KR20050007359A - 종양 치료를 위한 면역접합체 - Google Patents

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몰메드 에스피에이
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Abstract

시토킨과 종양 표적 잔기(TTM)의 접합체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는데, 여기서 시토킨은 네거티브 피드백 메카니즘을 유발하지 않는 양으로 존재하는 약제학적 조성물.

Description

종양 치료를 위한 면역접합체{IMMUNOCONJUGATES FOR THE TREATMENT OF TUMOURS}
일부 시토킨의 항종양 활성이 공지되어 있으며 본원에서 개시되어 있다. 일부 시토킨은 이미 사람을 치료하는데 사용되어 왔다. 예를 들자면 IL-2 및 IFN-γ와 같은 시토킨은 예컨대 신장 전이성 암종, 낫세포 백혈병, 카포지 종양, 흑색종, 다발성 골수종 등과 같은 상이한 유형의 종양 환자에게서 양성의 항종양 활성을 나타냈다. 다른 시토킨, 예를 들면 IFNβ, 종양 괴사 인자 (TNF)α, TNFβ, IL-1, 4, 6, 12, 15 및 콜로니 자극 인자 (CFS)들은 일부 유형의 종양에 대해 특정 항종양 활성을 나타냈다.
일반적으로, 시토킨을 치료용으로 사용하는 것은 이들의 전신 독성으로 인해 매우 제한된다. 예를 들면, TNF는 특정 종양의 출혈성 괴사를 유도하는 이의 능력, 및 상이한 종양 라인에 대한 시험관내 세포독성 효과에 대해 원래 발견되었지만 그 후로, 강한 전염증(pro-inflammatory) 활성을 갖는 것으로 밝혀졌는데, 이는 과생산 조건의 경우 인체에 유해한 영향을 미칠 수 있다.
전신 독성이 사람에서 약리학적 활성량의 시토킨을 사용하는데 근본적인 문제가 있기 때문에, 신규 유도체 및 치료 전략이, 이들의 치료 효능을 유지하면서 이러한 부류의 생물학적 효능들의 독성 효과를 감소시키는 것을 목적으로 현재 평가되고 있다.
특정한 신규의 방법은 다음에 관한 것이다:
(a) TNF를 종양에 전달하여 국소 농도를 증가시킬 수 있는 융합 단백질의 개발. (예를 들면, TNF와 종양 특이적 항체로 구성된 융합 단백질의 생성);
(b) 항종양 활성을 유지하고 전신 독성을 감소시키는 TNF 돌연변이체의 개발. (따라서 단지 하나의 수용체를 선택적으로 인식할 수 있는 돌연변이체를 미리 제조);
(c) 항종양 활성을 손상시키지 않고 TNF의 특정 독성 효과를 감소시킬 수 있는 항-TNF 항체의 사용. (이러한 항체는 이미 문헌에 기재되어 있음);
(d) 반감기가 긴 TNF 유도체의 사용 (예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과 접합된 TNF).
종양 부위를 선택적으로 표적할 수 있는 TNF 유도체의 제조가 최근에 보고되어 있다. 예를 들면, 항트랜스페린 수용체 mAb의 중쇄 유전자와 TNF 유전자를 융합하여 수득한 융합 단백질, 종양 관련 TAG72 항원에 대한 모노클로날 항체의 "힌지" 영역을 갖는 TNF의 융합 단백질 또는 Fv-TNF 융합 단백질이 기재되어 있다.
EP 251 494는 아비딘 또는 스트렙타비딘과 접합된 항체, 접합된 항체 및 비오틴과 접합된 진단제 또는 치료제로 구성된 화합물을 복합체화할 수 있는 제제를 포함하는 진단제 또는 치료제를 순차적으로 투여하여 적합하게 지연시켜, 치료제 또는 진단제가 항체에 의해 인식된 표적 세포에 대한 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 국소화될 수 있도록 하는 시스템을 기술하고 있다. 기술된 치료제 또는진단제를 금속 킬레이트, 특히 방사선핵종 및 저분자량 항종양제의 킬레이트, 예를 들면 시스-플라티넘, 독소루비신 등을 포함한다.
EP 496 074는 비오티닐화된 항체, 아비딘 또는 스트렙타비딘 및 비오티닐화된 진단제 또는 치료제를 순자적으로 투여하는 방법을 기술한다. 리신과 같은 세포독성제가 일반적으로 언급되지만, 방사선 표지된 화합물에 대한 적용이 주로 기술된다.
WO 95/15979는 리간드 또는 항-리간드와 접합된 특이적 표적 분자를 포함하는 제 1 접합체의 투여, 이어서 항-리간드 또는 리간드에 결합된 독성제로 구성된 제 2 접합체의 투여를 기본으로 하여, 세포상 표적에 대하여 독성제를 고도로 국소화시키는 방법을 기술한다.
WO 99/13329는 분자를 NGR 수용체의 리간드와 접합시키는 것을 기본으로 하여, 종양 혈관형성관에 분자를 표적화하는 방법을 기술한다. 다수의 분자들이 후보로서 가능한 것으로 제안되었지만 단지 독소루비신이 구체적으로 기술되어 있다. 면역반응을 유도하기 위한 시토킨 비이클로서 NGR 수용체의 리간드의 사용은 전혀 기술되어 있지 않다.
WO 01/61017에서 본 발명자는, 놀랍게도 특정 시토킨의 치료 지수가 현저하게 개선되었으며 이들의 면역치료학적 특성이 아미노펩티타제-N 수용체(CD13)의 리간드의 커플링에 의해 증가될 수 있음을 발견하였다고 기술한다. CD13은 여러 가지 종에 많이 분포되어 있는 150kDa의 트랜스멤브레인당단백질이다. 이는 정상 세포 뿐만 아니라 골수종양 라인, 혈관형성 내피 및 특정의 상피에서 발현된다.CD13 수용체는 이의 펩티드 리간드가 아미노산 "NGR" 모티프를 공유한다는 점에서 통상 "NGR" 수용체로서 동정된다.
그러나, 암 치료 및 진단을 위한 더욱 개선된 약제학적 조성물 및 방법이 여전히 필요하다.
발명의 요약
종양 세포에 약물 전달 및 침투는 종양 화학요법의 효과에 중요하다. 본 발명자들은 피코그램 용량의 시토킨의 놀라울 정도로 표적된 전달이 화학요법상 약물의 침투를 증가시킴을 밝혀내었다. 더 상세하게는, 본 발명자들은 매우 저용량의 시토킨을 종양 및 종양 혈관계를 포함한 종양 관련 환경에 전달하는 것은 네거티브 피드백 메카니즘을 피하고 이의 능력을 보존하여 약물 침투 장벽을 변경하는 새로운 방법이라는 사실을 밝혀내었다. 따라서 본 발명은 화학용법상 약물의 치료 지수를 증가시키는 신규하고도 놀라운 방법을 제시한다. 바람직한 예에서, 본 발명자들은 TNF를 CNGRC, 종양 신생혈관을 표적하는 펩티드와 결합시킴으로써 혈관 표적을 사용하면 이러한 치료가 독성을 증가시킨다는 증거가 전혀 없이, 독소루비신의 치료 효능을 8-10 배 증가시킨다는 것을 밝혀내었다. 유사하게, 혈관 표적은 상이한 화학요법상 약물인 멜팔란의 효능을 증가시킨다. 화학요법의 상승작용은 3-5 ng/kg의 표적된 TNF(복강내)로 관찰되는데, 이는 LD50보다 106배 낮고 비표적된 TNF용으로 필요한 용량 보다 105배 낮은 양이었다. 또한, 본 발명자들은 저용량의 TNF를 종양 혈관으로 표적 전달하는 것은 순환에서의 가용성 TNF 수용체의 방출을유도하지 않는다는 것을 밝혀내었다. 본 발명자들은 또한 RGD-TNF 및 IFNγ-NGR이 피코그램 범위에서 활성이 있음을 밝혀내었다. 본 발명자들은 또한 NGR-TNF가 시스플라티넘의 효과를 증가시킴을 나타내었다. 이들 결과는 종양 혈관에 최소량의 시토킨을 전달하여 네거티브 피드백 메카니즘을 피하고 이의 능력을 보존하여 약물 침투 장벽을 변경하는 새로운 방법을 나타냄을 의미하는 것이다. 이러한 방식으로의 혈관 표적은 화학요법상 약물의 치료지수를 증가시키는 새로운 전략을 나타내는 것이다.
본 발명의 한 측면에 따르면 시토킨과 종양 표적 잔기(TTM)의 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 여기서 시토킨은 네거티브 피드백 메카니즘을 유발하지 않는 양으로 존재하는 약제학적 조성물을 제공한다. 따라서, 시토킨은 가용성 시토킨 수용체 유출을 유도하지 않는 양으로 존재한다.
바람직하게는, 본 발명의 접합체는 0.5 내지 500 ng/kg, 더 바람직하게는 1 내지 50 ng/kg, 가장 바람직하게는 5 내지 15 ng/kg의 범위의 용량을 제공하는 양으로 존재한다.
한 실시예에서, 시토킨은 염증성 시토킨이다.
다른 실시예에서, 시토킨은 화학요법상 시토킨이다.
바람직하게는, 시토킨은 TNF, 예를 들어 TNFα, TNFβ, IFNα, IFNβ, IFNγ,IL-1, 2, 4, 6, 12, 15, EMAP II, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), PDGF, PD-ECGF또는 케모킨으로부터 선택된다.
더 바람직한 실시예에서, 시토킨은 TNF-α, TNF-β 또는 IFN-γ, 가장 바람직하게는 TNF-α 또는 TNF-β이다.
한 실시예에서, TTM은 수용체, 마커 또는 기타 세포외 성분과 같은 종양 세포 표면 분자의 리간드 또는 이에 대한 항체와 같은 결합 파트너이다.
다른 실시예에서, TTM은 종양 혈관 표적 잔기(TVTM)이고 수용체, 마커 또는 기타 세포외 성분과 같은 종양 세포 표면 분자의 리간드 또는 이에 대한 항체와 같은 결합 파트너일 수 있다.
한 실시예에서, TTM은 항체 또는 이의 단편이다.
다른 실시예에서, TTM은 리간드 또는 이의 단편이다.
바람직한 실시예에서, TTM은 NGR 또는 RGD 모티프 함유 펩티드이거나, HIV-tat, 아넥신 V, 오스테오폰틴, 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I 또는 IV, 히알루로네이트 또는 에프린이거나, 종양태아 피브로넥틴의 결합 파트너, 예를 들어 항체이거나; 전술한 것들의 단편이다. 더 바람직한 실시예에서, TTM는 NGR 모티프를 함유한다. 가장 바람직한 실시예에서, TTM은 CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, 사이클로CVLNGRMEC, 선형 또는 사이클릭 CNGRC이다.
다른 바람직한 실시예에서, TTM은 RGD 모티프 함유 펩티드이다.
하나의 실시예에서, TTM은 VEGFR, ICAM 1, 2 또는 3, PECAM-1, CD13, VCAM-1, 셀렉틴, Act RII, ActRIIB, ActRI, ActRIB, CD44, 아미노펩티다제 A, 아미노펩티다제 N(CD13), αvβ3 인테그린, αvβ5 인테그린, FGF-1, 2, 3, 또는 4, IL-1R,EPHR, MMP, NG2, 테나신, 종양태아 피브로넥틴, PD-ECGFR, TNFR, PDGFR 또는 PSMA에 표적된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 바람직한 표적 잔기 및 시토킨의 조합을 하기 표에 나타내었다.
상기 표에서, 용어 "Ab"는 항체를 나타내고, 항체 및 리간드는 이의 단편을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
특히 바람직한 실시예에서, 접합체는 TNF-α 또는 TNF-β 및 NGR 함유 펩티드, 또는 TNF-α 또는 TNF-β 및 RGD 함유 펩티드를 포함한다.
바람직한 다른 실시예에서, 접합체는 융합 단백질 형태이다.
바람직한 다른 실시예에서, 접합체는 핵산 형태이다.
다른 양태에서, 조성물은 추가로 다른 항종양제 또는 진단적 종양 영상 화합물을 포함한다. 바람직하게는 추가의 종양제는 독소루비신, 멜팔란 또는 시스플라틴이다.
본 발명의 다른 측면에 따라서 암 치료 또는 진단용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따르는 접합체 또는 약제학적 조성물의 용도가 제공된다.
환원하면 본 발명은 네거티브 피드백 메카니즘을 유발하지 않는 유효량의 본 발명에 따르는 접합체 또는 약제학적 조성물을 암 치료 또는 진단이 필요한 환자에게 투여함을 포함하는 암의 치료 또는 진단 방법을 제공한다.
발명의 특정한 중요한 이점
고형 종양의 암세포에 도달하기 위해서, 화학요법상 약물은 종양 혈관에 들어가서 혈관벽을 통과하여 최종적으로는 간질을 통해 이동해야 한다. 이종 종양 관류, 혈관 투과성 및 세포 밀도, 및 증가된 간질압은 종양 혈관으로부터 떨어져 있는 종양 세포내로의 약물의 투입 및 결과적으로는 화학요법의 효과를 제한할 수 있는 중요한 장벽을 의미할 수 있을 것이다(1). 따라서 종양내로 약물 침투를 개선시키는 것을 목적으로 하는 전략은 실험 및 임상면에서 상당한 관심분야이다.
구체적인 증거는 종양괴사인자-α(TNF) 및 강력한 항-종양 활성이 부여된 염증성 시토킨이 이러한 목적으로 이용될 수 있음을 암시한다. 예를 들면, 멜팔란 또는 독소루비신으로 국소 단리된 사지 관류에 TNF를 가하면 사지 연조직 육종 또는 흑색종이 있는 환자에서 화학요법상 약물 단독 사용으로 수득된 경우보다 반응 속도를 높여준다(2-6). 내피 장벽 작용의 TNF-유도된 변경, 종양 간질압의 감소, 화학요법상 약물의 증가된 침투 및 종양 혈관 손상은 TNF와 화학요법 사이의 상승작용의 중요한 메카니즘으로 여겨진다(3, 4, 7-10). 불행히도, TNF의 전신투여는 엄청난 독성이 수반되므로, 최대 허용량(8-10㎍/kg)이 평가된 유효량보다 10-50배 낮다(11,12). 이러한 이유로, TNF의 전신 투여는 포기되었으며 이러한 시토킨의 임상 사용은 국소 치료에 국한된다. 그럼에도 불구하고, TNF 활성의 몇몇 특성, 특히 종양 관련 혈관의 선택성 및 화학요법상 약물과의 상승작용은 더 넓은 치료 분야의 적용의 가능성에 대한 희망을 계속적으로 촉구한다(13).
TNF의 혈관 효과는 국소 효능을 증가시키고 치료 용량의 전신 투여를 가능케하는 것을 목적으로 하는 "혈관 표적" 전략을 개발하는 합리성을 제공한다. 본 발명자들은 최근에 TNF의 종양 혈관으로의 표적 전달은, 당해 단백질을 종양 신생혈관을 표적하는, CNGRC 펩티드, 아미노펩티다제 N(CD13) 리간드와 커플링시킴으로써 달성될 수 있음을 밝혀내었다(14). 당해 작업에서, 본 발명자들은 NGR-TNF로 칭해지는 이러한 접합체의 저용량을 사용한 혈관 표적화가 종양에서 화학요법상 약물의 침투를 증가시키고 이들의 효능을 개선시킬 수 있는지의 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 LD50보다 6등급 낮은 용량인 피코그램 용량의 NGR-TNF (3-5 ng/kg)를 마우스에게 전신 투여하는 것이 독성이 증가된다는 증거 전혀 없이 멜팔란 및 독소루비신의 항종양 활성을 증가시키기에 충분함을 입증하였다. 또한, 본 발명자들은 NGR-TNF에 의한 혈관 표적화가 약물투과 장벽을 감소시키고 암세포에 도달하는 독소루비신의 양을 증가시킨다는 증거를 제시하고 있다. 결국, 본 발명자들은 종양 혈관에 최소량의 NGR-TNF를 전달함으로써 비교적 고용량의 TNF의 전신 투여와관련된 다른 주요 문제, 즉 가용성 TNF 억제제의 유발을 극복함을 나타내었다.
상세한 기술
본 발명의 여러 가지 바람직한 특질 및 실시예가 비제한적 예로써 이제 기술될 것이다.
일반적으로 본원에 기술된 방법은 당업계에 익히 공지된 기술이지만, 문헌을참조할 수 있는데, 특히 하기와 같다[참조: Sambrook etal., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) 및 Ausubel etal., Short Protocols in MolecularBiology (1999)4th Ed, John Wiley & Sons, Inc (뿐만 아니라 완결판 Current Protocols in Molecular Biology)].
네거티브 피드백 메카니즘
네거티브 피드백 메카니즘은 당업계에게 공지되어 있고, 전신 또는 국소 수준에서 가용성 수용체 유출 및 기타 시토킨, 호르몬 또는 생물학적 제제들의 유도로 이들이 본 발명의 표적된 시토킨의 활성에 직간접으로 손상을 주는 것을 포함할 수 있다. 가용성 억제제 또는 유인 수용체의 유도는 직접 억제제의 예이다. IL-10, TGF-β 또는 기타 항염증성 시토킨은 염증성 시토킨에 의해 유발된 캐스케이드 현상을 간접적으로 예방할 수 있다.
