EA020398B1

EA020398B1 - Антитела к с-мет

Info

Publication number: EA020398B1
Application number: EA201170716A
Authority: EA
Inventors: Джулиан Дэвис; Лин Лю; Цзижун Лу; Питер Эдвард Вайлланкур; Марк Эндрю Уортинджер; Вэй Цзэн
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2009-11-18
Publication date: 2014-10-30
Also published as: DK2358755T3; JP5688027B2; BRPI0922800A2; KR20110074612A; EP2963058B1; AU2009316742B2; CA2743508A1; HK1158229A1; CY1116886T1; US20120263723A1; JP2012509881A; HRP20151019T1; SI2358755T1; CN102216333B; IL212633A0; EP2358755A1; US20100129369A1; EA201170716A1; JO3097B1; HUE026058T2

Abstract

Предоставлены моноклональные антитела, их антиген-связывающие фрагменты и комбинации вышеуказанного, которые связываются с c-Met и ингибируют его активность и которые являются эффективными при лечении раковых опухолей и других заболеваний, расстройств или состояний, патогенез которых опосредован c-Met.

Description

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связывают с-Ме!, и их применению для лечения состояний и расстройств, патогенез которых опосредован этим рецептором.

с-Ме!, представитель суперсемейства тирозинкиназ, является рецептором фактора роста гепатоцитов (НОР). Связывание НОР с с-Ме! приводит к димеризации или мультимеризации рецептора, фосфорилированию большого количества остатков тирозина в его внутриклеточном участке, каталитической активации и запуску нижеследующего сигнального каскада. с-Ме! также активируется через лиганднезависимые механизмы, включая сверхэкспрессию, амплификацию и мутацию рецептора. Активация сМе! усиливает пролиферацию, миграцию, морфогенез, выживание (включая защиту от апоптоза) клеток и синтез протеаз, что представляет собой характеристики, ассоциированные с инвазивным фенотипом клеток и неблагоприятным исходом болезни и устойчивостью к лекарствам у больных раком. Сигнальный путь с-Ме! представляет собой один из сигнальных путей, регуляция которого наиболее часто нарушается при раке у человека, что происходит практически при всех видах солидных опухолей.

Международная публикация РСТ νΟ 09/007427 описывает антитела мыши и гуманизированные антитела с привитыми СОК, направленные против с-Ме!. Мышиное антитело 224О11, описанное в указанном документе, не связывают домен §еша с-Ме!. Дополнительные функциональные свойства гуманизированных 1§О1-производных этих мышиных антител, обозначенных как Й224С11 МаЬ, приведены в рефератах №№ 835 (данные ίη νίίΓο) и 2792 (данные ίη νίνο) и на сопровождающих их постерах, представленных на съезде Американской ассоциации научных исследований в области раковых заболеваний (Денвер, штат Колорадо, США) в апреле 2009 г. В этих рефератах и постерах сообщается, что бивалентные Й224С11 МаЬ лишены собственных агонистических свойств, ведут себя как полные антагонисты сМе! и эффективно снижают димеризацию с-Ме!. Сообщается, что мышиные 224О11 подавляют с-Ме! и блокируют фосфорилирование с-Ме! ίη νίνο. В случае других рецепторов димеризация является обязательным условием для интернализации и деградации рецептора. В этих рефератах и постерах не представлены какие-либо данные, относящиеся к интернализации с-Ме!. Более того, не идентифицирован эпитоп с-Ме!, с которым связывает указанное гуманизированное антитело.

Международная публикация РСТ νΟ 05/016382 также описывает антитела к с-Ме!, но не идентифицирует эпитоп(ы), с которым(и) связываются указанные антитела. Пример картирования эпитопов представлен, однако описанные результаты всего лишь показывают, что шесть антител к с-Ме! связываются с общим эпитопом, а седьмое антитело к с-Ме! связывается с обособленным эпитопом. Конкретные эпитопы, с которыми связываются эти антитела к с-Ме!, не представлены.

Существует потребность в антагонистических антителах к с-Ме! человека, связывание которых с αцепью с-Ме! человека облегчает интернализацию рецептора с поверхности клетки в присутствии и/или в отсутствие НОР. Также существует потребность в антагонистических антителах к с-Ме! человека, связывание которых с α-цепью с-Ме! человека облегчает интернализацию рецептора с поверхности клетки в клетках, содержащих разновидности с-Ме! с мутациями, связанными с приобретением функции. Также существует потребность в антагонистических антителах к с-Ме! человека, индуцирующих деградацию сМе! и сокращение количества фосфорилированных с-Ме!. Подобная антагонистическая активность могла бы снизить количество доступных сайтов связывания для НОР на поверхности опухолевых клеток и остановить активацию каскада, вызванную сверхэкспрессией, амплификацией или мутацией с-Ме!. В то же время такие антагонистические антитела должны ингибировать связывание НОР с с-Ме! и НОРиндуцированную активацию с-Ме! и слабо индуцировать или не индуцировать агонистическую активность сами по себе.

Препараты антител согласно настоящему изобретению удовлетворяют этим потребностям. Они связываются с эпитопами в составе α-цепи домена 8еша с-Ме! человека, ингибируют связывание НОР с сМе! и активацию рецептора, при этом слабо индуцируя или не индуцируя агонистическую активность. Антитела согласно настоящему изобретению также индуцируют интернализацию рецептора в присутствии или в отсутствие НОР, а также в клетках, содержащих разновидности с-Ме! с мутациями, связанными с приобретением функции. Они индуцируют деградацию с-Ме! и сокращение количества фосфорилированных с-Ме! человека и ингибируют НОР-зависимую и НОР-независимую пролиферацию опухолевых клеток, которые экспрессируют этот рецептор. Ввиду этих свойств препараты указанных антител могут находить терапевтическое применение при лечении злокачественных опухолей, опосредованных с-Ме! через разнообразные механизмы.

Кроме того, препараты антител согласно настоящему изобретению обладают рядом других привлекательных свойств. Они демонстрируют высокую аффинность (К_с) к с-Ме!, блокируют НОРопосредованное фосфорилирование с-Ме! и активацию нижестоящего сигнального каскада, пролиферацию и миграцию клеток; и лишь в слабой степени индуцируют фосфорилирование с-Ме! при слабой индукции или отсутствии индукции НОР-подобной биологической активности, например индукции пролиферации, подвижности, инвазии опухолевых клеток, тубулогенеза, ангиогенеза или антиапоптозных эффектов. Они ингибируют и лиганд (НОР)-зависимую, и лиганд-независимую активацию пути с-Ме!. Кроме того, препараты антител согласно настоящему изобретению предпочтительно связывают внеклеточный домен (ЕСО) с-Ме! по сравнению с ЕСО близкородственных рецепторов ΚΟΝ и Р1ех1пА2 и не

- 1 020398 вызывают отщепления (кйеДДшд) ЕСЭ с-Ме!.

Соответственно, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или антигенсвязывающему фрагменту указанного антитела, которое:

a) связывается с эпитопом в составе α-цепи с-Ме! человека и

b) индуцирует интернализацию с-Ме! человека с поверхности клетки.

Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела индуцирует независимую от фактора роста гепатоцитов интернализацию с-Ме! человека с поверхности клетки. В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 29, а тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 41.

Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует интернализацию с-Ме! человека в клетках, содержащих разновидность с-Ме! с мутациями, связанными с приобретением функции. Мутация с приобретением функции может предствалять собой мутацию киназного домена с-Ме! М1149Т или мутацию субмембранного домена К.988С.

Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует интернализацию по меньшей мере 40% с-Ме! человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 45% с-Ме! человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных антител или антигенсвязывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 50% с-Ме! человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 55% с-Ме! человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 60% с-Ме! человека с поверхности клетки. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 65% с-Ме! человека в клетке. Любое из вышеуказанных антител или антиген-связывающих фрагментов указанных антител, где указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела индуцирует интернализацию по меньшей мере 70% с-Ме! человека с поверхности клетки.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающих фрагментов указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества с-Ме! в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов. В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества с-Ме! в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 28, а тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества с-Ме! в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 29, а тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 41.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение количества фосфорилированного с-Ме! в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывает, по существу, тот же эпитоп α-цепи с-Ме! человека, что и антитело, которое содержит легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую 8ЕС ГО N0: 28, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую 8ЕС ГО N0: 40, или которое связывает, по существу, тот же эпитоп α-цепи с-Ме! человека, что и антитело, которое содержит легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую 8ЕС ГО N0: 29, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую 8ЕС ГО N0: 41.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, за исключением тех, что содержат легкую цепь, содержащую последовательность амино- 2 020398 кислот, соответствующую δΕΟ ГО N0: 26, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую δΕΟ ГО N0: 38, отличающееся тем, что указанный эпитоп содержит один или более остатков аминокислот из ^ΗνΡΡΗΝΗΤΑΌΐρδ^ (δΕΟ ΙΌ N0: 82) включительно.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, отличающееся тем, что указанный эпитоп дополнительно содержит один или более аминокислотных остатков из ₁₂₃ΌΤΥΥΌΌ₁₂₈ (δΕΟ ΙΌ N0: 81) включительно.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, отличающееся тем, что указанный эпитоп дополнительно содержит один или более аминокислотных остатков из ^РЮТА (δΕΟ ГО N0: 83) включительно.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, отличающееся тем, что указанный эпитоп дополнительно содержит один или более аминокислотных остатков из ₂₂₀ΚΕΤΚΌΟΡΜ₂₂₇ (δΕΟ ΙΌ N0: 84) включительно.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанное антитело связывается с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из

a) ₁₂₁ννθΤΥΥΏΌρΕ₁₃₀ (δΡΟ ΙΌ N0: 77),

b) ₁₃₁IδСΟδVNКΟΤС^КΗVΡΡΗNΗΤΑ^I^δ₁₅₆ (δΡΟ ΙΌ N0: 78),

c) ₁₇₉Α^ΟΑΚV^δδVΚ^КΡINΡ₁₉₅ (δΡΟ ΙΌ N0: 79) и

ά) ₂₁₆νΚΚΡΚΕΤΚΌΟΡΜ₂₂₇ (δΕΟ ΙΌ N0: 80) включительно.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где антитело связывается с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из

a) 123ΌΤΥΥΌΌ128 (δΡΟ ΙΌ N0: 81),

b) 11ΥΡΡΙ 1\Ι ΙΊΑΙΙΙΟδ,.. (δΡΟ ΙΌ N0: 82),

c) ^РЮТ^ (δΡΡ) ΙΌ N0: 83) и

ά) ₂₂₀ΚΕΤΚΌΟΡΜ₂₂₇ (δΕΟ ΙΌ N0: 84) включительно.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывается с аминокислотной последовательностью в пределах зпитопа, характеризующегося последовательностями ₁₂₁ννΌΤΥΥΌΌρΌ₁₃₀ (δΕΟ ΙΌ N0: 77), ₁₃₁IδСΟδVNК.ΟΤС^КΗVΡΡΗNΗΤΑ^I^δ₁₅₆ (δΡΡ) ΙΌ N0: 78), π^ΟΑ^^δΥ^ΕΡ^^ (δΡΡ) ΙΌ N0: 79) и ₂₁₆νΚΚΕΚΕΤΚΌΟΡΜ₂₂₇ (δΕΟ ΙΌ N0: 80) включительно.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывается с аминокислотной последовательностью в пределах эпитопа, характеризующегося последовательностями ₁₂₃ΌΤΥΥΌΌ₁₂₈ (δΕΟ ΙΌ N0: 81), ₁₄₄ΗVΡΡΗNΗΤΑ^I^δ₁₅₆ (δΕΟ ΙΌ N0: 82), ^РЮТА (δΙΡ) ΙΌ N0: 83) и ₂₂₀ΚΕΤΚΌΟΡΜ₂₂₇ (δΙΤ) ΙΌ N0: 84) включительно.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанное антитело связывается с участком в пределах аминокислотной последовательности ₉₅ί'’ΡΡί'ΌΌί'’δδΙ<Α|₀₅ (δΕΟ ΙΌ N0: 86) включительно.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, за исключением тех, что включают легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую δΕΟ ΙΌ N0: 29, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, соответствующую δΕΟ ΙΌ N0: 41, где эпитоп содержит один или более аминокислотных остатков из ₉₅ί'’ΡΡί'ΌΌί'’δδΙ<Α₁₀₅ (δΕΟ ΙΌ N0: 86) включительно.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывают с-ΜοΙ человека и содержит три гипервариабельных участка легкой цепи (ЬСОК) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (ΗΟΌΚ), где указанные три ЬСГОК и указанные три ΗΟΌΚ выбраны из группы, состоящей из

a) ЬСОК1, содержащего последовательность аминокислот δνδδδΙδδΤΧΡΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 49);

ЬСОК2, содержащего последовательность аминокислот ΟΤδΧ₁ΌΧ₂δ (δΕΟ ΙΌ N0: 87), где Х₁ представляет собой Υ или К, а Х₂ представляет собой А или К;

ЬСОК3, содержащего последовательность аминокислот ρρνδδΥΡΥδ (δΕΟ ΙΌ N0: 51);

Ηί'ΌΚΡ содержащего последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤδΚΥΙΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 59);

Ηί'.’ΌΚ2. содержащего последовательность аминокислот νΙΥΡνΤΟΌΤΥΥΧ₇ΕΧ₈ΡΚΟ (δΕΟ ΙΌ N0: 90), где Х₇ представляет собой N Ι или К, а Х₈ представляет собой Κ или Ρ; и

ΗΡΏΕΙ, содержащего последовательность аминокислот ΟΥΟΑΡΧ₉Υ (δΕΟ ΙΌ N0:91), где Х₉ представляет собой Υ или Р; и

b) ЬСОК1, содержащего последовательность аминокислот δνδδδνΧ₃δΙΥΌΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 88), где Х3 представляет собой δ или К;

ЬСОК2, содержащего последовательность аминокислот δΤδΧΌΑδ (δΕΟ ΙΌ N0: 54);

ЬСОК3, содержащего последовательность аминокислот Χ₄Χ₅ΥΧ₆ΟΥΡΡΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 89), где Х₄представляет собой Ι или О, Х₅ представляет собой О или V, а Χ₆ представляет собой δ или К;

Ηί'ΌΚΡ содержащего последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤΌΥΥΜΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 65);

- 3 020398

НСОК2, содержащего последовательность аминокислот Κ.νΝΡΧι₀Κ.ΧιιΧι₂ΤΤΥΝΟΙ<ΕΕΟ (8ЕО ΙΌ N0: 92), где Х_!0 представляет собой N или Υ, Χ_η представляет собой О или К, а Х_!2 представляет собой О или 8; и

НСОК3, содержащего последовательность аминокислот Χ₁₃ΝΧ₁₄ΕΌΥ (8Е0 ΙΌ N0: 93), где Χ₁₃представляет собой Т или А, а Χ₁₄ представляет собой V или I;

где указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела связывает эпитоп в составе α-цепи указанного с-Ме! человека и индуцирует интернализацию с-Ме! человека с поверхности клетки.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывает с-Ме! человека и содержит три гипервариабельных участка легкой цепи (ЬСОК) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (НСОК), причем указанное антитело содержит три гипервариабельных участка легкой цепи (ЬСОК) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (НСОК), где

БСОК1 содержит последовательность аминокислот 8ν888Ι88ΤΝΕΜ (8Е0 ΙΌ N0: 49);

БСОК2 содержит последовательность аминокислот ОТ8Х₁ЬХ₂8 (8Е0 ГО N0: 87), где Χ₁ представляет собой Υ или К, а Х₂ представляет собой А или К;

БСОК3 содержит последовательность аминокислот ΟΟ\ν88ΥΡΥ8 (8Е0 ΙΌ N0: 51);

НСИК1 содержит последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤ8ΡΥΙΜ (8Е0 ΙΌ N0: 59);

НСИК2 содержит последовательность аминокислот νΙΥΡνΤΟΟΤΥΥΧ₇ΕΧ₈ΡΚΟ (8Е0 ΙΌ N0: 90), где Х₇ представляет собой N Ι или К, а Х₈ представляет собой Κ или Ρ; и

НСГОКЗ содержит последовательность аминокислот ΟΥΟΑΡΧ₉Υ (8Е0 ΙΌ N0: 91), где Х₉ представляет собой Υ или Ρ.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывает с-Ме! человека и содержит три гипервариабельных участка легкой цепи (ЬСОК) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (НСОК), где БСОК1 содержит последовательность аминокислот 8V888VX₃8IΥ^Н (8Е0 ГО N0: 88), где Х₃ представляет собой 8 или К;

БСОК2 содержит последовательность аминокислот 8Τ8ΧΕΑ8 (8Е0 ГО N0: 54);

ЬСОКЗ содержит последовательность аминокислот Χ₄Χ₅ΥΧ₆ΟΥΡΌΤ (8Е0 ΙΌ N0: 89), где Х₄ представляет собой Ι или О. Х₅ представляет собой О или V, а Х₆ представляет собой 8 или К;

НСОК1 содержит последовательность аминокислот 0ΥΤΡΤΌΥΥΜ4 (8Е0 ГО N0: 65);

НСОК2 содержит последовательность аминокислот КVNΡX₁₀КX₁₁X₁₂ΤΤΥN^ΚΡЕΟ (8Е0 ГО N0: 92), где Х₁₀ представляет собой N или Υ, Χ_η представляет собой О или К, а Х₁₂ представляет собой О или 8; и

НСОКЗ содержит последовательность аминокислот Χ^Χ^Ε-ΌΥ (8Е0 ΙΌ N0: 93), где Χ_!3 представляет собой Т или А, а Х_и представляет собой V или Ι.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывают с-Ме! человека и содержит три гипервариабельных участка легкой цепи (ЬСОК) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (НСОК), и где указанные три ЬСОК и указанные три НСОК выбраны из группы, состоящей из

a) БСОК1, содержащего последовательность аминокислот 8V888I88ΤN^Н (8Е0 ГО N0: 49);

БСОК2, содержащего последовательность аминокислот ΟΤ8ΥΌΑ8 (8Е0 ГО N0: 50);

БСОК3, содержащего последовательность аминокислот 00ν88ΥΡΥ8 (8Е0 ГО N0: 51);

НСОК1, содержащего последовательность аминокислот ОΥΤΡΤ8КΥIН (8Е0 ГО N0: 59);

НСОК2, содержащего последовательность аминокислот VIΥΡVΤО^ΤΥΥNЕΚΡΚО (8Е0 ГО N0:

60); и

НСОК3, содержащего последовательность аминокислот ΟΥΟΑΡΥΥ (8Е0 ГО N0: 61);

b) ЬСОК 1, содержащего последовательность аминокислот 8V888I88ΤN^Н (8Е0 ГО N0: 49);

БСОК3, содержащего последовательность аминокислот ΟΟ\ν88ΥΡΥ8 (8Е0 ГО N0: 51);

НСОК2, содержащего последовательность аминокислот νΙΥΡνΤΟΟΤΥΥΙΕΚΡΚΟ (8Е0 ГО N0: 62);

и

НСОК3, содержащего последовательность аминокислот ΟΥΟΑΡΡΥ (8Е0 ГО N0: 63);

c) БСОК1, содержащего последовательность аминокислот 8V888I88ΤN^Н (8Е0 ГО N0: 49);

БСОК2, содержащего последовательность аминокислот ΟΤ8ΡΕΡ8 (8Е0 ГО N0: 52);

НСОК2, содержащего последовательность аминокислот νΙΥΡνΤΟΌΤΥΥΡΕΡΡΚΟ (8Е0 ГО N0:

64); и

НСОК3, содержащего последовательность аминокислот ΟΥΟΑΡΥΥ (8Е0 ГО N0: 61); б) ЬСОК 1, содержащего последовательность аминокислот 8ν888ν88ΙΥΕΜ (8Е0 ГО N0: 53); БСОК2, содержащего последовательность аминокислот 8Τ8ΧΕΑ8 (8Е0 ГО N0: 54);

- 4 020398

ЬСОКЗ, содержащего последовательность аминокислот ΙΟΥδΟΥΡΕΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 55);

Ηί'ΌΚΙ. содержащего последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤΟΥΥΜΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 65);

Ηί'ΌΚ2. содержащего последовательность аминокислот ΚνΝΡΝΚΟΟΤΤΥΝρΚΡΕΟ (δΕΟ ΙΌ N0: 66); и

НСЭКЗ. содержащего последовательность аминокислот ΤΝ^ΕΌΥ (δΕΟ ΙΌ N0: 67); е) ЬСОК1, содержащего последовательность аминокислот δνδδδνδδΙΥΌΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 53); ЬСОК2, содержащего последовательность аминокислот δΤδ^Αδ (δΕΟ ΙΌ N0: 54);

ЬСОКЗ, содержащего последовательность аминокислот ΟΥΥδΟΥΡΕΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 56);

НСОК1, содержащего последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤΌΥΥΜΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 65);

НСОК2, содержащего последовательность аминокислот ΚVNΡNΚΚΟΤΤΥN^ΚΡΕΟ (δΕΟ ΙΌ N0:

68); и

НСОКЗ, содержащего последовательность аминокислот Α^ΥΕ-ΌΥ (δΕΟ ΙΌ N0: 69); и ί) ЬСОК1, содержащего последовательность аминокислот δνδδδνΚδΙΥΌΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 57); ЬСОК2, содержащего последовательность аминокислот δΤδ^Αδ (δΕΟ ΙΌ N0: 54);

ЬСОКЗ, содержащего последовательность аминокислот ρνΥΚΟΥΡΕΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 58);

Ηί'ΌΚΙ. содержащего последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤΌΥΥΜΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 65);

Ηί'ΌΚ2. содержащего последовательность аминокислот ΚVNΡΥΚΟδΤΤΥN^ΚΡΕΟ (δΕΟ ΙΌ N0:

70); и

Ηί'ΌΚ3. содержащего последовательность аминокислот ΑΜΕΌΥ (δΕΟ ΙΌ N0: 71); и причем указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела связывает эпитоп в составе α-цепи указанного с-Ме( человека и индуцирует интернализацию с-Ме( человека с поверхности клетки.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое содержит три гипервариабельных участка легкой цепи (ЬСОК) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (Ηί','ΌΚ). где указанные три ЬСОК и указанные три Ηί'ΌΚ выбраны из группы, состоящей из

a) ЬСОК1, содержащего последовательность аминокислот δVδδδIδδΤN^Η (δΕΟ ΙΌ N0: 49);

ЬСОК2, содержащего последовательность аминокислот ΟΤδΥΌΑδ (δΕΟ ΙΌ N0: 50);

ЬСОКЗ, содержащего последовательность аминокислот ΟΟνδδΥΡΥδ (δΕΟ ΙΌ N0: 51);

Ηί’ΌΚ1. содержащего последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤδΚΥΙΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 59);

ΗΟΌ^, содержащего последовательность аминокислот VΓΥΡVΤΟ^ΤΥΥNΕΚΡΚΟ (δΕΟ ΙΌ N0:

60); и

ИСОКЗ, содержащего последовательность аминокислот ΟΥΟΑΡΥΥ (δΕΟ ГО N0: 61);

b) ЬСОК1, содержащего последовательность аминокислот δVδδδIδδΤN^Η (δΕΟ ГО N0: 49);

ЬСОКЗ, содержащего последовательность аминокислот ΟΟνδδΥΡΥδ (δΕΟ ГО N0: 51);

ΗΟΌΚΕ содержащего последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤδΚΥΙΗ (δΕΟ ГО N0: 59);

ΗΟΌ^, содержащего последовательность аминокислот νΓΥΡνΤΟΌΤΥΥΙΕΚΡΚΟ (δΕΟ ГО N0: 62);

и

ИСОКЗ, содержащего последовательность аминокислот ΟΥΟΑΡΡΥ (δΕΟ ГО N0: 6З);

c) ЬСОК1, содержащего последовательность аминокислот δVδδδIδδΤN^Η (δΕΟ ГО N0: 49);

ЬСОК2, содержащего последовательность аминокислот ΟΤδΚ^Κδ (δΕΟ ГО N0: 52);

ИСОКЕ содержащего последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤδΚΥIΗ (δΕΟ ГО N0: 59);

ΗΟΌ^, содержащего последовательность аминокислот VΓΥΡVΤΟ^ΤΥΥΚΕΡΡΚΟ (δΕΟ ГО N0:

64); и содержащего последовательность аминокислот ΟΥΟΑΡΥΥ (δΕΟ ГО N0: 61).

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое содержит три гипервариабельных участка легкой цепи (ЬСОК) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (ЕСОК), причем указанные три ЬСОК и указанные три ЧСОК выбраны из группы, состоящей из

a) ЬСОК1, содержащего последовательность аминокислот δνδδδνδδΙΥΌΗ (δΕΟ ГО N0: 5З);

ЬСОК2, содержащего последовательность аминокислот δΤδ^Αδ (δΕΟ ГО N0: 54);

ЬСОКЗ, содержащего последовательность аминокислот ΙΟΥδΟΥΡΕΤ (δΕΟ ГО N0: 55);

КСОКЕ содержащего последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤΟΥΥΜΗ (δΕΟ ГО N0: 65);

ΗΟΌ^, содержащего последовательность аминокислот ΚVNΡNΚΟΟΤΤΥN^ΚΡΕΟ (δΕΟ ГО N0:

66); и

ЕСОКЗ, содержащего последовательность аминокислот Τ^ΥΕ-ΌΥ (δΕΟ ГО N0: 67);

b) ЬСОК1, содержащего последовательность аминокислот δνδδδνδδΙΥΌΗ (δΕΟ ГО N0: 5З);

ЬСОКЗ, содержащего последовательность аминокислот ΟΥΥδΟΥΡΕΤ (δΕΟ ГО N0: 56);

- 5 020398

НСОР2. содержащего последовательность аминокислот ΚΥΝΡΝΚΚΟΤΤΥΝΟΚΡΕΟ (δΕΟ ΙΌ N0: 68); и

НСОРЗ. содержащего последовательность аминокислот ΛΝ\νΕΟΥ (δΕΟ ΙΌ N0: 69); и

с) ЬСИК1, содержащего последовательность аминокислот δνδδδνΚδΙΥΣΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 57); ЬСИК2, содержащего последовательность аминокислот δΤδΝΣΆδ (δΕΟ ΙΌ N0: 54);

ЬСОРЗ, содержащего последовательность аминокислот ρνΥΡΟΥΡΕΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 58);

НСГОРЕ содержащего последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤΌΥΥΜΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 65);

НСОР2, содержащего последовательность аминокислот РVNΡΥРСδΤΤΥN^ΚΕΕС (δΕΟ ΙΌ N0:

70); и

НСОРЗ, содержащего последовательность аминокислот ΑΜΕΌΥ (δΕΟ ΙΌ N0: 71).

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое включает три гипервариабельных участка легкой цепи (ЬСОР) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (НСОР), где

ЬСОР1 содержит последовательность аминокислот δνδδδνδδΙΥΕ-Н (δΕΟ ΙΌ N0: 53);

ЬСОР2 содержит последовательность аминокислот δΤδΜΕΑδ (δΕΟ ΙΌ N0: 54);

ЬСОРЗ содержит последовательность аминокислот ΙΟΥδΟΥΡΕΤ (δΕΟ ΙΌ N0: 55);

НСОР1 содержит последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤ^ΥΥΜΗ (δΕΟ ΙΌ N0: 65);

НСОР2 содержит последовательность аминокислот РVNΡNРССΤΤΥN^ΚΕΕС (δΕΟ ΙΌ N0: 66) и

НСОРЗ содержит последовательность аминокислот Τ^νΕ-ΌΥ (δΕΟ ΙΌ N0: 67).

ЬСОР1 содержит последовательность аминокислот δνδδδνδδΙΥΕ-Н (δΕΟ ГО N0: 53);

ЬСОР2 содержит последовательность аминокислот δΤδΜΕΑδ (δΕΟ ГО N0: 54);

ЬСОРЗ содержит последовательность аминокислот ρνΥδΟΥΡΕΤ (δΕΟ ГО N0: 56);

НСОР1 содержит последовательность аминокислот ΟΥΤΡΤ^ΥΥΜΗ (δΕΟ ГО N0: 65);

НСОР2 содержит последовательность аминокислот РVNΡNРРСΤΤΥN^ΚΕΕС (δΕΟ ГО N0: 68) и

НСОРЗ содержит последовательность аминокислот Α^νΕ-ΌΥ (δΕΟ ГО N0: 69).

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи (ЬСУР) и вариабельную область тяжелой цепи (НСУР), где указанная ЬСУР и указанная НСУР, соответственно, содержат последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из

a) δΙΤ) ГО N0:94 и δΙΤ) ГО N0: 96 и

b) δΙΤ) ГО N0:95 и δΙΤ) ГО N0: 97, причем указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела связывает эпитоп в составе α-цепи указанного с-Мс1 человека и индуцирует интернализацию с-Мс1 человека с поверхности клетки.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи (ЬСУР) и вариабельную область тяжелой цепи (НСУР), где указанная ЬСУР содержит последовательность δΕΟ ГО N0: 94, а указанная НСУР содержит последовательность δΕΟ ГО N0: 96.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи (ЬСУР) и вариабельную область тяжелой цепи (НСУР), где указанная ЬСУР содержит последовательность δΕΟ ГО N0: 95, а указанная НСУР содержит последовательность δΕΟ ГО N0: 97.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанная ЬСУР и указанная НСУР содержат последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из

a) ЬСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 1, а НСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 1З;

b) ЬСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 2, а НСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 14;

c) ЬСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: З, а НСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 15; й) ЬСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 4, а НСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 16; ί) ЬСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 5, а НС'ХР представляет собой δΕΟ ГО N0: 17; и ί) ЬСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 6, а НСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 18.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанная ЬСУР и указанная НСУР, соответственно, содержат последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из:

b) ЬСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 2, а НСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 14; и

c) ЬСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: З, а НСУР представляет собой δΕΟ ГО N0: 15.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанная ЬСУР и указанная НСУР, соответственно, содержат последовательности

- 6 020398 аминокислот, выбранные из группы, состоящей из:

a) ЬСУК представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 4, а НСУК представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 16;

b) ЬСУК представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 5, а НСУК представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 17; и

c) ЬСУК представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 6, а НСУК представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 18.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанная ЬСУК содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 4, а указанная НСУК содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 16.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, где указанная ЬСУК содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 5, а указанная НСУК содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 17.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанное антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь и указанная тяжелая цепь содержат последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из

a) легкая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 25, а тяжелая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 37;

b) легкая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 26, а тяжелая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 38;

c) легкая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 27, а тяжелая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 39; ά) легкая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 28, а тяжелая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 40; ί) легкая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 29, а тяжелая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0:

41; и

1) легкая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 30, а тяжелая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 42.

b) легкая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 26, а тяжелая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0:

38; и

c) легкая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 27, а тяжелая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 39.

a) легкая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 28, а тяжелая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 40;

b) легкая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 29, а тяжелая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 41; и

c) легкая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 30, а тяжелая цепь представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 42.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 40.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 41.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанное антитело содержит две легких цепи и две тяжелых цепи, причем каждая легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 28, а каждая тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 40.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител, где указанное антитело содержит две легких цепи и две тяжелых цепи, причем каждая легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 29, а каждая тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 41.

Моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое конкурирует с любым из вышеуказанных моноклональных антител к с-Ме! или антиген-связывающим фрагментом указанного антитела за связывание с с-Ме!. Такое конкурирующее моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела может связываться с тем же эпитопом с-Ме!, что и любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела. В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела конкурирует с антителом, которое содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела конкурирует с антителом, которое содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 41.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества с-Ме! человека и количества фосфорилированного с-Ме! человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые

- 7 020398 конститутивно сверхэкспрессируют указанный с-Ме! человека. В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества с-Ме! человека и количества фосфорилированного с-Ме! человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые конститутивно сверхэкспрессируют указанный с-Ме! человека, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕО ГО N0: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества с-Ме! человека и количества фосфорилированного с-Ме! человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые конститутивно сверхэкспрессируют указанный с-Ме! человека, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 41.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества с-Ме! человека и количества фосфорилированного с-Ме! человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые конститутивно фосфорилируют указанный с-Ме! человека. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества с-Ме! человека и количества фосфорилированного с-Ме! человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые конститутивно фосфорилируют указанный с-Ме! человека, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества с-Ме! человека и количества фосфорилированного с-Ме! человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые конститутивно фосфорилируют указанный с-Ме! человека, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 41.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое индуцирует снижение общего количества с-Ме! человека и количества фосфорилированного с-Ме! человека в опухолевых клетках, независимых от фактора роста гепатоцитов, которые чувствительны к фактору роста гепатоцитов.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое предпочтительно связывает внеклеточный домен с-Ме! человека по сравнению с внеклеточным доменом ΚΌN человека или внеклеточным доменом Р1ехшА2 человека.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не индуцирует отщепление внеклеточного домена с-Ме! человека. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не индуцирует отщепление внеклеточного домена с-Ме! человека, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не индуцирует отщепление внеклеточного домена с-Ме! человека, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 41.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не защищает опухолевые клетки, экспрессирующие с-Ме! человека, от апоптоза, индуцированного стауроспорином. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не защищает опухолевые клетки, экспрессирующие с-Ме! человека, от индуцированного стауроспорином апоптоза, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела, которое не защищает опухолевые клетки, экспрессирующие с-Ме! человека, от апоптоза, индуцированного стауроспорином, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 41.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое ингибирует зависимую и независимую от фактора роста гепатоцитов пролиферацию опухолевых клеток, экспрессирующих с-Ме! человека.

- 8 020398

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое ингибирует связывание фактора роста гепатоцитов с с-Мс1 человека.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое не индуцирует НСР-подобную биологическую агонистическую активность. НСРподобная биологическая агонистическая активность включает пролиферацию опухолевых клеток, подвижность опухолевых клеток, инвазию опухолевых клеток, тубулогенез, ангиогенез и антиапоптозное действие. В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела, которое не индуцирует НСР-подобную биологическую агонистическую активность, содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 41.

Фармацевтическая композиция, которая содрежит любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения в терапии. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения в терапии содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения в терапии содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 41.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 41.

Любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека в комбинации с еще одним терапевтическим агентом. В предпочтительном варианте осуществления указанное моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека в комбинации с еще одним терапевтическим средством содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 28, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 40. В еще одном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела для применения при лечении рака у человека в комбинации с еще одним терапевтическим средством содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная легкая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 29, а указанная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот 8ЕС ГО N0: 41.

Фармацевтическая композиция, которая содержит любое из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

Применение любого из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающего фрагмента указанного антитела для изготовления медикамента для лечения рака у человека.

Способ лечения рака, включающий введение пациенту-человеку, нуждающемуся в нем, эффективного количества любого из вышеуказанных моноклональных антител или антиген-связывающего фрагмента указанного антитела.

Определения.

Полноразмерное антитело в том виде, как оно существует в природе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, включающую 2 тяжелые (Н) и 2 легкие (Ь) цепи, связанные друг с другом дисульфидными связями. ^концевая часть каждой цепи содержит вариабельную область размером приблизительно 100-110 или более аминокислот, главным образом ответственных за распознавание антигена с помощью гипервариабельных участков (СОК), содержащихся в них. С-концевая часть каждой цепи ограничивает константную область, главным образом ответственную за эффекторную функцию.

СОК перемежаются с областями, которые являются более консервативными и называются каркасными областями (РК). Каждая вариабельная область легкой цепи (ЬСУК) и вариабельная область тяжелой цепи (НСУК) состоит из 3 СОК и 4 РК, расположенных от Оконца к С-концу в следующем порядке:

- 9 020398

РК1, ΟΌΚ1, РК2, ΟΌΚ2, РК3, ΟΌΚ3, РК4. 3 СОК легкой цепи обозначаются как ЬСОК1, 1.С1Ж2 и ЬСПК3, а 3 СОК тяжелой цепи обозначаются как НСЭР1. НСЭР2 и НСЭР3. СОК содержат большинство остатков, участвующих в специфическом взаимодействии с антигеном. Нумерация и определение положения аминокислотных остатков в СОК в пределах областей ЬСУК и НСУК соответствуют общеизвестной конвенции нумерации Кабата.

Легкие цепи подразделяются на к- или λ- и характеризуются определенной константной областью, как известно специалистам. Тяжелые цепи подразделяются на γ-, μ-, α-, δ- или ε- и определяют изотопическую детерминанту антитела 1§С, 1дМ, 1дА, Ι§Ό или 1дЕ соответственно. Антитела 1§С, кроме того, делятся на подклассы, например 1§С1, 1§С2, 1дС3, 1дС4. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется определенной константной областью с последовательностью, общеизвестной специалистам.

В настоящем документе термин моноклональное антитело (МаЬ) применяется по отношению к препаратам антител по настоящему изобретению, относящимся к антителам, происходящим из единственной копии или клона, включая, например, клон эукариотической клетки, прокариотической клетки или фага, а не к способу, с помощью которого оно получено. МаЬ по настоящему изобретению предпочтительно существуют в гомогенной или практически гомогенной популяции. Полные МаЬ содержат 2 тяжелые цепи и 2 легкие цепи. Антиген-связывающие фрагменты подобных моноклональных антител включают, например, фрагменты РаЬ, фрагменты РаЬ', фрагменты Р(аЬ')₂, одноцепочечные фрагменты Ρν и одноплечие антитела, включающие легкую цепь и тяжелую цепь. Моноклональные антитела и их антиген-связывающие фрагменты по настоящему изобретению можно получить, например, с помощью рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий, например СЭКтрансплантации, или комбинации этих технологий, или иных технологий, известных специалистам.

Препарат антител относится к МаЬ и РаЬ, описанным в настоящем документе. Дополнительные препараты антител, демонстрирующие сходные функциональные свойства по настоящему изобретению, можно получить с помощью общепринятых способов. Например, мышей можно иммунизировать с-Мс1 человека или его фрагментами, полученные антитела можно выделить и очистить, и с помощью способов, описанных в примерах 2-19 ниже, можно определить, обладают ли они связывающими и функциональными свойствами, сходными или совпадающими со свойствами препаратов антител, описанных в настоящем документе. Антиген-связывающие фрагменты также можно получить с помощью общепринятых способов. Способы получения и очистки антител и антиген-связывающих фрагментов общеизвестны специалистам в данной области техники и могут быть найдены, например, в Наг1оте апД Ьапе (1988) АпйЬоШсъ А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1Д 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге88, Со1Д 8ргшд НагЬог, Ыете Уогк, сйар1ег8 5-8 апД 15, ΙδΒΝ 0-87969-314-2.

Фраза сконструированные антитела относится к моноклональным антителам и антигенсвязывающим фрагментам, кроме препаратов антител, описанных в настоящем документе, которые обладают связывающими и функциональными свойствами в соответствии с изобретением, сходными со свойствами, описанными в настоящем документе, и имеют каркасные области, в значительной степени или полностью соответствующие человеческим, окружающие СОК, происходящие из нечеловеческого антитела. Каркасная область или каркасная последовательность относится к любой из каркасных областей 1-4. Сконструированные антитела и антиген-связывающие фрагменты, охватываемые настоящим изобретением, включают молекулы, в которых любая или любые из каркасных областей 1-4 являются в значительной степени или полностью человеческими, т.е. в которых присутствует любая из возможных комбинаций индивидуальных в значительной степени или полностью человеческих каркасных областей 1-4. Например, это понятие включает молекулы, в которых каркасная область 1 и каркасная область 2, каркасная область 1 и каркасная область 3, каркасная область 1, 2 и 3 и т.д. являются в значительной степени или полностью человеческими. В значительной степени человеческие каркасные области представляют собой каркасные области, по меньшей мере приблизительно 80% последовательности которых идентично последовательности известной каркасной области антител эмбрионального типа человека. Предпочтительно в значительной степени человеческие каркасные области характеризуются последовательностью по меньшей мере на приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или приблизительно 99% идентичной последовательности известной каркасной области антител эмбрионального типа человека.

Полностью человеческие каркасные области представляют собой каркасные области, идентичные последовательности известной каркасной области антител эмбрионального типа человека. Последовательности каркасной области антител эмбрионального типа человека можно получить от 1тМипоСепеТЮ5 (1МСТ) через веб-сайт НЦр://|тд1.с1пе5.Гг или из Тйе 1ттипод1оЬи1ш Рас!§Воок под авторством МапеРаи1е ЬеГгапс и СегатД ЬеГгапс, АсаДетк Рге88, 2001, ΙδΒΝ 012441351. Например, каркасные области легкой цепи антител эмбрионального типа могут быть выбраны из группы, состоящей из А11, А17, А18, А19, А20, А27, А30, Ы, Ь11, Ь12, Ь2, Ь5, Ь15, Ь6, Ь8, 012, 02 и 08, а каркасные области тяжелой цепи антител эмбрионального типа могут быть выбраны из группы, состоящей из: УН2-5, УН2-26, УН2-70, УН3-20, УН3-72, УН1-46, УН3-9, УН3-66, УН3-74, УН4-31, УН1-18, УН1-69, νΐ-13-7, УН3-11, УН3-15, УН3-21, νΉ3-23, ^3-30, VI 1.3-48, VI 14-3‘λ VI14-59 и ^5-51.

- 10 020398

Сконструированные антитела, в дополнение к описанным в настоящем документе, демонстрирующие сходные функциональные свойства в соответствии с настоящим изобретением, можно получить несколькими различными способами. При одном подходе СОК исходного препарата антител трансплантируют в человеческую каркасную область, последовательность которой характеризуется высокой степенью идентичности с каркасной областью исходного препарата антител. Идентичность последовательности новой каркасной области в общем случае будет составлять по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 99% совпадения с последовательностью соответствующей каркасной области в исходном препарате антител. В случае, если каркасные области содержат менее 100 аминокислотных остатков, можно заменить один, два или три аминокислотных остатка. Эта трансплантация может приводить к снижению сродства связывания по сравнению с исходным антителом. В этом случае каркасную область можно мутировать к первоначальному виду исходной каркасной области в некоторых положениях на основании специфических критериев, описанных в Оиееп е! а1. (1991) Ргос. Ναΐΐ. Лсаб. δα. υδΑ 88:2869. Дополнительные ссылки, описывающие способы, используемые для гуманизации мышиных антител, включают патенты США № 4816397, 5225539 и 5693761; компьютерные программы ΑΒΜΘΌ и ΕΝΟΑΌ, согласно описанию в Ьеуй! (1983) 1. Мо1. Βίο1. 168:595-620; и способ согласно ХУиНег и соавторам (1оие8 е! а1. (1986) №-11иге 321:522-525; Шесйшаии е! а1. (1988) №-11иге 332:323-327 и Уетйоеуеи е! а1. (1988) 8с1еисе 239:1534-1536).

Идентификацию остатков для мутации к первоначальному виду можно выполнить следующим образом.

Если аминокислота попадает в следующую категорию, то аминокислоту каркасной области используемой последовательности антител эмбрионального типа человека (акцепторной каркасной области) заменяют аминокислотой каркасной области исходного препарата антител (донорной каркасной области).

(a) Аминокислота акцепторной каркасной области человека является нетипичной для каркасных областей человека в этом положении, в то время как соответствующая аминокислота донорного иммуноглобулина типична для каркасных областей человека в этом положении;

(b) положение аминокислоты непосредственно примыкает к одному из СИК; либо (c) любой атом боковой цепи аминокислоты каркасной области находится в пределах 5-6 А (центрцентр) от любого атома аминокислоты СИК в трехмерной модели иммуноглобулина.

Если и аминокислота акцепторной каркасной области человека, и соответствующая аминокислота в донорной области являются в общем случае нетипичными для каркасных областей человека в этом положении, такую аминокислоту можно заменить аминокислотой, типичной для каркасных областей человека в этом положении. Критерии для мутации к первоначальному виду позволяют восстановить активность исходного препарата антител.

Еще один подход к получению сконструированных антител, демонстрирующих функциональные свойства, сходные с препаратами антител, описанных в настоящем документе, включает случайные мутации аминокислот в пределах трансплантированных СИК без изменения каркасной области и скрининг полученных молекул на сродство связывания и другие функциональные свойства, совпадающие или превосходящие свойства исходного препарата антител. В положении каждой аминокислоты в пределах каждого СИК можно ввести одиночные мутации с последующей оценкой действия таких мутаций на сродство связывания и другие функциональные свойства. Одиночные мутации, приводящие к улучшению свойств, можно комбинировать для оценки их действия в комбинации друг с другом.

Кроме того, возможна комбинация обоих вышеописанных подходов. После трансплантации СОК можно мутировать специфические каркасные области к первоначальному виду в дополнение к внесению аминокислотных замен в СЭК. Эта методология описана в \Уи е! а1. (1999) 1. Мо1. Вю1. 294:151-162.

