CN102216333B

CN102216333B - c-Met抗体

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Publication number: CN102216333B
Application number: CN200980146173.1A
Authority: CN
Inventors: J·戴维斯; L·刘; J·卢; P·E·瓦扬古; M·A·沃廷格尔; W·曾
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2009-11-18
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2029-11-18
Also published as: DK2358755T3; JP5688027B2; BRPI0922800A2; KR20110074612A; EP2963058B1; AU2009316742B2; CA2743508A1; HK1158229A1; CY1116886T1; US20120263723A1; JP2012509881A; HRP20151019T1; SI2358755T1; IL212633A0; EP2358755A1; US20100129369A1; EA201170716A1; JO3097B1; HUE026058T2; EA020398B1

Abstract

本发明提供结合并抑制c-Met活性的单克隆抗体、其抗原结合片段以及上述的组合，并且所述单克隆抗体、其抗原结合片段以及其组合用于治疗发病机理是由c-Met介导的癌症和其他疾病、病症或紊乱。

Description

c-Met抗体

本发明涉及结合c-Met的抗体以及它们在治疗发病机理是由此受体介导的症状和紊乱中的应用。

c-Met，酪氨酸激酶超家族的成员，是肝细胞生长因子(HGF)的受体。HGF与c-Met的结合造成受体二聚化或多聚化、在细胞内区域中的多个酪氨酸残基的磷酸化、催化活化、以及进行下游信号传递。c-Met也通过包括受体过表达、扩增以及突变等与配体无关的机制被活化。c-Met活化增强细胞增殖、迁移、形态发生、存活(包括免于细胞凋亡)、以及蛋白酶合成、特征在于与侵袭细胞表型以及癌症患者的较差的临床结果和药物抗性相关。c-Met信号通路是人类癌症中一种最常见的失调通路，并且几乎发生于所有类型的实体瘤中。

PCT国际公开WO 09/007427公开了鼠类和CDR-移植的人化c-Met抗体。其中公开的鼠抗体224G11不与c-Met Sema结构域结合。这一鼠抗体的人化IgG1衍生物，称作h224G11 Mab的进一步的功能性能报道于Abstracts no.835(体外数据)和2792(体内数据)以及2009年4月在American Association for Cancer Research(Denver，CO)会议上呈现它们的相关的海报。这些摘要和海报公开了二价h224G11 Mab没有固有的激动剂特性，起c-Met的完全拮抗剂的作用，并且潜在地减少c-Met二聚化。报道了鼠224G11体内下调c-Met并且阻断c-Met磷酸化。在其他受体的情形下，二聚化是受体内化作用和降解的先决条件。这些摘要和海报没有公开关于c-Met内化作用的数据。此外，尚未鉴定出人化抗体结合的c-Met内的表位。

PCT国际公开WO 05/016382也公开了c-Met抗体但是没有鉴定出该抗体结合的表位。然而，提供了表位作图实例，所报道的结果仅仅表明六个c-Met抗体结合共同的表位而第七个c-Met抗体结合不同的表位。没有提供这些c-Met抗体结合的特定表位。

存在对于在HGF存在和/或不存在下，与人c-Met的α-链的结合促进来自细胞表面的受体的内化作用的人c-Met的拮抗剂抗体的需求。也需要人c-Met的拮抗剂抗体，其与人c-Met的α-链的结合促进来自包括含有功能获得性突变的c-Met变体的细胞表面的受体的内化作用。也需要诱导c-Met降解和磷酸化的c-Met减少的人c-Met的拮抗剂抗体。此种拮抗剂活性能够减少肿瘤细胞表面上可用于HGF的结合位点的数量，并且终止由c-Met过表达、扩增或突变而引起的通路活化。同时，此种拮抗剂抗体应抑制HGF与c-Met的结合以及HGF诱导的c-Met活化，并且少量诱导它们自身的激动剂活性或者不诱导其激动剂活性。

本发明的抗体化合物满足了这些需求。它们结合人c-Met Sema结构域的α-链的表位，抑制HGF对c-Met的结合和受体活化，同时诱导少量或者不诱导激动剂活性。本发明的抗体也在HGF存在或不存在下以及也在包括含有功能获得性突变的c-Met变体的细胞中诱导受体的内化作用。它们诱导c-Met的降解并且诱导磷酸化的人c-Met的减少，以及抑制表达这一受体的HGF依赖的和HGF无关的肿瘤细胞的增殖。鉴于这些特性，这些抗体化合物在治疗由c-Met通过多种不同机制介导的癌症上是有用的。

此外，本发明抗体化合物拥有许多其他想要的特性。它们展现出对c-Met高的亲和性(K_D)、阻断HGF介导的c-Met磷酸化和下游信号通路、细胞增殖和细胞迁移；并且只诱导较弱的c-Met磷酸化同时诱导少量或者不诱导HGF样生物激动剂活性，如诱导肿瘤细胞增殖、能动性、迁移、血管生成、血管新生或抗细胞凋亡作用。它们抑制配体(HGF)依赖的和配体无关的c-Met通路活化。此外，相比于密切相关的受体RON和丛蛋白A2的ECD，本发明的抗体化合物优选地结合人c-Met胞外结构域(ECD)，并且不造成c-Met ECD的“脱落”。

因此，本发明提供：

一种单克隆抗体或其抗原结合片段，该抗体：

a)结合人c-Met的α-链内的表位，和

b)诱导细胞表面人c-Met的内化作用。

任一前述抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导肝细胞生长因子无关的细胞表面人c-Met的内化作用。在优选的实施方式中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ IDNO：40的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

诱导细胞中的人c-Met内化作用的任一前述抗体或其抗原结合片段包括含有功能获得性突变的人c-Met变体。功能获得性突变可以是c-Met激酶结构域突变M1149T或近膜结构域突变R988C。

任一前述抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导细胞中至少40％的细胞表面人c-Met的内化作用。任一前述抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导细胞中至少45％的细胞表面人c-Met的内化作用。任一前述抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导细胞中至少50％的细胞表面人c-Met的内化作用。任一前述抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导细胞中至少55％的细胞表面人c-Met的内化作用。任一前述抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导细胞中至少60％的细胞表面人c-Met的内化作用。任一前述抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导细胞中至少65％的人c-Met的内化作用。任一前述抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导细胞中至少70％的细胞表面人c-Met的内化作用。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其诱导在肝细胞生长因子无关的肿瘤细胞中的总c-Met的减少。在优选的实施方式中，所述诱导在肝细胞生长因子无关的肿瘤细胞中的总c-Met的减少的单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，所述诱导在肝细胞生长因子无关的肿瘤细胞中的总c-Met的减少的单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ IDNO：41的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其诱导在肝细胞生长因子无关的肿瘤细胞中的磷酸化的c-Met的减少。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其在与包括具有SEQ IDNO：28所示氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：40所示氨基酸序列的重链的抗体基本上相同的表位结合人c-Met的α-链，或者其在与包括具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的重链的抗体基本上相同的表位结合人c-Met的α-链。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，排除包括具有SEQ IDNO：26所示氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：38所示氨基酸序列的重链的那些，其中表位包括₁₄₄HVFPHNHTADIQS₁₅₆(SEQ ID NO：82)及其内的一或多个氨基酸残基。

任一前述抗体或抗原结合片段，其中表位还包括₁₂₃DTYYDD₁₂₈(SEQ ID NO：81)及其内的一或多个氨基酸残基。

任一前述抗体或抗原结合片段，其中表位还包括₁₉₂FINF₁₉₅(SEQID NO：83)及其内的一或多个氨基酸残基。

任一前述抗体或抗原结合片段，其中表位还包括₂₂₀KETKDGFM₂₂₇(SEQ ID NO：84)及其内的一或多个氨基酸残基。

任一前述抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合下述氨基酸序列或其内的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自：

a)₁₂₁VVDTYYDDQL₁₃₀(SEQ ID NO：77)，

b)₁₃₁ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS₁₅₆(SEQ ID NO：78)，

c)₁₇₉ALGAKVLSSVKDRFINF₁₉₅(SEQ ID NO：79)，和

d)₂₁₆VRRLKETKDGFM₂₂₇(SEQ ID NO：80)。

a)₁₂₃DTYYDD₁₂₈(SEQ ID NO：81)，

b)₁₄₄HVFPHNHTADIQS₁₅₆(SEQ ID NO：82)，

c)₁₉₂FINF₁₉₅(SEQ ID NO：83)，和

d)₂₂₀KETKDGFM₂₂₇(SEQ ID NO：84)。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合特征为下述氨基酸序列的表位或其内的氨基酸序列：

₁₂₁VVDTYYDDQL₁₃₀(SEQ ID NO：77)，₁₃₁ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS₁₅₆(SEQ ID NO：78)，₁₇₉ALGAKVLSSVKDRFINF₁₉₅(SEQ ID NO：79)，和₂₁₆VRRLKETKDGFM₂₂₇(SEQ ID NO：80)。

₁₂₃DTYYDD₁₂₈(SEQ ID NO：81)，₁₄₄HVFPHNHTADIQS₁₅₆(SEQ ID NO：82)，₁₉₂FINF₁₉₅(SEQ ID NO：83)，和₂₂₀KETKDGFM₂₂₇(SEQ ID NO：84)。

任一前述抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合包括₉₅CFPCQDCSSKA₁₀₅(SEQ ID NO：86)本身及其内的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，排除包括具有SEQ IDNO：29所示氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的重链的那些，其中所述表位包括₉₅CFPCQDCSSKA₁₀₅(SEQ ID NO：86)及其内的一或多个氨基酸残基。

结合人c-Met的任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括三个轻链互补决定区(LCDR)和三个重链互补决定区(HCDR)，

其中所述三个LCDR和所述三个HCDR选自下组：

a)包括氨基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO：49)的LCDR1；

包括氨基酸序列GTSX₁LX₂S(SEQ ID NO：87)的LCDR2，其中X₁是Y或R，并且X₂是A或R；

包括氨基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO：51)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO：59)的HCDR1；

包括氨基酸序列WIYPVTGDTYYX₇EX₈FKG(SEQ ID NO：90)的HCDR2，其中X₇是N、I或R，并且X₈是K或P；和

包括氨基酸序列GYGAFX₉Y(SEQ ID NO：91)的HCDR3，其中X₉是Y或F；以及

b)包括氨基酸序列SVSSSVX₃SIYLH(SEQ ID NO：88)的LCDR1，其中X₃是S或R；

包括氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：54)的LCDR2；

包括氨基酸序列X₄X₅YX₆GYPLT(SEQ ID NO：89)的LCDR3，其中X₄是I或Q，X₅是Q或V，并且X₆是S或R；

包括氨基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：65)的HCDR1；

包括氨基酸序列RVNPX₁₀RX₁₁X₁₂TTYNQKFEG(SEQ ID NO：92)的HCDR2，其中X₁₀是N或Y，X₁₁是G或R，并且X₁₂是G或S；和

包括氨基酸序列X₁₃NX₁₄LDY(SEQ ID NO：93)的HCDR3，其中X₁₃是T或A，并且X₁₄是W或I；

其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段结合所述人c-Met的α-链内的表位并且诱导细胞表面人c-Met的内化作用。

结合人c-Met的任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括三个轻链互补决定区(LCDR)和三个重链互补决定区(HCDR)，其中所述抗体包括三个轻链互补决定区(LCDR)和三个重链互补决定区(HCDR)，其中

LCDR1包括氨基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO：49)；

LCDR2包括氨基酸序列GTSX₁LX₂S(SEQ ID NO：87)，其中X₁是Y或R，并且X2是A或R；

LCDR3包括氨基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO：51)；

HCDR1包括氨基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO：59)；

HCDR2包括氨基酸序列WIYPVTGDTYYX₇EX₈FKG(SEQ IDNO：90)，其中X₇是N、I或R，并且X₈是K或P；以及

HCDR3包括氨基酸序列GYGAFX₉Y(SEQ ID NO：91)，其中X₉是Y或F。

结合人c-Met的任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括三个轻链互补决定区(LCDR)和三个重链互补决定区(HCDR)，其中

LCDR1包括氨基酸序列SVSSSVX₃SIYLH(SEQ ID NO：88)；其中X₃是S或R；

LCDR2包括氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：54)；

LCDR3包括氨基酸序列X₄X₅YX₆GYPLT(SE Q ID NO：89)，其中X₄是I或Q，X₅是Q或V，并且X₆是S或R；

HCDR1包括氨基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：65)；

HCDR2包括氨基酸序列RVNPX₁₀RX₁₁X₁₂TTYNQKFEG(SEQ IDNO：92)，其中X₁₀是N或Y，X₁₁是G或R，并且X₁₂是G或S；以及

HCDR3包括氨基酸序列X₁₃NX₁₄LDY(SEQ ID NO：93)，其中X₁₃是T或A，并且X₁₄是W或I。

结合人c-Met的任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括三个轻链互补决定区(LCDR)和三个重链互补决定区(HCDR)，以及

其中所述三个LCDR和所述三个HCDR选自下组：

a)包括氨基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO：49)的LCDR1；

包括氨基酸序列GTSYLAS(SEQ ID NO：50)的LCDR2；

包括氨基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO：51)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO：59)的HCDR1；

包括氨基酸序列WIYPVTGDTYYNEKFKG(SEQ ID NO：60)的HCDR2；和

包括氨基酸序列GYGAFYY(SEQ ID NO：61)的HCDR3；

b)包括氨基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO：49)的LCDR1；

包括氨基酸序列GTSYLAS(SEQ ID NO：50)的LCDR2；

包括氨基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO：51)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO：59)的HCDR1；

包括氨基酸序列WIYPVTGDTYYIEKFKG(SE Q ID NO：62)的HCDR2；和

包括氨基酸序列GYGAFFY(SEQ ID NO：63)的HCDR3；

c)包括氨基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO：49)的LCDR1；

包括氨基酸序列GTSRLRS(SEQ ID NO：52)的LCDR2；

包括氨基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO：51)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO：59)的HCDR1；

包括氨基酸序列WIYPVTGDTYYREPFKG(SE Q ID NO：64)的HCDR2，和

包括氨基酸序列GYGAFYY(SEQ ID NO：61)的HCDR3；

d)包括氨基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO：53)的LCDR1；

包括氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：54)的LCDR2；

包括氨基酸序列IQYSGYPLT(SEQ ID NO：55)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：65)的HCDR1；

包括氨基酸序列RVNPNRGGTTYNQKFEG(SEQ ID NO：66)的HCDR2，和

包括氨基酸序列TNWLDY(SEQ ID NO：67)的HCDR3；

e)包括氨基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO：53)的LCDR1；

包括氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：54)的LCDR2；

包括氨基酸序列QVYSGYPLT(SEQ ID NO：56)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：65)的HCDR1；

包括氨基酸序列RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO：68)的HCDR2；和

包括氨基酸序列ANWLDY(SEQ ID NO：69)的HCDR3；以及

f)包括氨基酸序列SVSSSVRSIYLH(SEQ ID NO：57)的LCDR1；

包括氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：54)的LCDR2；

包括氨基酸序列QVYRGYPLT(SEQ ID NO：58)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：65)的HCDR1；

