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人膜铁转运蛋白1，或其特定肽片段，结合的能力，其中如通过例如本文描述的亲和ELISA或SPR试验或本领域已知的相似测定试验所确定的，KD小于约1000nM、小于约100nM、小于约10nM、小于约1nM、小于约100pM、或小于约10pM。 
另外或可替代地，短语“特异性结合”涉及本发明的抗体时表明，该抗体结合或检测由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列组成的人膜铁转运蛋白1或其肽片段的能力，比其结合或检测另一种多肽(例如肝素)或任选地人膜铁转运蛋白1的另一特定肽片段的能力，大至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约500倍或至少约1000倍。 
本发明还提供了包括编码Mab或其抗原结合片段的核酸序列的分离多核苷酸。在特定实施方案中，本发明还提供了包括核苷酸序列的分离多核苷酸，所述核苷酸序列编码i)具有如SEQ ID NOs：50、51、52、150、152、156、160和164中所示氨基酸序列的重链多肽，和/或ii)具有如SEQID NOs：53、54、55、151、154、158、162和166中所示氨基酸序列的轻链多肽。 
在另一个实施方案中，本发明提供了包括编码Mab或其抗原结合片段的多核苷酸的重组表达载体。在特定实施方案中，本发明还提供了包括多核苷酸的重组表达载体，所述多核苷酸编码(i)具有如SEQ ID NOs：50、 51、52、150、152、156、160和164中所示氨基酸序列的重链多肽，和/或(ii)具有如SEQ ID NOs：53、54、55、151、154、158、162和166中所示氨基酸序列的轻链多肽。 
当在本文中使用时，术语“铁调素”指已知存在于哺乳动物中的任何形式的铁调素蛋白质。当在本文中使用时，术语“成熟铁调素”指在哺乳动物中表达的任何成熟、生物活性形式的铁调素蛋白质。当在本文中使用时，短语“人铁调素”指在人中存在的任何形式的铁调素蛋白质。当在本文中使用时，短语“成熟人铁调素”指已知存在于人中的任何成熟、生物活性形式的铁调素蛋白质。优选地，“成熟人铁调素”指“人铁调素-25”，具有如SEQID NO：91中所示氨基酸序列的成熟形式的人铁调素。 
术语“生物活性”当涉及成熟铁调素多肽例如铁调素-25时包括但不限于，成熟铁调素与其受体FPN1的特异性结合，成熟铁调素的一种或多种由FPN1介导的功能，例如a)成熟铁调素诱导的FPN1内在化和/或降解(参见例如，Nemeth，E.，等人，Science，306：2090-2093，(2004))，b)成熟铁调素对以下的调节：FPN1介导的i)铁外流、ii)血清铁水平、iii)网织红细胞计数、iv)红细胞计数、v)血红蛋白水平、vi)血细胞比容、vii)铁调素多肽的表达水平、和/或viii)铁调素多肽的组织分布。 
短语“人工程化抗体”(human engineered antibody)指本文公开的某些抗体以及这样的抗体，该抗体具有类似于本文公开抗体的本发明结合和功能性质，并具有基本上人的或全人的构架区围绕在源自本文公开的非人抗体或其抗原结合片段的CDRs的周围。“构架区”或“构架序列”指构架区1-4中的任何一个。本发明的人工程化抗体及其抗原结合片段包括这样的分子，在该分子中构架区1-4中的任何一个或多个是基本上人的或全人的，即，存在基本上人的或全人的单个构架区1-4之间的任何可能组合。例如，这包括其中构架区1和构架区2，构架区1和构架区3，构架区1、2和3等是基本上人的或全人的分子。基本上人的构架是与已知人种系构架序列至少约80％序列相同的构架。优选地，基本上人的构架与已知人种系构架序列至少约85％、约90％或约95％序列相同。 
全人构架是与已知人种系构架序列相同的构架。人构架种系序列可以自ImMunoGeneTics(IMGT)经由其网站http://imgt.cines.fr获得，或自The Immunoglobulin Facts Book(Marie-Paule Lefranc和Gerard Lefranc著，Academic Press，2001，ISBN 012441351)获得。例如，种系轻链构架可以选自：Al1、A17、A18、A19、A20、A27、A30、L1、L11、L12、L2、L5、L15、L6、L8、O12、O2和O8，种系重链构架区可以选自：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VH1-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VH1-18、VH1-69、VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59和VH5-51。优选地，种系轻链构架选自O2、O18和L12、L1，并且种系重链构架区选自VH1-69、VH1-18或VH1-46。更优选地，种系轻链构架选自O2和L1，并且种系重链构架选自VH1-69和VH1-18。最优选地，种系轻链构架是O2，并且种系重链构架是VH1-69。 
除本文公开的人工程化抗体外，显示与根据本发明的抗体相似功能性质的人工程化抗体可以使用几种不同方法生成。本文具体公开的抗体可以用作模板或亲本抗体以制备另外抗体。在一种方法中，亲本抗体的CDRs移植到人构架内，其中该人构架与亲本抗体构架具有高序列同一性。新构架的序列同一性将一般为：与亲本抗体中的相应构架的序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％相同。这种移植可能导致与亲本抗体相比降低的结合亲和力。如果是这种情况，那么可以基于由Queen，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，88：2869(1991)公开的具体标准，将构架的某些位置回复突变为亲本构架。描述用于人源化小鼠抗体的方法的另外参考文献包括美国专利号4,816,397；5,225,539和5,693,761；如Levitt，J.，Mol.Biol.168：595-620(1983)中所述的计算机程序ABMOD和ENCAD；和Winter及同事的方法(Jones，等人，Nature321：522-525(1986)；Riechmann，等人，Nature，332：323-327(1988)；和Verhoeyen，等人，Science，239：1534-1536(1988)。 
可以如下鉴定待考虑进行回复突变的残基： 
当氨基酸落入下述范畴时，将所使用的人种系序列(“受体构架”)的构架氨基酸替换为来自亲本抗体构架(“供体构架”)的构架氨基酸： 
(a)在受体构架的人构架区中的该氨基酸对于人构架的那个位置是罕见的，而供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对于人构架的那个位置是典型的； 
(b)氨基酸的位置与CDRs之一紧密相邻；或 
(c)构架氨基酸的任何侧链原子在三维免疫球蛋白模型中位于CDR氨基酸的任何原子的约5-6埃(中心至中心)内。 
当受体构架的人构架区中的任何氨基酸和供体构架中的相应氨基酸对于人构架的那个位置而言一般是罕见的时，该氨基酸可以由在人构架的那个位置上的典型氨基酸替换。这种回复突变标准使得能够恢复亲本抗体的活性。 
生成显示与本文公开抗体相似的功能性质的人工程化抗体的另一种方法，涉及随机突变在移植的CDRs内的氨基酸而不改变构架，并且就与亲本抗体相比具有一样好的或更好的结合亲和力和其他功能性质，筛选所得到的分子。还可以在每个CDR内的每个氨基酸位置上引入单点突变，随后评估此类突变对结合亲和力和其他功能性质的影响。产生改善性质的单点突变可以组合，以评估其彼此组合的作用。 
进一步地，两种前述方法的组合是可能的。在CDR移植后，除在CDRs中引入氨基酸改变外，还可以回复突变特定的构架区。此方法学在Wu，等人，J.Mol.Biol. 294：151-162(1999)中描述。优选地，在构架内的氨基酸置换局限于在本文公开的任何一个或多个轻链和/或重链构架区(即图2-5中所示的构架区)内的一个、两个或三个位置。优选地，在CDRs内的氨基酸置换局限于在3个轻链和/或重链CDRs之任何一个或多个内的一个、两个或三个位置。在构架区和CDRs内描述的各种改变的组合也在本发明的考虑中。在本发明此方面的特定实施方案中，人工程化Mabs或其抗原结合片段的所有轻和重链可变区构架区均是全人的。 
下表1A和1B描述了本发明的优选抗体或其抗原结合片段的CDR氨基酸序列和共有氨基酸序列。下表2A和2B描述了本发明的更优选抗体或其抗原结合片段的CDR氨基酸序列和共有氨基酸序列。 
表1A 
Figure BDA0000065880450000141
Figure BDA0000065880450000151
表1B 
Figure BDA0000065880450000152
Figure BDA0000065880450000161
＊表1A和1B，共有序列1-5(C1-C5)，其中X1是N或S；X2是E、K或R；X3是E或A；X6是S或I；X7是N或K、X4是T、K或R；X5是F、H、Q；X8是L、T、S或A。 
表2A 
Figure BDA0000065880450000171
表2B 
Figure BDA0000065880450000172
Figure BDA0000065880450000181
＊表2A和2B，共有序列6，其中X1是Y、R或K；X2是A或R；X3是T或R；X4是G或R；X5是G或R；X6是T或R；X7是E、T、S或W；X8是K或V；X9是G或R；X10是D或V；X11是L或R；X12是H、R、V或Y；X13是S、W或Y。 
本发明更加优选的抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：170、171、172、23、173和19、或SEQ ID NOs：170、171、172、182、173和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明更加优选的抗体或抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、174、22、175、176和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。基于示例性抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的药代动力学(例如参见实施例11)和药效学(例如参见实施例10和12)特征以及功能性质(例如参见，实施例3(表位作图)、4(亲和力)、5(在体外对细胞内铁蛋白浓度的影响)、6(在体外对经改造而表达FPN1-GFP融合物的细胞与成熟铁调素的结合的影响)、7和9(在体外对铁调素诱导的FPN1内在化和降解的影响)、和8(在体内对血清铁水平的影响)，本发明最优选的Mabs或其抗原结合片段是Mabs4A10-3、L2.2-4和Com11GY，或其抗原结合片段。编码Mabs 34A9、1G9、3D8、Combi11、4A10-3、L2.2-4、1B7、1F8和Com11GY的重链、轻链、 重和轻链可变区、和CDRs的氨基酸序列，通过提及SEQ ID NOs，在下表3(a)和表3(b)中指出。 
表3(a) 
Figure BDA0000065880450000191
表3(b) 
在一些实施方案中，本文公开的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段可以与一种或多种ESAs组合使用，以提供与单独施用ESA治疗比较，在增加血清铁水平、增加血细胞比容、增加血红蛋白水平、减少输血需要、和/或改善贫血患者的功能状态、生产力和生活质量方面的额外益处。短语“联合/组合治疗”或“与之组合”意指本发明的抗FPN1 Mab或其抗原结合片段与另一种活性剂分开、同时或顺次施用，旨在与单独施用抗FPN1 Mab或其抗原结合片段相比，增加血清铁水平、增加血细胞比容、增加血红蛋白水平、减少输血需要、和/或改善贫血患者的功能状态、生产力和生活质量。 