Применяя идеи настоящего изобретения, специалист в данной области техники может использовать общепринятые методики, например сайт-направленный мутагенез, для замены аминокислот в пределах СОК и каркасных последовательностей, описанных в настоящем документе, и таким образом получать дополнительные аминокислотные последовательности вариабельных областей, являющиеся производными настоящих последовательностей. Все природные аминокислоты можно вводить в конкретный сайт замены. Способы, описанные в настоящем изобретении, можно использовать для скрининга этих дополнительных аминокислотных последовательностей вариабельной области для идентификации последовательностей, обладающих перечисленными функциями ίη νί\Ό. Таким образом, можно идентифицировать дополнительные последовательности, пригодные для изготовления сконструированных антител и их антиген-связывающих частей в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно аминокислотные замены в пределах каркасных областей ограничивают одним, двумя или тремя положениями в пределах одной или более из 4 каркасных областей легких цепей и/или тяжелых цепей, описанных в настоящем изобретении.

Предпочтительно аминокислотные замены в пределах СОК ограничивают одним, двумя или тремя положениями в пределах одной или более из 3 СОК легких цепей и/или тяжелых цепей. Также возможны комбинации различных изменений в пределах этих каркасных областей и СОК, описанных выше.

- 11 020398

То, что функциональные свойства препаратов антител, полученных путем аминокислотных замен, обсуждавшихся выше, соответствуют свойствам, демонстрируемым конкретными молекулами, описанными в настоящем документе, можно подтвердить с помощью способов, описанных ниже в примерах 219.

Термин эпитоп относится к специфическому расположению аминокислот, находящихся на пептиде или белке, с которым связывается антитело или фрагмент антитела. Эпитопы часто состоят из химически активных поверхностных групп молекул, например аминокислот или боковых цепей углеводов, и имеют специфические характеристики трехмерной структуры, а также специфические зарядовые характеристики. Эпитопы могут быть линейными, т.е. предусматривающими связывание с одиночной аминокислотной последовательностью, или конформационными, т.е. предусматривающими связывание с двумя или более аминокислотными последовательностями в различных областях антигена, которые не обязательно могут быть смежными. Эпитопы, описанные в настоящем документе, могут состоять из, главным образом состоять из или включать в себя последовательности аминокислот, описанные в примере 3.

Моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые конкурируют с молекулами, описанными в настоящем документе, представляют собой моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые связывают с-Ме! человека на сайте(ах), который(е) совпадает(ют) или перекрывается(ются) с сайтом(ами), с которым(и) связываются настоящие молекулы. Конкурирующие моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты можно идентифицировать, например, с помощью конкурентного иммуноанализа. Например, можно иммобилизовать образец очищенного или частично очищенного с-Ме! человека на твердой подложке. Затем добавляют препарат антител или антиген-связывающих фрагментов антител по настоящему изобретению и моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое предположительно способно конкурировать с препаратом антител согласно настоящему изобретению. Одну из двух молекул метят. Если меченое и немеченое соединение связываются с различными и отделенными друг от друга сайтами на с-Ме!, меченое соединение будет связываться на одном и том же уровне вне зависимости от наличия предположительно конкурирующего соединения. Однако если сайты взаимодействия совпадают или перекрываются, немеченое соединение будет вступать в конкуренцию, и количество меченого соединения, связанного с антигеном, будет снижаться. Если немеченое соединение присутствует в избытке, меченое соединение будет связываться в очень малом количестве или не будет связываться вообще. Для целей настоящего изобретения конкурирующие моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты представляют собой моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые снижают связывание настоящих препаратов антител к с-Ме! на примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 99%. Подробности процедур проведения подобных конкурентных анализов общеизвестны специалистам в данной области техники и могут быть найдены, например, в Нат1оте апб Ьаие (1988) АпДЬоФек, А ЬаЬота!огу Мапиа1, Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота!оту Ргекк, Со1б 8ртшд НагЬог, №\ν Уотк, радек 567-569, ΙδΒΝ 0-87969-314-2. Такие анализы можно выполнять количественно при применении очищенных антител. Стандартную кривую строят путем титрования одного из антител против самого себя, т.е. одно и то же антитело используют и в качестве меченого, и в качестве конкурирующего. Титруют способность немеченого конкурирующего моноклонального антитела или антиген-связывающего фрагмента указанного антитела ингибировать связывание меченой молекулы на планшете. Результаты выводят на график и сравнивают концентрации, необходимые для достижения требуемой степени ингибирования связывания. С помощью способов, описанных в примерах 2-19 в настоящем документе, можно определить, обладает ли моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое конкурирует с препаратом антител по настоящему изобретению, при таком конкурентном анализе функциональными характеристиками, совпадающими или сходными с характеристиками настоящих препаратов антител.

Моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые связываются практически с тем(и) же эпитопом(ами) с-Ме!, что и моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, представляют собой моноклональные антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые связывают с-Ме! человека на сайте(ах), который(е) перекрывается(ются) с сайтом(ами), с которым(и) связываются настоящие молекулы. Способы, которые облегчают идентификацию моноклональных антител или их антиген-связывающих фрагментов, связывающихся практически с тем же эпитопом с-Ме!, что и моноклональные антитела к с-Ме! или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, широко известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в международной публикации РСТ \УО 00/64946. С помощью способов, описанных в примерах 2-19 в настоящем документе, можно определить, обладает ли моноклональное антитело или антиген-связывающий фрагмент указанного антитела, которое связывается практически с тем(и) же эпитопом(ами) с-Ме!, что и препараты, описанные в настоящем изобретении, функциональными характеристиками, совпадающими или сходными с характеристиками настоящих препаратов антител.

с-Ме! или с-Ме! человека относится к любому с-Ме! человека, а также его функционально активным мутантным формам. Структура с-Ме! может быть схематически изображена следующим образом:

- 12 020398

Енектейммяый лм#ен ( ЕГО) £*д/йфикдеточный долге» ι ^{А 1} > / ^А “>

5ЕМА — Р£>1 — 4 ΙΡΤ — ТМ — ЛМ — ΚΙ) — внутриклеточный хвост §ЕМА: домен §ета,

ΡδΙ: домен плексина, семафоринов и интегринов,

ΙΡΤ: 4 домена иммуноглобулинов, плексинов и фактора транскрипции,

ТМ: трансмембранный участок,

ДМ: субмембранный участок,

ΚΌ: киназный домен.

В ЕСГО с-Ме! человека (ЗЕО ГО N0: 75) аминокислоты 1-24 включают сигнальную последовательность. Зрелый белок начинается с аминокислоты 25 (Е). Домен §ета состоит примерно из 500 аминокислотных остатков на Ν-конце с-Ме! и содержит α-цепь (аминокислотные остатки 25-307) и часть β-цепи (аминокислотные остатки 308-519).

Термин ингибировать означает способность в значительной степени оказывать антагонистическое действие, препятствовать, предотвращать, сдерживать, замедлять, разобщать, устранять, останавливать, снижать или обращать вспять биологическое действие с-Ме!.

Термин лечение (или лечить, или воздействие) означает замедление, прерывание, купирование, контроль, остановку, снижение или обращение вспять развития или тяжести симптома, расстройства, состояния или заболевания, но не обязательно включает полное устранение всех симптомов, состояний или расстройств, относящихся к заболеванию.

Можно лечить острые случаи и хронические состояния. При остром случае антитело или антигенсвязывающий фрагмент вводят при появлении симптома, расстройства, состояния или заболевания и прерывают при окончании острого случая. В противоположность этому хронический симптом, расстройство, состояние или заболевание лечат в течение более длительного промежутка времени.

Термин эффективное количество относится к количеству или дозе препарата антител по настоящему изобретению, которое при однократном или многократном введении пациенту обеспечивает требуемое лечение или профилактику. Терапевтически эффективное количество настоящих препаратов антител может составлять количество в диапазоне от примерно 0,1 до примерно 20 мг/кг на однократную дозу. Терапевтически эффективное количество для любого отдельного пациента можно определить в медицинском учреждении путем мониторинга действия препаратов антител на биомаркер, например поверхностный с-Ме! в опухолевых и неопухолевых тканях, регрессию опухоли и т.д. Анализ данных, полученных с помощью этих способов, позволяет модифицировать режим лечения во время терапии так, что вводят оптимальные количества препаратов антител самих по себе или в комбинации с еще одним терапевтическим агентом, а также так, что можно определить длительность лечения. Таким образом, схему дозирования/лечения можно модифицировать в течение курса терапии так, что вводят минимальные количества препаратов антител самих по себе или в комбинации, которые показывают удовлетворительную эффективность уменьшения опухоли, и так, что введение подобных препаратов продолжают только до тех пор, пока это необходимо для успешного лечения пациента.

Препараты антител по настоящему изобретению можно применять в качестве медикаментов для лечения человека, вводимых различными путями. Такие композиции наиболее предпочтительны для парентерального введения. Подобные фармацевтические композиции могут быть получены способами, широко известными в данной области техники. См., например, Репипфоп: Тйе Зшеисе апД Ргасйсе οί РЬагтасу, 19* еД. (1995), А. Сеииаго е! а1., Маск РиЪЬкЫид Со., и включают один или более из препаратов антител, описанных в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

Термин опухоль относится к росту и пролиферации всех неопластических клеток, как злокачественных, так и доброкачественных, и всех предраковых и раковых клеток и тканей. Термины рак, злокачественный и опухоль взаимно не исключают друг друга.

Термины рак и злокачественный относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, обычно характеризующееся нарушенным ростом/пролиферацией клеток. Примеры рака включают карциномы, лимфомы, бластомы, саркомы и лейкозы, но не ограничиваются ими.

с-Ме! и рак.

Сигнальные пути с-Ме! с нарушенной регуляцией могут быть индуцированы за счет транскрипционной активации, амплификации гена с-Ме!, специфических генетических изменений или лигандзависимых аутокринных или паракринных механизмов. Наиболее частый случай конститутивной активации с-Ме! в опухолях человека представляет собой повышенную экспрессию белка вследствие транскрипционной активации в отсутствие амплификации гена. Кроме того, амплификация гена МЕТ с последующей сверхэкспрессией белка и конститутивной активацией киназы описана для ряда первичных опухолей человека, включая карциномы желудочно-кишечного тракта и пищевода, немелкоклеточную карциному легкого (Νδί',Έ) и медуллобластомы. Опухоли мезенхимального происхождения, например остеосаркомы и рабдомиосаркомы, часто используют аутокринные механизмы для производства НОР. Повышенный уровень НОР и сверхэкспрессия с-Ме! часто ассоциируются с плохим исходом болезни, что

- 13 020398 включает более агрессивный ход болезни, повышенное метастазирование опухоли и сокращенную продолжительность жизни пациента. Кроме того, высокие уровни белков НОР и/или с-Ме! в опухолях придают устойчивость к химиотерапии и лучевой терапии. В дополнение к аномальной экспрессии НОР и сМе!, каскад с-Ме! может быть активирован за счет генетических изменений, например мутаций с-Ме!, амплификации гена и реаранжировки генов. Миссенс-мутации с-МЕТ найдены у всех лиц с выраженным наследственным папиллярным почечноклеточным раком (РКСС) и в небольшой подгруппе (13%) спорадических образцов РКСС. Некоторые из этих мутаций несут онкогенный потенциал ввиду повышенной киназной активности. Трисомия по 7 хромосоме, на которой расположены и НОР, и с-МЕТ гены, часто имеет место при РКСС и приводит к неслучайной дупликации мутантного аллеля с-МЕТ. Кроме того, соматические мутации с-МЕТ идентифицированы в других злокачественных опухолях человека, включая рак желудочно-кишечного тракта, головы и шеи, печени, яичника, немелкоклеточный рак легкого и рак щитовидной железы, а также в метастазах некоторых из этих злокачественных опухолей. В противоположность РКСС, при котором мутации обычно ограничиваются киназным доменом, эти мутации часто локализуются в других участках рецептора, например в субмембранном домене. Кроме мутаций, ген сМЕТ часто амплифицируется при раке молочной железы, печени, мозга, ободочной и прямой кишки, желудочно-кишечного тракта, легкого и желудка, что коррелирует с развитием заболевания у некоторых пациентов.

Показания к применению.

Нарушения сигнального каскада НОР/с-Ме! описаны для широкого спектра злокачественных новообразований, включая рак мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, ободочной и прямой кишки, эндометрия, пищевода, желудочно-кишечного тракта, головы и шеи, почек, печени, легкого, носоглотки, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы и щитовидной железы, а также холангиокарциномы, остеосаркомы, рабдомиосаркомы, синовиальной саркомы, саркомы Капоши, лейомиосаркомы и злокачественной фиброзной гистиоцитомы/фибросаркомы. Кроме того, аномальная экспрессия НОР и/или с-Ме! описана для гематологических злокачественных новообразований, например острого миелобластного лейкоза, Т-клеточного лейкоза взрослых, хронического миелолейкоза, лимфом и множественной миеломы, а также других опухолей, например меланомы, мезотелиомы, опухоли Вильмса, глиобластомы и астроцитом (обобщено в Пи е! а1. (2008) Ехрей Ορίη. Пкейщ. Огидк 17(7):997-1011). Антитела к с-Ме! по настоящему изобретению могут ингибировать и НОР-зависимые, и НОРнезависимые опухоли.

Следующие неограничивающие примеры иллюстрируют различные аспекты настоящего изобретения.

В примерах, приведенных ниже, контрольные антитела гуманизированные 1дО2 и 1дО4 и мышиные 1дО (также иногда называемые т1дО1) - представляют собой изотипические контрольные антитела, неродственные настоящим антителам к с-Ме!. Антитела С8, Ό11 и ορίΟ11 представляют собой мышиные антитела. Во всех случаях НОР человека получали из Κ&Ό Еуйепъ (#294).

Пример 1. Антитела к с-Ме!.

Аминокислотные последовательности вариабельных областей легких цепей и тяжелых цепей, полных легких и тяжелых цепей и соответствующие кодирующие нуклеотидные последовательности для настоящих сконструированных антител перечислены ниже в разделе, озаглавленном Аминокислотные и нуклеотидные последовательности. Аминокислотные последовательности СОК легких и тяжелых цепей показаны в табл. 1 и 2 соответственно.

- 14 020398

Таблица 1

СЭР легких цепей

Антитело	СОК 1	СОК 2	сок 3
Ο11-517Υ	ΞνΞΞΞΙΞΞΤΝΙιΗ {ΞΕΩ Ю N0:49)	ΟΤΞΥΕΑΞ {ΞΕΩ 10 N0:50)	ΩΩΝΞΞΥΡΥΞ (ΞΕΩ 10 N0:51)
Ц11-ВВ8	37533Ι58ΤΝΕΗ (3Εβ 10 N0:49)	ΰΤ3ΥΙΑ5 (ЗЕС Ю N0:50)	ΩΏΝΞΞΥΡΥΞ (ΞΕΩ ΙΟ N0:51)
С11-С2763	ΞνΞΞΞΙΞΞΤΝίΗ {ΞΕΩ 10 N0:49)	СТЗКЪРЗ {ΞΕΩ 10 N0:52)	ΩΩΗ55ΥΡΥ5 (ΞΕΩ Ю N0:51)
Консенсусная последовательность 011		ΟΤΞΧχΣΧίΞ {ΞΕΩ 10 N0:87)
са-6	ΞνΞΞΞνΞΒΙΥΕΗ {ΞΕΩ 10 N0:53)	ΞΤΞΝΣΑΞ {ΞΕΩ 10 N0:54)	ΙΩΥΞΟΥΡΙ/Γ (ΞΕΩ Ю N0:55)
С8-Н241	ΞνΞΞΞνΞΞΙΥΟΗ [ΞΕΩ 10 N0:53)	ΞΤΞΝΏΑΞ {ΞΕΩ 10 N0:54)	ΩνΥΞΟΥΡΙ/Γ (ΞΕΩ 10 N0:56)
Св-со-16	ΞνΞΞΞνΗΞΙΪΙυΗ [ΞΕΩ 10 N0:57)	ΞΤΞΝΕΑΞ (ΞΕΩ 10 N0:54)	ΩνΥΚΟΥΡΙ,Τ (ΞΕΩ 10 N0:50)
Консенсусная последовательность С8	5νΞΞΞνΧ₃5ΙΥ0Η (ΞΕΩ Ю N0:38)		Χ₄Χ₅ΥΧ_έΟΥΡΙιΤ (ΞΕΩ Ю N0:89)

Х₁ представляет собой Υ или К, а Х₂ представляет собой А или К;

Х₃ представляет собой 8 или К;

Х₄ представляет собой I или б, Х₅ представляет собой б или V, а Х₆ представляет собой 8 или К.

Таблица 2

СИК тяжелых цепей

Антитело	СОК 1	СОК 2	сок 3
Ο11-517Υ	ΟΥΤΕΤΞΡΥΙΗ (ΞΕΩ Ю N0:59)	ΜΙΥΡνΤΟΟΤΥΥΝΕΚΕΚΟ (ΞΕΩ ΙΟ N0:60)	0Υ5ΑΓΥΥ {ΞΕΩ 10 N0:61}
С11-8В8	αγτρτεκγΐΗ (ЗЕО Ю N0:59)	ΗΙΥΡνΤΟϋΤΥΥΙΕΚΓΚΒ (3Ε0 Ιϋ N0:62)	етедрру (3Ε0 Ιϋ N0:63)
О11-С27СЗ	ΟΥΤΓΤΞΕΥΙΗ (ΞΕΩ 10 N0:59)	ΜΙΥΡνΤΟΟΤΥΥΚΕΡΕΚΟ {ΞΕΩ Ю N0:64)	ΟΥΞΑΓΥΥ {ΞΕΩ ΙΟ N0:61)
Консенсусная последов ательность □11		ΗΙΥΡνΤΟΟΤΥΥΧ?ΕΧ₆ΕΚΟ (ΞΕΩ ΙΟ N0:90)	αΥΟΑΓΧ₉Υ (ΞΕΩ ΙΟ N0:91)
С8-6	ΟΥΤΕΤΏΥΥΜΗ (ΞΕΩ 10 N0:65)	ΡνΝΡΝΡΟΟΤΤΥΝΩΚΕΕΟ (ΞΕΩ ΙΟ N0:66)	ΤΝΝΙ,ΟΥ (ΞΕΩ ΙΟ N0:67)
СВ-Н241	ΟΥΤΕΤΟΥΥΜΗ (ΞΕΩ 10 N0:65)	ΚνΝΡΝΕΚΟΤΤΥΝΩΚΓΕΟ (ΞΕΩ ΙΟ N0:63)	ΑΝΗΣΟΥ {ΞΕΩ ΙΟ N0:69)
С8-со-1б	ΟΥΤΕΤΟΥΥΜΗ (ΞΕΩ 10 N0:65)	ΚνΝΡΥΡΩΞΤΤΥΝΩΚΕΕΟ [ΞΕΩ ΙΟ N0:70)	ΑΝΙΙ,ϋΥ (3Ε0 Ю N0:71)
Консенсусная последовательность С8		ΡνΝ ΡΧ ιοΡΧ _ηΧ ι₂ΤΤΥΝΩΚΓΕ5 (ΞΕΩ ΙΟ N0:92)	Χι₃ΝΧκίΟΥ {3Ε0 Ю N0:93)

Х₇ представляет собой Ν, I или К, а Х₈ представляет собой К или Р;

Х₉ представляет собой Υ или Р;

Х₁₀ представляет собой N или Υ, Х₁₁ представляет собой С или К, а Х₁₂ представляет собой С или 8; Х₁₃ представляет собой Т или А, а Х₁₄ представляет собой или I.

- 15 020398

Консенсусные последовательности для вариабельных областей легких и тяжелых цепей антител Ό11- и С8- представляют собой консенсусная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела Ό11- (8Е0 ГО N0: 94)

Е1У1/Г<28РСТЪЗЬ5РСЕРАТЕ5С5 УЗ 5313 3ΤΝΕΗΜ ΥΟΟΚΡΘΟΑΡΚΕΣΙУ

СТ5Х1ЬХ₂ЗС1Р0КЕ5С5С5СТ0ЕТЬТ13КЬЕРЕ0ЕАУУУС<Х2И55УРУЗГС

0СТКЕЕ1К где Х₁ представляет собой Υ или К, а Х₂ представляет собой А или К.

Консенсусная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела С8- (8Е0 ГО N0: 95) О10МТ£>ЗРЗЗЬЗАЗУСОКУТ1ТСЗУ5Б5УХз51УЬНИУС>СКРСКАРКЬЬ1¥ ЗТЗЫЬА36УРЗКРЗС365С‘Г0Е’ТЬТ1БЗЬ0РЕ0РАТУУСХ₄Х₅УХбСУРЪТРС σστκνΕίκ где Х₃ представляет собой δ или К, Х4 представляет собой I или О, Х₅ представляет собой О или V, а Х₆представляет собой δ или К.

Консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела Ό11- (δΕΟ ГО N0:

96)

ОУОЪУ<23САЗУККРС55УКУЗСКАЗетТГТЗЕУ1НИУНСАРСССЬЕИИСИ

1УРУТС0ТУУХтЕХзЕКСРУТ1ТА0КЗТЗТАУМЕЪЗЗЬЕЗЕ0ТАУУУСАРСУ

ОАГХ.,УМС0СТЬУТУЗ где Х₇ представляет собой N I или К, Х₈ представляет собой К или Р, а Х₉ представляет собой Υ или Р.

Консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела С8- (δΕΟ ГО N0:

97)

СУОЬУОЗбАЕУККРеАЗУКУЗСКАЗСУТРТОУУМНИУКСАРСОСЬЕММСЕ

УНРХ^РХиХщТТУЫЗКГЕСРУТМТТОТЗТЗТАУМЕЬКЗЬКЗООТАУУУСАКХпВХ^ЬОУИО

0СТТУТУ5 где Х₁₀ представляет собой Υ или И, Х₁₁ представляет собой С или К, Х₁₂ представляет собой δ или С, Х₁₃ представляет собой А или Т, а Х₁₄ представляет собой I или

Временную экспрессию антител осуществляли в клетках НЕК293 ΕΒNΑ (ЕДде Βίοδ\'8^ιη8, #90500130) согласно стандартной процедуре трансфекции. Трансфицированные клетки культивировали в стандартной бессывороточной среде, содержащей генетицин (С418) и тобрамицин в течение 48 и 120 ч при 37°С после трансфекции. Антитела очищали на 60-мл колонке гРго!еш А δерЬа^ο8е (АтегкЬат Βίο8с1еисе8, #17-1279-04), следуя инструкциям изготовителя, затем концентрировали и очищали гельхроматографией (ХК50/60 δире^άеx200, РРагтааа) с фосфатно-солевым буферным раствором (ΡΒδ), рН 7,4 в качестве подвижной фазы. Затем антитела фильтровали с помощью ПВДФ мембран М^11еν-СV, 0,22 мкм, 33 мм (МПНроте, # δ^СV033Кδ) и хранили при температуре от 4 до 8°С.

Мышиные 1дС1 антитела к с-Ме! 5Ό5 (патент США № 5,686,292), обсуждающиеся ниже во многих примерах, выделяли и очищали из гибридомы НВ-11895, полученной из Американской коллекции типовых культур, Манассас, штат Виргиния, США, как описано выше.

Пример 2. Кинетика связывания антител к с-Ме! с различными внеклеточными доменами с-Ме!.

Последовательности внеклеточных доменов (ЕСГО) с-Ме! человека, яванского макака и крысы экспрессировали в виде гибридного белка Рс с Над- и Ηίδ-маркером (Ρΐίδ-маркер) на С-конце Рс (последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 72-74). Эти гибридные с-Ме! ЕСГО Рс белки по отдельности временно экспрессировали в клетках НЕК293 ΕΒNА и очищали согласно описанию в примере 1.

Для измерения кинетики связывания антител к с-Ме! с ЕСГО с-Ме! человека, яванского макака и крысы использовали измерительный прибор В1асоге® 2000. Измерения выполняли при 25°С. Образцы растворяли в ΗΒδ-ЕР буфере (150 мМ хлорида натрия, 3 мМ ЭДТА, 0,005% (вес./об.) поверхностноактивного вещества Р-20 и 10 мМ ^2-гидроксиэтилпиперазин-№-2-этансульфоновой кислоты (ΗΕΡΕδ) при рН 7,4; #ВК-1001-88). Р(аЬ')₂ фрагмент козьих антител к 1дС человека, отдельно взятый фрагмент Р(аЬ')₂ (1аск8оп 1ттипоге8еагсЬ 1пс., #109-006-097) иммобилизовали на проточных ячейках 1-4 сенсорного чипа СМ5 с уровнем 4000 единиц ответа (КИ) с помощью амин-связывающего реагента для захвата антител к с-Ме!.

Связывание оценивали с помощью множественных циклов.

Каждый цикл выполняли при скорости потока 50 мкл/мин, цикл состоял из следующих этапов: ввод примерно 10 мкл антител к с-Ме! при 10 мкг/мл с ожидаемым захватом 40-100 КИ, ввод 250 мкл ЕСГО сМе!-Р118-Рс человека, яванского макака или крысы (начиная со 100 нМ, используя двукратные последовательные разведения для каждого цикла), затем диссоциация в течение 20 мин и регенерация с помо- 16 020398 щью 30 мкл 10 мМ гидрохлорида глицина, рН 1,5. Скорость ассоциации и диссоциации для каждого цикла оценивали с помощью модели 1:1 (Ьапдтшг) Ьшбшд в программе ΒIΑеνа1иаί^οη версии 4.1. При связывании антитела Ό11-817Υ с ЕСЭ с-Ме!-Р118-Рс крысы для адекватной аппроксимации данных использовали модель гетерогенного лиганда; таким образом, получили два значения сродства связывания.

Результаты представлены ниже в табл. 3-5.

Таблица 3

Аффинность и кинетика связывания антител к с-Ме! с ЕСЭ с-Ме!-Р118-Рс человека

Антитело	к_вп (1/Мс)	ко« (1/о)	Ко (нИ)
Ό11-8Β8	1,0±0,1х10⁵	0,510,2/10^-4	0,5±0,2
Ш1-С27СЗ	6,4±0,2х10⁴	0,9±0,2х10^-4	1,4+0,3
Ο11-317Υ	0,7±0,1х10⁵	2,8±0, 1х10^-4	4,2+0,9
С8-М241	1,1±0,3х10⁵	<10^ь	<0,1
С8-6	1,6+0,4х10⁵	3±2х10^-4	4 + 1
С8-со16	1,1±0,2х10⁵	0,3±0,2х10^-4	0,3+0,1

Таблица 4

Аффинность и кинетика связывания антител к с-Ме! с ЕСЭ с-Ме!-Р118-Рс яванского макака

Антитело	к_оп (1/Мс)	к_О££ (1/с)	К„ (нМ)
О11-8В8	0,78 + 0,02х10⁵	2,23+0,07/1С^-4	2,9±0,2
О11-С2763	0,5+0,1х10⁵	3,2±0,4х10^-4	б,5±0,7
Ο11-317Υ	0,70±0,08х10⁵	3,б±0,5х10^-4	5,1+0,2
СВ-Н241	0,80±0, ОбхЮ⁵	<10^-ί>	<0,2

С8-6	1,4±0,5х10*	4,5±0,2х10^-4	3,6±1,1
С8-со1б	1,03±0,02х10⁵	<10‘^ь	<0,1

Таблица 5

Аффинность и кинетика связывания антител к с-Ме! с ЕСЭ с-Ме!-Р118-Рс крысы

Антитело	к„„ (1/Мс)	(1/о)	Кл (пМ)	(1/Мс\|	к_о££ (1/е)	Кв (нМ)
Б11-8В8	2,1 + 0,2х10⁵	1, 9+0, ЗхЮ¹	0,89±0,04
011- С2763	1,3±0,1х10⁵	3,4±0,5х10⁴	2,7+0,2
Β11-317Υ	0,66х10⁵	189х10’⁴	286	2,5х10⁵	3,0x10“!	1,2

Эти данные демонстрируют, что антитела С8-Н241, С8-6 и С8-со16 связывают ЕСЭ с-Ме! и человека, и яванского макака (но не крысы) с близкой аффинностью. Дополнительные данные (не приведены) указывают, что эти антитела не связывают ЕСЭ с-Ме! мыши вплоть до 100 нМ антител при 1 мкг/мл ЕСЭ, нанесенного на планшеты для твердофазного ИФА. Однако антитела Ό11-8Β8, Э11-С27О3 и Ό11817Υ связывают ЕСЭ с-Ме! человека, яванского макака и крысы.

Пример 3. Картирование эпитопов.

Эпитопы настоящих антител к с-Ме! картировали с помощью комбинации масс-спектрометрии водородно-дейтериевого обмена (НЭХМ8) (Уатаба е! а1. (2002) Кар1б Соттип. Ма88 8рес!гот. 16(4):293299) и мечения диэтилполикарбонатом (ПЕРС) (Мепбо/а е! а1. (2008) Лпа1у. СНет. 80 (8): 2895-2904). Реакцию водородно-дейтериевого обмена в домене 8ета с-Ме! человека проводили в присутствии и в отсутствие антител к с-Ме!. Области домена 8ета, которые накапливали меньше дейтерия в присутствии антитела, чем в его отсутствие, идентифицировали как эпитоп(ы) для этого антитела. ЭЕРС' может реагировать с аминогруппами поверхностно локализованных остатков лизина или гистидина в домене 8ета, образуя этилкарбамат лизина или гистидина. Если эти аминокислоты локализованы в области эпитопа, они будут защищены при связывании с антителом и не будут реагировать с ЭЕРС. Это помогало при дальнейшей локализации и/или подтверждении локализации областей эпитопа, определенной с помощью

- 17 020398

НЭХМ8.

Экспрессия и очистка домена 8ета с-Ме!.

Домен 8ета с-Ме! человека экспрессировали с Ρ1Ϊ8 маркером на С-конце (8ЕЦ ГО N0: 76) в клетках НЕК293 ЕΒNΑ и очищали согласно описанию в примерах 1 и 2. Очищенный белок хранили при 4°С в РВ8 при рН 7,4. Этот домен связывается с антителами к с-Ме! по настоящему изобретению с аффинностью, близкой к аффинности полноразмерного ЕСГО с-Ме! человека, что указывает на то, что эпитопы для этих антител локализованы в этой области с-Ме! человека.

Дегликозилирование и десиалирование домена 8ета с-Ме!.

Для де-Л-гликозилирования 100 мкл 1,2 мг/мл раствора домена 8ета с-Ме! обрабатывали 1 мкл раствора РNΟазы Р (Рго/уте, 0КЕ-5006В) при 37°С в течение ночи. ЖХ/МС-анализ демонстрировал, что большая часть белка после обработки являлась дегликозилированной. Отдельно для десиалирования домена 8ета 100 мкл 1,2 мг/мл раствора домена 8ета с-Ме! обрабатывали 2 мкл 10 Ед/мл раствора нейраминидазы (Косйе, Са!. # 10 269 611 001) при 37°С в течение 1 ч.

Образование комплексов домен 8ета с-Ме!/антитело.

мкл раствора дегликозилированного домена 8ета с-Ме! (1,2 мг/мл) смешивали с аликвотой раствора антител, содержавшей 29 мкг белка (2,07 мкл С8-Н241, 2,01 мкл Э11-8В8 или 3,87 мкл неродственных контрольных МаЬ) и затем разбавляли 1Х раствором РВ8 до конечного объема 40 мкл. Отдельно 5 мкл раствора десиалированного домена 8ета с-Ме! (1,2 мг/мл) смешивали с аликвотой раствора антител, содержавшей 14 мкг белка (1,04 мкл С8-Н241, 1,01 мкл Ό11-8Β8 или 1,94 мкл неродственных контрольных МаЬ) и затем разбавляли 1Х раствором РВ8 до конечного объема 15 мкл. Каждый из смешанных растворов каждого антитела затем подвергали НЭХМ8-анализу.

НЭХМ8-анализ.

мкл смеси дегликозилированного или десиалированного домена 8ета с-Ме!/антитело смешивали с 16 мкл 100% Э₂0 (Асго8, Собе 166310500; 80% Ό во время обмена) и инкубировали при комнатной температуре в течение 90 с. Реакцию обмена гасили 50 мкл 0,5% (об./об.) раствора муравьиной кислоты в воде при 0°С. Сразу после гашения раствор обрабатывали 2 мкл 5 мг/мл (об./об.) раствора пепсина (8ί§та, Са!. # Р6887) при 0°С в течение 3,5 или 4 мин. Сразу после этого гидролизованный раствор вручную вводили в колонку для обращенно-фазной ВЭЖХ (Ро1утег ЬаЬога!ог1е8, Рай #1912-1802; 2,1x50 мм, размер пор 1000 А, размер частиц 8 мкм). Поток буфера для ВЭЖХ от ВЭЖХ-насоса (^а!ег8, 2795 НРЬС) проходил через металлическую трубку (приблизительно 1 мл) в ручной инжектор. Элюат колонки затем подавали на масс-спектрометр М1сгота88 ЬСТ Ргеипег или 8УКЛРТ. Металлическую трубку, петлю инжектора и колонку погружали в водную баню со льдом.

Колонку уравновешивали 99% А (0,05% (об./об.) водного раствора ТФУК (трифторуксусной кислоты)) и 1% В (0,04% (об./об.) ТФУК в ацетонитриле) при скорости потока 0,2 мл/мин. Изократическое градиентное элюирование осуществляли в течение 1 мин, от 1 до 10% В в течение 1 мин, до 40% В в течение 12 мин, до 90% В в течение 4 мин при 3 мин задержки, а затем быстро восстанавливали исходные условия. Масс-спектрометрию осуществляли на масс-спектрометре М1сгота88 ЬСТ Ргеипег при положительном распылении в режиме при следующих настройках: напряжение на капилляре 1,5 кВ, напряжение на конусе 100 В, апертура 1 25 В, диапазон массовых чисел от 200 до 2000, температура высушивания 150°С, поток сушащего газа 500 л/ч. Масс-спектр каждого пептического пептида с-Ме! получали после Ό/Н-обмена с или без антител к с-Ме!. Среднюю массу каждого пептида рассчитывали согласно распределению изотопов в наиболее интенсивном ионном пике.

ЭЕРС-мечение комплексов с-Ме!/антитело. 8,3 мкл 1,2 мг/мл раствора домена 8ета с-Ме! человека смешивали с раствором антител (24 мкг белка: 1,71 мкл С8-Н241, 1,67 мкл Э11-8В8 или 3,2 мкл неродственных контрольных МаЬ) и с 1Х раствором РВ8 до конечного объема 76 мкл. Каждую смесь сМе!/антитело обрабатывали 4 мкл 10 мг/мл (об./об.) раствора ЭЕРС в изопропаноле при комнатной температуре в течение 5 мин и затем гасили 10 мкл 20 мг/мл раствора гистидина в 0,1М Трис-НС1 буфере, рН 8, и 10 мкл 0,2 мг/мл раствора лизина в 0,1М Трис-НС1 буфере, рН 8. Каждый раствор смешивали с 5 мкл 0,2 мг/мл (вес./об.) раствора трипсина свиньи (Рготеда, Са!. # У528А), и половину смеси смешивали с 0,5 мкл 50 мг/мл (вес./об.) раствора дитиотрейтола. Каждый раствор образца инкубировали при 37°С в течение 5 ч и затем обрабатывали 0,5 мкл раствора РNΟазы Р в течение следующего часа. Каждый гидролизованный раствор подкисляли 2 мкл 10% (об./об.) раствора уксусной кислоты. К невосстановленному гидролизату без добавленного дитиотрейтола добавляли 2 мкл 100 мг/мл раствора ТСЕР (трис(2карбоксиэтил)фосфин-гидрохлорида) (81дта, Са!. # С4702-2О). Каждый из растворов подвергали ЖХ/МС-анализу, используя ^а!ег8 Лссций ИРЬС и масс-спектрометр ^а!ег8 8УКЛРТ. При ВЭЖХ использовали колонку ^а!ег8 ЛссцШу ИРЬС ВЕН С8 (2,1x50 мм, 1,7 мкм, ^а!ег8, рай #186002877) при 60°С, пептиды элюировали градиентом ацетонитрила в системе подвижной фазы ВЭЖХ вода/ацетонитрил/ТФУК. Для гидролизатов использовали время прогона 45 мин. Колонку уравновешивали 99% А (0,05% (об./об.) водного раствора ТФУК) и 1% В (0,04% (об./об.) ТФУК в ацетонитриле) при скорости потока 0,2 мл/мин. Градиентное элюирование осуществляли в изократическом состоянии в течение 2 мин, от 1 до 25% В в течение 25 мин, до 45% В в течение 10 мин, до 90% В в течение 1 мин с задерж- 18 020398 кой 1,5 мин (в тот же самый промежуток времени, скорость потока 0,3 мл/мин) и затем быстро восстанавливали до 1% В.

Результаты.

По-видимому, МаЬ С8-Н241 связывают конформационный эпитоп, включающий четыре области домена 8ета с-Ме!, расположенных на α-цепи внеклеточного домена с-Ме! человека (аминокислотные остатки 25-307 последовательности 8ЕЭ ГО N0: 75):

₁₂₁ννΌΤΥΥΏΌΟΕ₁₃₀ (8ЕО ΙΌ N0: 77), ₁₃₁18СО8У]МКеТС0КНУРРНМНТАП108₁₅₆ (8ЕО ΙΌ N0: 78), ₁₇₉АЕОАК¹УР88¹УКОКРЮТР₁₉₆ (8ЕО ΙΌ N0: 79) и ₆\ЛНЕ<ЕТ<1)С,Р\Е_; ( 8ЕО ΙΌ N0: 80).

Более конкретно, МаЬ С8-Н241 связывает с-Ме! за счет взаимодействия с одним или более аминокислотных остатков в пределах ι₂₃ΌΤΥΥΏΌι₂₈ (8Е0 ΙΌ N0: 81) включительно,

1₄₄НVΡРНNНΤА^I^81₅₆ (8ЕЭ ΙΌ N0: 82) включительно, ^РЮТ^ (8Е0 ГО N0: 83) включительно и ₂₂₀КЕТКОСРМ₂₂₇ ( 8Е0 ГО N0: 84) включительно.

Связывание МаЬ С8-Н241 с областью 1₄₄НVРРНNНΤА^I^81₅₆ (8ЕЭ ГО N0: 82) делает его способным связывать внеклеточный домен с-Ме! и человека (8ЕЭ ГО N0: 75) и яванского макака (аминокислоты 25-932 последовательности 8ЕЭ ГО N0: 73) с сопоставимой аффинностью, но не с-Ме! крысы или мыши вплоть до 100 нМ антител при анализе связывания.

МаЬ Ό11-8Β8 связывается с α-цепью домена 8ета с-Ме!, видимо, локализованной в одной области, т.е. аминокислотными остатками в пределах линейного эпитопа в рамках аминокислотной последовательности ₈₄ΥКΤΟРV^ЕНР^СРРС^^С88КАN^₁₀₇ (8ЕЭ ГО N0: 85) включительно, более конкретно в области ₉₅ί’ΡΡί'ΌΌί’88Ι<Λι₀₅ (8ЕЭ ΙΌ N0: 86) включительно. Эпитоп для МаЬ Ό11-8Β8 дополнительно подтвержден экспериментами по выделению эпитопа (ОБипдапа е! а1. (2009) Ме!БоЙ8 Мо1. Βίο1. 524:87101). Домен 8ета с-Ме! гидролизовали трипсином свиньи (Рготеда) и затем смешивали гидролизат с биотинилированным МаЬ Ό11-8Β8, используя комплект ΕΖ-ΕίηΕ™ 8и1Го-НН8-ЕС-Вю1и1 (Р1егсе, РгоД. #1754210), для связывания пептидов с-Ме!. Биотинилированные Ό11-8Β8 с или без связанных пептидов с-Ме! захватывали стрептавидин-агарозной смолой высокой емкости (ТБегто 8с1епИПс. РгоД. # 20359). Связанные пептиды высвобождали 0,15% раствором (об./об.) муравьиной кислоты в Н₂0 и затем идентифицировали ЖХ/МС.

Пример 4. Предпочтительное связывание антител с с-Ме! по сравнению с ЕСГО ΚΌN и Р1ех1п А2.

ΚΌN и Р1ех1п А2 представляют собой белки человека, наиболее родственные по последовательности с-Ме!. Данный эксперимент сравнивал специфичность связывания антител к с-Ме! с ЕСО с-Ме!, ΚΌN и Р1ех1п А2.

Лунки 96-луночных планшетов с высокой степенью фиксации для ИФА/РИА (Со8!аг, #2592) покрывали 100 мкл 1 мкг/мл раствора гибрида внеклеточный домен (ЕСО) с-Ме! человека - Рс - Ρ1Ϊ8 (8ЕЭ ГО N0: 72), Р0К-ЕСГО-Рс (Ρ&Ό 8у8!ет8, #1947-М8) или Р1ех1пА2-ЕС0-Рс (АЬпоуа, Тайбэй, Тайвань #Н00005362-Р01) в буфере для иммобилизации (ТОюРХ ЬаЬ8, # С0АТ-1000-01) в течение ночи при 4°С. Лунки аспирировали, несвязавшиеся сайты связывания блокировали добавлением 200 мкл блокирующего буфера (Трис-солевой буферный раствор, рН 8,0, с 0,05% (об./об.) полисорбата 20 (Т\уееп-20) (ТИБ-Т) фюРХ ЬаЬ8, # \У8Н\У-1000-01) и 1% (вес./об.) бычьего сывороточного альбумина (БСА) (1аск8оп Ιιηтипо, #001-000-162)) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали отмывочным буфером (ТВ8-Т), добавляли 100 мкл/лунку последовательных разведений 1:6 антител к с-Ме! в блокирующем буфере (начиная с 100 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Планшеты промывали и инкубировали в присутствии 100 мкл/лунку раствора козьих Р(аЬ)₂ к Ι§0 человека, конъюгированных с ПХ (1аск8оп IттипοΡе8еа^сΗ ЬаЬ8 #109-036-097) в блокирующем буфере в течение 90 мин. После промывки планшетов добавляли 100 мкл/лунку раствора субстрата (ТОюРх. #ТМЕ^-1000-01) и инкубировали планшеты в течение 10 мин при комнатной температуре. Добавляли 100 мкл/лунку раствора стоп-реагента ^юРх, # Б8ТР-1000-01) для остановки реакции. Развившийся колориметрический сигнал считывали при длине волны 450 нм на устройстве для считывания планшетов 8рес1гаМах 190 (Мо1еси1аг Оеуюе8, Саннивейл, штат Калифорния, США). Связывание антител к с-Ме! с ЕСО с-Ме!, ΚΌN и Р1ех1пА2 было пропорционально образованию цветового сигнала.

Как показано в табл. 6, антитела к с-Ме! по настоящему изобретению - и С8, и Ό11 - предпочтительно связываются с ЕСО с-Ме! человека по сравнению с ЕСО ΚΌN или ЕСО Р1ех1пА2.