包括氨基酸序列RVNPYRGSTTYNQKFEG(SEQ ID NO：70)的HCDR2；和

包括氨基酸序列ANILDY(SEQ ID NO：71)的HCDR3；并且

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段包括三个轻链互补决定区(LCDR)和三个重链互补决定区(HCDR)，其中所述三个LCDR和所述三个HCDR选自下组：

a)包括氨基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO：49)的LCDR1；

包括氨基酸序列GTSYLAS(SEQ ID NO：50)的LCDR2；

包括氨基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO：51)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO：59)的HCDR1；

包括氨基酸序列WIYPVTGDTYYNEKFKG(SEQ ID NO：60)的HCDR2；和

包括氨基酸序列GYGAFYY(SEQ ID NO：61)的HCDR3；

b)包括氨基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO：49)的LCDR1；

包括氨基酸序列GTSYLAS(SEQ ID NO：50)的LCDR2；

包括氨基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO：51)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO：59)的HCDR1；

包括氨基酸序列WIYPVTGDTYYIEKFKG(SE Q ID NO：62)的HCDR2；和

包括氨基酸序列GYGAFFY(SEQ ID NO：63)的HCDR3；

c)包括氨基酸序列SVSSSISSTNLH(SEQ ID NO：49)的LCDR1；

包括氨基酸序列GTSRLRS(SEQ ID NO：52)的LCDR2；

包括氨基酸序列QQWSSYPYS(SEQ ID NO：51)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTSRYIH(SEQ ID NO：59)的HCDR1；

包括氨基酸序列WIYPVTGDTYYREPFKG(SEQ ID NO：64)的HCDR2；和

包括氨基酸序列GYGAFYY(SEQ ID NO：61)的HCDR3。

a)包括氨基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO：53)的LCDR1；

包括氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：54)的LCDR2；

包括氨基酸序列IQYSGYPLT(SEQ ID NO：55)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：65)的HCDR1；

包括氨基酸序列RVNPNRGGTTYNQKFEG(SEQ ID NO：66)的HCDR2；和

包括氨基酸序列TNWLDY(SEQ ID NO：67)的HCDR3；

b)包括氨基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO：53)的LCDR1；

包括氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：54)的LCDR2；

包括氨基酸序列QVYSGYPLT(SEQ ID NO：56)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：65)的HCDR1；

包括氨基酸序列RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO：68)的HCDR2；和

包括氨基酸序列ANWLDY(SEQ ID NO：69)的HCDR3；以及

c)包括氨基酸片列SVSSSVRSIYLH(SEQ ID NO：57)的LCDR1；

包括氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：54)的LCDR2；

包括氨基酸序列QVYRGYPLT(SEQ ID NO：58)的LCDR3；

包括氨基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：65)的HCDR1；

包括氨基酸序列RVNPYRGSTTYNQKFEG(SEQ ID NO：70)的HCDR2；和

包括氨基酸序列ANILDY(SEQ ID NO：71)的HCDR3。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段包括三个轻链互补决定区(LCDR)和三个重链互补决定区(HCDR)，其中：

LCDR1包括氨基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO：53)；

LCDR2包括氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：54)；

LCDR3包括氨基酸序列IQYSGYPLT(SEQ ID NO：55)；

HCDR1包括氨基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：65)；

HCDR2包括氨基酸序列RVNPNRGGTTYNQKFEG(SEQ IDNO：66)；和

HCDR3包括氨基酸序列TNWLDY(SEQ ID NO：67)；

LCDR1包括氨基酸序列SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO：53)；

LCDR2包括氨基酸序列STSNLAS(SEQ ID NO：54)；

LCDR3包括氨基酸序列QVYSGYPLT(SEQ ID NO：56)；

HCDR1包括氨基酸序列GYTFTDYYMH(SEQ ID NO：65)；

HCDR2包括氨基酸序列RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ IDNO：68)；和

HCDR3包括氨基酸序列ANWLDY(SEQ ID NO：69)。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR和所述HCVR分别包括选自下组的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：96；和

b)SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：97，

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包括SEQ ID NO：94并且所述HCVR包括SEQ ID NO：96。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，其中所述LCVR包括SEQ ID NO：95并且所述HCVR包括SEQ ID NO：97。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述LCVR和所述HCVR包括选自下组的氨基酸序列：

a)LCVR是SEQ ID NO：1并且HCVR是SEQ ID NO：13；

b)LCVR是SEQ ID NO：2并且HCVR是SEQ ID NO：14；

c)LCVR是SEQ ID NO：3并且HCVR是SEQ ID NO：15；

d)LCVR是SEQ ID NO：4并且HCVR是SEQ ID NO：16；

e)LCVR是SEQ ID NO：5并且HCVR是SEQ ID NO：17；以及

f)LCVR是SEQ ID NO：6并且HCVR是SEQ ID NO：18。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述LCVR和所述HCVR分别包括选自下组的氨基酸序列：

a)LCVR是SEQ ID NO：1并且HCVR是SEQ ID NO：13；

b)LCVR是SEQ ID NO：2并且HCVR是SEQ ID NO：14；以及

c)LCVR是SEQ ID NO：3并且HCVR是SEQ ID NO：15。

a)LCVR是SEQ ID NO：4并且HCVR是SEQ ID NO：16；

b)LCVR是SEQ ID NO：5并且HCVR是SEQ ID NO：17；以及

c)LCVR是SEQ ID NO：6并且HCVR是SEQ ID NO：18。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述LCVR包括SEQID NO：4的氨基酸序列并且所述HCVR包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述LCVR包括SEQID NO：5的氨基酸序列并且所述HCVR包括SEQ ID NO：17的氨基酸序列。

任一前述单克隆单克隆抗体，其中所述抗体包括轻链和重链，其中所述轻链和重链包括选自下组的氨基酸序列：

a)轻链是SEQ ID NO：25并且重链是SEQ ID NO：37；

b)轻链是SEQ ID NO：26并且重链是SEQ ID NO：38；

c)轻链是SEQ ID NO：27并且重链是SEQ ID NO：39；

d)轻链是SEQ ID NO：28并且重链是SEQ ID NO：40；

e)轻链是SEQ ID NO：29并且重链是SEQ ID NO：41；以及

f)轻链是SEQ ID NO：30并且重链是SEQ ID NO：42。

任一前述单克隆抗体，其中所述抗体包括轻链和重链，其中所述轻链和重链包括选自下组的氨基酸序列：

a)轻链是SEQ ID NO：25并且重链是SEQ ID NO：37；

b)轻链是SEQ ID NO：26并且重链是SEQ ID NO：38；以及

c)轻链是SEQ ID NO：27并且重链是SEQ ID NO：39。

a)轻链是SEQ ID NO：28并且重链是SEQ ID NO：40；

b)轻链是SEQ ID NO：29并且重链是SEQ ID NO：41；以及

c)轻链是SEQ ID NO：30并且重链是SEQ ID NO：42。

任一前述单克隆抗体，其中所述轻链包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体，其中所述抗体包括两个轻链和两个重链，其中每个轻链包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列并且每个重链包括SEQID NO：40的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体，其中所述抗体包括两个轻链和两个重链，其中每个轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且每个重链包括SEQID NO：41的氨基酸序列。

与任意前述c-Met单克隆抗体或其抗原结合片段相竞争结合c-Met的单克隆抗体或其抗原结合片段。此种竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段可以结合与任一前述c-Met单克隆抗体或其抗原结合片段相同的c-Met表位。在优选的实施方式中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与包括轻链和重链的抗体竞争，其中所述轻链包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与包括轻链和重链的抗体竞争，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其诱导肝细胞生长因子无关的肿瘤细胞总的所述人c-Met和磷酸化的人c-Met的减少，所述肿瘤细胞组成型过表达人c-Met。在优选的实施方式中，诱导肝细胞生长因子无关的、组成型过表达人c-Met的肿瘤细胞中总所述人c-Met和磷酸化的人c-Met的减少的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，诱导肝细胞生长因子无关的、组成型过表达人c-Met的肿瘤细胞中总所述人c-Met和磷酸化的人c-Met的减少的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其诱导肝细胞生长因子无关的肿瘤细胞中总的所述人c-Met和磷酸化的人c-Met的减少，所述肿瘤细胞组成型磷酸化人c-Met。在优选的实施方式中，诱导肝细胞生长因子无关的、组成型磷酸化人c-Met的肿瘤细胞中总的所述人c-Met和磷酸化的人c-Met的减少的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，诱导肝细胞生长因子无关的、组成型磷酸化人c-Met的肿瘤细胞中总的所述人c-Met和磷酸化的人c-Met的减少的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其诱导肝细胞生长因子无关的肿瘤细胞中肝细胞生长因子应答的总的人c-Met和磷酸化的人c-Met的减少。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其相比于人RON胞外结构域或人丛蛋白A2胞外结构域，优选地结合人c-Met胞外结构域。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其不诱导人c-Met胞外结构域的脱落。在优选的实施方式中，不诱导人c-Met胞外结构域脱落的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，不诱导人c-Met胞外结构域脱落的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其不保护表达人c-Met的肿瘤细胞免于星形孢菌素诱导的细胞凋亡。在优选的实施方式中，不保护表达人c-Met的肿瘤细胞免于星形孢菌素诱导的细胞凋亡的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ IDNO：28的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，不保护表达人c-Met的肿瘤细胞免于星形孢菌素诱导的细胞凋亡的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其抑制肝细胞生长因子依赖的和肝细胞生长因子无关的表达人c-Met的肿瘤细胞增殖。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其抑制人肝细胞生长因子与人c-Met的结合。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段，其不诱导HGF样生物激动剂活性。HGF样生物激动剂活性包括肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞能动性、肿瘤细胞迁移、血管生成、血管发生和抗细胞凋亡作用。在优选的实施方式中，不诱导HGF样生物激动剂活性的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

一种药物组合物，包括任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段和可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段用于治疗。在优选的实施方式中，用于治疗的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，用于治疗的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段用于治疗人类的癌症。在优选的实施方式中，用于治疗人类癌症的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，用于治疗人类癌症的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段用于与另一治疗剂组合治疗人类癌症。在优选的实施方式中，用于与另一治疗剂组合治疗人类癌症的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：28的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，用于与另一治疗剂组合治疗人类癌症的所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链和重链，其中所述轻链包括SEQ ID NO：29的氨基酸序列并且所述重链包括SEQ ID NO：41的氨基酸序列。

任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段在制造用于治疗人类癌症的药物中的应用。

一种治疗癌症的方法，包括向有需要的人类患者给予有效量的任一前述单克隆抗体或其抗原结合片段。

定义

全长抗体正如其天然存在的，是包括通过二硫键互联的2条重(H)链和2条轻(L)链的免疫球蛋白分子。每一链的氨基酸末端部分包括主要通过其中所含的互补决定区(CDR)来负责抗原识别的、约100-110或更多个氨基酸的可变区。每一链的羧基末端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。

CDR被较保守的，称作框架区(“FR”)的区域分散。每一轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR和4个FR构成，它们按下述顺序从氨基末端到羧基末端排列：FRI、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR称作“LCDR1、LCDR2和LCDR3”并且重链的3个CDR称作“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。CDR含有与抗原形成特异相互作用的大多数残基。在LCVR和HCVR内的CDR氨基酸残基的编号和位置是根据公知的Kabat编号协定。

轻链分为K或λ，并且表征为本领域已知的特定恒定区。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG抗体可以进一步划分为亚型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。每种重链类型表征为具有本领域公知序列的特定恒定区。

如在此使用，如应用于本发明抗体化合物的术语“单克隆抗体”(Mab)指源自单拷贝或克隆如任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而并不是生产它的方法。本发明的Mab优选以均一的或基本上均一的群体存在。完整的Mab含有2条重链和2条轻链。此种单克隆抗体的“抗原结合片段”包括例如，Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、单链Fv片段和包括轻链和重链的单臂抗体。可以例如通过重组技术、噬菌体展示技术、合成技术如CDR-移植、或此种技术的组合或者其他本领域已知的技术来生产本发明的单克隆抗体及其抗原结合片段。

“抗体化合物”指在此公开的Mab和Fab。根据本发明展现类似的功能特性的其他抗体化合物可以通过常规方法来生产。例如，可以用人c-Met或其片段免疫小鼠，得到的抗体可以回收并纯化，并且可以通过在下面实施例2-19中公开的方法来评估确定它们是否拥有与在此公开的抗体化合物相似或相同的结合和功能特性。抗原结合片段也可以通过常规方法来生产。生产和纯化抗体及抗原结合片段的方法是本领域公知的并且可见于，例如Harlow and Lane(1988)Antibodies，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，第5-8以及15章，ISBN 0-87969-314-2。

短语“人改造的抗体”指除了在此公开的抗体化合物以外的单克隆抗体及抗原结合片段，其与在此公开的那些具有类似的根据本发明的结合和功能特性，并且具有围绕源自于非人抗体的CDR的基本上是人源的或者完全是人源的的框架区。“框架区”或“框架序列”指框架区1至4中任一。本发明所涵盖的人改造的抗体和抗原结合片段包括其中框架区1至4中一或多个为基本上或完全是人源的分子，即其中存在任何的单个基本上是人源的或者完全是人源的框架区1至4的可能组合。例如，这包括其中框架区1和框架区2、框架区1和框架区3、框架区1、2和3等基本上是或者完全是人源的分子。基本上是人源的框架是与已知的人胚系框架序列具有至少约80％序列同一性的那些。优选地基本上是人源的框架与已知的人胚系框架序列具有至少约85％、约90％、约95％或约99％的序列同一性。

完全人框架是与已知的人胚系框架序列相同的那些。人框架胚系序列可以通过其网站http://imgt.cines.fr获自ImMunoGeneTics(IMGT)，或者获自Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc的The ImmunoglobulinFactsBook，Academic Press，2001，ISBN 012441351。例如，胚系轻链框架可以选自下组：A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、LI、L1I、L12、L2、L5、L15、L6、L8、O12、O2和O8，并且胚系重链框架区可以选自下组：VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VHI-18、VHI-69、VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59和VH5-5I。

除了在此公开的那些，根据本发明展现类似功能特性的人改造的抗体可以使用若干不同的方法来产生。在一种方法中，亲本抗体化合物CDR移植到与亲本抗体化合物框架具有高序列同一性的人框架中。新框架的序列同一性通常将与亲本抗体化合物中相应框架的序列有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同一性。在具有少于100个氨基酸残基的框架的情形下，可以改变一个、两个或三个氨基酸残基。这一移植可造成相比于亲本抗体而言减小的结合亲和性。如果是这种情况，那么可以根据Queen等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2869公开的特定规则，将框架回复突变成亲本框架。描述用于人化鼠抗体的其他参考文献包括美国专利No.4,816,397；5,225,539和5,693,761；Levitt(1983)J.Mol.Biol.168：595-620所述的计算机程序ABMOD和ENCAD；以及Winter和同事的方法(Jones等人，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等人，(1988)Nature 332：323-327；以及Verhoeyen等人，(1988)Science 239：1534-1536)。