在一些实施方案中，本文公开的抗FPN1 Mab或其抗原结合片段可以代替ESA治疗施用于对ESA治疗不耐受或无应答的患者。 
短语“红细胞生成刺激剂”或“红细胞生成刺激物”意指直接地或间接地引起促红细胞生成素受体激活的化合物，例如通过与受体结合且引起受体二聚化，或通过刺激内源促红细胞生成素表达。ESAs包括结合且激活促红细胞生成素受体的促红细胞生成素及其变体、类似物或衍生物；与促红细胞生成素受体结合且激活受体的抗体；或与促红细胞生成素受体结合且激活促红细胞生成素受体的肽；或与促红细胞生成素受体结合且激活促红细胞生成素受体的小分子有机化学化合物，分子量任选地小于约1000道尔顿。ESAs包括但不限于依泊汀(epoetin)α、依泊汀β、依泊汀δ、依泊汀ω、依泊汀ι、依泊汀ζ及其类似物、聚乙二醇化促红细胞生成素、氨基甲酰化促红细胞生成素、模拟肽(包括EMPl/hematide)、模拟抗体和HIF抑制剂(参见美国专利公开号2005/0020487)。示例性ESAs包括促红细胞生成素、达依泊汀(darbepoetin)、促红细胞生成素激动剂变体、和结合且激活促红细胞生成素受体的肽或抗体，包括美国专利申请公开号2003/0215444和2006/0040858中报道的化合物，以及本领域已知的促红细胞生成素分子或其变体或类似物。促红细胞生成素包括但不限于包含SEQID NO：88中所示氨基酸序列的多肽。术语“依泊汀”包括但不限于依泊汀α、依泊汀β、依泊汀δ、依泊汀ω、依泊汀ι、依泊汀γ、依泊汀ζ等。另外，依泊汀还包括化学修饰的上述任何依泊汀，其例如用一个或多个水溶 性聚合物例如聚乙二醇进行化学修饰(包括PEG-EPO-β)。重组人促红细胞生成素的示例性序列、制造、纯化和用途在许多专利文献中描述，包括但不限于美国专利号4,703,008和4,667,016。达依泊汀和其他促红细胞生成素类似物的示例性序列、制造、纯化和用途在许多专利文献中描述，包括Strickland等人，91/05867，以及PCT国际专利申请公开号WO95/05465、WO 00/24893和WO 01/81405。天然多肽或类似多肽的衍生物包括已进行化学修饰的那些，例如以附着水溶性聚合物(例如聚乙二醇化)、放射性核素、或其他诊断或靶向或治疗性部分。 
术语“促红细胞生成活性”意指刺激红细胞生成的活性，可以在体内测定试验中证实，例如exhypoxic、红细胞增多症小鼠试验(参见例如，Cotes和Bangham，Nature，191：1065(1961))。 
术语“表位”指能够在一个或多个抗体的抗原结合区域上被抗体识别且结合的任何分子的部分。表位通常由分子的化学活性表面组(grouping)，例如氨基酸或糖侧链，组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。本文公开的人FPN1表位在FPN1的一级氨基酸结构(SEQ ID NO：1)中给出。然而，一些表位可以是不连续的而非连续的，因此这些氨基酸残基不是处于连续的肽连接中，而是由于FPN1的三级或四级结构及由此其在该分子表面上的呈递而成为彼此空间接近的。优选地，本发明的抗FPN1 Mab或其抗原结合片段在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列区域中。更优选地，本发明的抗FPN1 Mab或其抗原结合片段在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列中。甚至更加优选地，本发明的抗FPN1Mab或其抗原结合片段在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1但是不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽，其中所述表位包含一个或多个氨基酸、或主 要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列中。 
本发明的抗体还结合食蟹猴FPN1(SEQ ID NO：3)，从而促进在一种或多种灵长类模型中的强制性临床前安全和功效治疗药物开发研究。 
短语“人膜铁转运蛋白1”或可替代地“人FPN1”指在人中表达的具有如SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的铁转运蛋白质，以及保留响应与成熟人铁调素的相互作用而输出细胞铁的能力的变体。 
优选地，本发明的抗FPN1 Mab或其抗原结合片段包括： 
1)分别如SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：134中所示的轻链可变区和重链可变区； 
2)分别如SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：178中所示的轻链可变区和重链可变区；或 
3)分别如SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：138中所示的轻链可变区和重链可变区。 
甚至更加优选地，本发明的抗FPN1 Mab或其抗原结合片段包括： 
1)分别如SEQ ID NO：154和SEQ ID NO：152中所示的轻链和重链； 
2)分别如SEQ ID NO：181和SEQ ID NO：179中所示的轻链和重链；或 
3)分别如SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：156中所示的轻链和重链。 
甚至更加优选地，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段包括： 
1)2条轻链多肽和2条重链多肽，并且其中轻链多肽各自具有如SEQ ID NO：154中所示的氨基酸序列，并且重链多肽各自具有如SEQ ID NO：152中所示的氨基酸序列； 
2)2条轻链多肽和2条重链多肽，并且其中轻链多肽各自具有如SEQ ID NO：181中所示的氨基酸序列，并且重链多肽各自具有如SEQ ID NO：179中所示的氨基酸序列；或 
3)2条轻链多肽和2条重链多肽，并且其中轻链多肽各自具有如SEQ ID NO：158中所示的氨基酸序列，并且重链多肽各自具有如SEQ ID NO：156中所示的氨基酸序列。 
甚至更加优选地，如通过表面等离子体共振在25℃测定的，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段以小于约10nM的KD结合人膜铁转运蛋白1。甚至更加优选地，本发明的单克隆抗体或抗原结合片段包括Fab，其中如通过表面等离子体共振在37℃测定的，所述Fab以小于约100nM的KD结合人膜铁转运蛋白1。更加优选地，如通过SPR在37℃测定的，Fab对于人膜铁转运蛋白1具有约7.5x10-3s-1-约9x10-4s-1的解离速率(koff)。更加优选地，Fab以约100nM-约1nM的KD结合人膜铁转运蛋白1。更加优选地，Fab以约10nM-约.5nM的KD结合人膜铁转运蛋白1。更加优选地，单克隆抗体或抗原结合片段在铁调素-25生物活性的体外测定试验中具有约100nM-约1nM的IC50。更加优选地，单克隆抗体或其抗原结合片段在铁调素-25生物活性的体外测定试验中具有约100nM-约10nM的IC50。更加优选地，铁调素-25生物活性是膜铁转运蛋白1的内在化和/或降解。更加优选地，单克隆抗体或其抗原结合片段在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约100nM-约1nM的IC50。更加优选地，铁调素-25生物活性的体内测定试验测量灵长类动物中IL-6诱导的血清铁水平降低。最优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、或小于约10nM。优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD为约100nM-约.5nM、优选约100nM-约.5nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM。优选地，抗FPN1Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，解离速率(koff)为约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1。优选地，抗FPN1Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、或小于约10nM，并且对于人膜铁转运蛋白1，解离速率(koff)为约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约 1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1。优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM，并且对于人膜铁转运蛋白1，解离速率(koff)为约7.5x 10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1。优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、或小于约10nM。优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在一些实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分 别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD为约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM。优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在其他实施方案中，本发明提供Mab或其抗原结合片段，该Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，解离速率(koff)为约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1。优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位 包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、或小于约10nM，并且对于人膜铁转运蛋白1，解离速率(koff)为约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1。优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在一些实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD为约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM，并且对于人膜铁转运蛋白1，解离速率(koff)为约7.5x 10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1。优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
术语“抑制”意指拮抗、阻止、预防、限制、减缓、破坏、消除、停止、减少或逆转FPN1的生物效应和/或成熟铁调素的生物活性，包括但不限于如例如本文实施例5-11、13或14中测量的成熟人铁调素生物活性，的能力。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。 