수용체 유출
이 용어는 시토킨 수용체의 세포외 도메인을 절단해서 이를 가용성 생성물로서 순환시키는 세포의 능력에 관한 것이다. 여러 경우에, 이들 절단 생성물은 여전히 이들의 리간드를 결합할 수 있다. 그러나, 대조적으로, 막 결합 수용체의 나머지 부분은 리간드를 더이상 결합하지 않기 때문에 세포는 특정 시토킨의 작용에 대해 감작성을 상실하게 된다. 이러한 가용성 수용체가 다양한 시토킨으로 기술되어 있는데 IL-4, 6, 6, IGF, TNF-α 및 IFN-γ를 포함한다.
접합체
본 발명은 유전자 융합 또는 화학적 커플링을 통해 형성된 하나 이상의 시토킨에 결합된 하나 이상의 표적화 단백질을 포함하는 분자인 접합체에 관한 것이다. "결합된"이라는 것은, 제 1 및 제 2 서열이 관련되어 제 2 서열이 표적 세포에 대한 제 1 서열에 의해 이송될 수 있음을 의미한다. 따라서 접합체는 융합 단백질을 포함하는데 여기서 이송 단백질이 당해 단백질을 암호화하는 DNA 분자의 유전자 발현을 통해 폴리펩티드 주쇄를 통해 시토킨에 결합되고, 단백질을 직접 합성하여 단백질을 커플링하는데, 여기서 미리 형성된 서열은 가교 결합제에 의해 연합된다. 당해 용어는 또한 본원에서 연합, 예를 들어 표적 단백질과 시토킨의 응집을 포함한다. 하나의 실시예에 따라서, 제 2 서열은 폴리누클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 당해 실시예는 단백질/핵산 복합체로서 보여질 수 있다.
제 2 서열은 제 1 서열과 동일 종으로부터 온 것일 수 있지만, 본 발명의 접합체에서는 자연 상태와는 상이한 방식으로 존재하거나, 상이한 종으로부터 온 것이다.
본 발명의 접합체는 세포에 대해 유도될 수 있어서 이송 서열에 커플링된 폴리펩티드 서열에 상응하는 효능제 작용이 일어날 수 있다.
당해 펩티드를 시토킨에 직접 커플링하거나 스페이서를 통해 간접적으로 커플링할 수 있는데, 이는 단일 아미노산 단일 아미노산 서열 또는 유기 잔기, 예를 들어 6-아미노카프릴-N-하이드록시숙신이미드일 수 있다.
펩티드 리간드는 바람직하게는 시토킨 N-말단에 결합하여, 개질된 시토킨이 이의 수용체에 결합하는데 어떠한 간섭도 최소화한다. 또는 펩티드는 아미노산 잔기에 결합하는데, 이는 아미도-또는 카복실산-결합된 허용체이고, 이는 분자에서 자연발생하거나 유전공학기술을 이용하여 인공적으로 삽입될 수 있다. 개질된 시토킨은 바람직하게는 펩티드를 암호화나는 5'-연속 서열을 포함하는 cDNA를 사용하여 제조된다.
바람직한 실시예에 따라서, TNF과 CNGRC 서열 사이의 접합 생성물이 제공되는데 여기서 TNF의 아미노 말단이 스페이서 G(글리신)를 통해 CNGRC 펩티드에 결합한다.
시토킨
종양 세포로의 약물 침투는 고형 종양 화학요법의 효과에는 중요한 문제이다. 고형 종양의 암세포에 도달하기 위해서, 화학요법상 약물은 종양 혈관에 들어가서 혈관벽을 통과하여 최종적으로는 간질을 통해 이동해야 한다. 이종 종양 관류, 혈관 투과성 및 세포 밀도 및 증가된 간질압은 종양 혈관으로부터 떨어져 있는 종양 세포내로의 약물의 투입 및 결과적으로는 화학요법의 효과를 제한할 수 있는 중요한 장벽을 의미할 수 있을 것이다. 따라서 이들 인자에 영향을 미치는 효과를 갖는 시토킨은 본 발명에서 유용하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 시토킨을 비제한적으로 다음과 같이 열거할 수 있다: TNFα, TNFβ, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-1, 2, 4, 6, 12, 15, EMAP II, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), PDGF, PD-ECGF 또는 케모킨.
TNF
TNF는 염증성 시토킨으로서 작용하여 내피 장벽 기능의 변경을 유도하고 종양 간질압을 감소시키고, 화학요법상 약물 침투 및 종양 혈관 손상을 증가시키는 효과를 갖는다.
암환자가 종종 세균 감염 이후에 그들의 종양의 자발적 퇴행을 나타냄이 관찰되었을 때 종양 괴사 분자가 존재한다는 제 1 제안이 이루어졌다. 1960대 후속 연구에서는 세균 생성물에 대한 반응으로 제조된 숙주-관련(또는 내인성) 조정자가 관찰된 효과와 유사하게 연관되어 있는 것으로 지적되었다. 1975년에는, 세균 유도된 순환 인자가 마우스 피부에 이식된 종양에 대하 강한 항-종양 활성을 갖는 것으로 나타났다. 종양 괴사 인자(TNF)로서 칭해지는 이러한 인자는 순차적으로 단리되고, 클로닝된 다음 면역 조절 및 염증과 관련된 분자 과(family)의 원형인 것으로 밝혀졌다. TNF에 대한 수용체 및 TNF 상과(superfamily)의 기타 구성원은 또한 관련 단백질의 상과를 구성한다.
TNF-관련 리간드는 통상 수많은 공통 특질을 공유한다. 이들 특질에는 높은 정도의 전반적인 아미노산(aa) 서열 상동성이 포함되지 않는다. 신경 성장 인자(NGF) 및 TNF-베타를 제외하고는, 모든 리간드가 짧은 세포질 분절(10-80 aa 잔기) 및 상대적으로 긴 세포외 영역(140-215 aa 잔기)을 포함하는 유형 II 트랜스멤브레인 단백질(세포외 C 말단)로 합성된다. 구조적으로 TNF와 관련이 없는 NGF는 TNFRSF 저친화성 NGF 수용체(LNGFR)로의 이의 결합능 때문에 단지 당해 상과에 포함된다. NGF는 전형적인 신호 서열 펩티드이고 분비된다. 이와 대조적으로, TNF-β는, 또한 완전히 분비되긴 하지만, 유형 II 트랜스멤브레인단백질과 훨씬 더 관련이 있는 1차 구조를 갖는다. TNF-β는 무작용성 또는 비효율성 트랜스멤브레인 분절을 갖는 유형 II 단백질로서 간주될 수 있었다. 일반적으로, TNFSF 막은 삼량체 구조를 형성하고, 이들의 단량체는 그 자체를 두개의 시트 구조로 배향되도록 하는 베타 스트랜드로 구성된다. 이들 분자의 삼량체 구조의 결과로서, TNSF 및TNFRSF 상과의 리간드 및 수용체는 신호 전달 도중 "클러스터링"을 겪게 된다.
TNF-α: 사람 TNF-α는 233개의 aa 잔기, 무당화(nonglycosylated) 폴리펩티드인데, 이는 트랜스멤브레인 또는 가용성 단백질 중 어느 하나로 존재한다. 26 kDa 트랜스멤브레인 결합 단백질로 발현된 경우, TNF-α는 29개의 aa 잔기 세포질 도메인, 28개의 aa 잔기 트랜스멤브레인 분절 및 176개의 aa 잔기 세포외 영역으로 구성된다. 가용성 단백질은 85 kDa TNF-알파 전환 효소 (TACE)를 통해 단백질분해 절단 현상에 의해 생성되는데, 이는 통상 동종삼량체로서 순환되는 17 kDa, 157개의 aa 잔기 분자를 생성시킨다.
TNF-β/LT-α: 림포톡신-α(LT-α)으로서 또한 공지되어 있는 TNF-β는 이의 클로닝이 TNF-α의 클로닝과 동시에 일어나는 분자이다. TNF-β가 171개의 aa 잔기, 25 kDa 당화 폴리펩티드로서 순환하지만, 더 큰 형태로서 194개의 aa 잔기가 발견되었다. 205개의 aa 잔기(202 마우스에서)의 개방 판독 프레임용 사람 TNF-β cDNA 코드, 및 가능하게는 특정한 유형의 단백질분해 과정이 분비도중 일어난다. TNF-α에서와 마찬가지로, TNF-β는 비공유적으로 결합된 삼량체로서 존재하고 TNF-α와 동일 수용체에 결합하는 것으로 공지되어 있다.
한 실시예에서, TNF는 TNF 수용체 중 하나에 선택적으로 결합할 수 있는 TNF의 돌연변이 형태이다[참조:(Loetscher H et al (1993) J BiolChem 268: 26350-7; Van Ostade X et al (1993) Nature 361: 266-9)]
많은 다른 염증성 시토킨은 또한 내피 혈관 투과성을 증가시키는 성질을 갖고, 본 발명이 이러한 시토킨에, 이러한 시토킨의 발현을 증가시키는 제제와 함께,적용할 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 또한 전염증성 시토킨으로서 공지된 염증성 시토킨은 다수의 폴리펩티드 및 당단백질인데 이의 분자량은 5kDa 내지 70 kDa이다. 이들은 염증 반응을 자극하는 효과가 있다. 가장 중요한 염증성 시토킨은 TNF, IL-1, IL-6 및 IL-8이다.
염증성 시토킨으로 분류되는 몇몇 시토킨을 하기 표에 기재하였다:
염증성 시토킨
TGF-β : 형질전환 성장 인자, LIF: 백혈병 억제 인자; OSM: 온코스태틴 M; CNTF: 섬모 향신경 인자; PF-4: 혈소판 인자 4; PBP: 혈소판 기본 단백질; NAP-2: 호중구 활성화 단백질 2; β-TG: β-트롬보글로불린; MIP: 대식세포 염증성 단백질; MCP: 단핵구 화학유인물질 단백질.
염증성 반응의 상향 조절은 또한 IL-11, IFN-α, IFN-β 및 특히 케모킨 상과의 구성원에 의해 수행된다. TGF-β는 어떤 경우에는 호중구, T 림프구 및 불활성화 단핵구에 대한 화학유인물질 효과를 포함하는 다수의 염증 활성을 갖는다.
IL-2
면역 및 염증성 반응에서의 IL-2/IL-2R 시스템의 중요한 역할 때문에, 이러한 시스템을 탐지하고 조작하는 것은 중요한 진단 및 치료학적 의미를 갖는다. IL-2는 LAK 및 TIL (종양 침윤 림프구) 세포의 증식 및 활성을 자극하는 이의 능력 때문에 항암제로서의 역할을 한다, 그러나 IL-2 독성의 문제는 여전히 조사해야 할 관심사 및 문제이다. 본 발명은 이 문제에 주안점을 두고 있다.
IL-15
인터루킨 15 (IL-15)는 IL-2와 다수의 생물학적 특성을 공유하나 IL-2에 대한 아미노산 서열 상동성이 결여된 신규한 시토킨이다. IL-15는 뮤린 T 세포주 CTLL-2에 대한 분열촉진 활성을 기본으로 한 원숭이 신장 상피 세포주(CVI/EBNA)에 의해 조절된 매질에서 원래 동정된 것이다. IL-15는 또한 T 세포 증식을 자극하여 IL-T로 지칭되는 사람 성인 T 세포 백혈병 세포주 (HuT- 102)에 의해 생성된 시토킨으로서 독립적으로 발견되었다. T 세포, NK 세포, LAK 세포 및 TIL의 자극제로서의 활성으로 인해, IL-2는 현재 암 및 바이러스 감염 치료에서 이의 사용 가능성에 관한 임상 시험중에 있다. 이의 유사한 생물학적 활성 때문에, IL-15는 유사한 치료 잠재력을 가질 수 있다.
케모킨
케모킨은 백혈구 트래픽킹(trafficking), 점증 및 재순환에 기능하는 대부분 소형의 분비 단백질의 상과이다. 이들은 알러지 반응, 감염성 및 자기면역 질환, 혈관신생, 염증, 종양 성장 및 조혈 발생과 같은 많은 병리생리학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 이들 단백질의 약 80%가 이들의 성숙 형태에서 66 내지 78개의아미노산 (aa)를 갖는다. 나머지 부분은 단백질 코어 또는 신장된 C 말단 분절의 일부로서 추가의 aa 발생 업스트림으로 인해 더 크다. 모든 케모킨은 7개의 트랜스멤브레인 도메인 G-단백질 커플링된 수용체를 통해 신호 전달한다. 17개 이상의 공지된 케모킨 수용체가 있으며 이들 수용체의 다수는 무차별 결합 특성을 나타내기 때문에 수개의 케모킨은 동일한 수용체를 통해 신호전달할 수 있다.
케모킨은 보존된 aa 서열 모티프를 기본으로 아과(subfamily)로 나누어진다. 대부분의 과 구성원은 4개 이상의 보존된 시스테인 잔기를 갖는데 이는 2개의 분자내 이황화물 결합을 형성한다. 아과는 제 1의 2개의 시스테인 잔기 위치에 의해 정해진다:
ㆍCXC 케모킨으로 또한 칭해지는 알파 아과는 하나의 aa 분리성 제 1 2개의 시스테인 잔기를 갖는다. 이 그룹은 제 1 시스테인 잔기에 바로 선행하는 glu-leu-arg (ELR) aa 모티프의 존재 또는 부재를 기본으로 추가로 다시 나누어질 수 있다. 현재 5개의 CXC-특이적 수용체가 있고 이들은 CXCR1 내지 CXCR5로 지칭된다. ELR+ 케모킨은 CXCR2에 결합되고 일반적으로 호중구 화학유인물질 및 활성화제로서 작용한다. ELR-케모킨이 CXCR3 내지 -5에 결합하고 주로 림파구에서 작용한다. 당해 기술 당시, CXC를 암호화하는 14개의 상이한 사람 유전자가 과학문헌에 보고되어 있고, 몇몇의 추가의 다양성이 대체 스플라이싱에 의해 가능하다.
ㆍCC 케모킨으로 또한 칭해지는 베타 아과에서, 제 1 2개의 시스테인은 개입되는 aa가 없는 다른 하나와 인접한다. 이들은 현재 24개의 구분되는 사람 베타 아과 구성원이다. 당해 그룹용 수용체는 CCR1 내지 CCRll로 칭해진다. 상이한 CC과 구성원에 대한 표적 세포는 대부분의 유형의 백혈구를 포함한다.
ㆍ알파 및 베타 아과에는 속하지 않으면서 케모킨 상동성이 있는 2개의 공지된 단백질이 있다. 림포택틴은 감마 부류의 유일한 구성원(C 케모킨)으로 제 1 및 제 3 시스테인이 결실된 것이다. 림포택틴 수용체는 XCR1로서 칭해진다. 델타 부류의 유일하게 공지된 구성원인 프랙탈킨(CX3C 케모킨)은 제 1 2개의 시스테인 잔기사이에서 3개의 간섭 aa를 갖는다. 이 분자는, 긴 뮤신-유사 줄기에 융합된 N-말단 케모킨을 갖는 트랜스멤브레인 단백질이라는 점에서, 케모킨 중에서 독특하다. 프랙탈킨 수용체는 CX3CR1로서 공지되어 있다.
VEGF
본 발명은 혈관 내피 성장인자(VEGF)에 또한 적용가능하다. 혈관신생은 미리 존재하는 혈관구조로부터 새로운 혈관 개발의 과정이다. 이는 배아 발생, 조직의 정상 성장, 상처 치유, 암컷의 생식 주기(즉, 배란, 월경 및 태반 발생)에서 본질적인 역할을 할 뿐만 아니라 많은 질병에서도 중요한 역할을 한다. 종양은 새로운 혈액의 공급을 일으키지 않고는 수밀리미터 크기 이상으로 성장할 수 없기 때문에, 암에 특히 관심이 집중된다. 혈관신생은 또한 종양 세포 전이에서 필수적인 역할을 한다.
내피에 가장 중요한 성장 및 생존 인자중의 하나가 VEGF이다. VEGF는 혈관신생 및 내피 세포 증식을 유도하며 혈관형성을 조절하는데 중요한 역할을 한다. VEGF는 동종이량체 45 kDa로서 분비되는 헤파린-결합 당단백질이다. 통상은 그 자체가 내피 세포가 아닌 대부분의 유형의 세포가 VEGF를 분비한다. 초기 발견된 VEGF, VEGF-A는 혈관 투과성을 증가시키기 때문에, 혈관 투과성 인자로 공지되었다. 또한, VEGF는 부분적으로는 내피 세포의 산화질소 합성효소의 자극을 통해 혈관확장을 유발한다. VEGF는 또한 세포 이동을 자극하고 아폽토시스를 억제한다. VEGF-A의 수개의 스플라이스 변이체가 있다. 주요한 것들은 121, 165, 189 및 206개의 아미노산 (aa)을 포함하고, 각각은 특이적 엑손 부가를 포함한다.
EMAP II
내피-단핵구 활성화 폴리펩티드-II(EMAP-II)는 종양 혈관 생성에서 항혈관생성 인자인 시토킨이고, 종양 성장을 강하게 억제한다. 재조합 사람 EMAP-II는 166개의 아미노산 잔기를 함유하는 18.3 kDa 단백질이다. EMAP-II는 또한 내피 혈관 침투성을 증가하는 것으로 밝혀졌다.