- 19 020398

Таблица 6

Предпочтительное связывание антител к с-Ме! с ЕСЭ с-Ме! человека по сравнению с ЕСЭ К0N и Ρΐβχίη А2

	Средняя А45О нм
Доза антител	С8-И241	С8-6	С8-со1б
(нг/мл)	ΕΟϋ с-Ме1:	ЕСР ΗΟΝ	Ρΐβχίη А2	ЕСО с-МеЪ	ЕСО ЕОЫ	Ρΐβχίη А2	ΕΟΏ с-Μβί	ЕСО ΚΟΝ	ΡΐθΧίη Α2
0, 000	0, 300	0, 098	0,092	0,322	0,110	0,109	0, 335	0, 106	0, 104
0, 002	0,317	0, 088	0,082	0,326	0, 106	0,099	0,369	0,100	0, 094
0, 010	0, 317	0,081	0,090	0,335	0,097	0,095	0,374	0, 096	0, 078
0, 060	0,484	0,104	0,099	0,551	0, 087	0,096	0, 446	0,089	0, 082
0,357	0, 902	0, 091	0,097	0,813	0, 080	0,107	0, 907	0, 083	0, 095
2, 143	2,861	0,101	0,103	2, 415	0, 098	0,106	2,888	0, 114	0,092
12,860	4,000	0, 079	0,083	4, 000	0,087	0,085	4,000	0, 102	0, 069
77,160	4, 000	0,085	0,079	4,000	0,090	0,078	4,000	0, 084	0, 096
462,963	4,000	0, 090	0,104	4,000	0, 088	0,086	4,000	0,103	0, 092
2777,778	4, 000	0,085	0, 092	4,000	0,088	0,094	4,000	0, 095	0, 114
16666,667	4,000	0,117	0,125	4,000	0,124	0,118	4,000	0,198	0,284
100000,000	4,000	0,267	0,310	4,000	0,170	0, 171	4, 000	0, 421	0,983
Стандартная ошибка
0, 000	0,006	0,015	0,007	0,011	0, 000	0,004	0, 003	0, 005	0, 011
0, 002	0, 003	0,006	0,002	0,012	0, 005	0,006	0, 023	0,000	0, 006
0,010	0, 002	0,000	0, 005	0,001	0,004	0,009	0, 015	0,012	0, 002
0, 060	0, 055	0, 001	0, 002	0,144	0,004	0,005	0,029	0,003	0, 002
0,357	0,004	0, 004	0,002	0,022	0,005	0,003	0,005	0, 007	0, 000

2, 143	0, 032	0, 004	0, 005	0, 041	0,004	0, 003	0,128	0, 002	0,007
12,860	0,000	0,001	0, 012	0,000	0,000	0, 007	0, 000	0, 004	0, 004
77,160	0, 000	0, 002	0,014	0,000	0,008	0,007	0, 000	0,003	0,001
462,963	0, 000	0, 004	0, 003	0,000	0,006	0, 001	0, 000	0, 013	0,001
2777,778	0, 000	0,004	0, 002	0,000	0,004	0,001	0, 000	0,007	0,000
16666,667	0, 000	0, 005	0,004	0,000	0,004	0, 003	0, 000	0,003	0, 002
100000,000	0,000	0,008	0,012	0,000	0,002	0,003	0, 000	0, 011	0,093

Ο11-8Β8	Ш1-С2763	011-5ΠΥ
ЕСО с-Ме£	ЕСО ΚΟΝ	Ρΐθχϊη Α2	Ε€ϋ с-МеЪ	ЕСО ΚΟΝ	Ρΐθχίη Α2	ЕСС с-Ме!	ЕСО ΚΟΝ	Ρΐθχίη Α2
0,297	0,097	0,081	0,2844	0,0791	0,0771	0,31475	0,1129	0,10795
0, 299	0, 082	0, 078	0,2708	0,07065	0,07965	0,3091	0,09705	0,09345
0,304	0,074	0,078	0,2904	0,0715	0,0763	0,31405	0,0868	0, 0986
0, 445	0,094	0,073	0,45965	0,0695	0,06605	0,37355	0,0857	0,09455
1,314	0,073	0,074	1,43965	0,07085	0,0792	0,78915	0,08475	0,0924
2,416	0,069	0,073	2,5266	0,0655	0,0742	2,1432	0,1085	0,08235
3, 931	0,079	0,075	4	0,07835	0,0641	4	0,0825	0,0768
4,000	0,079	0,066	4	0,06725	0, 076	4	0,08195	0,07575
4,000	0,071	0,077	4	0,0981	0,1045	4	0,08185	0,0783
4,000	0, 088	0, 093	4	0,20445	0,30325	4	0,09255	0,0955
4,000	0, 165	0, 181	4	0,67565	1,33475	4	0,1274	0,1491
4,000	0,544	0,498	3,9211	2,30295	3,37085	4	0,23775	0, 3146

- 20 020398

Стандартная оши&ка
0,006	0, 003	0,003	0,0087	0,0017	0,0106	0,00515	0,0012	0,00035
0, 011	0,002	0,002	0,0194	0,00595	0,00185	0,0228	0,00065	0,01725
0,012	0,002	0,001	0,0051	0,0018	0,0017	0,01195	0,0058	0,0079
0, 007	0, 017	0,003	0,01495	0,0006	0,00335	0,00375	0,0013	0,00035
0, 092	0,007	0,004	0,02935	0,00695	0,0017	0,04195	0,00075	0,0039
0,044	0, 002	0,001	0,2742	0,0002	0,0015	0,0841	0,0054	0,00015
0, 069	0, 005	0,002	0	0,01505	0,0043	0	0,0029	0,0061
0, 000	0, 007	0,000	0	0,00275	0,0066	0	0,00445	0,00455
0,000	0, 005	0,004	0	0, 0063	0,0032	0	0,00485	0,0089
0,000	0, 003	0,005	0	0,00975	0,00535	0	0,00705	0,0055
0,000	0,007	0, 004	0	0,03125	0,03495	0	0,0007	0,0035
0,000	0, 016	0, 006	0, 0789	0,07335	0,14345	0	0,00865	0, 004

Пример 5. Антитела к с-Ме! блокируют связывание НОР/с-Ме!.

Для определения ингибирования связывания НОР с с-Ме! настоящими антителами к с-Ме! использовали анализ связывания ш У1!го.

Лунки 96-луночных планшетов с высокой степенью фиксации для ИФА/РИА (Сок!аг, #2592) покрывали 100 мкл раствора ЕСЭ с-Ме! человека-Рс-Рйк (δΕΟ ГО N0: 72) (2 мкг/мл) в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (ΌΡΒδ) в течение ночи при комнатной температуре; четырежды промывали отмывочным буфером (Трис-солевой буферный раствор, рН 8,0, с 0,05% (об./об.) полисорбата 20 (Τ\νΕΕΝ®-20) (ΤΒδ-Т) (ВюРХ ЬаЬк, # VδНV-1000-01) на устройстве отмывки планшетов; блокировали добавлением 300 мкл блокирующего буфера (ΤΒδ-Τ с добавлением 1% (вес./об.) бычьего сывороточного альбумина (БСА) Оасккоп 1ттипо, #001-000-162)); и инкубировали в течение 60 мин при 37°С. Затем блокирующий буфер удаляли из лунок и в каждую лунку добавляли 50 мкл антител в блокирующем буфере с конечными концентрациями согласно указаниям в табл. 7 соответственно. Добавляли блокирующий буфер в контрольные лунки, содержащие только НОР. Планшеты с антителами к с-Ме! инкубировали в течение 90 мин при 37°С. В каждую лунку, кроме контрольных лунок, содержащих только антитела, добавляли 50 мкл фактора роста гепатоцитов человека (НОР) (Κ&Ό §ук!етк, #294) в блокирующем буфере с конечной концентрацией 10 нг/мл. Планшеты, содержащие смесь антитела к с-Ме!/НОР, инкубировали на планшетном шейкере в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем лунки четырежды промывали ΤΒδ-Τ на устройстве отмывки планшетов. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора биотинилированных антител к НОР (Κ&Ό δук!етк, # ΒΑΡ294) в блокирующем буфере с конечной концентрацией 100 нг/мл. Планшеты инкубировали в течение 90 мин при комнатной температуре. Лунки вновь четырежды промывали ΤΒδ-Τ на устройстве отмывки планшетов. В каждую лунку добавляли 100 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидазы хрена (ПХ) (Κ&Ό δук!етк, ΌΥ998), разведенной 1:200 в блокирующем буфере. Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Лунки четырежды промывали ΤΒδ-Τ на устройстве отмывки планшетов. Затем добавляли 100 мкл/лунку раствора субстрата (ΒώΡχ, #ΤМΒV-1000-01) и инкубировали планшеты в течение 10 мин при комнатной температуре. Для остановки реакции добавляли 100 мкл/лунку раствора стоп-реагента (ЫоРх. # ΕδΤΡ-1000-01). Образцы считывали при длине волны 450-570 нм на устройстве для считывания микропланшетов (Ърес1га, МАХ 190), не вычитая фоновый сигнал.

Как показано в табл. 7, и антитела С8, и Ό11 по настоящему изобретению блокируют связывание НОР человека/с-Ме!.

- 21 020398

Таблица 7

Ингибирование связывания НОР человека с с-Ме! человека антителами С8- и Ό11-

	СРЕД. А450 нм
Доза антител (нг/ып)	ЫдС2	ϋΐΐ- 8В8	О11-27СЗ	ϋΐΐ- 317Υ		С8-6	С8-Н241	сз- со16
0,00	2,43	2,43	2,43	2,43	2,61	2,61	2,61	2,61
0,48	2,46	2,51	2,37	2,15	2,41	2,56	2,45	2,05
1, 91	2,87	2,43	2,31	1, 98	2,49	2,59	2,46	2,18
7, 63	2,70	2,41	227	2,08	2,88	2,64	2,53	2,20
30,52	2,41	2,32	2,38	2,07	2,63	2,42	2,42	2,08
122,07	2,52	1,92	1,60	1, 69	2,44	2,00	1,77	1,30
488,26	2,53	1,30	0, 94	1,29	2,44	1,33	0,73	0,70
1953,13	2,43	1,43	0, 97	1,23	2,27	1,08	0,68	0, 60
7812,50	2,50	1,24	0, 91	1,12	2,49	0,95	0,70	0,57
31250,00	2,50	1,31	0,94	1,17	2,67	0,98	0,77	0,56
125000,00	2,43	1,38	0,89	1,35	3, ОЭ	1, 32	0, 69	0, 38
	Станд.	ОШ 4
0,00	0,06	0,06	0,06	0,06	0,10	0, 10	0, 10	0, 10
0,48	0,02	0,13	0,01	0,09	0,24	0,02	0,14	0,15
1,91	0,27	0,08	0,08	0,03	0,00	0, 03	0, 16	0,12
7, 63	0,14	0,01	021	0,08	0,14	0,03	0,06	0,09
30,52	0,09	0,02	0,31	0,09	0,16	0,01	0,03	0,01
122,07	0,09	0,07	0,03	0,02	0,08	0,10	0,02	0,03

488,28	0,00	0,04	0,04	0,02	0, 01	0,02	0,00	0,01
1953,13	0, 13	0, 16	0,02	0,05	0,00	0,01	0,01	0,01
7812,50	0, 04	0, 01	0, 01	0,02	0,25	0, 07	0,01	0,02
31250,00	0,06	0, 02	0,02	0,04	0,03	0,03	0,03	0, 03
125000,00	0,07	0,03	0, 01	0, 08	0,13	0, 47	0,01	0,00

Сокращения: СРЕД. - среднее значение; Станд. ош. - стандартная ошибка

Пример 6. Антитела к с-Ме! индуцируют ослабленное фосфорилирование с-Ме! по сравнению с фактором роста гепатоцитов и агонистом МаЬ 5Ό5.

При стимуляции НОР клеточная линия карциномы легких А549 демонстрирует повышенное фосфорилирование с-Ме! по остатку тирозина 1349. Для измерения агонистической активности различных антител к с-Ме! в отсутствие НОР, а также МаЬ 5Ό5 и самого НОР использовали твердофазный ИФА фосфорилированного с-Ме! (р-Ме!).

Клетки А549 (АТСС, #ССЬ-185) культивировали на среде Хэма Р12К+2 мМ глутамина (1пу1!годеп, # 21127-022)+10% ΡΒδ (1пу1!годеп, #10082). Клетки высевали на 96-луночные планшеты из расчета 6х10⁴клеток/лунку на богатую сывороточную среду и инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% (об./об.) СО₂. Среду удаляли из лунок и клетки оставляли голодать в 100 мкл среды Хэма Р12К+2 мМ глутамина + 0,5% ΡΒδ в течение 6 ч при 37°С и 5% (об./об.) СО₂. Антитела или НОР разбавляли голодной культуральной средой, добавляли в конечных концентрациях, указанных в табл. 8, и инкубировали в течение 15 мин при 37°С. Среду отбирали, клетки лизировали в 50 мкл лизирующего буфера (10 мМ Трис (1пуЦгодеп, #15567-027), 150 мМ №С1, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (1пу1!годеп, #15575038), 50 мМ NаΡ (δίβΐηο, #δ1504), 1% (об./об.) октилфеноксиполиэтоксиэтанола (ΤКIΤОN®-X 100; δ^дта, #Т8787), 2 мМ ортованадата натрия (ЕМО СНеписаЕ, Гиббстаун, штат Нью-Джерси, США, #567540), ингибитор протеаз ^дта, Сент-Луис, штат Миссури, США; #Р8340) и смесь ингибиторов фосфатаз II (δίβΐηη #Р5726)) на лунку и инкубировали на льду в течение 15-20 мин. Клеточные лизаты использовали при твердофазном ИФА, описанном ниже, для определения фосфорилирования с-Ме! по остатку Υ1349.

Антитела для захвата с-Ме! разбавляли буфером для иммобилизации Βιιρ Н (ТЬегто Р18Ьег δс^еηι^Γ^с. Уолтем, штат Массачусетс, США, #28382) до 2 мкг/мл, добавляли на планшеты для твердофазного ИФА (Огешег Βώ-Опе, Монро, штат Северная Каролина, США, #655081) и инкубировали в течение

- 22 020398 ночи при 4°С. Лунки аспирировали, трижды промывали ΤΒδ-Τ (ВюРХ, Оуингс-Миллз, штат Мэриленд, США, VδН-1000-01) и затем блокировали 200 мкл блокирующего буфера (ΤΒδ-Τ плюс 2% (вес./об.) БСА) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды промывали ΤΒδ-Τ. Затем добавляли 25 мкл клеточных лизатов и 75 мкл блокирующего буфера и инкубировали планшеты в течение ночи при 4°С. Затем планшеты трижды промывали ΤΒδ-Τ. В каждую лунку добавляли 100 мкл 0,5 мкг/мл раствора поликлональных антител к с-Ме! ρΥ1349 (Се11 δίβηηΠηβ ΤесЬηο1ο§у, Данверс, штат Массачусетс, США, #3133) в блокирующем буфере и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали ΤΒδ-Τ. В каждую лунку добавляли 100 мкл козьих поликлональных антител к 1§О кролика, конъюгированных с пероксидазой и разведенных 1/10000 (ΕκΚδοη IттиηοΚеδеа^сЬ ^аЬο^а!ο^^еδ, Вест-Гроув, штат Пенсильвания, США, #111-035-144) в блокирующем буфере и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали ΤΒδ-Τ. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ΒίοΓΧ, #ΤМΒV-1000-01) с последующим добавлением 100 мкл раствора стоп-реагента (ΒίοΓΧ, #ΕδΤΡ-1000-01). Планшеты считывали при длине волны 450 нм на устройстве для считывания планшетов δρес!^аМаx М5 ^ο^^Πτ ^еν^сеδ, Саннивейл, штат Калифорния, США), значения образцов определяли с помощью программы δΟРΤтаx Рго 4,8 (\'1ο1οοιι1;ΐΓ ОеЛсех).

Результаты представлены в табл. 8.

Таблица 8

Действие антител к с-Ме!, НОР и агониста МаЬ 5Ό5 на фосфорилирование с-Ме! в клетках А549

Конц. ΆΤ	сигнал р-Ме5	сигнал р-МеЬ	сигнал р-МеЬ
(мкг/мл)	С8-Н241	С8-6	Ыд64
30	0,333	0,272	0,061
10	0,418	0,334	0,077
3, 333	0, 450	0,328	0, 068
1,113	0,465	0,365	0,087
0, 370	0, 340	0,211	0,082
0, 123	0, 304	0,127	0,067
0, 041	0, 130	0,125	0,268
0,014	0, 078	0,105	0,074
0, 005	0, 074	0,070	0,074
0,002	0,070	0,081	0,117

Конц. НСГ (нг/мл)	сигнал р-МеГ	Конц. АТ (нг/мл)	сигнал р-МеЬ МаЬ 505
300	10,615	5	3,290
100	6,129
33,33333	2,2 67
11,11111	1,0667
3,703704	0,461
1,234568	0,211
0,411523	0, 142
0, 137174	0,12В
0,045725	0, 100
0,015242	0, 148

Данные демонстрируют, что НОР и агонист с-Ме! МаЬ 5Ό5 сильно стимулируют фосфорилирование с-Ме!, в то время как настоящие с-Ме! МаЬ С8-Н241 и С8-6 слабо стимулируют фосфорилирование с-Ме!. Аналогичные результаты получили при использовании клеточных линий НСТ116, Н460 и МОАМΒ-231.

МаЬ Ό11-8Β8 дают аналогичные результаты.

Пример 7. Антитела к с-Ме! ингибируют НОР-индуцированное фосфорилирование с-Ме!.

Связывание НОР с с-Ме! приводит к фосфорилированию тирозина в молекулах с-Ме! и активации сигнального пути с-Ме!. В данном примере для оценки ингибирования НОР-индуцированного фосфори- 23 020398 лирования с-Ме! по остаткам тирозина 1230, 1234 и 1235 использовали клеточную линию рака толстой кишки человека НСТ116.

Клетки НСТ116 (АТСС, Манассас, штат Виргиния, США, #ССЬ-247) ресуспендировали в среде Мак-Коя 5А (1иуйгодеи, Карлсбад, штат Калифорния, США, #16600-082) с добавлением пенициллина/стрептомицина (1иуйгодеи, #15140-122) и 10% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки (РВ8) (Ιηνί!годеп, #10082-147) из расчета 150000 клеток/мл. 0,2 мл ресуспендированных клеток НТС116 вносили в 96-луночные титрационные микропланшеты (Согшид, Лоуэлл, штат Массачусетс, США, #3596) из расчета 300000 клеток/лунку и инкубировали клетки в течение 48 ч при 37°С и 5% (об./об.) СО₂. Затем удаляли культуральную среду и оставляли клетки голодать в 100 мкл среды Мак-Коя 5А с добавлением пенициллина/стрептомицина и 0,1 (вес./об.) БСА в течение 24 ч при 37°С и 5% (об./об.) СО₂. Добавляли 25 мкл раствора азида натрия (конечная концентрация 0,01% (вес./об.)) (81дта, #82002) с немедленным последующим добавлением 25 мкл 8Х разведений антител к с-Ме! в среде Мак-Коя 5А с добавлением пенициллина/стрептомицина и 0,1 (вес./об.) БСА и инкубировали клетки в течение 30 мин при 37°С и 5% (об./об.) СО₂. В каждую лунку добавляли 50 мкл НОР в конечной концентрации 200 нг/мл и инкубировали клетки в течение следующих 15 мин при 37°С и 5% (об./об.) СО₂. Затем удаляли среду и добавляли 50 мкл буфера для лизирования клеток (10 мМ Трис ОтЦгодеп, #15567-027), 150 мМ ЫаС1, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) ОтЦгодеп, #15575-038), 50 мМ ЫаР (81дта, #81504), 1% (об./об.) октилфеноксиполиэтоксиэтанола (ΤΚΙΤΟΝ®-Χ 100; 81дта, #Т8787), 2 мМ ортованадата натрия (ΕΜΌ СйетюаН, Гиббстаун, штат Нью-Джерси, США, #567540) и полный ингибитор протеаз, не содержащий ЭДТА (Косйе, Базель, Швейцария, #11836170001). Клетки инкубировали в лизирующем буфере при комнатной температуре в течение 15-30 мин. Клеточные лизаты анализировали на фосфорилирование тирозина в составе с-Ме! с помощью твердофазного ИФА следующим образом.

Антитела для захвата с-Ме! разбавляли буфером для иммобилизации (ВюРХ, Глендора, штат Калифорния, США, СОАТ-1000-01) до концентрации 2 мкг/мл. 110 мкл разбавленных антител вносили в каждую лунку планшетов для твердофазного ИФА (Огешег Вю-Оие, Монро, штат Северная Каролина, США, #655081) и инкубировали планшеты в течение ночи при 4°С. Лунки аспирировали, дважды промывали ТВ8-Т и затем блокировали 200 мкл блокирующего буфера (ТВ8-Т плюс 2% (вес./об.) БСА) в течение 1 ч. Планшеты дважды промывали ТВ8-Т. Затем добавляли 25 мкл клеточных лизатов и 75 мкл блокирующего буфера или 100 мкл разведения клеточных лизатов МКШ5 (разбавленных блокирующим буфером, в качестве стандарта) и инкубировали планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты четырежды промывали ТВ8-Т. В каждую лунку добавляли 100 мкл 0,5 мкг/мл раствора поликлональных антител к с-Ме! ρΥρΥρΥ1230/1234/1235 (1^йгодеи, #44-8880) в блокирующем буфере и инкубировали планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты четырежды промывали ТВ8-Т. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл козьих поликлональных антител к 1дО кролика, конъюгированных с пероксидазой и разведенных 1/12000 Оаскюп 1ттцпоКе8еагсй ЬаЬога!ог1е8, ВестГроув, штат Пенсильвания, США, #111-035-144) в блокирующем буфере и инкубировали смесь в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты шестикратно промывали ТВ8-Т. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ВюРХ, #ТМВ\У-1000-01) с последующим добавлением 100 мкл раствора стоп-реагента (ВюРХ, #Ь8ТР-1000-01). Планшеты считывали при длине волны 450 нм с коррекцией при 570 нм на устройстве для считывания планшетов 8рес!гаМах 190 (Мо1еси1аг ^еν^сеδ, Саннивейл, штат Калифорния, США). Стандартную кривую устанавливали, используя 4параметрический анализ, значения образцов определяли с помощью программы 8ОРТтах Рго 3.1.2 (Мо1еси1аг Ое\асе5).

Процент ингибирования фосфорилирования тирозина в составе с-Ме! устанавливали как среднее значение при обработке НОР без добавления антител к с-Ме! (0% ингибирования), а 100% ингибирования устанавливали как среднее значение при обработке азидом натрия (без обработки НОР или антителами к с-Ме!).

В табл. 9 показаны средние значения по трем повторам обработки на эксперимент для трех экспериментов со стандартными ошибками. Данные демонстрируют, что пять из шести антител к с-Ме! по настоящему изобретению значительно ингибируют НОР-индуцированное фосфорилирование тирозина в составе с-Ме! по сравнению с изотипическими контролями 1дО2 и 1дО4 человека.

- 24 020398

Таблица 9

Процент ингибирования ΗΟΡ-индуцированного фосфорилирования тирозина в составе с-ΜοΙ антителами С8- и Ό11-

		Дозы антител:
		10 мкг/мл	2 мкг/мл	0,4 мкг/мл	0,08 мкг/мл	0,016 мкг/мл	0,0032	мкг/мл
Обработка	изотип	среднее	станд.	среднее	станд.	среднее	станд.	среднее	станд.	среднее	станд.	среднее	станд.
АЬ			ош.		ош.		ош.		ош.		ош.		ош.
О11-8В8	1дС2	19,56	4,68	40,74	8,24	35,04	6, 43	10,52	7,41	-6,68	9,48	-10,37	6, 79
О11-С27СЗ	1дС2	1,25	7,55	31,78	7,71	38,10	4, 97	20,79	5, 72	5,73	8,95	9,72	7,09
Ό11-517Υ	1ЧС2	16,73	8,72	31,39	6,43	15,91	6,05	-3,24	10,54	2,53	8,52	9,48	8,51
С8-Н241	1дС4	60,08	5,27	62,20	2,10	59,09	3,05	22,09	4,92	14,68	12,40	-12,33	10,18
С8-СО-16	1дС4	65,40	3,94	58,96	3,37	45,08	3,44	9,77	9,14	-2,89	10, 95	-10,72	5,41
С8-6		14, ее	10,73	27,94	3,80	16,33	4,36	7,79	7,68	-6,06	8,84	-11,34	8, 65
5Э5	т1дС1	64,12	3,31	63,75	4,44	42,55	4,27	11,87	7,73	-3,50	9,70	-6,07	5,68
ЫдС2	изотип.	6,24	5,31	17, 53	5,74	9,31	6, 56	-1,58	8,16	9,49	6,77	-10,21	6, 78
	контроль
МдС4	изотип.	-1,47	5,76	-6,62	9,07	-16,07	7,01	-21,70	9,09	-7,96	10,97	-14,40	7,37
	контроль
тп1дС1	изотип.	5,46	6,31	9,76	9, 27	13,43	8,18	-10,59	10, 31	-5,42	10, 53	-9,76	8, 42
	контроль
		сред.	станд.
			ошибка
без		100,00	0,98
обработки
НСГ	200 нг/мл	0, 00	2,76

% ингибирования ΗΟΡ-стимулированного ρ-Μβΐ по данным твердофазного ИФА

Пример 8. Индукция интернализации с-ΜοΙ антителами к с-ΜοΙ.

В экспериментах, описанных в этом примере, для демонстрации того, что настоящие антитела к сΜβΐ связываются с молекулами с-ΜοΙ на поверхности клеток и индуцируют интернализацию ^Μβΐ, использовали сортировку клеток с активацией флуоресценции (ΡΑСδ). Использованные клетки ΜΚΜ5 отличаются высоким уровнем конститутивной экспрессии общего с-ΜοΙ и демонстрируют ΗΟΡнезависимое фосфорилирование с-Μοΐ в результате амплификации гена МЕТ. По-видимому, интернализация с-Μβΐ индуцирует деградацию с-Μβΐ (см. примеры 10 и 19), что приводит к ингибированию сигнального пути с-Μοΐ.

В лунки 6-луночных планшетов для тканевых культур (Сократ, #3598) засевали по 1,5х10⁵ клеток опухоли желудочно-кишечного тракта человека ΜΚ№5 (1араи ΗοηΙΐΠ δαακοδ ΡουηάηΙίοη, ΗοηΙΐΠ δΑιτ^ КекеатсБ Кекоигсе Вапк, #1СКВ0254) в 2 мл культуральной среды (ΚΡΜΙ-1640 ОпуЦгодсп, #11835); 10% (об./об.) ΡΒδ ОпуНгодеп, #10082); 2 мМ Ь-глутамина ОпуНгодеп, #25030); 100 Ед/500 мл пенициллина Ο и 100 мкг/500 мл стрептомицина ОпуНгодеп, #15140)). Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37°С, 95% относительной влажности и 5% (об./об.) С0₂. Затем в лунки добавляли антитела в конечной концентрации 5 мкг/мл. После обработки в течение ночи из лунок удаляли культуральную среду, заменяя ее 1 мл раствора для диссоциации клеток, не содержащего ферментов (СБешюоп, #δ-014-Β). После инкубирования в течение 5 мин при комнатной температуре клетки собирали в центрифужные пробирки, однократно промывали культуральной средой, после чего еще раз промывали буфером для фиксации (ΌΡΒδ с добавлением 1% (вес./об.) БСА и 0,01% (вес./об.) азида натрия). Перед окрашиванием клеток антитела к с^е!, распознающие иной эпитоп, чем настоящие антитела к с^еР метили с помощью комплекта для мечения моноклональных антител Α1еxа Ρΐυοτ 488 Μοηοс1οηа1 ЛпйЬойу ЬаЬеИпд Κίΐ (ΜοΕαι1;·ΐΓ РгоЬек, Юджин, штат Орегон, США, #А-20181) согласно инструкциям поставщика. К клеткам добавляли 100 мкл буфера для фиксации, содержащего 2 мкг/мл антител, меченных Α1еxа Ρΐ^τ 488, после чего инкубировали в течение 60 мин на льду. Затем клетки однократно промывали буфером для фиксации и ресуспендировали в ΌΡΒδ, содержащем 2 мкг/мл пропидиум-иодида (для окрашивания мертвых клеток). Количество молекул с^еР оставшихся на поверхности клеток, анализировали с помощью ΡΑСδ и в каждом образце обнаруживали 10000 событий.

Средняя интенсивность флуоресценции на поверхности клеток отражала количество молекул с^еР которые остались на поверхности клеток после обработки антителами к с^еР

Данные одного типичного эксперимента показаны в табл. 10.

- 25 020398

Таблица 10

Действие антител С8- и Ό11- на интернализацию с-Ме! согласно анализу РАСБ

	Среднее значение флуоресценции
Антитело (мкг/мл)	ЫдС2	О11-8В8	О11-С27СЗ	Ο11-517Υ	Ъ1д64	С8-6	С8-Н241	С8-СО16	тп1дС	505
5,00	130,25	44,66	51,09	56,35	135,03	67,88	57,63	56,16	136,47	92,87

Данные демонстрируют, что средняя интенсивность флуоресценции на поверхности клеток, обработанных настоящими антителами к с-Ме!, ниже, чем в клетках, обработанных соответствующими изотипическими контрольными антителами т1дО, что указывает на индукцию интернализации с-Ме! настоящими антителами к с-Ме!. Более того, средняя интенсивность флуоресценции на поверхности клеток, обработанных настоящими антителами к с-Ме!, ниже, чем в клетках, обработанных контрольными агонистическими антителами к с-Ме! 5Ό5. % интернализации можно рассчитать следующим образом:

% интернализации=[1-(средняя флуоресценция тестируемого антитела, разделенная на среднюю флуоресценцию изотипического контрольного антитела)] х 100.

Данные по интернализации означают, что настоящие антитела индуцируют димеризацию с-Ме! человека. Данные в примерах 9 и 19 демонстрируют, что антитела С8- и Ό11- также индуцируют деградацию и снижают фосфорилирование с-Ме!.

Дополнительные результаты по интернализации получили с помощью конфокальной микроскопии, используя мышиные антитела С8 с флуоресцентной меткой и клетки МКШ5 и Сак1-1.

При использовании антител С8-Н241, С8-6, С8-со-16 и мышиных антител Ό11 получили аналогичные результаты на клетках яванского макака №Н3Т3, трансфицированных нуклеиновой кислотой, кодирующей с-Ме! яванского макака.

Антитела С8-Н241, С8-6, С8-со-16 и орШ11 также индуцируют интернализацию с-Ме! в клетках №Н3Т3, трансфицированных нуклеиновой кислотой, кодирующей мутацию киназного домена с-Ме! человека М1149Т. Антитела С8-Н241, С8-6, С8-со-16 и мышиные антитела Ό11 также индуцируют интернализацию с-Ме! в клетках немелкоклеточного рака легких Н1437, содержащих мутацию субмембранного домена с-Ме! К988С. Обе мутации вызывают конститутивную активацию с-Ме!.

Пример 9. Ингибирование лиганд-независимой пролиферации опухолевых клеток ш νίΙΐΌ антителами.

В этом исследовании производили оценку ингибирования роста опухолевых клеток ш νίΙΐΌ антителами к с-Ме! в НОР-независимых клетках МКЖ5 в отсутствие лиганда НОР.

с-Ме! и изотипические контрольные антитела разбавляли культуральной средой (КРМ1-1640 (Ιπνί!годеп, #11835); 10% (об./об.) ΡΒδ, 2 мМ Ь-глутамина ОпуЦгодеи #25030); 100 Ед/500 мл пенициллина О и 100 мкг/500 мл стрептомицина (ЗпуНгодеи #15140)) до 2х конечных концентраций, указанных в табл. 11, и в каждую лунку 96-луночных планшетов для тканевых культур (Регк1пЕ1тег #1450-517) добавляли 50 мкл 2х растворов антител. Клетки МКШ5 (1арап Неа1!Б Баепсек РоипДаБоп, НеаНЪ Заепсе КекеатсБ Кекоигсе Вапк, #1СКВ0254) поддерживали на вышеуказанной среде и ресуспендировали в той же среде до концентрации 1 х 10⁵ клеток/мл. 50 мкл этой суспензии МКШ5 добавляли в каждую лунку до количества 5х10³ клеток/лунку. Затем планшеты инкубировали в течение 48 ч при 37°С, 95% относительной влажности и 5% (об./об.) С02. В течение последних 6 ч культивирования выполняли импульсное мечение клеток ³Н-тимидином (МР ВютеДюаИ, Солон, штат Огайо, США #24066) из расчета 1 мкКи/лунку при 37°С, 95% относительной влажности и 5% (об./об.) С02. Затем среду удаляли и однократно промывали клетки ИРВ§. После этого в каждую лунку добавляли 200 мкл 0р!1рЬаке 8ирегт1х (Регк1пЕ1тег, #1200439). Планшеты герметично закрывали и инкубировали по меньшей мере в течение 1 ч при комнатной температуре. ³Н-тимидин, ассимилированный клетками, подсчитывали в течение 1 мин с помощью сцинтилляционного счетчика.

Данные одного типичного эксперимента показаны в табл. 11.

- 26 020398

Таблица 11

Ингибирование ассимиляции ^ЗН-тимидина клетками МКЛ45 различными антителами С8- и И11-

	Сред, соб/мин
Доза антител
(нг/мл)	Мд62	О11-8В8	011-2763	ϋ11-517Υ	Ыд64	С8-со16	С8-Н241	С8-6	га1дС	505
20000,0	45054	11239	18407	19752	50628	11738	11425	16387	52448	35086
3333,3	49384	11441	16920	21239	54026	12956	12063	13216	53670	38195
555, 6	51720	11925	15987	20936	54204	13476	13217	18334	54655	39496
92,6	47562	11094	14550	21911	54264	12419	11962	23041	52241	39607
15, 4	50488	24402	28685	39695	53806	22528	23150	44771	51329	49766
2,6	48491	44741	47034	49868	54765	53465	48761	54598	55463	54967
0,4	46468	43334	43998	45304	55330	47485	46645	53389	51549	49563
0,1	44822	41578	41515	44566	53856	45725	44418	51668	47709	51883
0,0	50427	50427	44213	44213	48708	51478	51478	48708	50300	50300
	Станд. ош.
20000,0	2927	114	1265	1206	2491	262	654	282	1845	764
3333,3	2462	732	641	689	1421	388	386	314	1310	1491
555,6	2166	605	578	267	4364	281	341	1116	1192	534
92,6	1835	22	150	564	1733	352	636	475	1036	370
15,4	2144	2024	941	4 63	1376	207	1771	422	1281	968
2, 6	2587	1914	1133	1910	1978	2164	1945	444	919	2577
0,4	2041	650	1177	2551	1501	378	2392	162	438	1943
0,1	1628	1734	1817	2402	678	1340	2442	1589	2092	3143
0,0	1203	1203	841	841	1377	886	886	1377	777	777

Сокращения:

Сред. = среднее; соб./мин = событий/минуту;

Станд. ош. = стандартная ошибка

Эти данные демонстрируют, что различные антитела С8- и И11- по настоящему изобретению ингибируют НСР-независимую пролиферацию клеток МКШ5. что доказывается снижением ассимиляции ^ЗНтимидина. Аналогичные результаты получили на опухолевых клетках δΧυ5 и ХИСС-4, каждые из которых демонстрируют конститутивную сверхэкспрессию и фосфорилирование с-Ме!.

Пример 10. Снижение количества фосфорилированного и общего с-Ме! и дефект отщепления внеклеточного домена с-Ме!п в ответ на антитела к с-Ме!.

В данном примере исследовали, приводит ли обработка клеток МКЛ45 антителами к с-Ме! по настоящему изобретению к снижению фосфорилированного с-Ме! (р-Ме!) и общего с-Ме!. Кроме того, данное исследование использовали для определения того, индуцирует ли обработка антителами к с-Ме! отщепление БСИ с-Ме! в среду, кондиционированную МК^45.

с-Ме! и изотипические контрольные антитела разбавляли культуральной средой (ΚΡΜΙ-1640 (Ιηνί!годеп, #118З5); 10% (об./об.) ΡΒδ Дпуйгодеп, #10082), 2 мМ Ь-глутамина Дпуйгодеп, #250З0); 100 Ед/500 мл пенициллина Ο и 100 мкг/500 мл стрептомицина Дпуйгодеп, #15140)) до 2Х конечных концентраций, указанных в табл. 12, и в каждую лунку 96-луночных планшетов для тканевых культур (Со8!аг, #З596) добавляли 50 мкл 2Х растворов антител. Клетки МКЛ45 (.Гараи Неайй δ^ΐ'^δ Роипйайоп, Неайй δ^η^ Рекеагсй Рекоигсе Вапк, #1СРВ0254) поддерживали на вышеуказанной среде и ресуспендировали в той же среде до концентрации 1х 10⁵ клеток/мл. 50 мкл этой суспензии МКЛ45 добавляли в каждую лунку до количества 5х10^З клеток/лунку. Затем планшеты инкубировали в течение 24 ч при З7°С, 95% относительной влажности и 5% (об./об.) СО₂ и получали клеточные лизаты согласно описанию в примере 7. Кроме того, собирали кондиционированную среду после каждой обработки для количественной оценки БСИ с-Ме!. Уровни р-Ме! и общего с-Ме! в клеточных лизатах определяли с помощью твердофазного ИФА и нормализовали по концентрации белка в лизате (определенной по ВСА, Р1егсе #2З225).

Фосфорилированный р-Ме!.

Фосфорилирование с-Ме! по остаткам тирозина 12З0, 12З4 и 12З5 определяли согласно описанию в примере 7.

Общий с-Ме! и отщепление ИСИ с-Ме!.

Для твердофазного ИФА общего с-Ме! и ЬСИ с-Ме! антитела для захвата с-Ме! разбавляли буфером для иммобилизации (ВюРХ, Глендора, штат Калифорния, США, СОАТ-1000-01) до концентрации 2 мкг/мл. 110 мкл разбавленных антител вносили в каждую лунку планшетов для твердофазного ИФА (Стешет Вю-0пе, Монро, штат Северная Каролина, США, #655081) и инкубировали планшеты в течение ночи при 4°С. Лунки аспирировали, дважды промывали ΤΒδ-Т и затем блокировали 200 мкл блокирующего буфера (ΤΒδ-Τ плюс 2% (вес./об.) БСА) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты

- 27 020398 дважды промывали ΤΒδ-Τ. Затем добавляли лизаты клеток ΜΚ№5, кондиционированную среду ΜΚΉ45 или внеклеточный домен (Εί'.'Ό) с^е( (δΕΟ ΙΌ N0:75) (в качестве стандарта) и инкубировали планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты четырежды промывали ΤΒδ-Τ. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл 0,5 мкг/мл раствора биотинилированных вторых антител (Μ;Φ 505) в блокирующем буфере, которые связывают эпитоп с^еЕ отличающийся от эпитопа антител для захвата, и инкубировали планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты четырежды промывали ΤΒδ-Τ. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой и разведенного 1/12000 (Дасккои ПптипоКехеагсН ЬаЬотаФпек, Вест-Гроув, штат Пенсильвания, США, #016-0З0-084) в блокирующем буфере и инкубировали смесь в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты шестикратно промывали ΤΒδ-Τ. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора З,З',5,5'тетраметилбензидина (ΒίοΡΧ, #ΤΜΒΥ-1000-01) с последующим добавлением 100 мкл раствора стопреагента (ΒίοΡΧ, #ΌδΤΡ-1000-01). Планшеты считывали при длине волны 450 нм с коррекцией при 570 нм на устройстве для считывания планшетов δрес!^аΜаx 190 (ΜοΡα.!!·!!' Оеуюек, Саннивейл, штат Калифорния, США). Стандартную кривую устанавливали, используя 4-параметрический анализ, значения образцов определяли с помощью программы δ0ΡΤтаx Рго З.1.2 (ΜοΡα.!!»· Оеуюек).

Как показано в табл. 12, данные твердофазного ИФА р-Ые! и общего с-Ые! выявили, что обработка ЫаЬ С8-Ю41 максимально снижает р^е! на 77%, а общий с^е! - приблизительно на 67%. Обработка Ο11-8Β8 максимально снижает р^е! приблизительно на 75%, а общий с^е! - на 6З%.

Как отмечено в примере 8, эти данные демонстрируют, что антитела С8- и О11- индуцируют деградацию с^е! и снижают фосфорилирование с^е!.

Данные в табл. 12 также показывают, что обработка антителами к с-Με! С8-Ю41 и Ο11-8Β8 не индуцирует отщепления и сбрасывания ΕΟΌ с-Μεί.

Таблица 12

Действие антител С8- и О11- на фосфорилированный с-Με!, общий с-Με! и отщепление внеклеточного домена с-Με! в лизатах клеток ΜΚ№5 и кондиционированной среде Процент ингибирования фосфорилированного с^е! в ΜΚ№5

	С8-Н241	Ыдб4	О11-8В8	ЫдС2
Доза МаЬ (нг/мл)	сред.	станд. откл.	сред.	станд. откл.	сред.	станд. откл.	сред.	станд. откл.
10000	77,0	2,4	-2,1	10,9	74,8	3,4	14,0	7,1
1000	74,1	1,3	11,1	9,7	72,8	2,0	-4,6	10,9
100	71,7	2,5	13,4	13,3	69,1	3, 7	-7,6	24,4
10	42,3	3,0	5, 8	11,3	37, б	5,5	6, 1	11, 0
	сред.	станд. откл.
без обработки	0, 0	8,0

Процент ингибирования общего с^е! в ΜΚ№5

	С8-Н241	ЫдС4	О11-8В8	ЫдС2
Доза МаЬ (нг/мл)	сред.	станд. откл.	сред.	станд. откл.	сред.	станд. откл.	сред.	станд. откл.
10000	63,1	1,6	-23, 7	4,1	63,0	7,0	14,1	9,1
1000	66,7	4,3	10, 4	16, 0	62,7	0, 6	-2,4	22,4
100	61,5	3,4	-3,7	14,4	62,9	2,5	7,3	9,1
10	32,3	4,9	-3,4	13,5	34,5	8,4	15,1	7,0
	сред.	станд. откл.
без обработки	0,0	25,9

- 28 020398

Уровень ЕСГО с-Ме! в среде, кондиционированной МКШ5 (нг/мл)

	С8-Н241	ЫдС4	О11-8В8	ЫдС2
Доза МаЬ (нг/мл)	сред.	станд. откл.	сред,	станд. откл.	сред.	станд. откл.	сред.	станд. откл,
10000	5, 1	0,5	7,4	0,7	6,2	0,2	7,0	0,1
1000	6, 1	0, 8	7, 6	0, 4	7,2	0,5	7,2	0, 5
100	5,4	0,4	7,6	0, 8	6,9	1,6	7,2	0,6
10	6, 6	0,2	8,4	1,1	6,2	0,4	7,2	0,1
	сред.	станд. откл.
без обработки	8,3	1,0

Пример 11. Агонистическая активность антител в опухолевых клетках СакМ в отсутствие НОР.

Клетки почечно-клеточного рака СакМ пролиферируют в ответ на НОР. В данном примере выполняли проверку активации с-Ме! в клетках СакМ антителами к с-Ме! для оценки агонистической активности антител к с-Ме! по настоящему изобретению.

В лунки 96-луночных планшетов для тканевых культур засевали по 5000 клеток светлоклеточного рака почек человека СакМ (АТСС, #НТВ-46) в культуральной среде Мак-Коя 5А ОпуПгодеп, #16600) с добавлением 10% (об./об.) РВ§, 2 мМ Ь-глутамина (1пуЦгодеп, #25030), 100 Ед/500 мл пенициллина О и 100 мкг/500 мл стрептомицина (1пу1!годеп, #15140). После культивирования в течение 24 ч клетки оставляли голодать в среде с низким содержанием сыворотки (0,5% (об./об.) РВ§) в течение следующих 24 ч. Затем клетки культивировали в присутствии антител к с-Ме! и контрольных антител в среде с низким содержанием сыворотки в конечных концентрациях, указанных в табл. 13, в течение 24 ч при 37°С, 95% относительной влажности, 5% (об./об.) СО₂. В течение последних 6 ч культивирования выполняли импульсное мечение клеток ³Н-тимидином (МР ВютеДюаП, Солон, штат Огайо, США #24066) из расчета 1 мкКи/лунку при 37°С, 95% относительной влажности и 5% (об./об.) С0₂. Затем среду удаляли и однократно промывали клетки ΌΡΒδ. После этого в каждую лунку добавляли 200 мкл ОрДрЬаке 8ирегт1х (Регк1пЕ1тег, #1200-439). Затем планшеты герметично закрывали и инкубировали по меньшей мере в течение 1 ч при комнатной температуре. ³Н-тимидин, ассимилированный клетками, подсчитывали в течение 1 мин с помощью сцинтилляционного счетчика.

Данные одного типичного эксперимента показаны в табл. 13.

Таблица 13

Действие антител С8- и Ό11- на ассимиляцию ³Н-тимидина в клетках СакМ в отсутствие НОР

Сред, соб/мин
Доза антител (нг/мл)	Ыд52	О11-8В8	011-27(13	Ο11-317Υ	Н1дС4	С8-СО16	С8-Н241	СЗ-6	тп1дС	505
20000,0	14658	15866	16054	18616	13704	13112	12797	13194	14224	19893
3333,3	14034	15730	15765	17897	13023	13829	12702	13193	13469	19018
555,6	14048	13997	14536	16620	12393	11359	12116	13494	13200	20043
92,6	14113	13705	14718	15342	12934	11563	12142	12793	13761	15588
15,4	14473	13488	13836	14579	13271	12111	13020	13670	13638	11748
2,6	15517	14097	13325	14867	13858	13713	14407	14126	13766	12520
0,4	14341	14411	13596	14618	13412	14080	14142	14601	14357	12896
0,1	16947	15319	17690	15899	13547	15567	15530	16121	13797	14383
0, 0	14992	14992	15237	15237	14622	13889	14622	13889	14531	14531
	Станд. ош.
20000,0	398	737	549	345	219	642	268	96	465	807
3333,3	358	959	538	466	84	1086	380	382	927	954
555,6	343	809	705	284	478	437	216	4	397	505
92,6	428	502	728	237	447	292	445	212	706	394
15,4	232	737	729	160	437	2 67	305	107	514	318
2,6	386	173	295	404	339	299	291	711	91	221
0,4	357	568	508	392	317	556	656	281	331	323
0,1	262	550	1108	326	381	601	583	536	229	145
0, 0	310	310	394	394	364	554	364	554	238	238

Сокращения: Сред. = среднее; соб/мин = событий/минуту; Станд. ош. = стандартная ошибка

Эти данные демонстрируют, что антитела к с-Ме! С8-Н241, С8-6, С8-со-16 и Ό11-8Β8 не вызывают существенного увеличения поглощения тимидин-[метил-³Н] клетками СакМ по сравнению с изотипическими контрольными 1дО. Э11-С27О3 и Ό11-δ17Υ вызывают слабую, переменную, но статистически значимую стимуляцию поглощения тимидин-[метил-³Н] клетками СакМ по сравнению с изотипически- 29 020398 ми контрольными 1дО. Контрольные агонистические антитела к с-Ме! 5Ό5 индуцируют более выраженное поглощение тимидин-[метил-³Н] клетками Сак1-1, чем настоящие антитела к с-Ме! в тех же экспериментальных условиях.