另外或可替代地，本发明的抗FPN1Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在铁调素-25生物活性的体外测定试验中具有约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50。优选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1的内在化和/或降解。更加优选地，抗FPN1Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、或小于约10nM；并且在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。更加优选地，抗FPN1Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD为约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM- 约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM；并且进一步特征在于在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD为约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM；且如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，具有约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1的解离速率(koff)；且进一步特征在于在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包括SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且在如下 表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、或小于约10nM；并且如通过SPR测定的，，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，解离速率(koff)为约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1；并且进一步特征在于在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在一些实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD为约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM；并且如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃并且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，解离速率(koff)为约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1 x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1；并且进一步特征在于在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在本发明的一些实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、或小于约10nM；并且在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50，并且进一步特征在于，在铁调素-25生物活性的体外测定试验中具有约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。优选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1的内在化和/或降解。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段的特征在于，在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD为约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、 更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM；并且在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50；并且进一步特征在于，在铁调素-25生物活性的体外测定试验中具有约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。优选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1的内在化和/或降解。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在一些实施方案中，本发明提供了Mabs或其抗原结合片段，该Mabs或其抗原结合片段在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中；并且1)如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD为约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM，2)在铁调素-25生物活性的体内测定试验中约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50，3)在铁调素-25生物活性的体外测定试验中约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50，和4)如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1的解离速率(koff)。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。优 选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1的内在化和/或降解。更加优选地，抗FPN1Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且特征在于在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。更加优选地，抗FPN1Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且特征在于在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50，和在铁调素-25生物活性的体外测定试验中约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。优选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1的内在化和/或降解。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中， 如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、或小于约10nM；且在铁调素-25生物活性的体内测定试验中约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。更加优选地，抗FPN1Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD为约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM；并且进一步特征在于，在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于 选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM；如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1具有约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1的解离速率(koff)；并且进一步特征在于，在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD小于约100nM、小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、或小于约10nM；并且如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，具有约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1的解离速率(koff)；并且进一步特征在于在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50。 优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在本发明的一些实施方案中，本发明的抗FPN1Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD小于约75nM、小于约50nM、小于约25nM、或小于约10nM；并且在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50；并且进一步特征在于在铁调素-25生物活性的体外测定试验中具有约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。优选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1内在化和/或降解。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，其中，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD为约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、 更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM；并且在铁调素-25生物活性的体内测定试验中具有约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50；并且进一步特征在于在铁调素-25生物活性的体外测定试验中具有约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。优选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1内在化和/或降解。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、129、22、107、118和120中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中，并且1)如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，KD为约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM，2)在铁调素-25生物活性的体内测定试验中约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50，3)在铁调素-25生物活性的体外测定试验中约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50，和4)如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加 优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1的解离速率(koff)。