PDGF
혈소판 유도 성장 인자 (PDGF) 길항제는 통상의 고형 종양에 넓은 범위의 항-종양제의 치료 효과 및 약물 흡수를 증가시킬 수 있는 것으로 또한 제안된다. PDGF는 30kDA의 시토킨이고 상처시 혈소판으로부터 방출되어 인접 세포의 성장을 를 자극하여 상처를 회복시킨다.
PD-ECGF
이의 명칭이 암시하는 바와 같이, 혈소판 유도된 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF)은 내피 세포에서 유사분열을 유도하는 이의 능력을 기본으로 하여 혈소판으로부터 원래 분리되었다. 이와 관련되는 단백질은 글리오스태틴이다.
표적 잔기
본 발명자들은 시토킨의 치료 지수가, 시토킨을 종양 혈관에 표적화하는 귀환에 의해 증가될 수 있음을 밝혀내었다. 또한, 종양 세포가 종양 혈관구조의 라이닝 부분을 형성할 수 있는 것으로 공지되어 있기 때문에 본 발명은 종양 혈관으로 뿐만 아니라 종양 세포를 직접 표적화하는 것을 포함한다. 어떠한 편리한 종양 또는 종양 혈관구조, 특히 내피 세포, 표적 잔기도 본 발명의 접합체에서 사용될 수 있다. 다수의 이러한 표적 잔기는 공지되어 있으며 이들 및 후속적으로 사용가능한 어떠한 것도 본 발명의 범주에 포함된다. 하나의 실시예에서, 표적 잔기는 결합 파트너, 예를 들어, 종양 세포에 의해 발현되는 수용체의, 리간드이거나 결합 파트너, 예를 들어, 종양 세포와 관련되는 세포외 매트릭스의 성분 또는 마커에 대한 항체이다. 더 특히 표적 잔기는 결합 파트너, 예를 들어, 종양 관련 혈관에 의해 발현되는 수용체의, 리간드이거나 결합 파트너, 예를 들어, 혈관형성관과 관련되는 세포외 매트릭스의 성분 또는 내피 마커에 대한 항체이다. 용어 결합 파트너는 본원에서는 그의 가장 광범위한 의미로 사용되며 리간드 및 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하여 천연 및 합성 결합 도메인 둘 다를 포함한다. 따라서 언급한 결합 파트너는 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 Fab, Fv, 단일 사슬 Fv, 펩티드 또는 펩티도 유사체, 즉 수용체에 결합할 수 있는 펩티도 유사 분자, 세포의 세포외 성분의 마커일 수 있다.
다음은 접합체로 표적화될 수 있는 적합한 표적 도메인 및 수용체/마커를 비제한적으로 예시한 것이다:
CD13
특정 시토킨의 치료 지수가 현저히 개선될 수 있고 이들의 면역요법 특성이 아미노펩티다제-N 수용체(CD13)의 리간드와 결합함으로써 개선될 수 있는 것으로 놀랍게도 밝혀졌다. CD13은 다양한 종에서 고도로 보존되는 150 kDa의 트랜스멤브레인 당단백질이다. 이는 정상세포상에서 뿐만 아니라 골수종양 라인, 혈관형성 내피 및 특정의 상피에서 발현된다. CD13 수용체는 이의 펩티드 리간드가 아미노산 "NGR" 모티프를 공유한다는 점에서 통상 "NGR" 수용체로서 동정된다. 리간드는 바람직하게는 NGR 모티프를 포함하는 직쇄 또는 사이클릭 펩티드, 예를 들면 CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, 사이클로CVLNGRMEC 또는 사이클로CNGRC, 더욱 바람직하게는 펩티드 CNGRC이다. 보다 상세한 사항은 본원에 참조 문헌으로 인용한 본 출원인의 WO01/61017에서 발견할 수 있다.
TNF 수용체
TNF 상과의 구성원에서와 마찬가지로, TNF 수용체 상과(TNFRSF)의 구성원은 또한 다수의 공통되는 특징을 공유한다. 특히 TNFRSF의 분자는 모두, 1 내지 6개의 리간드-결합성 40 aa 잔기 시스테인 풍부 모티프를 이들의 세포외 도메인에 함유하는 유형 I (N-말단 세포외) 트랜스멤브레인 당단백질이다. 또한, 작용성 TNFRSF 구성원은 통상 시스테인내 이황화물 결합에 의해 안정화된 삼량체 또는 다량체 복합체이다. 대부분의 TNFSF의 구성원과 달리, TNFRSF 구성원은 막 결합성 및 가용성 형태 둘 모두로 존재한다. 최종적으로, 상과 구성원의 세포질 도메인에서 aa 서열 상동성이 25%를 초과하지 않을지라도, 다수의 수용체는 다양한 세포에서 아폽토시스 신호를 전달할 수 있는데, 이는 통상의 기능을 암시하는 것이다.
CD40: CD40은 가장 흔히 B 세포 증식 및 분화와 관련되는 50 kDa의 277 aa 잔기 트랜스멤브레인 당단백질이다. 여러 가지 세포 유형에서 발현되는 경우, 사람 CD40 cDNA는 20 aa 잔기 신호 서열, 173 aa 잔기 세포외 영역, 22 aa 잔기 트랜스멤브레인 분절, 및 62 aa 잔기 세포질 도메인을 암호화한다. 세포외 영역에 세린 및 트레오닌이 풍부한 근접막 서열이 수반되는 4개의 시스테인 풍부 모티프가 있다. CD40을 발현하는 것으로 공지된 세포는 내피 세포이다.
TNFRI/p55/CD120a: TNFRI은 실질적으로 모든 유핵 포유동물 세포에 의해 명백히 발현되는 55 kDa의 455 aa 잔기 트랜스멤브레인 당단백질이다. 상기 분자는 190 aa 잔기 세포외 영역, 25 aa 잔기 트랜스멤브레인 분절, 및 220 aa 잔기 세포질 도메인을 갖는다. TNF-α와 TNF-β는 둘 모두 TNFRI에 결합한다. TNFRI를 발현하는 것으로 공지된 다수의 세포중에 내피세포가 있다.
TNFRII/p75/CD120b: 사람 TNFRII는 사람 폐 섬유모세포 라이브러리로부터 최초로 분리된 75 kDa의 461 aa 잔기 트랜스멤브레인 단백질이다. 이러한 수용체는 240 aa 잔기 세포외 영역, 27 aa 잔기 트랜스멤브레인 분절 및 173 aa 잔기 세포질 도메인으로 구성된다. 가용성 형태의 TNFRII가 동정되었으며, 이는 TRRE (TNF-수용체 방출 효소)로 일컬어지는 메탈로프로테이나제에 의한 단백분해 절단으로부터 명백히 생성된다. 유출 과정은 가용성 TNFRI에 대한 과정과 독립적인 것으로 보인다. TNFRII를 발현하는 것으로 공지된 다수의 세포중에 내피 세포가 있다.
CD134L/OX40L: OX40L의 수용체인 OX40는 염증 부위에서 CD4+ T 세포의 생존을 촉진(아마도 면역 반응을 연장시킴)하는 것으로 보이는 제한된 발현을 갖는 T 세포 활성화 마커이다. OX40L은 또한 제한된 발현을 나타낸다. 현재 단지 활성화된 CD4+, CD8+T세포, B세포 및 혈관 내피 세포가 이러한 인자를 발현하는 것으로 보고되었다. 사람 리간드는 21 aa 잔기 세포질 도메인, 23 aa 잔기 트랜스멤브레인 분절, 및 139 aa 잔기 세포외 영역으로 이루어진 32 kDa의 183 aa 잔기의 당화된 폴리펩티드이다.
VEGF 수용체 과(family)
VEGF 수용체 과에는 3종의 수용체가 있다. 이들은 다수의 IgG-유사 세포외 도메인 및 티로신 키나제 활성의 공통 특성을 갖는다. VEGF 수용체 1 (VEGF Rl, Flt-1로서 또한 공지됨), VEGF R2 (KDR 또는 Flk-1로서 공지됨), 및 VEGF R3 (Flt-4로서 또한 공지됨)의 효소 도메인은 삽입된 서열에 의해 나뉘어진다. 내피 세포는 또한 추가의 VEGF 수용체, 뉴로필린(Neuropilin)-1 및 뉴로필린-2를 발현한다. VEGF-A는 VEGF Rl 및 VEGF R2에 결합하고, 뉴로필린-1 및 뉴로필린-2에 결합한다. P1GF 및 VEGF-B는 VEGF Rl 및 뉴로필린-1과 결합한다. VEGF-C 및 -D는 VEGF R3 및 VEGF R2와 결합한다. HIV-tat 및 이로부터 유도된 펩티드는 또한 VEGFR을 표적화하는 것으로 밝혀졌다.
PDGF 수용체
PDGF 수용체는 가장 흔한 고형 종양의 기질 부위에서 발현된다. 래트 결장 암종 모델에서 기질 발현된 PDGF 수용체의 억제는 종양 간질액압을 감소시키고 종양 모세관운반을 증가시킨다.
PSMA
전립선 특이적 막항원(PSMA)은 또한 탁월한 종양 내피 마커이고, PSMA 항체가 생성될 수 있다.
세포 부착 분자(CAM)
세포 부착 분자(CAM)는 세포, 통상적으로 백혈구가 서로 결합하거나, 내피 세포에 결합하거나, 세포외 기질에 결합하는 것에 관여하는 세포 표면 단백질이다. 상처 및 감염에 반응할 때 생성되는 특이적 신호는 이들 부착 분자의 몇몇의 발현과 활성화를 조절한다 이어서 이들 CAM이 이들의 수용체/리간드에 결합함으로써 개시된 상호작용 및 반응은, 이들 손상에 대한 신체 방어의 한 라인을 구성하는 염증 및 면역 반응의 매개에서 중요한 역할을 한다. 지금까지 특징화된 대부분의 CAM은 3개의 일반적인 단백질 과에 속한다: 면역글로불린(Ig) 상과, 인테그린 과 또는 셀렉틴 과.
세포 표면 분자의 셀렉틴 과의 구성원인 L-셀렉틴은 NH2-말단 렉틴 유형 C 도메인, EGF-유사 도메인, 2개의 보체 조절 도메인, 15 아미노산 잔기 스페이서, 트랜스멤브레인 서열 및 짧은 세포질 도메인으로 구성된다.
내피 세포상의 L- 셀렉틴에 대한 3개의 리간드가 동정되었는데 이들 모두는 O-당화 뮤신 또는 뮤신 유사 도메인을 함유한다. 첫번째 리간드인 GlyCAM-1은 거의 배타적으로, 말초 및 창자간막 림프절 상부 내피 세정맥에서 발현된다. 원래 sgp90으로 불리는 두 번째 L-셀렉틴 리간드는 현재 CD34로 밝혀졌다. 이러한 시알로뮤신 유사 당 단백질은 종종 다능성 줄기세포의 정제용 표면 마커로서 사용되는데, 광범위한 비림프 조직에서뿐만 아니라 말초 림프절의 모세관에서 혈관 발현을 나타낸다. 세 번째 L-셀렉틴 리간드는 점막 림프절 상부 내피 세정맥에서 발견된 뮤신 유사 당단백질인 MadCAM 1이다.
세포 표면 분자의 셀렉틴 과의 구성원인 P-셀렉틴은, NH2-말단 렉틴 유형 C 도메인, EGF-유사 도메인, 9개의 보체 조절 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 짧은 세포질 도메인으로 구성된다.
테트라사카라이드 시알릴 루익스(sLex)는 P- 및 E-셀렉틴 둘 모두에 대한 리간드로서 동정되어 있지만, P- E- 및 L-셀렉틴은 모두 적합한 조건하에서 sLex 및 sLea와 결합한다. P-셀렉틴은 또한 선택적으로 뮤린 골수 세포상에 존재하는 160kDa 당단백질 및 또한 E-셀렉틴과 결합할 수 있는 리간드인 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(PSGL-1)로 칭해지며, 골수세포, 혈액 호중구, 단핵구, 및 림프구에 존재하는 당단백질에 결합하는 것으로 여겨진다. 백혈구의 P-셀렉틴 매개된 역할은 PSLG-1에 대해 특이적인 모노클로날 항체에 의해 완전히 억제될 수 있는데, 이는 P-셀렉틴이 시험관내 조건에서 다양한 당단백질을 결합할 수 있더라도, 생리학적으로 중요한 결합은 더욱 제한되는 것으로 여겨짐을 암시한다. 여러 가지의 증거가 P-셀렉틴이 골수세포 뿐만 아니라 B 및 T 세포의 서브세트가 활성화된 내피에 부착하는 것에 관여함을 나타낸다.
Ig 상과(superfamily) CAM
Ig 상과 CAM은 칼슘 비의존성 트랜스멤브레인 당단백질이다. Ig 상과의 구성원은 세포간 부착 분자(ICAM), 혈관 세포 부착 분자(VCAM-1), 혈소판-내피세포 부착 분자(PECAM-1), 및 신경세포 부착 분자(NCAM)를 포함한다. 각각의 Ig 상과 CAM은 세포외 도메인을 갖는데, 이는 보존된 시스테인 잔기를 갖는 몇몇의 Ig-유사 세포내 이황화물-결합된 루프, 트랜스멤브레인 도메인, 및 세포골격과 상호작용하는 세포내 도메인을 함유한다. 전형적으로, 이들은 인테그린 또는 그 밖의 Ig 상과 CAM과 결합한다. 신경세포 CAM은 신경세포 패턴화에 관련된다. 내피 CAM은 면역 반응 및 염증에서 중요한 역할을 한다.
더 상세히, 혈관 세포 부착 분자 (VCAM-1, CD106, 또는 INCAM-110), 혈소판 내피세포 부착 분자 (PECAM-1/CD31) 및 세포간 부착 분자 1, 2 & 3 (ICAM-1,2 & 3)은 5가지의 기능적으로 관련된 CAM/IgSF 분자인데 이는 백혈구-결합 조직/내피 세포 상호작용에 중요하게 관여한다. 내피 세포상에서 주로 발현되는 경우, 이들 분자들은 일반적으로 혈관벽을 통한 백혈구 이동을 조절하고, 혈관형성 도중 내피를 발생시키기 위한 부착 지점을 제공하며, 이들 모두는 본 발명에서 표적화하기에 모두 적합하다.
사람 CD31은 세포 부착 분자(CAM) 또는 IgSFl의 C2-유사 아그룹에 속하는 130 kDa의 유형 I (세포외 N-말단) 트랜스멤브레인 당단백질이다. 성숙 분자는 길이가 711 아미노산(aa) 잔기이고, 574 aa 잔기 세포외 영역, 19 aa 잔기 트랜스멤브레인 분절, 및 118 aa 잔기 세포질 테일을 함유한다. 세포외 영역에서 9개의 잠재성 N-결합된 당화 부위가 있고, 예정된 분자량이 80 kDa이며, 이들 부위의 다수가 점유되어 있는 것으로 보인다. 세포외 영역의 가장 놀랄만한 특징은 IgSF의 C2도메인과 유사한 6개의 Ig-상동성 유닛의 존재이다. 이들이 수에서 변할지라도 이들 분자의 존재는 모든 IgSF 부착 분자(ICAM-1,2,3 & VCAM-1)의 공통되는 특징이다.
인테그린
인테그린은 α 및 β 서브유닛의 비공유결합된 이종이량체이다. 이제까지, 16α 서브유닛 및 8β 서브유닛이 동정되었다. 이들은 여러 가지 방법으로 조합되어 상이한 유형의 인테그린 수용체를 형성할 수 있다. 수개의 인테그린의 리간드는 부착성 세포외 기질(ECM) 단백질, 예를 들면, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐 및 라미닌이다. 많은 인테그린이 피브로넥틴 또는 이들이 결합하는 기타 부착성 단백질에 존재하는 아미노산 서열 RGD(아르기닌-글리신-아스파르트산)을 인식한다. RGD를 함유하는 펩티드 및 단백질 단편을 사용하여 RGD 인식 인테그린의 활성을 조절할 수 있다. 따라서 본 발명은 인테그린에 의해 인식된 펩티드를 표적 잔기로서 사용할 수 있다. 이들 펩티드는 통상 "RGD-함유 펩티드"로서 공지되어 있다. 이들 펩티드는 인테그린에 결합되는 것으로서 동정된 펩티드 모티프를 포함할 수 있다. 이들 모티프는 아미노산 서열 DGR, NGR 및 CRGDC를 포함한다. 펩티드 모티프는 선형 또는 사이클릭일 수 있다. 이러한 모티프는 본원에 RGD 펩티드와 관련해서 참조문헌으로 인용한 미국특허 제5,536,814호에 기술 되어 있는데 이는 폐환된 CRGDCL, CRGDCA 및 GACRGDCLGA를 기술하고 있다. 미국특허 제4,578,079호는 식 X-RGD-T/C-Y의 합성 펩티드에 관한 것이고, 여기서 X 및 Y는 아미노산이다. 미국특허 제 5,547,936호는 서열 X-RGDXX를 카운팅하는 펩티드를 기술하고 있으며, 여기서 X는 아미노산일 수 있다. 미국특허 제4,988,621호는 다수의 RGD-카운팅 펩티드를 기술한다. 미국특허 제4,879,237호는 식 RGD-Y의 일반적인 펩티드를 기재하고, 여기서 Y는 아미노산이고, 또한 펩티드 G-RGD-AP를 기재한다. 미국특허 제5,169,930 호는 αvβ1 인테그린에 결합하는 펩티드 RGDSPK를 기재한다. 미국특허 제5,498,694호 및 제5,700,908호는 엄격히 말하자면 RGD-함유 펩티드가 아닌 β3 인테그린 서브유닛의 세포질 도메인에 관한 것이지만, 이는 서열 RDG를 함유한다. W097/08203은 구조적 유사체 또는 RGD-결합 부위인 사이클릭 펩티드를 기술한다. 미국특허 제5,612,311호는 C-C 결합에 의해서 또는 페니실라민 또는 메르캅토 프로피온산 유사체와 같은 기타 그룹을 통해 폐환될 수 있는 15 RGD-함유 펩티드를 기재한다. 미국특허 제5,672,585호는 RGD-함유 펩티드를 포함하는 일반식을 기재한다. 펩티드의 바람직한 그룹은 RGD의 아스파르트산 잔기가 O-메톡시 티로신 유도체로 유도체화된 것이다. 미국특허 제5,120,829호는 RGD 세포 부착 촉진 결합 부위 및 소수성 부착 도메인을 기재한다. D형태는 미국특허 제5,587,456호에 기재되어 있다. 미국특허 제5,648,330호는 GPIib/IIIa에 대해 높은 친화성을 지닌 사이클릭 RGD 함유 펩티드를 기재한다.