可以按照下面进行考虑用于回复突变的残基鉴定。

当氨基酸落入下述目录时，被使用的人胚系序列的框架氨基酸(“受体框架”)由来自亲本抗体化合物的框架的框架区氨基酸(“供体框架”)所替代：

(a)在该位置，受体框架的人框架区的氨基酸对于人框架是不寻常的，而在该位置供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对于人框架是典型的。

(b)氨基酸的位置紧挨着CDR之一；或者

(c)在三维免疫球蛋白模型中，框架氨基酸的任何侧链原子都在约5-6埃(中心到中心)的CDR氨基酸的任何原子内。

当受体框架的人框架区的每个氨基酸以及供体框架中的相应氨基酸在该外置对于人框架通常是不寻常的，此氨基酸可以由在该位置对于人框架是典型的氨基酸所取代。这一回复突变原则使得恢复亲本抗体化合物的活性。

另一种产生与在此公开的抗体化合物展现相似的功能特性的人改造的抗体的方法涉及随机突变移植CDR内的氨基酸而不改变框架，并且筛选得到的分子与亲本抗体化合物一样好甚至比它们更好的结合亲和性以及其他功能特性。也可以在每个CDR内的每个氨基酸位置引入单突变，随后评估此种突变对结合亲和性以及其他功能特性的影响。产生改善的特性的单突变可以组合以评估它们与其他组合的作用。

此外，前述两种方法的组合是可能的。在CDR移植后，除了在CDR中引入氨基酸改变外，可以使特异框架区回复突变。这一方法描述于Wu等人，(1999)J.Mol.Biol.294：151-162

应用本发明的教导，本领域技术人员可以使用诸如定点诱变的常用技术来置换本发明公开的CDR和框架内序列的氨基酸，从而产生源自本发明序列的其他可变区氨基酸序列。所有天然产生的氨基酸都可以引入特异置换位点。在此公开的方法可以随后用于筛选这些其他的可变区氨基酸序列以鉴定具有所示体内功能的序列。以此方式，可以鉴定其他适于制备根据本发明的人改造的抗体及其抗原结合部分的序列。优选地，框架内的氨基酸置换限于在此公开的4条轻链和/或重链框架内中任何一或多条内的一、二或三个位置。优选地，CDR内的氨基酸置换限于3条轻链和/或重链CDR中任何一或多条内的一、二或三个位置。上述这些框架区和CDR内的多种改变的组合也是可能的。

可以通过下面实施例2-19中公开的方法来确认通过引入上述氨基酸修饰所产生的抗体化合物的功能特性符合通过在此公开的特异分子所展现的功能特性。

术语“表位”指在抗体或抗体片段结合的肽或蛋白质上定位的氨基酸的特异排列。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面基团所组成，并且具有特异的三维结构特性以及特异的电荷特性。表位可以是线性的，即参与与单个氨基酸序列结合，或者是构象性的，即参与抗原不同区域的两个或更多个氨基酸序列的结合，这些序列可能并不必然是连续的。在此公开的表位可以由实施例3中公开的氨基酸序列组成，基本上由其组成或者包括它。

与在此公开的分子相“竞争”的单克隆抗体或其抗原结合片段是与人c-Met在本发明分子结合的位点相同或重叠的位点处结合的那些。竞争单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如，通过抗体竞争检测来鉴定。例如，纯化或部分纯化的人c-Met的样品可以结合到固相支持物上。然后，加入本发明的抗体化合物或其抗原结合片段以及怀疑能够与本发明抗体化合物竞争的单克隆抗体或其抗原结合片段。标记两个分子之一。如果标记的化合物和未标记的化合物结合c-Met上的单独的且分开的位点，那么标记的化合物将以相同的水平结合而不管是否存在怀疑的竞争化合物。然而，如果相互作用的位点是相同的或者重叠的，那么未标记的化合物将竞争，并且结合到抗原上的标记化合物的量将下降。如果过量存在未标记的化合物，那么如果有则极少量标记的化合物将结合。为了本发明的目的，竞争单克隆抗体或其抗原结合片段是使本发明抗体化合物与c-Met的结合减少约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的那些。进行此种竞争检测的方法的细节是本领域公知的并且可见于，例如Harlow and Lane(1988)Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，第567-569页，ISBN 0-87969-314-2。此种检测可以通过使用纯化抗体而成为定量的。通过针对抗体自身滴定它来建立标准曲线，即使用相同的抗体用于标记和竞争物。滴定未标记的竞争单克隆抗体或其抗原结合片段抑制标记的分子与板结合的能力。对结果作图，并比较实现想要的结合抑制程度所需的浓度。可以通过本文实施例2-19中公开的方法来测定在此种竞争检测中与本发明抗体化合物竞争的单克隆抗体或其抗原结合片段是否具有与本发明抗体化合物相同或相似的功能特性。

与在此公开的单克隆抗体或其抗原结合片段基本上结合相同的c-Met表位的单克隆抗体或其抗原结合片段是在与本发明分子结合的人c-Met位点重叠的位点处结合人c-Met的那些。促进鉴定与在此公开的c-Met单克隆抗体或其抗原结合片段基本上结合相同表位的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法是本领域公知的并且描述于例如PCT国际公开WO 00/64946。可以通过本文实施例2-19中公开的方法来测定是否结合与本文公开的那些抗体或其抗原片段结合的位点基本上相同的c-Met表位之此类单克隆抗体或其抗原结合片段具有与本发明抗体化合物相同或相似的功能特性。

“c-Met”或“人c-Met”指任何人c-Met，以及其功能上活跃的、突变的形式。c-Met的结构示意性地表示为：

SEMA：Sema结构域

PSI：丛蛋白，脑信号蛋白和整联蛋白结构域

IPT：4免疫球蛋白，丛蛋白和转录因子结构域

TM：跨膜区

JM：近膜结构域

KD：激酶结构域

在人类c-Met ECD(SEQ ID NO：75)中，氨基酸1-24包括信号序列。成熟蛋白质从氨基酸25(E)开始。Sema结构域由c-Met的N-末端的接近500个氨基酸残基组成，并且含有α-链(氨基酸残基25-307)和部分β-链(氨基酸残基308-519)。

术语“抑制”指基本上反抗、阻止、预防、限制、减缓、打断、消除、停止、减少或逆转c-Met的生物作用的能力。

术语“治疗”指减缓、妨碍、制止、控制、停止、减少或逆转症状、紊乱、状况或疾病的进展或严重性，但并不必然涉及全部疾病相关的症状、状况或紊乱的总的消除。

可治疗急性事件和慢性状况。在急性事件中，在症状、紊乱、状况或疾病发作时给予抗体或其抗原结合片段，并且当急性事件结束时终止。相反，在更长的时间框架中治疗慢性症状、紊乱、状况或疾病。

术语“有效量”指以单剂量或多剂量给予患者时，提供想要的治疗或预防的本发明抗体化合物的量或剂量。本发明抗体化合物的治疗有效量可以包括每单剂量约0.1mg/kg至约20mg/kg的范围。可以通过保健提供商通过检测抗体化合物对生物标记的作用(例如肿瘤或非肿瘤组织中的细胞表面c-Met)、肿瘤退化等来测定任何个体患者的治疗有效量。对通过这些方法获得的数据进行分析允许在治疗期间修改治疗方法以便无论单独使用或者与其他治疗剂组合来给予最佳量的抗体化合物，并且以便也可以测定治疗的持续期。以此方式，可以贯穿治疗过程来修改给予剂量/治疗方案以便给予展现满意的肿瘤减小效力的单独或者组合物使用的最小量的抗体化合物，并且以便只要对于成功治疗患者是必须的就持续此种化合物的给药。

本发明的抗体化合物可以作为药物用于以多种途径给予的人类药物。更优选地，此种组合物用于胃肠外给药。此种药物组合物可以通过本领域已知的方法制备。参见，例如Remington：The Science and Practiceof Pharmacy，第19版(1995)，A.Gennaro等人，Mack Publishing Co.，并且包括在此公开的一或多种抗体化合物，以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。

术语“肿瘤”指所有的恶性或良性的瘤细胞生长和增殖，以及所有癌前和癌细胞和组织。如在此使用的术语“癌症”、“癌”和“肿瘤”并不互相排除。

术语“癌症”和“癌”指或描述哺乳动物的生理状况，其典型地表征为异常的细胞生长/增殖。癌症的实例包括但不限于癌(carcinomas)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。

c-Met和癌症

可以通过转录上调、c-Met基因扩增、特异的遗传改变或者配体依赖的自分泌或旁分泌机制而诱导不受控的c-Met通路。在人肿瘤中，组成型c-Met活化的最常见成因是在没有基因扩增时，转录上调造成的增加的蛋白质表达。此外，在许多的人原发瘤，包括胃癌和食道癌、非小细胞肺(NSCL)癌以及髓母细胞瘤中报道了MET基因扩增，随之而来的蛋白质过表达以及组成型激酶活化。间质细胞来源的肿瘤，如骨肉瘤和横纹肌肉瘤，通常利用自分泌机制产生HGF。升高的HGF水平以及c-Met过表达通常与较差的临床结果相关联，该结果包括更具侵袭性的疾病，增加的肿瘤转移以及缩短的患者存活。此外，肿瘤中的高水平HGF和/或c-Met蛋白质赋予针对化疗和放疗的抗性。除了异常HGF和c-Met表达，c-Met途径可以通过诸如c-Met突变、基因扩增和基因重排的遗传改变而被活化。错义c-MET突变可见于所有具有充分表征的遗传性乳头状肾细胞癌(PRCC)的个体以及在小亚群(13％)的零星的PRCC样品中。一些突变由于增加的激酶活性而拥有致瘤潜能。带有HGF和c-MET基因的染色体7的三体性经常出现在PRCC中，并造成突变的c-MET等位基因的非随机复制。此外，在包括胃癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、非小细胞肺癌和甲状腺癌的其它的人类癌症，以及在这些癌症中的一些的转移癌中鉴定出体细胞c-MET突变。不同于突变通常限于激酶结构域的PRCC，这些突变通常位于受体的其它区域，例如，近膜结构域。除了突变，c-MET基因通常在乳腺癌、肝癌、脑癌、结肠直肠癌、胃癌(gastric cancer)、肺癌和胃癌(stomach cancer)中扩增，这与一些患者中的疾病进展相关。

治疗适应症

已经在很大范围的人恶性肿瘤，包括膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌，以及胆管癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、卡波氏肉瘤、平滑肌肉瘤和MFH/纤维肉瘤中记载了异常的HGF/c-MET信号。此外，也在血液恶性肿瘤如急性髓性白血病、成人T-细胞白血病、慢性髓样白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤，以及其它肿瘤如黑素瘤、间皮瘤、Wilms’肿瘤、成胶质细胞瘤和星型细胞瘤(概述于Liu等人，(2008)Expert Opin.Investig.Drugs17(7)：997-1011)中报道了异常的HGF和/或c-Met表达。本发明的c-Met抗体可以抑制HGF依赖的和HGF无关的肿瘤。

下面的非限制性实例说明了本发明的多个方面。

在下面的实例中，人化IgG2和IgG4和鼠IgG(有时也称作mIgG1)对照抗体是与本发明的c-Met抗体无关的同种型对照抗体。抗体C8、D11和optD11是鼠抗体。在所有情形下，人HGF获自R&D Systems(#294)。

实施例1、c-Met抗体

在下面名为“氨基酸和核苷酸序列”部分列出本发明的人遗传改造的抗体的轻链和重链可变区、完整的轻链和重链的氨基酸序列以及前述的各自编码核苷酸序列。表1和2分别示出轻链和重链CDR氨基酸序列。

表1.轻链CDR

X₁是Y或R，并且X₂是A或R；

X₃是S或R；

X₄是I或Q，X₅是Q或V，并且X₆是S或R；

表2.重链CDR

X₇是N，I，或R，并且X₈是K或P；

X₉是Y或F；

X₁₀是N或Y，X₁₁是G或R，并且X₁₂是G或S；

X₁₃是T或A，并且X₁₄是W或I；

D11-和C8-抗体轻链和重链可变区的共有序列是：

D11-抗体轻链可变区共有序列(SEQ ID NO：94)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSVSSSISSTNLHWYQQKPGQAPRLLIYGTSX₁LX₂SGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSYPYSFGQGTKLEIK

其中X₁是Y或R，并且X₂是A或R；

C8-抗体轻链可变区共有序列(SEQ ID NO：95)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVX₃SIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCX₄X₅YX₆GYPLTFGGGTKVEIK

其中X₃是S或R，X₄是I或Q，X₅是Q或V，并且X₆是S或R；

D11-抗体重链可变区共有序列(SEQ ID NO：96)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSRYIHWVRQAPGQGLEWMGWIYPVTGDTYYX₇EX₈FKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGAFX₉YWGQGTLVTVS

其中X₇是N、I或R，X₈是K或P，并且X₉是Y或F；

C8-抗体重链可变区共有序列(SEQ ID NO：97)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPX₁₀RX₁₁X₁₂TTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARX₁₃NX₁₄LDYWGQGTTVTVS

其中X₁₀是Y或N，X₁₁是G或R，X₁₂是S或G，X₁₃是A或T，并且X₁₄是I或W。

使用标准转染方法在HEK293EBNA细胞(Edge BioSystems，#90500130)中瞬时表达抗体。将转染后的细胞在转染后于含有遗传霉素(G418)和妥布拉霉素的标准无血清培养基中37℃培养48至120小时。在60mL rProtein A Sepharose柱(Amersham Biosciences，#17-1279-04)上按照制造商的说明纯化抗体，并且使用pH 7.4的磷酸缓冲盐水(PBS)作为移动相，通过体积排阻层析(XK50/60 Superdex200，Pharmacia)进一步浓缩及纯化。然后使用Millev-GV，PVDF膜，0.22μm，33mm，(Millipore，#SLGV033RS)过滤抗体并于4至8℃存储。

如上所述，在下面许多实例中讨论的鼠IgG1c-Met抗体5D5(美国专利No.5,686,292)是从获自美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国菌种保藏中心的杂交瘤HB-11895所分离及纯化的。

实施例2、c-Met抗体对多种c-Met胞外结构域的结合动力学

人、食蟹猴(cynomolgus monkey)和大鼠c-Met序列的胞外结构域(ECD)与在Fc的C末端的flag及His标签(Flis标签)表达为Fc融合蛋白(SEQ ID NOs：72-74)。这些c-Met ECD Fc融合蛋白在HEK293EBNA细胞中按实施例1所述分别瞬时表达并纯化。

使用

2000设备来测量c-Met抗体对人、食蟹猴以及大鼠c-Met ECD的结合动力学。测量在25℃进行。将样品溶解于HBS-EP缓冲液(150mM氯化钠，3mM EDTA，0.005％(w/v)表面活性剂P-20，以及10mM的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)，pH7.4；#BR-1001-88)中。使用胺耦合化学将山羊抗人IgG，F(ab’)₂片段特异的F(ab’)₂片段(Jackson Immunoresearch Inc，#109-006-097)以4000反应单位(RU)的水平固定在CM5感应芯片的流动孔1-4中以捕获抗-c-Met抗体。