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。优选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1内在化和/或降解。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、125、22、23、110和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中；并且特征在于，如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，具有约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM的KD，2)在铁调素-25生物活性的体内测定试验中约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50，3)在铁调素-25生物活性的体外测定试验中约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50，和4)如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1的解离速率(koff)。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。优选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1内在化和/或降解。更加优选地，抗FPN1Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ IDNOS：98、183-214的一种或多种肽。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗 原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、177、22、23、112和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中；并且特征在于具有1)如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM的KD，2)在铁调素-25生物活性的体内测定试验中约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50，3)在铁调素-25生物活性的体外测定试验中约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50，和4)如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1的解离速率(koff)。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。优选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1内在化和/或降解。更加优选地，抗FPN1Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括分别包含SEQ ID NOs：37、122、22、23、110和19中所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3；并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位 包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中；并且特征在于具有1)如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM的KD，2)在铁调素-25生物活性的体内测定试验中约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50，3)在铁调素-25生物活性的体外测定试验中约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50，和4)如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1的解离速率(koff)。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。优选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1内在化和/或降解。更加优选地，抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段不结合选自SEQ ID NOS：98、183-214的一种或多种肽。 
在特定实施方案中，本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段包括： 
a.分别如SEQ ID NO：154和SEQ ID NO：152中所示的轻链和重链； 
b.分别如SEQ ID NO：181和SEQ ID NO：179中所示的轻链和重链；或 
c.分别如SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：156中所示的轻链和重链；并且在如下表位结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人FPN1，所述表位包含一个或多个氨基酸、或主要由之组成或由之组成，所述氨基酸定位于选自SEQ ID NO：12、13、14、15、16和95的氨基酸序列区域中；并且特征在于具有1)如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃ 且对于Fabs在37℃测定，约100nM-约.5nM、优选约100nM-约1nM、更优选约75nM-约5nM、更加优选约50nM-约10nM、更加优选约15nM-约10nM、更加优选约10nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.5nM、更加优选约5nM-约.7nM、更加优选约3nM-约.7nM、或最优选约3nM-约1nM的KD，2)在铁调素-25生物活性的体内测定试验中约250nM-约25nM、优选100nM-约25nM、或更优选50nM-约25nM的IC50，3)在铁调素-25生物活性的体外测定试验中约100nM-约1nM、优选约75nM-约1nM、更优选约50nM-约1nM、更加优选约25nM-约1nM的IC50，和4)如通过SPR测定的，优选地对于Mabs在25℃且对于Fabs在37℃测定，对于人膜铁转运蛋白1，约7.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、优选约2.5x10-3s-1-约1x10-4s-1、更优选约1x10-3s-1-约1x10-4s-1、且更加优选约5x10-4s-1-约1x10-4s-1的解离速率(koff)。优选地，体内测定试验测量IL-6诱导的血清铁水平降低。优选地，铁调素-25生物活性的体外测定试验测量铁调素诱导的膜铁转运蛋白1内在化和/或降解。 
术语“治疗”指减缓、中断、停滞、控制、停止、减少或逆转症状、病症、病状或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关症状、病状或病症的完全消除。 
术语“预防”(或“防止”)意指阻止、限制或抑制症状、病症、病状或疾病的发生或出现。可以治疗且预防急性事件和慢性病状。在急性事件中，抗体或其抗原结合片段在症状、病症、病状或疾病发作时施用，并且在急性事件终止时中止。相比之下，跨更延长的时间窗，治疗慢性症状、病症、病状或疾病。 
“病症”是将获益于根据本发明的治疗的任何病状。术语“病症”(disorder)、“病状”(condition)和“疾病”(disease)在本文中可互换使用，并且包括慢性和急性的由成熟铁调素促进的病症，包括但不限于贫血，包括但不限于慢性病性贫血。 
术语“慢性病性贫血”指由于例如长期的感染、炎症和赘生性病症而发 展的任何贫血。该发展的贫血的特征常常在于，缩短的红细胞寿命和铁在巨噬细胞中的隔离，这导致可用于制备新红细胞的铁量降低。与慢性病性贫血相关的病状包括但不限于，慢性细菌性心内膜炎、骨髓炎、风湿热、溃疡性结肠炎和赘生性病症。其它病状包括与感染、炎症和赘生相关的其他疾病和病症，包括例如炎症性感染(例如肺脓肿、结核)，炎症性非感染性病症(例如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、肝炎、炎性肠病)，以及各种癌症、肿瘤和恶性病(例如癌、肉瘤、淋巴瘤)。慢性病性贫血与低铁血症和网状内皮细胞铁隔离相关。 
炎性细胞因子是铁调素表达的有力诱导物，并且铁调素过量可以在这些患者的贫血发病中起关键作用(Weiss，等人，N.Engl.J.Med.，352：1011-1023(2005)；Pigeon.等人，J.Biol.Chem.276：7811-7819(2001)；Nicolas，等人，J.Clin.Invest.110：1037-1044(2002)；Nemeth，等人，J.Clin.Invest.113：1271-1276(2004)；Nemeth，等人，Blood，101：2461-2463(2003)；Lee，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，102：1906-1910(2005))。炎性介质例如IL-6可以通过STAT3调节铁调素表达(Wrighting，等人，Blood，108：3204-3209(2006)；Verga Falzacappa，等人，Blood，109：353-358(2007)；Pietrangelo等人，Gastroenterology，132：294-300(2007))。本文呈现的数据提供本发明的抗FPN1 Mabs增加血清铁水平的体内证据。 
本发明还提供治疗贫血的方法，其包括施用本发明的抗FPN1 Mabs或其抗原结合片段。在一些实施方案中，治疗贫血的方法包括步骤：使用标准施用技术，给有发生本文描述的病理状况的危险或显示如本文描述的病理状况，如贫血病症，的受试者，施用包括抗FPN1 Mab或其抗原结合片段的药物组合物。 
如本文使用的，短语“有效量”指(以剂量和时间段以及施用方式)达到所需治疗结果必需的量。抗体的有效量可以根据多种因素而变，例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及抗体或抗体部分在个体中引发所需应答的能力。有效量也是治疗有益效果胜过抗体的任何毒性或有害效应时的量。 
有效量是至少对受试者赋予治疗益处所需的活性剂最低量，但小于毒性量。换言之，本发明抗体的有效量或治疗有效量将是这样的量，该量在哺乳动物优选人中(i)增加血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容；或(ii)治疗病症，其中在该病症中成熟铁调素的存在引起或促成了不希望有的病理学效应；或(iii)降低成熟铁调素生物活性，从而在哺乳动物，优选地人，包括但不限于具有贫血(包括但不限于慢性病性贫血，包括但不限于起因于感染、炎症和/或癌症的贫血)的哺乳动物，优选地人中导致有益治疗效果。有效量的本发明的抗体可以以单个剂量或多个剂量施用。此外，有效量的本发明的抗体可以以如下量的多个剂量施用，所述量如果不施用一次以上则将小于有效量。 