본 발명의 바람직한 예에서, 표적 잔기는 αvβ3 또는 αvβ5 인테그린의 리간드이다.
악티빈
ActRII를 발현하는 것으로 공지된 세포는 내피 세포를 포함한다. ActRIIB 발현은 ActRII와 유사하고, 또한 내피 세포에서 다시 발견된다. ActRI를 발현하는 것으로 공지된 세포는 혈관 내피 세포를 포함한다. ActRIB는 또한 내피 세포에서 동정되었다.
안지오게닌
안지오게닌(ANG)은 새로운 혈관 성장을 유도하는 그의 능력으로 명명되는 14 kDa의 무당화된 폴리펩티드이다.
아넥신 V
아넥신 V는 혈관 항응고활성을 지닌 단백질의 칼슘 및 인지질 결합 과의 구성원이다. 아넥신 V의 여러 가지 동의어가 존재한다: 태반 단백질 4(PP4), 태반 항응고 단백질 I (PAP1), 칼포비딘 I(CPB-I), 칼슘 의존성 인지질 결합 단백질 33 (CaBP33), 혈관 항응고 단백질 알파(VACα), 안코린 CII, 리포코르틴-V, 엔도넥신 II, 및 트롬보플라스틴 억제제. 아넥신 V의 결합 부위수는 종양 세포에서 6-24 x 106/세포이고, 내피 세포에서 8.8 x 106/세포로 보고되어 있다.
CD44
백혈구 부착 현상에 명백히 관여하는 또 다른 분자는 CD44인데 이는 조혈 및 비조혈 세포 둘 모두상에서 편재하여 발현되는 분자이다. CD44는 대안적으로 스플라이싱된 형태를 생성시키는 능력이 탁월하여 이의 다수가 활성이 상이하다. 이러한 현저한 신축성은 이의 변화하는 성질을 통해, CD44가 종양세포가 성장 및 전이을 통해 성공적으로 나아가기 위해 사용하는 특정의 방법에서 역할을 할 것으로 숙고하게 하였다. CD44는 80-250 kDa의 유형 I(세포외 N-말단) 트랜스멤브레인 단백질이다. CD44H를 발현시키는 것으로 공지된 세포는 혈관 내피 세포를 포함한다.
CD44용으로 다수의 리간드가 있는데, 오스테오폰틴, 피브로넥틴, 콜라겐 유형 I 및 II 및 히알루론산염이 포함된다. 피브로넥틴으로의 결합은 크론드로이틴 설페이트를 발현하는 CD44 변이체에 국한 되는 것으로 보고되어 있는데, 크론드로이틴 설페이트 부착 부위는 엑손 v8-vll에 국소화된다. 히알루론산염 결합은 거의 모든 CD44 이소폼에 대해 가능한 것으로 제안되어 있다. 중요한 결합 부위중의 하나는 엑손 2에 중심을 두고, 리신 및 알기닌 잔기를 포함하도록 제안된다. 공지된 히알루론산염 결합 모티프의 단순 발현 이외의 인자는 또한 히알루론산염 결합에 필수적인 것처럼 보인다. 성공적인 히알루론산염 결합은 발현된 엑손, 독특한 세포질 테일, 당화 패턴, 및 세포의 활성 상태의 조합에 의해 촉진된다. 따라서 히알루론산염 결합 기능면에서, 상당한 "잠재적" 신축성인 각각의 CD44-발현 세포에 존재한다.
섬유모세포 성장 인자(FGF)
"섬유모세포 성장 인자"(FGF)라고 하는 것은 이러한 과의 시토킨에 대한 제한적 기술이다. FGF의 기능은 세포 성장에 국한되지 않는다. 몇몇 FGF가 실제로 섬유모세포 증식을 유도하지만, 원래의 FGF 분자 (FGF-2 또는 FGF 염기성)는 현재 또한 내피세포, 연골세포, 평활근 세포, 멜라닌 세포뿐만 아니라 기타 세포의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이는 또한 지방세포 분화를 촉진하고, 대식세포 및 섬유모세포 IL-6 생성을 유도하고 성상세포 이동을 자극하고, 신경세포 생존을 연장한다. 현재까지, FGF 상과는 23개의 구성원으로 이루어지는데, 이들 모두는 6개의 동일한 산재된 아미노산을 함유하는 보존된 120 아미노산 (aa) 코어 영역을 함유한다.
FGF-1: 사람 FGF-1 (FGF 산성, FGFa, ECGF 및 HBGF-1로서 또한 공지됨)은 모든 3개의 배엽층으로부터 다양한 세포에 의해 발현되는 17-18 kDa 무당화된 폴리펩티드이다. 결합 분자는 FGF 수용체일 수 있다. FGF-1을 발현하는 것으로 공지된 세포는 내피 세포이다.
FGF-2: FGF 염기성, HBGF-2, 및 EDGF로도 공지된 사람 FGF-2는 세포내 및 세포외 활성 둘 다를 나타내는 18 kDa의 무당화된 폴리펩티드이다. 분비에 이어서, FGF-2는 세포 표면 HS 또는 매트릭스 글리코스아미노글리칸에서 격리된다. FGF-2가 단량체로서 분리되더라도, 세포 표면 HS는 비공유 면 대 면 배열에서 단량체성 FGF-2를 이량체화하고 후속적으로 FGF 수용체를 이량체화하고 활성화시킨다. FGF-2를 발현시키는 것으로 공지된 세포는 내피 세포이다.
FGF-3: 사람 FGF-3은 int-2 유전자의 산물이다[즉, 레트로바이러스 삽입후 우발적으로 활성화되는 유전자(int-2/FGF-3)를 함유하는 마우스 염색체 7상의 영역인 통합 영역-2으로부터 유도됨]. 이러한 분자는 28-32 kDa의 222 aa 당단백질로서 합성되는데, 이는 다수의 펩티드 모티프를 함유한다. FGF-3을 발현하는 것으로 보고된 세포는 발생중의 세포 및 종양에 국한된다. FGF-3을 발현하는 것으로 공지된 종양은 유방암종 및 결장 암세포주이다.
FGF-4: 사람 FGF-4는 22 kDa의 176 aa 당단백질인데 이는 발생학적으로 조절된 유전자의 산물이다. 이 분자는 206 aa 전구체로서 합성되는데, 이는 크고, 잘 정의되지 않은 경우 30 aa 신호 서열과 2개의 헤파린 결합 모티프(aa 51-55 및140-143에서)를 함유한다. 헤파린 결합 부위는 직접 FGF-4 활성에 관여하고; 헤파린/헤파란은 FGF-4의 능력을 조절하여 FGFR1 및 FGFR2를 활성화시킨다. FGF-4를 발현시키는 것으로 공지된 세포는 종양 세포 및 배아 세포 둘 모두를 포함한다. 사람 위암에서의 동정은 하나의 대안적인 명명(/hst-1/hst)을 발생시키며, 카포시 육종에서의 이의 분리는 또 다른 명명(K-FGF)의 근거를 제공한다.
IL-1R
IL-1은 특이적 수용체에 결합함으로써 이의 효능을 발휘한다. 2개의 독특한 IL-1 수용체 결합 단백질과 비결합성 신호화 보조 단백질이 동정되었다. 각각은 3개의 세포외 면역글로불린 유사(Ig-like) 도메인을 갖는데, 이는 이들을 유형 IV 시토킨 수용체 과로 간주하게 한다. 2개의 수용체 결합 단백질은 각각 유형 I IL-1 수용체 (IL-1 RI) 및 유형 II IL-1 수용체 (IL-1 RII)로 칭해진다. 사람 IL-1 RI은 552 aa의 80 kDa 트랜스멤브레인 당단백질인데, 이는 내피세포로부터 분리된 것이다.
RTK
수용체 티로신 키나제의 새로운 과(RTK)인 Eph 수용체 및 이의 리간드 에프린은 혈관 어셈블리, 혈관형성, 종양형성, 및 전이에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 부류 A Eph 수용체 및 이의 리간드는 종양 및 관련 혈관계에서 상승되는 것으로 되어 있다.
MMP
매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)는 종양 성장, 혈관형성, 침습 및 전이에관련되어 있다. 이들은 또한 종양 마커로서의 사용이 제안되어 있다.
NG2
NG2는 큰 내재성 막 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸인데 이는 먼저 미성숙 신경세포에 의해 발현된 세포 표면 분자로서 동정되었다. 후속적으로 NG2는 광범위한 미성숙 세포뿐만 아니라 높은 악성을 갖는 몇몇 유형의 종양에 의해 발현되는 것으로 밝혀졌다. NG2는 종양 혈관계에서 표적 분자로서 제안되었다. 특히, 콜라게나제-1(Cl)은 새로이 형성된 미세관에 존재하는 우세한 매트릭스 메탈로프로테이나제이고 신생혈관의 마커로서 작용한다.
종양태아성 피브로넥틴
피브로넥틴의 종양태아성 단편의 발현(Fn-f)은 또한 혈관형성 도중에 증가하는 것으로 밝혀졌고 종양 혈관형성의 마커로서 제안되었다. 하나의 구체예에서, TTM은 피브로넥틴의 종양태아성 ED-B 도메인에 대한 항체 또는 이의 단편이다. 이러한 항체 및 IL-12과의 이의 접합체의 제조는 문헌[참조: Halin et al (2002) Nature Biotechnology 20: 264-269]에 기재되어 있다.
테나신
테낙신은 뇌 및 유방암 및 흑색종을 포함하는 악성 종양에서 나타나는 매트릭스 당단백질이다. 이의 발현은 악성이지만 잘 분화되지 않는 종양이고 종양의 혈관과의 연합으로 악성 종양 및 혈관형성의 생물학 둘 다를 이해하는데 중요한 표적이 되지만 마찬가지로 치료용 암 표적 및 마커이다.
표적화 잔기는 바람직하게는 종양 세포 또는 종양 혈관계 표면 분자에 결합할 수 있는 폴리펩티드이다. 상기에서 언급한 것들 뿐만 아니라 공지되거나 입수용이한 기타 이러한 표면 분자가 또한 제 1 서열에 의해 표적화될 수 있다.
표면 분자에 결합하는 분자들 동정하기 위해 통상의 단백질 결합 검정이 적용될 수 있는 것으로 인식된다. 또한 표면 분자에 결합하는 서열을 개발하기 위해 구조-기본 약물 설계가 적용될 수 있는 것으로 인식된다.
합성 화합물에 대해 상기에서 언급한 바와 같이, 높은 처리량 스크리닝이 또한 표적화 분자를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 경쟁적인 약물 스크리닝 검정의 사용을 고려하며, 여기서 표적과 결합할 수 있는 중화항체가 표적에 결합하는 시험 화합물과 특이적으로 경쟁한다.
결합 파트너(BP)
표적화 잔기는 일반적으로, 하나 이상의 결합 도메인을 포함하거나 그로써 이루어진 표면 분자에 대한 결합 파트너(BP)의 형태를 취한다.
리간드
본 발명의 표적화 잔기는 리간드 형태를 취할 수 있다. 리간드는 천연 또는 합성일 수 있다. 용어 "리간드"는 또한 화학적으로 개질된 리간드를 의미한다. BP의 하나 이상의 결합 도메인은, 예를 들면, 수용체의 천연 리간드로 구성될 수 있으며, 이러한 천연 리간드가 부착 분자 또는 성장 인자 수용체 리간드(예: 상피 성장 인자)일 수 있거나, 수용체에 대한 결합 친화성을 유지하는 천연 리간드의 단편일 수 있다.
합성 리간드는 고안자 리간드를 포함한다. 본원에 사용된 용어는 "고안자 리간드"는 수용체의 형태와 비교하여 이들의 3차원 형태을 기본으로 하여 수용체에 결합하는 것으로 여겨지는 제제를 의미하는 것이다.
항체
또한, 결합 도메인은 면역글로불린(Ig) 가변 영역으로부터의 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유도될 수 있다. 이러한 가변 영역은 천연 사람 항체 또는 설치류 항체와 같은 다른 종으로부터의 항체로부터 유도될 수 있다. 또한, 가변 영역은 인간화된 항체와 같은 유전공학처리된 항체 또는 면역화된 또는 비면역화된 동물로부터의 파지 디스플레이 라이브러리 또는 돌연변이된 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유도될 수 있다. 또하나의 대안으로서, 가변 영역은 단일 쇄 가변 단편(scFv)으로부터 유도될 수 있다. BP는 기타 서열을 함유하여 다량체화를 달성하거나 결합 도메인 사이에서 스페이서로 작용하거나, Ig 힌지 서열 또는 신규 스페이서 및 공학처리된 링커 서열을 포함하여, BP를 암호화하는 유전자에서 제한 부위의 삽입으로부터 생성된다.
BP는, 하나 이상의 면역글로불린 가변 영역 이외에, Ig 중쇄 불변 영역의 전부 또는 부분을 포함할 수 있어서 천연의 전체 Ig, 공학처리된 Ig, 공학처리된 Ig 유사 분자, 단일 쇄 Ig 또는 단일 쇄 Ig 유사 분자를 포함할 수 있다. 또한, 추가로, BP는 독소와 같은 또 다른 단백질로부터의 하나 이상의 도메인을 함유할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린유전자의 단편에 의해 실질적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 의미한다. 항체는 온전한 면역글로불린으로서 또는 다수의 단편으로서 존재할 수 있는데, 이는 여러 가지 펩티다제에 의해 분해되어 생성된 특징화가 잘 된 단편을 포함한다. 여러 가지 항체 단편이 온전한 항체의 분해의 견지에서 정의되어 있고, 당업자는 항체 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 사용함으로써 새롭게 합성될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서 용어 항체는, 또한 본원에서 사용된 바와 같이 전체 항체의 변형에 의해 생성되거나 아니면 재조합 DNA 방법론을 사용하여 다시 합성한 항체 단편을 포함하는 것이다. 용어 "항체"의 사용으로 포함되게 된 항체 단편은 이로써 제한되는 것은 아니지만, Fab, Fab', F (ab') 2, scFv, Fv, dsFv diabody, 및 Fd 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 표면 단백질에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 제공한다. 따라서 본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩티드에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 제조 방법을 제공한다.
폴리클로날 항체를 목적으로 할 경우, 선택된 포유동물(예: 마우스, 래빗, 염소, 말 등)을 에피토프 함유 면역원성 폴리펩티드로 면역화시킨다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 수집하고 공지된 방법으로 처리한다. 에피토프에 대한 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청이 기타 항원에 대한 항체를 함유한 경우, 폴리클로날 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 폴리클로날 항혈청을 제조하고 처리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 항체를 제조할 수 있게 하기 위하여, 본 발명은 또한 동물 또는 사람에서 면역원으로 사용되는 또 다른폴리펩티드로 합텐화된 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 제공한다.
폴리펩티드의 결합 세포 표면 에피토프에 대해 유도된 모노클로날 항체는 또한 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 하이브리도마에 의해 모노클로날 항체를 제조하는 일반적인 방법론은 익히 공지되어 있다. 불멸 항체 생성 세포주는 세포 융합에 의해, 및 또한 기타 기술, 예를 들어, 종양유전자 DNA로 B 림프구를 직접 형질전환하거나 엡슈타인-바르 바이러스로 형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 에피토프에 대해 생성된 모노클로날 항체의 패널은 여러 가지 특성, 즉, 이소타입 및 에피토프 친화성에 대해 스크리닝될 수 있다.
대체 기술로서는 스크리닝 파지 디스플레이 라이브러리가 포함되는데, 여기서, 파지는 광범위한 상보성 결정 영역(CDR)과 함께 이들의 외피 표면상에서 scFV 단편을 발현시킨다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "항체"는 달리 언급이 없는한, 표적 항원에 대한 이들의 결합 활성을 유지하는 전체 항체의 단편을 포함한다. 상기에서 언급한 바와 같이, 이러한 단편은 Fv, F (ab') 및 F (ab')2단편뿐만 아니라 단일 쇄 항체(scFv)를 포함한다. 더욱이, 항체 및 이의 단편은 예를 들면,EP-A-239400에 기재된 바와 같이 인간화된 항체일 수 있다.