Пример 12. Агонистическая активность антител в первичных гепатоцитах человека в отсутствие

НОР.

Агонистическую активность настоящих антител к с-Ме! дополнительно оценивали в отсутствие НОР в первичных гепатоцитах человека (РНН), которые являются НОР-чувствительными.

Замороженные, пригодные для высева на планшеты клетки РНН (КЦО Се1818, Чикаго, штат Иллинойс, США, КЭ#00002) размораживали при 37°С и ресуспендировали до концентрации 175000 клеток/мл в среде тУйгоОК0 СР (Се1818, #Ζ99029) со смесью антибиотиков Югрейо (Се1818, #Ζ99000). 0,2 мл ресуспендированных клеток РНН вносили в каждую лунку 96-луночных титрационных микропланшетов, покрытых коллагеном I (ВО, Франклин-Лейкз, штат Нью-Джерси, США, #354407) из расчета 35000 клеток/лунку и инкубировали клетки в течение 24 ч при 37°С, 5% (об./об.) СО₂. Затем удаляли культуральную среду и в каждую лунку добавляли 150 мкл среды шУйгоОК0 Н1 (Се1818, #Ζ99009) со смесью антибиотиков !огребо и добавлением 0,1% (вес./об.) БСА, а также 50 мкл раствора антител к с-Ме! и контрольных антител в диапазоне конечных концентраций от 10 мкг/мл до 0,0032 мкг/мл либо НОР в конечной концентрации 200 нг/мл в среде тУйгоОК0 Н1 со смесью антибиотиков !огребо и добавлением 0,1% (вес./об.) БСА. Клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С, 5% (об./об.) С0₂ и в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора 0,1 мКи тимидин-[метил-³Н]/мл (МР ВютеШсаН Солон, штат Огайо, США, #24066) в течение последних 6 ч инкубирования. Анализируемые планшеты замораживали при -70°С, размораживали при 37°С и собирали на планшеты итРй!ег-96, ОР/С (Регкш Е1тег, Уолтем, штат Массачусетс, США, #6005174) с помощью коллектора Рй!егта!е Нагуе8!ег (Регкш Е1тег). Планшеты ИтРШег высушивали, добавляли 20 мкл сцинтиллятора Мюго8сш! 0 (Регкш Е1тег, #6013611) на лунку и считывали планшеты на жидкостном сцинтилляционном счетчике 1450 М1сгоЬе!а (Регкш Е1тег).

В табл. 14 показаны средние значения со стандартными отклонениями по трем повторам обработки, типичные для трех повторных экспериментов.

Таблица 14

Действие различных антител С8- и Ό11- на ассимиляцию ³Н-тимидина в первичных гепатоцитах человека в отсутствие НОР

		Дозы:
		10 мкг/мл	2 мкг/мл	0,4 мкг/мл	0,08 мкг/мл	0,016 мхг/мл	0,0032	мкг/мл
обработка АЪ	изотип	среднее	станд. ОШ.	среднее	станд. ОШ.	среднее	станд. ОШ.	среднее	станд. ОШ .	среднее	станд. ОШ.	среднее	станд. ош.
О11-8В8	1дС2	1703,7	140,1	1427,0	120,3	1231,0	232,4	1122,7	188,3	715,3	25,8	611,0	61,5
Р11-С27СЗ	1дС2	2145,7	1710	1874,0	443,4	1753,0	199, 8	1283,3	131,6	892,0	109, 3	692,7	23, 0
011-517Υ	1дС2	3155,0	594,2	2566,0	173,1	1911,0	348,3	1458,7	132,7	919,7	47,5	726, 3	131,7
С8-Н241	ТдС4	671,0	61,0	710,3	81,8	681, 3	13,7	669,3	77,0	630,0	37,2	625, 0	65, 5
СЗ-СО-16	1д<34	952,0	36,0	822,0	88,4	670,0	23, 3	767,3	12,6	715,7	12,5	828,7	35,2
С8-6	ТдС4	1042,3	91,3	892,3	107,0	301,7	77,4	792,3	48,4	769,7	109,9	736,3	43,1
505	т1дб1	4978,0	59, 9	4912,3	287,7	3763,7	292,1	3320,7	40,1	1716,3	324,1	321,7	175,3
ЫдС2	изотип. контроль	650,0	39,4	643,7	11,7	711,7	16,6	836, 0	61,0	748,3	57,7	799,7	80, 3
Ъ1дС4	изотип. контроль	647,3	77,1	735,0	33, 8	717,3	19,4	819,0	44,2	848,3	75,1	806, 7	79, 7
т!дС1	изотип. контроль	616,7	24,8	581,0	81,8	601,0	82,0	596,0	78,6	588,7	43,0	675,0	73,0

		сред,	станд. ош.
нсг	200 нг/мл	6292.7	733,0
без обработки	615, 1	83, 9

Эти данные демонстрируют, что, по сравнению с изотипическими контрольными 1дО, настоящие антитела к с-Ме! С8-Н241 не вызывают существенного увеличения поглощения тимидин-[метил-³Н] клетками РНН; С8-6, С8-со-16, Э11-8В8, Э11-С27О3 и Ό11-817Υ вызывают слабую, переменную, но статистически значимую стимуляцию поглощения тимидин-[метил-³Н]. Однако агонистическая активность настоящих антител к с-Ме! значительно ниже, чем у контрольных антител к с-Ме! 5Ό5. Агонистические антитела 5Ό5 стимулируют пролиферацию РНН в зависимости от дозы, с 5-кратным увеличением в концентрации 3 мкг/мл. В концентрации 200 нг/мл НОР стимулирует 5-кратное увеличение поглощения ³Н-тимидина. МаЬ С8-Н241 не индуцирует пролиферации даже в концентрации 10 мкг/мл.

Аналогичные результаты получили для клеток эпителия почек человека НК2, которые также пролиферируют в ответ на стимуляцию НОР.

Пример 13. Действие антител на тубулярный морфогенез в клетках НерО2 в отсутствие НОР.

НОР индуцирует тубулярные морфогенетические изменения в клетках НерО2, выращенных на Ма!п§е1™ (ВесЮп-Оюкиъоп, #354234), материале внеклеточного матрикса, содержащем компоненты ба- 30 020398 зальной мембраны. В данном эксперименте проводили оценку НОР-подобной агонистической активности антител по настоящему изобретению в отношении индукции тубулярных морфогенетических изменений в клетках НерО2.

Клетки НерО2 (АТСС, #НВ-8065) культивировали на ЭМЕМ с добавлением 10% РΒδ. 100 мкл раствора Ма!пде1™ (Ма!пде1™, Βес!οη-^^ск^ηδοη), разбавленного Ор1-МЕМ1 (ΙηνίίΓο^η, #31985) с добавлением 10% (об./об.) РΒδ, 2 мМ Ь-глутамина (ΙηνίίΓο^η, #25030), 100 Ед/500 мл пенициллина О и 100 мкг/500 мл стрептомицина (ΙηνίϋΌ^η, #15140) вносили в лунки 96-луночных планшетов для тканевых культур ^οδ^Γ, #3596). После затвердевания раствора Майде1™ добавляли 2000 клеток НерО2 в 50 мкл культуральной среды с добавлением 10% сыворотки. Затем к клеткам добавляли антитела к с-Ме! и контрольные антитела в конечной концентрации 50 мкг/мл или НОР в конечной концентрации 50 нг/мл. Клетки выращивали в течение 4 суток при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% (об./об.) СО₂. Через 4 суток верхнюю среду удаляли и замещали 50 мкл 1 мг/мл раствора р-иоднитротетразолиевого фиолетового ^1дта, #18377) в ΡΒδ и инкубировали клетки в течение следующих 48 ч при тех же условиях. Делали фотографии окрашенной области 32 мм и анализировали их с помощью 1таде-Рго Р1их 6 (МеЛа СуЬетеЕсх, 1пс., МО).

Данные одного типичного эксперимента при концентрации антител 50 мкг/мл показаны в табл. 15.

Таблица 15

Действие антител С8- на тубулярный морфогенез в клетках НерО2

Антитело (50 мкг/мл)	Н1дС4	С8-Н241	С8-со16	С8-6	т!дС	565	нег (50 нг/мл)
Тубулярный морфогенез	стимуляции нет	стимуляции нет	стимуляции нет	1,2	1,2	4,9	5,4
Агонистическая активность
(стимуляция, разы)

Эти данные демонстрируют, что НОР и контрольные агонистические антитела 5Ό5 индуцируют тубулярные морфогенетические изменения в клетках НерО2 приблизительно в 5-кратном размере по сравнению с изотипическим контролем. В противоположность этому настоящие антитела к с-Ме! С8-Н241 и С8-со-16 не индуцируют значительных тубулярных морфогенетических изменений в клетках НерО2 в тех же условиях, в то время как антитела к с-Ме! С8-6 индуцируют лишь слабый уровень стимуляции.

Аналогичные результаты получили при использовании МаЬ Э11-8-В8.

Пример 14. Действие антител на подвижность клеток: анализ рассеивания ЭШ45 и анализ зарастания царапины клетками Н441.

При стимуляции НОР клетки рака предстательной железы ЭШ45 отделяются друг от друга, а клетки Н441 заполняют царапину, сделанную в сплошном слое клеток. Клетки Н441 демонстрируют высокий уровень экспрессии с-Ме! и конститутивное фосфорилирование этого рецептора, но остаются НОРчувствительными. В следующем эксперименте оценивали агонистический эффект антител по настоящему изобретению в отношении подвижности клеток с помощью анализа рассеивания и анализа зарастания царапины.

Анализ рассеивания клеток ЭШ45.

Клетки Όυ145 (АТСС, # НТВ-81), выращенные на среде МЕМ (ΙηνίϋΌ^η, #11095)+10% РΒδ (Ιηνί1годе1Т #10082) при 37°С и 5% (об./об.) СО₂ высевали из расчета 2х10³ клеток/лунку в объеме 70 мкл в черные 96-луночные планшеты У1е\\Р1а1е (Регкш Е1тег, Уолтем, штат Массачусетс, США, #6005182) и инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% (об./об.) СО₂. Антитела к с-Ме! и контрольные антитела разбавляли средой для культивирования клеток и добавляли в конечной концентрации 20 мкг/мл, а НОР добавляли в конечной концентрации 20 нг/мл; и антитела, и НОР добавляли в объеме 30 мкл в двенадцати повторностях и инкубировали в течение 48 ч при 37°С и 5% (об./об.) СО₂. Затем среду удаляли и фиксировали клетки в 2% формальдегиде в течение 15 мин при комнатной температуре. Лунки трижды промывали ΡΒδ и добавляли 50 мкл 5 ед/мл раствора фаллоидина А1еха Ейюг 488 (^йгодещ #А12379) на 30 мин при комнатной температуре. Лунки трижды промывали ΡΒδ и добавляли 50 мкл 15 мкМ пропидиумиодида Д^йгодещ #Р3566). Затем планшеты считывали на флуоресцентном микропланшетном цитометре с лазерным сканированием Аситеη ЕхрИгег™ (ПР ЬаЬ!есй Ь!й., Кембридж, штат Массачусетс, США) с помощью программы .^скухх для определения процента клеток Όυ145 в колониях.

Результаты представлены в табл. 16.

- 31 020398

Таблица 16

Действие антител С8- и Ό11- на рассеивание клеток Όυ 145

С8-со-16, С8-6 или Э11-8В8 в значительной степени стимулируют рассеивание/подвижность клеток Όυ145.

Анализ зарастания царапины клетками Н441.

Для анализа зарастания царапины Н441 клетки Н441 (АТСС, # НТВ-174) выращивали на РРМ11640 (1п\'Пгодеп, #11835); 10% (об./об.) РВ8 (1п\'Пгодеп, #10082); 2 мМ Ь-глутамина (1п\'Пгодеп, #25030), 100 Ед/500 мл пенициллина О и 100 мкг/500 мл стрептомицина (1п\'Пгодеп, #15140)) и высевали в культуральную среду из расчета 1 х 10⁶ клеток/2 мл/лунку в лунки 6-луночных планшетов для тканевых культур (Со§!аг, #3598). Планшеты инкубировали в течение 3 суток при 95% относительной влажности и 5% (об./об.) СО₂. Затем среду удаляли и оставляли клетки голодать в среде с низким содержанием сыворотки (0,5% (об./об.) РВ8 в среде КРМ1) в течение 16 ч. Сплошной слой клеток на дне лунок царапали 5-мл наконечником пипетки в центре каждой лунки и аспирировали плавающие клетки. Оставшиеся клетки промывали 1Х средой с низким содержанием сыворотки. Добавляли среду с низким содержанием сыворотки и получали изображения областей царапины с помощью светлопольного микроскопа с 4Х объективом. Эти промежутки обозначали как промежутки на момент времени 0 ч.

К клеткам добавляли тестируемые антитела в конечной концентрации 10 мкг/мл с последующим инкубированием при 37°С и 5% (об./об.) СО₂ в течение 16 ч. НОР тестировали в конечной концентрации 200 нг/мл. Каждую обрабатываемую группу тестировали по меньшей мере в дублируемых лунках. Через 16 ч вновь получали изображения областей царапин помощью светлопольного микроскопа. Эти промежутки обозначали как промежутки на момент времени 16 ч.

Действие антител к с-Ме! или НОР на движение клеток Н441 при заполнении промежутков рассчитывали следующим образом:

Средний процент изменений =

Обрабатываемая группа (промежуток на момент 0 часов - промежуток на момент 16 часов] __и___ хЮО

Среднее по группе со средой (промежуток на момент 0 часов - промежуток на момент 1€ часов)

Результаты представлены в табл. 17.

Таблица 17

Действие антител С8- при анализе зарастания царапины Н441

Антитело (10 мкг /мл)	Сред. %	Станд. откл.
Среда	100	7
ЫдС4	98	9
С8-Н241	98	9
С8-6	102	4
ш1дС1	98	13
МаЬ 505	244	4
НСГ (200 нг/мл)	364	9

Данные демонстрируют, что агонистические МаЬ к с-Ме! 5Ό5 и НОР стимулируют движение клеток Н441/заполнение областей царапин. При тех же условиях МаЬ к с-Ме! С8-Н241 и С8-6 не стимулируют подвижность клеток Н441.

Пример 15. Действие антител к с-Ме! на инвазивность клеток НерО2.

НОР и агонистические антитела к с-Ме! стимулируют инвазию клеток, несущих с-Ме!. В этом при- 32 020398 мере проверяли агонистическую активность настоящих антител к с-Ме! при анализе инвазии клеток, используя клетки НерС2, которые являются НОР-чувствительными при анализе инвазии.

Клетки НерО2 (АТСС, #НВ-8065) оставляли голодать в течение ночи в среде МЕМ, не содержащей сыворотки ОпуПгодеп, #11095), а затем добавляли 5х10⁴ клеток в общем объеме 500 мкл в каждую лунку верхнего отсека камеры для инвазии с та!пде1 (ΒΌ, Франклин-Лейкз, штат Нью-Джерси, США, #3544 83), причем нижний отсек содержал антитела в общем объеме среды, не содержавшей сыворотки 750 мкл, в концентрации 10 мкг/мл, либо НОР в среде, не содержавшей сыворотки в концентрации 50 нг/мл, с последующим инкубированием в течение 48 ч при 37°С и 5% (об./об.) С0₂. Неинвазирующие клетки удаляли из верхнего отсека тампоном, затем фиксировали мембрану 95% этанолом и окрашивали 0,2% (вес./об.) кристаллическим фиолетовым. После промывки и высушивания подсчитывали количество инвазирующих клеток с помощью программы анализа Ппаде-Рго Р1и8 6 Мапиа1 Тад (МеЛа СуЬегпейс8, Юс., МО) на фотографиях окрашенных клеток, сделанных с 2,5 х объективом.

Результаты обобщены в табл. 18.

Таблица 18

Действие антител С8-, С8 и 011 на инвазивность клеток Нер62

Концентрация антител (мкг/мл)	Среднее количество клеток в поле 2,5х
ЫдС4	С8- Н241	С8	т1дС1	орЕИ11	5ϋ5	НСГ (50 нг/мл)	Среда
10,00	5,5	3,5	4,3	5,5	19, 8	85,0	509,5	3,5
	Станд. ОШ.
	0,5	0,9	1,3	0,5	4,1	20, 4	4,5	0,5

Данные демонстрируют, что агонистические МаЬ к с-Ме! 505 и НОР, но не МаЬ к с-Ме! С8-Н241 и С8 (мышиные) стимулируют инвазию клеток НерО2. Мышиные МаЬ к с-Ме! орГО11 слабо индуцируют инвазию клеток НерО2.

Пример 16. Антитела С8- и 011- не защищают клетки Сак1-1 от апоптоза, индуцированного стауроспорином.

НОР и агонистические антитела к с-Ме! защищают клетки от гибели клеток, индуцированной стауроспорином. В данном примере проверяли агонистическую активность антител к с-Ме! по настоящему изобретению при анализе апоптоза, индуцированного стауроспорином, используя НОР-чувствительные клетки Сак1-1.

Клетки Сак1-1 (АТСС, #НТВ-46) выращивали согласно описанию в примере 11, высевали в культуральную среду из расчета 1х 10⁴ клеток/лунку на 96-луночные планшеты (Со8!аг, #3596) и проводили предобработку антителами (разбавленными от 30000 до 3 нг/мл в среде для культивирования клеток) или НОР (разбавленным от 225 до 0,02 нг/мл) в течение 1 ч с последующей обработкой 0,1 мкМ стауроспорином (конечная концентрация) в течение 48 ч при 37°С. Среду удаляли и лизировали клетки в течение 30 мин 0,2 мл лизирующего буфера из комплекта Се11 ОеаЮ Ое!ес!юп ЕЫ8А кН (КосЬе АррНеД 8аепсе, Индианаполис, штат Индиана, США, #11774425001). Этот комплект использует 20 мкл каждого лизата для измерения клеточной гибели путем определения цитоплазматических связанных с гистонами фрагментов ДНК по поглощению при длине волны 450 нм. Более высокие значения оптической плотности при 450 нм означают более выраженный апоптоз.

Результаты, показанные в табл. 19, демонстрируют, что НОР, но не МаЬ к с-Ме! С8-Н241, С8-6 и Ο11-8Β8, защищает клетки Сак1-1 от апоптоза, индуцированного стауроспорином.

- 33 020398

Таблица 19

Действие антител к с-Ме! на апоптоз, индуцированный стауроспорином, в клетках СакМ

Доза антител (нг/мл)	Средняя А450 ни
ЫдС4	С8-Н241	С8-6	Н6Г	Ыд02	ϋ11-6Β8	Среда	5ТЗ*
3	0,95	0, 83	1,09	0,97 (0,02 нг/мл)	0, 95	1,02	0, 24	0,87
30	0,98	0, 84	1,02	0,93 (0,23 нг/мл)	0, 91	0,91
300	0, 87	0, 86	0,97	0,73 (2,25 нг/мл)	0, 95	0,81
3000	0, 98	0, 85	0, 92	0,58 (22,5 нг/мл)	0, 95	0,91
30000	0/ 91	0, 90	0, 96	0,45 (225 нг/мл)	0,94	0, 87
	Станд. ош.
3	0,03	0, 02	0,19	0,02	0, 07	0, 01	0,01	0,03
30	0,03	0, 01	0,14	0,06	0,00	0, 11
300	0,10	0, 03	0, 06	0,03	0,02	0, 02
3000	0,04	0,01	0,12	0,01	0,06	0, 02
30000	0, 00	0, 01	0,13	0,06	0, 04	0,03

δΤδ*: Стауроспорин

Пример 17. Действие антител С8- на ангиогенез.

НСР и агонистические антитела к с-Ме! стимулируют ангиогенез. Антитела к с-Ме! по настоящему изобретению проверяли на функциональные агонистические свойства при анализе образования трубок в совместной культуре Λ^δС/ΕСРС. Стволовые клетки, происходящие из жировой ткани (А^δС) экспрессируют НСР; эндотелиальные колониеобразующие клетки (ЕСРС) образуют трубчатые структуры в ответ на стимуляцию НСР.

АЭСЪ (Ьоп/а, Эллендейл, штат Нью-Джерси, США, # РТ-5006) диссоциировали, ресуспендировали в минимальной среде (среда МСЭВ-131 ^дта, Сент-Луис, штат Миссури, США, #М8537)) с добавлением 30 мкг/мл 2-фосфата Ь-аскорбиновой кислоты ^1дта #А8960), 1 мкМ дексаметазона ^1дта #Ό4902), 50 мкг/мл тобрамицина ^1дта #Т4014), 10 мкг/мл г-трансферрина АР Се11 Рпте (МПНроте #9701) и 10 мкг/мл №се11ш (рекомбинантный инсулин человека, ЬШу), высевали из расчета 4х 10⁴ клеток/лунку в 96луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% (об./об.) С0₂. Среду удаляли и добавляли 500 мкг/мл раствор гепарина натрия ^дта, #Н3393) в минимальной среде по 100 мкл/лунку; затем клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Лунки аспирировали, однократно промывали 100 мкл минимальной среды и добавляли ЕСРС следующим образом: ЕСРС (ЕпДСепйот ТесЬпо1од1е8, 1пс., Индианаполис, штат Индиана, США, #ЕСТ-ЕСРС100506) диссоциировали, промывали в минимальной среде и добавляли из расчета 4х10³ клеток/лунку на поверхность ΛϋδΡ в 96-луночные планшеты. Через 4 ч инкубирования при 37°С НСР и антитела разбавляли средой для культивирования клеток и добавляли в отдельные лунки в следующих конечных концентрациях: НСР: 100 нг/мл; антитела: 10 мкг/мл. Также добавляли антитела к НСР (К&ТО δу8!ет8 #ЛВ-294-ЫА) в конечной концентрации 10 мкг/мл. Клетки инкубировали в течение следующих 4 суток при 37°С. Лунки аспирировали и добавляли 100 мкл/лунку 1% параформальдегида с последующим инкубированием в течение 20-30 мин. Клетки трижды промывали ΡΒδ-БСА (0,1% БСА, 1пуЦтодеп #152 60-037) и обрабатывали 50 мкл 1 мкг/мл раствора антител к СГО31 человека (К&ГО δу8!ет8, #АР806) в течение 1 ч при 37°С или в течение ночи при 4°С. Клетки дважды промывали ΡΒδ-БСА (0,1% БСА, 1пуЦтодеп #15260-037) и обрабатывали 50 мкл 4 мкг/мл раствора конъюгата антител к 1дС овцы с А1ехаР1иог488 (1пу1!тодеп, #А11015) в течение 1 ч при комнатной температуре. Клетки дважды промывали ΡΒδ-БСА, окрашивали 100 мкл красителя НоесБ8!3342 и считывали на Се11от1с8 Λ^^ауδсаη (ТБетто Р|8Нег δαοιΙίΓία Уолтем, штат Массачусетс, США). Для определения общей площади трубок, которая используется для оценки действия различных антител и НСР на стимуляцию ангиогенеза, применяли программу νΗСδ νί^№ версии 1.4.6. Результаты представлены в табл. 20.

- 34 020398

Таблица 20

Действие антител С8- на образование трубок клетками ЕРСР

Общая площадь трубок
	Минимальная среда	ЫдС4	С8-Н241	С8-6	га1д61	505	АЬ к НСГ	Н6Г
Сред.	67753,3	90134,3	22979,7	65224,0	125538,3	147237,3	22824,3	212104,7
Станд. откл,	24221,6	17741,1	604,9	18275,9	34702,4	18748,1	6586, 0	16588,5

Результаты демонстрируют, что С8-Н241 и С8-6 не стимулируют образование трубок по сравнению со средой или соответствующими им изотипическими контрольными антителами, в то время как НОР и агонистические МаЬ 5Ό5 в значительной степени стимулируют образование трубок.

Пример 18. Ингибирование НОР-независимого и НОР-зависимого роста опухолевых клеток в моделях ксенотрансплантатов.

Ингибирование НОР-независимого и НОР-зависимого роста опухолевых клеток антителами к с-Ме! по настоящему изобретению проверяли путем анализа ίη У1уо, используя модели ксенотрансплантатов клеток МКШ5 и И87МО (глиобластома человека) у мышей соответственно. Клетки МКШ5 конститутивно экспрессируют высокие уровни с-Ме! и фосфорилирования с-Ме! в отсутствие НОР. Клетки И87МО секретируют НОР аутокринным путем и являются НОР-чувствительными.

Клетки МКШ5 (1арап Неа1!й δ^ΐ'^κ Роипбайоп, Неа1!й δ^ΐ'^ Кекеагсй Кекоигсе, #1ΟΚΒ0254) наращивали согласно описанию в примере 8, обрабатывали трипсином для получения отдельных клеток, собирали и ресуспендировали в ΡΒδ. Два миллиона клеток МКШ5 в ΡΒδ подкожно вводили в заднюю часть тела бестимусных голых мышей (Наг1ап, Индианаполис, штат Индиана, США). Антитела к с-Ме! и соответствующие антитела 1дО2 и 1дО4 разбавляли ΡΒδ, рН 7,2, и еженедельно вводили внутривенно, начиная с 3 по 7 сутки после имплантации опухолевых клеток в концентрациях 1, 5 или 20 мг/мл. Ингибирование роста опухолевых клеток определяли путем замера диаметра в трех измерениях для определения объема опухолей два раза в неделю в ходе курса лечения. Для общего измерения токсичности измеряли массу тела.

Клетки И87МО (АТСС, #НТВ-14) выращивали на среде МЕМ (1пуйгодеп, #11095) при 37°С, обрабатывали трипсином для получения отдельных клеток, собирали и ресуспендировали в ΡΒδ Опуйгодеп # 14190). Пять миллионов клеток подкожно вводили в заднюю часть тела бестимусных голых мышей (Наг1ап, Индианаполис, штат Индиана, США). Антитела к с-Ме! разбавляли в ΡΒδ и еженедельно вводили внутривенно в дозах, указанных в табл. 22, начиная через 7 суток после имплантации опухолевых клеток. Контрольные антитела 1дО4 вводили в концентрации 10 мг/кг. Ингибирование роста опухолевых клеток определяли путем замера диаметра в трех измерениях для определения объема опухолей два раза в неделю в ходе курса лечения. Для общего измерения токсичности измеряли массу тела.

Противоопухолевая эффективность четырех антител - Ό11-8Β8, С8-Н241, С8-6 и С8-со-16 в модели ксенотрансплантата клеток МКШ5 обобщена в табл. 21. Максимальный % ингибирования представляет собой процент ингибирования опухолевого роста по сравнению с лечением соответствующими контрольными антителами (0% ингибирования).

В дозах 5 или 20 мг/кг все четыре антитела к с-Ме! вызывают значительное ингибирование роста опухолевых клеток МКШ5 по сравнению с соответствующими им изотипическими контрольными 1дО.

Таблица 21

Действие антител С8- и Ό11- на НОР-независимый опухолевый рост МКШ5 ш У1уо

Антитело	Уровень дозы (мг/кг)	Максимальный % ингибирования	Значение р
О11-8В8	5	53	р<0,05
	20	56	р<0,01
С8-Н241	1	39	Н . 3 .
	5	63	р<0,01
	20	51	р<0,05
СЭ-6	1	60	р<0,001
	5	59	р<0,01
	• 20	73	р<0,001
СЗ-Со-16	1	36	Н.з.
	5	60	р<0,001
	20	35	р<0,001

- 35 020398

Дозозависимое ингибирование роста опухолевых клеток С8-Н241 также наблюдали на модели ксенотрансплантата НОР-независимых клеток И87МО, что обобщено в табл. 22. Максимальный % ингибирования представляет собой процент ингибирования опухолевого роста по сравнению с лечением соответствующими контрольными антителами 1дО4 (0% ингибирования).

Таблица 22

Действие антител С8-Н241 на НОР-зависимый опухолевый рост И87МО ш νί\Ό

Антитело	Уровень дозы (мг/кг)	Максимальный % ингибирования	Значение р
С8-Н241	0,1	45,2	н. 3,
С8-Н241	0,3	86, 8	р<0,001
С8-Н241	1	91,9	р<0,001
С8-Н241	3	91	р<0,001
С8-Н241	10	94, 8	р<0,001

При 5 и 20 мг/кг антитела С8-Н241 также ингибируют опухолевый рост ксенотрансплантата немелкоклеточного рака легких на 58% и 60%, соответственно. Клетки Н441 демонстрируют высокий уровень экспрессии с-Ме! и конститутивное фосфорилирование с-Ме!, но остаются чувствительными к НОР.

Пример 19. Снижение общего и фосфорилированного с-Ме! с помощью антител в ксенотрансплантатах опухолей МКШ5.

В данном примере исследовали активность антител С8-Н241 к с-Ме! в отношении общего с-Ме! и фосфорилированного с-Ме! ш νί\Ό на мышах, несущих ксенотрансплантаты опухолей МКШ5 (НОРнезависимых). Дозозависимое снижение и общего с-Ме!, и фосфорилированного с-Ме! (по тирозину 1349) наблюдали через 24 ч после введения антител.

Клетки МКШ5 наращивали согласно описанию в примере 8, обрабатывали трипсином и собирали. Два миллиона клеток МК№5 в РВ8 подкожно вводили в заднюю часть тела бестимусных голых мышей (Наг1ап, Индианаполис, штат Индиана, США). Антитела С8-Н241 к с-Ме! разбавляли РВ8, рН 7,2 и внутривенно вводили через восемь суток после имплантации опухолевых клеток в концентрациях 2,5, 5, 10, 20 и 40 мг/кг. Контрольные антитела Ы§О4 вводили в концентрации 40 мг/кг. Через 24 ч обработки опухоли удаляли, мгновенно замораживали, временно хранили при -80°С и лизировали в лизирующем буфере (5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 5 мМ этиленгликоль-бис-(Ь-аминоэтил)Ν,Ν,Ν',Ν'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА), 50 мМ НЕРЕ8, 20 мМ пирофосфата натрия (ТЬеттоР15Ьег8с1епййс, #8390-500), 150 мМ №С1, 20 мМ NаΡ, 1% (об./об.) октилфеноксиполиэтоксиэтанол (ТКIТ0N®-X 100), полный ингибитор протеаз, не содержащий ЭДТА (КосЬе, Базель, Швейцария, # 1836153), смесь ингибиторов фосфатаз I (8щта #Р2850) и смесь ингибиторов фосфатаз II (81дта #Р5726)).

Твердофазный ИФА общего с-Ме!.

Для твердофазного ИФА общего с-Ме! антитела для захвата с-Ме! разбавляли в буфере для иммобилизации Вир Н (ТЬегто Р15Ьег Бшепййс, Уолтем, штат Массачусетс, США, #28382) до концентрации 2 мкг/мл. 100 мкл разбавленных антител вносили в каждую лунку планшетов для твердофазного ИФА (ТЬеттоР15Ьег8с1епййс, Уолтем, штат Массачусетс, США, #439454) и инкубировали планшеты в течение ночи при 4°С. Лунки аспирировали, дважды промывали ТВ8-Т и затем блокировали 200 мкл блокирующего буфера (ТВ8-Т плюс 2% (вес./об.) БСА) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты дважды промывали ТВ8-Т. Затем добавляли разбавленные лизаты опухолей или внеклеточный домен с-Ме! (аминокислоты 25-932 последовательности 8ЕО ΙΌ Ν0: 75) и инкубировали планшеты в течение ночи при 4°С. Затем планшеты трижды промывали ТВ8-Т. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл 0,5 мкг/мл раствора биотинилированных МаЬ 5Ό5 (в качестве вторых антител к с-Ме!, которые связывают эпитоп с-Ме!, отличающийся от эпитопа антител для захвата), разбавленных блокирующим буфером, и инкубировали планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали ТВ8-Т. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой и разведенного 1/10000 Оасккоп IттиπоКе5еа^сЬ ЬаЬога!ойе5, Вест-Гроув, штат Пенсильвания, США, #016-030-084) в блокирующем буфере и инкубировали смесь в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали ТВ8-Т. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора 3,3',5,5'тетраметилбензидина (ВюРХ, #ТМВ\У-1000-01) с последующим добавлением 100 мкл раствора стопреагента (ВюРХ, #Ь8ТР-1000-01). Планшеты считывали при длине волны 450 нм на ридере для планшетов 8рес!гаМах 250 (Мо1еси1аг ^еν^се5, Саннивейл, штат Калифорния, США) с помощью программы 80РТтах Рго 3.1.2 (Мо1еси1аг Оеуюек).

Твердофазный ИФА фосфорилированного с-Ме!.

Для твердофазного ИФА фосфорилированного с-Ме! антитела для захвата с-Ме! разбавляли в бу- 36 020398 фере для иммобилизации Вир Н (ГНетю Р18кег 8с1ей1Йс, Уолтем, штат Массачусетс, США, #28382) до концентрации 2 мкг/мл. 100 мкл разбавленных антител вносили в каждую лунку планшетов для твердофазного ИФА (ΤΕπηοΡίδΕιΕ^ηΙίΠα Уолтем, штат Массачусетс, США, #439454) и инкубировали планшеты в течение ночи при 4°С. Лунки аспирировали, дважды промывали ΤΒ8-Τ и затем блокировали 200 мкл блокирующего буфера (ΤΒ8-Τ плюс 2% (вес./об.) БСА) в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты дважды промывали ΤΒ8-Τ. Затем добавляли лизаты клеток М1<У45 и инкубировали планшеты в течение ночи при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали ΤΒ8-Τ. В каждую лунку добавляли 100 мкл 0,5 мкг/мл раствора антител к с-Ме! р¥1349 (Се11 81дпа1т§ ΤесЬηο1ο§у, Данверс, штат Массачусетс, США, #3121), разбавленного блокирующим буфером, и инкубировали планшеты в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали ΤΒ8-Τ. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл антител к Ι§Ο кролика, конъюгированных с пероксидазой и разведенных 1/10000 (1аск8оп ПптипоКезеагск ЬаЬога!о1ге8, Вест-Гроув, штат Пенсильвания, США, #111-035-144) в блокирующем буфере и инкубировали смесь в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты трижды промывали ΤΒ8-Τ. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ΒωΡΧ, #ΤМΒV-1000-01) с последующим добавлением 100 мкл раствора стоп-реагента (ΒώΡΧ, #Ε8ΤΡ1000-01). Планшеты считывали при длине волны 450 нм на считывающем устройстве для планшетов 8рес!гаМах 250 (Мо1еси1аг Оеуюез, Саннивейл, штат Калифорния, США) с помощью программы 80ΡΤтах Рго 3.1.2 (Мо1еси1аг Оеуюез).

Результаты показаны в табл. 23.

Данные демонстрируют, что обработка ксенотрансплантатов опухолей МΚN45 МаЬ С8-Н241 ш νίуо в течение 24 ч при этих условиях максимально снижает общий с-Ме! приблизительно на 43%, а фосфорилированный с-Ме! - приблизительно на 73%.

Таблица 23

Снижение общего и фосфорилированного с-Ме! в ксенотрансплантатах опухолей МΚN45 через 24 ч после обработки антителами С8-Н241 к с-Ме! ш утуо Снижение общего с-Ме!

% ингибирования		С8-Н241	Ыд64
	РВ5	2,5 м/к	5 м/к	10 м/к	20 м/к	40 м/к	40 м/к
средний % ингибирования	-88,51	-8,43	4,26	25,07	42,85	30,62	0,00
станд. откл. % ингибирования	62,63	-8,43	36, 34	26, 38	17,67	35,95	41,23
Снижение фосфорилированного с-Ме£.
% ингибирования		С8-Н241	МдС4
	РВ5	2,5 м/к	5 м/к	10 м/к	20 м/к	40 м/к	40 м/к
средний % ингибирования	12,16	22,89	17, 56	53,21	67,04	73,42	0,00
станд, откл. % ингибирования	23,89	22,89	37, 05	9,90	6,58	7,04	48,81

м/к: мг/кг

- 37 020398

Аминокислотные и нуклеотидные последовательности Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи

Ο11-517Υ (ЗЕЙ 10 N0:1)

Е1УЬТЙ5РСТЬЗЕЗР6ЕЕАТЬЗСЗУ53513гТНЪНИ¥ЙЙКРСЙАРЕЪЫ¥6ТЗ¥ЪА86

РРОКГЗСЗСЗСТОГТЬ'ПЗКЪЕРЕОЕАУУУСООЮЗЗУРУЗЕ’бОСТКЪЕИ;

О11-8В8 (ЗЕЙ ГО N0:2)

ЕТУТТЙЗРСТЬЗТЗРбЕЕАТЪЗСЗУЗЗЗГЗЗТИЕНИУЙЙКРСЙАРКЪЫУСТЗУТАЗС

1РОЕЕЗСЗСЗСТОГТЬТ13ЕЬЕРЕОЕАУ¥¥СЙЙНЗЗУР¥5ЕСЙСТКЪЕ1К

011-С2763 (ЗЕЙ ю N0:3)

Е17ЬТЙЗРСТЬЗЬЗР6ЕКАТЬЗСБУ333133ТИЕНН¥ЙЙКРСЙАРКЬЫ¥6Т5ЕЪИЗС

1Р0ЕГЗЕ5ЕЗСТПГТЬТ15КЬЕРЕ0ГАУ¥¥СЙЙНЗЗ¥Р¥ЗГ6ЙСТКЪЕ1К

С8-6 (ЗЕЙ ГО N0:4)

О1ЙМТЙЗРЗЗЬЗАЗУС0ЕУТ1ТСЗУ533У351¥ЪНИ¥ЙЙКРСКАРКЫ1¥ЗТ5НЪА5<э νΡ8Κ£’56£683ΤϋΕ’ΤΙ₁ΤΙ58Ι,0ΡΕ0ΓΑΤΥΥ<:ΐς)Υ36ΥΡΙ,ΤΓΕ6ΘΤΚνΕΙΚ

С8-Н241 (ЗЕЙ Ю N0:5)

О1ЙМТЙ5Р35Ь5А5УеОВУТ1ТС5У535УЗЗХУЬНМ¥ЙЙКР6КАРКЬЫ¥ЗТ5МЬАЗе

УРЗЕЕЗСЗС5СТПЕТЬТ133ЬЙРЕ0ЕАТУУСЙУ¥ЗСУРЬТГеССТКУЕ1К

С8-ОО-16 (ЗЕй ГО N0:6)

ОГОМТЙЗРЗЗЬЗАЗУСОЕУПТСЗУЗЗЗУИЗХУЪНЙУЙЙКРСКАРКЪНУЗТЗИЪАЗС νΡ3ΚΓ56365<3ΤϋΓΤΙ,ΤΙ33Ι.0ΡΕ0ΓΑΤΥΥ0ανΥΚ6ΥΡΙ.ΙΤ666ΤΚνΕΙΚ

Последовательности нуклеиновых кислот вариабельных областей легкой цепи

Ο11-317Υ (ЗЕЙ ГО N0:7)

ЕАААТТСТЕТТЕАСССАЕТСТССАЕЕСАСССТЕТСТТТСТСТССАеебСАААЕАСССА

СССТСТССТССАСТСТСАОСТ СААСТАТААСТТССАСС ДАСТТАСАСТЕСТАС САССАСАААС СТЕЕССАЕЕСТ С С САБССТ С СТСАТСТАТЕЕСАСАТССТАТ СТСССТТ СТСССАТ С ССАСАСА

СОТТСАеТСССАСТСССТСТСЕЕАСАеАСТТСАСТСТСАССАТСАССАеАСТееАеССТСААе

АТТТТеСАСТСТАТТАСТСТСААСАСТСЕАеТАСТТАССССТАСАСТТТСССССААСССАССА

АСТТСЕАСАТСААА

011-8ΒΘ (ЗЕЙ ГО N0:8)

САААТТСТСТТСАСССАСТСТССАСССАСССТСТСТТТСТСТССАССССАААСАСССА

СССТСТССТССΑΘΤ СТСАОСТ СААСТАТААСТТССАССААСТ ТАСАСТ ССТАСС АССАЕ АААС

СТССССАСССТСССА6ССТССТСАТСТАТСССАСАТССТАССТСССТТСТСССАТСССАСАСА

ССТТСАСТСССАЕТСССТСТСССАСАСАСТТСАСТСТСАССАТСАССАСАСТССАСССТСААС

АТТТТССАСТСТАТТАСТСТ СААСАСТООАСТАСТТАСС С СТАСАСТТТ С6СС СААСССАССА

- З8 020398

АСТТССАСАТСААА

Р11-С27еЗ (ЗЕЙ Ю N0:9)

САААТТ0ТСТТ0АСССАСТСТССАСССАСССТСТСТТТСТСТССАССССАААЗАСССА

СССТСТССТССАСТеТСАССТСААСТАТААСТТССАССААСТТАСАСТССТАССАССАбАААС

СТССССАСССТСССАС6СТССТСАТСТАТеССАСАТССАСАСТ6АеАТСТ6ССАТСССА6АСА

06ТТСА6ТееСАСТеебТСТ0ССАСАСАСТТСАСТСТСАССАТСАеСАСАСТ66АСССТ6ААС

АТТТТбСАеТбТАТТАСТСТСААСАСТСОАбТАСТТАСССеТАСАеТТТСбСССААСССАССА

АСТТС6АСАТСААА

С8-6 (5ЕЙ 10 N0:10)

6АСАТССА6АТСАСССАСТСТССАТССТСССТСТСТССАТСТСТА66АСАСАСАСТСА

ССАТСАСТТССАбТСТСАбСТСААОТ&ТААСТТССАТТТАСТТбСАСТССТАТСАбСАеАААС

САСССАААСССССТААССТССТСАТСТАТАССАСАТССААСТТСССТТСТССАСТСССАТСАА

ССТТСАСТСССАСТЗСАТСТСССАСАЗАТТТСАСТСТСАССАТСАССАСТСТОСААССТСААС

АТТТТССААСТТАСТАСТСТАТТСАСТАСА6ТССТТАССС6СТСАССТТСС6СССАСС6АССА

АС6ТССАСАТСААА

С8-Н241 (5ΕΩ 10 N0:11)

САСАТССАСАТСАСССАСТСТССАТССТСССТОТСТССАТСТСТАбСАСАСАСАбТСА

ССАТСАСТТеСАбТбТСАССТСААСТОТААбТТССАТТТАСТТССАСТСОТАТСАССАСАААС

САСССАААСССССТАА6СТССТСАТСТАТАССАСАТССААСТТСССТТСТССА6ТСССАТСАА

ООТТСАСТСССАСТССАТСТСССАСАСАТТТСАСТСТСАССАТСАССАСТСТССААССТОААС

АТТТТССААСТТАСТАСТбТСАССТСТАСАСТСбТТАСССССТСАССТТССССеОАСССАССА

А66Т66АСАТСААА

Св-со-16 <5Е0 Ю N0:12)

САСАТССА0АТ6АСССА6ТСТССАТССТСССТ6ТСТССАТСТСТА66АСАСА6АСТСА

ССАТСАСТТССАСТСТСАССТСААСТеТАССТТССАТТТАСТТеСАСТССТАТСАССАСАААС

СА6С6АААСССССТАА6СТССТ6АТСТАТАССАСАТССААСТТСССТТСТ6САСТСССАТСАА

ССТТСАбТОССАСТОСАТСТСеСАСАСАТТТСАСТСТСАССАТСАССАСТСТССААССТСААС

АТТТТССААСТТАСТАСТСТСАССТСТАСАСССеТТАСССеСТСАССТТССССССАеССАССА

АС6ТССАСАТСААА

Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи

011-517Υ (5ЕС 10 N0:13) ανΩΕνΩ56ΑΕνΚΚΡσ55νκν50ΚΑ50ΥΤΓΤ5ΚΥΙΗΝνΡΩΑΡ£0£ΕΕΜΜ0ΝΙΥΡνΤ0ϋΤ

УУЫЕКГКСКУТИАОКЗТЗТАУМЕЬЗЗЬКЗЕОТАУУУСАКСУСАЕУУИСОеТЬУТУЗ ϋΙΙ-δΒβ (5Ε0 10 N0:14)

0νΩΕνΩ50ΑΕνΚΚΡ055νκν30ΚΑ50ΥΤΓΤ5ΚΥΙΗΗνΡΩΑΡΟΟΟΙ,ΕΝΜ0ΜΙΥΡνΤΩΌΤ

ΥΥΙΕΚΕΚϋΚνΤΐΤΑ0Κ3ΤΞΤΑΥΜΕΕ33ΕΚΞΕΕΤΑνΥΥΟΑΚΰΥ0ΑΕΕΥΉΟΩσΤΕντν3

О11-С27ОЗ <5Ε2 ΙΟ N0:15)

272ЬУ(35САЕУККРС53УК73СКА5СУТГТЗЕУ1Н^УР0АРС0СЬЕИМС?/1УР7ТСОТ

УУКЕРГКбЮТЧТАОКЗТЗТАУМЕЬЗЗЬКЗЕОТАУУУСАКОУСАРУУИСОСТЬУТУЗ

С6-6 (5Ε0 ΙΟ N0:16)