如医学领域众所周知的，用于任何一个受试者的剂量依赖于许多因素，包括患者的体积、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康、和待并行施用的其他药物。剂量可以进一步依赖于疾病类型和严重性而变。一般剂量可以是例如在约1mg-约100mg范围中；优选约2mg-约100mg；更优选约5mg-约100mg；更加优选约5mg-约50mg，更加优选约5mg-约25mg；更加优选约5mg-约20mg；更加优选约5mg-约15mg；然而，特别是在考虑上述因素时，可以预见到低于或高于该示例性范围的剂量。每日肠胃外给药方案可以是约10μg/kg-约100mg/kg、优选约100μg/kg-约100mg/kg、更优选约1mg/kg-约100mg/kg、更加优选约1mg/kg-约30mg/kg、更加优选约3mg/kg-约30mg/kg、或最优选约3mg/kg-约30mg/kg。可以通过定期评估，监控进展，并且相应调整剂量。 
这些提出的抗FPN1抗体量将接受大量的治疗判断。选择合适剂量和给药时间安排的关键因素是所获得的结果。在此考虑的因素包括待治疗的具体病症、患者个体的临床病状、病症起因、抗体递送部位、抗体具体类型、施用方法、施用时间安排、和医学从业者已知的其他因素。 
本发明的抗体可以在人类医学中用作药物，通过各种途径施用。最优选地，此组合物用于肠胃外施用。此药物组合物可以通过本领域众所周知 的方法进行制备。参见例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(1995)，Gennaro，A.，等人，Mack Publishing Co.。因此，本发明还提供了药物组合物，其包括与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的本发明的一种或多种抗体。在一个特定实施方案中，药物组合物进一步包括一种或多种其他治疗剂。 
如本文使用的，术语肠胃外包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道或腹膜内施用。通过静脉内输注或静脉内、腹膜内或皮下注射的肠胃外递送是优选的。皮下注射是最优选的。用于此类注射的合适媒介物是本领域众所周知的。 
药物组合物一般必须是无菌的且在制备和贮存条件下在提供的容器中是稳定的，所述容器包括例如密封小瓶、注射器或其他递送装置例如笔。因此，药物组合物可以在制剂配制后进行无菌过滤，或以其他方式成为微生物学上可接受的。 
本发明的抗体可以掺入适合于施用于人受试者的药物组合物内。本发明的抗体可以以单个或多个剂量单独或与药学上可接受的载体和/或稀释剂组合施用于人受试者。此类药物组合物设计为适合于选择的施用方式，并且酌情地使用药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂，例如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂，包括但不限于氯化钠、稳定剂等。所述组合物可以依照例如Remington，The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro，编辑，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)中公开的常规技术进行设计，其提供了从业者一般已知的配制技术的纲要。用于药物组合物的合适载体可以包括当与本发明的抗体组合时保留该分子的活性并且与受试者的免疫系统不反应的任何物质。 
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，优选地人。在特定实施方案中，患者具有这样的病症，其将获益于成熟铁调素水平的降低，成熟铁调素生物活性的降低，和/或血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容的增加。 
单独FPN1抗体化合物施用可以用于如下患者，所述患者由于例如不 希望有的副作用而对一种或多种ESAs在任何剂量下或仅在高剂量下是不耐受的。也可以在如下ESA抗性患者中单独施用或与ESA组合施用本发明的FPN1 Mab或其抗原结合片段，所述ESA抗性患者用单独的ESAs以常规或高剂量不能实现其血细胞比容目标。 
本发明的FPN1 Mab或其抗原结合片段也可以在联合的药物治疗，包括使用ESAs，不足以允许患者达到其血细胞比容目标时施用。 
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制造药物的用途，所述药物用于增加人中的血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容。 
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段在制造用于在联合治疗中使用的药物中的用途，所述联合治疗用于增加人中的血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容，其中所述药物待与一种或多种ESAs或其他治疗剂或治疗处理组合施用，所述ESAs选自依泊汀α、依泊汀β、达依泊汀α、hematide、甲氧基聚乙二醇-依泊汀β，所述其他治疗剂或治疗处理为常规用于增加人中的血清铁水平、网织红细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容的治疗剂或治疗处理。 
下述非限制性实施例举例说明了本文公开的抗FPN1抗体的各种性质。 
实施例1：人铁调素-25的产生 
人铁调素-25可以得自商业来源(例如Peptide International(Louisville，Kentucky))，或通过本领域已知的各种合成或重组技术产生。可替代地，在大肠杆菌中表达包括人铁调素-25序列的25个氨基酸且具有如SEQ ID NO：91中所示氨基酸序列的融合蛋白。在37℃用1mMIPTG诱导3-6小时后，从表达人铁调素融合蛋白的3升大肠杆菌中分离包含体。使包含体在缓冲液A(50mM Tris和8M尿素(pH 8.0))中溶解。使上清液经过IMAC柱(20mL树脂)。用缓冲液A洗涤柱，直至吸光度 回到基线，并且通过在缓冲液A中的0.5M咪唑，从柱中分批洗脱结合的多肽。合并人铁调素-25融合蛋白，并且用50mM DTT还原。随后通过如下方式，使融合蛋白重折叠：将合并物在2M尿素、3mM半胱氨酸、50mMTris(pH 8.0)内稀释至小于50μg/mL的最终蛋白质浓度。在室温搅拌该物质并且空气氧化48小时。使氧化后的多肽以5mL/分钟的流速经过IMAC柱(20mL)，并且通过在缓冲液A中的0.5M咪唑，从柱中分批洗脱人铁调素-25融合蛋白。将包含人铁调素-25融合蛋白的合并级分浓缩，并且以3mL/分钟的流速通过用50mM Tris、4M尿素，pH 8.0平衡过的Superdex 75(GE Healthcare，XK26/60)筛分柱。将单体融合蛋白合并，并且随后稀释在50mM Tris、2M尿素、5mM CaCl2，pH 8.0中，随后用肠激酶切割，以产生SEQ ID NO：1的人铁调素-25。通过被动IMAC层析(如上所述)去除未切割的人铁调素-25融合蛋白。来自IMAC柱的流过物(flow through)随后以4.0mL/分钟的流速通过C-18反相柱。用在水中的0.1％TFA洗涤柱，直至吸光度回到基线，并且用从20％到40％的乙腈线性梯度及0.1％TFA以0.5％/分钟的速率从柱中洗脱结合的多肽。合并包含人铁调素-25多肽的级分，并且通过N端氨基酸测序和基质辅助激光解吸/电离质谱法(MALDI-MS)进行分析。商业(例如Peptide International)获得编码大鼠、小鼠和食蟹猴铁调素-25的多肽、以及人铁调素-25的各种N端截短形式，包括铁调素-22和铁调素-20。 
实施例2：34A9 Fab的生成 
抗FPN1抗体可以通过用免疫原性肽免疫接种小鼠来获得，所述免疫原性肽具有如SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列。更具体而言，包括通过肽接头与SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列连接的OVA表位的免疫原性肽可以用于免疫接种小鼠，SEQ ID NO：12被认为是人FPN1的细胞外环的至少部分。在免疫后，收获小鼠脾脏，并且使用具有SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的生物素化肽和链霉亲和素珠，通过磁性激活细胞分选来分选脾细胞。从抗原结合细胞中分离RNA，并且使用寡聚dT转换成 cDNA。使用抗体构架引物通过PCR获得抗体重和轻链可变区，且克隆到噬菌体载体内，以制备Fab抗体文库。噬菌体抗体文库用例如100nM生物素化肽进行筛选，所述生物素化肽具有SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列。随后通过DNA测序、Fabs表达和与免疫肽和/或表达人膜铁转运蛋白的细胞结合，表征阳性结合克隆。根据基本上如上所述的操作，鉴定了Fab 34A9。 
实施例3：抗FPN1 Mabs的表位作图 
包含该FPN1相关免疫原的部分序列的肽可以用于斑点印迹杂交实验中，以测定小鼠Mab 34A9的表位。可以合成下述肽且溶解于水中(有下划线的氨基酸指示实际FPN1氨基酸序列)： 
FpnE3a     (SEQ ID NO：96)： GGSPFEDIRSRFIQGESITPTKGC 
060719Z    (SEQ ID NO：97)： GGSPFEDIRSRFIQGC 
060719Y    (SEQ ID NO：98)： GGIQGESITPTKIPEITTEGC 
0708L4A    (SEQ ID NO：99)： GGMPGSPLDLSVSPFEDGC 
0708L4B    (SEQ ID NO：100)：GGSPLDLSVSPFEDIRSGC 
0708L4C    (SEQ ID NO：101)：GGEDIRS RFIQGESITGC 
0708L4D    (SEQ ID NO：102)：GGRSRFIQGESITPTKGC 
对于每种肽，将3μl的1-5μg/mL肽点在硝酸纤维素膜片上并且风干。用封闭缓冲液(例如，包含1％BSA的PBS)封闭膜，随后在封闭缓冲液中室温与3-5μg/mL FPN1抗体孵育1小时。膜用1x PBST(10mM磷酸钠、150mM NaCl、0.1％Tween-20，pH 7.4)洗涤3次，每次5分钟；之后，根据制造商的方案(LiCor，Inc；Lincoln，NE)，与IR700标记的山羊抗小鼠抗体一起孵育。膜用1x PBST洗涤3次，每次5分钟，使用Odyssey成像系统和Odyssey软件(LiCor，Inc)进行成像。 
表1指出Mab 34A9与FpnE3a、060719Z、0708L4C和0708L4D肽结合，所有这些肽都包含SEQ ID NO：1的氨基酸409-415。Mab 34A9不需要EDI的氨基酸序列，如通过与肽0708L4D的结合所指示的。Mab 34A9与肽060719Z的结合比与0708L4C的结合弱；后面一种肽包含FPN1(SEQ ID NO：1)的氨基酸416-419。 
实施例4：通过SPR测定抗FPN1 Fabs和Mabs的亲和力 
可以在Biacore T100上，使用在Biacore T100评估软件( 
Figure BDA0000065880450000481