使用多循环来评估结合。每个循环在50μL/min流速下进行并且由下述步骤组成：针对40-100RU的捕获，以10μg/mL注射约10μL的c-Met抗体，随后注射250μL的人、食蟹猴或大鼠c-Met-Flis-Fc ECD(对每个循环以100nM开始并且使用两倍的系列稀释)20min。对于分离和再生，使用约30μL的10mM谷氨酸盐酸盐，pH 1.5。在BIAevaluation软件，4.1版中，使用“1∶1(Langmuir)结合”模型来评估每个循环的结合和分离速率。对于抗体D11-S17Y对大鼠c-Met-Flis-Fc ECD的结合，使用异源配体模型来充分地拟合数据；因此，获得两种结合亲和性。

结果如下表3-5所示。

表3

c-Met抗体对人c-Met-Flis-Fc ECD的结合动力学和亲和性

抗体	k_on(1/Ms)	k_off(1/s)	K_D(nM)
				D11-8B8	1.0±0.1×10⁵	0.5±0.2×10^-4	0.5±0.2
D11-C27G3	6.4±0.2×10⁴	0.9±0.2×10^-4	1.4±0.3
				D11-S17Y	0.7±0.1×10⁵	2.8±0.1×10^-4	4.2±0.9
C8-H241	1.1±0.3×10⁵	＜10^-5	＜0.1
				C8-6	1.6±0.4×10⁵	3±2×10^-4	4±1
C8-co16	1.1±0.2×10⁵	0.3±0.2×10^-4	0.3±0.1

表4

c-Met抗体对食蟹猴c-Met-Flis-Fc ECD的结合动力学和亲和性

抗体	k_on(1/Ms)	k_off(1/s)	K_D(nM)
				D11-8B8	0.78±0.02×10⁵	2.23±0.07×10^-4	2.9±0.2
D11-C27G3	0.5±0.1×10⁵	3.2±0.4×10^-4	6.5±0.7
				D11-S17Y	0.70±0.08×10⁵	3.6±0.5×10^-4	5.1±0.2
C8-H241	0.80±0.06×10⁵	＜10^-5	＜0.2
				C8-6	1.4±0.5×10⁵	4.5±0.2×10^-4	3.6±1.1
C8-co16	1.03±0.02×10⁵	＜10^-5	＜0.1

表5

c-Met抗体对大鼠c-Met-Flis-Fc ECD的结合动力学和亲和性

这些数据表明抗体C8-H241、C8-6和C8-co16以相似的亲和性结合人和食蟹猴c-Met ECD，但是不结合大鼠c-Met ECD。其他数据(未示出)表明在高达100nM抗体和涂布在ELISA板上的1μg/mL ECD的情况下这些抗体不结合小鼠c-Met ECD。然而，抗体D11-8B8、D11-C27G3和D11-S17Y结合人、食蟹猴和大鼠c-Met ECD。

实施例3、表位作图

通过氢/氘交换质谱(HDXMS)(Yamada等人，(2002)Rapid Commun.Mass Spectrom.16(4)：293-299)和焦碳酸二乙酯(DEPC)标记(Mendoza等人，(2008)Analy.Chem.80(8)：2895-2904)的组合来绘制本发明的c-Met抗体表位。在c-Met抗体存在或不存在下，进行人c-Met Sema结构域的氢/氘交换反应。将在抗体存在下获得比其不存在时更少的氘的Sema结构域区鉴定为抗体表位。DEPC可以与Sema结构域中的表面暴露的赖氨酸或组氨酸残基的氨基基团反应，形成氨基甲酸乙酯赖氨酸或组氨酸。如果这些氨基酸位于表位区，那么它们将受到保护并且将在抗体结合时不与DEPC反应。这帮助进一步定位和/或确认HDXMS所确定的表位区。

c-Met Sema结构域的表达和纯化。按实施例1和2所述，在HEK293EBNA细胞中表达C末端具有Flis标签的人c-Met的Sema结构域(SEQID NO：76)并纯化。然后将纯化的蛋白质在4℃储存于pH7.4的PBS中。这一结构域以与全长人c-Met ECD相似的亲和性结合本发明的c-Met抗体，表明这些抗体的表位位于人c-Met的这一区域。

c-Met Sema结构域的去糖基化作用和去唾液酸化作用。用1μL的PNGase F溶液(Prozyme，GKE-5006B)在37℃过夜处理100μL的1.2mg/mL人c-Met Sema结构域溶液用于去N-糖基化。LC/MS分析表明多数蛋白质在这一处理后被脱去糖基。分开地，用2μL的10U/mL唾液酸苷酶溶液(Roche，Cat.#10 269 611 001)在37℃处理100μL的1.2mg/mL人c-Met Sema结构域溶液1小时用于使Sema结构域脱去唾液酸。

c-Met Sema结构域/抗体复合体的形成。将10μL去糖基化的c-MetSema结构域溶液(1.2mg/mL)与等份含有29μg蛋白质的抗体溶液(2.07μL的C8-H241，2.01μL的D11-8B8，或3.87μL的不相关对照Mab)混合，然后用1X PBS溶液稀释至40μL的终体积。分开地，将5μL的去唾液酸化的人c-Met Sema结构域溶液(1.2mg/mL)与等份含14μg蛋白质的抗体溶液(1.04μL的C8-H241，1.01μL的D11-8B8，或1.94μL的不相关对照Mab)混合，然后用1X PBS溶液稀释至15μL的终体积。然后将每种抗体的每一混合溶液进行HDXMS分析。

HDXMS检测。将4μL去糖基化的或去唾液酸化的c-Met Sema结构域/抗体混合物与16μL的100％D₂O(Acros，Code 166310500；交换期间80％D)混合，并在环境温度下孵育90秒。然后用50μL的0.5％(v/v)甲酸水溶液在0℃使该交换结束。将结束的溶液立即用2μL的5mg/mL(v/v)胃蛋白酶溶液(Sigma，Cat.#P6887)在0℃处理3.5或4min。将经消化的溶液立即手工注射到RP-HPLC柱(Polymer Laboratories，Part#1912-1802；2.1×50mm，

孔径，8μM粒径)上。来自HPLC泵(Waters，2795HPLC)的HPLC缓冲液流经金属管(约1mL)进入手工注射器。然后使柱洗脱液流入Micromass LCT Premier或SYNAPT质谱仪。金属管、注射器回路以及柱都浸在冰水浴中。

将柱用流速为0.2mL/min的99％A(0.05％(v/v)水性TFA(三氟乙酸)和1％B(在乙腈中的0.04％(v/v)TFA)平衡。进行等度梯度洗脱1min，从1至10％B持续1min，到40％B持续12min，到90％B持续4min，保持3min，然后迅速返回初始条件。在Micromass LCT PremierMass Spectrometer上用正喷射，W模式以及下述设置进行质谱：毛细管电压1.5kV，椎电压100V，孔1为25V，质量范围200至2000，去溶剂化温度150℃，以及去溶剂化气流500L/h。在用或不用c-Met抗体的D/H交换后获得c-Met每一胃蛋白酶解肽的质谱。根据最强离子峰的同位素分布来计算每一肽的平均质量。

c-Met/抗体复合体的DEPC标记。将8.3μL的1.2mg/mL人c-MetSema结构域溶液与抗体(24μg蛋白质：1.71μL的C8-H241，1.67μL的D11-8B8，或3.2μL不相关对照Mab)溶液，以及1X PBS溶液混合至76μL的终体积。在环境温度下用4μL的异丙醇中的10mg/mL(w/v)DEPC处理每一c-Met/抗体混合物5分钟，用10μL在0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8)中的20mg/mL组氨酸和10μL在0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8)中的0.2mg/mL赖氨酸结束。每种溶液与5μL的0.2mg/mL(w/v)猪胰蛋白酶溶液(Promega，Cat.#V528A)混合，并且将一半的混合液与0.5μL的50mg/mL(w/v)二硫苏糖醇溶液混合。在37℃将每种样品溶液孵育5小时然后用0.5μL的PNGase F溶液再处理1小时。每一消化后的溶液用2μL的10％(v/v)乙酸溶液酸化。将2μL的100mg/mL TCEP(三(2-羧乙基)磷盐酸盐(Sigma，Cat.#C4702-2G)溶液加入未还原的消化物中而不加入二硫苏糖醇。使用Waters Acquity UPLC和Waters SYNAPT质谱仪对每种溶液进行LC/MS分析。HPLC使用在60℃的WatersAcquity UPLC BEH C8柱(2.1×50mm，1.7μm，Waters，part#186002877)，并且用水/乙腈/TFA HPLC流动相体系中的乙腈梯度洗脱肽。对于该消化物使用45min运行时间。将柱用流速0.2mL/min的99％A(0.05％(v/v)TFA水溶液)和1％B(乙腈中的0.04％(v/v)TFA)平衡。在等度状态下进行梯度洗脱2min，从1至25％B持续25min，到45％B持续10min，到90％B持续1min，保持1.5min(在相同的时间段，流速为0.3mL/min)，然后迅速返回1％B。

结果。Mab C8-H241似乎结合包括c-Met Sema结构域的四个区域的构象表位，该区域位于人c-Met胞外结构域的α链(SEQ ID NO：75的氨基酸残基25-307)：

₁₂₁VVDTYYDDQL₁₃₀(SEQ ID NO：77)，

₁₃₁ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS₁₅₆(SEQ ID NO：78)，

₁₇₉ALGAKVLSSVKDRFINFF₁₉₆(SEQ ID NO：79)，和

₂₁₆VRRLKETKDGFM₂₂₇(SEQ ID NO：80)。

更具体地，Mab C8-H241通过与：

包括₁₂₃DTYYDD₁₂₈(SEQ ID NO：81)，

包括₁₄₄HVFPHNHTADIQS₁₅₆(SEQ ID NO：82)，

包括₁₉₂FINF₁₉₅(SEQ ID NO：83)，和

包括₂₂₀KETKDGFM₂₂₇(SEQ ID NO：84)及其内的一或多个氨基酸残基相互作用而结合c-Met。

Mab C8-H241与区域₁₄₄HVFPHNHTADIQS₁₅₆(SE Q ID NO：82)的结合使得它能够在高达100nM抗体的结合检测中，以类似的亲和性结合人(SEQ ID NO：75)和食蟹猴(SEQ ID NO：73的氨基酸25至932)的c-Met胞外结构域而不结合大鼠或小鼠c-Met。

Mab D11-8B8与c-Met Sema结构域的α链的结合似乎定位于一个区域，即包括氨基酸序列₈₄YKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANL₁₀₇(SEQ ID NO：85)及其内的线性表位内的氨基酸残基，更优选包括区域₉₅CFPCQDCSSKA₁₀₅(SEQ ID NO：86)及其内的氨基酸残基。进一步通过表位提取实验(Dhungana等人，(2009)Methods Mol.Biol.524：87-101)来确认Mab D11-8B8的表位。用猪胰蛋白酶(Promega)消化c-Met Sema结构域然后使用EZ-Link^TM Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂盒(Pierce，Prod.#1754210)将消化物与生物素化的Mab D11-8B8混合以结合c-Met肽。通过高容量链霉抗生物素琼脂糖树脂(Thermo Scientific，Prod.#20359)来捕获结合了或未结合c-Met肽的生物素化的D11-8B8。结合的肽由0.15％(v/v)的甲酸水溶液释放，然后通过LC/MS来鉴定。

实施例4、相比于RON和丛蛋白A2ECD，抗体对c-Met的优先结合

与c-Met具有最大序列同一性的人蛋白是RON和丛蛋白A2。这一实验比较了c-Met抗体与c-Met、RON和丛蛋白A2ECD结合的特异性。

在4℃用100μL的在包被缓冲液(BioFX Labs，#COAT-1000-01)中的1μg/mL人c-Met胞外结构域(ECD)-Fc-Flis融合物(SEQ ID NO：72)，RON-ECD-Fc(R&D Systems，#1947-MS)，或丛蛋白A2-ECD-Fc(Abnova，Taipei，Taiwan#H00005362-P01)过夜包被96-孔EIA/RIA高结合板(Costar，#2592)的孔。吸干孔并且通过添加200μL封闭缓冲液(Tris-缓冲的盐水，pH 8.0，具有0.05％(v/v)聚山梨醇酯20(Tween-20)(TBS-T)(BioFX Labs，#WSHW-1000-01)和1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)(Jackson Immuno，#001-000-162))在室温孵育1小时封闭非特异性结合位点。用洗涤缓冲液(TBS-T)洗涤板3次后，加入100μL/孔的在封闭缓冲液中1∶6系列稀释的c-Met抗体(从100μg/mL开始)并在室温孵育2小时。洗涤板并用100μL/孔的在封闭缓冲液中HRP-缀合的山羊抗人F(ab)₂IgG(Jackson ImmunoResearch Labs#109-036-097)孵育90min。洗涤板后，加入100μL/孔的底物溶液(BioFx，#TMBW-1000-01)并在室温下孵育板10min。加入100μL/孔的终止溶液(BioFx，#LSTP-1000-01)以终止反应。使比色信号显色并使用SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm读数。c-Met抗体与c-Met、RON和丛蛋白A2ECD的结合与颜色信号的产生成比例。

如表6所示，本发明的C8和D11c-Met抗体相比于RON ECD或丛蛋白A2ECD，优先结合人c-Met ECD。

表6

相比于RON和丛蛋白A2ECD，c-Met抗体对人c-Met ECD的优先结合

实施例5、c-Met抗体阻断HGF/c-Met结合

使用体外结合检测来测定本发明的c-Met抗体对HGF结合c-Met的抑制。

在室温下用100μL在Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中的人c-Met ECD-Fc-Flis(SEQ ID NO：72)(2μg/mL)过夜包被96-孔EIA/RIA高结合板(Costar，#2592)的孔；在洗板器中用洗涤缓冲液(Tris-缓冲的盐水，pH 8.0，具有0.05％(v/v)聚山梨醇酯20(

-20)(TBS-T)(BioFX Labs，#WSHW-1000-01)洗涤4次；加入300μL封闭缓冲液(TBS-T加1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)(Jackson Immuno，#001-000-162)在37℃孵育60min进行封闭。然后从孔中除去封闭缓冲液并分别向每孔中加入50μL以表7中指出的终浓度的封闭缓冲液中的抗体。向只有HGF的对照孔中加入封闭缓冲液。在37℃孵育具有c-Met抗体的板90min。然后向除了只有抗体的对照孔以外的每孔加入50μL在封闭缓冲液中终浓度为10ng/mL的人肝细胞生长因子(HGF)(R&DSystems，#294)。在室温下于摇床中孵育含有c-Met抗体/HGF混合物的板2小时。然后在洗板器中用TBS-T洗涤孔四次。接下来，向每孔中加入100μL终浓度为100ng/mL的封闭缓冲液中的生物素化的抗HGF抗体(R&D Systems，#BAF294)。室温孵育板90min。在洗板器中再次用TBS-T洗涤孔4次。向每孔中加入100μL在封闭缓冲液中的1∶200稀释链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)(R&D Systems，DY998)。室温孵育板30min。在洗板器中用TBS-T洗涤孔4次。然后加入100μL/孔的底物溶液(BioFx，#TMBW-1000-01)，并且室温孵育板10min。为了终止反应，加入100μL/孔的终止溶液(BioFx，#LSTP-1000-01)。在酶标仪(Spectra，MAX 190)上以450-570nm的波长读数并且不减背景。