스크린
한 양태에서, 본 발명은 종양 또는 종양 혈관계 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이고, 이러한 방법은 세포 표면 분자를제제와 접촉시키고, 상기 제제가 세포 표면 분자에 결합하는 지의 여부를 결정하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "제제"는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 화합물, 예를 들면 시험 화합물을 포함하는데, 이는 적합한 공급원에 의해 천연이든 아니든, 수득하거나 제조될 수 있다. 이러한 제제는 화합물의 라이브러리로부터 고안되거나 수득될 수 있는데, 이는 펩티드뿐만 아니라, 기타 화합물, 예를 들어 작은 유기 분자 및 특히 새로운 선도 화합물을 포함할 수 있다. 예로써, 제제는 천연 물질, 생물학적 거대 분자, 또는 생물학적 물질, 예를 들면 세균, 진균, 또는 동물(특히 포유동물) 세포 또는 조직으로부터 유래된 추출물, 유기 또는 무기 분자, 합성 시험 화합물, 반합성 시험 화합물, 구조 또는 기능적 유사체, 펩티드, 펩티드유사체, 유도체화된 시험 화합물, 전체 단백질로부터 분해된 펩티드 또는 합성적으로(예를 들어, 예로서, 펩티드 합성기를 사용하여) 또는 재조합적으로 또는 이들의 조합에 의해 합성된 펩티드, 또는 재조합 시험 화합물, 천연 또는 비천연 시험 화합물, 융합 단백질 또는 이의 등가물 및 이의 돌연변이체, 유도체 또는 조합물을 포함할 수 있다.
제제는 아미노산 서열 또는 이의 화학적 유도체일 수 있다. 물질은 심지어 유기 화합물 또는 기타 화학물질일 수 있다. 제제는 심지어 뉴클레오티드 서열일 수 있는데 이는 센스 서열 또는 안티센스 서열일 수 있다.
단백질
용어 "단백질"은 단일 사슬 폴리펩티드 분자뿐만 아니라 다중폴리펩티드 복합체를 포함하는데, 여기서 개별적인 구성 폴리펩티드는 공유 또는 비공유 방식으로 결합되어 있다. 용어 "폴리펩티드"는 길이가 2개 이상의 아미노산의 펩티드를 포함하는데, 전형적으로는 5, 10 또는 20개 아미노산을 갖는다.
폴리펩티드 상동체
본 발명에 사용하기 위한 폴리펩티드 서열은 특정 서열 또는 이의 단편에 제한되지 않지만 또한 어떠한 공급원으로부터 수득된 상동체를 포함하는데, 예를 들어 관련 바이러스/세균 단백질, 세포상 상동체 및 합성 펩티드뿐만 아니라 이의 변이체 또는 유도체인 것으로 이해된다. 본 발명의 폴리펩티드 서열은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드를 포함한다.
폴리펩티드 변이체, 유도체 및 단편
본 발명의 아미노산 서열과 관련된 용어 "변이체" 또는 "유도체"는, 서열로부터 또는 서열에 대한 하나 이상의 아미노산의 임의의 치환, 변이, 변화, 대체, 결실 또는 첨가를 포함하는데, 생성된 아미노산 서열은 바람직하게는 표적화 활성을 갖는데, 바람직하게는 서열 목록에 제시된 폴리펩티드 활성의 25 내지 50% 이상, 더욱 바람직하게는 그와 최소한 거의 동일한 활성을 갖는다.
따라서 서열은 본 발명에 사용하기 위해 변형될 수 있다. 전형적으로는, 서열의 활성을 유지시키는 변형이 이루어진다. 따라서 한 구체예에서, 아미노산 치환은, 예를 들면, 1, 2 또는 3 내지 10, 20 또는 30개의 치환으로 이루어질 수 있는데, 단 변형된 서열은 최소한 약 25 내지 50%의 활성을 유지하거나 거의 동일한 활성을 유지한다. 그러나 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대한 변형은 의도적으로 폴리펩티드의 생물학적 활성을 감소시키도록 이루어질 수 있다. 예를 들면, 표적 분자에 결합할 수 있지만 기능성 효능제 도메인이 결여된 트렁케이팅된 폴리펩티드가 유용할 수 있다.
일반적으로, 서열 목록에 도시된 상응하는 영역과 비교하여 바람직하게는 20%, 10% 또는 5% 미만의 변이체 또는 유도체의 아미노산 잔기가 변경된다.
아미노산 치환은 예를 들면, 치료용으로 투여되는 폴리펩티드의 혈장 반감기를 증가시키기 위해 천연발생이 아닌 유사체의 사용을 포함할 수 있다 (더 상세하게는, 치료에 사용되는 펩티드 유도체의 제조에 대해서는 하기를 참조)
보존적 치환이, 예를 들면 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 제 2컬럼에서 동일한 블록의 아미노산 및 바람직하게는 제 3컬럼에서 동일한 라인에서 서로에 대해 치환될 수 있다.
지방족 비극성 G A P
I L V
극성-비하전 C S T M
N Q
극성-하전 D E
K R
방향족 H F W Y
본 발명의 폴리펩티드는 또한 상기 언급한 바와 같은 폴리펩티드 및 이의 변이체의 단편을 포함하며, 서열의 단편을 포함한다. 바람직한 단편은 에피토프를 포함하는 것을 포함한다. 적합한 단편은 길이가 최소한 약 5, 예를 들어 10, 12, 15 또는 20 아미노산일 것이다. 이들은 또한 길이가 200, 100 또는 50 미만의 아미노산일 수 있다. 단백질 및 이의 대립유전자 및 종변이체의 폴리펩티드 단편은 하나 이상의(예: 2, 3, 5, 또는 10) 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 수 있으며, 보존적 치환을 포함한다. 예를 들어 재조합기술에 의해 치환, 결실 및/또는 삽입이 일어난 경우, 바람직하게는, 서열 목록에 도시된 아미노산 잔기의 20%, 10% 또는 5% 미만이 변경된다.
본 발명의 단백질은 전형적으로는 재조합 방식에 의해, 예를 들면 하기한 바와 같이 제조된다. 그러나 고형상 합성과 같이 당업자에게 익히 공지된 기술을 사용하는 합성 방법으로도 제조할 수 있다. 화학 합성 펩티드에 대한 여러 가지 기술은 본원에 포함시킨 문헌[Borgia and Fields, 2000, TibTech 18: 243-251]을 참조할 수 있다.
치료학적 펩티드
본 발명의 펩티드는 환자에세 치료용으로 투여될 수 있다. 천연 아미노산만으로 유일하게 이루어지지 않는 펩티드를 사용하는 것이 바람직한데, 예를 들면 변화시켜 면역원성을 감소시키고, 환자 체내의 순환 반감기를 증가시키고, 생체이용율을 증가시키고/시키거나 효능 및/또는 특이성을 증가시킨다.
다수의 접근법을 사용하여 펩티드를 변화시켜 치료 적용에 사용된다. 하나의 방법은 펩티드 또는 단백질을 여러 가지 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 폴리프로필렌 글리콜(PPG)에 결합시키는 것이다[참조: 미국특허 제5,091,176호, 제5,214,131호 및 미국특허 제5,264,209호].
천연 아미노산을 여러 가지 암호화되지 않거나 변화된 아미노산, 예를 들어 D-아미노산 및 N-메틸 아미노산으로 대체시키는 것이 또한 펩티드를 변화시키는데 사용될 수 있다.
다른 접근법은 이작용성 가교제, 예를 들어 N-숙신이미딜 3-(2 피리딜디티오) 프로피오네이트, 숙신이미딜 6-[3-(2 피리딜디티오) 프로피온아미도] 헥사노에이트, 및 설포숙신이미딜 6-[3-(2 피리딜디티오) 프로피온아미도] 헥사노에이트를 사용하는 것이다[참조: 미국특허 제 5,580,853호 참조].
입체형태적으로 제한된 본 발명의 펩티드 유도체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 입체형태 제한이란 용어는 펩티드가 취하는 3차원 형상의 안정성 및 바람직한 입체형태를 의미한다. 입체형태 제한은 펩티드에서 단일 잔기의 입체형태 이동성을 포함하는 국소 제한; 잔기 그룹의 입체형태 이동성을 제한하는 것을 포함하는 영역 제한 (여기서 잔기는 특정의 2차 구조 유닛을 형성할 수 있다); 및 전체 펩티드 구조를 포함하는 통괄 제한을 포함한다.
펩티드의 활성 입체형태는 공유 변화, 예를 들어 고리화에 의해 또는 감마-락탐 또는 다른 유형의 브릿지의 혼입에 의해 안정화될 수 있다. 예를 들면, 측쇄를 주쇄에 고리화하여 L-감마 락탐 부분을 상호작용 부위 각 면에 형성시킬 수 있다[참조: Hruby et al., "Applications of Synthetic Peptides, "in Synthetic Peptides: A User's Guide: 259-345 (W. H. Freeman & Co. 1992)]. 고리화는 또한 ,예를 들어 시스테인 브릿지의 형성, 각각의 말단 아미노산의 아미노 및 카복시 말단 그룹의 결합, 또는 Lys 잔기 또는 관련 상동체의 아미노 그룹과 Asp, Glu 또는 관련 상동체의 카복시 그룹의 결합에 의해 수행될 수 있다. 폴리펩티드의 알파 아미노 그룹을 리신잔기의 엡실론 아미노산 그룹과, 요오도아세트산 무수물을 사용하여 결합시키는 것이 또한 채택될 수 있다[참조:Wood andWetzel, 1992,Int'l J.Peptide Protein Res. 39: 533-39].
미국특허 제5,891,418호에 기재된 다른 방법은 금속 이온 착체화 주쇄를 펩티드 구조에 포함시키는 것이다. 전형적으로, 바람직한 금속-펩티드 주쇄는 소정의 착체 금속 이온의 배위구체에 필요한 수의 특정 배위 그룹을 기본으로 한다. 일반적으로, 유용한 것으로 입증된 대부분의 금속이온은 4 내지 6개의 배위수를 갖는다, 펩티드 쇄의 배위그룹은 아민, 아미드, 이미다졸 또는 구아니디노 작용기와 함께 질소 원자; 티올 또는 이황화물의 황원자; 및 하이드록시, 페놀계, 카보닐 또는 카복실 작용기의 산소 원자를 포함한다. 또한, 펩티드 쇄 또는 개개의 아미노산은 화학적으로 변화되어 배위 그룹, 예를 들어 옥심, 하이드라지노, 설프하이드릴, 포스페이트, 시아노, 피리디노, 피페리디도 또는 모르폴리노를 포함할 수 있다. 펩티드 구성물은 선형 또는 사이클릭이지만, 선형 구성물이 전형적으로는 바람직하다. 소형의 선형 펩티드의 일례는 Gly-Gly-Gly-Gly이고, 이는 주쇄에 4개의 질소( N4 착체화 시스템)를 가져서 4개의 배위수를 갖는 금속 이온과 착체를 형성할 수 있다.
치료학적 펩티드의 특성을 개선하는 추가의 방법은 비(non-)펩티드 펩티드유사체를 사용하는 것이다. 광범위한 여러 가지 기술을 사용하여 펩티드의 정확한 구조를 밝힐 수 있다. 이들 기술은 아미노산 시퀀싱, x선 결정분석, 질량 분광법, 핵자기공명 분광법, 컴퓨터 보조 분자 모델링, 펩티드 지도화, 및 이의 병용을 포함한다. 펩티드의 구조 분석은 일반적으로는 펩티드의 아미노산 서열 뿐만 아니라 이의 원자 성분의 3차원적 위치화를 포함하는 광대한 자료를 제공한다. 이러한 정보로부터, 치료활성을 위해 화학 작용기는 갖지만 보다 안정한, 예를 들어 생물학적 분해에 덜 민감한 비펩티드 펩티드유사체가 설계될 수 있다. 이러한 방법의 예는 미국특허 제5,811,512호에 제공되어 있다.
본 발명의 치료적 펩티드를 화학적으로 합성하는 방법은 상기 참조 문헌에 기재되어 있고, 문헌[참조예: Borgia and Fields, 2000, TibTech 18: 243-251] 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조할 수 있다.
이작용성 유도체
본 발명의 추가의 구체예는 이작용성 유도체에 의해 제공되는데 여기서 TTM으로 변형된 시토킨이 종양 항원 또는 기타 종양 항원성 마커에 대한 항체 또는 이의 단편과 접합되거나, 예를 들어 αv 인테그린, 메탈로프로테아제 또는 혈관성장인자, 또는, 항테낙신 항체 또는 항피브로넥틴 EDB 도메인과 같은 세포외 기질의 성분에 대한 항체 또는 이의 단편과 접합되어 있다. 위선암종 및 난소선암종 세포에 의해 발현된 종양 관련 TAG72 항원에 대한 mAb의 힌지 영역과 TNF 간의 융합 생성물을 제조하는 방법이 최근 보고되었다.
본 발명의 추가의 구체예는 비오틴/아비딘 시스템으로 종양을 사전에 표적화하는 것(pre-tarketing)에 의해 제공된다. 이러한 방법에 따르면, 3 성분 착체가 종양 항원 부위에서 상이한 단계로 수득되는데, 이는 1) 비오티닐화된 mAb, 2) 아비딘 (또는 스트펩타비딘) 및 3) TTM 및 비오틴으로 변형된 2가 시토킨에 의해 형성된다. 다수의 논문들이 면역접합체로의 통상적인 표적에 비해, 사전에 표적하는 방법이 실제로 자유 활성 분자에 대한 표적에 귀환되는 활성 분자의 비를 증가시킬수 있어 치료 독성을 감소시키는 것으로 입증되었다. 이러한 방법은 비오틴화 TNF를 사용하여 유리한 결과를 수득하는데, 이는 시험관내에서 세포독성을 유도하여 정상 TNF가 비활성이었던 조건하에서의 종양 세포 성장을 감소시킬 수 있다. 사전 표적 방법은 또한 동시에 종양 항원과 변형된 시토킨에 결합하는 이특이적(bispecific) 항체를 사용하여 2-페이스 절차에 의해 수행할 수 있다. TNF 및 배암암종 항원에 대한 이특이적 항체의 사용은 TNF 종양 사전 표적의 수단으로서 최근에 기술되었다.
추가의 구체예에 따라서, 본 발명은 상이한 TNF 서브유닛상에서, TTM 및 항체 둘 모두 또는 이의 단편에 (직간접으로 비오틴-아비딘 브릿지를 통해) 접합된 시토킨을 포함하는데, 여기서 항체 또는 이의 단편은 종양 세포 또는 종양 스트로마의 기타 성분, 예를 들어 테낙신 및 피브로넥틴 EDB 도메인상에서 발현된 항원에 대한 것이다. 이로써 변형된 시토킨의 종양 귀환 특성이 개선되고, 삼량체-단량체-삼량체 전이를 통해 종양 미세환경에서 후자가 서방출된다. 예를 들어 TNF 접합체의 변형된 서브유닛이 표적 착체로부터 분리될 수 있고 재결합되어 미변형 삼량체성 TNF 분자를 형성하고, 이어서 종양 미세환경으로 확산된다. 생체활성 TNF의 방출은 표적 후 24-48시간내에 일어나는 것으로 나타났다.
리포좀 형태의 시토킨 제조물은 이의 생물학적 활성을 개선시킬 수 있다. 사실상, TNF 아미노 그룹의 아실화가 시험관내에서 생물학적 활성의 상실없이 소수성을 증가시키는 것으로 관찰되었다. 더욱이, 지질에 결합된 TNF는 시험관내에서의 세포 독성에 영향을 받지 않으며, 생체내에서 면역조절 효과 및 감소된 독성을갖는 것으로 보고되었다.
폴리누클레오티드
본 발명에 사용되는 폴리누클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드 접합체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 당업자가 유전자 코드의 쇠퇴 결과로 다수의 상이한 폴리뉴클레로타이드가 동일한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다는 사실을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 당업자는, 통상의 기술을 사용하여, 본 발명의 폴리펩티드가 발현될 수 있는 특정의 숙주 유기체의 코돈 사용을 반영하기 위한 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드 서열에 영향을 주지않는 누클레오티드 치환을 할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 폴리누클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다. 이는 또한 이들내에 합성 또는 변형된 누클레오티드를 포함하는 폴리누클레오티드일 수 있다. 다수의 상이한 유형의 올리고누클레오티드 변형이 당업계에 공지되어 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 주쇄를 포함하고, 당해 분자의 3' 및/또는 5' 말단에서 아크리딘 또는 폴리리신 쇄의 첨가를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에 기재된 폴리누클레오티드는 당업계에 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형을 수행하여 본 발명의 폴리누클레오티드의 생체내 활성 또는 반감기를 증가시킬 수 있다.
누클레오티드 벡터
본 발명의 폴리누클레오티드를 재조합된 복제가능한 벡터내로 혼입시킬 수 있다. 벡터를 사용하여 상용성 숙주세포에 핵산을 복제할 수 있다. 따라서 추가의 예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리누클레오티드를 복제가능한 벡터내로 도입하고 벡터를 상용성 숙주세포에 도입하고, 숙주 세포를 벡터의 복제가 일어나는 조적하에서 성장시킴으로써 본 발명의 폴리누클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 벡터를 숙주세포로부터 회수할 수 있다. 적합한 숙주세포는 이.콜라이와 같은 박테리아, 세균, 효모, 포유동물 세포주 및 기타 진핵 세포주, 예를 들어 곤충 Sf9 세포를 포함한다.