AB，Upsala，瑞典)中的1∶1结合模型，测定FPN1结合Fabs和Mabs的亲和力。简言之，T-REx系统，一种商购可得的无病毒反式激活物的四环素调节的表达系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)，用于在T-Rex HEK293细胞中生成稳定细胞系。所有生长条件在由Invitrogen提供的T-REx手册中描述。FPN1与GFP在C末端上融合。用1-10ng/mL多西环素诱导FPN1-GFP的表达1-24小时。通过从烧瓶上刮取来收获诱导后的细胞，并且随后用1x PBS洗涤。在使用前细胞团块可以贮存于-80℃。使约5百万诱导细胞重悬浮于含0.2％Tween-20和蛋白酶抑制剂的10mM磷酸盐缓冲液中，所述蛋白酶抑制剂例如CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail Tablet(Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，IN)。使用3个循环的冷冻/融化/超声处理，裂解细胞。用Biacore运行缓冲液将裂解产物稀释2倍，并且离心以去除碎片。 
在Biacore T100上，以5000-15000Rus，将兔抗GFP抗体或山羊抗GFP抗体固定到CM5芯片的流室1-4上。将来自诱导细胞的裂解产物的FPN1-GFP捕获到流室2、3或4上。流室1用作参照。随后所有流室注入不同浓度的抗体，以评估结合和动力学。为使亲合力效应(avidity effect)最小化，使用单价抗原结合片段例如Fabs的基于表面等离子体共振的测量一般优于在这种测定形式中使用多价抗体。表4a和4b显示抗人FPN1结合性Fabs的结合特征，其中分别使用兔抗GFP抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA(目录#A11122))和山羊抗GFP抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN(目录#AF4240))。 
表4(a)：来自FPN1抗体的Fabs与人FPN1的结合动力学(通过Biacore T100在37℃测定) 
  Fab   Kon(M-1s-1)   Koff(s-1)   动力学KD(M)
  34A9   6.321E+04   2.620E-03   4.145E-08
  1G9   1.269E+05   8.974E-04   7.707E-09
  3D8   1.920E+05   2.000E-03   1.042E-08
如表4(a)中所示，在这种测定形式中，通过SRP在37℃测定，小鼠Fab 34A9对于人FPN1的KD是约41nM。通过SRP在37℃测定，小鼠Fab 1G9(小鼠Fab 34A9的亲合力成熟形式)对于人FPN1的KD是约7.7nM，结合亲合力提高约5倍。在这种测定形式中，通过SRP在37℃测定，Fab 3D8(具有人重链构架VH1-69和轻链构架O2的人源化形式的小鼠Fab 1G9)显示对于人FPN1的约10nM的KD。 
表4(b)：来自FPN1抗体的Fabs与人FPN1的结合动力学(通过Biacore T100在37℃测定) 
如表4(b)中所示，在这种测定形式中，通过SRP在37℃测定，小鼠Fab 1G9(小鼠Fab 34A9的亲合力成熟形式)对于人FPN1的KD是约2.9nM。在这种测定形式中，通过SRP在37℃测定，Fab 3D8(具有人重链构架VH1-69和轻链构架O2的人源化形式的小鼠Fab 1G9)显示对于人 FPN1的约6.3nM的KD。在这种测定形式中，通过SRP在37℃下测定，亲合力成熟的Fabs 4A10-3、Combi11和L2.2-4显示对于人FPN1的约2.4nM-约1.8nM的KD。 
表5显示使用兔抗GFP抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA(目录#A11122))时抗人FPN1结合性Mabs的结合特征。 
表5：Mabs与人FPN1的结合动力学(通过Biacore T100在25℃或37℃测定) 
  Mab   温度  Kon(M-1s-1)   Koff(s-1)   动力学KD(M)
  小鼠34A9   25℃  6.901E+04   8.155E-05   1.182E-09
  小鼠1G9   25℃  1.348E+05   9.813E-05   7.281E-10
  人3D8   37℃  3.252E+05   1.095E-03   3.366E-09
通过SRP在25℃测定，小鼠34A9Mab对于人FPN1的KD是约1.1nM。通过SRP在25℃测定，小鼠1G9Mab(小鼠34A9Mab的亲合力成熟形式)对于人FPN1的KD是约0.73nM。通过SRP在37℃测定，具有人重和轻链构架VH1-69和O2的人源化形式的小鼠1G9Mab，3D8Mab，显示对于人FPN1的约3.4nM的KD。 
如这个实施例中所述测定的对人FPN1的KD，说明针对人FPN1的抗体的生成，其以高亲和力结合人FPN1，并且更具体而言，与甚至当人FPN1由细胞表达且定位至细胞膜时也存在的FPN1表位结合。 
实施例5：FPN1 Mabs对细胞铁蛋白水平的影响的体外测定试验 
可以监控Caco-2细胞，内源表达FPN1的人肠细胞系，中的铁蛋白改变。在Caco-2细胞中的铁蛋白浓度可以通过加入外源铁源得到增加，并且该浓度可以通过添加阻止铁输出的铁调素进一步提高。因此，可以如下测定在Caco-2细胞中抗人FPN1抗体对成熟铁调素调制的铁调节作用的影响。 
使用胰蛋白酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)从细胞培养瓶中取出Caco-2 细胞。收集细胞并且在生长培养基(例如DMEM+10％FBS+1％非必需氨基酸+1％抗生素/抗真菌剂)中洗涤，温和离心收集。细胞重悬浮于培养基中并且计数。在生长培养基中将细胞浓度调整至1x106细胞/mL，并且将2.5μM Fe∶NTA(1∶4摩尔比制备)加入细胞中。将100μl细胞加入96平底孔板的孔中，随后在37℃、5％CO2下孵育24小时。在生长培养基中以6x最终浓度制备小鼠IgG1阴性对照、和对于人FPN1具有不同亲和力的2种抗体。将抗体稀释物(25μL)或培养基一式三份地加入孔中。使板在室温下孵育15分钟，在这时将含或不含600nM铁调素(100nM最终浓度)的25μL5μM Fe∶NTA加入合适孔中。使细胞在37℃、5％CO2下孵育24小时，并且随后用200μl达尔贝科氏PBS洗涤3x，并且在50μL放射免疫沉淀测定缓冲液(50mM Tris，pH 7.5、150mM NaCl、0.1％SDS、1％Triton- 
Figure BDA0000065880450000511
和0.5％脱氧胆酸钠)加上蛋白酶抑制剂例如CompleteTMProtease Inhibitor Cocktail Tablet(Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，IN)中裂解，混合且在70℃冷冻，直至使用ELISA就铁蛋白进行测定。 
简言之，用110μL/孔1μg/mL抗人铁蛋白(Leinco Technologies，St.Louis，MO)包被微量滴定板，并且在4℃下孵育过夜。板用洗涤缓冲液(0.02M Tris、0.15M NaCl、0.1％Tween 20，pH 7.4)洗涤2次，并且用在PBS中的150μL 1％酪蛋白(Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL)封闭。使板在室温下孵育1小时。将100微升(μL)裂解产物和标准品(人肝铁蛋白，Calbiochem/EMD Biosciences，La Jolla，CA)加入合适孔中，并且在室温下孵育1小时。洗涤板3次，如下检测结合的铁蛋白：以100μL/孔使用以1∶2000稀释的抗铁蛋白-HRP缀合物(Leinco Technologies)，在室温下孵育1小时。洗涤板4次，并且将100μL OPD底物(5mg底物片剂，溶解于12.5mL 0.1M Na2HPO4、0.05M柠檬酸，pH 5.0以及5μL30％H2O2中)分配至所有孔。在10分钟后用100μL 1N HCl停止反应。使用合适的ELISA板阅读器读取在490nm的吸光度(A490)。在每种样品中的蛋白质浓度也使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行测量。为了考虑可能的孔与孔在细胞数目上的差异，将铁 蛋白浓度数据针对蛋白质浓度标准化，并且所加入抗体的效应表示为抑制百分比。 
如这个实施例中所述进行的实验表明，人铁调素-25对细胞中的铁蛋白浓度的影响可以被Mabs 34A9和1G9抑制(表6)。此外，结果显示抗FPN1Mab的亲和力直接牵涉到其功能性。更具体而言，较低亲和力的Mab 34A9，即使在最高浓度(200μg/mL)，也仅轻微抑制成熟铁调素诱导的效应(25％抑制±.5％)，而较高亲和力的Mab 1G9显示以剂量依赖性方式的显著抑制。 
表6 
Figure BDA0000065880450000521
这个数据举例说明Mabs 1G9和34A9封闭人铁调素-25诱导膜铁转运蛋白内在化和降解的能力，并且因此减少由细胞输出的铁。 
实施例6：用于抑制人铁调素-25与FPN1结合的试验 
将稳定转染的FPN-GFP/293细胞以60,000细胞/孔种在多聚-D-赖氨酸包被的板中，于80μL试验培养基(DMEM 11965、10％透析的FBS、20μMFAC，青霉素-链霉素)中，并且在37℃、10％CO2下孵育4小时。加入多西环素至11.2nM的最终浓度，以诱导FPN1表达。多西环素诱导的和未诱导的对照细胞在37℃下孵育过夜。接下来，弃去生长培养基，并且替换为在30μL试验培养基中的测试抗体或同种型对照抗体或单独30μL试验培养基对照，并且在37℃下孵育1小时。接下来，将20μL生物素化的成熟人铁调素加入孔中，至30nM的最终浓度。样品在37℃留置1小时，之后用200μL 2％FBS、D-PBS(Invitrogen，Carlsbad，CA)洗涤4次。接下来，加入65μL裂解缓冲液(0.5％Triton X-100、10mM EDTA)，并且振荡板10分钟。接下来，将每个孔中的50μL溶液转移到链霉亲和素包被的板的各孔中(60μL 2μg/mL在PBS中的链霉亲和素，在4℃孵育过夜，洗涤2次(0.1％Tween 20、TBS)，用酪蛋白/PBS封闭)，随后在室温孵育1小时。接下来，洗涤板孔3次(0.1％Tween 20、TBS)，加入0.5μg/mL的50μL抗人铁调素-25Mab 3.23，并且使样品在室温下孵育1小时。抗人铁调素-25Mab 3.23在PCT国际专利申请公开WO 2009/058797中描述。接下来，洗涤板3次，并且加入以1∶2000稀释的50μL抗人IgG-辣根过氧化物酶(HRP)。在室温下孵育1小时后，加入50μL OPD底物。在4分钟后用100μL 1N HCl停止反应。使用合适的ELISA板阅读器，读取在490nm的吸光度(A490)。 
表7 
在基本上如实施例6中所述进行的实验中生成的数据证实，Mabs 1G9和34A9抑制人铁调素-25结合人FPN1的能力。 
实施例7：抗FPN1抗体抑制铁调素-25诱导的内在化和降解的基于细胞的测定试验 
可以用体外基于细胞的测定试验，测量抗人FPN1的Mabs或其抗原结合片段的中和成熟铁调素的活性。此测定试验可以基于成熟铁调素诱导的其受体FPN1的内在化和降解而进行。例如，制备允许诱导表达FPN1的HEK 293稳定细胞系。为追踪目的，FPN1可以与GFP在C末端上融合。使用T-REx系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)控制FPN1-GFP分子的诱导表达。将FPN1-GFP编码序列克隆到pCDNA4/TO载体内，该载体包含诱导型启动子和Zeocin抗性标记。将所得到的构建体转染到T-REx-293细胞内，所述T-REx-293细胞表达多西环素诱导表达所需的调节性蛋白质。Zeocin抗性克隆就FPN1-GFP的诱导表达进行测试。细胞生长条件基本上如制造商的T-REx System(Invitrogen)用户手册中所述。简言之，细胞在DMEM、10％透析的FBS、20μM FAC加上5μg/mL青 霉素-链霉素中生长。用100μg/mL zeocin和5μg/mL杀稻瘟菌素维持选择。将细胞种在用多聚-D-赖氨酸包被的96孔黑色/透明板上。Acumen Explorer HTS高分辨率荧光板阅读器用于读取总荧光/孔。 