如表7所示，本发明的C8和D11c-Met抗体都阻断人HGF/c-Met结合。

表7

通过C8-和D11-抗体对人HGF结合人c-Met的抑制

平均值A450nm

简称：AVG＝平均值；STDErr＝标准误

实施例6、相比于肝细胞生长因子和激动剂Mab 5D5，c-Met抗体诱导弱的c-Met磷酸化

用HGF刺激时，A549肺癌细胞系在酪氨酸残基1349处展现增加的c-Met磷酸化。使用磷酸化的c-Met(p-Met)ELISA检测来测量在无HGF时，多种c-Met抗体，以及Mab 5D5和HGF自身的激动剂活性。

在Ham’s F12K+2mM谷氨酰胺(Invitrogen，#21127-022)+10％FBS培养基(Invitrogen，#10082)中培养A549细胞(ATCC，#CCL-185)。将细胞以6×10⁴细胞/孔在96孔板中的上述全血清培养基中铺板并在37℃，5％(v/v)CO₂下过夜孵育。从孔中除去培养基并且在37℃，5％(v/v)CO₂下在100μL的Ham’s F12K+2mM谷氨酰胺培养基+0.5％FBS中使细胞饥饿6小时。在饥饿培养基中稀释抗体或HGF，以表8所示的终浓度添加，并且在37℃孵育15min。吸干培养基并使细胞在每孔50μL裂解缓冲液(10mM Tris(Invitrogen，#15567-027)，150mMNaCl，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)(Invitrogen，#15575-038)，50mM NaF(Sigma，#S1504)，1％(v/v)辛基苯氧聚乙氧基乙醇(

-X 100；Sigma，#T8787)，2mM原钒酸钠(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ，#567540)，蛋白酶抑制剂(Sigma，St.Louis，MO；#P8340)，磷酸酶抑制剂混合物I(Sigma#P2850)，以及磷酸酶抑制剂混合物II(Sigma#P5726))中裂解并在冰上孵育15-20min。在下述ELISA检测中使用细胞裂解物以测定残基Y1349处的c-Met磷酸化。

在Bup H包被缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，#28382)中稀释c-Met捕获抗体至2μg/mL，加到ELISA板(GreinerBio-One，Monroe，NC，#655081)中并在4℃过夜孵育。吸干孔并用TBS-T(BioFX，Owings Mills，MD，WSH-1000-01)洗涤3次，然后用200μL封闭缓冲液(TBS-T加2％(w/v)BSA)在室温下封闭1小时。用TBS-T洗涤板3次。接下来加入25μL细胞裂解物加75μL封闭缓冲液，并在4℃过夜孵育板。然后用TBS-T洗涤板3次。向每孔中加入100μL在封闭缓冲液中的0.5μg/mL的pY1349c-Met(Cell SignalingTechnology，Danvers，MA，#3133)多克隆抗体并在室温下孵育2小时。然后用TBS-T洗涤板3次。向每孔中加入100μL在封闭缓冲液中的1/10,000稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG多克隆抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA，#111-035-144)并在室温下孵育1小时。然后用TBS-T洗涤板3次。向每孔中加入100μL的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺溶液(BioFX，#TMBW-1000-01)，随后加入100μL终止溶液(BioFX，#LSTP-1000-01)。在SpectraMax M5酶标仪(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)中于450nm处读板并使用SOFTmax Pro 4.8软件(Molecular Devices)测定样品值。

结果如表8所示。

表8

c-Met抗体、HGF和激动剂Mab 5D5对A549细胞中c-Met磷酸化的作用

数据表明HGF和激动剂c-Met Mab 5D5强烈刺激c-Met磷酸化，而本发明的c-Met Mabs C8-H241和C8-6微弱地刺激c-Met磷酸化。在HCT116、H460和MDA-MB-231细胞系中获得相似的结果。

Mab D11-8B8产生类似的结果。

实施例7、c-Met抗体抑制HGF诱导的c-Met磷酸化

HGF与c-Met的结合造成c-Met分子的酪氨酸磷酸化以及c-Met信号通路的活化。在这一实施例中，使用对HGF有应答的人结肠癌细胞系HCT116来评估本发明c-Met抗体对HGF诱导的在c-Met酪氨酸残基1230、1234和1235处磷酸化的抑制。

在具有10％(v/v)胎牛血清(FBS)(Invitrogen，#10082-147)和青霉素/链霉素(Invitrogen，#15140-122)的McCoy’s 5A培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA，#16600-082)中重悬浮HCT116细胞(ATCC，Manassas，VA，#CCL-247)至150,000细胞/mL。将0.2mL重悬的HCT116细胞以30,000细胞/孔加入96孔微滴定板(Corning，Lowell，MA，#3596)中，然后在37℃，5％(v/v)CO₂下孵育该细胞48小时。然后吸干培养基并使细胞在37℃，5％(v/v)CO₂下于100μL具有0.1％(w/v)BSA和青霉素/链霉素的McCoy’s 5A培养基中饥饿。加入25μL叠氮化钠(终浓度0.01％(w/v))(Sigma，#S2002)，随后立即将25μL的8X c-Met抗体稀释液加入具有0.1％(w/v)BSA和青霉素/链霉素的McCoy’s 5A培养基，并且在37℃，5％(v/v)CO₂下孵育30min。向每孔加入50μL终浓度为200ng/mL的HGF并且在37℃，5％(v/v)CO₂下再孵育细胞15min。然后吸干培养基并且加入50μL细胞裂解缓冲液(10mM Tris(Invitrogen，#15567-027)，150mM NaCl，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)(Invitrogen，#15575-038)，50mM NaF(Sigma，#S1504)，1％(v/v)辛基苯氧聚乙氧基乙醇(-X 100；Sigma，#T8787)，2mM原钒酸钠(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ，#567540)，以及无EDTA的完全蛋白酶抑制物(Roche，Basel，Switzerland，#11836170001)。在室温下于裂解缓冲液中孵育细胞15-30min。按照下述，通过ELISA来评估细胞裂解物的c-Met酪氨酸磷酸化。

在包被缓冲液(BioFX，Glendora，CA，COAT-1000-01)中稀释c-Met捕获抗体至2μg/mL，向ELISA板(Greiner Bio-One，Monroe，NC，#655081)中每孔加入110μL稀释的抗体并在4℃过夜孵育该板。吸干孔，用TBS-T洗涤2次，然后用200μL封闭缓冲液(TBS-T加2％(w/v)BSA)封闭1小时。用TBS-T洗涤板2次。接下来加入25μL细胞裂解物加75μL封闭缓冲液或100μL的MKN45细胞裂解物稀释液(用封闭缓冲液稀释，作为标准)，并在室温孵育板2小时。然后用TBS-T洗涤板4次。然后向每孔中加入100μL在封闭缓冲液中的0.5μg/mL的pYpYpY1230/1234/1235c-Met多克隆抗体(Invitrogen，#44-888G)，并在室温下孵育板2小时。接下来用TBS-T洗涤板4次。然后加入100μL在封闭缓冲液中的1/12,000稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA，#111-035-144)并在室温下孵育1小时。然后用TBS-T洗涤板6次。向每孔中加入100μL的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺溶液(BioFX，#TMBW-1000-01)，随后加入100μL终止溶液(BioFX，#LSTP-1000-01)。在SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中于450nm处读板，以570nm校正。使用4-参数分析来建立标准曲线，并使用SOFTmax Pro 3.1.2软件(Molecular Devices)测定样品值。

c-Met酪氨酸磷酸化抑制的百分数在没有加入c-Met抗体(0％添加)的HGF处理的平均值基础上设置，并且100％抑制设定为叠氮化钠处理(没有HGF或c-Met抗体处理)的平均值。

表9显示出对于三个实验的每个实验，三次重复处理的平均值，以及标准误。数据表明相比于人IgG2和IgG4同种型对照，本发明的六个c-Met抗体中的五个显著抑制HGF诱导的c-Met酪氨酸磷酸化。

表9

通过C8-和D11-抗体对HGF诱导的c-Met酪氨酸磷酸化的抑制百分数

实施例8、c-Met抗体对c-Met内化作用的诱导

这一实施例中描述的实验使用荧光激活的细胞分选(FACS)分析来证明本发明的c-Met抗体结合细胞表面c-Met分子并诱导c-Met内化作用。所用的MKN45细胞组成型表达高水平的总c-Met，并且作为MET基因扩增的结果而展现HGF无关的c-Met磷酸化。c-Met内化作用似乎诱导c-Met降解(参见实施例10和19)，造成c-Met信号通路的抑制。

用在2mL培养基(RPMI-1640(Invitrogen，#11835)；10％(v/v)FBS(Invitrogen，#10082)；2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，#25030)；100U/500mL青霉素G，以及100μg/500mL链霉素(Invitrogen，#15140))中的1.5×10⁵人胃肿瘤MKN45细胞(Japan Health Sciences Foundation，Health Science Research Resource Bank，#JCRB0254)接种6孔组织培养板(Costar，#3598)中的孔。将板在37℃，95％相对湿度和5％(v/v)CO₂下孵育24小时。然后向孔中加入抗体至终浓度为5μg/mL。过夜处理后，从孔中除去培养基并用1mL不含酶的细胞消化液(Chemicon，#S-014-B)代替。室温孵育5min后将细胞收集到离心管中，并在培养基中洗涤一次，随后在结合缓冲液(具有1％(w/v)BSA和0.01％(w/v)叠氮化钠的DPBS)中再洗涤一次。染色细胞之前，使用Alexa Fluor 488Monoclonal Antibody Labeling Kit(Molecular Probes，Eugene，OR，#A-20181)，按照供应商的说明书，标记来自本发明c-Met抗体的识别不同表位的c-Met抗体。向细胞中加入100μL含有2μg/mL的Alexa Fluor488-标记的抗体的结合缓冲液，然后将其在冰上孵育60min。然后用结合缓冲液洗涤细胞一次并在含有2μg/mL碘化丙啶(染色死亡的细胞)的DPBS中重悬细胞。通过FACS分析来分析残留在细胞表面的c-Met分子的量，并且对每种样品获得10,000事件。

细胞表面的平均荧光强度反应了在用c-Met抗体处理后残留在细胞表面的c-Met分子的量。

来自一个代表性实验的数据如表10所示。

表10

通过FACS分析测定的C8-和D11-抗体对c-Met内化作用的影响

平均荧光

数据表明用本发明的c-Met抗体处理的细胞表面的平均荧光强度低于用相应的IgG同种型对照抗体或mIgG抗体处理的细胞的平均荧光强度，表面本发明的c-Met抗体诱导c-Met内化作用。此外，用本发明的c-Met抗体处理的细胞表面的平均荧光强度低于用对照激动剂c-Met抗体5D5处理的细胞的平均荧光强度。可按照下述计算％内化作用。

％内化作用＝[1-(检测抗体的平均荧光除以同种型对照抗体的平均荧光)]乘以100]。

内化作用数据表明本发明的抗体诱导人c-Met的二聚化。实施例9和19的数据表明C8-和D11-抗体也诱导c-Met的降解，并且减少c-Met的磷酸化。

在MKN45和Caki-1细胞中使用荧光标记的鼠C8抗体，通过共聚焦显微镜获得补充的内化作用结果。

使用C8-H241、C8-6、C8-co-16以及鼠D11抗体，在转染有编码食蟹猴c-Met的核酸的食蟹猴NIH3T3细胞中获得类似的内化作用结果。

C8-H241、C8-6、C8-co-16以及optD11抗体也诱导转染有编码人c-Met激酶结构域突变M1149T的核酸的NIH3T3细胞中的c-Met的内化作用。抗体C8-H241、C8-6、C8-co-16和鼠D11也诱导在含有c-Met近膜结构域突变R988C的非小细胞肺癌H1437细胞中的c-Met的内化作用。两种突变都造成c-Met的获得性功能组成型活化。

实施例9、抗体体外抑制配体无关的肿瘤细胞增殖

在这一检测中检测没有HGF配体时，在HGF无关的MKN45细胞中c-Met抗体的体外抑制肿瘤细胞生长。

用培养基(RPMI-1640(Invitrogen，#11835)，10％(v/v)FBS，2mML-谷氨酰胺(Invitrogen，#25030)，100U/500mL青霉素G，和100μg/500mL链霉素(Invitrogen，#15140))稀释c-Met和同种型对照抗体以实现2X的表11所示的终浓度，并且向96孔组织培养板(PerkinElmer#1450-517)的每孔中加入50μL的2X抗体溶液。将MKN45细胞(Japan Health SciencesFoundation，Health Science Research Resource Bank，#JCRB0254)维持在上面所示的培养基中，并且在相同的培养基中重悬浮至1×10⁵细胞/mL。将50μL的这一MKN45重悬液加入每孔以实现5×10³细胞/孔。然后在37℃，95％相对湿度和5％(v/v)CO₂下孵育板48小时。对于最后六小时的培养，用³H-胸苷(MP Biomedicals，Solon，OH#24066)以1μci/孔在37℃，95％相对湿度和5％(v/v)CO₂下脉冲细胞。然后除去培养基并用DPBS洗涤细胞一次。此后，向每孔中加入200μL的Optiphase Supermix(PerkinElmer，#1200-439)。室温下密封板并孵育至少1小时。使用闪烁记数器对细胞中掺入的³H-胸苷计数1min。

来自一个代表性的实验的数据如表11所示。

表11

通过多种C8-和D11-抗体对MKN45细胞中³H-胸苷掺入的抑制

AVGCPM

简称：AVG＝平均值；CPM＝每分钟计数；STDErr＝标准误

这些数据表明本发明的多种C8-和D11-c-Met抗体抑制HGF无关的MKN45细胞增殖，如由3H-胸苷掺入中的减少所证实。在SNU5和NUGC-4肿瘤细胞中获得类似的结果，它们各展现c-Met的组成型过表达和磷酸化。

实施例10、应答c-Met抗体，磷酸化的和总c-Met的减少，以及c-Met 胞外结构域脱落的缺乏

这一实施例调查了使用本发明c-Met抗体处理的MKN45细胞是否造成磷酸化的c-Met(p-Met)和总c-Met的减少。此外，使用这一检测来确定c-Met抗体处理是否诱导c-Met ECD脱落到MKN45-条件培养基中。

用培养基(RPMI-1640(Invitrogen，#11835)，10％(v/v)FBS(Invitrogen，#10082)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，#25030)，100U/500mL青霉素G，和100μg/500mL链霉素(Invitrogen，#15140))稀释c-Met和同种型对照抗体以实现2X的表12所示的终浓度，并且向96孔组织培养板(Costar，#3596)的每孔中加入50μL的2X抗体溶液。将MKN45细胞(Japan Health Sciences Foundation，Health ScienceResearch Resource Bank，#JCRB0254)维持在上面所示的培养基中，并且在相同的培养基中重悬浮至1×10⁵细胞/mL。将50μL的这一MKN45重悬液加入每孔以实现5×10³细胞/孔。然后在37℃，95％相对湿度和5％(v/v)CO₂下孵育板24小时，并且按实施例7所述制备细胞裂解物。此外，收集来自每个处理的条件培养基用于c-Met-ECD量化。通过ELISA测定细胞裂解物中的p-Met和总c-Met水平，并且标准化为裂解物蛋白质浓度(如由BCA所测，Pierce#23225)。