바람직하게는, 벡터중의 본 발명의 폴리누클레오티드는 숙주 세포에 의해 암호화 서열의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열에 작동적으로 결합되며, 즉 벡터는 발현 벡터이다. 용어 "작동적으로 결합된"은 기재된 성분이 이들을 이들의 의도된 방법으로 기능하도록할 수 있는 관계에 있음을 의미한다. 암호화 서열에 대해 "작동적으로 결합된" 조절성 서열은 암호화 서열의 발현이 조절 서열과 병용되는 조건하에서 달성되는 방식으로 결찰한다.
조절 서열은 예를 들어, 조절 서열에 의한 전사 수준을 전사 조정자에 대해 더 반응성이게 하는 추가의 전사 조절 요소의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 벡터는 하기한 바와 같이 적합한 숙주세포에 형질전환시키거나 형질감염시켜 본 발명의 단백질 발현을 위해 제공한다. 이러한 방법은 단백질을 암호화하는 암호화 서열의 벡터에 의해 발현을 제공하는 조건하에, 상기한 바와 같은 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하고 발현된 단백질을 선택적으로 회수하는 것을 포함할 수 있다.
벡터는 예를 들면, 복제 기원, 임의로 상기 폴리누클레오티드의 발현을 위한프로모터, 및 임의로 프로모터의 조절자가 제공된 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자, 예를 들면 박테리아 플라스미드의 경우는 암피실린 내성 유전자 또는 포유동물 벡터의 경우는 네오마이신 내성 유전자를 함유할 수 있다. 벡터는 예를 들면 숙주세포를 형질감염시키거나 형질젼환시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질을 암호화하는 서열에 작동적으로 결합된 조절 서열은 프로모터/인핸서 및 기타 발현 조절 신호를 포함한다. 이들 조절 서열은 발현 벡터가 사용되도록 고안된 숙주 세포와 병용가능하도록 선택될 수 있다. 용어 "프로모터"는 당업계에 익히 알려져 있는 것이고 최소 프로모터에서부터 업스트림 요소 및 인핸서를 포함하는 프로모터에 이르는 크기 및 복합성의 범주의 핵산 영역을 포함한다.
프로모터는 전형적으로는 포유동물 세포에서 기능성인 프로모터로부터 선택되지만 원핵세포 프로모터 및 기타 진핵 세포에서 기능성인 프로모터를 사용할 수 있다. 프로모터는 전형적으로는 바이러스 또는 진핵 유전자의 프로모터 서열로부터 유도된다. 예를 들면, 발현이 일어날 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터일 수 있다. 진핵 프로모터에 대해서는, 편재하는 방식으로(예를 들어, a-액틴, b-액틴, 튜불린의 프로모터) 또는, 대안으로, 조직 특이적 방식 (예를 들어 피루베이트 키나제의 유전자의 프로모터)으로 기능하는 프로모터일 수 있다. 특정 세포에 특이적인 조직-특이적 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 이들은 또한 특이적 자극에 반응하는 프로모터일 수 있는데, 예를 들면 스테로이드 호르몬 수용체에 결합하는프로모터일 수 있다. 바이러스 프로모터를 또한 사용할 수 있는데 예를 들면 몰로니(Moloney) 쥐과 백혈병 바이러스 긴 말단 반복(MMLVLTR) 프로모터, 로우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터 또는 사람 거대세포바이러스 (CMV) IE 프로모터이다.
프로모터를 이종유전자 발현 수준이 세포의 생존기간중에 조절될 수 있도록 유도하는 것이 또한 유리할 수 있다. 유도한다는 것의 의미는 프로모터를 사용하여 수득된 발현 수준을 조절할 수 있다는 의미이다.
또한, 이들 프로모터는 추가의 조절 서열, 예를 들면 인핸서 서열을 첨가함으로써 변형될 수 있다. 상기한 바와 같은 2개 이상의 상이한 프로모터로부터의 서열 요소를 포함하여 키메릭 프로모터를 또한 사용할 수 있다.
숙주 세포
본 발명의 벡터 및 폴리누클레오티드를 또한 벡터/폴리누클레오티드를 복제하고/거나 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 발명의 단백질을 발현시키기 위해 숙주세포로 도입할 수 있다. 본 발명의 단백질은 원핵 세포를 숙주 세포로서 사용하여 제조할 수 있지만 진핵 세포, 예를 들어, 효모, 곤충 또는 포유 동물, 특히 포유동물 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 벡터/폴리누클레오티드는, 당업계에 공지된 여러 가지 방법, 예를 들어, 형질 감염, 형질 전환 및 일렉트로포레이션을 사용하여 적합한 숙주 세포로 도입할 수 있다. 본 발명의 벡터/폴리누클레오티드는, 당업계에 공지된 몇가지 방법, 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스, 헤르페스 단순바이러스 및 아데노바이러스로의 형질감염, 핵산의 직접 주입 및 바이오리스틱형질전환으로 동물에 투여한다.
단백질 발현 및 정제
본 발명의 폴리누클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 본 발명의 단백질을 발현시킬 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 단백질을 발현시킬 수 있는 적합한 조건하에서 배양시킬 수 있다. 본 발명의 단백질의 발현은 이들이 연속적으로 생산되거나 유도되도록 조작될 수 있는데, 이는 발현을 개시하기 위한 자극을 필요로 한다. 유도성 발현의 경우, 단백질 제조를 필요한 경우 예를 들면 배양 배지에 인듀서 물질, 예를 들어 덱사메타손 또는 IPTG를 가하여 개시할 수 있다.
본 발명의 단백질은 당업계에 공지된 다양한 방법으로, 예를 들어, 효소적, 화학적 및/또는 삼투성 용해 및 물리적 파쇄로 추출할 수 있다.
투여
본 발명의 단백질은 바람직하게는 본 발명의 조성물을 제조하기 위해 여러 성분과 배합할 수 있다. 바랍직하게는 조성물을 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 배합하여 약제학적 조성물(이는 사람 또는 동물용)을 제조한다. 적합한 담체 및 희석제는 등장성 염수 용액, 예를 들면 인산염 완충 염수를 포함한다. 부형제에 관한 세부 사항은 문헌[참조: The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edn, Eds Wade & Weller, American Pharmaceutical Association]에 기재되어 있다. 본 발명의 조성물은 직접 주사에 의해 투여할 수 있다. 조성물은 비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 안내, 경구 또는 경피 투여용으로 제형화될 수 있다. 전형적으로는 각각의 단백질을 0.5 내지 500ng/kg, 바람직하게는 1 내지 50 ng/kg, 더 바람직하게는 5 내지 15ng/kg의 범위의 용량으로 투여할 수 있다.
본 발명의 대안적 측면에서는 약제학적 조성물은 접합체를 포함하는데, 접합제 또는 이의 대사산물이 치료 대상의 혈장에 약 35,000 ng/일, 바람직하게는 약 3,500ng/일, 더 바람직하네는 약 1,000ng/일 이하 범위의 양으로 제공되도록 접합체가 존재한다.
상기 투여용량은 70kg 대상자에 대한 용량이다. 당업자는 70kg 이외의 체중을 지닌 대상자에 적합한 용량으로 상기한 바와 같은 용량을 용이하게 변화시켜 사용할 수 있을 것이다.
1일 용량은 대상자에게 투여될 용량을 예기되는 용량투여 기간의 일수로 나누어 산출한다. 예기되는 용량투여 기간은 전형적으로는 다음 투여까지의 기간인데 이 기간에 걸쳐서 그 용량이 효과를 갖거나 그 용량이 효과를 나타내도록 사용되어야 한다.
조성물은 매일, 매주 또는 매월 투여에 따라 목적하는 1일 용량이 되도록 제형화할 수 있다. 조성물은 편리하게는 덜 자주, 예를 들면 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 시간 마다 투여될 수 있다.
폴리펩티드 성분을 암호화하는 폴리누클레오티드/벡터를 나출형 핵산 작제물에 직접 투여하는데, 이는 바람직하게는 숙주 세포 게놈에 동종성인 주변 서열을 추가로 포함한다.
포유동물에 의한 나출형 핵산 작제물의 흡수는 몇몇의 공지된 형질감염 기술, 예를 들면 형질감염제의 사용을 포함하는 것에 의해 증강될 수 있다. 이들 제제는 양이온성 제제(예를 들면 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란) 및 리포펙턴트(예를 들면 리포펙탐(lipofectamTM) 및 트랜스펙탐(transfectamTM))를 포함한다. 전형적으로, 핵산 작제물을 형질감염제와 혼합하여 조성물을 제조한다.
바람직하게는 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 벡터를 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 배합하여 약제학적 조성물을 제조한다. 적합한 담체 및 희석제는 등장성 염수, 예를 들면 등장성 염수 용액, 예를 들면 인산염 완충 염수를 포함한다.
기술한 투여 경로 및 투여 섭생은 단지 지침용으로 제시하고자 하는 것인데, 이는 당업계의 숙련자들이 특정한 환자 및 조건에 적합하도록 투여 및 투여 섭생의 최적 방법을 용이하게 결정할 수 있다는 관점에서이다.
바이러스 벡터
바람직한 구체예에서 접합체는 바이러스 벡터, 보다 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 투여된다.
레트로바이러스
본 발명에 사용하기 위한 레트로바이러스 벡터는 어떠한 적절한 레트로바이러스로부터 유도되거나 유도가능하다. 대다수의 상이한 레트로바이러스가 확인되어 있다. 예를 들면 다음과 같다: 쥐과의 백혈병 바이러스 (MLV), 사람 면역결핍 바이러스 (HIV), 유인원 면역결핍 바이러스, 사람 T-세포 백혈병 바이러스 (HTLV),말의 전염성 빈혈 바이러스 (EIAV), 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 라우스 육종 바이러스 (RSV), 후지나미 육종 바이러스 (FuSV), 멀로니 쥐 백혈병 바이러스 (Mo-MLV), FBR 쥐 골육종 바이러스 (FBR MSV), 멀로니 쥐 육종 바이러스 (Mo-MSV), 아벨슨 쥐 백혈병 바이러스 (A-MLV), 조류 골수세포증 바이러스 (myelocytomatosis)-29 (MC29), 및 조류 적아구증 바이러스 (AEV). 레트로바이러스의 상세한 목록은 문헌에서 찾아볼 수 있다 (Coffin et al., 1997, "retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp758-763).
일부의 레트로바이러스의 게놈 구조에 대한 상세한 설명은 당업계에서도 찾을 수 있다. 예를 들면 HIV와 Mo-MLV에 대한 상세한 내용은 NCBI Genbank로부터 얻을 수 있다 (각각 게놈 승인 번호 AF033819 및 AF033811).
레트로바이러스는 크게 두 개의 카테고리: 즉 "단순한" 것과 "복잡한" 것으로 나눌 수 있다. 레트로바이러스는 추가로 7개의 그룹으로 나누어질 수 있다. 이들 그룹중 5개는 발암성 잠재력을 가지고 있는 레트로바이러스를 나타낸다. 나머지 두개의 그룹은 렌티바이러스와 스푸마바이러스이다. 이들 레트로바이러스에 대한 개관은 문헌에 나타나있다 (Coffin et al., 1997 (상기 동일)).
렌티바이러스 그룹은 다시 "영장류"와 "비-영장류"로 세분될 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예를 들면 사람 자가-면역결핍증 (AIDS)의 병원체인 사람 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV)가 있다. 비-영장류 렌티바이러스 그룹으로는 원형 "슬로우 바이러스" 비스나/매디 바이러스 (VMV), 및관련된 염소 관절염-뇌염 바이러스 (CAEV), 말 전염성 빈혈 바이러스 (EIAV) 및, 보다 최근에 설명된 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV) 및 소 면역결핍 바이러스 (BIV)가 있다.
본 발명은 또한 조혈 간 세포 (HSC)에 누클레오티드 서열의 형태로 접합체를 전달하기 위한 벡터의 사용에도 관련된다.
유전자 전달은 표적 세포, 예컨대 HSC에 하나 또는 그 이상의 누클레오티드 서열과 그것의 발현을 조절하는 서열로 구성된 발현 카세트를 전달하는 것을 포함한다. 이것은 생체외에서 카세트가 실험실안의 세포에 전달된 후 변형된 세포가 수용체에 투여되는 과정으로 수행될 수 있다. 또는 달리 유전자 전달은 생체외에서 발현 카세트가 직접 개체내의 세포에 전달되는 과정으로 수행될 수 있다. 두 가지 전략 모두에서 전달 과정은 통상 카세트가 적절한 세포내 부위로 전달되는 것을 도와주는 벡터의 보조를 받는다.
골수는 변환을 위한 HSC의 전통적인 공급원이었는데, 보다 최근의 연구 결과 말초혈 간 세포 또는 코드 (cord) 혈구는 동등하게 양호하거나 더 좋은 표적 세포가 될 수 있음을 시사하였다 (Cassel et al., 1993, Exp. Hematol. 21:585-591; Bregni et al., 1992, Blood 80:1418-1422; Lu et al., 1993, J. Exp. Med. 178:2089-2096).
추가의 항암 제제
본 발명의 접합체는 하나 또는 그 이상의 다른 활성 제제, 예컨대 하나 또는 그 이상의 세포 독성 약물과 조합하여 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명의 한 양태에 있어서, 방법은 추가로 다른 활성 약제학적 성분, 예컨대 세포 독성 약물을 접합체와 조합된 단위 용량 형태로 또는 별도의 단위 용량 형태로 투여하는 것을 포함한다. 그러한 별도의 세포독성 약물 단위 용량 형태로는 고체 경구, 고체 용액, 시럽, 엘릭서제, 주사용, 경피용, 경점막용, 또는 다른 단위용량 형태가 있다. 접합체 및 다른 활성 약제학적 성분은 하나의 단위 용량 형태로 조합되거나 또는 함께 또는 차례로 사용될 수 있는 별도의 단위 용량 형태로 공급될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 세포 독성 약물의 실예는 다음과 같다: 알킬화 약물, 예컨대 시클로포스파미드, 이포스파미드, 클로로암부실, 멜팔란, 부술판, 로무스틴, 카르무스틴, 클로로메틴 (무스틴), 에스트라무스틴, 트레오술판, 티오테파, 미토브로니톨; 세포독성 항체, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 아클라루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 미톡산트론 (미토잔트론), 블레오마이신, 닥티노아미신 및 미토마이신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트, 카페시타빈, 시타라빈, 플루다라빈, 클라드리빈, 젬시타빈, 플루오로우라실, 랄티트렉세드, 메르캅토푸린, 테라푸르 및 티오구아닌; 빈카 알카로이드, 예컨대 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 빈오랠빈, 및 에토포시드; 다른 신생 약물, 예컨대 암사크린, 알트레타민, 크리산타스파제, 다카르바진 및 테모졸로미드, 히드록시카바미드 (히드록시우레아), 펜토스타틴, 백금 화합물, 예컨대 카르보플라틴, 시스플라틴 및 오살리플라틴, 포르피머 나트륨, 프로카바진, 라족산, 탁산, 예컨대 도세탁셀 및 팔시탁셀, 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대 이리노테칸 및 노포테칸, 트라스투주마브, 및 트레티노인.
추가의 세포 독성 약물의 바람직한 실시예는 독소루비신, 멜팔란 또는 시스플라틴이다.
본 발명의 접합체는 또한 종양 세포 및 혈관의 투과성을 진단 목적의 화합물에 사용하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면 접합체는 종양의 방사선 면역 신티그래피 또는 방사선 요법에서 방사선 표지된 항체 또는 호르몬 (종양-이미지화 화합물)의 종양 흡수를 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.
도면 및 실시예
본 발명을 다음의 제한하지 않는 실시예 및 도면을 참조로 추가로 설명하기로 한다.
도 1. RMA-T 림프종 함유 동물의 종양 성장 및 체중에 대한 mTNF 및 NGR-mTNF의 효과
RMA-T 종양 함유 동물(그룹당 5마리 마우스)를 2개의 별도의 실험(실험 1 및 실험 2)에서 종양 이식한지 12일째(A) 또는 10, 11 및 12일째(B)에 NGR-mTNF 또는 mTNF를 사용하여 복막내 처리하였다. 처리한지 1 내지 4일 후에 실험 1(A) 및 실험 2(B)에서는 종양 체적을 나타내고 실험 1(C)에서는 동물 체중을 나타낸다. 패널 C에서 화살표는 처리 시간을 나타낸다.
도 2. 순환하는 sTNF-R2의 수준 및 NGR-mTNF 및 NGR-hTNF의 활성을 조절하는 이의 역할
패널 A: 다양한 투여량의 NGR-mTNF 또는 mTNF로 처리한지 1시한 후 B16F1 종양 함유 마우스에서 sTNF-R1과 sTNF-R2의 혈청 수준. 동물(그룹당 3마리의마우스)를 6일째에 처리한다.
패널 B: NGR-mTNF의 항종양 활성에 대한 항-sTNF-R2 mAb 6G1의 효과. MAb 6G1(100㎍)을 5일 및 8일째에 B16F1 종양 함유 동물에 투여한다. 1시간 후에 동물 각각을 정해진 용량의 NGR-mTNF로 처리하고 2시간 후에는 멜팔란(90㎍, 그룹당 5마리의 마우스)으로 처리한다.