Ων0Εν05ΟΑΕνΚΚΡΟΑ3νκν3€ΚΑ5ΟΥΤΕΤΟΥΥΜΗΜνΚΩΑΡΟΩ3ΕΕΗΜ£ΚνΝΡΝΡ£θΤ

ΤΥΝΩΚΓΕΟΕνΤΜΤΤΟΤΞΤ3ΤΑΥΜΕίΕ5ΒΡΞΕΟΤΑνΥΥΟΑΡΤΝ«ΕΟΥνϊΟΩΰΤΤνΤν5

С8-Н241 (ЗЕЙ 10 N0:17) ^□ЬУСЗСАЕУККРСАЗА/КУЗСКАЗСУТГТОУУМНИУЕОАРСОСЬЕИМСЖЖРЫЕЕСТ

ТУМОКЕЕСРУТМТТОТЗТЗТАУМЕЬЕЗЬЕЗООТАУУУСАРАЫИЕОУИСССТТУТУЗ

С8-СО-16 (5£φ ΙΟ N0:18)

ОУОЬУОЗСАЕУККРСАЗУКУЗСКАЗСУТГТОУУМНИУЕОАРСОСЬЕЮМСКУЫРУЕСЗТ

ТУНЗКЕЕСЕУТМТТОТЗТЗТАУМЕЕКЗЬКЗООТАУУУСАЕАЫГЬОУИСОеТТУТУЗ

- 39 020398

Последовательности нуклеиновых кислот вариабельных областей тяжелой цепи

О11-317У (ЗЕф 10 N0:19)

СА56ТССАеСТебТССАбТСТСбеССТСА6бТСАА6ААСССТСССТССТС66ТСААбС

ТСТССТССААС6СТТСТ6ССТАСАССТТСАСААСТАССТАТАТАСАСТСССТСС6АСАССССС

СТбСАСААбСССТТСАСТбСАТбССАТСеАТТТАТССТСТААСТССТСАТАСТТАСТАСААСб

АбААСТТСААббеСАСАСТСАСеАТТАССССССАСАААТССАСбАССАСАСССТАСАТССАСС

ТеАССА0ССТСА0АТСТ6А00АСАСС6СССТ0ТАТТАСТСТСС0АСАСеСТАС6САССТТТТТ

АстАстееесссАосссАСССтеетсАССстстсс

О11-8ВЗ (3Ε0 Ю N0:20)

САббТССАССТССТбСАСТСТСССССТСАбСТСААСААСССТСССТССТСССТСААбб

ТСТССТССААСССТТСТСССТАСАССТТСАСААСТАССТАТАТАСАСТСССТбССАСАбСССС

СТССАСААССССТТСА6Т6САТСССАТССАТТТАТССТСТААСТССТСАТАСТТАСТАСАТСС

АбААСТТСААССССАеАСТСАСбАТТАССССССАСАААТССАССАССАСАСССТАСАТССАСС

Т6А6САСССТСА6АТСТеАССАСАС66СССТСТАТТАСТ6ТСС6АСА6ССТАТССТССТТТТТ

ТСТАСТССССССАССССАСССТССТСАСССТСТСС

О11-С27ОЗ (ЗЕО 10 N0:21)

САСЙТбСАССТббТеСАеТСТеССеСТбАСбТбААСААСССТбббТССТСССТСААСС

ТСТССТССААСССТТСТСССТАСАССТТСАСААеТАССТАТАТАСАСТССбТСССАСАССССС

СТеСАСААССССТТбАбТееАТСбСАТСбАТТТАТССТбТААСТССТбАТАСТТАСТАСАбАС

А6ССТТТСААСС6СА6АСТСАССАТТАСССС6САСАААТССАССАССАСАСССТАСАТССАСС

ТСАССАСССТСАСАТСТСАССАСАСеССССТСТАТТАСТСТСССАСАСССТАТСССССТТТТТ

АСТАСТСееСССАСОССАСССТССТСАСССТСТСС

С8-6 (5Е0 Ю N0:22)

САССТТСАбСТССТССАбТСТССТбСТСАССТСААСААбССТССТСССТСАбТбААСб

ТСТССТССААС6СТТСТССТТАСАССТТТАСССАСТАСТАСАТ6САСТС0СТСССТСАССССС

СТееТСААСеТСТТСАСТСеАТ<^ССТССТеТТААТССТААССееС6ТССТАСТАССТАСААСС

АСАААТТССАСС6СССТСТСАССАТСАССАСАСАСАСАТССАССАССАСАСССТАСАТССАСС

ТеСбТАСССТбСОТТСТбАССАСАСССССеТСТАТТАСТСТСССССТАССААСТеССТТСАСТ

АСТСбССССАббССАССАССбТСАСССТСТСС

С8-Н241 {ЗЕО 10 N0:23)

САССТТСАССТССТССАСТСТеСТССТСАССТСААСААеССТСеТСССТСАСТСААСС

ТСТССТССААббСГТСТСбТТАСАССТТТАССбАСТАСТАСАТбСАСТСССТбССТСАССССС

СТССТСААССТСТТСАСТбСАТбССТССТСТТААТССТААССССАСббСТАСТАССТАСААСС

АСАААТТССАббССССТСТСАССАТСАССАСАСАСАСАТССАССАССАСАбССТАСАТССАСС тесетАссстесбттстсАССАСАСсессететАТТАСтстбСбсетсссААстсесттсАст

АСТССССССАССССАССАСССТСАСССТСТСС

С8-СО-16 (ЗЕО ΙΟ N0:24)

САС6ТТСАССТССТССАСТСТССТССТСАССТСААСААСССТССТСССТСАСТСААСС

ТСТССТССААСССТТСТСОТТАСАСАТТСАСТСАСТАСТАСАТбСАСТСССТеССТСАССССС

СТССТСААССТСТТСАСТССАТСССТССТСТТААТССТТАТСССССТАСТАСТАССТАСААСС

АСЛААТТССАССССССТСТСАССАТСАССАСАСАСАСАТССАССАССАСАбССТАСАТбеАСС

ТбССТАСССТбСбГТСТСАСбАСАССССССТСТАТТАСТСТССбССТСССААСАТТСТТСАСТ

АстесеесслеоссАССАссотсАссетстсс

- 40 020398

Полные аминокислотные последовательности легкой цепи

011-8177 каппа (8Е0 ГО N0:25)

Е1УЪТ25Р6ТЬЗЪЗРеЕЕАТЬЗСЗУ333133ТЫЬНИ¥00КРС0АРРЬЫУ6ТЗУЪАЗе

1РПЕГЗСЗС56ТОРТЬТ15К1,ЕРЕОРАУУУС00И55УРУЗРСССТКЬЕ1ККТУААРЗУГ1ГРР

ЗПЕОЬКЗЕТАЗУУСЪЪННРУРИЕАКУОИКУОЫАЬОЗЕЫЗОЕЗУТЕООЗКСЗТУЗЕЗЗТЪТЬЗК

АЕУЕКНКУУАСЕУТНаСЬЗЗРУТКЗЕЫКСЕС ϋ11-8Β8 каппа (ЗЕО ГО N0:26)

Е1УЪТ03РСТЪЗЕ5РСЕКАТЕЗСЗУ333133ТЫЬНИУ00КРС0АРКЪЫУСТЗУЬАЗС 1РОЕЕЗС5ЕЗСТОЕГЬГ13ЕЕЕРЕБЕАУУУС0(ЗИЗЗУРУЗРСаСТКЕЕ1ККТУААРЗУЕ1РРР ЗПЕОЕКЗСТАЗУУСЪЪННРУРКЕАКУОИЮТЫАЪОЗСЫЗОЕЗУТЕООЗКОЗТУЗЕЗЗТЪТЬЗК АОУЕКНКУУАСЕУТНОЗЪЗ ЗРУТКЗ ЕМКСЕС

О11-С27СЗ каппа (ΞΕ2 ГО N0:27)

Е1УЪТ03РСТЬЗЕЗРСЕЕАТЬ8С8У333138ТМЬНИУ00КРС0АРКЕЫУеТЗНЬРЗе

1РОКР5С5Е5еТОЕТ1,Т15й1,ЕРЕОЕАУУУС00И35УРУ5ЕЕ05ТК1,Е1ККТУААР5УПРРР

ЗЕЕОЬКБеТАЗТУСЬЬНЫРУРКЕАКУйИКУОЫАЪОЗбЫЗОЕЗУТЕООЗКОЗТУЗЕЗЗТЬТЬЗК

АБУЕКНКУУАСЕУТНОЕЬЗЗРУТКЗРЫЕЕЕС

С8-6 каппа (3Εβ ГО N0:28)

ОЮМТСЗРЗЗЬЗАЗУбСНУПТСЗУЗЗЗУЗЗХУЬНИУОеЭКРеКАРКЬЫУЗТЗМЬАЗС

УР5КР5С5С5СТ0ГТЬТ133Ь0РЕ0РАТУУС1С!У8СУРЬТРЕССТКУЕ1ККТУААРЗУГ1РРР

ЗЕЕОЬКЗСТАЗУУСЬЬЫНЕУРКЕАКУОНКУОНАЬОЗЕНЗйЕЗУТЕООЗКОЗТУЗЬБЗТЬТЬЗК

АОУЕКНКУУАСЕУТНОСЬЗЗРУТКЗГНЕЕЕС

С8-Н241 каппа (ЗЕй ГО N0:29,

ОЮМТОЗРЗЗЬЗАЗУеСНУТТТСЗУЗЗЗУЗЗТУЬНМУООКРСКАРКЬЫУЗТЗЫЪАЗе УРЗКЕЗеЗЕЗеТ0РТЬТ133Ь0РЕОГАТУУС0УУЗеУРЬТЕ5ееТКУЕ1КЕТУААРЗУЕ1ГРР ЗОЕОЬКЗеТАЗУУСЫ+гаГУ РЕЕАКУОИКУОМАЬОЗСНЗОЕЗУТЕООЗКОЗТУЗЬЗЗТЬТЪЗК АОУЕКНКУУАСЕУТНОЕЕЗЗРУТКЗЕЖЕЕС

С8-СО-16 каппа (5Е2 ГО N0:30)

ОЮМТ05РЗЗЪЗАЗУСОЕУТ1ТСЗУЗЗЗУК51УЬНИУ00КРСКАРКЬЫУЗТЗКЕА36

УРЗЕГЗСЗСЗСТ0РТЕТ133Ь0РЕ0ЕАТУУС07УКеУРЬТГСССТКУЕ1КЕТ7ААРЗУЕ1ГРР

ЗОЕСЕКЗСТАЗУУСЬЕЫНРУРКЕАКУОИКУОНАЬОЗОТЗОЕЗУТЕООЗКОЗТУБЬЗЗТЬТЬЗК

АОУЕКНКУУАСЕУТНОбЬЗЗРУТКЗГЫКОЕС

Полные последовательности нуклеиновых кислот легкой цепи

Β11-817Υ 1дЕ2 ЬС (ВЕС ГО N0:31)

ЕАААТТСТСТТбАСЕСАЕТСТССАЕССАСССТЕТСТТТСТСТССАЕеССАААСАбССА

СССТСТССТеСАеТСТСАССТСААСТАТААБТТССАССААСТТАСАСТбСТАССАЕСАЕАААС

СТСЕССАСССТСССАЕССТССТСАТСТАТЕЕСАСАТССТАССТЕЕСТТСТСЕСАТСССАбАСА беТТСАеТС6САСТЕСеТСТе5САСАеАСТТСАСТСТСАССАТСА6САбАСТ5САеССТеААе

АТТТТеСАЕТСТАТТАСТЕТСААСАСТЕеАЕТАЕТТАСССеТАСАЕТТТССЕССААСЕСАССА

АСТТСеАСАТСАААССААСТСТСССТеСАССАТСТеТСТТСАТСТТССССССАТСТбАТЕАСС

АеТТСАААТСТССААСТСССТСТЕТТбТЕТЕССТССТЕААТААСТТСТАТСССАЕАЕАЕеССА

ААСТАСАСТебААССТССАТААСССССТССААГСбеСТААСТСССАССАСАСГСТСАСАЕАСС

АССАСАЕСААЕЕАСАЕСАССТАСАЕССТСАЕСАЕСАСССТСАСЕСТСАеСАААЕСАСАСТАСЕ

АСАААСАСАААСТСТАСЕССТЕССААЕТСАСССАТСАСеСССТБАЕСТСЕСССЕТСАСАААбА

ЕСТТСААСАЕЕССАЕАСТСС

О11-8В8 1д62 ЬС (ЗЕ(2 ГО N0:32)

ЕАААТТСТЕТТЕАСССАЕТСТССАСЕСАСССТЕТСТТТЕТСТССАЕЕЕЕАААЕАЕССА

СССТСТССТССАЕТЕТСАССТСААЕТАТААЕТТССАССААСТТАСАСТебТАССАЕСАСАААС

СТССССАббСТСССАСЕСТССТСАТСТАТСССАСАТССТАССТСеСТТСТСССАТСССАЕАСА ббттсастеесастсестстббсасасасттсастстсассатсаесаеастееаесстеаае

АТТТТССАЕТБТАТТАСТБТСААСАЕТБСАБТАБТТАССССТАСАСТТТСБЕССААСЕСАССА

АСТТССАОАТСАААСЕААСТеТОССТЕСАССАТСТЕТСТТСАТСТТССССССАТСТСАТеАеС

- 41 020398

АЕТТЕАААТСТЕЕААСТСССТСТЕТТЕТЕТЕССТССТСААТААСТТСТАТСССАСАСАЕЕССА

ААСТАСА6Те<ЗААееТС6АТААС5СССТССААТСееСТААСТСССАСеАеАСТеТСАСАСА5С

АЕЕАСАЕСААЕЕАСАбСАССТАСАбССТСАЕСАССАСССТЕАСЕСТЕАЕСАААЕСАСАСТАСе

АСАААСАСАААСТСТАСеССТСССААСТСАСССАТСАбСеССТеАССТСбСССеТСАСАААСА

ЕСТТСААСАЕЕЕЕАСАЕТЕС

011-С2763 1дЕ2 ЬС (ЗЕО 10 N0:33)

САААТТ6Т6ТТСАСЕСАСТСТССАЕеСАСССТ6ТСТТТСТСТССАЕЕЕЕААА5АЕССА

СССТСТССТССАОТСТСАЕСТСААеТАТААЕТТССАССААСТТАСАСТСЕТАССАЕСАЕАААС

СТЕЕССАЗЕСТСССАбЕСТССТСАТСТАТСЕСАСАТССАСАСТЕАСАТСТСССАТСССАСАСА

СЕТТСАЕТСССАеТСССТСТСЕЕАСАСАСТТСАСТСТСАССАТСАССАСАСТСбАЕССТСААЕ

АТТТТеСАЕТЕТАТТАСТеТСААСАЕТЕЕАЕТАЕТТАСССЕТАСАСТТТССеССААЕЕСАССА

АОТТЕЕАСАТСАААСЕААСТЕТЕЕСТССАССАТСТЕТСТТСАТСТТСССЕССАТСТСАТСАСС

АСТТЕАААТСТССААСТСССТСТСТТСТЕТЕССТССТбААТААСТТСТАТСССАЕАСАЕСССА

ААЕТАСАетСЕААСЕТССАГААСССССТССААТСЕЕСТААСТСССАЕЕАСАЕТЕТСАСАСАбС

АСЕАСАбСААбСАСАССАССТАСАСССТСАОСАЕСАСССТСАСССТСАССАААОСАСАСТАСС

АЕАААСАСАААСТСТАСЕССТССЕААСТСАСССАТСАЕСЕССТеАЕСТСЕСССбТСАСАААСА

ЕСТТСААСАСЕСЕАСАЕТЕС

С8-6 1дС4 ЬС (ЗЕ() Ю N0:34)

САСАТССйСАТСАСССАЕТСТССАТССТСССТЕТСТССАТСТСТАССАбАСАСАСТСА

ССАТСАСТТССАСТЕТСАССТСААСТСТААСТТССАТТТАСТТССАСТССТАТСАССАСАААС

САЕССАААЕССССТААССТССТСАТСТАТАЕСАСАТССААСТТСССТТСТССАСТСССАТСАА

СЕТТСАСТБ6САСТ6ЕАТСТСССАСАСАТТТСАСТСТСАССЙТСАЕСАСТСТССААССТСААЕ

АТТТТССААСТТАСТАСТСТАТТСАОТАСАЕТОСТТАСССССТСАССТТССССССАСССАССА

АССТСЕАСАТСАААССААСТСТСССТССАССАТСТСТСТТСАТСТТСССБССАТСТСАТСАСС

АСТТСАААТСТССААСТСССТСТСТТСТСТСССТССТБААТААСТТСТАТСССАСАСАССССА

ААСТАСАЕТССААЕСТЕЕАТААСССССТССААТССССТААСТСССАЕЕАСАЕТСТСАСАСАСС

АСЕАСАЕСААСЕАСАЕСАССТАСАЕССТСАССАбСАСССТЕАСЕСТЕАЕСАААЕСАЕАСТАСЕ

АЕАААСАСАААСТСТАССССТСССААСТСАСССАТСАЕЕЕССТЕАЕСТСССССЕТСАСАААСА

ЕСТТСААСАСЕСЕАСАЕТЕС

С8-Н241 1дС4 ЬС (ЗЕО 10 N0:35)

ЕАСАТССА6АТСАСССАЕТСТССАТССТСССТСТСТЕСАТСТСТАСЕАЕАСАСАСТСА

ССАТСАСТТССАСТСТСАЕСТСААСТСТАТССТССАТТТАСТТЕСАСТССТАТСАССАСАААС

ЕЕТТСАСТЕССАЕТЕСАТСТЕЕЕАСАСАТТТСАСТСТСАССАТСАССАЕТСТЕСААССТСААС

АТТТТЕСААСТТАСТАСТСТСААЕТСТАСАСТССТТАСССССТСАССТТССССЕСАСССАССА

АСЕТССАЕАТСАААССААСТСТСЕСТССАССАТСТбТСТТСАТСТТСССЕССАТСТСАТСАСС

АСТТЕАААТСТСЕААСТСССТСТ6ТТСТСТЕССТССТСААТААСТТСТАТСССАЕАЕАССССА

ААСТАСАСТЕСААССТСеАТААСЕСССТССААТСЕСЕТААСТСССАСЕАЕАЕТСТСАСАСАЕС

АССАСАССААССАСАССАССТАСАСССТСАССАЕСАСССТЕАСЕСТеАЕСАААССАБАСТАСЕ

АЕАААСАСАААЕТСТАСЕССТСССАА6ТСАСССАТСАСЕ6ССТСАССТС6СССЕТСАСАААСА

ССТТСААСАЕЕС6АСАЕТЕС

С8-СО16 1дО4 ЬС (ЗЕ<2 Ю N0:36)

ЕАСАТССАСАТЕАСССАСТСТССАТССТСССТСТСТЕСАТСТЕТАЕЕАСАСАЕАЕТСА

ССАТСАСТТССАЕТСТСАССТСААСТСТАС6ТТССАТТТАСТТЕСАСТСЕТАТСАЕСАСАААС

САСССАААЕССССТААССТССТСАТСТАТАбСАСАТССААСТТСССТТСТЕСАСТСССАТСАА

ССТТСАСТСССАСТССАТСТЕССАСАСАТТТСАСТСТСАССАТСАССАЕТСТССААССТСААС

АТТТТССААСТТАСТАСТЕТСАСЕТЕТАСАЕЕЕЕТТАСССЕСТСАССТТСЕЕСССАЕЕСАССА

АЕСТССАСАТСАААСбААСТСТСЕСТССАССАТСТСТСТТСАТСТТССССССАТСТСАТСАСС

АЕТТЕАААТСТЕЕААСТСССТСТСТТЕТСТЕССТОСТСААТААСТТСТАТСССАОАЕАОЕССА

ААСТАСАСТССААССТССАТААСОСССТССААТССССТААСТСССАССАСАСТСТСАСАСАЕС

АССАСАЕСААССАСАССАССТАСАСССТСАССАССАСССТСАСССТСАЕСАААССАСАСТАСС

АСАААСАСАААСТСТАССССТЕСЕААСТСАСССАТСАСЕСССТСАЕСТСССССЕТСАСАААЕА

ССТТСААСАСЕССАСАЕТСС

- 42 020398

Полные аминокислотные последовательности тяжелой цепи ϋ11-5ΐ7ϊ 1д©2 (3Ερ ΙΟ N0:37)

0ν0£νθ5ΟΑΕνΚΚΡ655νκν5€ΚΑ3ΰΥΤΓΤ5ΚΥΙΗΐϊνΚ0ΑΡΟ0ΟΙ,Ε№ΜαΝΙΥΡνΤ6ΟΤ

ΥΥΝΕΚΓΚΟΡνΤΙΤΑΟΚ5Τ3ΤΑΥΜΕΙ,33Ι,Κ5ΕΟΤΑνΥΥσΑΡΟΥ6ΑΓΥΥΜΟι26ΤΙ,νΤν55Α5ΤΚΟ

РЗУРРЬАРСЗЕЗТЗЕЗТААЪеСЪУКОУРРЕРУТУЗИЫЗСАЪТЗСУНТРРАУЬОЗЗЗЪУЗЬЗЗУ

УТУРЗЗЫРСТОТУТСЫУОНКРЗЫТКУБКТУЕНКССУЕСРРСРАРРУАСРЗУГЬРРРКРКОТЬМ ΐεΡΤΡΕνΤΟνννονΞΗΕΟΡΕνΟΕΝΝΥνΟΟΜΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΕΝίΤΓΚννΒνΐ/ΓννΗΟΟΜΣΝ

ΘΚΕΥΚΟΚν5ΝΚΟΕΡΑΡΙΕΚΤΙ5ΚΤΚΟΟΡΡΕΡανΥΊΈΡΡ3ΚΕΕΜΤΚΝθν3Ι/ΓΟΙ.νΚ<3ΓΥΡ80ΐΑ νΕΝΕ3Ν6ΏΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡΜΣ030ΰ3ΡΠ,ΥΞΚΕΤνΏΚ5ΚΝθζ)ΰΝνΓ3€3νΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤΟΚ5Β

ЗЬЗРС

Ο11-8Β8 1д<32 (5Ε£ ΙΟ N0:38)

0ναΣνθ5ΟΑΕνΚΚΡε33νκν5€ΚΑ3£ΥΤΕΤ5ΡΥΙΗΝνΚ£ΑΡΰθσΐΕΜΜΰΜΙΥΡνΤ3ΟΤ

ΥΥΙΕΚΓΚσΡνΤΙΤΑΟΚ3Τ5ΤΑΥΜΕΣ55ΙΡ3ΕΟΤΑνγγεΑΚσΥσΑΕΕΥ«ΟΟΘΤΙ,ντν53Α3ΤΚ3

Р5УГРЬАРСЗЕ5ТЗЕЗТААЪССЪУКРУРРЕРУТУ5ИЫЗСАЪТ5СУНТГРАУЪ055СЪУЗЬ35У

УТУРЗЗМРСТОТУТСЫУОНКРЗЫТКУПКТУЕРКССУЕСРРСРАРРУАСРЗУРЬГРРКРКОТЪМ

Ι3ΡΤΡΕνΤ€ννν0ν3ΗΕΟΡΕν0ΕΝΝΥνθ0ΜΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ0ΓΝ5ΤΓΚνν5νΐ,ΤννΗ(20ΜΕΝ

6ΚΕΥΚ0Κν3ΝΚ6ΓΡΑΡΙΕΚΤΙ3ΚΤΚΟΟΡΡΕΡθνΥΤΙ.ΡΡ5ΕΕΕΜΤΚΝθν5Ι/?<:ΐ,νΚ6ΡΥΡ3ΟΙΑ

УЕКЕЗМСЗРЕНЫУКТТРРМЬОЗОСЗЕЕЬУЗКЪТУОКЗРЖЮСЫУЕЗСЗУМНЕАЪНЫНУТЗКЗЬ

ЗЪЗРС

011-С27СЗ 1дС2 <8Εβ ΙΟ N0:39)

0ν0Εν05αΑΕνΚΚΡθ33νκν3ΟΚΑ5ΰΥΤΡΤ£ΚΥΙΗΝνΕςΑΡΟ$ΘΕΕΝΜΘΝΙΥΡνΤΟΌΤ

ΥΥΚΕΡΡΚσκνΤΙΤΑΏΚ5Τ5ΤΑΥΜΕΕ38ΕΚ3ΕΓΤΑνγΥΟΑΡΟΥΟΑΡΎΥΝσζ>(3ΤΕντν53Α5ΤΚΏ

РЗУРРЬАРСЗРЗТЗЕБТААЬССЬУКПУРРЕРУТУЗМИЗСАЪТЗОУНТРРАУЬОЗЗСЬУЗЬЗЗУ

УТУРБЗНРОТОТУТСЫУВНКРЗЬГТКТОКТУЕККССУЕСРРСРАРРУАОРЗУРЬРРРКРКВТЕМ

1$НТРБУТСУУУОУЗНЕОРЕУ0Р1ЖУУПаМЕУНИАКТКРЕЕЕ0РЫЗТГРУУ5УЬТУУНСЮИ1Л аКЕУКСКУ5ЫКаЬРАР1ЕКТ15КТКаОРКЕРОУУТЬРР5КЕЕМТКЫОУЗЬТСЬУКаГУР301А νΕΜΕ5Νσ0ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡΜΕϋ5ΌΟ3ΡΡΕΥ3ΚΕΤνΏΚ5Ρ400αΝνΡ3Ο3νΜΗΕΑΒΗΝΗΥΤ(2Κ5Ε

ЗЪЗРС

С8-6 1дС2 (3Ε0 Ιϋ N0:40)

ОУОЬУОЗОАЕУККРСЗАЗУКУЗСКАЗОУТРТВУУМНИУЕОАРСООЬЕИМОЕУЯРНЕОаТ

ΤΥΝ0ΚΡΕΟΚνΤΜΤΤϋΤ3Τ3ΤΑΥΜΕΕΕ3ΕΕ3ϋυΤΑνΥΥ0ΑΕΤΝΐίΕυΥΗθ00ΤΤντν33Α3ΤΚ0Ρ

ЗУРРЬАРСЗЕЗТЗЕЗТААЬССЪУКОУРРЕРУТУЗИЫЗСАЪТЗаУНТРРАУЬОЗЗСЪУЗЬЗЗУУ

ТУР35МРСТ0ТУТСКУВНКРЗЫТКУВКТУЕККССУЕСРРСРАРРУАСРЗУРЬРРРКРКВТЪМ1

ЗЕТРЕУТСУУУПУЗНЕОРЕУОРМИУУООМЕУШАКТКРЕЕЕОРНЗТРЕУУЗУЬТУУНОПИЬНС

КЕУКСКУЗКГКСЬРАР1ЕКТ13КТКС0РЕЕР0УУТЬРРЗЕЕЕМТКН0УЗЬТСЬУКСРУРЗПГАУ

ЕИЕЗПООРЕЫЫУКТТРРМЬБЗЕСЗРРЬУЗКЬТУОКЗЕИОООЫУРЗСЗУМНЕАЬНЫНУТОКЗЬЗ

ЪЗРО

С8-Н241 1дС2 (ЗЕО Ю N0:41)

ОУОЬУОЗСАЕУККРСАЗУКУБСКАЗОУТРТОУУМНИУЕОАРСОСЬЕИМеЕУЫР]ЯЕЕСТ

ТУПОКРЕСЕУТМТТЕТЗТЗТАУМЕЪЕЗЪЕЗОПТАЛТУУСАЕАГТОЬВУИООСТТУТУЗЗАЗТКСР

ЗУРРЬАРСЗКеТЗЕЗТААЬССЬУКВУРРЕРУТУЗТОТБОАЬТЗСУНТРРАУЪОБЗОЬУЗЬЗЗУУ

ТУРЗЗНРСТ0ТУТСЫУВНКРЗМТКУВКТУЕЕКССУЕСРРСРАРРУАОРЗУРЬРРРКРКПТЬМ1

ЗКТРЕУТСЛ7УТОУЗНЕОРЕУ0ЕМИУУВСМЕУНЫАКТКРЕЕЕ0РГ13ТРЕУУЗУЫУУН0БИШС

КЕУКСКУЗНКОЬРАР1ЕКТ13КТКС0РЕЕР0УУТЬРРЗЕЕЕМТКЫ0УЗЬТСЬУКСРУРЗО1АУ

ЕНЕЗЫаОРЕШУКТТРРМЬПЗВСЗЕЕЬУЗКЬТУОКЗЕИООСЫУЕЗСЗУМНЕАЪНЫНУТОКЗВЗ

ЬЗРО

С8-СО-16 1дС2 (ЗЕО Ю N0:42)

ОУОЬУОЗСАЕУККРСАЗУКУЗСКАЗСУТРТВУУМНИУЕОАРСОСЪЕИМСЕУКРУЕСЗТ

ΤΥΝ0ΚΕΞσΕνΤΜΤΤΒΤ3Τ3ΤΑΥΜΕΕΕ3ΒΕ3ΌηΤΑνΥΥΟΑΕΑΝΙΒΌΥΝΟ0αΤΤντν53Α3ΤΚ(5Ρ

ЗУРРЬАРСЗКЗТЗЕЗТААЪССЬУКВУЕРЕРУТУЗИПЗаАЕТЗОУНТРРАУЪОЗЗОЪУЗЬЗЗУУ

ТУРЗЗЫРОТ0ТУТСМУОНКРЗЫТКУБКТУЕЕКССУЕСРРСРАРРУАСРЗУРЬРРРКРК1)ТЪМ1

БЕТРЕУТСУУУОУЗНЕВРЕУОРЫИУУВОМЕУНиАКТКРЕЕЕОЕЫЗТРЕУУЗУЬТУУНОРИЬИС

КЕУКСКУ5ЫКОЬРАР1ЕКТ15КТКа0РЕЕР0УУТЬРРеЕЕЕМТКМ0УЗЬТСЬУКОРУРЗО1АУ

ЕИЕЗМаОРЕНЫУКТТРРМЬОЗОаЗРРЬУЗКЬТТОКЗКИООаОТРЗСЗУМНЕАЬНИНУТОКЗЬЗ

ЬЗРО

- 43 020398

Полные последовательности нуклеиновых кислот тяжелой цепи

Ο11-517Υ 1дС2 НС (8Е0 ГО НО:43) сАестесАсстсстссАбтстесбсстсАсстеААеААссстесстсстссетеААбс

ТСТССТЕСААеССТТСТСЕСТАСАССТТСАСААСТАСЕТАТАТАСАСТЕССТСССАСАССССС

СТССАСААССССТТСАСТСЕАТССЕАТСЕАТТТАТССТЕТААСТСЕТСАТАСТТАСТАСААСЕ

АЕААСТТСААССеСАСАЕТСАСбАТТАСССССЕАСАААТССАСЕАССАСАЕССТАСАТССАЕС

ТЕАЕСАСССТбАСАТСТЕАССАСАССССССТСТАТТАСТеТССЕАеАСССТАТЕЕСССТТТТТ

АСТАСТЕЕССССАЕСССАСССТССТСАСССТСТССТССЕССТССАССААСЕССССАТСЕСТСТ

ТСССЕСТАЕСССССТЕСТССАЕСАССАССТССЕАСАЕСАСАЕССССССТЕОеСТСССТеЕТСА

А0САСТАСТТССССЕААССЕЕТСАСС6ТЕТССТ60ААСТСАЕ6СЕСССТСАССАЕСеССЕТЕС

АСАССТТССССЕСТЕТССТАСАСТССТСАСЕАСТСТАСТСССТСАЕСАССЕТЕЕТЕАСССТЕС

ССТССАЕСААСТТСЕЕСАСССАСАССТАСАССТССААСЕТАСАТСАСААЕСССАЕСААСАССА

А6СТ6ЕАСААЕАСАЕТТСАССЕСАААТСТТЕТЕТСЕАСТССССАССЕТ6СССАЕСАССАССТЕ

ТбЕСАЕЕАССЕТСАЕТСТТССТСТТССССССААААСССААЕЕАСАСССТСАТСАТСТСССЕЕА

ССССТЕАЕбТСАСеТССеТЕЕТЕЕТЕЕАСЕТОАЕССАСЕААЕАССССЕАЕЕТССАЕТТСААСТ еСТАССТССАСЕЕСАТССАЕЕТЕСАТААТСССААСАСАААЕССАССССАЕСАССАСТТСААСА

ЕСАСЕТТССбТСТЕЕТСАССЕТССТСАССЕТСЕТбСАССАЕСАСТСССТСААССССААСЕАСТ

АСААЕТССААССТСТССААСАААЕЕССТСССАЕСССССАТСБАЕААААССАТСТССААААССА

ААССССАСССССЕАЕААССАСАЕЕТЕТАСАСССТССССССАТСССЕСЕАЕЕАЕАТСАССААЕА

АССАССТСАСССТЕАССТЕССТСЕТСАААЕЕСТТСТАССССАССЕАСАТСбССеТСбАСТЕЕЕ

АЕАбСААТбСЕСАЕССССАЕААСААСТАСААСАССАСАСС’ГСССАТССТСЕАСТССбАСБЕСТ

ССТТСТТССТСТАСАеСАА6СТСАССЕТ6ЕАСАА6А6САОетееСАеСАЕООЕААСеТСТТСТ

САТССТССЕТЕАТССАТСАЕЕСТСТЕСАСААССАСТАСАСАСАСААСАЕССТСТСССТСТСТС

СОЕЕТ

О11-8ВЗ 1д<32 НС (ЗЕС ГО НО:44)

САЕСТССА6СТеСТеСАСТСТСЕСЕСТСА6СТСАА6ААСССТ66СТССТСССТЕААЕЕ

ТСТССТССААСССТТСТЕЕСТАСАССТТСАСААСТАСЕТАТАТАСАСТСЕЕТССЕАСАЕСССС

СТЕСАСААССССТТСАЕТЕбАТСеСАТЕЕАТТТАТССТеТААСТебТСАТАСТТАСТАСАТСЕ

АЕААЕТТСААССССАСАСТСАССАТТАССЕСССАСАААТССАССАССАСАбССТАСАТССАСС

ТСАЕСАЕССТЕАЕАТСТЕАЕЕАСАСЕЕССЕТЕТАТТАСТЕТЕСЕАСАЕЕСТАТЕЕТеСТТТТТ

ТСТАСТССССССАССССАСССТССТСАССЕТСТССТСССССТССАССААСЕССССАТСССТСТ

ТСССЕСТАЕСЕСССТЕСТССАССАССАССТССЕАЕАЕСАСАЕССЕСССТЕЕЕСТЕССТЕЕТСА

АЕСАСТАСТТССССЕААССЕЕТСАСЕЕТЕТСбТЕЕААСТСАЕЕСЕСССТСАССАЕССЕСЕТЕС

АСАССТТСССЕССТЕТССТАСАЕТССТСАЕЕАСТСТАСТСССТСАЕСАБСЕТЕЕТЕАССЕТЕС

ССТССАЕСААСТТСЕССАСССАСАССТАСАССТЕСААСЕТАСАТСАСААЕСССАЕСААСАССА

АЕЕТЕЕАСААСАСАЕТТСАЕСЕСАААТбТТСТЕТСЕАЕТССССАССЕТЕСССАЕСАССАССТС

- 44 020398

ТЕССАСОАССЕТСАЕТСТТССТСТТССССССААААСССААЕЕАСАСССТСАТОАТСТСССеСА

ССССТОАЕОТСАСЕТССЕТОЕТЕСТеСАССТеАЕССАСЕААеАССССЕАЕЕТССАЕТТСААСТ

ЕЕТАСЕТЕСАСЕЕСАТЕЕАЕЕТЕСАТААТЕССААЕАСАААЕССАСЕСЕАЕЕАЕСАЕТТСААСА

ОСАСЕТТСССТЕТЕСТСАСССТССТСАСССТССТССАССАЕСАСТСЕСТСААССССААССАСТ

АСААЕТССААЕСТСТССААСАААССССТСССАЕСССССАТСЕАЕААААССАТСТССААААССА

ААССССАЕССССЕАЕААССАСА0ЕТеТАСАСССТ6СССССАТССС6ЕСАЕЕАСАТ0АССАА6А

АССАООТСАЕССТСАССТСССТЕЕТСАААЕОСТТСТАССССАЕСЕАСАТСОСССТЕОАЕТЕСС

АЕАЕСААТЕЕЕСАЕССССАЕААСААСТАСААЕАССАСАССТСССАТССТЕЕАСТССЕАСЕССТ

ССТТСТТССТСТАСАЕСААЕСТСАСССТССАСААЕАССАЕЕТСССАЕСАССЕЕААССТСТТСТ

САТССТСССТЕАТССАТЕАЕССТСТССАСААССАСТАСАСАСАСААЕАЕССТСТСССТОТСТС сосет

О11-С2763 1дО2 НС (ЗЕО П> N0:45»

САЕЕТЕСАЕСТЕЕТЕСАСТСТООЕЕСТЕАЕЕТЕААСААЕССТЕЕСТССТСЕСТСААЕЕ

ТСТССТЕСААЕЕСТТСТЕССТАСАССТТСАСААЕТАЕЕТАТАТАСАСТЕЕЕТЕСОАСАЕЕССС

СТОЕАСААЕЕОСТТЕАЕТЕЕАТЕОЕАТЕЕАТТТАТССТбТААСТЕЕТЕАТАСТТАСТАСАЕАЕ

А6ССТТТСААООССАСАСТСАСЕАТТАССЕССЕАСАААТССАСЕАЕСАСАЕССТАСАТЕЕАЕС

ТЕАЕСАСССТСАеАТСТСАбСАСАССЕССЕТСТАТТАСТСТССЕАЕАЕССТАСССАССТТТТТ

АСТАСТЕЕЕСССАСЕЕСАСССТСЕТСАССЕТСТССТССЕССТССАССААССССССАТСЕСТСТ

ТСССОСТАССССССТССТССАСеАЕСАССТССЕАЕАЕСАСАеССЕСССТЕЕОСТЕССТЕЕТСА

А6САСТАСТТСССС6ААССЕСТСАССЕТСТСЕТ6ЕААСТСАСЕСССССТЕАССАССЕЕСЕТСС

АСАССТТСССБЕСТСТССТАСАСТССТСАЕСАСТСТАСТСССТСАЕСАСССТЕСТСАССЕТСС

ССТССАЕСААСТТССЕСАСССАСАССТАСАССТеСААСЕТАСАТСАСААОСССАЕСААСАССА

АЕЕТОЕАСААЕАСАЕТТЕАЕСЕСАААТЕТТЕТЕТСЕАЕТЕСССАССбТЕСССАЕСАССАССТЕ

ТЕЕСАЕОАССЕТСАЕТСТТССТСТТССССССААААСССААЕСАСАСССТСАТЕАТСТСССЕЕА

ССССТЕАСЕТСАСЕТЕССТеОТССТЕ6АС6ТЕА6ССАССААСАССССЕАЕ6ТССАЕТТСААСТ

ССТАССТСЕАССССАТЕСАеОТеСАТААТСССААСАСАААСССАСССЕАЕЕАССАЕТТСААСА

ЕСАСЕТТСССТ6ТСЕТСАЕССТССТСАСС6ТСЕТЕСАССАЕСАСТЕЕСТЕААССССААЕЕАЕТ

АСААЕТЕСААЕ6ТСТ ССААСАААЕЕССТСССА6ССССС АТССАЕАА ААС САТСТ ССААААССА

ААСОССАЕССССеАбААССАСАЕСТСТАСАСССТЕСССССАТСССбОЕАСЕАОАТСАССААЕА

АССАССТСАЕССТСАССТЕССТСЕТСАААОЕСТТСТАССССАСССАСАТСЕССЕТЕЕАЕТЕЕЕ

АЕАЕСААТЕЕССАСССЕЕАЕААСААСТАСААСАССАСАССТСССАТеСТЕЕАСТСССАСЕССТ

ССТТСТТССТСТАСАЕСААССТСАСССТЕСАСААЕАССАССТСЕСАССАЕССЕААССТСТТСТ

САТЕСТССЕТЕАТбСАТЕАЕЕСТСТЕСАСААССАСТАСАСАСАЕААСАЕССТСТСССТеТСТС

СЕСЕТ

С8-6 1дО4 НС (ЗЕЙ Ю N0:46)

САССТТСАЕСТССТбСАОТСТССТССТбАСбТСААЕААЕССТССТЕССТСАОТЕААСС

- 45 020398

ТСТССТССААбЕСТТСТЕЕТТАСАССТТТАСССАСТАСТАСАТССАСТЕЕЕТеСЕТСАЕЕССС

СТБЕТСААЕЕТСТТЕАЙТЕЕАТЕЕбТСЕТЕТТААТССТААССЕЕЕЕТЕЕТАСТАССТАСААСС

АСАААТТССАСОСССЕТеТСАССАТЕАССАСАОАСАСАТССАСЕАЕСАСАОССТАСАТЕСАСС

ТСССТАСССТЕСЕТТСТЕАСЕАСАСЕСССЕТСТАТТАСТСТЕСССЕТАССААСТСЕСТТСАСТ

АСТЕОЕЕССАЕЕЕСАССАССЕТСАССЕТСТССТССЕССТССАССААЕСЕСССАТСЕЕТСТТСС

СЕСТАЕСЕСССТЕСТССАЕЕАЕСАССТССЕАЕАЕСАСАеССЕСССТЕСЕСТЕССТЕСТСААЕЕ

АСТАСТТСССССААССЕЕТЕАССЕТЕТССТЕЕААСТСАеЕСССССТЕАССАбССбСЕТЕСАСА

ССТТСССеЕСТЕТССТАСАЕТССТСАЕЕАСТСТАСТСССТСАОСАЕСЕТЕЕТЕАССЕТЕСССТ

ССАССАОСТТССбСАСЕААЕАССТАСАССТЕСААСЕТАСАТСАСААЕСССАЕСААСАССААСЕ

ТСЕАСААЕАОАЕТТЕАЕТССАААТАТЕЕТСССССАТССССАСССТЕСССАЕСАССТЕАЕЕССС

ССССеСЕАССАТСАЕТСТТССТСТТССССССААААСССААССАСАСТСТСАТСАТСТСССССА

ССССТОАееТСАСЕТССЕТОСТЕеТСбАСЕТСАОССАСбААеАСССССАЕСТССАЕТТСААСТ

ЕЕТАСЕТбЕАТЕЕСЕТЕбАЕСТЕСАТААТЕССААЕАСАААЕССЕСЕЕеАСЕАЕСАЕТТСААСА

ЕСАСеТАССЕТЕТЕЕТСАЕСЕТССТСАСССТССТЕСАССАСЕАСТЕССТЕААСЕССААССАЕТ

АСААЕТЕСААЕЕТСТССААСАААЕСССТСССЕТССТССАТСЕАЕААААССАТСТССАААЕССА

АЛЕЕбСАСССССЕАСАЕССАСАСЕТСТАСАСССТЕСССССАТСССАЕСАСЕАбАТЕАССААСА

АССАбетсАесстеАсстссстсстсАААбесттстАссссАссбАСАГссссбтеслстеее

АААЕСААТЕЕЕСАЕССЕЕАЕААСААСТАСААЕАССАСЕССТССССТЕСТЕЕАСТСССАСЕЕСТ

ССТТСТТССТСТАСАЕСАСЕСТААССЕТСеАСААЕАССАЕСТЕССАеСАЕЕСЕААТЕТСТТСТ

САТЕСТССЕТЕАТССАТЕАЕЕСТСТССАСААССАСТАСАСАСАЕААСАЕССТСТСССТЕТСТС

ТССЕТ

С8-Н241 1дЕ4 НС (ЗЕф Ю ИО;47)

САСЕТТСАЕСТСЕТЕСАЕТСТЕСТЕСТЕАСЕТЕААЕААЕССТЕЕТЕССТСАЕТЕААЕС

ТСТССТЕСААСЕСТТСТЕеТТАСАСАТТСАСТЕАСТАСТАСАТЕСАСТЕССТеССТСАСЕССС

СТЕЕТСААСОТСТТЕАЕТЕЕАТССЕТССТСТТААТССТААССЕЕАЕСЕЕТАСТАССТАСААСС

АЕАААТТСЕАЕЕЕССЕТЕТСАССАТСАССАСАЕАСАСАТССАСОАЕСАСАЕССТАСАТССАСС тесЕТАЕсстссеттстЕАсеАСАсссссетатАттАстбтссЕсетбсеААстесеттЕАст