磷酸化的c-Met

按照实施例7所述测定c-Met在酪氨酸残基1230、1234和1235处的磷酸化。

总c-Met和c-Met ECD脱落

对于总c-Met和c-Met ECD ELISA，在包被缓冲液(BioFX，Glendora，CA，COAT-1000-01)中稀释c-Met捕获抗体至2μg/mL。将110μL稀释抗体加入ELISA板(Greiner Bio-One，Monroe，NC，#655081)的每孔并将板在4℃过夜孵育。吸干孔并用TBS-T洗涤2次，然后用200μL封闭缓冲液(TBS-T加2％(w/v)BSA)在室温下封闭1小时。然后用TBS-T洗涤板2次。接下来加入MKN45细胞裂解物，MKN45条件培养基或c-Met胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：75)(作为标准)，并将板在室温孵育2小时。然后用TBS-T洗涤板4次。然后向每孔中加入100μL在封闭缓冲液中稀释的结合捕获抗体不同c-Met表位的生物素化第二c-Met抗体(Mab 5D5)并将板在室温下孵育2小时。接下来用TBS-T洗涤板4次。然后加入100μL在封闭缓冲液中的1/12,000稀释的过氧化物酶缀合的链霉抗生物素(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA，#016-030-084)，并将混合物在室温下孵育1小时。然后用TBS-T洗涤板6次。向每孔加入100μL的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺溶液(BioFX，#TMBW-1000-01)，随后加入100μL终止溶液(BioFX，#LSTP-1000-01)。在SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，cA)中于450nm处读板，以570nm校正。使用4-参数分析来建立标准曲线，并使用SOFTmax Pro 3.1.2软件(Molecular Devices)确定样品值。

如表12所示，p-Met和总c-Met ELISA数据揭示Mab c8-H241处理使p-Met最大降低77％，使总c-Met最大降低约67％。D11-8B8处理使p-Met最大降低约75％，并且使总c-Met最大降低63％。

如实施例8所指出，这些数据表明c8-和D11-抗体诱导c-Met降解并降低c-Met磷酸化。

表12的数据也表明用c8-H241和D11-8B8c-Met抗体的处理没有诱导c-Met ECD的切割和脱落。

表12

c8-和D11-抗体对MKN45细胞裂解物和条件培养基中的磷酸化的c-Met、总c-Met减少，以及c-Met胞外结构域脱落的作用

MKN45磷酸化的c-Met的抑制百分数

MKN45总c-Met的抑制百分数

MKN45-条件培养基中的c-Met ECD水平(ng/mL)

实施例11、没有HGF时，抗体在Caki-1肿瘤细胞中的激动剂活性

Caki-1肾癌细胞响应HGF而增殖。在这一实施例中检测了没有HGF时通过c-Met抗体在Caki-1细胞中的c-Met活化来评估本发明的c-Met抗体的激动剂活性。

用在补充有10％(v/v)FBS，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，#25030)，100U/500mL青霉素G和100μg/500mL链霉素(Invitrogen，#15140)的McCoy’s 5A培养基(Invitrogen，#16600)中的5,000个人肾透明癌细胞Caki-1细胞(ATCC，#HTB-46)接种96孔组织培养板的孔。培养24小时后，使细胞在低血清培养基(0.5％(v/v)FBS)中饥饿另外的24小时。然后在37℃，95％相对湿度和5％(v/v)CO₂下，在表13所示终浓度的抗-c-Met和对照抗体存在下，在低血清基中培养细胞。对于最后六小时的培养，用³H-胸苷(MP Biomedicals，Solon，OH#24066)以1μci/孔在37℃，95％相对湿度和5％(v/v)CO₂下脉冲细胞。接下来除去培养基并用DPBS洗涤细胞一次。之后，向每孔中加入200μL的Optiphase Supermix(PerkinElmer，#1200-439)。然后在室温下密封板并孵育至少1小时。使用闪烁记数器对细胞中掺入的³H-胸苷计数1min。

表13示出来自一个代表性实验的数据。

表13

在没有HGF时，C8-和D11-抗体对Caki1细胞中³H-胸苷掺入的作用

AVGCPM

简称：AVG＝平均值；CPM＝每分钟计数；STDErr＝标准误

这些数据表明相比于IgG同种型对照，c-Met抗体C8-H241、C8-6、C8-co-16和D11-8B8没有显著增加Caki-1细胞中胸苷-[甲基-³H]的摄入。相比于IgG同种型对照，D11-C27G3和D11-S17Y展现低的、可变的但统计学上显著的胸苷-[甲基-³H]摄取的刺激。在相同实验条件下，在Caki-1细胞中，对照c-Met激动剂抗体5D5诱导比本发明c-Met抗体更强的胸苷-[甲基-³H]摄取。

实施例12、在没有HGF时，抗体在原代人肝细胞中的激动剂活性

进一步在没有HGF下，在响应HGF的原代人肝细胞(PHH)中评估本发明的c-Met抗体的激动剂活性。

在37℃将冷藏的有附着可能(plateable)的PHH细胞(KQG Celsis，Chicago，IL，RD#00002)解冻并在具有torpedo抗生素混合物(Celsis，#Z99000)的InVitroGRO CP培养基(Celsis，#Z99029)中重悬至175,000细胞/mL。以35,000细胞/孔向胶原I包被的96孔微滴定板(BD，FranklinLakes，NJ，#354407)每孔加入0.2mL的重悬PHH细胞，并且在37℃，5％(v/v)CO₂下孵育细胞24小时。然后吸干培养基并向每孔加入150μL具有torpedo抗生素混合物和0.1％(w/v)BSA的InVitroGRO HI培养基(Celsis，#Z99009)，以终浓度范围为10μg/mL至0.0032μg/mL加50μL的c-Met和对照抗体或加终浓度为200ng/mL的HGF，其配置在具有torpedo抗生素混合物和0.1％(w/v)BSA的InVitroGRO HI培养基中。在37℃，5％(v/v)CO₂下孵育细胞48小时，并且孵育最后6小时时，向每孔加入10μL的0.1mCi胸苷-[甲基-³H]/mL(MP Biomedicals，Solon，OH，#24066)。将检测板在70℃冷冻，在37℃解冻，并使用Filtermate Harvester(PerkinElmer)收集到UniFilter-96，GF/C板(Perkin Elmer，Waltham，MA，#6005174)上。干燥UniFilter板并向每孔加入20μL的Microscint 0闪烁剂(Perkin Elmer，#6013611)，以及在1450Microbeta液体闪烁记数器(Perkin Elmer)上对板计数。

表14示出具有标准差的三个重复处理的平均值，并且代表三个重复实验。

表14

在没有HGF时，多种C8-和D11-抗体对原代人肝细胞中³H-胸苷掺入的作用

数据表明相比于IgG同种型对照，本发明c-Met抗体C8-H241不显著增加PHH细胞中的胸苷-[甲基-³H]摄取；C8-6、C8-co-16、D11-8B8、D11-C27G3和D11-S17Y展现低的、可变的但统计学上显著的胸苷-[甲基-³H]摄取的刺激。然而，本发明c-Met抗体的激动剂活性显著降低5D5对照c-Met抗体的激动剂活性。激动剂抗体5D5以剂量依赖方式刺激PHH增殖，3μg/mL浓度刺激5倍增加的增殖。在200ng/mL，HGF刺激³H-胸苷摄取的5倍增加。甚至在以10μg/mL使用时，Mab C8-H241不诱导增殖。

在人肾上皮HK2细胞中获得类似结果，该细胞也响应HGF刺激而增殖。

实施例13、在没有HGF时，抗体对HepG2细胞中的管状结构形态发生的作用

HGF诱导在Matrigel^TM(Becton-Dickinson，#354234)中生长的HepG2细胞中的管状结构形态发生的改变，Matrigel^TM是含有基膜的组分的胞外基质材料。在这一实验中，评估在诱导HepG2细胞中的管状结构形态发生改变中本发明抗体的HGF样激动剂活性。

在补充有10％FBS的DMEM中培养HepG2细胞(ATCC，#HB-8065)。将100μL在补充有10％(v/v)FBS，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，#25030)，100U/500mL青霉素G和100μg/500mL链霉素(Invitrogen，#15140)的Opi-MEMI(Invitrogen，#31985)中稀释的Matrigel^TM溶液(Matrigel^TM，Becton-Dickinson)加入96孔组织培养板(Costar，#3596)的孔中。Matigel^TM溶液凝固后，加入在50μL补充有10％血清的培养基中的2000HepG2细胞。接下来，向细胞中加入终浓度为50μg/mL的c-Met和对照抗体，或者终浓度为50ng/mL的HGF。在37℃于含有5％(v/v)CO₂的潮湿环境下使细胞生长4天。4天后，除去上层培养基并用在PBS中的50μL的1mg/mL对碘硝基四唑紫(p-Iodonitro-tetrazolium violet，Sigma，#I8377)代替，在相同条件下，再孵育细胞48小时。在染色的32mm区域中拍照，并使用Image-Pro Plus 6(Media Cybernetics，Inc.，MD)分析。

在表15中示出来自一个代表性实验的数据，抗体为50μg/mL。

表15

C8-抗体对HepG2细胞中管状结构形态发生的作用

抗体(50ug/ml)

hIgG4

C8-H241

C8-co16

C8-6

mIgG

5D5

HGF(50ng/ml)

管状结构形态发生

无刺激

1.2

4.9

5.4

激动剂活性

(成倍刺激)

这些数据表明HGF和对照激动剂抗体5D5相比于同种型对照诱导HepG2细胞中约5倍管状结构形态发生的改变。相反，在相同条件下，本发明的c-Met抗体C8-H241和C8-co16不显著诱导HepG2细胞中的管状结构形态发生的改变，而c-Met抗体C8-6只诱导低水平的刺激。

用Mab D11-8-B8获得相似的结果。

实施例14、抗体对细胞能动性的作用：DU145分散检测和H441细胞划痕检测

在用HGF刺激时，DU145前列腺癌细胞彼此分离并且H441细胞填充在汇合细胞层中产生的划痕。H441细胞展现高水平的c-Met表达和这一受体的组成型磷酸化，但是仍旧是对HGF有应答的。下面的实验在分散检测和划痕检测中评估本发明的抗体对细胞能动性的激动剂作用。

DU145细胞分散检测

将在37℃，5％(v/v)CO₂下于MEM培养基(Invitrogen，#11095)+10％FBS(Invitrogen，#10082)中生长的DU145细胞(ATCC，#HTB-81)以2×10³细胞/孔在黑ViewPlate 96孔板(Perkin Elmer，Waltham，MA，#6005182)中以70μL体积铺板并在37℃，5％(v/v)CO₂下过夜孵育。将c-Met和对照抗体在细胞培养基中稀释并以20μg/mL的终浓度添加，以20μg/mL的终浓度添加HGF，每个为30μL，12个重复，并且在37℃，5％(v/v)CO₂下孵育48小时。然后吸干培养基并将细胞在2％甲醛中室温固定15min。用PBS洗涤孔3次，并且加入50μL的5U/mL AlexaFluor 488鬼笔环肽(Invitrogen，#A12379)，室温持续30min。用PBS洗涤孔3次，并且加入50μL的15μM碘化丙啶(Invitrogen，#P3566)。随后在Acumen Explorer^TM激光扫描荧光微板血细胞计数器(TTPLabtech Ltd，Cambridge，MA)上使用Jockyss软件读板以测定菌落中的DU145细胞的百分数。

结果如表所示16。

表16

C8-和D11-抗体对DU145细胞分散的作用

数据表明激动剂c-Met Mab 5D5和HGF，而非c-Met MabsC8-H241、C8-co-16、C8-6或D11-8B8显著刺激DU145细胞分散/能动性。

H441细胞划痕检测

对于H441划痕检测，使H441细胞(ATCC，#HTB-174)在RPMI-1640(Invitrogen，#11835)；10％(v/v)FBS(Invitrogen，#10082)；2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，#25030)；100U/500mL青霉素G，和100μg/500mL链霉素(Invitrogen，#15140))中生长，并且在培养基中以1×10⁶细胞/2mL/孔在6孔组织培养板(Costar，#3598)中接种。在95％相对湿度和5％(v/v)CO₂下孵育板3天。然后吸干培养基并且使细胞在低血清培养基(在RPMI培养基中0.5％(v/v)FBS)中饥饿16小时。在每孔的中部用5mL移液管头对孔底部的汇合的细胞层进行划痕，并且吸干悬浮细胞。残留的细胞用低血清培养基洗涤1X。加入低血清培养基并且使用4X物镜的明视场显微镜对划痕区域成像。这些空隙定义为0小时的空隙。

向细胞中加入检测抗体至终浓度为10μg/mL，随后在37℃，5％CO₂(v/v)孵育16小时。在200ng/mL的终浓度检测HGF。每个处理组至少以重复孔进行检测。在16小时再次使用明视场显微镜对划痕区域成像。这些空隙定义为16小时的空隙。

按照下述来计算c-Met抗体或HGF对H441细胞移动以填充空隙的作用：

结果如表17所示。

表17

C8-抗体在H441划痕检测中的作用

数据表明激动剂c-Met Mab 5D5和HGF刺激H441细胞运动/填充划痕区域。在相同条件下，c-Met Mab C8-H241和C8-6不刺激H441细胞能动性。

实施例15、c-Met抗体对HepG2细胞侵袭的作用

HGF和激动剂c-Met抗体刺激带有c-Met的细胞的侵袭。这一实验使用HepG2细胞在细胞侵袭检测中检测了本发明的c-Met抗体的激动剂活性，该HepG2细胞在侵袭检测中是对HGF有应答的。

使HepG2细胞(ATCC，#HB-8065)在无血清MEM培养基(Invitrogen，#11095)中过夜饥饿然后向基质胶侵袭室(BD，FranklinLakes，NJ，#354483)的上室中的每孔中加入总体积为500μL的5×10⁴细胞，而下室含有在总体积为750μL的无血清培养基中的浓度为10μg/mL的抗体，或者在无血清培养基中的50ng/mL的HGF。随后在37℃，5％(v/v)CO₂孵育48小时。用拭子从上室除去非侵袭细胞，随后用95％乙醇进行膜固定并用0.2％(w/v)结晶紫染色。洗涤并干燥后，使用Image-Pro Plus 6Manual Tag(Media Cybernetics，Inc.，MD)软件分析照片对侵袭细胞数计数，照片是以2.5X物镜自染色细胞获得。

结果概述于表18中。

表18

C8-、C8和D11抗体对HepG2细胞侵袭的作用

数据表明激动剂c-Met Mab 5D5和HGF，而非c-Met MabsC8-H241和(鼠)C8刺激HepG2侵袭。鼠c-Met Mab optD11微弱地诱导HepG2细胞侵袭。

实施例16、C8-和D11-抗体不保护Caki-1细胞免于星形孢菌素诱导的细胞凋亡

HGF和激动剂c-Met抗体保护细胞免于星形孢菌素诱导的细胞死亡。这一实施例使用HGF反应性Caki-1细胞在星形孢菌素诱导的细胞凋亡检测中检测了本发明的c-Met抗体的激动剂活性。