패널 C: RMA-T 종양 성장에 대한 NGR-hTNF와 hTNF의 효과. 11일째에 다양한 용량의 각각의 시토킨으로 처리한다. N.S.:상당하지 않음(t-시험).
도 3. B16F1 흑색종 함유 마우스의 종양 성장(A-D) 및 체중(E-F)에 대한 단독(A)의 멜팔란 또는 NGR-mTNF(C) 또는 mTNF(D)와 배합된 멜팔란의 효과.
동물을 종양 이식한지 4일, 7일 및 9일째(화살표로 나타냄)에 약물 및 각각의 패널(그룹당 5마리)에서 정해진 용량으로 복막내 처리한다.
도 4. B16F1 흑색종 함유 마우스의 종양 성장(A,B), 체중(C,D) 및 생존(E)에 대한 다양한 용량의 단독(흰색 막대)의 독소루비신 또는 NGR-mTNF(검정 막대)와 배합된 독소루비신의 효과.
약물을 종양 이식한지 5일째에 동물(그룹당 5마리의 마우스, 복막내)에 투여한다.
도 5. NGR-mTNF 및 멜팔란의 공동상승작용 활성에서의 TNF 수용체의 역할
패널 A: B16F1 모델에서 NGR-mTNF와 배합된 멜팔란의 항종양 활성에 대한 mAb V1q(항 mTNF 중화 항체)의 효과. 약물을 5일째에 투여한다. Mab V1q 및 NGR-TNF를 예비 혼합하고 동물에게 주사하기 전에 1시간 동안 인큐베이팅하였다.
패널 B: 지정된 용량에서 NGR-hTNF와 배합된 멜팔란의 효과.
도 6. B16F1 및 RMA-T 종양에서 독소루비신 침투에 대한 NGR-mTNF의 효과.
패널 A: 100㎍/ml의 독소루비신으로 시험관내에서 인큐베이팅(30분, 37℃)된 B16F1 세포에 대한 밝은 영역(상부 패널) 및 형광(하부 패널) 현미경. Inset: 밝은 영역과 형광 이미지의 합성.
패널 B: 독소루비신으로 시험관내 처리 후 B16F1 형광 시그날의 안정성. B16F1 세포를 배양 배지에서 다양한 용량의 독소루비신과 함께 인큐베이팅(30분, 37℃)하고, 0.9% 염화나트륨으로 세척하고, 4% 포름알데하이드로 고정하였다. 세포를 이어서 4℃의 배양 배지에서 0 내지 24시간 동안 인큐베이팅하고 다시 세척하고 FACS로 분석하였다.
패널 C, F: 단독의 독소루비신(320㎍) 또는 NGR-mTNF와 배합된 독소루비신(0.1ng)을 시험관내 투여한지 2시간 후 B16F1(C) 또는 RMA-T(F) 종양으로부터 회수된 세포의 대표적인 FACS 분석. 점선은 양성인 것으로 사료되는 형광 간격을 나타낸다.
패널 D, G: 종양으로부터 회수된 B16F1(D) 또는 RMA-T(G)의 평균 ±SE 형광.
패널 E, H: B16F1(E) RMA-T(H) 종양으로부터 회수된 양성 세포의 평균 ±SE.
2개의 꼬리 t-시험에 의한 통계학적 분석, p<0.05(*).
도 7. 정상 혈관(CD13-음성) 및 종양 관련 혈관(CD13-양성)에서의 가용성 및 막 수용체와 저용량(A), 중간 용량(B) 및 고용량(C)의 NGR-TNF와의 가설적 상호작용에 대한 도식.
검정 화살표는 TNF 수용체 시그날 전달 또는 세포외 도메인 유출을 나타낸다.
도 8. RMA-T 함유 동물의 종양 성장(도 8A) 및 체중(도 8B)에 대한 RGD-TNF의 효과.
도 9. C57B6 마우스(도 9A 및 도 9C)에서 RMA 림프종 종양의 성장 및 동물 체중(도 9B)에 대한 IFNγ-NGR을 사용한 단일 치료(화살표)의 효과.
도 10. C57/BL6 마우스에서 RMA 종양에 대한 NGR-TNF 및 시스플라티눔의 효과.
실시예 1- 종양 세포주 및 시약
마우스 B16F1 흑색종 및 RMA-T 림프종 세포를 선행 문헌(14, 15)에 기재된 바와 같이 배양한다. Mab 6G1(래트 항-p75 mTNF 수용체 길항제)를 선행 문헌(16, 17)에 기재된 바와 같이 제조하고 특징을 밝힌다. Mab V1q(래트 항-mTNF)은 만넬 디 박사(Dr. D. Mannel: 독일 로젠버그 대학)가 친절히 제공해주었다. 멜팔란(Alkeran: 알케란)은 글락소-웰컴(Glaxo-Wellcome: 영국 런던)으로부터 구입하였다. 독소루비신(Adriblastine: 아드리블라스티나)은 파마샤-업죤(Pharmacia-Upjohn: 이탈리아 밀란)으로부터 구매하였다.
실시예 2- 사람 및 쥐 TNF 및 NGR-TNF의 제조
사람 및 쥐 TNF 및 NGR-TNF(CNGRCG의 C 말단과 융합된 TNF로 이루어짐)를 재조합 DNA 기술로 제조하고 문헌(14)에 기재된 바와 같이 이. 콜리 세포 추출물로부터 정제하였다. 크로마토그래피 단계에 사용되는 모든 용액은 멸균 및 내독소 부재 물(이탈리아 베르가모 살프)로 제조하였다. 단백질 농도는 시판되는 단백질 정량 분석 키트(Pierce, Rockford, IL)으로 측정한다. L-M 마우스 섬유아세포와 함께 표준 세포용해 분석으로부터 평가된 사람 TNF(hTNF)의 시험관내 세포용해 활성(18)은 5.4 x 107유니트/mg인 반면, 정제된 NGR-hTNF의 활성은 1.4 x 108유니트/mg이었다. 쥐 TNF(mTNF)의 세포용해 활성은 7.6 x 107유니트/mg인 반면, NGR-mTNF의 활성은 9.1 x 107유니트/mg이다. NGR-mTNF, NGR-hTNF 및 mTNF의 유체역학적 용적은 슈퍼덱스 75HR 칼럼(Pharmacia, Sweden)상에서 겔 여과 크로마토그래피로 측정한 결과 hTNF의 동종삼량체성 단백질(19) 용적과 유사하다. 각각의 생성물에 대한 전기분무 질량 분광기에 의해서 하기의 분자 질량을 측정하였다: NGR-hTNF, 17937.6±1.9Da(CNGRCG-hTNF1-157단량체로 예상됨, 17939.4Da); hTNF, 17349±1.3(hTNF1-157로 예상됨, 17350.7); NGR-mTNF,17841.16±2.5(CNGRCG-mTNF1-156로 예상됨, 17844.2), mTNF, 17384.9±2(Met-mTNF1-156로 예상됨, 17386.7). 정량 비색 리물루스 아모에보사이트 용해물(LAL) 시험(BioWhittaker)을 사용하여 측정된 생성물 각각의 내독소 함량은 다음과 같다: NGR-hTNF, 0.079 유니트/㎍; hTNF, 0.117 유니트/㎍; NGR-mTNF, 0.082 유니트/㎍; mTNF, 1.61유니트/㎍.
실시예 3- 생체내 연구
동물 모델에 관한 연구는 에티컬 컴미티 오브 더 샌 라파엘 에이취 사이언티픽 인스티튜트(Ethical Commitee of the San Raffaele H Scientific Institute)에 의해 승인되었고 규정된 지침에 따라 수행하였다. 체중이 16 내지 18g인 C57BL/6 마우스(Charles River Laboratories, Calco, Italy)의 왼쪽 대퇴부에 5 x 104RMA-T 또는 B16F1 생존 세포를 피하 주사하여 투여하고 4 내지 12일 후에, 마우스를 TNF 또는 NGR-TNF 용액(100㎕)로 처리한 다음 2시간 후에 멜팔란 또는 독소루비신 용액(100㎕)을 투여한다. 특정하지 않는 경우, 모든 약물은 복막내(i.p.)로 투여한다. 모든 약물은 100㎍/ml의 내독소 부재 사람 혈청 알부민(Farma-Biagini, Lucca, Italy)을 함유하는 0.9% 염화나트륨으로 희석하지만 독소루비신 만큼은 단독의 0.9% 염화나트륨으로 희석시킨다. 종양 성장은 선행 문헌(20)에 기재된 바와 같이 캘리퍼스로 종양을 측정하여 매일 조사한다. 동물은 종양이 직경 1.0 내지 1.5cm가 되기 전에 희생시킨다. 종양 크기는 평균 ±SE(그룹당 5마리의 동물)로서 나타낸다.
실시예 4- 가용성 TNF 수용체 검정
동물 혈청에서 가용성 p55-TNF 수용체(sTNF-R1) 및 가용성 p75-TNF 수용체( sTNF-R2)를 쿠안티킨 M 키트(Guantikine M kit: R & D Systems, Minneapolis, MN 55413)를 사용하여 측정한다.
실시예 5- 종양내 독소루비신의 검출
B16F1 또는 RMA-T 종양(직경 0.5 내지 1cm) 함유 C57/BL6 마우스를 NGR-m TNF(0.1ng, 복막내)의 존재 또는 부재하에 처리한 후 2시간 후에 독소루비신(320㎍, 복막내)으로 처리하였다. 2시간 후, 동물을 희생시키고 종양을 절개하였다. 각각의 종양의 무게를 측정하고 분해하고 냉 인산 완충 식염수(PBS)에 재현탁시키고 70㎛ 필터로 여과하였다. 세포를 냉 PBS(50ml)로 재현탁시키고 원심분리(1500rpm, 10분, 4℃)하고 냉 PBS(종양 조직 2.5ml/g)중에 재현탁시키고 8%의 포름알데하이드를 함유하는 새롭게 제조된 PBS(조직의 2.5ml/g)과 혼합하였다. 새포를 4℃에서 밤새 암실에서 저장한 다음 FACS로 분석하였다. FACScan(Becton-Dickinson)을 비처리된 종양으로부터 회수된 세포로 측정하였다. 각각의 샘플을 FL-3 필터 및 셀 퀘스트 소프트웨어(Cell Quest software)를 사용하여 분석하였다.
실시예 6- 쥐의 림프종 및 흑색종 모델에서 NGR-mTNF 및 mTNF의 용량 반응 곡선
NGR-mTNF 및 mTNF의 항종양 활성을 우선 화학치료 약물의 부재하에 특성화한다. NGR-mTNF와 mTNF의 용량 반응 곡선을 비교하기 위해, 본 발명자는 다양한 용량의 NGR-mTNF 및 mTNF(0.01 내지 10000ng)을 RMA-T 림프종 또는 B16F1 흑색종 함유 마우스에 1회 또는 반복 투여를 기준으로 여러 실험을 수행하였다. 쥐 TNF는 고용량(10000ng)(도 1A)으로 투여되는 경우 종양 성장을 지연시켰다. 1회 투여(도 1A) 또는 반복 투여(도 1B)로 100ng 미만의 투여량으로는 어떠한 효과도 유도되지 않았다. NGR-mTNF는 매우 보다 강력하였다. 이 경우에, 본 발명자는 심지어 0.01ng 정도로 낮은 용량에서도 항종양 효과를 관찰하였다(도 1A, B). 그러나, 용량 반응 곡선은 보다 복잡하였다. 예를 들어, 10ng의 효과는 놀랍게도 0.01 내지 0.1ng 및 1000-10000ng의 효과 보다 현저하게 낮았다. 벨형 용량 반응 곡선은RMA-T 모델에서 뿐만 아니라 B16F1 흑색종 모델(나타내지 않음)에서 수행된 여러 기타 실험에서 관찰되었다. 이들 결과는 1) 저용량의 NGR-mTNF 효능이 mTNF 용량보다 현저히 높고 2) 1 내지 10ng 초과의 NGR-mTNF의 용량은 이의 잠재적인 항종양 활성을 억제하는 음성 피드백 기작을 활성화시킴을 시사한다.
실시예 7- 피코그램 용량이 아니라 나노그램 용량의 NGR-TNF는 가용성 TNF 수용체 유출을 유도한다.
NGR-mTNF의 벨형 용량 반응 곡선에 관여하는 보호 기작을 조사하였다. 외인성으로 투여된 TNF는 생체내에서 가용성 TNF 수용체(sTNF-Rs) 유출을 유도하기 때문에(21) 본 발명자는 저효능의 10ng의 NGR-TNF가 sTNF-R1 및/또는 sTNF-R2의 유도와 관련되어 있어 결과적으로 막 수용체와의 상호작용을 중화시키는 것으로 가정하였다.
당해 가설을 시험하기 위해, 본 발명자는 다양한 용량의 mTNF 및 NGR-mTNF를 투여한지 1시간 후 수거된 종양 함유 마우스의 혈청에서 sTNF-R1 및 sTNF-R2의 수준을 측정하였다. 예상된 바와 같이, 2개의 생성물은 4ng 초과의 용량에서 sTNF-R1 유출이 아니라 sTNF-R2 유출을 유도하였다(도 2A).
sTNF-R2 유출이 NGR-mTNF의 활성을 조절하는지의 여부를 평가하기 위해, 본 발명자는 당해 시토킨을 mTNF와 가용성 및 막 쥐의 TNF-R2와의 결합을 방해하는 mAb 6G1인 길항제 항-sTNF-R2 항체와 동시 투여하였다(문헌참조: 16). 10ng의 NGR-mTNF의 항종양 활성을, sTNF-R2가 NGR-mTNF의 항 종양 효과를 억제하는 역할을 한다는 가정에 맞추어 mAb 6G1(도 2B)으로 강화시켰다.
당해 가설을 보다 뒷받침하기 위해, 사람 시토킨이 쥐의 sTNF-R2와 결합할 수 없다는 사실을 이용하여 본 발명자는 NGR-mTNF의 생체내 용량 반응 곡선과 NGR-hTNF의 곡선을 비교하였다(문헌참조: 22). 본 발명자는 NGR-hTNF의 용량 반응 곡선이 벨형이 아니고 10ng의 NGR-hTNF가 1ng 만큼 활성임을 밝혔다(도 2C). 또한, 1ng이 최대 항종양 효과를 유도하는데 충분함이 명백해졌다. 이것은 혈관상의 수용체 결합이 NGR-hTNF의 매우 낮은 혈액 농도로 성취될 수 있음을 시사하는 것일 수 있다.
이를 종합하여, 이들 실험의 결과는 4ng 초과의 용량에서 NGR-mTNF와 mTNF가 이들의 항 종양 활성을 억제하기에 충분한 양으로 sTNF-R2의 유출을 유도함을 강하게 시사하는 것이다.
실시예 8- NGR-mTNF의 피코그램 용량은 멜팔란 및 독소루비신의 치료학적 효과를 증진시키는데 충분하다.
본 발명자는 이어서, 저용량의 NGR-mTNF의 종양 혈관으로의 표적 전달이 화학치료 약물의 항종양 활성을 증진시키는지의 여부를 조사하였다. 이들 실험은 멜팔란에 대한 희박한 면역원성 및 낮은 민감성을 특징으로 하는 B16F1 모델인 자발적 마우스 흑색종에서 수행한다. 멜팔란(90㎍)은 단독으로 주사되는 경우 종양 성장에 영향을 미칠 수 없다(도 3A). 유사하게, mTNF(0.1ng 단독, 복막내)는 실질적으로 불활성인 반면, 동일 용량의 NGR-mTNF는 대부분 종양 성장을 지연시켰다(도 3B 상부 패널). 멜팔란을 0.1ng의 NGR-mTNF와 배합하면 단일의 시약보다 강한 항종양 효과를 나타내어, 상승효과를 나타내었다(도 3C). 현저하게, 0.1ng의 NGR-mTNF와 멜팔란의 배합은 5000ng의 mTNF와의 배합 보다 효과적이다(도 3C-D). 본 발명자는 심지어 NGR-mTNF(0.1ng)이 정맥내 주사되는 경우(나타내지 않음) 상승작용을 관찰하였다.
2개의 유사한 실험은 B16F1 모델에서 독소루비신으로 수행하였다. 동물은 종양 이식한지 5일 후에 NGR-mTNR의 존재 또는 부재하에 처리하고 2시간 후 다양한 용량의 독소루비신(20 내지 320㎍, 복막내)으로 처리하였다. 2개의 실험에서, 독소루비신 + NGR-mTNF의 효과는 단독의 독소루비신의 효과 보다 강하였고(도 4A, B, E) 이것은 NGR-mTNF가 당해 약물의 효능을 상당히 개선시킴을 나타낸다. 예를 들어, 독소루비신(40㎍) + NGR-mTNF(0.1ng)의 효과는 단독의 독소루비신 320㎍의 효과 보다 강한 반면(도 4B), 독소루비신(20㎍) + NGR-mTNF의 효과는 낮았다(도 4A). 이들 결과로부터, 본 발명자는 독소루비신의 활성이 NGR-mTNF에 의해 8 내지 10배 강화된 것으로 평가한다.
결론적으로 이들 결과는 피코그램 용량의 NGR-TNF가 멜팔란 및 독소루비신 둘다에 대한 종양이 반응을 충분히 개선시킴을 시사한다.