在胰蛋白酶消化后，使用FPN1-GFP/TREx 293稳定细胞系，以9,000细胞/孔种植96孔测定板。种植体积/孔是80μL。允许细胞贴壁过夜。第二天早晨，将9μL 30ng/mL多西环素加入每个孔中，以诱导FPN1-GFP表达。在37℃诱导8小时后，抽吸培养基并且用150μL/孔PBS小心地洗涤孔。 
所需处理(例如人铁调素-25和/或测试抗体)以96孔形式建立，以便快速加入洗涤后的测定板中。最终测定体积/孔是45μL。紧在加入处理后，使用Acumen Explorer(设为550伏、在通道1中)读取测定板。这个读数一般是0小时读数，并且用于标准化细胞数目/孔(其与总荧光单位(FLU)/孔相关)。对于成熟人铁调素诱导的FPN1内在化和降解，在0.5μM成熟人铁调素下观察到最大效应。成熟人铁调素的IC50是约10nM。对于抗FPN1抗体中和测定试验，人铁调素-25浓度保持在120nM，并且抗FPN1Mabs在600nM、200nM、67nM、22nM和7.4nM进行测试。使板孵育24小时，这之后，对板进行再次读数，数据产生为24小时时的总FLU/孔除以在0小时时的总FLU/孔的比值。所有数据点一式四份地完成。抑制百分比(％)通过下述进行确定：扣除120nM成熟人铁调素处理的值，然后用该FPN1抗体处理的值除以无人铁调素-25处理的值。 
在基本上如上所述执行的体外测定试验中，人铁调素-25的生物活性被各种抗FPN1 Mabs中和，测量的抑制百分比如下表8中所示。 
表8：在体外抗FPN1Mab对成熟人铁调素诱导的内在化和降解的抑制百分比(％) 
    Mab 34A9   Mab 1G9   Mab 3D8
  600nM的Mab   39.0％   67.9％   66.4％
  200nM的Mab   30.8％   62.4％   63.8％
  67nM的Mab   23.6％   61.8％   55.7％
  22nM的Mab   14.1％   49.9％   50.2％
  7.4nM的Mab   4.8％   24.3％   28.1％
在基本上如实施7中所述进行的实验中生成的数据支持结论：Mabs1G9、34A9和3D8在体外极大地抑制人铁调素-25引起人FPN1内在化和降解的能力。 
实施例8：在对食蟹猴给予单个静脉内剂量后Mab 1G9相对于对照鼠IgG1的生物活性 
将Mab以单个静脉内剂量施用于雄性食蟹猴(Macaca fascicularis；3-4kg)，并且将其作用与鼠IgG1对照施用比较，研究了抗人FPN1鼠Mab 1G9对血清铁调素和血清铁水平的生理学影响。在施用后，收集血样用于分析血清铁和血清铁调素。剂量(30mg/kg)经由隐静脉注射施用。紧在剂量施用后，但在从动物中取出针头前，用约2mL盐水冲洗给药器。 
表9 
Figure BDA0000065880450000561
取样用于血清铁调素： 
在给药前以及在剂量后0.5、1、3、6、10、24、48、72、96和168小时时，收集血液。经由股静脉将血液(约0.5mL)收集到不含抗凝剂的管内。允许血液在环境条件下凝结，之后离心获得血清。将血清样品置于干冰上，之后贮存于约-70℃。 
取样用于血清铁： 
在给药前以及在剂量后1、3、6、24、48、72、96和168小时时，收集血液。依照在医学界内认为可接受的方法，收集所有血样，处理，加工，贮存且分析。血清铁水平可以通过在医学界内一般被认为是测量总血清铁(Fe)的可接受方法的本领域已知的任何方法进行测量。铁调素的血清浓度通过液相层析-质谱法进行了测定，基本上如Murphy，等人，Blood，110：1048-54(2007)中所述。用于测量血清铁的测定试验是本领域众所周知的(参见例如，Goodwin，J.F.，等人，Clinical Chemistry 12：47-57(1966)，和J.Clin.Path.，24：334-335(1971))。 
血清铁调素浓度不受对照鼠IgG1施用的影响，并且在研究时间过程中为1.5-31ng/mL。对照动物中的平均铁调素水平是11.5±8.8ng/mL(平均值±SD)。在鼠Mab 1G9施用后，血清铁调素水平从7.6和14.7ng/mL的基线分别升高到49.7和79.1ng/mL的峰值。血清铁调素的峰值在鼠Mab1G9施用后约10小时发生(图6)。血清铁调素的升高可能是由于鼠Mab1G9与其靶FPN1的相互作用，其在与FPN1结合后封闭FPN1和铁调素的相互作用，从而减慢FPN1的清除和/或内在化。 
血清铁在用对照鼠IgG处理的动物中未升高，并且在研究的时间内范围为64-97μg/dL。在鼠Mab 1G9施用后，血清铁水平从136和144μg/dL的基线分别升高到306和292μg/dL的峰值。血清铁的峰值在鼠Mab 1G9施用后约48小时发生(图7)。血清铁水平到施用后96小时时逐渐回到基线，说明血清铁水平的升高是可逆的。 
实施例9：抗FPN1抗体抑制铁调素-25诱导的内在化和降解的基于细 胞的测定试验 
基本上如上文实施例7中所述进行的实验证实，与Mabs 34A9、3D8和1G9比较，Mabs Combi-11、4A10-3和L2.2-4在体外更有效地抑制人铁调素-25诱导的人FPN1内在化和降解(参见表10)。更具体而言，抗FPN1Mabs在9点浓度曲线中进行测试，所述曲线从900nM开始并且执行3倍连续稀释。抑制百分比(％)通过下述进行测定：扣除120nM铁调素处理的值，然后用该Mab处理的值除以无铁调素处理的值。相对IC50在Sigma Plot中进行测定。最高抑制百分比(％)以及相对和绝对IC50显示于表10中。 
表10 
Figure BDA0000065880450000581
N.C.：曲线的拟合顶部未达到50％，因此无法计算绝对IC50。 
实施例10：在食蟹猴中人源化抗膜铁转运蛋白单克隆抗体4A10-3的药效学作用 
可以根据本领域技术人员已知的方法，在雄性食蟹猴接受静脉内施用后，研究抗膜铁转运蛋白Mabs的药效学。例如，在5个独立研究中，Mab4A10-3以0.3、1.0、3.0、10和30mg/kg的剂量以单剂静脉内推注形式施用于食蟹猴(n＝4/组)。在第一个剂量前以及在剂量后1、6、12、24、48、72、96、168和264小时时，获取血样(约0.5mL用于铁参数)。在较高剂量水平下，在剂量后360、456、552和648小时时，获取另外血样。在 给药时，动物称重2-3kg。经由股静脉将来自每只动物的血样收集到不含抗凝剂的管内。 
在0.3、1.0、3.0、10和30mg/kg Mab 4A10-3静脉内施用于雄性食蟹猴后，血清铁浓度-时间曲线与血清铁的剂量依赖性增加相关，血清铁在给药后24小时时达到峰值。峰值铁应答(约2倍增加)和应答的持续时间在10mg/kg和30mg/kg剂量之间是相似的。在施用0.3、1.0和3.0mg/kg剂量的动物中，在给药后约48小时，血清铁回到基线值。在施用10mg/kg和30mg/kg剂量的动物中，在给药后约72小时，血清铁回到基线值。 
此外，在单个研究中，Mab 4A10-3以10mg/kg剂量单次皮下注射施用产生了在强度和持续时间两方面与在等价静脉内给药后观察到的应答(n＝4；平均值±SD)相同的血清铁应答(n＝2；平均值±SD)。 
实施例11：在大鼠和食蟹猴中人源化抗膜铁转运蛋白单克隆抗体的药代动力学 
可以根据本领域技术人员众所周知的方法，在体内研究抗膜铁转运蛋白Mabs的药代动力学。在例如对雄性食蟹猴和Sprague Dawley大鼠单次静脉内给药后，研究了抗FPN1 Mabs 4A10-3和Combi 11的药代动力学。在给药时，使用的食蟹猴称重2.2-5.5kg，Sprague Dawley大鼠称重240-265g。 
在食蟹猴中进行的药代动力学研究以3个阶段执行，其中以约2周的间隔施用1.0mg/kg、3.0mg/kg和0.3mg/kg剂量。在每个阶段，Mab 4A10-3或Mab Combi11以单个静脉内推注形式施用(n＝4/组)。在第一个剂量前以及在剂量后1、6、12、24、48、72、96、168和264小时时，获取血样。 
在大鼠中，Mab 4A10-3或Mab Combi 11作为3mg/kg的单个静脉内推注剂量施用(n＝3/组)。在剂量前以及在剂量后0.08、1、4、8、24、48、72、120和168小时时，获取系列血样。 
使用人IgG夹心ELISA形式，测定Mabs 4A10-3和Combi 11的血清浓度。标准曲线范围是5-400ng/mL，其中工作定量下限(LLOQ)定义为10ng/mL。使用在WinNonlin版本5.2中的非室分析，测定药代动力学参数。 
在图10中标绘在静脉内施用于雄性食蟹猴后的血清浓度-时间曲线。在研究的所有剂量下，Mab 4A10-3的清除比Mab Combi11慢得多(约5倍)。当时，差异在检查的第一个时间点(1小时)时是明显的，在该时间点Mab Combi11的血清浓度是Mab 4A10-3观察值的约50％。在给药后24小时时，与Combi11的仅6-9％比较，Mab 4A10-3的血清浓度是20-33％Cmax。Mab Combi11的外周血浓度在0.3mg/kg给药后不明显。与3mg/kg剂量比较，Mab 4A10-3的清除在2个更低剂量下略微较快。Mab 4A10-3的T1/2范围为2-3天。然而，Mab Combi11的T1/2范围为约12-约27小时。 
相对于Mab 4A10-3增强的Mab Combi11清除被推测起因于MabCombi11与细胞表面蛋白质的非特异性相互作用增加，对于Mab 4A10-3这不发生。为了评估这个假设，在大鼠中研究了Mab 4A10-3和MabCombi11的药代动力学，因为无一Mab与大鼠膜铁转运蛋白有效结合。 
在图11中标绘在静脉内施用于雄性大鼠后的血清浓度-时间曲线。类似于在灵长类中的观察，在大鼠中Mab 4A10-3比Mab Combi11清除得慢得多(约5倍)(数据未显示)。再次，差异在检查的第一个时间点(0.08小时)时是明显的，在该时间点Mab Combi11的血清浓度是Mab 4A10-3的观察值的约50％。在大鼠中Mab 4A10-3和Mab Combi11的T1/2分别是约4.5天和3天(数据未显示)。 
这些数据强烈提示，对于Mab Combi11观察到的更快速清除不归于靶受体介导的清除，因为Mab 4A10-3和Mab Combi11都不结合大鼠膜铁转运蛋白。 
实施例12：具有延迟的清除和/或低的非特异性(肝素)结合的抗人FPN1 Mabs 
上文实施例11中所述的Mab Combi11的药代动力学研究提示，与Mab 4A10-3比较，Mab Combi11从血清中更快速地清除。数据还提示，与Mab 4A10-3比较，Mab Combi11的更快速清除不归因于Mab Combi11相对于Mab 4A10-3增加的靶受体介导的清除。 
因为多个精氨酸残基已在Mab Combi11改造过程中引入，所以怀疑由此引起的Mab Combi11相比于Mab4A10-3的正电荷增加例如导致了与带负电的膜表面和肝素的不期望的非特异性结合增加。事实上，MabCombi11的结构建模显示了在Mab Combi11表面上强烈带正电的斑片，这在Mab Combi11中比一些其他人工程化抗FPN1 Mabs，包括Mab4A10-3和Mab L2.2-4，中更明显。 
根据本领域技术人员已知的方法，使用肝素ELISA，就非特异性肝素结合，测试了Mabs Combi11、4A10-3和L2.2-4。还就与人FPN1表达HEK293细胞以及缺乏在细胞表面上表达的人FPN1的对照HEK 293细胞的结合，测试了Mabs Combi11、4A10-3、3D8和L2.2-4。 
使用Mab Combi-11的肝素ELISA显示，Mab Combi11与肝素强烈结合，而Mabs 4A10-3和L2.2-4则不。此外，Mab Combi-11还与人FPN1表达HEK 293细胞和缺乏在细胞表面上表达的人FPN1的对照HEK 293细胞强烈结合。而另一方面，Mabs 4A10-3、3D8和L2.2-4与人FPN1表达HEK 293细胞显著结合，但不与对照HEK 293细胞显著结合。 