Caki-1细胞(ATCC，#HTB-46)按实施例11所述生长，并以1×10⁴细胞/孔接种到96孔板(Costar，#3596)的培养基中，并且用抗体(在细胞培养基中从30000ng/mL到3ng/mL稀释)，或HGF(从225ng/mL到0.02ng/mL稀释)预处理1小时，随后用0.1μM星形孢菌素(终浓度)在37℃处理48小时。吸干培养基并用Cell Death Detection ELISA试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN，#11774425001)的0.2mL裂解缓冲液组分裂解细胞30min。这一试剂盒利用20μL各裂解物通过检测由在450nm处的吸收所测定的细胞质组蛋白相关的DNA片段来测量细胞死亡。

表19所示的结果表明HGF，而非c-Met Mabs C8-H241、C8-6和D11-8B8保护Caki-1细胞免于星形孢菌素诱导的细胞凋亡。

表19

c-Met抗体对Caki-1细胞中星形孢菌素-诱导的细胞凋亡的作用

^*STS：星形孢菌素

实施例17、C8-抗体对血管发生的作用

HGF和激动剂c-Met抗体刺激血管发生。在ADSC/ECFC共培养管形成检测中评估本发明的c-Met抗体此功能性激动剂特性。源自脂肪的干细胞(ADSC)表达HGF；内皮集落形成细胞(ECFC)响应HGF的刺激而形成管。

分离ADCS(Lonza，Allendale，NJ，#PT-5006)并在基础培养基(MCDB-131培养基(Sigma，St.Louis，MO#M8537))+30μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma#A8960)，1μM地塞米松(Sigma#D4902)，50μg/mL妥布拉霉素(Sigma#T4014)，10μg/mL Cell Prime r-转铁蛋白AF(Millipore#9701)+10μg/mL Nucellin(Lilly人重组胰岛素))中重悬，并以4×10⁴细胞/孔加入96孔板中，并在37℃，5％(v/v)CO₂下过夜孵育。吸干培养基，并且在基础培养基中以100μL/孔加入500μg/mL肝素钠(Sigma，#H3393)；然后在37℃孵育细胞1小时。吸干孔并用100μL基础培养基洗涤一次，按下述加入ECFC：分离ECFC(EndGenitor Technologies，Inc.，Indianapolis，IN#EGT-ECFC100506)，在基础培养基中洗涤，在基础培养基中重悬，并在96孔板中ADSC的上部以4×10³细胞/孔加入。在37℃孵育4小时后，在细胞培养基中稀释HGF和抗体并以下面的终浓度添加到分别的孔中：HGF：100ng/mL；抗体：10μg/mL。HGF抗体(R&DSystems#AB-294-NA)也以10μg/mL的终浓度添加。将细胞在37℃再孵育另外的4天。吸干孔，并加入100μL/孔的1％多聚甲醛，随后孵育20-30min。细胞用PBS-BSA(0.1％BSA，Invitrogen#15260-037)洗涤三次并用50μL的1μg/mL抗人CD31抗体(R&D Systems，#AF806)在37℃处理1小时或者在4℃过夜处理。细胞用PBS-BSA洗涤两次并用50μL的4μg/mL抗山羊IgG AlexaFluor488缀合物(Invitrogen，#A11015)在室温处理1小时。细胞用PBS-BSA洗涤两次并用100μL的Hoechst3342染料染色并在Cellomics ArrayScan(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)上读数。使用vHCS View Version 1.4.6软件来测定总的管面积，该管面积用来评估多种抗体和HGF刺激血管发生的作用。

结果如表所示20。

表20

C8-抗体对ECFC细胞中管形成的影响

结果表明C8-H241和C8-6相比于培养基或它们相应的同种型对照抗体而言并不刺激管形成，而HGF和激动剂Mab 5D5显著刺激管形成。

实施例18、在异种移植模型中，HGF无关的和HGF依赖的肿瘤细胞生长的抑制

分别使用MKN45细胞和U87MG(人成胶质细胞瘤)细胞小鼠异种移植模型，在体内检测中检测本发明的c-Met抗体对HGF无关的和HGF依赖的肿瘤细胞生长的抑制。在没有HGF时，MKN45细胞组成型表达高水平的c-Met和c-Met磷酸化。U87MG细胞以自分泌方式分泌HGF，并且是对HGF有应答的。

如实施例8所述扩增MKN45细胞(Japan Health SciencesFoundation，Health Science Research Resource，#JCRB0254)，胰蛋白酶化成单细胞，收集并在PBS中重悬。将在PBS中的二百万MKN45细胞皮下注射到无胸腺裸鼠(Harlan，Indianapolis，IN)的后腹侧中。将c-Met抗体和相应的IgG2及IgG4抗体在pH 7.2的PBS中稀释，并且在肿瘤细胞移植后的3或7天开始，以1、5或20mg/mL每周通过静脉内注射给予。在处理过程期间每周两次通过三维卡尺测量肿瘤体积来测定肿瘤细胞生长的抑制。测量体重作为总的毒性测量值。

在37℃，使U87MG细胞(ATCC，#HTB-14)在MEM(Invitrogen，#11095)中生长，在培养基中扩增，胰蛋白酶化成单细胞，收集并在PBS(Invitrogen，#14190)中重悬。将五百万细胞皮下注射到无胸腺裸鼠(Harlan，Indianapolis，IN)的后腹侧中。在PBS中稀释c-Met抗体并且从肿瘤细胞移植后7天开始，以表22所示的剂量每周通过静脉内注射给予。以10mg/kg给予对照IgG4抗体。在处理过程期间每周两次通过三维卡尺测量肿瘤体积来测定肿瘤细胞生长的抑制。测量体重作为总的毒性测量值。

表21概述了在MKN45细胞异种移植模型中，四种抗体D11-8B8、C8-H241、C8-6和C8-Co-16的抗肿瘤效力。“最大抑制％”表示相比于用相应对照抗体(0％抑制)的处理，肿瘤生长的抑制百分数。

当施以5mg/kg或20mg/kg剂量时，所有四种c-Met抗体都产生相比于它们相应的IgG同种型对照，对于MKN45肿瘤细胞生长的显著抑制。

表21

C8-和D11-抗体体内对HGF无关的MKN45肿瘤生长的影响

如表22所总结，也在HGF依赖的U87MG细胞异种移植模型中观察到C8-H241对肿瘤细胞生长的剂量依赖型抑制。“最大抑制％”表示相比于用相应的IgG4对照抗体(0％抑制)的处理，肿瘤生长的抑制百分数。

表22、C8-H241抗体体内对HGF依赖的U87MG肿瘤生长的影响

在5和20mg/kg，C8-H241抗体也分别抑制H441非小细胞肺癌异种移植肿瘤生长58％和60％。H441细胞展现出高水平的c-Met表达以及c-Met的组成型磷酸化，但仍旧对HGF是有应答的。

实施例19、抗体减少在MKN45异种移植肿瘤中总的和磷酸化的c-Met

在这个实施例中调查了c-Met抗体C8-H241对带有MKN45(HGF无关的)异种移植肿瘤的小鼠的总c-Met和磷酸化的c-Met的体内活性。在给予抗体后24小时观察到总c-Met和磷酸化的c-Met(1349位的酪氨酸)两者的剂量依赖型减少。

如实施例8所述，在培养基中扩增MKN45细胞，胰蛋白酶化并收集。将二百万在PBS中的MKN45细胞皮下注射无胸腺裸鼠(Harlan，Indianapolis，IN)的后腹侧。在pH 7.2的PBS中稀释c-Met抗体C8-H241并且在肿瘤细胞移植后，以2.5、5、10、20和40mg/kg静脉内注射给予8天。以40mg/kg给予对照抗体hIgG4。在处理24小时后，除去肿瘤、瞬时冷冻、在-80℃临时存储，并在裂解缓冲液(5mM乙二胺四乙酸(EDTA)，5mM乙二醇-二(b-氨乙基)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)，50mMHEPES，20mM焦磷酸钠(ThermoFisherScientific，#S390-500)，150mMNaCl，20mM NaF，1％(v/v)辛基苯氧聚乙氧基乙醇(

-X 100)，无EDTA的完整的蛋白酶抑制剂(Roche，Basel，Switzerland，#1836153)，磷酸酶抑制剂混合物I(Sigma#P2850)，以及磷酸酶抑制剂混合物II(Sigma#P5726))中裂解。

总c-Met ELISA

对于总c-Met ELISA，将c-Met捕获抗体在Bup H包被缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，#28382)中稀释至2μg/mL。向ELISA板(ThermoFisherScientific，Waltham，MA#439454)的每孔中加入100μL稀释的抗体并在4℃过夜孵育板。吸干孔，用TBS-T洗涤两次，然后用200μL封闭缓冲液(TBS-T加2％(w/v)BSA)在室温封闭1小时。用TBS-T洗板两次。接下来，加入肿瘤裂解物或c-Met胞外结构域(SEQ ID NO：75的氨基酸25-932)的稀释液，并在4℃过夜孵育板。然后用TBS-T洗板3次。然后向每孔加入100μL在封闭缓冲液中稀释的0.5μg/mL的生物素化的Mab 5D5(作为结合捕获抗体不同c-Met表位的第二个c-Met抗体)并在室温孵育板2小时。接下来，用TBS-T洗板3次。加入100μL在封闭缓冲液中的1/10,000稀释的过氧化物酶缀合的链亲和素(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA，#016-030-084)，并在室温下孵育混合物1小时。然后用TBS-T洗涤板3次。向每孔中加入100μL的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺溶液(BioFX，#TMBW-1000-01)，随后加入100μL终止溶液(BioFX，#LSTP-1000-01)。在具有SOFTmax Pro 4.8软件(Molecular Devices)的SpectraMax M5酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中于450nm处读板。

磷酸化的c-Met EIISA

对于磷酸-c-Met ELISA，将c-Met捕获抗体在Bup H包被缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，#28382)中稀释至2μg/mL。向ELISA板(ThermoFisherScientific，Waltham，MA#439454)的每孔中加入100μL稀释的抗体并在4℃过夜孵育板。吸干孔，用TBS-T洗涤两次，然后用200μL封闭缓冲液(TBS-T加2％(w/v)BSA)在室温封闭1小时。用TBS-T洗板两次。接下来，加入MKN45细胞裂解物，并在室温过夜孵育板。然后用TBS-T洗板3次。然后向每孔加入100μL在封闭缓冲液中稀释的0.5μg/mL的抗-pY1349c-Met抗体(Cell SignalingTechnology，Danvers，Massachusetts，#3121)并在室温孵育板2小时。接下来，用TBS-T洗板3次。加入100μL在封闭缓冲液中的1/10,000稀释的过氧化物酶缀合的抗兔IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，PA，#111-035-144)，并在室温下孵育混合物1小时。然后用TBS-T洗涤板3次。向每孔中加入100μL的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺溶液(BioFX，#TMBW-1000-01)，随后加入100μL终止溶液(BioFX，#LSTP-1000-01)。在具有SOFTmax Pro 3.1.2软件(MolecularDevices)的SpectraMax 250酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中于450nm处读板。

结果如表23所示。

数据表明在这些条件下，用Mab C8-H241体内处理MKN45异种移植肿瘤24小时使总c-Met最大减少约43％，并且使磷酸化的c-Met最大减少约73％。

表23

c-Met抗体C8-H241体内处理24小时后，MKN45异种移植肿瘤中总的以及磷酸化的c-Met的减少

总c-Met的减少

mpk：mg/kg

氨基酸和核苷酸序列

轻链可变区氨基酸序列

D11-S17Y(SEQ ID NO：1)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSVSSSISSTNLHWYQQKPGQAPRLLIYGTSYLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSYPYSFGQGTKLEIK

D11-8B8(SEQ ID NO：2)

D11-C27G3(SEQ ID NO：3)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSVSSSISSTNLHWYQQKPGQAPRLLIYGTSRLRSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSYPYSFGQGTKLEIK

C8-6(SEQ ID NO：4)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCIQYSGYPLTFGGGTKVEIK

C8-H241(SEQ ID NO：5)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIK

C8-co-16(SEQ ID NO：6)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVRSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYRGYPLTFGGGTKVEIK

轻链可变区核酸序列

D11-S17Y(SEQ ID NO：7)

GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGTCAGCTCAAGTATAAGTTCCACCAACTTACACTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGCACATCCTATCTGGCTTCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAACAGTGGAGTAGTTACCCGTACAGTTTCGGCCAAGGGACCAAGTTGGAGATCAAA

D11-8B8(SEQ ID NO：8)

GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGTCAGCTCAAGTATAAGTTCCACCAACTTACACTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGCACATCCTACCTGGCTTCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAACAGTGGAGTAGTTACCCGTACAGTTTCGGCCAAGGGACCAAGTTGGAGATCAAA

D11-C27G3(SEQ ID NO：9)

GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGTCAGCTCAAGTATAAGTTCCACCAACTTACACTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGCACATCCAGACTGAGATCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAACAGTGGAGTAGTTACCCGTACAGTTTCGGCCAAGGGACCAAGTTGGAGATCAAA

C8-6(SEQ ID NO：10)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTAAGTTCCATTTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTATTCAGTACAGTGGTTACCCGCTCACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

C8-H241(SEQ ID NO：11)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTAAGTTCCATTTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGGTGTACAGTGGTTACCCGCTCACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

C8-co-16(SEQ ID NO：12)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTACGTTCCATTTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGGTGTACAGGGGTTACCCGCTCACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

重链可变区氨基酸序列

D11-S17Y(SEQ ID NO：13)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSRYIHWVRQAPGQGLEWMGWIYPVTGDTYYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGAFYYWGQGTLVTVS

D11-8B8(SEQ ID NO：14)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSRYIHWVRQAPGQGLEWMGWIYPVTGDTYYIEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGAFFYWGQGTLVTVS

D11-C27G3(SEQ ID NO：15)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSRYIHWVRQAPGQGLEWMGWIYPVTGDTYYREPFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGAFYYWGQGTLVTVS

C8-6(SEQ ID NO：16)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRGGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARTNWLDYWGQGTTVTVS

C8-H241(SEQ ID NO：17)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPNRRGTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANWLDYWGQGTTVTVS

C8-co-16(SEQ ID NO：18)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPYRGSTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANILDYWGQGTTVTVS

重链可变区核酸序列

D11-S17Y(SEQ ID NO：19)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGTAGGTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTTATCCTGTAACTGGTGATACTTACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCTACGGAGCTTTTTACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCC

D11-8B8(SEQ ID NO：20)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGTAGGTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTTATCCTGTAACTGGTGATACTTACTACATCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCTATGGTGCTTTTTTCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCC

D11-C27G3(SEQ ID NO：21)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGTAGGTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTTATCCTGTAACTGGTGATACTTACTACAGAGAGCCTTTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCTATGGGGCTTTTTACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCC

C8-6(SEQ ID NO：22)