АСТЕЕЕЕССАЕЕЕСАССАССЕТСАССеТСТССТССеССТССАССААЕЕЕСССАТСЕСТСТТСС

СЕСТАССЕСССТЕСТССАбЕАЕСАССТССЕАЕАССАСАЕССЕСССТСЕЕСТСССТеЕТСААСЕ

АСТАСТТССССЕААССЕЕТЕАСЕЕТСТСЕТЕЕААСТСАЕССССССТСАССАЕСОЕСЕТЕСАСА

ССТТСССЕбСТЕТССТАСАЕТССТСАеЕАСТСТАСТСССТСАЕСАЕСЕТСЕТЕАССЕТЕСССТ

ССАССАЕСТТЕЕЕСАСЕААЕАССТАСАССТЕСААСОТАЕАТСАСААССССАССААСАССААСЕ

ТЕЕАСААЕАЕАЕТТЕАЕТССАААТАТЕбТССССЕАТЕСССАСССТЕСССАЕСАССТЕАЕЕССЕ

СССЕЕЕЕАССАТСАЕТСТТССТЕТТССССССААААСССААЕЕАСАСТСТСАТСАТСТССССЕА

ССССТСАССТСАССТЕС6ТЕ6ТС6ТССАСЕТСАЕССА0ЕААЕАССССЕАС6ТССАЕТТСААСТ

Е6ТАСЕТСЕАТЕЕС6ТЕ6АЕЕТ6САТААТЕССААЕАСАААЕССЕСЕЕЕАЕЕА6САЕТТСААСА

- 46 020398

ССАССТАСССТСТССТСАСССТССТСАСССТССТССАССАССАСТСССТСААССССААССАСТ

АСААСТССААССТСТССААСАААССССТССССТССТССАТССАСААААССАТСТССАААСССА

ААССССАССССССАСАСССАСАССТСТАСАСССТССССССАТСССАССАССАСАТСАССААСА

АССАССТСАСССТеАССТеССТССТСАААееСТТСТАССССА6ССАСАТСССС6ТССА6Т6С6

АААССААТ66ССАСССССАСААСААСТАСААСАССАССССТССССТ6СТССАСТСССАСС6СТ

ССТТСТТССТСТАСАССАСССТААСССТССАСААСАССАСбТСССАбСАССССААТСТСТТСТ

САТССТСССТСАТССАТСАСССТСТССАСААССАСТАСАСАСАСАА6АСССТСТСССТ6ТСТС

ТСССТ

С8“со16 1дС4 НС (3Εβ 10 N0:48)

САССТТСАССТ6СТССАСТСТССТССТСАССТСААСААСССТ6СТСССТСАСТ6ААСС

ТСТССТССААСССТТСТССТТАСАСАТТСАСТСАСТАСТАСАТССАСТСССТСССТСАССССС

СТССТСААССТСТТСА6ТССАТСССТССТСТТААТССТТАТСССССТАСТАСТАССТАСААСС

АСАААТТССАССССССТСТСАССАТСАССАСАСАСАСАТССАССАССАСАСССТАСАТССАСС

ТСССТАСССТСССТТСТСАССАСАС6ССССТСТАТТАСТСТ6ССССТ6ССААСАТТСТТСАСТ

АСТССССССАССССАССАСССТСАСССТСТССТСССССТССАССААССССССАТСССТСТТСС

СССТАССССССТССТССАССАССАССТСССАСАССАСАСССССССТ6С6СТСССТССТСААСС

АСТАСТТСССССААССбеТбАСббТеТСОТеСААСТСАСССССССТСАССАСССеССТбСАСА

ССТТССССССТСТССТАСАСТССТСАССАСТСТАСТСССТСАССАСССТССТСАСССТССССТ

ССАССАССТТССССАССААСАССТАСАССТССААССТАСАТСАСААССССАССААСАССААСС

ТССАСААСАСА0ТТСА6ТССАААТАТС0ТСССССАТССССАСССТССССАССАССТСАССССС

СССССССАССАТСАСТСТТССТСТТССССССААААСССААССАСАСТСТСАТСАТСТСССССА

ССССТСАССТСАССТСС6ТССТССТ6САССТСАСССАССААСАСССС6АССТССА6ТТСААСТ

ССТАССТССАТССССТ6САССТССАТААТСССААСАСАААССССССССАССАССАСТТСААСА

ССАС6ТАСС6ТСТССТСА6ССТССТСАСССТССТССАССАССАСТСССТСААССССААССАСТ

АСААСТССААебТСТССААСАААбСССТССССТССТССАТССАСААААССАТСТССАААСССА

ААССССАбСССССАСАбССАСАССТСТАСАСССТССССССАТСССАССАССАСАТСАССААСА

АССАССТСАСССТСАССТ6ССТС6ТСАААСССТТСТАССССАСССАСАТСССССТССАСТССС

ААДССААТСбССАСССССАСААСААСТАСААСАССАССССТССССТССТССАСТСССАССбСТ

ССТТСТТССТСТАСАССАСССТААСССТССАСААСАССАССТСССАС6А6СССААТСТСТТСТ

САТССТСССТСАТССАТСАСССТСТ6САСААССАСТАСАСАСАСААСАСССТСТСССТ6ТСТС

ТСССТ

ЕСО с-МеЪ человека-ГС-Γ1ί3 (3Ερ 10 N0:72)

МКАРАПЛРСТХУХМТ1,ГеК5И^,ЙЕСКБАЪАК5ЕМЫ7ЫМКУ0ЬРНЕ’ТАЕТР10ЫУ1ЬН

ЕНН1ЕЕСАТМУТУУЕМЕЕОЕ0КУАЕУКТСРУЕЕНРОСЕРС0ОС53КАЫЕЗССУИКРЫ1ИМАЕУ

УОТУУОООЫ5ССЗУККСТСОРНУЕРНЫНТАР105ЕУНС1ГЗРС1ЕЕРЗОСРОСУУЗАЕСАКУ

Σ55νΚΌΡΕΙΝΕΕνσΝΤΤΝ55ΥΕΡ0ΗΡΣΗ5Ι3νΚΡΣΚΕΤΚΟ£ΓΜΓΣΤΟ05ΥΙΏνΣΡΕΕΡΟ5ΥΡΙ куунаеезыыНуеътуокетьоастенткыкесзтызсьнзумемрьесхътекркккзтк ΚΕνΓΝΙΕ0ΑΑΥν3ΚΡσΑ0ΣΑΡΩΙΰΑΞΕΝΟϋΙΕΕ6ν?ΑΟ5ΚΡΟ3ΑΕΡΜΌΚ3ΑΜαΑΕΡΙΚΥνΝΟΕ ΕΝΚίνΝΚΝΝνΒΟΕΟΗΕΥΟΡΝΗΕΗΕΕΝΡΤΣΙΡΝΞΞΰεΕΑΡΡϋΕΥΡΤΕΓΤΤΑΕΟΡνϋΕΕΜΘΟΕΞΕ УЪЕТ315ТЕ1КСРЕТ1АЫЕСТ5ЕСКЕМдУУУЗЕЗСРЗТРНУЫЕЬЬОЗНРУЗРЕУ1 νΕΗΤΣΝζ)Ν СУТЕУ1ТСКК1ТК1РЕМСЕССРНГ05С50СЕЗАРРЕУОССНСНОКСУКЗЕЕСЕЗСТИТ001СЕ РА1УКУЕРЫБАРЕЕС6ТКЕТ1ССИОЕСЕККММКЕОЕККТКУЕЕСЫЕЗСТЕТЕЗЕЗТМНТЕКСГ ν6ΡΑΜΝΚΗΕΝΜ5ΙΙΙ3ΝΘΗ0ΤΤ0Υ3ΤΓ3Υν0ΡνΐΤ3Ι3ΡΚΥ0ΡΜΑΘβΤΕΕΤΕΤ0ΝΥΕΝ36Ν3Κ ΗΙ5ΙΰΰΚΤθΤΕΚ5ν5Ν3ΐΕΕ0ΥΤΡΑ0ΤΙ5ΤΕΕΑνΚΕΚΙΡΕΑΝΚΕΤ3ΐΕ3ΥΚΕθΡΐνΥΕΙΗΡΤΚ 5Е15ССЗТ1Т6УСКМЕЫЗУЗУРРМУ1КУНЕАСРЫЕТУАС0НК5ЕЗЕ11ССТТР5Ь00ЫВДЬР ЕКТКАЕГМЕ0С1Е5КУЕ0Е1УУЯЫРУЕКРГЕКРУМ13МСЫЕНУЕЕ1КСЫРХ0РЕАУКСЕУЕКУ ΟΝΚ5€ΕΝΙΗΙ,Η5ΕΑνΚΤνΡΝΟΕ/ΕΚΣΝ5ΕΙιΝΙΞΜΚ<2ΑΙ53ΤνΕ£Κνΐν0Ρϋ0ΝΡΤΙ.ΕνΕΕ0ΟΡ Е1ЕРК5СПКТНТСРРСРАРЕЕЕССР5УЕЕЕРРКРКРТЕМГ5КТРЕУТСУУУРУ5НЕ0РЕУКЕЫ ϋϊΥνθβνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ0ΥΝ3ΤΥΚνν3νΕΤνΕΗ0ΟΐΐΕΝΟΚΕΥΚΟΚνΞΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙ3ΚΑ Κ3ΰΡΚΕΡΟΕΥΤΕΡΡ5ΡΕΕΜΤΚΝθν3ΕΤΟΕνΚ£ΓΥΡ3ϋΙΑνΕΜΕ5Ν£ΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕ03θσ ЗЕЕЕУЗКЕТУРКБКИООСМУЕЗСЗУМНЕАЪНМНУТОКЗЕЗЕБРСКРХРТКРООРКНУНННННН

Аминокислоты, выделенные полужирным курсивом, представляют собой сигнальную последовательность; аминокислоты, выделенные полужирным подчеркнутым шрифтом, представляют собой маркер Р118.

- 47 020398

ЕСО с-МеЪ яванского макака-Е*С-£*1х& (ЗЕО Ю N0:73)

МКаРАУЪГРеИКЬЫТХУСКетОЕСКБАЪАКЗЕМЫУКМКУОЬРКГТАЕТАЮЫУХЬН

ЕНН1ЕЪСАТЫУ1УУЪИЕЕОЪ£КУАЕУКТСРУЪЕНРОСЕРСООСЗЗКАЫЕЗССУИКОЫ1ЫМАЬУ

У0Т¥УОО0Ы5СС5УЫКСТССЕНУГРН1ЯНТАО1125ЕУНС1Г5Р0:!:ЕЕР№СР0СУУЗАЪСАКУ

13ΞνΚϋΗΡΙΝΓΡν6ΜΤΙΝ3ΞΥΡΡΗΗΡΕΗ3Ι3νΚΡ1ΚΕΤΚΌ6ΡΜΡ1Τ00ΞΥΙθνΒΡΕΕΕ0ΞΥΡΙ

КУ1НАЕЕЗМЫЕ1УЕЪТУ0КЕТЬМА2ТЕНТЕ11ЕЕСЗЬЫЗСЪНЗУМЕМРЬЕС1ЬТЕКЕККЕЗТК

КЕУГМ1Ь0ААУУ5КРСАаЬАК01СА5ЬЫО01ЬГ6УЕ*А<Э8КР05АЕРМ0К5АМСАКР1КУУЫ0Е*

ЕЫКТУКККЮТЕСЬОНЕУеРКНЕНСЕЫИТЬЬЕЫЗЗССЕАККОЕУЕАЕЕТТАЬОРУОЬЕМСОЕЗЕ

УЬЪТ513ТЕУКСОЬТ1АЫЪСТЗЕ5КЕМ127УУ5Р36РЗТРН7ЫЕЪ1,РЗНРУЗРЕУ1УЕНРЬН0Н

СУТЬУУТСКК1ТК1РЬИСЬССЙНЕС5С50СЬ5АРРЕУОССИСНОКС7К8ЕЕСРЗСТ№ТаеДСЬ

РА1УКУЕРТЗАРЬЕССТКЬТ1СС№РРСЕНКММКРПЪККТКУЬЕСТЗЕ5СТЕТЪЗЕЗТМНТЪКСТ

УбРАМНКНЕКМЗИГЗ^СНСТТдУЗТГЗУУОРИТЗТЗРКУСРМАеСТЬЬТЬТСЫУЬЫЗСЫЗЕ

ΗΙ5Ι33ΚΤΌΤΙιΚ3ν3Ν3ΙΙιΕ0ΥΤΡΑ<2ΤΙ3ΤΕΕΑνΚΙ,ΚΙΠ1ΑΝΚΕΤ5ΙΕ3ΥΚΕ0ΡΐνΥΕΙΗΡΤΚ

ЗЕ13665Т1ТСУСКМЪН5УЗУРКМУ1ЫУНЕАСРМЕТУАС0НЕ5КЗЕ1ТССТТРЗЬ2СЪМЕС5ЕР

ΣΚΤΚΑΕΕΜΕ0σΐΕ3ΚΥΕ0ΣΙΥνΗΝΡνΕΚΡΕΕΚΡνΜΙ3Μ0ΝΕΝνΐ.ΕΙΚΰΝΡΙ0ΡΕΑνΚΰΕνΐιΚν

ΟΝΚ30ΕΝΙΗΣΗ5ΕΑνΣΟΤνΡΝΟΕΕΚΕΝ5ΕΕΝΙΕΗΚΟΑΙ85ΤνίΘΚνΐνθΡΟΟΝΕΊΈΕνΐ,ΕΟθΡ

П1ЕРКЗС0КТНТСРРСРАРЕЬЬеСРЗУЕЬЕРРКРКРТЬМ15ЕТРЕУТСУУУ0УЗНЕ0РЕУКРМ

ИУУОСУ£УНЫАКТКРПЕЕОУЫ5ТУКУУЗУЪТУЬНООНЬМСКЕУКСКУЗНКАЪРАР1ЕКТ15КА

ΚΘΟΡΚΕΡΟΕΥΤΕΡΡ5ΚΕΕΜΤΚΝς)ν3ΣΤΟΣνΚΟΡΥΡ50ΙΑνΕΗΕ3ΝΕΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕ03θε

ЗЕЕЬУЗКЬТУРКЗРИОССМУГЗСЗУМНЕАЬНННУТйКЗЬЗЬЗРСККЮУКРРРРКНУНННННН

Аминокислоты, выделенные полужирным курсивом, представляют собой сигнальную последовательность; аминокислоты, выделенные полужирным подчеркнутым шрифтом, представляют собой маркер Ρ1Ϊ8.

ЕСР С-Ме! крысы-РС-ГЫз (8Е2 ГО N0:74)

МКАР2Я1ЛРСКЬЫ1ТХАЙК8ЯСЕСКЕАЬУК5ЕМЫУЫМКУ0ЬРЫГТАЕТР1НМУУЬН

ΟΗΗΙ ΥΙ,ΟΑΤΝΥΙΥνί,ΝϋΚΟΙ,βΚνΞΕΓΚΤίσΡννΕΗΡΟΟΡΡΟΟΟσΞΞΚΑΝνίϊΟΟνΐίΚΟΝνΝΜΑΙ,Ι, У0ТУУР00ЫЗССЗУНЕСТСЙННУЬРРРЫААР105ЕУНСМГЗРЬАЕЕЕ560СРРСУУЗАЪСАК УЪЬЗЕК0КГ1ЫЕЕУОЫТ1ЫЗЗУРРО¥ЗЬН515УККЬКЕТС!ОСЕКЕЬТОС>ЗУ1ОУЬРЕЕН05УР ΙΚΥΙΗΑΡΕ5ΝΗΕΙΥΡΙ,ΤνΟΚΕΤΙ,ΡΑζίΊΤΗΤΚΙ1ЕЕСЗУОЗСЬНЗУМЕМРЬЕС1ЬТЕККРККЗТ ЕЕЕУЕЫ1ЬОААУУЗКРСАЫЪАК010А5РУР01ЬУСУЕАОЗКРРЗАЕРМЫКЗАУСАЕР1КУУЫР ΓΡΝΚΐνΝΚΝΝνΕ0Ιι0ΗΓΥ6ΡΝΗΕΗΟΕΝΚΤΙ,Ι,ΕΝ55(3ΟΕνΚ5ΟΕΥΕΤΕΕΤΤΑΙ,0ΕνΌΙ,ΡΜ(3ΕΙ,Ν НУЕЬТ515ТЕ1КС0ЪТ1АНЪСТ5Е0КРМС)УУЬ5КТАНРТРНУНЕЬЬР5УРУЗРЕУ1УЕНР5Ы2 ЫеУТЬУУТОКК1ТК1РЬЫСЕСССНЕОЗСЗОСЬЗАРУЕ10СОНСННЕСУНЗЫЕСР50ТНТОЕ1С ЪРАУУКУГРТЗАРЬЕ6СТМЬТ1ССН0ГСГККНИКЕРЬККТКУЫСМЕ5СТЪТЬ5ЕЗТТМТЬКС ТУ6РАМ5ЕНЕЫУЗУ1УЗЫЗЕЕТТ0У5АЕЗУУРРУ1Т313РКУСРНАСеТЬЬТЬТСКУЬНЗСН5 КН131ООКТСТЬКЗУ3051ЪЕСУТРСНТУЗАЕЕРУКЬКГОЬА0КУТЗЗГЗУКЕОРУУЗЕ1НРТ К5Р13беЗТ1ТС16КНЬЫ5У5ТРКЬУ1ЕУН0У6УЫ¥ТУАС0НКЗЗЗЕ11ССТТРЗЪ20ЬРЪ0Ь РЬКТКАЕЕЬЪ0С1Ь5КНГРЬТУУН0РМРКРЕЕКРУМ13МСНЕНУУЕ1КС00ГОРЕАУКСЕУЬК УСНКЗСЕНЪНИН5ЕАЫ.СТУР5РЬЬКЪК1ССЕЬМ1ЕИК0АУ55ТУЬСКУ1У0РР(ЭЫЕАЬЕУЬГ0 еРР1ЕРК5С0КТНТСРРСРАРЕЬЬССР5УЕЬГРРКРКРТЕМ13КТРЕУТСУУУРУ5НБ0РЕУК

ΕΝΜΥνΟΕνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝΒΤΥΕννβνΐ,Τνί,ΗΟΟΜΕΝεΚΕΥΚαΚνβΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙΒ

КАКОСРКЁР0ЕУТЬРРЗЕ<ЕЕМТКН0У5ЪТСЬУКОЕУРЗР1АУЕИЕЗЫО0РЕЫЫУКТТРРУЪР5

РСЗЕЕЬУЗКЪТУРКЗКИООеНУЕЗСЗУМНЕАЬНИНУТОКЗЬЗЕЗРбКЕГОУКРРРРКНУНННН

НН

ЕСР с-МеЪ человека (££{2 ¹⁰ N0:75)

МКАРАтаДРет£УЬХГТХТОК5ЖЖСКЕАЬАК5ЕМЫУЫМК¥0ЬРЫРТАЕТР10ЫУ1ЬН

ЕННТГЬСАТКУ!УУЬЫЕЕОЬ0КУАЕУКТСРУ1ЕНРОСГРС£ОСЗЗКАНЪ36СУИКРЫ1ЫМАЬУ У0ТУУЕ0(ЭЫЗСеЗУНКСТССИНУГРНЫНТА0Х23ЕУНС1РЗР|21ЕЕРЗССР0СУУЗАЬСАКУ

- 48 020398

Ε53νΚΌΕΕΙΝΕΕν6ΝΤΪΝ35ΥΕΡ0ΗΡΙιΗ5Ι5νΚΚΙ,ΚΕΤΚθαΡΜΕΙιΤ005ΥΙϋνΐ,ΡΕΕΚΟ5ΥΡΙ ΚΥνΗΑΓΕ3ΝΝΕΙΥΕΣΤν£ΕΕΤΙΟΑΟΤ?ΗΤΚΙΙΡΕ05ΙΝ$ΟΙΗ5ΥΜΕΜΡΕΕΟΙΕΤΕΚΗΚΚΚ£ΤΚ ΚΕνΕΝΙΕΰΑΑΥν3ΚΡ6Α0ΕΑΕΩΐσΑ3ΕΝϋϋΙΕΕανΕΑ23ΚΡϋΞΑΕΡΜϋΕΞΑΜΟΑΕΡΪΚΥνΝΟΕ ΓΝΚΐνΝΚΝΝνΚ€Ε0ΗΕΥ6ΡΝΗΕΗαΕΝΚΤΕΕΚΝΞ5ΟΟΕΑΚΚΟΕΥΚΤΕΕΤΤΑΕζ)ΚνθΕΕΜσ(2ΕΞΕ νΕΕΤ5Ι3ΤΕΙΚσ0ΕΤΐΑΝΕΘΤ8Ε6ΡΕΜαννν5Κ50Ρ5ΤΡΗνΝΕΕΕ05ΗΡν3ΡΕνΐνΕΗΤΙ,ΝΩΝ С¥ТЕУ1Т6ККТТК1РЬЫСЬССРНЕ05С30СЬ5АРРЕУаССМСНОКС7Р5ЕЕСЪЗСТИТ001СЪ РА1¥К7ГРНЗАР1ЕееТКЬТ1ССИ0ЕСЕККЫККЕ0ЕККТЕ7ЬЪ51>]Е5СТЬТЬ5Е5ТМЫТЪКСТ ν0ΡΑΜΝΚΗΕΝΜ5ΙΙΙ5ΝΘΗ6ΤΤ(2ΥΞΊΤΞΥνΕΡνΐΤΞΙΞΡΚΥ6ΡΜΑ(30ΤΕΕΊΈΊΌΝΥΙ,ΝΞ6ΝΞΚ ΗΙ3Ι6ςΚΤσΤΕΚ3νΞΝ5ΣΕΕΟΥΤΡΑ0ΤΙ3ΤΕΕΑνΚΕΚΙΟΕΑΝΕΕΤ3ΙΕΞΥΕΕΩΡίνΥΕΙΗΡΤΚ ЗЕ15ССЗТ1ТСТСКЫЬМ5УЗУРРМ71Ы7НЕАСЕЫЕТУАС0НКЗМ8Е11ССТТР5Ь(ЮЬЫЬ0ЬР ЬКТКАЕЕМЬ0С1Е5КУЕ0Е1¥УНЫР7ЕКРЕЕКРУМ13М6КЕМУЕЕ1КСМ010РЕАУКСЕ7ЪК7 ΟΗΚ3ΓΕΝΙΗΕΗ3ΕΑνΕΟΤνΡΝΌΕΕΚΕΝ3ΕΕΝΤΕΝΚΟΑΙ33ΤνΕ3ΚνΐνΰΡΟΏΜΕΤ

Аминокислоты, выделенные полужирным курсивом, представляют собой сигнальную последовательность.

Домен Зеша с-МеЪ человека с маркером Р11з (5Е0 10 N0:76) МКаРАгаЛРСХХГЬХВТЬУСЮЛСЕСКЕАЬАКЗЕМНУЫМКУОЕРЫГТАЕТРЮНУТЕН

ΕΗΗΙΕΕΟΑΤΝΥΙΥνΕΗΕΕΟΕΟΚνΑΕΥΚΤΟΡνΕΕΗΡϋΟΕΡΟΟϋΟΞΞΚΑΜΕΞΟΌνΜίωΝΙΝΜΑΕν ν0ΤΥΥ000ΕΙ5Ο03λ™Κΐ3ΤΟ0ΕΗνΕΡΗΜΗΤΑ0Ιΐ3ΞΕνΗΟΙΡ3ΡΩΙΕΕΡ5(2ΟΡ00νν£ΑΕΟΑΚν

Ε35νΚ0Ε<ΕΙΝΕΕνθΗΤΙΝ55ΥΕΡΟΗΡΕΗΞΙ5νΡΚΕΚΕΤΚΠΟΕΜΕΕΤΟ03ΥΙθνΕΡΕΕΚΟ3ΥΡΙ

ΚΥνΗΑΕΕ3ΝΝΕΙΥΕΕΤνθΡΕΤΕΟΑ(2ΤΕΗΤΚΣΙΕΕΟΞΙΜΞΞΕΗ3ΥΜΕΜΡΕΕςΐΕΤΕΚΡΚΚΡ3ΤΚ

ΚΕνΕΝΐΕ£ΑΑΥν5ΚΡ8Α3ΕΑΡ0Ι<5Α3ΕΝΌΟΙΕΕθνΡΑ05ΚΡΕ3ΑΕΡΜϋϊ<5ΑΜΟΑΕΡΙΚΥνΝΟΓ

ΕΝΚΐνΝΚΝΝνΡΟΕ0ΗΕΥ6ΡΝΗΕΗΟΕΝΕΤΕΕΚΝ35ΰΟΕΑΕίΐθΕΥΚΤΕΕΤΤΑΕ0ΚνθΕΕΜ60Ε3Ε νΕΕΤ5Ι3ΤΕΙΚ£ΟΕΤΙΑΝΕΟΤΞΕΰΚΓΜΩννν5Ε5θΡΞΤΡΗνΝΕΕΕ03ΗΡν5ΡΕνΐνΕΚΤΕΝ£Ν е¥ТЪ71ТСКК1ТК1РЬМСЬаСКНГ£5С50СЬ5АРРГУ£ССЮСНЕКСТНЗЕЕСЬЗСТИТ001С1|

РУКРРРРКНУНННННН

Аминокислоты, выделенные полужирным курсивом, представляют собой сигнальную последовательность; аминокислоты, выделенные полужирным подчеркнутым шрифтом, представляют собой маркер РНк

Эпитопы антител С8- во внеклеточном домене с-Ме! человека

121¹У^ТУУВПРЬ130 (8ЕЕ) ΙΌ Ν0: 77) вДБСОБ’УЫКОТСРКНУРРНХНТАП^^ (8ЕЕ) ΙΌ Ν0: 78) пэАЬОАКтБ’УКОКРПМР^ (8ЕЕ) ΙΌ Ν0: 79) и ₂1</УККЬКЕТКООРМ₂₂₇ (8ЕЕ) ΙΌ Ν0: 80) ₁₂₃ОТУУ0О₁₂₈ (8ЕЕ) ΙΌ Ν0: 81) мЛ’УРРНХНТАО^^ (8ЕО ΙΌ Ν0: 82) ₁₉₂РТЫР₁₉₅ (8ЕЕ) ΙΌ Ν0: 83) ₂₂₀КЕТКООРМ₂₂₇ ( 8ЕЕ) ΙΌ Ν0: 84)

Эпитопы антител Ό11- во внеклеточном домене с-Ме! человека ₈₄УКТОР’УЪЕНРОСРРСрОС88КА№₉5 (8ЕЕ) ГО Ν0: 85) ₉₅СРРСРОС88КА₁₀₅ (8ЕЕ) ГО Ν0: 86)

Консенсусные последовательности СОК

СЮК2 легкой цепи антител Ό11ОТ8Х1ЬХ₂8 (8Е0 ГО Ν0: 87), где Х₁ представляет собой Υ или К, а Х₂ представляет собой А или К;

СЮК1 легкой цепи антител С88V888VX₃8IУ^Н (8Е0 ГО Ν0: 88), где Х₃ представляет собой 8 или К;

СЮК3 легкой цепи антител С8Х.-ХяУХсСУРЬТ (8Е0 ГО Ν0: 89), где Х₄ представляет собой Ι или О, Х₅ представляет собой О или V, а Х₆ представляет собой 8 или К;

СЮК2 тяжелой цепи антител Ό11\VIУРVТС^ТУУX-ЕX₈ΡI<С (8Е0 ГО Ν0: 90), где Х₇ представляет собой Ν, Ι или К, а Х₈ представляет собой К или Р;

СОК3 тяжелой цепи антител Ό11ОΥОАΡX9Υ (8Е0 ГО Ν0: 91), где Х₉ представляет собой Υ или Р;

СОК2 тяжелой цепи антител С8ΡVNРX_|0ΡX_||X_I2ТТУN^КΡЕС (8Е0 ГО Ν0: 92), где Х₁₀ представляет собой Ν или Υ, Х₁₁ представляет собой О или К, а Х₁₂ представляет собой О или 8;

СОК3 тяжелой цепи антител С8Х|₃,ХХ|..|ЬОУ (8Е0 ГО Ν0: 93), где Х₁₃ представляет собой Т или А, а Х₁₄ представляет собой или Ι;

- 49 020398

Консенсусные последовательности вариабельной области легкой цепи Консенсусная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела Ό11- (8ЕЦ ГО N0: 94)

Е1УЬТ(25РСТЕ5ЬЗР6ЕЕАТЬЗСЗУ333133ТЫЬНИУООКРСОАРЕЬЫУ еТЗХхЬХгЗСГРРКЕ’ЗбЗОЗСТОЕ'ТЪТТЗЕЪЕРЕОГАУУУСООИЗЗУРУЗГС <2СТКЬЕ1К где Х₁ представляет собой Υ или К, а Х₂ представляет собой А или К;

Консенсусная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела С8- (8ЕЦ ГО N0: 95)

012МТОЗР53ЬЗАЗУСОКУТ1ТС5УББЗУХ₃31УЬНМУООКРСКАРКЕЪ1У

ЗТЗЫЪА5СУРЗЕЕЗСЗеЗСТ0ЕТЬТ15БЬ0РЕ0ЕАТУУСХ₄Х₅УХ₆СУРЬТЕС

ССТКУЕ1К где Х₃ представляет собой 8 или К, Х4 представляет собой I или О, Х₅ представляет собой О или У, а Х₆представляет собой 8 или К;

Консенсусные последовательности вариабельной области тяжелой цепи Консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела Ό11- (8ЕЦ ГО N0: 96) <2У(21Л7<Э5САЕУККРС55УКУ8СКА5СУТЕТ5ЕУ ГН№УЕ<ЭАРСССЬЕ№МСИ

1УРУТ60ТУУХ₇ЕХ₃ЕКСЕУТ1ТАОКЗТБТАУМЕЪЗЗЬЕЗЕ0ТАУУУСАКСУ

САЕХ_эУИСфСТЪУТУ5 где Х₇ представляет собой N I или К, Х₈ представляет собой К или Р, а Х₉ представляет собой Υ или Р; Консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела С8- (8ЕЦ ГО N0: 97)

0νφΙ,ν<25(3ΑΕνΚΚΡΰΑ5νκν5<;ΚΑ5ΟΥΤΕΤϋΥΥΜΗΜνΚ0ΑΡεζ)εΐ,Ε»Μ6Κ νΝΡΧκ,ΚΧχιΧιζΤΤΥΝΟΚΓΕεκνΤΜΤΤϋΤεΤεΤΑΥΜΕΙ,Κεί,ΕΞϋΟΤΑνΥΥσΑΚΧηΝΧι,ιΙ,ΕΥΜΰ

Φεττντνε где Х₁₀ представляет собой Υ или N Х₁₁ представляет собой О или К, Х₁₂ представляет собой 8 или О, Х₁₃ представляет собой А или Т, а Х₁₄ представляет собой I или

Список последовательностей <110> ЕН Ы11у апс! Сотрапу <120> Антитела к с-МеС <130> Х-18217 <150> 61/116825 <151> 2008-11-21 <150> 61/219903 <151> 2009-06-24 <150> РСТ/и32009/064881 <151> 2009-11-18 <160> 97 <170> Версия РаЬепЩп 3.5 <210> 1 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 1

С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг 01п 5ег Рго С1у ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у 15 10 15

С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег Уа1 Зег Зег Зег 11е Зег Зег ТЬг 20 25 30

Азп Ьеи Ηίδ Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 35 40 45

11е Туг С1у ТЬг Зег Туг Ьеи А1а Зег 01у Не Рго Азр Агд РЬе Зег 50 55 60

С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ьеи С1и

70 75 80

Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Тгр Зег Зег Туг Рго

Туг Зег РЬе 01у С1п 01у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз 100 105 <210> 2 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность

- 50 020398 <220>

<2 23> Синтетический конструкт <400> 2

С1и Не Уа1 Ьеи ТЕг С1п Бег Рго С1у ТЬг Ьеи Бег Ьеи Бег Рго С1у

С1и Агд А1а ТЕг Ьеи Бег Суз Бег Уа1 Бег Бег Бег Не Бег Бег ТЕг

Азп Ьеи Низ Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи

11е Туг С1у ТЕг Бег Туг Ьеи А1а Бег С1у Не Рго Азр Агд РЕе Бе

С1у Бег С1у Бег <31у ТЕг Азр РЕе ТЬг Ьеи ТЕг 11е Бег Агд Ьеи С1и

Рго С1и Азр РЕе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Тгр Бег Бег Туг Рго

Туг Бег РЕе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз 100 105 <210> 3 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400 3

С1и Не Уа1 Ьеи ТЕг С1п Бег Рго 61у ТЕг Ьеи Бег Ьеи Бег Рго С1у

С1и Агд А1а ТЕг Ьеи Бег Суз Бег Уа1 Бег Бег Бег 11е Бег Бег ТЕг

Азп Ьеи Нлз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи

11е Туг €1у ТЕг Бег Агд Ьеи Агд Бег С1у 11е Рго Азр Агд РЕе Бег 50 55 60

С1у Бег С1у Бег С1у ТЕг Азр РЕе ТЕг Ьеи ТЕг Не Бег Агд Ьеи С1и

Рго С1и Азр РЕе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Тгр Бег Бег Туг Рго <210> 4 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 4

Азр 11е С1п Мер ТЕг С1п Бег Рго Бег Бег Ьеи Бег А1а Бег Уа1 С1у 15 10 15

Азр Агд Уа1 ТЕг Не ТЕг Суз Бег Уа1 Бег Бег Бег Уа1 Бег Бег 11е 20 25 30

Туг Ьеи НЬз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 35 40 45

11е Туг Бег ТЕг Бег Азп Ьеи А1а Бег С1у Уа1 Рго Бег Агд РЕе Бег 50 55 60

С1у Бег 51у Бег С1у ТЕг Азр РЕе ТЕг Ьеи ТЕг 11е Бег Бег Ьеи С1п

70 75 80

Рго С1и Азр РЕе А1а ТЕг Туг Туг Суз 11е С1п Туг Бег С1у Туг Рго <210> 5 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 5

Азр 11е С1п МеГ ТЕг С1п Бег Рго Бег Бег Ьеи Бег А1а Бег Уа1 С1у 15 10 15

Азр Агд Уа1 ТЕг 11е ТЕг Суз Бег Уа1 Бег Бег Бег Уа1 Бег Бег Не

Туг Ьеи Низ Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи

- 51 020398

Не Туг Зег ТЬг 5ег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа! Его Зег Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег с1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е 65 70 75	Зег Зег	Ьеи	С1п 80
Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п Уа1 Туг 85 90 Ьеи ТЬг РЬе <31у С1у 61у ТЬг Ьуз Уа1 51и 11е Ьуз 100 105 <210> б <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> Синтетический конструкт <400> б	Зег С1у	Туг 95	Рго
Азр Не С1п Мес ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег 1 5 10	А1а Зег	Уа1 15	С1у
Азр Агд \7а1 ТЬг 11е ТЬг Суз Зег Уа1 Зег Зег Зег 20 25	Уа1 Агд 30	Зег	Не
Туг Ьеи Ηϊβ Тгр Туг С1п 31п Ьуз Рго 61у Ьуз А1а 35 40	Рго Ьуз 45	Ьеи	Ьеи
Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег б1у Уа1 Рго 50 55 60	Зег Агд	РЬе	Зег
С1у Зег С1у Зег <51у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е 65 70 75	Зег Зег	Ьеи	С1п 80
Рго €1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п Уа1 Туг 85 90 Ьеи ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз 100 105 <210> 7 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Синтетический конструкт <400> 7	Агд С1у	Туг 95	Рго
даааЕЕдЕдЕ ЕдасдсадЕс Ессаддсасс сЕдЕсЕЕЕдЕ сЕссадддда	аададссасс		60
сЕсЕссЕдса дЕдЕсадсЕс аадЕаЕаадЕ ЕссассаасЕ ЕасасЕддЕа	ссадсадааа		120
ссЕддссадд сЕсссаддсЕ ссЕсаЕсЕаЕ ддсасаЕссЕ аЕсЕддсЕЕс	ЕддсаЕссса		180
дасаддЕЕса дЕддсадЕдд дЕсЕдддаса дасЕЕсасЕс ЕсассаЕсад	садасЕддад		240
ссЕдаадаЕЕ ЕЕдсадЕдЕа ЕЕасЕдЕсаа садЕддадСа дЕЕасссдЕа саадддасса адЕЕддадаЕ сааа <210> 8 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Синтетический конструкт <400> 8	садЕЕЕсддс		300 324
даааЕЕдЕдЕ ЕдасдсадЕс Ессаддсасс сЕдЕсЕЕЕдЕ сЕссадддда	аададссасс		60
сЕсЕссЕдса дЕдЕсадсЕс аадЕаЕаадЕ ЕссассаасЕ ЕасасЕддЕа	ссадсадааа		120
ссЕддссадд сЕсссаддсЕ ссЕсаЕсЕаЕ ддсасаЕссЕ ассЕддсЕЕс	ЕддсаЕссса		180
дасаддЕЕса дЕддсадЕдд дЕсЕдддаса дасЕЕсасЕс ЕсассаЕсад	садасЕддад		240
ссЕдаадаЕЕ ЕЕдсадЕдЕа ЕЕасЕдЕсаа садЕддадЕа дЕЕасссдЕа саадддасса адЕЕддадаЕ сааа <210> 9 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Синтетический конструкт <400> 9	садЕЕЕсддс		300 324
даааЕЕдЕдЕ ЕдасдсадЕс Ессаддсасс сЕдЕсЕЕЕдЕ сЕссадддда	аададссасс		60
сЕсЕссЕдса дЕдЕсадсЕс аадЕаЕаадЕ ЕссассаасЕ ЕасасЕддЕа	ссадсадааа		120
ссЕддссадд сЕсссаддсЕ ссЕсаЕсЕаЕ ддсасаЕсса дасЕдадаЕс	ЕддсаЕссса		180
дасаддЕЕса дЕддсадЕдд дЕсЕдддаса дасЕЕсасЕс ЕсассаЕсад	садасЕддад		240
ссЕдаадаЕЕ ЕЕдсадЕдЕа ЕЕасЕдЕсаа садЕддадСа дЕЕасссдЕа саадддасса адЕЕддадаЕ сааа	садЕЕЕсддс		300 324

<210> 10 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400 10

дасаДссада ДдасссадДс	ДссаДссДсс сДдДсДдсаД	сДддаддада	сададДсасс	60
аДсасДДдса дДдДсадсДс	аадДдДаадД ДссаДДДасД	ДдсасДддДа	Дсадсадааа	120
ссадддааад ссссДаадсД	ссДдаДсДаД адсасаДсса	асДДддсДДс	ДддадДссса	180
ДсааддДДса дДддсадДдд	аДсДдддаса даДДДсасДс	ДсассаДсад	садДсддсаа	240
ссДдаадаДД ДДдсаасДДа	сДасДдДаДД садДасадДд	дДДасссдсД	сасдДДсддс	300
ддадддасса аддДддадаД	сааа			324
<210> 11
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 11
дасаДссада ДдасссадДс	ДссаДссДсс сДдДсДдсаД	сДдДаддада	сададДсасс	60
аДсасДДдса дДдДсадсДс	аадДдДаадД ДссаДДДасД	ДдсасДддДа	Дсадсадааа	120
ссадддааад ссссДаадсД	ссДдаДсДаД адсасаДсса	асДДддсДДс	ДддадДссса	180
ДсааддДДса дДддсадДдд	аДсДдддаса даДДДсасДс	ДсассаДсад	садДсДдсаа	240
ссДдаадаДД ДДдсаасДДа	сдасдддсад дДдДасадДд	дДДасссдсД	сасдДДсддс	300
ддадддасса аддДддадаД	сааа			324
<210 12
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220
<223> Синтетический конструкт
<400> 12
дасаДссада ДдасссадДс	ДссаДссДсс сДдДсДдсаД	сДддаддада	сададДсасс	60
аДсасДДдса дДдДсадсДс	аадДдДасдД ДссаДДДасД	ДдсасДддДа	Дсадсадааа	120
ссадддааад ссссДаадсД	ссДдаДсДаД адсасаДсса	асДДддсДДс	ДддадДссса	180
ДсааддДДса дДддсадДдд	аДсДдддаса даДДДсасДс	ДсассаДсад	садДсДдсаа	240
ссДдаадаДД ДДдсаасДДа	сдасдддсад дДдДасаддд	дДДасссдсД	сасдДДсддс	300
ддадддасса аддДддадаД	сааа			324
<210> 13
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 13
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1	С1п Зег С1у А1а С1и	\7а1 Ьуз Ьуз	Рго С1у Зег
1 5	10		15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег	Суз Ьуз А1а Зег С1у	Туг ТЬг РЬе	ТЬг Зег Агд
20	25		30
Туг Не Ηίδ Тгр Уа1	Агд С1п А1а Рго 61у	01п С1у Ьеи	С1и Тгр МеД
35	40	45
С1у Тгр Не Туг Рго	Уа1 ТЬг С1у Азр ТЬг	Туг Туг Азп	С1и Ьуз РЬе
50	55	60
Ьуз С1у Агд Уа1 ТЬг	11е ТЬг А1а Азр Ьуз	Зег ТЬг Зег	ТЬг А1а Туг
65	70	75	80
МеД С1и Ьеи Зег Зег	Ьеи Агд Зег 01и Азр	ТЬг А1а Уа1	Туг Туг Суз
85	90		95
А1а Агд С1у Туг С1у	А1а РЬе Туг Туг Тгр	01у С1п С1у	ТЬг Ьеи Уа1
100	105		110
ТЬг Уа1 Зег
115
<210> 14
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственна.	я последовательность
<220
<223> Синтетический конструкт
<400> 14
С1п Уа1 С1п Ьеи \7а1	С1П Зег С1у А1а С1и	Уа1 Ьуз Ьуз	Рго С1у Зег
1 5	10		15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег	Суз Ьуз А1а Зег С1у '	Туг ТЬг РЬе	ТЬг Зег Агд
20	25		30
Туг Не Нтз Тгр Уа1	Агд С1п А1а Рго С1у	С1п С1у Ьеи	С1и Тгр МеД
35	40	45
С1у Тгр 11е Туг Рго	Уа1 ТЬг С1у Азр ТЬг '	Туг Туг 11е	С1и Ьуз РЬе
50	55	60

5З

Ьуз С1у 65	Агд	Уа1	ТЬг Не ТЬг А1а Азр Ьуз Бег ТЬг Бег ТЬг А1а Туг
70	75	80
МеС б1и	Ьеи	Бег	Бег Ьеи	Агд Зег б1и Азр ТЬг	А1а Уа1 Туг Туг Суз
			85	90	95
А1а Агд	С1у	Туг	С1у А1а	РЬе РЬе Туг Тгр С1у	61п С1у ТЬг Ьеи Уа1
		100		105	110
ТЬг Уа1	Бег
	115
<210>	15
<211>	115
<212> 1	Белок
<213> 1	Искусственная последовательность
<220>
<223> '	Синтетический конструкт
<400>	15
С1п Уа1	С1п	Ьеи	Уа1 С1п	Бег С1у А1а С1и Уа1	Ьуз Ьуз Рго С1у Бег
1			5	10	15
Бег Уа1	Ьуз	Уа1	Бег Суз	Ьуз А1а Бег С1у Туг	ТЬг РЬе ТЬг Бег Агд
		20		25	30
Туг Не	Ηίδ	Тгр	Уа1 Агд	С1п А1а Рго С1у С1п	61у Ьеи 61и Тгр МеЬ
	35			40	45
С1у Тер	Не	Туг	Рго Уа1	ТЬг С1у Азр ТЬг Туг	Туг Агд 61и Рго РЬе
50				55	бо
Ьуз 61у	Агд	7а1	ТЬг Не	ТЬг А1а Азр Ьуз Зег	ТЬг Зег ТЬг А1а Туг
65			70	75	80
Мес 61с	Ьеи	Бег	Бег Ьеи	Агд Бег С1и Азр ТЬг	А1а Уа1 Туг Туг Суз
			85	90	95
А1а Агд	С1у	Туг	С1у А1а	РЬе Туг Туг Тгр 61у	61п С1у ТЬг Ьеи Уа1
		100		105	110

ТЬг Уа1 Бег 115 <210 16 <211> 114 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 16

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Бег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Бег

Уа1

Ьуз

Уа1

Бег

Суз

Ьуз

А1а

Бег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

20

25

30

Туг

МеС

Ηίβ

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

О1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеЬ

35

40

45

С1у

Агд

Уа1

Азп

Рго

Азп

Агд

С1у

О1у

ТЬг

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1и

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

МеС

ТЬг

Азр

ТЬг

Бег

ТЬг

Бег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

С1и

Ьеи

Агд

Бег

Ьеи

Агд

Бег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

ТЬг

Азп

Тгр

Ьеи

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Уа1

ТЬг

100 105 110

Уа1 5ег <210> 17 <211> 114 <212> Белок <213> Искусственная последовательность

<220>

<223> '

Синтетический конструкт

<400>

17

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Бег

С1у

А1а

С1и

УаЬ

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Бег

Уа1

Ьуз

Уа1

Бег

Суз

Ьуз

А1а

Бег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

20

25

30

Туг

МеС

ΗΪ3

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеС

35

40

45

61у

Агд

Уа1

Азп

Рго

Азп

Агд

С1у

ТЬг

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1и

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

МеС

ТЬг

Азр

ТЬг

Бег

ТЬг

Бег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Μοί С1и Ьеи Агд Зег Ьеи Агд Зег Азр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз

А1а Агд А1а Азп Тгр Ьеи Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг 1/а1 ТЬг 100 105 110 <210> 16 <211> 114 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 18

С1п Уа1 61п Беи \7а1 С1п Зег б1у А1а б1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго <51у А1а 15 10 15

Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг 20 25 30

Туг МеС Шз Тгр ν&1 Агд С1п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи С1и Тгр МеР