因此通过用甘氨酸残基替换HCDR2中的精氨酸残基，生成Mab Com11GY，以减少在Mab Combi11上观察到的非特异性结合。此外，在Mab Combi11中的另一个潜在有问题的氨基酸残基——LCDR2中的色氨酸残基——在Mab Com11GY中由酪氨酸残基置换。使用来自表达Mabs Com11GY的细胞的上清液，初步结合数据证实缺乏与对照HEK 293细胞即人FPN1非表达细胞的非特异性结合，而Mabs 1B7和1F8两者显示与相同对照细胞显著更多的非特异性结合。 
实施例13：用于抑制人铁调素-25与FPN1结合的测定试验 
人工程化的、亲和力成熟的抗人FPN1抗体可以就其抑制人铁调素-25与HEK 293细胞中表达的人FPN1结合的能力进行测定。简言之，在96孔板(BD Biosciences，San Jose，CA；BD Biocoat板#35 4640)上将转染的FPN/293细胞以40,000细胞/孔、于80μL试验培养基(DMEM 11965、10％透析的FBS、20μM FAC、青霉素-链霉素)中种在多聚-D-赖氨酸包被的板中，以1000转每分钟离心1分钟，并且随后在37℃、10％CO2下孵育4小时。通过将20μL的10nM多西环素加入种板的细胞中，诱导FPN1表达(2nM最终浓度的多西环素。多西环素诱导和未诱导的对照细胞在37℃、10％CO2下孵育5小时。接下来，通过用DMEM洗涤板2X，去除诱导剂。细胞在100μL试验培养基中孵育过夜。接下来，去除试验培养基，并且替换为40μL测试抗体或同种型对照抗体溶液(一式三份)，并且在37℃、10％CO2下孵育20分钟。接下来，将20μL生物素化的成熟人铁调素加入孔中，至30nM/孔的最终浓度。样品在37℃、10％10％CO2下孵育1小时之后用200μL 2％FBS、D-PBS(Gibco，目录号14040)洗涤4次。接下来，将65μL裂解缓冲液(0.5％Triton X-100、10mM EDTA)加入所有孔中，并且板振荡10分钟。接下来，将每个孔中的50μL溶液转移到链霉亲和素包被的Greiner微量滴定板的各孔中(60μL 2μg/mL在PBS中的链霉亲和素(Sigma，St.Louis，MO；目录号S4762)，在4℃下孵育过夜，洗涤2次(0.1％Tween 20、TBS)，用酪蛋白/PBS封闭)，并且随后在室温下孵育1小时。接下来，板孔洗涤3次(0.1％Tween 20、TBS)，加入0.5μg/mL的50μL抗人铁调素-25Mab 3.23，并且使样品在室温下孵育1小时。抗人铁调素-25Mab 3.23在PCT国际专利申请公开WO 2009/058797中描述。接下来，板洗涤3次，加入以1∶2000稀释的50μL山羊抗人IgG-辣根过氧化物酶(Southern Biotech目录号2060-05)。在室温下孵育1小时后，板洗涤4X，并且加入50μL OPD底物(Sigma；目录号P6912)。在4分钟后用100μL 1N HCl停止反应。使用合适的ELISA 板阅读器，读取在490nm的吸光度(A490)。通过从接受对照抗体的诱导孔中扣除未诱导孔的A490来确定测定范围。 
表11中所示数据证实人源化Mab 3D8及其亲和力成熟形式显著抑制人铁调素-25与人FPN1结合的能力。更具体而言，如在这种测定形式中测定的，Mab 3D8——具有人重链构架VH1-69和轻链构架O2的人源化形式的小鼠Mab 1G9——显示了约400nM的IC50。如在这种测定形式中测定的，亲合力成熟的Mabs 4A10-3、Combi11和L2.2-4显示了显著改善的结合抑制作用。 
表11 
注：75kg/mole是用于计算抗体浓度的分子量。 
实施例14：FPN1Mabs对细胞铁蛋白水平的影响的体外测定试验 
如实施例5中所述，可以监测Caco-2细胞(内源表达FPN1的人肠细 胞系)中铁蛋白的改变。在基本上如实施例5中所述进行的实验中，测定抗人FPN1抗体对Caco-2细胞中成熟铁调素调制的铁调节的影响，并且表示为抑制百分比，在下表12中为多个独立实验的平均值。 
数据指出铁调素对细胞中铁蛋白浓度的作用可以被抗人FPN1 Mabs以剂量依赖性方式抑制。如由EC50值指出的，一些抗人Mabs在抑制铁调素的作用方面比其他的更有力，例如Combi11 
Figure BDA0000065880450000641
4A10-3＞L2-2-4＞3D8。 
表12：在体外Caco-2细胞中抗人FPN1Mabs对成熟铁调素诱导的细胞铁蛋白水平增加的抑制百分比(±SEM) 
Figure BDA0000065880450000642
N.C.：阴性对照EC50无法进行计算。 
Figure IDA0000065880560000011
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Claims (21)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括
a)包含SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ IDNO：125中所示氨基酸序列的LCDR2、包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列的LCDR3、包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：110中所示氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO：19中所示氨基酸序列的HCDR3;
b)包含SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ IDNO：177中所示氨基酸序列的LCDR2、包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列的LCDR3、包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：112中所示氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO：19中所示氨基酸序列的HCDR3；或
c)包含SEQ ID NO：37中所示氨基酸序列的LCDR1、包含SEQ IDNO：122中所示氨基酸序列的LCDR2、包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列的LCDR3、包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：110中所示氨基酸序列的HCDR2和包含SEQ ID NO：19中所示氨基酸序列的HCDR3;
并且结合由SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列组成的人膜铁转运蛋白1。
2.权利要求1的单克隆抗体或抗原结合片段，其包括：
a)分别如SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：134中所示的轻链可变区和重链可变区;
b)分别如SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：178中所示的轻链可变区和重链可变区；或
c)分别如SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：138中所示的轻链可变区和重链可变区。
3.权利要求1的单克隆抗体或抗原结合片段，其包括：
a.分别如SEQ ID NO：154和SEQ ID NO：152中所示的轻链和重链；
b.分别如SEQ ID NO：181和SEQ ID NO：179中所示的轻链和重链；或
c.分别如SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：156中所示的轻链和重链。
4.权利要求1的单克隆抗体，其包括2条轻链多肽和2条重链多肽，并且其中每条轻链多肽各自具有如SEQ ID NO：154中所示的氨基酸序列，并且每条重链多肽各自具有如SEQ ID NO：152中所示的氨基酸序列。
5.权利要求1的单克隆抗体，其包括2条轻链多肽和2条重链多肽，并且其中每条轻链多肽各自具有如SEQ ID NO：181中所示的氨基酸序列，并且每条重链多肽各自具有如SEQ ID NO：179中所示的氨基酸序列。
6.权利要求1的单克隆抗体，其包括2条轻链多肽和2条重链多肽，并且其中每条轻链多肽各自具有如SEQ ID NO：158中所示的氨基酸序列，并且每条重链多肽各自具有如SEQ ID NO：156中所示的氨基酸序列。
7.权利要求1-6中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段，如通过表面等离子体共振在25℃测定的，其以小于约10 nM的KD结合人膜铁转运蛋白1。
8.权利要求1-6中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段，其结合选自以下的一个或多个肽：
a.403SPFEDIRSRFIQGESITPTK422(SEQ ID NO：12)；
b.406EDIRSRFIQGESIT419(SEQ ID NO：13)；
c.409RSRFIQGESITPTK422(SEQ ID NO：14)；
d.403SPFEDIRSRFIQG415(SEQ ID NO：15)；
e.409RSRFIQGESIT419(SEQ ID NO：16)；和
f.409RSRFIQG415(SEQ ID NO：95)。
9.权利要求1-8中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段在制备用于受试者中治疗或预防贫血的药物中的用途。
10.权利要求9的用途，其中所述药物用于治疗或预防癌症性贫血或慢性病性贫血。
11.权利要求1–8中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段在制备用于增加血清铁水平、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容的药物中的用途。
12.权利要求11的用途，其中，所述药物用于增加网织红细胞计数。
13.权利要求1–8中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段在制备用于增加网织红细胞计数的药物中的用途。
14.权利要求1–8中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段在制备用于治疗受试者中的贫血的药物中的用途。
15.权利要求1–8中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段在制备用于治疗受试者中的癌症性贫血的药物中的用途。
16.权利要求11–15中任一项的用途，其中，该单克隆抗体或抗原结合片段与红细胞生成刺激剂或其他常规用于增加受试者中的血清铁水平、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容的治疗剂联用。
17.权利要求11-15中任一项的用途，其中，该单克隆抗体或抗原结合片段与其它常规用于增加受试者中的网织红细胞计数的治疗剂联用。
18.一种药物组合物，其包括权利要求1–8中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
19.权利要求18的药物组合物，其还包括红细胞生成刺激剂。
20.权利要求18的药物组合物，其还包括其他常规用于增加受试者中的血清铁水平、红细胞计数、血红蛋白、和/或血细胞比容的治疗剂。
21.权利要求18的药物组合物，其还包括其他常规用于增加受试者中的网织红细胞计数的治疗剂。
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