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGTCAGGCCCCTGGTCAAGGTCTTGAGTGGATGGGTCGTGTTAATCCTAACCGGGGTGGTACTACCTACAACCAGAAATTCGAGGGCCGTGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGCGTAGCCTGCGTTCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGTACGAACTGGCTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTCTCC

C8-H241(SEQ ID NO：23)

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGTCAGGCCCCTGGTCAAGGTCTTGAGTGGATGGGTCGTGTTAATCCTAACCGGAGGGGTACTACCTACAACCAGAAATTCGAGGGCCGTGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGCGTAGCCTGCGTTCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGTGCGAACTGGCTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTCTCC

C8-co-16(SEQ ID NO：24)

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACATTCACTGACTACTACATGCACTGGGTGCGTCAGGCCCCTGGTCAAGGTCTTGAGTGGATGGGTCGTGTTAATCCTTATCGGGGTAGTACTACCTACAACCAGAAATTCGAGGGCCGTGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGCGTAGCCTGCGTTCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGTGCGAACATTCTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTCTCC

完整轻链氨基酸序列

D11-S17Y kappa(SEQ ID NO：25)

EIVLTQSPGTLSLSpGERATLSCSVSSSISSTNLHWYQQKpGQAPRLLIYGTSYLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSYPYSFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

D11-8B8kappa(SEQ ID NO：26)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSVSSSISSTNLHWYQQKPGQAPRLLIYGTSYLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSYPYSFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

D11-C27G3kappa(SEQ ID NO：27)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSVSSSISSTNLHWYQQKPGQAPRLLIYGTSRLRSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQWSSYPYSFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

C8-6kappa(SEQ ID NO：28)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCIQYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDFQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

C8-H241kappa(SEQ IDNO：29)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVSSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYSGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

C8-co-16kappa(SEQ ID NO：30)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVRSIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQVYRGYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

完整轻链核酸序列

D11-S17Y IgG2 LC(SEQ ID NO：31)

GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGTCAGCTCAAGTATAAGTTCCACCAACTTACACTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGCACATCCTACCTGGCTTCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAACAGTGGAGTAGTTACCCGTACAGTTTCGGCCAAGGGACCAAGTTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

D11-8B8IgG2LC(SEQ ID NO：32)

D11-C27G3IgG2LC(SEQ ID NO：33)

GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGTGTCAGCTCAAGTATAAGTTCCACCAACTTACACTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGCACATCCAGACTGAGATCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAACAGTGGAGTAGTTACCCGTACAGTTTCGGCCAAGGGACCAAGTTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

C8-6IgG4LC(SEQ ID NO：34)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTAAGTTCCATTTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTATTCAGTACAGTGGTTACCCGCTCACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

C8-H241IgG4LC(SEQ ID NO：35)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTATCCTCCATTTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAAGTCTACAGTGGTTACCCGCTCACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

C8-co16IgG4LC(SEQ ID NO：36)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGTGTCAGCTCAAGTGTACGTTCCATTTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGGTGTACAGGGGTTACCCGCTCACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

完整重链氨基酸序列

D11-S17Y IgG2(SEQ ID NO：37)

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D11-8B8IgG2(SEQ ID NO：38)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSRYIHWVRQAPGQGLEWMGWIYPVTGDTYYIEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYGAFFYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPFPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGMEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

D11-C27G3IgG2(SEQ ID NO：39)

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C8-6IgG4(SEQ ID NO：40)

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C8-H241IgG4(SEQ ID NO：41)

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C8-co-16IgG4(SEQ ID NO：42)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGRVNPYRGSTTYNQKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARANILDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGMEVHNAKTKPRFEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREFMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

完整重链核酸序列

D11-S17Y IgG2HC(SEQ ID NO：43)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGTAGGTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTTATCCTGTAACTGGTGATACTTACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCTATGGGGCTTTTTACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCATGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT

D11-8B8IgG2HC(SEQ ID NO：44)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGTAGGTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTTATCCTGTAACTGGTGATACTTACTACATCGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCTATGGTGCTTTTTTCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCATGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT

D11-C27G3IgG2HC(SEQ ID NO：45)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGTAGGTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTTATCCTGTAACTGGTGATACTTACTACAGAGAGCCTTTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGCTACGGAGCTTTTTACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCATGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT

C8-6IgG4HC(SEQ ID NO：46)

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCGACTACTACATGCACTGGGTGCGTCAGGCCCCTGGTCAAGGTCTTGAGTGGATGGGTCGTGTTAATCCTAACCGGGGTGGTACTACCTACAACCAGAAATTCGAGGGCCGTGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGCGTAGCCTGCGTTCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGTACGAACTGGCTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTCTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

C8-H241IgG4HC(SEQ ID NO：47)

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACATTCACTGACTACTACATGCACTGGGTGCGTCAGGCCCCTGGTCAAGGTCTTGAGTGGATGGGTCGTGTTAATCCTAACCGGAGGGGTACTACCTACAACCAGAAATTCGAGGGCCGTGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGCGTAGCCTGCGTTCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGTGCGAACTGGCTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTCTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

C8-co16IgG4HC(SEQ ID NO：48)

CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGTGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACATTCACTGACTACTACATGCACTGGGTGCGTCAGGCCCCTGGTCAAGGTCTTGAGTGGATGGGTCGTGTTAATCCTTATCGGGGTAGTACTACCTACAACCAGAAATTCGAGGGCCGTGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGCGTAGCCTGCGTTCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGTGCGAACATTCTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTCACCGTCTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

人cMet-ECD-Fc-Flis(SEQ ID NO：72)

ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCS SKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTLEVLFQGPDIEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQEYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKRI

黑体，斜体氨基酸代表信号序列；黑体下划线氨基酸代表Flis标签。

食蟹猴cMet-ECD-Fc-Flis(SEQ ID NO：73)

ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETAIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPNQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPHHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYIHAFESNNFIYFLTVQRETLNAQTFHTRIIRFCSLNSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRAEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFVKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHPLNQNGYTLVVTGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECPSGTWTQQICLPAIYKVFPTSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPIITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLHSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTLEVLFQGPDIEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQEYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKRI

大鼠cMet-ECD-Fc-Flis(SEQ ID NO：74)

ECKEALVKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIHNVVLHGHHIYLGATNYIYVLNDKDLQKVSEFKTGPVVEHPDCFPCQDCS SKANVSGGVWKDNVNMALLVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVLPPDNAADIQSEVHCMFSPLAEEESGQCPDCVVSALGAKVLLSEKDRFINFFVGNTINSSYPPDYSLHSISVRRLKETQDGFKFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYIHAFESNHFIYFLTVQKETLDAQTFHTRIIRFCSVDSGLHSYMEMPLECILTEKRRKRSTREEVFNILQAAYVSKPGANLAKQIGASPYDDILYGVFAQSKPDSAEPMNRSAVCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEVRSDEYRTEFTTALQRVDLFMGRLNHVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVLSRTAHFTPHVNFLLDSYPVSPEVIVEHPSNQNGYTLVVTGKKITKIPLNGLGCGHFQSCSQCLSAPYFIQCGWCHNRCVHSNECPSGTWTQEICLPAVYKVFPTSAPLEGGTMLTICGWDFGFKKNNKFDLRKTKVLLGNESCTLTLSESTTNTLKCTVGPAMSEHFNVSVIVSNSRETTQYSAFSYVDPVITSISPRYGPHAGGTLLTLTGKYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSDSILECYTPGHTVSAEFPVKLKIDLADRVTSSFSYREDPVVSEIHPTKSFISGGSTITGIGKNLNSVSTPKLVIEVHDVGVNYTVACQHRSSSEIICCTTPSLQQLDLQLPLKTKAFFLLDGILSKHFDLTYVHDPMFKPFEKPVMISMGNENVVEIKGDDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENLHWHSEALLCTVPSDLLKLNGGELNIEWKQAVSSTVLGKVIVQPDQNFALEVLFQGPDIEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQEYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKRI

人c-Met ECD(SEQ ID NO：75)

ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIF SPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNS SGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFT

黑体，斜体氨基酸代表信号序列。

具有Flis标签的人c-Met Sema结构域(SEQ ID NO：76)

ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQ]GASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICL

人c-Met胞外结构域中的C8-抗体表位

₁₂₁VVDTYYDDQL₁₃₀(SEQ ID NO：77)

₁₃₁ISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQS₁₅₆(SEQ ID NO：78)

₁₇₉ALGAKVLSSVKDRFINF₁₉₅(SEQ ID NO：79)

₂₁₆VRRLKETKDGFM₂₂₇(SEQ ID NO：80)

₁₂₃DTYYDD₁₂₈(SEQ ID NO：81)

₁₄₄HVFPHNHTADIQS₁₅₆(SEQ ID NO：82)

₁₉₂FINF₁₉₅(SEQ ID NO：83)

₂₂₀KETKDGFM₂₂₇(SEQ ID NO：84)

人c-Met胞外结构域中的D11-抗体表位

₈₄Y KTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANL₉₅(SEQ ID NO：85)

₉₅CFPCQDCSSKA₁₀₅(SEQ ID NO：86)

共有CDR序列

D11-抗体轻链CDR2

GTSX₁LX₂S(SEQ ID NO：87)，其中X1是Y或R，并且X₂是A或R；

C8-抗体轻链CDR1

SVSSSVX₃SIYLH(SEQ ID NO：88)，其中X₃是S或R；

C8-抗体轻链CDR3

X₄X₅YX₆GYPLT(SEQ ID NO：89)，其中X₄是I或Q，X₅是Q或V，并且X₆是S或R；

D11-抗体重链CDR2

WIYPVTGDTYYX₇EX₈FKG(SEQ ID NO：90)，其中X₇是N、I或R，并且X₈是K或P；

D11-抗体重链CDR 3

GYGAFX₉Y(SEQ ID NO：91)，其中X₉是Y或F；

C8-抗体重链CDR 2

RVNPX₁₀RX₁₁X₁₂TTYNQKFEG(SEQ ID NO：92)，其中X₁₀是N或Y，X₁₁是G或R，并且X₁₂是G或S；

C8-抗体重链CDR3

X₁₃NX₁₄LDY(SEQ ID NO：93)，其中X₁₃是T或A，并且X₁₄是W或I；

共有轻链可变区序列

D11-抗体轻链可变区共有序列(SEQ ID NO：94)

其中X₁是Y或R，并且X₂是A或R；

C8-抗体轻链可变区共有序列(SEQ ID NO：95)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSVSSSVX₃SIYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCX₄X₅YX₆GYPLTFGGGTKVEIK

其中X₃是S或R，X₄是I或Q，X₅是Q或V，并且X₆是S或R；

共有重链可变区序列

D11-抗体重链可变区共有序列(SEQ ID NO：96)

其中X₇是N、I或R，X₈是K或P，并且X₉是Y或F；

C8-抗体重链可变区共有序列(SEQ ID NO：97)

Claims

1.一种特异性结合c-MET的单克隆抗体，包括三个轻链互补决定区LCDR和三个重链互补决定区HCDR，其中LCDR1的氨基酸序列是SVSSSVSSIYLH(SEQ ID NO:53)，LCDR2的氨基酸序列是STSNLAS(SEQ ID NO:54)，LCDR3的氨基酸序列是QVYSGYPLT(SEQ IDNO:56)，HCDR1的氨基酸序列是GYTFTDYYMH(SEQ ID NO:65)，HCDR2的氨基酸序列是RVNPNRRGTTYNQKFEG(SEQ ID NO:68)，和HCDR3的氨基酸序列是ANWLDY(SEQ ID NO:69)。

2.权利要求1的单克隆抗体，包括轻链可变区LCVR和重链可变区HCVR，其中LCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO:5并且HCVR的氨基酸序列是SEQ ID NO:17。

3.权利要求1-2中任一项的单克隆抗体，包括轻链κ恒定区和IgG4重链恒定区。

4.权利要求1的单克隆抗体，其中所述轻链的氨基酸序列与由SEQID NO:35编码的氨基酸序列相同；并且所述重链的氨基酸序列与由SEQ ID NO:47编码的氨基酸序列相同。

5.权利要求1的单克隆抗体，其中轻链由SEQ ID NO:35的多核苷酸序列编码，和重链由SEQ ID NO:47的多核苷酸序列编码。

6.权利要求5的单克隆抗体，由SEQ ID NO:35的多核苷酸序列编码的两条轻链和由SEQ ID NO:47的多核苷酸序列编码的两条重链组成。

7.权利要求1的单克隆抗体，包含两条轻链和两条重链，其中所述轻链的氨基酸序列与由SEQ ID NO:35编码的氨基酸序列相同；并且所述重链的氨基酸序列与由SEQ ID NO:47编码的氨基酸序列相同。

8.权利要求2的单克隆抗体，其中所述轻链的氨基酸序列与由SEQID NO:35编码的氨基酸序列相同；并且所述重链的氨基酸序列与由SEQ ID NO:47编码的氨基酸序列相同。

9.权利要求2的单克隆抗体，其中轻链由SEQ ID NO:35的多核苷酸序列编码，和重链由SEQ ID NO:47的多核苷酸序列编码。

10.权利要求9的单克隆抗体，由SEQ ID NO:35的多核苷酸序列编码的两条轻链和由SEQ ID NO:47的多核苷酸序列编码的两条重链组成。

11.权利要求2的单克隆抗体，包含两条轻链和两条重链，其中所述轻链的氨基酸序列与由SEQ ID NO:35编码的氨基酸序列相同；并且所述重链的氨基酸序列与由SEQ ID NO:47编码的氨基酸序列相同。

12.权利要求3的单克隆抗体，其中所述轻链的氨基酸序列与由SEQID NO:35编码的氨基酸序列相同；并且所述重链的氨基酸序列与由SEQ ID NO:47编码的氨基酸序列相同。

13.权利要求3的单克隆抗体，其中轻链由SEQ ID NO:35的多核苷酸序列编码，和重链由SEQ ID NO:47的多核苷酸序列编码。

14.权利要求13的单克隆抗体，由SEQ ID NO:35的多核苷酸序列编码的两条轻链和由SEQ ID NO:47的多核苷酸序列编码的两条重链组成。

15.权利要求3的单克隆抗体，包含两条轻链和两条重链，其中所述轻链的氨基酸序列与由SEQ ID NO:35编码的氨基酸序列相同；并且所述重链的氨基酸序列与由SEQ ID NO:47编码的氨基酸序列相同。

16.权利要求4的单克隆抗体，包含两条轻链和两条重链，其中所述轻链的氨基酸序列与由SEQ ID NO:35编码的氨基酸序列相同；并且所述重链的氨基酸序列与由SEQ ID NO:47编码的氨基酸序列相同。

17.一种药物组合物，包括权利要求1-16中任一项的单克隆抗体，以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。

18.权利要求17的药物组合物在制备用于治疗由c-Met介导的人类癌症的药物中的用途。

19.权利要求18的用途，所述药物用于治疗人类的胃癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌或肺癌。

20.权利要求1-16中任一项的单克隆抗体在制造治疗由c-Met介导的人类癌症的药物中的应用。

21.权利要求1-16中任一项的单克隆抗体在制造治疗人类癌症的药物中的应用，其中所述癌症是胃癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌或肺癌。