С1у Агд Уа1 Азп Рго Туг Агд С1у Зег ТЬг ТЬг Туг Азп С1п Ьуз РЬе

С1и С1у Агд Уа1 ТЬг Мер ТЬг ТЬг Азр ТЬг Зег ТЬг Зес ты А1а Туг

МеР С1и Ьеи Агд Зег Ьеи Агд Зег Азр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз

А1а Агд А1а Азп Не Ьеи Азр Туг Тгр 61у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг 100 105 110 <210> 19 <211> 345 <212> ДНК <213:

<220>

<223>

Искусственная последовательность

Синтетический конструкт

РссРдсаадд сРРсРддсРа сассРРсаса адРаддРаРа РасасРдддР дсдасаддсс 120 ссрддасаад ддсРРдадРд даРдддаСдд аРРРаРссРд РаасРддРда РасРРасРас 180 аасдадаадР Рсаадддсад адРсасдаРР ассдсддаса ааРссасдад сасадссРас 240 аРддадсРда дсадссРдад аРсРдаддас асддссдрдр аРРасРдрдс дададдсРас 300 ддадсРРРРР асРасРдддд ссадддсасс сРддРсассд РсРсс 345 <210> 20 <211> 345 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <400> 20 саддрдсадс РддРдсадРс РддддсРдад дрдаадаадс сРдддРссРс ддРдааддРс

РссРдсаадд сРРсРддсРа сассРРсаса адРаддРаРа РасасРдддР дсдасаддсс ссрддасаад ддсРРдадРд даРдддаРдд аРРРаРссРд РаасРддРда РасРРасРас аРсдадаадР Рсаадддсад адРсасдаРР ассдсддаса ааРссасдад сасадссРас аРддадсРда дсадссРдад аРсРдаддас асддссдрдр аРРасРдрдс дададдсРаР ддРдсРРРРР РсРасРдддд ссадддсасс сРддРсассд РсРсс

240

300

345 <210> 21 <211> 345 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

РссРдсаадд сРРсРддсРа сассРРсаса адРаддРаРа РасасРдддР дсдасаддсс 120 ссрддасаад ддсРРдадРд даРдддаРдд аРРРаРссРд РаасРддРда РасРРасРас 180 адададссрр Рсаадддсад адРсасдаРР ассдсддаса ааРссасдад сасадссРас 240 аРддадсРда дсадссРдад аРсРдаддас асддссдрдр аРРасРдрдс дададдсРаР 300 ддддсРРРРР асРасРдддд ссадддсасс сРддРсассд РсРсс 345 <210> 22 <211> 342 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность

- 55 020398 <223> Синтетический конструкт <400> 22 саддСЛсадс Еддсдсадбс сддСдсСдад дсдаадаадс ссддСдссСс адЬдааддСс

ЕссЕдсаадд сЬСсЬддЬЬа сассЬЬЬасс дасЬасЬаса СдсасЬдддЬ дсдСсаддсс ссСддЬсаад дссССдадсд даЕдддЬсдь дСбааСссСа ассддддЬдд СасИасссас эассадаааС £сдадддсед СдСсассаСд ассасадаса саСссасдад сасадссСас аЬддадсбдс дЬадсссдсд СЬсСдасдас асддссдСдС аЕЬасЬдСдс дсдСасдаас

СддсССдасС асСддддсса дддсассасс дСсассдСсС сс <210> 23 <211> 342 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Синтетический конструкт <400> 23 саддССсадс СддСдсадСс СддСдсСдад дСдаадаадс сСддСдссСс адСдааддСс

СссСдсаадд сССсСддССа сассСССасс дасСасСаса СдсасСдддС дсдСсаддсс сссддСсаад дСсССдадСд даСдддСсдС дССааСссСа ассддадддд СасСассСас аассадааас Ссдадддссд сдссассаСд ассасадаса сасссасдад сасадссСас аСддадсСдс дСадссСдсд ССсСдасдас асддссдСдС аССасСдСдс дсдСдсдаас

СддсССдасС асСддддсса дддсассасс дСсассдСсС сс <210> 24 <211> 342 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 24 саддССсадс СддСдсадСс СддСдсСдад дСдаадаадс сСддСдссСс адСдааддСс

СссСдсаадд сССсСддССа еасасссасс дасСасСаса СдсасСдддС дсдСсаддсс ссСддСсаад дСсССдадСд даСдддСсдС дССааСссСС аСсддддСад СасСассСас аассадаааС Ссдадддссд СдСсассаСд ассасадаса саСссасдад сасадссСас аСддадсСдс дСадссСдсд ССсСдасдас асддссдСдС аССасСдСдс дсдСдсдаас аССсССдасс асСддддсса дддсассасс дСсассдСсС сс <210 25 <211> 215 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 25

С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго С1у ТЬг Ьеи Зег Ьеи 5ег Рго С1у

120

180

240

300

342

120

180

240

300

342

120

180

240

300

342

С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Зег Уа1 Зег Зег Зег Не Зег Зег ТЬг

Азп Ьеи ΗΪ3 Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи

Не Туг С1у ТЬг Зег Туг Ьеи А1а Зег С1у 11е Рго Азр Агд РЬе Зег

Туг Зег РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз Асд ТЬг \7а1 А1а 100 105 110

А1а Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр 01и 01п Ьеи Ьуз Зег 115 120 125

С1у ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд С1и 130 135 140

А1а Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п Зег С1у Азп Зег 145 150 155 160

Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и Ьуз Ηίί Ьуз Уа1 180 185 190

Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЬг Ηί3 С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Ьуз 195 200 205

Зег РЬе Азп Агд С1у С1и Суз 210 215 <210> 26 <211> 215

- 56 020398 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 26

С1и

11е

Уа1

Ьеи

ТЬг

61п

5ег

Рго

61у

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

01у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Зег

Уа1

Зег

11е

Зег

ТЬг

20

25

30

Азп

Ьеи

ΗΪ2

Тгр

Туг

<31п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

35

40

45

Не

Туг

С1у

ТЬг

Зег

Туг

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Не

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

Зег

61у

ТЫ

Αερ

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Пе

Зег

Агд

Ьеи

01и

65

70

75

80

Рго

С1и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

01п

С1п

Тгр

Зег

Туг

Рго

85

90

95

Туг

Бег

РЬе

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Не

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

100

105

110

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Не

РЬе

Рго

Зег

Азр

С1и

С1п

Ьеи

Ьуз

Зег

115

120

125

С1у

ТЬг

А1а

Зег

Уа1

Суз

Ьеи

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

С1и

130

135

140

А1а

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

УаЬ

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Зег

С1у

Азп

Зег

145

150

155

160

С1п

С1и

Зег

Уа1

ТЬг

С1и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

165

170

175

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьуз

ΗΪ3

Ьуз

Уа1

180

185

190

Туг

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТЬг

ΗΪ3

С1п

С1у

Ьеи

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

_Ьу5

195 200 205

Зег РЬе Азп Агд С1у С1и Суз 210 215 <210> 27 <211> 215 <212> Белок <213> Искусственная последовательность

<220> <223> Синтетический конструкт <400> 27

С1и

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг

С1п

Зег

Рго

С1у

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

1

5

10

15

С1и

Агд

А1а

ТЬг

Ьеи

Зег

Суз

Зег

Уа1

Зег

Не

Зег

ТЬг

20

25

30

Азп

Ьеи

ΗΪ3

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

А1а

Рго

Агд

Ьеи

35

40

45

11е

Туг

С1у

ТЬг

Зег

Агд

Ьеи

Агд

Зег

С1у

Не

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Агд

Ьеи

С1и

65

70

75

80

Рго

С1и

Азр

РЬе

А1а

Уа1

Туг

Суз

С1п

Тгр

Зег

Туг

Рго

85

90

95

Туг

Зег

РЬе

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

Не

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

100

105

110

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Не

РЬе

Рго

Зег

Азр

С1и

С1п

Ьеи

Ьуз

Зег

115

120

125

С1у

ТЫ

А1а

Зег

Уа1

Суз

Ьеи

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

С1и

130

135

140

А1а

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Зег

С1у

Азп

Зег

145

150

155

160

С1п

С1и

Зег

Уа1

ТЬг

С1и

С1п

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

165

170

175

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

С1и

Ьуз

ΗΪ5

Ьуз

Уа1

180

185

190

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг

НЬз

С1п

С1у

Ьеи

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

195

200

205

- 57 020398

- 58 020398 <210> 30 <211> 215 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 30

Азр 11е С1п МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1

Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Зег Уа1 Зег Зег Зег Уа1 Агд Зег

Туг Ьеи Ηίε Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи

Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд рНе

С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи

Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п Уа1 Туг Агд С1у Туг

А1а Рго Зег \7а1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр С1и <31п Ьеи Ьуз 115 120 125

А1э Ьуз νοί С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи С1п Зег С1у Азп 145 150 155

С1п С1и Зег Уа1 ТЬг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг $ег 165 170 175

Зег Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и Ьуз Низ Ьуз 180 185 190

С1у

Не

Ьеи

Зег

С1п

Рго

А1а

Зег

С1и £ег

160

Уа1

Туг А1а Суз С1и Уа1 ТЬг Нхз С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго Уа1 ТЬг Ьуз <210> 31 <211> 645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность сСсСссСдса дСдСсадсСс аадСаСаадС СссассаасС СасасСддСа ссадсадааа сссддссадд сСсссаддсС ссСсаСсСаС ддсасаСссС ассСддсССс СддсаСссса дасаддССса дСддсадСдд дСсСдддаса дасССсасСс СсассаСсад садаседдад ссСдаадаСС сСдсадСдСа ССасСдСсаа садСддадСа дССасссдЬа садСССсддс саадддасса адССддадаС сааасдаасС дСддсСдсас саСсСдСсСС саСсССсссд ссаСсСдаСд адсадССдаа аСсСддаасС дссСсСдССд сдСдссСдсС дааСаасССс

СаСсссадад аддссааадС асадСддаад дСддаСаасд сссСссааСс дддСаасСсс саддададСд Ссасададса ддасадсаад дасадсассС асадссСсад садсасссСд асдсСдадса аадсадасСа сдадааасас ааадСсСасд ссСдсдаадС сасссаСсад ддссСдадсС сдсссдСсас ааададсССс аасаддддад адСдс

120

180

240

300

360

420

480

540

600

645 сСсСссСдса дСдСсадсСс аадСаСаадС СссассаасС СасасСддСа ссадсадааа ссСддссадд сСсссаддсС ссСсаСсСаС ддсасаСссС ассСддсССс СддсаСссса дасаддССса дСддсадСдд дСсСдддаса дасССсасСс СсассаСсад садасСддад ссСдаадаСС ССдсадСдСа ССасСдСсаа садСддадСа дССасссдСа садСССсддс саадддасса адССддадаС сааасдаасС дСддсСдсас саСсСдСсСС саСсССсссд ссаСсСдаСд адсадССдаа аСсСддаасС дссСсСдССд СдСдссСдсС дааСаасССс

СаСсссадад аддссааадС асадСддаад дСддаСаасд сссСссааСс дддсаасСсс

120

180

240

300

360

420

480

- 59 020398 саддададСд Ссасададса ддасадсаад дасадсассС асадссСсад садсасссСд асдсСдадса аадсадасСа сдадааасас ааадСсСасд ссСдсдаадС сасссаСсад ддссСдадсС сдсссдСсас ааададсССс аасаддддад адСдс <210> 33 <211> 645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность сСссадддда аададссасс сСсСссСдса дСдСсадсСс аадСаСаадС СссассаасС СасасСддСа ссадсадааа ссСддссадд сСсссаддсС ссСсаСсСаС ддсасаСсса дасСдадаСс СддсаСссса дасаддсСса дСддсадСдд дссСдддаса дасССсасСс СсассаСсад садасСддад ссСдаадаСС ССдсадСдСа ССасСдСсаа садСддадСа дССасссдСа садСССсддс саадддасса адССддадаС сааасдаасС дСддсСдсас саСсСдСсСС саСсССсссд ссаСсСдаСд адсадССдаа аСсСддаасС дссСсСдССд СдСдссСдсС дааСаасССс

СаСсссадад аддссааадС асадСддаад дСддаСаасд сссСссааСс дддСаасСсс саддададСд Ссасададса ддасадсаад дасадсассС асадссСсад садсасссСд асдсСдадса аадсадасСа сдадааасас ааадСсСасд ссСдсдаадС сасссаСсад ддссСдадсС сдсссдСсас ааададсССс аасаддддад адСдс <210> 34 <211> 645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность : сСдСсСдсаС сСдСаддада сададСсасс аСсасССдса дСдСсадсСс аадСдСаадС СссаСССасС СдсасСддСа Ссадсадааа ссадддааад ссссСаадсС ссСдаСсСаС адсасаСсса асССддсССс сддадсссса

СсааддССса дСддсадСдд аСсСдддаса даСССсасСс СсассаСсад садСеСдсаа ссСдаадаСС ССдсаасССа сСасСдСаСС садСасадСд дССасссдсС сасдССсддс ддадддасса аддСддадаС сааасдаасС дСддсСдсас саСсСдСсСС саСсССсссд ссаСсСдаСд адсадССдаа аСсСддаасС дссСсСдССд СдСдссСдсС дааСаасССс

СаСсссадад аддссааадС асадСддаад дСддаСаасд ссссссааСс дддСаасСсс саддададСд Ссасададса ддасадсаад дасадсассС асадссСсад садсасссСд асдсСдадса аадсадасСа сдадааасас ааадСсСасд ссСдсдаадС сасссаСсад ддссСдадсС сдсссдСсас ааададсССс аасаддддад адСдс <210> 35 <211> 645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <400> 35 дасаСссада СдасссадСс СссаСссСсс сСдСсСдсаС сСдСаддада сададСсасс аСсасССдса дСдЬсадсСс аадСдСаСсс СссаСССасС СдсасСддСа Ссадсадааа ссадддааад ссссСаадсС ссСдаСсСаС адсасаСсса асССддсССс Сддадсссса

СсааддССса дСддсадСдд асссдддаса даСССсасСс СсассаСсад садСеСдсаа ссСдаадаСС ССдсаасССа сСасСдСсаа дСсСасадСд дССасссдсС сасдССсддс ддадддасса аддСддадаС сааасдаасС дСддсСдсас саСсСдСсСС саСсССсссд ссаСсСдаСд адсадССдаа аСсСддаасС дссСсСдССд СдСдссСдсС дааСаасССс

СаСсссадад аддссааадС асадСддаад дСддаСаасд сссСссааСс дддСаасСсс саддададСд Ссасададса ддасадсаад дасадсассС асадссСсад садсасссСд асдсСдадса аадсадасСа сдадааасас ааадСсСасд ссСдсдаадС сасссаСсад ддссСдадсС сдсссдСсас ааададсССс аасаддддад адСдс <210> 36 <211> 645 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность сСдСаддада сададСсасс аСсасССдса дСдСсадсСс аадСдСасдС СссаСССасС СдсасСддСа Ссадсадааа ссадддааад ссссСаадсС ссСдаСсСаС адсасаСсса асССддсССс СддадСссса

СсааддсСса дСддсадСдд аСсСдддаса дассссассс СсассаСсад садСеСдсаа ссСдаадаСС ССдсаасССа сСасСдСсад дСдСасаддд дССасссдсС сасдССсддс ддадддасса аддСддадаС сааасдаасС дСддсСдсас саСсСдСсСС саСсССсссд ссаСсСдаСд адсадССдаа аСсСддаасС дссСсСдССд СдСдссСдсС дааСаасССс

540

600

645

120

180

240

300

360

420

480

540

600

645

120

180

240

300

360

420

480

540

600

645

120

180

240

300

360

420

480

540

600

645

120

180

240

300

360

420

480

- 60 020398 саддададРд Рсасададса ддасадсаад дасадсассР асадссРсад садсасссРд 540 асдсРдадса аадсадасРа сдадааасас ааадрсРасд ссРдсдаадр сасссаРсад 600 ддссРдадсР сдсссдРсас ааададсРРс аасаддддад адрдс 645 <210> 37 <211> 441 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <400> 37

С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 61п Зег С1у А1а 21и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у Зег

Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Агд

Туг Не ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи О1и Тгр Мер

С1у Тгр 11е Туг Рго Уа1 ТЬс С1у Азр ТЬг Туг Туг Азп О1и Ьуз РЬе

Ьуз С1у Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг А1а Туг

Мер С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз

- 61 020398

- 62 020398

- 63 020398

С1п Уа1 01п Ьеи Уа1 О1п 5ег С1у А1а 01и Уа1 Ьуз Ьуз Рго 61у А1а 15 10 15

Бег Уа1 Ьуе Уа1 Бег Суз Ьуз А1а Бег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг 20 25 30

Туг Мей Шз Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи 51и Тгр Мей 35 40 45

С1у Агд Уа1 Азп Рго Азп Агд С1у С1у ТЬг ТЬг Туг Азп С1п Ьуз РЬе 50 55 60

61и 01у Агд Уа1 ТЬг Мей ТЬг ТЬг Азр ТЬг Бег ТЬг 5ег ТЬг А1а Туг 65 70 75 80

Мей С1и Ьеи Агд Бег Ьеи Агд Бег Азр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

А1а Агд ТЬг Азп Тгр Ьеи Азр Туг Тгр С1у О1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг 100 105 110

Уа1 Бес Бег А1а Бег ТЬг Ьуз С1у Рго Бех Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго 115 120 125

Суз Бег Агд Бег ТЬг Бег С1и Бег ТЬг А1а А1а Ьеи 01у Суз Ьеи Уа1 130 135 140

Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Бег Тгр Азп Бег С1у А1а 145 150 155 160

Ьеи ТЬг Бег С1у Уа1 Ηίβ ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи С1п Бег Бег С1у 165 170 175

Ьеи Туг Бег Ьеи Бег Бег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Бег Бег Азп РЬе С1у 180 185 190

ТЬг С1п ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр Шз Ьуз Рго Бег Азп ТЬг Ьуз 195 200 205

Уа1 Азр Ьуз ТЬг Уэ1 С1и Агд Ьуз Суз Суз Уа1 С1и Суз Рго Рго Суз 210 215 220

Рго А1а Рго Рго Уа1 А1а О1у Рго Бес Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 225 230 235 240

Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мей Не Бег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1

245

250

255

Уа1

Азр

Уа1

Бег

Шз

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

С1п

РЬе

Азп

Тгр

Туг

260

265

270

Уа1

Азр

С1у

Мей

С1и

Уа1

НЬз

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

С1и

275

280

285

С1п

РЬе

Азп

Бег

ТЬг

РЬе

Агд

Уа1

Бег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

НЬз

290

295

300

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Ьуз

01и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

Ьуз

305

310

315

320

С1у

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

С1и

Ьуз

ТЬг

11е

Бег

Ьуз

ТЬг

Ьуз

С1у

С1п

325

330

335

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Бег

Агд

С1и

Мей

340

345

350

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Бег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

355

360

365

Бег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Бег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

370

375

380

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Мей

Ьеи

Азр

Бег

Азр

С1у

Бег

РЬе

Ьеи

385

390

395

400

Туг

Бег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Бег

Агд

Тгр

С1п

С1у

Азп

Уа1

405

410

415

РЬе

Бег

Суз

Бег

Уа1

Мей

ΗΪ3

С1и

А1а

Ьеи

Шз

Азп

НЬз

Туг

ТЬг

С1п

420

425

430

Ьуз

Бег

Ьеи

Бег

Ьеи

Бег

Рго

С1у

435 440 <210> 41 <211> 440 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт
<400> 41
С1п Уа1 С1п	Ьеи	Уа1 С1п Бег С1у	А1а	С1и	УаЬ	Ьуз	Ьуз	Рго	С1у А1а
1		5		10					15
Бег Уа1 Ьуз	Уа1	Бег Суз Ьуз А1а	Бег	С1у	Туг	ТЬг	РЬе	ТЬг	Азр Туг
	20		25					30

Туг

МеЕ

ΗΪ5

Тгр

ν§1

Агд

С1п

А1а

Рго

01у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеЕ

35

40

45

С1у

Агд

Уа1

Азп

Рго

Азп

Агд

61у

ТЬг

Туг

Азп

61п

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1и

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

МеЕ

ТЬг

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЕ

С1и

Ьеи

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Зег

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

А1а

Азп

Тгр

Ьеи

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Уа1

ТЬг

100

105

110

Уа1

Зег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

115

120

125

Суз

Зег

Агд

Зег

ТЬг

Зег

С1и

Зег

ТЬг

А1а

Ьеи

С1у

Суз

Ьеи

Уа1

130

135

140

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

С1и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Тгр

Азп

Зег

С1у

А1а

145

150

155

160

Ьеи

ТЬг

Зег

С1у

Уа1

Низ

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

С1п

Зег

С1у

165

170

175

Ьеи

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Зег

Азп

РЬе

С1у

180

185

190

ТЬг

С1п

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Азп

Уа1

Азр

ΗΪ5

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

195

200

205

Уа1

Азр

Ьуз

ТЬг

Уа1

С1и

Агд

Ьуз

Суз

Уа1

61и

Суз

Рго

Суз

210

215

220

Рго

А1а

Рго

Уа1

А1а

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Ьуз

225

230

235

240

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЕ

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

С1и

Уа1

ТЬг

Суз

Уа1

245

250

255

Уа1

Азр

Уа1

Зег

Низ

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

01п

РЬе

Азп

Тгр

Туг

260

265

270

Уа1

Азр

С1у

МеЕ

С1и

Уа1

Шз

Азп

А1а

Ьуз

ТЬх

Ьуз

Рго

Агд

С1и

275

280

285

С1п

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

РЬе

Агд

Уа1

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Уа1

Низ

290

295

300

01п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

01у

Ьуз

С1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Ьуз

305

310

315

320

С1у

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

С1и

Ьуз

ТЬг

11е

Зег

Ьуз

ТЬг

Ьуз

С1у

С1п

325

330

335

Рго

Агд

С1и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

Агд

С1и

МеЕ

340

345

350

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

355

360

365

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

370

375

380

Туг

Ъу,

ТЬг

Рго

МеЕ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

Ьеи

385

390

395

400

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1п

51п

01у

Азп

νβΐ

405

410

415

РЬе

Зег

Суз

Зег

νβΐ

МеЕ

НЬз

С1и

А1а

Ьеи

ΗΪ3

Азп

ΗΪ5

Туг

ТЬг

С1п

420

425

430

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

435 440 <210> 42 <211> 440 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт

<400>

42

61п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Азр

Туг

20

25

30

Туг

МеЕ

Низ

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

МеЕ

35

40

45

С1у Агд Уа1 Азп Рго Туг Агд С1у Зег ТЬг ТЬг Туг Азп С1п Ъуз РЬе

С1и С1у Агд Уа1 ТЬг Мет: ТЬг ТЬг Азр ТЬг Зег ТЬг Зег ТЬг А1а Туг

МеЬ С1и Ъеи Агд Зег Ъеи Агд Зег Азр Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз

А1а Агд А1а Азп Не Ъеи Азр Туг Тгр С1у 51п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг 100 105 110

Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ъуз 61у Рго Зег ΐβΐ РЬе Рго Ъеи А1а Рго 115 120 125

Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег С1и Зег ТЬг А1а А1а Ъеи С1у Суз Ъеи Уа1 130 135 140

Ъуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег 61у А1а 145 150 155 160

Ъеи ТЬг Зег С1у Уа1 НЪз ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ъеи С1п Зег Зег С1у 165 170 175

Ъеи Туг Зег Ъеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Азп РЬе С1у 180 185 190

ТЬг С1п ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр Ηϊβ Ъуз Рго Зег Азп ТЬг Ъу$ 195 200 205

Уа1 Αερ Ъуз ТЬг Уа1 С1и Агд Ъуз Суз Суз Уа1 С1и Суз Рго Рго Суз 210 215 220

Рго А1а Рго Рго Уа1 А1а С1у Рео Зег Уа1 РЬе Ъеи РЬе Рго Рго Ъуз 225 230 235 240

Рго Ъуз А5р ТЬг Ъеи Ме£ 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 245 250 255

Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Ηίδ С1и Азр Рго О1и Уа1 С1п РЬе Азп Тгр Туг 260 265 270

Уа1 Азр С1у МеС С1и Уа1 Н1з Азп А1а Ъуз ТЬг Ъуз Рго Агд С1и С1и 275 280 285

С1п РЬе Азп Зег ТЬг РЬе Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ъеи ТЬг Уа1 Уа1 Ηίδ 290 295 300 <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 43 саддЕдсадс ЕддЕдсадЕс ЕддддсЕдад дЕдаадаадс сЕдддЕссЕс ддЕдааддЕс 60

ЕссЕдсаадд сЕЕсЕддсЕа сассЕЕсаса адЕаддЕаЕа ЕасасЕдддЕ дсдасаддсс 120 ссЕддасаад ддсЕЕдадЕд даЕдддаЕдд аЕЕЕаЕссЕд ЕаасЕддЕда ЕасЕЕасЕас 180 аасдадаадЕ Есаадддсад адЕсасдаЕЕ ассдсддаса ааЕссасдад сасадссЕас 240 аЕддадсЕда дсадссЕдад аЕсЕдаддас асддссдЕдЕ аЕЕасЕдЕдс дададдсЕаЕ 300 ддддсЕЕЕЕЕ асЕасЕдддд ссадддсасс сЕддЕсассд ЕсЕссЕссдс сЕссассаад 360 ддсссаЕсдд ЕсЕЕсссдсЕ адсдсссЕдс Ессаддадса ссЕссдадад сасадссдсс 420 сЕдддсЕдсс ЕддЕсаадда сЕасЕЕсссс даассддЕда сддЕдЕсдЕд даасЕсаддс 480 дсссЕдасса дсддсдЕдса сассЕЕсссд дсЕдЕссЕас адЕссЕсадд асЕсЕасЕсс 540 сЕсадсадсд ЕддЕдассдЕ дсссЕссадс аасЕЕсддса сссадассЕа сассЕдсаас 600

- 66 020398 дРадаРсаса дадрдсссас ааасссаадд дрдадссасд ааРдссаада сРсассдРсд аааддссРсс ссасаддрдр ассРдссРдд садссддада сРсРасадса

РссдРдаРдс ддр адсссадсаа сдрдсссадс асасссРсаР аадассссда сааадссасд

Рдсассадда садсссссаР асасссРдсс рсаааддсрр асаасРасаа адсРсассдР аРдаддсРсР сассааддрд ассассрдрд даРсРсссдд ддРссадРРс ддаддадсад сРддсРдаас сдадаааасс сссарсссдд сРассссадс дассасассР ддасаададс дсасаассас дасаадасад дсаддассдр ассссрдадд аасРддРасд

РРсаасадса ддсааддадр аРсРссаааа даддадаРда дасаРсдссд сссаРдсРдд аддрддсадс

Расасасада

РРдадсдсаа садРсРРссР

РсасдРдсдР

РддасддсаР сдРРссдРдР асаадрдсаа ссааадддса ссаадаасса рддадрддда асРссдасдд аддддаасдР ададссРсРс ардррдрдрс сРРсссссса ддрддрддас ддаддРдсаР ддРсадсдРс ддРсРссаас дссссдадаа ддрсадссрд дадсаарддд сРссРРсРРс сррсрсардс ссрдрсрссд

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1323 <210> 44 <211> 1323 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 44 саддрдсадс РддРдсадРс рддддсрдад дрдаадаадс

РссРдсаадд сРРсРддсРа сассРРсаса адРаддРаРа ссрддасаад ддсРРдадрд даРдддаРдд аРРРаРссРд аРсдадаадР Рсаадддсад адРсасдаРР ассдсддаса аРддадсрда дсадссРдад аРсРдаддас асддссдрдр ддРдсРРРРР РсРасРдддд ссадддсасс сРддРсассд ддсссаРсдд РсРРсссдсР адсдсссРдс Рссаддадса сРдддсРдсс РддРсаадда сРасРРсссс даассддрда дсссРдасса дсддсдрдса сассРРсссд дсРдРссРас сРсадсадсд РддРдассдР дсссРссадс аасРРсддса дРадаРсаса адсссадсаа сассааддрд дасаадасад дадрдсссас сдрдсссадс ассассрдрд дсаддассдр ааасссаадд асасссРсаР даРсРсссдд ассссрдадд дрдадссасд аадассссда ддРссадРРс аасРддРасд сРдддРссРс

РасасРдддР

РаасРддРда ааРссасдад аРРасРдРдс

РсРссРссдс ссРссдадад сддрдрсдрд адРссРсадд сссадассРа

РРдадсдсаа садРсРРссР

РсасдРдсдР

РддасддсаР ддрдааддрс дсдасаддсс

РасРРасРас сасадссРас дададдсРаР сРссассаад сасадссдсс даасРсаддс асРсРасРсс сассРдсаас ардррдрдрс сРРсссссса ддрддрддас ддаддРдсаР

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840 ааРдссаада сааадссасд ддаддадсад РРсаасадса сдРРссдРдР ддРсадсдРс 900 сРсассдРсд рдсассадда сРддсРдаас ддсааддадр асаадрдсаа ддРсРссаас 960 аааддссРсс садсссссаР сдадаааасс аРсРссаааа ссааадддса дссссдадаа 1020 ссасаддрдр асасссРдсс сссарсссдд даддадаРда ссаадаасса ддрсадссрд 1080 ассРдссРдд РсаааддсРР сРассссадс дасаРсдссд Рддадрддда дадсаарддд 1140 садссддада асаасРасаа дассасассР сссаРдсРдд асРссдасдд сРссРРсРРс 1200 сРсРасадса адсРсассдР ддасаададс аддрддсадс аддддаасдР сРРсРсаРдс 1260

РссдРдаРдс аРдаддсРсР дсасаассас Расасасада ададссРсРс ссРдРсРссд 1320 ддр 1323 <210> 45 <211> 1323 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 45

саддрдсадс	РддРдсадРс	рддддсрдад	дрдаадаадс	сРдддРссРс	ддрдааддрс	60
РссРдсаадд	сРРсРддсРа	сассРРсаса	адРаддРаРа	РасасРдддР	дсдасаддсс	120
ссрддасаад	ддсРРдадрд	даРдддаРдд	аРРРаРссРд	РаасРддРда	РасРРасРас	180
адададссРР	Рсаадддсад	адРсасдаРР	ассдсддаса	ааРссасдад	сасадссРас	240
аРддадсрда	дсадссРдад	аРсРдаддас	асддссдрдр	аРРасРдРдс	дададдсрас	300
ддадсРРРРР	асРасРдддд	ссадддсасс	сРддРсассд	РсРссРссдс	сРссассаад	360
ддсссаРсдд	РсРРсссдсР	адсдсссРдс	Рссаддадса	ссРссдадад	сасадссдсс	420
сРдддсРдсс	РддРсаадда	сРасРРсссс	даассддрда	сддрдрсдрд	даасРсаддс	480
дсссРдасса	дсддсдрдса	сассРРсссд	дсРдРссРас	адРссРсадд	асРсРасРсс	540
сРсадсадсд	РддРдассдР	дсссРссадс	аасРРсддса	сссадассРа	сассРдсаас	600
дРадаРсаса	адсссадсаа	сассааддрд	дасаадасад	РРдадсдсаа	ардррдрдрс	660
дадрдсссас	сдрдсссадс	ассассрдрд	дсаддассдр	садРсРРссР	сРРсссссса	720
ааасссаадд	асасссРсаР	даРсРсссдд	ассссрдадд	РсасдРдсдР	ддрддрддас	780
дрдадссасд	аадассссда	ддРссадРРс	аасРддРасд	РддасддсаР	ддаддРдсаР	840
ааРдссаада	сааадссасд	ддаддадсад	РРсаасадса	сдРРссдРдР	ддРсадсдРс	900
сРсассдРсд	рдсассадда	сРддсРдаас	ддсааддадр	асаадрдсаа	ддРсРссаас	960
аааддссРсс	садсссссаР	сдадаааасс	аРсРссаааа	ссааадддса	дссссдадаа	1020
ссасаддрдр	асасссРдсс	сссарсссдд	даддадаРда	ссаадаасса	ддрсадссрд	1080

- 67 020398

ассРдссРдд	РсаааддсРР сРассссадс дасаРсдссд РддадРддда дадсааРддд	1140
садссддада	асаасРасаа дассасассР сссаРдсРдд асРссдасдд сРссРРсРРс	1200
сРсРасадса	адсРсассдР ддасаададс аддрддсадс аддддаасдр СРРсРсардс	1260
РссдРдаРдс	аРдаддсРсР дсасаассас Расасасада ададссРсРс ссРдРсРссд	1320

ддр 1323 <210> 46 <211> 1323

<212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетический конструкт
<400> 46 саддРРсадс	РддРдсадРс	рддрдсрдад	дрдаадаадс	сРддрдссРс	адРдааддРс	60
РссРдсаадд	сРРсРддРРа	сассРРРасс	дасРасРаса	РдсасРдддР	дсдРсаддсс	120
ссРддРсаад	дРсРРдадРд	даРдддРсдР	дРРааРссРа	ассддддрдд	РасРассРас	180
аассадаааР	Рсдадддссд	РдРсассаРд	ассасадаса	саРссасдад	сасадссРас	240
аРддадсРдс	дРадссРдсд	РРсРдасдас	асддссдрдр	аРРасРдрдс	дсдРасдаас	300
рддсррдаср	асРддддсса	дддсассасс	дРсассдРсР	ссРссдссРс	сассаадддс	360
ссаРсддРсР	РсссдсРадс	дсссРдсРсс	аддадсасср	ссдададсас	адссдсссРд	420
ддсРдссРдд	РсааддасРа	сРРссссдаа	ссддрдасдд	рдрсдрддаа	сРсаддсдсс	480
сРдассадсд	дсдрдсасас	сРРсссддсР	дРссРасадР	ссРсаддасР	сРасРсссРс	540
адсадсдрдд	рдассдрдсс	сРссадсадс	ррдддсасда	адассРасас	сРдсаасдРа	600
даРсасаадс	ссадсаасас	сааддРддас	аадададРРд	адРссаааРа	РддРссссса	660
РдсссасссР	дсссадсасс	Рдаддссдсс	дддддассаР	садРсРРссР	дРРсссссса	720
ааасссаадд	асасРсРсаР	даРсРсссдд	ассссрдадд	РсасдрдсдР	ддрддрддас	780
дрдадссадд	аадассссда	ддРссадРРс	аасРддРасд	РддаРддсдР	ддаддрдсар	840
ааРдссаада	сааадссдсд	ддаддадсад	РРсаасадса	сдрассдрдр	ддРсадсдРс	900
сРсассдРсс	Рдсассадда	сРддсРдаас	ддсааддадР	асаадрдсаа	ддРсРссаас	960
аааддссрсс	сдРссРссаР	сдадаааасс	аРсРссааад	ссааадддса	дссссдадад	102 0
ссасаддрдр	асасссрдсс	сссаРсссад	даддадаРда	ссаадаасса	ддрсадссрд	1080
ассРдссРдд	РсаааддсРР	сРассссадс	дасаРсдссд	рддадрддда	аадсаарддд	1140
садссддада	асаасРасаа	дассасдссР	сссдРдсРдд	асРссдасдд	сРссРРсРРс	1200
сРсРасадса	ддсРаассдР	ддасаададс	аддрддсадд	аддддааРдР	сРРсРсардс	1260
РссдРдаРдс	аРдаддсРсР	дсасаассас	Расасасада	ададссРсРс	ссРдРсРсРд	1320

ддС 1323 <210> 47 <211> 1323 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 47 саддРРсадс РддРдсадРс рддрдсрдад дрдаадаадс сРддрдссРс адРдааддРс 60

РссРдсаадд сРРсРддРРа сасаРРсасР дасРасРаса РдсасРдддР дсдРсаддсс 120 ссРддРсаад дРсРРдадРд даРдддРсдР дРРааРссРа ассддадддд РасРассРас 180 аассадаааР Рсдадддссд РдРсассаРд ассасадаса саРссасдад сасадссРас 240 аРддадсРдс дРадссРдсд РРсРдасдас асддссдрдр аРРасРдрдс дсдрдсдаас 300 рддсррдаср асРддддсса дддсассасс дРсассдРсР ссРссдссРс сассаадддс 360 ссаРсддРсР РсссдсРадс дсссСдсРсс аддадсасср ссдададсас адссдсссРд 420 ддсРдссРдд РсааддасРа сРРссссдаа ссддрдасдд рдрсдрддаа сРсаддсдсс 480 сСдассадсд дсдрдсасас сРРсссддсР дРссРасадР ссРсаддасР сРасСсссРс 540 адсадсдрдд рдассдрдсс сРссадсадс ррдддсасда адассРасас сРдсаасдРа 600 даРсасаадс ссадсаасас сааддРддас аадададРРд адРссаааРа РддРссссса 660

РдсссасссР дсссадсасс Рдаддссдсс дддддассаР садРсРРссР дРРсссссса 720 ааасссаадд асасРсРсаР даРсРсссдд ассссрдадд РсасдрдсдР ддрддрддас 780 дрдадссадд аадассссда ддРссадРРс аасРддРасд РддаРддсдР ддаддрдсар 840 ааРдссаада сааадссдсд ддаддадсад РРсаасадса сдрассдрдр ддРсадсдРс 900 сРсассдРсс Рдсассадда сРддсРдаас ддсааддадР асаадрдсаа ддРсРссаас 960 аааддссрсс сдРссРссаР сдадаааасс аРсРссааад ссааадддса дссссдадад 1020 ссасаддрдр асасссрдсс сссаРсссад даддадаРда ссаадаасса ддрсадссрд 1080 ассРдссРдд РсаааддсРР сРассссадс дасаРсдссд РддадРддда аадсаарддд 1140 садссддада асаасРасаа дассасдссР сссдРдсРдд асРссдасдд сРссРРсРРс 1200 сРсРасадса ддсРаассдР ддасаададс аддрддсадд аддддааРдР сРРсРсардс 1260

РссдРдаРдс аРдаддсРсР дсасаассас Расасасада ададссРсРс ссРдРсРсРд 1320 ддр 1323 <210> 48 <211> 1323 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 48 саддССсадс СддСдсадСс СддСдссдад дСдаадаадс сСддСдссСс адСдааддсс

СссСдсаадд сССсСддССа сасаССсасС дасСасСаса СдсасСдддС дсдСсаддсс ссСддСсаад дСсССдадСд даСдддСсдС дССааСссСС аСсддддСад СасСассСас аассадаааС Ссдадддссд СдСсассаСд ассасадаса саСссасдад сасадссСас аСддадссдс дСадссСдсд сссСдасдас асддссдСдС аССасСдСдс дсдСдсдаас асСсССдасС асСддддсса дддсассасс дСсассдСсс ссСссдссСс сассаадддс ссаСсддСсС СсссдсСадс дсссСдсСсс аддадсассС ссдададсас адссдсссСд ддсСдссСдд СсааддасСа сССссссдаа ссддСдасдд СдСсдСддаа сСсаддсдсс сСдассадсд дсдСдсасас сССсссддсС дСссСасадС ссСсаддасС сСасссссСс адсадсдСдд СдассдСдсс сСссадсадс ССдддсасда адассСасас сСдсаасдСа даСсасаадс ссадсаасас сааддСддас аадададССд адСссаааСа СддСссссса

СдсссасссС дсссадсасс Сдаддссдсс дддддассаС садСсССссС дССсссссса ааасссаадд асасСсСсаС даСсСсссдд ассссСдадд СсасдСдсдС ддСддСддас дСдадссадд аадассссда ддСссадССс аасСддСасд СддаСддсдС ддаддСдсаС ааСдссаада сааадссдсд ддаддадсад ССсаасадса сдсассдСдС ддСсадсдСс сСсассдСсс Сдсассадда сСддсСдаас ддсааддадС асаадСдсаа ддСсСссаас аааддссСсс сдСссСссаС сдадаааасс аСсСссааад ссааадддса дссссдадад ссасаддСдС асасссСдсс сссаСсссад даддадаСда ссаадаасса ддссадссСд ассСдссСдд СсаааддсСС сСассссадс дасаСсдссд СддадСддда аадсааСддд садссддада асаасСасаа дассасдссС сссдСдсСдд асСссдасдд сСссССсССс сСсСасадса ддсСаассдС ддасаададс аддСддсадд аддддааСдС сССсСсаСдс

СссдСдаСдс аСдаддсСсС дсасаассас Сасасасада ададссСсСс ссСдСсСсСд ддр

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1323 <210> 49 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 49

Бег Уа1 Бег 5ег Бег Не 5ег Бег ТЬг Азп Ьеи НЬз 1 5 10 <210> 50 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 50

С1у ТЬг Зег Туг Ьеи А1а Зег

5 <210> 51 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <4СЮ> 51

С1п С1п Тгр Зег Бег Туг Рго Туг Бег 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 52

51у ТЬг Зег Агд Ьеи Агд Бег

5 <210> 53 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 53

Зег Уа1 Зег Зег Зег Уа1 Зес Зег 11е Туг Ьеи Н1з 15 10 <210> 54 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400 54

Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег <210> 55 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400 55

Не С1п Туг Зег Б1у Туг Рго Ьеи ТЬг <210 56 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <223> Синтетический конструкт <400 56

С1п Уа1 Туг Зег 61у Туг Рго Ьеи ТЬг <210 57 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400 57

Зег Уа1 Зег Зег Зег Уа1 Агд Зег Не Туг Ьеи Η±ε <210> 58 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400 58

С1п Уа1 Туг Агд С1у Туг Рго Ьеи ТЬг

- 70 020398 <210> 63 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 63

С1у Туг С1у А1а РЬе РЬе Туг

5 <210> 64 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 64

Тгр Не Туг Рго Уа1 ТЬг С1у Азр ТЬг Туг Туг Агд С1и Рго РЬе Ьуз 15 10 15

С1у <210> 65 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 65

С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг Туг МеЬ Шз 15 10 <210> 66 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 66

Агд Уа1 Азп Рго Азп Агд С1у С1у ТЬг ТЬг Туг Азп С1п Ьуз РЬе С1и 15 10 15

С1у <210> 67 <211> 6 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 67

ТЬг Азп Тгр Ьеи Азр Туг

5 <210> 68 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 68

Агд Уа1 Азп Рго Азп Агд Агд С1у ТЬг ТЬг Туг Азп С1п Ьуз РЬе С1и 15 10 15

С1у <210> 69 <211> 6 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 69

А1а Азп Тгр Ьеи Азр Туг

5 <210> 70 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <400> 70

Агд Уа1 Азп Рго Туг Агд О1у 5ег ТЬг ТЬг Туг Азп С1п Ьуз РЬе С1и 15 10 15

С1у

- 71 020398 <210> 71 <211> б <212> Белок <213> Искусственная последовательность <400> 71

А1а Азп 11е Ьеи Азр Туг <400> 72

МеС Ьуз А1а Рго А1а Уа1 Ьеи А1а Рго С1у 11е Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи РЬе

ТЬг Ьеи Уа1 С1п Агд Зег Азп С1у С1и Суз Ьуз С1и А1а Ьеи А1а Ьуз

Зег С1и Мес Азп Уа1 Азп МеС Ьуз Туг С1п Ьеи Рго Азп РЬе ТЬг А1а <31и ТЬг Рго 11е С1п Азп Уа1 11е Ьеи Шз С1и Шз Низ 11е РЬе Ьеи

С1у А1а ТЬг Азп Туг 11е Туг Уа1 Ьеи Азп С1и С1и Азр Ьеи С1п Ьуз

Уа1 А1а С1и Туг Ьуз ТЬг С1у Рго Уа1 Ьеи С1и ΗΪ5 Рго Азр Суз РЬе

- 72 020398

- 73 020398

Ьуз Бег Суд Азр Ьуз ТЬг ΗΪ3 ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и 945 950 955 960

Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Бег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр 965 970 975

ТЬг Ьеи Меи Не Бег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр 980 985 990

Уа1 Бег Ηίδ С1и Азр Рго е1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у 995 1000 1005

Уа1 51и Уа1 НЬз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг 1010 1015 1020

Азп Бег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи НЬз С1п 1025 1030 1035

Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз 1040 1045 1050

А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е О1и Ьуз ТЬг 11е Бег Ьуз А1а Ьуз <31у 1055 1060 1065

С1и Меи ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Бег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у 1085 1090 1095

РЬе Туг Рго Бег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Бег Азп С1у С1п 1100 1105 1110

Рго 31и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Бег Азр 1115 1120 1125

С1у Бег РЬе РЬе Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Бег Агд ИЗО 1135 1140

Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Бег Суз Бег Уа1 Меи Ηίδ С1и А1а 1145 1150 1155

Ьеи Н1з Азп Низ Туг ТЬг С1п Ьуз Бег Ьеи Бег Ьеи Бег Рго С1у 1160 1165 1170

Ьуз Агд Не Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз ΗΪ5 Уа1 НЬз ΗΪ3 1175 1180 1185 <210> 73 <211> 1192 <212> Белок <213> Масаса тиЬаЬСа <400> 73

Меи Ьуз А1а Рго А1а \/а1 Ьеи Уа1 Рго С1у Не Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи РЬе 15 10 15

ТЬг Ьеи Уа1 С1п Агд Бег Азп С1у С1и Суз Ьуз С1и А1а Ьеи А1а Ьуз 20 25 30

Бег С1и Меи Азп Уа1 Азп Меи Ьуз Туг С1п Ьеи Рго Азп РЬе ТЬг А1а 35 40 45

С1и ТЬг А1а Не С1п Азп Уа1 Не Ьеи НЬз С1и Ηίε Ηίδ Не РЬе Ьеи 50 55 60

01у А1а ТЬг Азп Туг Не Туг Уа1 Ьеи Азп 61и 61и Азр Ьеи С1п Ьуз

УаЬ А1а С1и Туг Ьуз ТЬг С1у Рго Уа1 Ьеи С1и ΗΪ3 Рго Азр Суз РЬе 85 90 95

Рго Суз С1п Азр Суз Бег Бег Ьуз А1а Азп Ьеи Бег С1у С1у УаЬ Тгр 100 105 110

Ьуз Азр Азп Не Азп Меб А1а Ьеи Уа1 УаЬ Азр ТЬг Туг Туг Азр Азр 115 120 125

С1п Ьеи Не Бег Суз 21у Бег \?а1 Азп Агд С1у ТЬг Суз С1п Агд НЬз 130 135 140

Уа1 РЬе Рго Ыз Азп Ηίδ ТЬг АЬа Азр Не С1п Бег 01и Уа1 Ηίδ Суз 145 150 155 160

Не РЬе Бег Рго С1п Не 01и С1и Рго Азп С1п Суз Рго Азр Суз Уа1 165 170 175

Уа1 Бег А1а Ьеи С1у А1а Ьуз УаЬ Ьеи Бег Бег Уа1 Ьуз Азр Агд РЬе 180 185 190

Не Азп РЬе РЬе Уа1 01у Азп ТЬг Не Азп Бег Бег Туг РЬе Рго Ηίδ 195 200 205

- 74 020398

ΗΪ5 Рго Ьеи НДз Зег Не Зег Уа1 Агд Агд Ьеи Ьуз С1и ТЬг Ьуз Азр 210 215 220

01у РЬе МеД РЬе Ьеи ТЬг Азр С1п Зег Туг 11е Азр Уа1 Ьеи Рго 51и 225 230 235 240

РЬе Агд Азр Зег Туг Рго 11е Ьуз Туг Не ΗΪ3 А1а РЬе С1и Зег Азп 245 250 255

Азп РЬе 11е Туг РЬе Ьеи ТЬг Уа1 С1п Агд 01и ТЬг Ьеи Азп А1а С1п 260 265 270

ТЬг РЬе На? ТЬг Агд Не Не Агд РЬе Суз Зег ьеи Азп Зег С1у Ьеи 275 280 285

ΗΪ3 Зег Туг МеД С1и МеД Рго Ьеи С1и Суз Не Ьеи ТЬг С1и Ьуз Агд 290 295 300

Ьуз Ьуз Агд Зег ТЬг Ьуз Ьуз С1и Уа1 РЬе Азп 11е Ьеи С1п А1а А1а 305 310 315 320

Туг Уа1 2ег Ьуз Рго С1у А1а С1п Ьеи А1а Агд С1п Не С1у А1а Зег 325 330 335

Ьеи Азп Азр Азр 11е Ьеи РЬе С1у νβΐ РЬе А1а С1п Зег Ьуз Рго Азр 340 345 350

5ег А1а С1и Рго МеД Азр Агд Зег А1а МеД Суз А1а РЬе Рго 11е Ьуз 355 360 365

Туг Уа1 Азп Азр РЬе РЬе Азп Ьуз 11е Уа1 Азп Ьуз Азп Азп УаЬ Агд 370 375 380

Суз Ьеи С1п Щз РЬе Туг С1у Рго Азп Шз С1и ΗΪ5 Суз РЬе Азп Агд 385 390 395 400

ТЬг Ьеи Ьеи Агд Азп Зег Зег С1у Суз С1и А1а Агд Агд Азр О1и Туг 405 410 415

Агд А1а С1и РЬе ТЬг ТЬг А1а Ьеи С1п Агд Уа1 Азр Ьеи РЬе МеД С1у 420 425 430

С1п РЬе Зег С1и Уа1 Ьеи Ьеи ТЬг £ег Не Зег ТЬг РЬе \7а1 Ьуз С1у 435 440 445

Азр Ьеи ТЬг Не А1а Азп Ьеи С1у ТЬг Зег С1и С1у Агд РЬе МеД С1п 450 455 460

Уа1 Уа1 Уа1 Зег Агд Зег 61у Рго Зег ТЬг Рго Нгз Уа1 Азп РЬе Ьеи 465 470 475 480

Ьеи Азр Зег Нгз Рго Уа1 Зег Рго С1и Уа1 Не Уа1 01и ΗΪ3 Рго Ьеи 485 490 495

Азп С1п Азп 01у Туг ТЬг Ьеи Уа1 Уа1 ТЬг С1у Ьуз Ьуз Не ТЬг Ьуз 500 505 510

11е Рго Ьеи Азп С1у Ьеи С1у Суз Агд Шз РЬе С1п Зег Суз Зег С1п 515 520 525

Суз Ьеи Зег А1а Рго Рго РЬе Уа1 С1п Суз С1у Тгр Суз ΗΪ3 Азр Ьуз 530 535 540

Суз Уа1 Агд Зег С1и С1и Суз Рго Зег С1у ТЬг Тгр ТЬг С1п С1п Не 545 550 555 560

Суз Ьеи Рго А1а Не Туг Ьуз Уа1 РЬе Рго ТЬг Зег А1а Рго Ьеи С1и 565 570 575

С1у С1у ТЬг Агд Ьеи ТЬг Не Суз С1у Тгр Азр РЬе С1у РЬе Агд Агд 580 535 590

Азп Азп Ьуз РЬе Азр Ьеи Ьуз Ьуз ТЬг Агд Уа1 Ьеи Ьеи С1у Азп С1и 595 600 605

Зег Суз ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег С1и Зег ТЬг МеД Азп ТЬг Ьеи Ьуз Суз 610 615 620

ТЬг Уа1 С1у Рго А1а МеД Азп Ьуз Ηίί РЬе Азп МеД Зег 11е 11е 11е 625 630 635 640

Зег Азп С1у НДз 61у ТЬг ТЬг С1п Туг Зег ТЬг РЬе Зег Туг Уа1 Азр 645 650 655

Рго Не 11е ТЬг Зег 11е Зег Рго Ьуз Туг С1у Рго МеД А1а С1у С1у 660 665 670

ТЬг Ьеи Ьеи ТЬг Ьеи ТЬг С1у Азп Туг Ьеи Азп Зег С1у Азп Зег Агд 675 680 685

Шз Не Зег Не С1у С1у Ьуз ТЬг Суз ТЬг Ьеи Ьуз Зег Уа1 Зег Азп 690 695 700

Зег Не Ьеи С1и Суз Туг ТЬг Рго А1а С1п ТЬг Не Зег ТЬг С1и РЬе 705 710 715 720

- 75 020398

А1а Уа1 Ьуз Ьеи Ьуз 11е Азр Ьеи А1а Азп Агд <31и ТЬг Зег Не РЬе 725 730 735

Зег Туг Агд С1и Азр Рго 11е Уа1 Туг С1и Не Нхз Рго ТЬг Ьуз Зег 740 745 750

РЬе Не Зег С1у С1у Зег ТЬг 11е ТЬг С1у Уа1 С1у Ьуз Азп Ьеи Ηίβ 755 760 765

Зег Уа1 Зег Уа1 Рго Агд МеС Уа1 11е Азп Уа1 Ηί$ С1и А1а С1у Агд 770 775 780

Азп РЬе ТЬг Уа1 А1а Суз С1п Ηίε Агд Зег Азп Зег С1и Не Не Суз 785 790 795 800

Суз ТЬг ТЬг Рго Зег Ьеи С1п С1п Ьеи Азп Ьеи С1п Ьеи Рго Ьеи Ьуз 805 810 815

ТЬг Ьуз А1а РЬе РЬе МеС Ьеи Азр С1у 11е Ьеи Зег Ьуз Туг РЬе Азр 820 825 830

Ьеи Не Туг Уа1 Ηίβ Азп Рго Уа1 РЬе Ьуз Рго РЬе С1и Ьуз Рго Уа1 835 840 845

Мес Не Зег Мес С1у Азп С1и Азп Уа1 Ьеи С1и Не Ьуз С1у Азп Азр 850 855 860

11е Азр Рго С1и А1а Уа1 Ьуз С1у С1и Уа1 Ьеи Ьуз Уа1 С1у Азп Ьуз 865 870 875 880

Зег Суз С1и Азп 11е Нхз Ьеи Ηίε Зег С1и А1а Уа1 Ьеи Суз ТЬг Уа1 885 890 895

Рго Азп Азр Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Азп Зег С1и Ьеи Азп 11е 01и Тгр Ьуз 900 905 910

С1п А1а Не Зег Зег ТЬг Уа1 Ьеи С1у Ьуз Уа1 Не Уа1 С1п Рго Азр 915 920 925

С1п Азп РЬе ТЬг Ьеи С1и \7а1 Ьеи РЬе С1п С1у Рго Азр 11е С1и Рго 930 935 940

Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Нхз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и 945 950 955 960

Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр 965 970 975

ТЬг Ьеи МеС Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 νβΐ Уа1 Азр 980 985 990

Уа1 Зег Нхз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у 995 1000 1005

7а1 С1и Уа1 Нхз Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг 1010 1015 1020

Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нхз С1п 1025 1030 1035

Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз 1040 1045 1050

А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у 1055 1060 1065

С1п Рго Агд С1и Рго С1п С1и Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и 1070 1075 1080

С1и МеС ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у 1085 1090 1095

РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр <31и Зег Азп 01у С1п 1100 1105 1110

Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр 1115 1120 1125

С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд ИЗО 1135 1140

Тгр С1п С1п С1у Азп Л/а1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеС Нхз С1и А1а 1145 1150 1155

Ьеи Нхз Азп Нхз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у 1160 1165 1170

Ьуз Агд 11е Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз Нхз Уа1 Нхз Нхз 1175 1180 1185

Нхз Нхз Нхз Нхз 1190 <210> 74 <211> 1194 <212> Белок <213> РаССиз гаССиз

- 76 020398 <400> 74

МеС Ьуз А1а Рго ТЬг А1а Ьеи А1а Рго С1у Не Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи 15 10 15

ТЬг Ьеи А1а С1п Агд Зег Шз 61у С1и Суз Ьуз С1и А1а Ьеи Уа1 Ьуз 20 25 30

Зег С1и МеС Азп Уа1 Азп Мес Туз Туг С1п Ьеи Рго Азп РЬе ТЬг А1а 35 40 45 <31и ТЬг Рго 11е Н1« Азп Уа1 Уа1 Ьеи Низ С1у Ηί3 Низ Не Туг Ьеи 50 55 60

01у А1а ТЬг Азп Туг 11е Туг Уа1 Ьеи Азп Азр Ьуз Азр Ьеи б1п Ьуз 65 70 75 80

Уа1 Зег С1и РЬе Ьуз ТЬг С1у Рго Уа1 Йа1 С1и Низ Рго Азр Суз РЬе 85 90 95

Рго Суз С1п Азр Суз Зег Зег Ьуз А1а Азп Уа1 Зег С1у С1у Уа1 Тгр 100 105 110

Ьуз Азр Азп Уа1 Азп МеС А1а Ьеи Ьеи Уа1 Азр ТЬг Туг Туг Азр Азр 115 120 125

01п Ьеи 11е Зег Суз С1у Зег Уа1 Азп Агд С1у ТЬг Суз С1п Агд Низ 130 135 140

Уа1 Ьеи Рго Рго Азр Азп А1а А1а Азр 11е С1п Зег С1и Уа1 Низ Суз 145 150 155 160

Мес РЬе Зег Рго Ьеи А1а С1и С1и С1и 5ег С1у С1п Суз Рго Азр Суз 165 170 175

Уа1 Уа1 Зег А1а Ьеи С1у А1а Ьуз Уа1 Ьеи Ьеи Зег С1и Ьуз Азр Агд 180 185 190

РЬе Не Азп РЬе РЬе Уа1 С1у Азп ТЬг 11е Азп Зег Зег Туг Рго Рго 195 200 205

Азр Туг Зег Ьеи Низ Зег Не Зег Уа1 Агд Агд Ьеи Ьуз С1и ТЬг С1п 210 215 220

Азр С1у РЬе Ьуз РЬе Ьеи ТЬг Азр С1п Зег Туг 11е Азр Уа1 Ьеи Рго 225 230 235 240

С1и РЬе Агд Азр Зег Туг Рго 11е Ьуз Туг Не Низ А1а РЬе С1и Зег 245 250 255

Азп Низ РЬе 11е Туг РЬе Ьеи ТЬг Уа1 С1п Ьуз С1и ТЬг Ьеи Азр А1а 260 265 270

С1п ТЬг РЬе Низ ТЬг Агд 11е Не Агд РЬе Суз Зег Уа1 Азр Зег С1у 275 280 285

Ьеи Низ Зег Туг МеС С1и МеС Рго Ьеи С1и Суз Не Ьеи ТЬг С1и Ьуз 290 295 300

Агд Агд Ьуз Агд Зег ТЬг Агд С1и С1и Уа1 РЬе Азп Не Ьеи С1п А1а 305 310 315 320

А1а Туг Уа1 Зег Ьуз Рго С1у А1а Азп Ьеи А1а Ьуз С1п 11е С1у А1а 325 330 335

Зег Рго Туг Азр Азр 11е Ьеи Туг С1у Уа1 РЬе А1а С1п Зег Ьуз Рго 340 345 350

Азр Зег А1а С1и Рго МеС Азп Агд Зег А1а Уа1 Суз А1а РЬе Рго 11е 355 360 365

Ьуз Туг Уа1 Азп Азр РЬе РЬе Азп Ьуз Не Уа1 Азп Ьуз Азп Азп Уа1 370 375 380

Агд Суз Ьеи С1п Низ РЬе Туг С1у Рго Азп Низ С1и Низ Суз РЬе Азп 385 390 395 400

Агд ТЬг Ьеи Ьеи Агд Азп Зег 5ег С1у Суз С1и Уа1 Агд Зег Азр С1и 405 410 415

Туг Агд ТЬг С1и РЬе ТЬг ТЬг А1а Ьеи С1п Агд Уа1 Азр Ьеи РЬе МеС 420 425 430

С1у Агд Ьеи Азп Низ Уа1 Ьеи Ьеи ТЬг Зег 11е Зег ТЬг РЬе 11е Ьуз 435 440 445

С1у Азр Ьеи ТЬг 11е А1а Азп Ьеи С1у ТЬг Зег С1и С1у Агд РЬе МеС 450 455 460

С1п Уа1 Уа1 Ьеи Зег Агд ТЬг А1а Низ РЬе ТЬг Рго Низ Уа1 Азп РЬе 465 470 475 480

Ьеи Ьеи Азр Зег Туг Рго Уа1 Зег Рго С1и Уа1 Не Уа1 С1и Низ Рго 485 490 495

Зег Азп С1п Азп С1у Туг ТЬг Ьеи Уа1 Уа1 ТЬг С1у Ьуз Ьуз 11е ТЬг 500 505 510

- 77 020398

Ьуз 11е Рго Ьеи Азп 61у Ьеи <31у Суз С1у Низ РЬе С1п Зег Суз Зег 515 520 525

С1п Суз Ьеи 5ег А1а Рго Туг РЬе Не С1п Суз С1у Тгр Суз Ηίδ Азп 530 535 540

Агд Суз Уа1 Низ 5ег Азп С1и Суз Рго Зег С1у ТЬг Тгр ТЬг С1п 01и 545 550 555 560

Не Суз Ьеи Рго А1а \?а1 Туе Ьуз Уа1 РЬе Рго ТЬг Зег А1а Рго Ьеи 565 570 575

С1и С1у С1у ТЬг МеС Ьеи ТЬг Не Суз С1у Тгр Азр РЬе С1у РЬе Ьуз 580 585 590

Ьуз Азп Азп Ьуз РЬе Азр Ьеи Агд Ьуз ТЬг Ьуз ^а1 Ьеи Ьеи С1у Азп 595 600 605

С1и 5ег Суз ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег С1и Зег ТЬг ТЬг Азп ТЬг Ьеи Ьуз 610 615 620

Суз ТЬг А/а1 С1у Рго А1а МеС Зег С1и Н1з РЬе Азп Уа1 Зег Уа1 11е 625 630 635 640

Уа1 Зег Азп 5ег Агд <31и ТЬг ТЬг С1п Туг Зег А1а РЬе Зег Туг Уа1 645 650 655

Азр Рго Уа1 11е ТЬг Зег Не Зег Рго Агд Туг С1у Рго Низ А1а С1у 660 665 670

С1у ТЬг Ьеи Ьеи ТЬг Ьеи ТЬг 61у Ьуз Туг Ьеи Азп Зег 61у Азп Зег 675 680 685

Асд Низ Не 5ег 11е 61у С1у Ьуз ТЬг Суз ТЬг Ьеи Ьуз Зег Уа1 Зег 690 695 700

Азр Зег 11е Ьеи С1и Суз Туг ТЬг Рго С1у Ηίδ ТЬг Уа1 Зег А1а С1и 705 710 715 720

РЬе Рго Уа1 Ьуз Ьеи Ьуз Не Азр Ьеи А1а Азр Агд Уа1 ТЬг Зег Зег 725 730 735

РЬе Зег Туг Агд С1и Азр Рго Уа1 Уа1 Зег С1и 11е Низ Рго ТЬг Ьуз 740 745 750

Зег РЬе Не Зег С1у С1у Зег ТЬг Не ТЬг С1у Не С1у Ьуз Азп Ьеи 755 760 765

Азп Зег νβΐ Зег ТЬг Рго Ьуз Ьеи Уа1 Не 01и Уа1 Низ Азр Уа1 С1у 770 775 780

Уа1 Азп Туг ТЬг Уа1 А1а Суз С1п Низ Агд Зег Зег Зег С1и 11е Не 785 790 795 800

Суз Суз ТЬг ТЬг Рго Зег Ьеи С1п С1п Ьеи Азр Ьеи С1п Ьеи Рго Ьеи 805 810 815

Ьуз ТЬг Ьуз А1а РЬе РЬе Ьеи Ьеи Азр С1у 11е Ьеи Зег Ьуз Низ РЬе 820 825 830

Азр Ьеи ТЬг Туг Уа1 Низ Αερ Рго МеС РЬе Ьуз Рго РЬе С1и Ьуз Рго 835 840 845

Уа1 МеС Не Зег МеС С1у Азп О1и Азп Уа1 Уа1 С1и Не Ьуз С1у Азр 850 855 860

Азр Не Азр Рго С1и А1а Уа1 Ьуз С1у С1и Уа1 Ьеи Ьуз Уа1 С1у Азп 865 870 875 880

Ьуз Зег Суз 51и Азп Ьеи Низ Тгр Низ Зег С1и А1а Ьеи Ьеи Суз ТЬг 885 890 895

Уа1 Рго Зег Азр Ьеи Ьеи Ьуз Ьеи Азп С1у С1у С1и Ьеи Азп Не 01и 900 905 910

Тгр Ьуз С1п А1а νβΐ Зег Зег ТЬг Уа1 Ьеи С1у Ьуз Уа1 Не Уа1 С1п 915 920 925

Рго Азр С1п Азп РЬе А1а Ьеи С1и Уа1 Ьеи РЬе С1п С1у Рго Азр Не 930 935 940

С1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Низ ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а 945 950 955 960

Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго 965 970 975

Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеС Не Зег Агд ТЬг Рго 01и Уа1 ТЬг Суз УаЬ Уа1 980 985 990

Уа1 Азр Уа1 Зег Низ С1и Азр Рго 01и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 995 1000 1005

Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Низ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и 1010 1015 1020

- 78 020398

С1п Туг Азп 5ег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 5ег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 1025 1030 1035 <210> 75 <211> 932 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 75

МеЬ Ьуз А1а Рго А1а Уа1 Ьеи А1а Рго С1у Не Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи РЬе

ТЬг Ьеи Уа1 С1п Агд 5ег Азп С1у С1и Суз Ьуз С1и А1а Ьеи А1а Ьуз

Бег С1и Мер Азп Уа1 Азп Мер Ьуз Туг С1п Ьеи Рго Азп РЬе ТЬг А1а

С1и ТЬг Рго 11е 61п Азп Уа1 11е Ьеи Ηίδ 01и Ηίε Ηίί 11е РЬе Ьеи

С1у А1а ТЬг Азп Туг 11е Туг Уа1 Ьеи Азп С1и О1и Азр Ьеи С1п Ьуз

Уа1 А1а С1и Туг Ьуз ТЬг С1у Рго Уа1 Ьеи С1и Ηϊί Рго Азр Суз РЬе

11е РЬе Бег Рго С1п 11е С1и С1и Рго Бег С1п Суз Рго Азр Суз Уа1 165 170 175

Уа1 Бег А1а Ьеи С1у А1а Ьуз Уа1 Ьеи Бег Бег Уа1 Ьуз Азр Агд РЬе 180 185 190

РЬе Агд Азр Бег Туг Рго 11е Ьуз Туг Уа1 ΗΪ5 А1а РЬе О1и Бег Азп 245 250 255

- 79 020398

Ηίδ Зег Туг МеС С1и МеС Рго Ьеи С1и Суз Не Деи ТЬг С1и Ьуз Агд 290 295 300

Ьуз Ьуз Агд Зег ТЬг Ьуз Ьуз С1и Уа1 РЬе Азп Не Ьеи С1п А1а А1а 305 310 315 320

Туг Уа1 Зег Ьуз Рго С1у А1а С1п Ьеи А1а Агд С1п Не С1у А1а Зег 325 330 335

Ьеи Азп Азр Азр Не Ьеи РЬе С1у Уа1 РЬе А1а С1п Зег Ьуз Рго Азр 340 345 350

Зег А1а С1и Рго МеС Азр Агд Зег А1а МеС Суз А1а РЬе Рго Не Ьуз 355 360 365

Туг Уа1 Азп Азр РЬе РЬе Азп Ьуз 11е Уа1 Азп Ьуз Азп Азп Уа1 Агд 370 375 380

Суз Ьеи С1п Низ РЬе Туг С1у Рго Азп Низ С1и Низ Суз РЬе Азп Агд 385 390 395 400

ТЬг Ьеи Ьеи Агд Азп Зег Зег С1у Суз С1и А1а Агд Агд Азр С1и Туг 405 410 415

Агд ТЬг С1и РЬе ТЬг ТЬг А1а Ьеи С1п Агд Уа1 Азр Ьеи РЬе МеС С1у 420 425 430

С1п РЬе Зег С1и Уа1 Ьеи Ьеи ТЬг Зег Не Зег ТЬг РЬе 11е Ьуз С1у 435 440 445

Азр Ьеи ТЬг Не А1а Азп Ьеи С1у ТЬг Зег 01и С1у Агд РЬе МеС 01п 450 455 460

Уа1 17а1 Уа1 Зег Агд Зег С1у Рго Зег ТЬг Рго Низ Уа1 Азп РЬе Ьеи 465 470 475 480

Ьеи Аар Зег Низ Рго Уа1 Зег Рго С1и Уа1 11е Уа1 01и Низ ТЬг Ьеи 485 490 495

Азп С1п Азп С1у Туг ТЬг Ьеи Уа1 11е ТЬг С1у Ьуз Ьуз Не ТЬг Ьуз 500 505 510

11е Рго Ьеи Азп С1у Ьеи С1у Суз Агд Низ РЬе б1п Зег Суз Зег С1п

515 520 525

Суз Ьеи Зег А1а Рго Рго РЬе Уа1 С1п Суз С1у Тгр Суз Низ Азр Ьуз 530 535 540

Суз Уа1 Агд Зег С1и С1и Суз Ьеи Зег С1у ТЬг Тгр ТЬг С1п С1п Не 545 550 555 560

Суз Ьеи Рго А1а Не Туг Ьуз Уа1 РЬе Рго Азп Зег А1а Рго Ьеи С1и 565 570 575

01у 21у ТЬг Агд Ьеи ТЬг 11е Суз С1у Тгр Азр РЬе С1у РЬе Агд Агд 580 585 590

Зег Суз ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег О1и Зег ТЬг МеС Азп ТЬг Ьеи Ьуз Суз 610 615 620

ТЬг Уа1 С1у Рго А1а МеС Азп Ьуз Низ РЬе Азп МеС Зег Не 11е Не 625 630 635 640

Зег Азп С1у Низ С1у ТЬг ТЬг С1п Туг Зег ТЬг РЬе Зег Туг Уа1 Азр 645 650 655

Рго Уа1 Не ТЬг Зег Не Зег Рго Ьуз Туг С1у Рго МеС А1а С1у С1у 660 665 670

ТЬг Ьеи Ьеи ТЬг Ьеи ТЬг 61у Азп Туг Ьеи Азп Зег С1у Азп Зег Агд 675 680 685

Низ Не Зег Не С1у С1у Ьуз ТЬг Суз ТЬг Ьеи Ьуз Зег Уа1 Зег Азп 690 695 700

А1а Уа1 Ьуз Ьеи Ьуз Не Азр Ьеи А1а Азп Агд 01и ТЬг Зег Не РЬе 725 730 735

Зег Туг Агд С1и Азр Рго Не Уа1 Туг С1и 11е Низ Рго ТЬг Ьуз Зег 740 745 750

РЬе 11е Зег С1у С1у Зег ТЬг 11е ТЬг <31у Уа1 С1у Ьуз Азп Ьеи Азп 755 760 765

Зег Зег Уа1 Рго Агд МеС Уа1 Не Азп Уа1 Низ С1и А1а С1у Агд 770 775 780

Азп РЬе ТЬг Уа1 А1а Суз С1п Низ Агд Зег Азп Зег С1и 11е Не Суз 785 790 795 800

- 80 020398

Суз

ТЬг

Рго

Зег Ьеи С1п С1п Ьеи Азп Ьеи С1п Ьеи Рго Ьеи Ьуз

805

810

815

ТЬг

Ьуз

А1а

РЬе

МеЬ

Ьеи

Азр

С1у

Не

Ьеи

Зег

Ьуз

Туг

РЬе

Азр

820

825

830

Ьеи

11е

Туг

Уа1

Шв

Азп

Рго

Уа1

РЬе

Ьуз

Рго

РЬе

С1и

Ьуз

Рго

Уа1

835

840

845

МеЬ

Не

Зег

МеЬ

С1у

Азп

С1и

Азп

Уа1

Ьеи

С1и

Пе

Ьуз

С1у

Азп

Азр

850

855

860

Не

Азр

Рго

О1и

А1а

Уа1

Ьуз

С1у

С1и

Уа1

Ьеи

Ьуз

Уа1

С1у

Азп

Ьуз

865

870

875

880

Зег

Суз

С1и

Азп

11е

Низ

Ьеи

Н1з

Зег

61и

АЬа

Уа1

Ьеи

Суз

ТЬг

Уа1

885

890

895

Рго

Азп

Азр

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Азп

Зег

СЬи

Ьеи

Азп

Не

С1и

Тгр

Ьуз

900

905

910

С1п

А1а

11е

Зег

ТЬг

Уа1

Ьеи

С1у

Ьуз

УаХ

11е

Уа1

С1п

Рго

Азр

915

920

925

С1п

Азп

РЬе

ТЬг

930 <210> 76 <211> 578 <212> Белок

<213> Ното <400> 76	зарЬепз
МеЬ 1	Ьуз	А1а	Рго	А1а 5	Уа1	Ьеи	А1а	Рго	С1у 10	11е Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи РЬе 15
тьг	Ьеи	Уа1	С1п 20	Агд	Зег	Азп	С1у	С1и 25	Суз	Ьу5 СЬи А1а Ьеи А1а Ьуз 30
Зег	С1и	МеС 35	Азп	Уа1	Азп	МеС	Ьуз 40	Туг	С1п	Ьеи Рго Азп РЬе ТЬг А1а 45
С1и	ТЬг 50	Рго	Не	С1п	Азп	Уа1 55	Не	Ьеи	Ηί з	С1и Шз Шз Не РЬе Ьеи 60
С1у 65	А1а	ТЬг	Азп	Туг	Не 70	Туг	Уа1	Ьеи	Азп	01и С1и Азр Ьеи С1п Ьуз 75 80
Уа1	АЬа	61и	Туг	Ьуз 85	ТЬг	С1у	Рго	Уа1	Ьеи 90	С1и Шз Рго Азр Суз РЬе 95
Рго	Суз	С1п	Азр 100	Суз	Зег	Зег	Ьуз	А1а 105	Азп	Ьеи Зег С1у С1у Уа1 Тгр 110
Ьуз	Азр	Азп 115	Не	Азп	МеЬ	А1а	Ьеи 120	Уа1	Уа1	Азр ТЬг Туг Туг Азр Азр 125
С1п	Ьеи 130	Не	Зег	Суз	С1у	Зег 135	Уа1	Азп	Агд	О1у ТЬг Суз С1п Агд Шз 140
Уа1 145	РЬе	Рго	Шз	Азп	Нхз 150	ТЬг	А1а	Азр	Не	С1п Зег С1и Уа1 Шз Суз 155 160
Не	РЬе	Зег	Рго	С1п 165	Не	С1и	С1и	Рго	Зег 170	С1п Суз Рго Азр Суз Уа1 175
Уа1	Зег	А1а	Ьеи 180	С1у	А1а	Ьуз	Уа1	Ьеи 185	Зег	Зег Уа1 Ьуз Азр Агд РЬе 190
Не	Азп	РЬе 195	РЬе	Уа1	С1у	Азп	ТЬг 200	Не	Азп	Зег Зег Туг РЬе Рго Азр 205
ΗΪ5	Рго 210	Ьеи	ΗΪ3	Зег	Не	Зег 215	Уа1	Агд	Агд	Ьеи Ьуз С1и ТЬг Ьуз Азр 220
С1у 225	РЬе	МеЬ	РЬе	Ьеи	ТЬг 230	Азр	С1п	Зег	Туг	11е Азр Уа1 Ьеи Рго 01и 235 240
РЬе	Агд	Азр	Зег	Туг 245	Рго	Не	Ьуз	Туг	УаЬ 250	Шз А1а РЬе С1и Зег Азп 255
Азп	РЬе	11е	Туг 260	РЬе	Ьеи	ТЬг	Уа1	С1п 265	Агд	С1и ТЬг Ьеи Азр А1а 01п 270
ТЬг	РЬе	Низ 275	ТЬг	Агд	11е	Х1е	Агд 280	РЬе	Суз	Зег 11е Азп Зег 01у Ьеи 285
ΗΪ3	Зег 290	Туг	МеС	С1и	Мес	Рго 295	Ьеи	С1и	Суз	Не Ьеи ТЬг С1и Ьуз Агд 300
Ьуз 305	Ьуз	Агд	Зег	ТЬг	Ьуз 310	Ьуз	С1и	Уа1	РЬе	Азп Не Ьеи С1п А1а А1а 315 320
Туг	Уа1	Зег	Ьуз	Рго 325	С1у	А1а	01п	Ьеи	А1а 330	Агд С1п Не С1у А1а Зег 335

Ьеи Азп Αδρ Αδρ 11$ Ьеи РЬ$ 61у Уа1 РЬе А1а С1п Бег Ьуз Рго Азр 340 345 350

Зег А1а С1и Рго Мер Азр Агд Зег А1а Мер Суз А1а РЬе Рго Не Ьуз 355 360 365

Туг Уа1 Азп Азр РЬе РЬе Азп Ьуз 11е Уа1 Азп Ьуз Азп Азп. Уа1 Агд 370 375 380

Суз Ьеи С1п Ηίδ РЬе Туг С1у Рго Азп Шз С1и Шз Суз РЬе Азп Агд 385 390 395 400

ТЬг Ьеи Ьеи Агд Азп Зег Зег <51у Суз 61и А1а Агд Агд Азр О1и Туг 405 410 415

Агд ТЬг С1и РЬе ТЬг ТЬг А1э Ьеи С1п Агд Уа1 Азр Ьеи РЬе МеР С1у 420 425 430

С1п РЬе 5ег С1и Уа1 Ьеи Ьеи ТЬг Зег Не Зег ТЬг РЬе 11е Ьуз С1у 435 440 445

Азр Ьеи ТЬг Не А1а Азп Ьеи <51у ТЬг Зег С1и О1у Агд РЬе Мер <31п 450 455 460

Уа1 Уа1 Уа1 Зег Агд Зег С1у Рго Зег ТЬг Рго Ηίδ Уа1 Азп РЬе Ьеи 465 470 475 480

Ьеи Азр Зег Шз Рго Уа1 Зег Рго С1и Уа1 Не Уа1 С1и Шз ТЬг Ьеи 485 490 495

Азп С1п Азп С1у Туг ТЬг Ьеи Уа1 Не ТЬг С1у Ьуз Ьуз 11е ТЬг Ьуз 500 505 510

Не Рго Ьеи Азп С1у Ьеи 01у Суз Агд Н1з РЬе С1п Зег Суз Зег 61л 515 520 525

Суз Ьеи Зег А1а Рго Рго РЬе Уа1 С1п Суз С1у Тгр Суз Шз Азр Ьуз 530 535 540

Суз νβΐ Агд Зег С1и <31и Суз Ьеи Зег С1у ТЬг Тгр ТЬг С1п С1п 11е 545 550 555 560

Суз Ьеи Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз Н1з Уа1 Шз Шз Шз Шз 565 570 575 <210> 77 <211> 10 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 77

Уа1 Уа1 Азр ТЬг Туг Туг Азр Азр С1п Ьеи 15 10 <210> 78 <211> 25 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 78

11е Зег Суз С1у Зег Уа1 Азп Агд С1у ТЬг Суз С1п Агд Ηίδ Уа1 РЬе

Рго ΗΪ3 Азп ΗΪ3 ТЬг А1а Азр Не С1п <210> 79 <211> 18 <212> Белок <213> Ното заргепа <400> 79

А1а Ьеи С1у А1а Ьуз Уа1 Ьеи Зег Зег Уа1 Ьуз Азр Агд РЬе Не Азп <210> 80 <211> 12 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 80

Уа1 Агд Агд Ьеи Ьуз С1и ТЬг Ьуз Азр С1у РЬе Мер <210> 81 <211> 6 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 81

Азр ТЬг Туг Туг Азр Азр 1 5

- 82 020398 <211> 13 <212> Белок <213> Мото заргепз <400> 82

К1з Уа1 РЬе Рго НЬз Азп ΗΪ5 ТЬг А1а Аар Не С1п Зег 15 10 <210> 33 <211> 4 <212> Белок <213> Нолю зар1епз <400> 83

РЬе Не Азп РЬе 1 <210> 84 <211> 8 <212> Белок <213> Ношо заргепз <400 84

Ьуз С1и ТЬг Ьуз Азр 61у РЬе МеС 1 5 <210 85 <211> 24 <212> Белок <213> Нолю зархепз <400> 85

Туг Ьуз ТЬг 61у Рго Уа1 Ьеи 61и Н1з Рго Азр Суз РЬе Рго Суз С1п 15 10 15

Азр Суз Зег Зег Ьуз А1а Азп Ьеи 20 <210> 86 <211> 11 <212> Белок <213> Ношо зарЬепз <400> 86

Суз РЬе Рго Суз 61п Азр Суз Зег Зег Ьуз А1а 1 5 10 <210> 87 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <2 2 0>

<223> Синтетический конструкт <220 <221> проч. свойство <222> (4)..(4) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220 <221> проч. свойство <222> (6)..(6) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <400 87

01у ТЬг Зег Хаа Ьеи Хаа Зег

5 <210> 88 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220 <223> Синтетический конструкт <220 <221> проч. свойство <222> (7)..(7) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <400 88

Зег Уа1 Зег Зег Зег Уа1 Хаа Зег 11е Туг Ьеи Ηίβ

10 <210> 89 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220 <223> Синтетический конструкт <220 <221> проч. свойство <222> (1)..(2) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

<221> проч. свойство <222> (4)..(4) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <400> 89

Хаа Хаа Туг Хаа С1у Туг Рго Ьеи ТЬг

5

- 83 020398 <210> 90 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический КбнСТруКг <220>

<221> лроч. свойство <222> (12)..(12) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

<221> лроч. свойство <222> (14)..(14) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <400> 90

Тгр Не Туг Рго Уа1 ТЬг С1у Азр ТЬг Туг Туг Хаа С1и Хаа РЬе Ьуз 15 10 15

С1у <210> 91 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <220>

<221> проч. свойство <222> (6) ..(б) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <400> 91

С1у Туг 51у А1а РЬе Хаа Туг

5 <210> 92 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <220>

<221> проч. свойство <222> (5)..(5) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

<221> проч. свойство <222> (7) .. (8) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <400> 92

Агд Уа1 Аэп Рго Хаа Агд Хаа Хаа ТЬг ТЬг Туг Азп С1п Ьуз РЬе С1и 15 10 15

С1у <210> 93 <211> б <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <220>

<221> проч. свойство <222> (1)..(1) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

<221> проч. свойство <222> (3).. (3) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <400> 93

Хаа Азп Хаа Ьеи Азр Туг

5 <210> 94 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <220>

<221> проч. свойство <222> (54)..(54) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

<221> проч. свойство <222> (56)..(56) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <400> 94

С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п 5ег Рго С1у ТЬг Ьеи 5ег Ьеи 5ег Рго 01у 15 10 15

Азп Ьеи Шз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи

11е Туг С1у ТЬг Зег Хаа Ьеи Хаа Зег С1у 11е Рго Азр Агд РЬе Зег

Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз С1п С1п Тгр Зег Зег Туг Рго <210> 95 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <220>

<221> проч. свойство <222> (30).. (30) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

<221> проч. свойство <222> (90)..(91) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

<221> проч. свойство <222> (93)..(93) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <400> 95

Азр Не С1п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у

Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Зег Уа1 Зег Зег Зег Уа1 Хаа Зег Не

Туг Ьеи Нхз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи

Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег

С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п

70 75 30

Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз Хаа Хаа Туг Хаа С1у Туг Рго

Ьеи ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз 7а1 С1и Не Ьуз 100 105 <210> 96 <211> 115 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <220>

<221> проч. свойство <222> (61)..(61) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

<221> проч. свойство <222> (63)..(63) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

<221> проч. свойство <222> (104) . . (104) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <400> 96

С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 6ΐη Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у Зег

Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Агд 20 25 30

Туг Не Ηίε Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи б!и Тгр МеД

С1у Тгр 11е Туг Рго Уа1 ТЬг С1у Азр ТЬг Туг Туг Хаа С1и Хаа РЬе

Ьуз С1у Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг А1а Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг А1а Туг 65 70 75 80

МеД С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз

А1а Агд С1у Туг б1у А1а РЬе Хаа Туг Тгр С1у 01п О1у ТЬг Ьеи Уа1 100 105 110

ТЬг УаЬ Зег 115

- 85 020398 <210> 97 <211> 114 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетический конструкт <220>

<221> проч. свойство <222> (56)..(57) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

<221> проч. свойство <222> (99)..(99) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <220>

<221> проч. свойство <222> (101)..(101) <223> Хаа может представлять собой любую природную аминокислоту <400> 97

61п 1	Уа1	Οίη Ьеи Уа1 5	С1п Зег С1у А1а	С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у А1а
10	15
Зег	Уа1	Ьуз Уа1 Зег	Суз Ьуз А1а Зег	С1у	Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг
		20	25		30
Туг	Мер	ΗΪ3 Тгр Уа1	Агд С1п А1а Рго	С1у	С1п 01у Ьеи 01и Тгр Мер
		35	40		45
С1у	Агд	Уа1 Азп Рго	Хаа Агд Хаа Хаа	ТЬг	ТЫ Туг Азп С1п Ьуз РЬе
	50		55		60
С1и	С1у	Агд Уа1 ТЬг	Мер ТЬг ТЬг Азр	ТЬг	Зег ТЬг 5ег ТЬг А1а Туг
65			70		75 80
Мер	С1и	Ьеи Агд Зег	Ьеи Агд Зег Азр	Азр	ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
		85		90	95
А1а	Агд	Хаа Азп Хаа	Ьеи Азр Туг Тгр	С1у	С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг
		100	105		110
Уа1	Зег
		ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которое связывается с сМе!

Claims

1. Моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которое связывается с сМе! человека и содержит три гипервариабельных участка легкой цепи (ЬСОК) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (ΗС^К), где указанные три ЬСЭК и указанные три ΗС^К представляют собой ЬСЭК1, содержащий аминокислотную последовательность δνδδδνδδΙΥΕΗ (δΕ^ ГО N0: 53), 1.С1Ж2, содержащий аминокислотную последовательность δΈδΗΡΑδ (δΕ^ ГО N0: 54), ЕСОК3, содержащий аминокислотную последовательность ^VΥδΟΥΡ^Τ (δΕ^ ГО N0: 56), ΗС^К1, содержащий аминокислотную последовательность ΟΥΤΡΤΌΥΥΜΗ (δΕ^ ΙΌ N0: 65), ΗС^К2, содержащий аминокислотную последовательность КVNΡNККΟΤΤΥN^ΚΡΕΟ (δΕ^ ГО N0: 68), и ЖОГО, содержащий аминокислотную последовательность ΑΗνΕΌΥ (δΕ^ ΙΌ N0: 69).

2. Моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент по п.1, которое связывается с эпитопом в пределах α-цепи с^е! человека.

3. Моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп.1, 2, отличающееся тем, что указанное моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается в пределах аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

a) 121VV^ΤΥΥ^^^^1зο (δΕ^ ГО N0: 77),

b) 131IδСΟδVNКΟΤС^КΗVΡΡΗNΗΤΑ^I^δ156 (δΕ^ ГО N0: 78),

c) 1₇₉Α^ΟΑΚV^δδVΚ^КΡINр1₉5 (δΕ^ ГО N0: 79) и ά) ₂1₆VКК^ΚΕΤΚ^ΟΡΜ₂₂₇ (δΕ^ ГО N0: 80).

4. Моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что указанное антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается в пределах аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

a) 1₂3ΒΤΥΥΒΒ1₂8 (δΕ^ ГО N0: 81),

b) 144ΗVΡΡΗNΗΤΑ^I^δ156 (δΕ^ ГО N0: 82),

c) ^ΡΙΜΡ^ ίδΗΟ ГО N0: 83) и

ά) ₂₂0ΚΕΤΚΌΟΡΜ₂₂₇ ίδΗΟ ГО N0: 84).

5. Моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается с аминокислотной последовательностью в пределах конформационного эпитопа, характеризующегося последовательностями

- 86 020398 _;1)ТУУ1)1)₈ (ЪЕО ΙΌ N0: 81), ₁₄₄НУРРНМНТАПад₅₆ (8Ер ГО N0: 82), ₁₉₂РПХР₁₉₅ (8Ер ГО N0: 83) и ₂₂₀КЕТКЭСРМ₂₂₇ (ЪЕО ГО N0: 84) включительно.

6. Моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп.1-5, где указанное антитело включает вариабельную область легкой цепи (ЬСУК) и вариабельную область тяжелой цепи (НСУК), причем ЬСГОК содержит аминокислотную последовательность δΕ^ ГО N0: 5, а НСУК содержит аминокислотную последовательность δΕ^ ГО N0: 17.

7. Моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где указанное антитело включает легкую цепь с аминокислотной последовательностью δΕ^ ГО N0: 29 и тяжелую цепь с константной областью тяжелой цепи 1дС4.

8. Моноклональное антитело по любому из пп.1-7, включающее две легких цепи, которые имеют аминокислотную последовательность δΕ^ ГО N0: 29, и две тяжелых цепи с константной областью тяжелой цепи 1дС4.

9. Фармацевтическая композиция для лечения рака у человека, содержащая эффективное количество моноклонального антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.1-8, 14 или 15 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.

10. Применение моноклонального антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.1-8, 14 или 15 для лечения рака у человека.

11. Применение моноклонального антитела или его антиген-связывающего фрагмента по п.10, где указанный рак представляет собой рак желудочно-кишечного тракта, толстой кишки, ободочной и прямой кишки, рак предстательной железы или рак легких.

12. Применение моноклонального антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.1-8, 14 или 15 для получения лекарственного средства для лечения рака у человека.

13. Применение моноклонального антитела или его антиген-связывающего фрагмента по любому из пп.1-8, 14 или 15 для получения лекарственного средства для лечения рака у человека, при этом указанный рак представляет собой рак желудочно-кишечного тракта, толстой кишки, ободочной и прямой кишки, рак предстательной железы или рак легких.

14. Моноклональное антитело или его антиген-связывающий фрагмент по любому из пп.1-7, где аминокислотная последовательность указанной легкой цепи кодируется последовательностью δΕ^ ГО N0: 35, а аминокислотная последовательность указанной тяжелой цепи кодируется последовательностью δΙΥ) ГО N0: 47.

15. Моноклональное антитело по любому из пп.1-7, где антитело содержит две легких цепи и две тяжелых цепи и где аминокислотная последовательность указанных легких цепей кодируется последовательностью δΕ^ ГО N0: 35, а аминокислотная последовательность указанных тяжелых цепей кодируется последовательностью δΕ^ ГО N0: 47.