실시예 9- 저용량의 NGR-mTNF는 독성이 아니고 멜팔란의 독성을 증가시키지 않는다.
처리 각각의 효능/독성 비를 평가하기 위해, 본 발명자는 처리 후 동물 체중 및 동물 생존을 조사하였다. mTNF(10000ng)의 치료학적 용량은 RMA-T 함유 동물에서 상당한 체중 감소를 유도하지만(도 1C, 왼쪽), NGR-mTNF(0.01 내지 1ng)의 치료학적 용량은 체중 감소를 유도하지 않았다(도 1C 오른쪽). 더욱이, NGR-mTNF나mTNF(각각 1ng)은 RNA-T 종양 함유 마우스에서 멜팔란 200㎍의 치사량을 증가시키지 않았다(표 1).
종양 함유 마우스a에서 멜팔란(고용량)의 독성에 대한 mTNF 및 NGR-mTNF의 효과
처리 처리 3일 후 생존 마우스 수
무처리 5/5(100%)
멜팔란 7/10(70%)
멜팔란 + mTNF 8/10(80%)
멜팔란 + NGR-mTNF 8/10(80%)
a11일된 종양 함유 C57BL6 마우스는 1ng의 NGR-mTNF 또는 mTNF로 처리(복막내)하였고 2시간 후 200㎍의 멜팔란으로 처리하였다
B16F1 모델에서, NGR-mTNF(0.1ng)의 치료학적 용량은 심지어 멜팔란과 배합되는 경우에도 체중 감소를 유도하지 않았다(도 3E). 대조적으로, 치료학적 용량의 mTNF(5㎍)와 배합된 멜팔란은 체중 감소를 상당히 유도하였다(도 3F). 추가로, NGR-mTNF(0.1ng)은 고용량의 독소루비신에 의해 유발되는 체중 감소를 증가시키지 않았다(도 4C 내지 D).
이들 결과는 피코그램 용량의 NGR-mTNF가 종양의 반응을 멜팔란과 독소루비신으로 증가시키면서 독성이 증가하였다는 증거는 없음을 시사한다.
실시예 10- TNF-R1 활성화는 NGR-TNF 및 화학치료 약물간의 상승작용에 필요하고 충분하다.
이어서 저용량의 NGR-mTNF와 화학 치료간의 상승작용 기작을 조사하였다.
이들 기작이 TNF-Rs 활성화에 의존하는 지를 검정하기 위해서, 본 발명자는 멜팔란(90㎍)과 배합된 NGR-mTNF의 항종양 활성에 대한 mAbV1q, 즉, 중화 항 mTNF항체의 효과를 시험하였다. MAb V1q는 B16F1 모델(도 5A)에서 이들 약물의 항종양 활성을 적어도 부분적으로 억제하였다. 이것은 TNF 잔기와 TNF-Rs간의 상호작용이 접합체의 활성에 중요함을 시사한다.
이어서 TNF-R1과 TNF-R2의 역할을 연구하였다. 결국, 본 발명자는 0.01ng 또는 0.1ng의 NGR-hTNF, TNF-R1 특이적 효능제과 배합된 멜팔란의 효과를 평가하였다(문헌참조: 22). B16F1 모델에서 멜팔란의 효과는 NGR-hTNF에 의해 강화되었고(도 5B) 이것은 TNF-R1 활성화가 상승작용에 충분함을 시사한다.
실시예 11- NGR-TNF와 화학치료간의 상승작용은 종양 세포 세포독성에 의존하지 않는다.
공동상승작용이 종양 세포에 대한 세포독성에 직접적으로 의존하는지를 평가하기 위해, 본 발명자는 단독의 각각의 화합물의 효과 또는 배합된 효과를 배양된 B16F1 세포에 대해 측정하였다. 단독의 또는 배합된 멜팔란 또는 NGR-mTNF은 시험관내 분석(나타내지 않음)에서 48시간 후 이들 세포를 사멸시키지 못했다. 유사하게, NGR-mTNF는 시험관내 독소루비신의 세포독성 활성을 증진시키지 못했다(나타내지 않음). 이들 결과는 생체내 관찰된 상승작용이 종양 세포에 대한 세포독성 효과에 직접적으로 의존하지 않고 종양 스트로마, 예를 들어, 종양 혈관의 상피 배열의 성분의 간접적인 역할과 관련되어 있음을 시사한다.
실시예 12- NGR-TNF는 쥐의 흑색종 및 림프종에서 독소루비신의 침투를 증가시킨다.
이어서 본 발명자는 NGR-mTNF가 종양에서 화학치료 약물의 침투를 증가시킬수 있는지를 조사하였다. 이러한 목적을 위해 본 발명자는 약물의 형광 특성을 사용하여 투여한지 2시간 후에 B16F1 및 RMA-T 종양을 침투하는 독소루비신의 양을 측정하였다(문헌참조: 23). 예비 실험은 B16F1 세포의 핵이 이들 세포가 시험관내에 독소루비신에 노출되는 경우 형광성이 됨을 보여주었다(도 6A). 세포가 포름알데하이드로 고정되고 4℃에서 유지되는 경우 FACS에 의해 측정되는 바와 같이 형광 시그날은 용량 의존성이고 24시간 이상동안 안정하다(도 6B). 따라서, 처리후 동물로부터 회수된 종양 세포의 형광 강도는 종양을 침투하는 독소루비신의 양을 나타낸다. 본 발명자는 독소루비신이 투여되기 2시간 전에 투여된 0.1ng의 NGR-mTNF는 처리한지 2시간 후 B16F1 및 RMA-T 종양으로부터 회수된 양성 세포의 형광 강도 및 백분율을 증가시켰슴을 관찰하였다(2 내지 5배, 도 6C-H). 이것은 NGR-mTNF가 세포내 약물의 양 뿐만 아니라 독소루비신이 도달하는 세포 수를 증가시킴을 시사한다.
실시예 13- 종양에 대한 RGD-TNF의 효과
RMA-T 종양 함유 C57/BL6 마우스(그룹당 5마리의 마우스)를 단독의 멜팔란 또는 RGD-TNF 또는 TGF-TNF와 배합된 멜팔란으로 복강내 처리하였다. 종양 용적에 대한 효과는 도 8A에 나타내고 동물 체중에 대한 효과는 도 8B에 나타내었다. 이들 결과는 RGD-TNF가 또한 피코그램 범위에서 활성임을 입증한다.
실시예 14- 종양에 대한 IFNγ-NGR의 효과
RMA 림프종 종양 함유 C57/BL6 마우스를 IFNγ(3ng) 또는 IFNγ-NGR(3ng)의 존재 또는 부재하에 처리하였다. 21일 후에 동물을 희생시켰다. 종양 용적 및 동물 체중의 감량에 대한 결과는 도 9A 및 도 9B에 나타낼 수 있다. 추가로, RMA 림프종 종양 함유 C57/BL6 마우스는 IFNγ(3ng), IFNγ-NGR(3ng), IFNγ-NGR(3ng) + 항-CD13 R3-63 mAb(25㎍) 또는 IFNγ-NGR(3ng) + mAB 19E12(50㎍)의 존재 또는 부재하에 처리하였다. mAB 19E12는 실험에서 음성 대조군으로서 사용되는 관련없는 IgG이다. 당해 결과는 IFNγ-NGR이 피코그램 범위에서 활성임을 입증한다.
실시예 15- NGR-TNF의 피코그램 용량은 시스플라티넘의 치료학적 효과를 증진시키기에 충분하다.
본 발명자는 저용량의 NGR-TNF의 종양 혈관으로의 표적화 전달은 항 암 약물, 시스플라티넘의 항 종양 활성을 증진시킬 수 있음을 조사하였다. 이들 실험은 초기 8주령의 RMA-T 종양 함유 C57/BL6.N 마우스에서 수행하였다. 마우스는 시스플라티넘 또는 NGR-mTNF의 존재 또는 부재하에 10일째에 처리한다. 당해 결과는 도 10에 나타낸다. 당해 도면에서, Cys=시스플라티노 테바 용액 0.5mg/ml; NGR=NGR-mTNF. 희석제는 NaCl 0.9%에서 HAS 100mg/ml이다. 당해 결과는 피코그램 용량의 NGR-TNF은 시스플라티넘의 치료학적 효가를 증진시키기에 충분함을 시사한다.
이점의 요약
혈관 투과성 및 간질 압력의 변화, 내피 세포 손상 및 섬유소 침적은 단독으로 또는 화학치료 약물과 배합된 TNF의 항종양 활성에 중요한 기작이다. 동물 또는 환자에게 주입한 후 TNF는 또한 이들 효과의 대부분을 중화시키는 음성 피드백 기작을 유도할 수 있다. 예를 들어, 중간 정도의 용량에서도 TNF는 막 수용체와의상호작용을 차단할 수 있는 가용성 p55 및 p75 TNF 수용체의 방출을 유도한다[문헌참조: 21, 24]. 당해 가용성 억제제가 당해 시토킨의 해로운 효과로부터 신체를 보호할 수 있지만, 이들은 또한 이의 항종양 활성을 차단시킬 수 있고 부분적으로 효과적인 치료를 위해 고용량의 TNF가 요구됨을 설명할 수 있다. 이러한 연구에서, 본 발명자는 저용량의 TNF의 종양 혈관으로의 투입이 음성 피드백 기작 뿐만 아니라 독성 반응을 회피하기 위한 새로운 전략이고 화학치료와의 공동상승작용을 보존하는 것으로 주장하였다. 이러한 가설을 입증하기 위해, 본 발명자는 피하 RMA-T 림프종 및 B16F1 흑색종 종양을 기준으로 2마리의 쥐의 모델에서 피코그램에서 마이크로그램의 양에 이르는 고용량 및 저용량의 NGR-mTNF 및 mTNF의 항종양 활성을 조사하였다. 당해 연구는 단독의 또는 멜팔란 또는 독소루비신과 배합된 이들 시토킨을 사용하여 수행하였다. mTNF는 실질적으로 100 내지 1000ng 미만의 저용량에서 비활성인 반면, 본 발명자는 심지어 단독의 NGR-mTNF도 0.01 내지 0.1ng 정도의 낮은 용량으로 항종양 효과를 유도할 수 있음을 밝혔다. mTNF와 NGR-mTNF의 LD50값은 유사하고 RMA-T 종양 함유 마우스(14)에서 약 50,000ng에 상응하기 때문에 이들 결과는 NGR-mTNF의 효능/독성 비가 mTNF보다 104내지 105배 높음을 지적한다.
종양 함유 동물에 소량의 NGR-mTNF(0.1ng)의 투여는 처리 후 종양 질량 감소, 동물 생존 및 체중 감소에 의해 판단되는 바와 같이, 독성이 증가되었다는 증거없이 멜팔란과 독소루비신의 항종양 활성을 강화시켰다. 이것은 NGR-mTNF가 이들 약물의 치료학적 지수를 개선시킴을 시사한다. 5 x 104배 초과 용량의 mTNF가 체중을 현저히 감소시키는, 견줄만한 수준으로 멜팔란의 효과를 증진시키기 위해 필요하다는 것은 주목할만 하다.
실질적으로 B16F1 모델에서 불활성인 용량에서 멜팔란 및 독소루비신 둘다가 NGR-mTNF와 배합되는 경우 종양 성장을 감소시킨다는 사실은 이들 약물이 상승작용적으로 작용함을 시사한다. 당해 작용 기작에 대한 연구는 상승작용이 간질 세포, 가장 바람직하게는 내피 세포상에서 NGR-mTNF와 TNF-R1과의 상호작용에 의존하고 종양 세포에는 훨씬 덜 의존함을 보여준다. 추가로, 본 발명자는 NGR-mTNF를 사용한 혈관 표적화가 종양내 세포독성 약물 침투를 개선시킴을 밝혔다. 주목할만하게, NGR-mTNF는 세포내 약물의 양 뿐만 아니라 2시간 후 독소루비신이 도달할 수 있는 암 세포의 % 둘다를 증가시켰고 이것은 NGR-TNF가 약물 침투 장벽을 변화시킬 수 있음을 시사한다. 이전의 연구는 TNF가 신속하게 내피 침투력을 증가시킬 수 있고(문헌참조 25, 26) 종양에서 약물 침투에 대한 중요한 장벽이 될 것으로 사료되는(문헌참조: 1) 장내 유체 압력(문헌참조: 8)일 수 있다. 능히, 이들 기작은 종양 혈관 벽 및 간질을 통해 약물의 전달 수송을 증가시켜 최종적으로 종양 세포에 의한 약물 흡수를 증가시킨다. 투여 시기는 TNF가 또한 혈관내 응집(문헌참조:27)을 유도하여 혈관 폐색 및 종양 관류의 감소를 유도함으로써 당해 기작을 위해 상당히 중요하다. 이러한 관점에 따라, 본 발명자는 멜팔란의 효과가 이의 약물이 6시간 후 보다(데이타는 나타내지 않음) NGR-TNF 2시간 후에 투여된다.
혈관 표적화가 일반적으로 TNF 치료법과 연합되어 음성 피드백 기작을 회피할 수 있다는 가설은 피코그램 용량의 NGR-mTNF가 가용성 수용체 유출을 유도하지 않으면서 NGR-mTNF와 mTNF 둘다가 4 내지 10ng 초과의 용량에서 혈류로 신속하게 sTNF-R2의 방출을 유도한다는 관찰에 의해서 지지된다. 이들 수준의 sTNF-R2는 10ng의 NGR-mTNF의 항 종양 활성 대부분을 억제하였고 10ng이 0.1ng보다 덜 활성이라는 역설적 관찰을 설명할 수 있다. 마찬가지로, 대부분의 주사된 분자는 sTNF-Rs에 의해 신속하게 복합체화되고 이의 활성은 차단된다.
저용량의 NGR-mTNF와 종양 혈관과의 선택적 상호작용을 뒷받침하는 분자 기작은 부분적으로 설명되었다. 본 발명자는 최근에 상이한 CD13 이소형이 상피 및 골수 세포에서 종양 관련된 혈관에서 발현됨을 밝혔고 NGR-TNF의 NGR 도메인이 종양 혈관과 연관된 CD13 이소형을 선택적으로 인지한다는 것을 밝혔다(28). 본 발명자는 따라서, 저혈류량의 NGR-mTNF는 CD13 및 TNF-Rs 둘다를 포함하는 고가의 다가 결합 때문에 CD13-양성 내피 세포와 신속하게 상호작용할 수 있고 낮은 결합력 때문에 정상의 혈관의 CD13-음성 내피 세포와 거의 또는 전혀 반응하지 않는다고 가설한다. 이들 기술적 개념의 도식 및 가용성 및 막 수용체와의 NGR-TNF의 추정적 상호작용에 대한 도식은 도 7에 나타낸다.
본 발명자는 또한 RGD-TNF 및 IFNγ-NGR이 피코그램 범위에서 활성임을 밝혔다. 본 발명자는 또한 NGR-TNF가 시스플라티넘의 효과를 증가시킴을 밝혔다.
결론적으로, 본 발명자는 피코그램 용량의 시토킨의 종양 혈관으로의 표적화된 전달이 가용성 수용체 유출을 유도하지 않으면서 마우스에서 화학치료 약물의항종양 활성을 증진시킴을 밝혔다. CNGRC 모티프가 쥐 뿐만 아니라 사람 종양 연관 혈관(문헌참조: 29)을 표적화할 것으로 예상되는 경우, 본 발명자의 결과는 항암 약물과 저용량의 표적화된 시토킨의 배합이 사람 환자에서 이들의 치료학적 지수를 증가시킬 수 있음을 시사한다.
상기 명세서에 언급된 모든 문헌들은 참조 문헌으로 본원에 인용한다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 여러가지 변형 및 수정이 본 발명의 범주 및 사상을 벗어남이 없이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명을 구체적인 바람직한 양태와 관련하여 기술하였지만 청구된 발명이 이러한 구체적인 실시예로 부당하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해하여야 할 것이다. 또한, 분자 생물학 또는 관련 분야의 숙련가에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방법의 여러가지 변형은 하기 청구범위 범주내에서 이루어지도록 한다.
참조문헌
1. Jain, R. K. 1994. Sci Am. 271: 58-65.
2. Lienard, D. , et al. 1992J ; Clin. Oncol. 10: 52-60.
3. Eggermont, A. M. , et al. 1996.J. Clin.Oncol. 14: 2653-2665.
4. Lejeune, F. J. 1995. Eur.J Cancer. 31A: 1009-1016.
5. Fraker, D. L. , et al. 1996.J Clin. Oncol. 14: 479-489.
6. Rossi, C. R. , et al. 1999. Cancer. 86: 1742-1749.
7. van der Veen, A. H. , et al. 2000. Br. J. Cancer. 82: 973-980.
8. Kristensen, C. A. , et al. 1996. Br.J. Cancer. 74: 533-536.
9. Suzuki, S. , et al. 1990. Int. J. Cancer. 46: 1095-1100.
10. de Wilt, J. H. , et al. 2000. Br.J Cancer. 82: 1000-1003.
11. Fiers, W. 1995. Biologic therapy with TNF: preclinical studies. In Biologic therapy of cancer: principles and practice. V. De Vita, S.Hellman, and S. Rosenberg, editors. J. B. Lippincott Company, Philadelphia. 295-327.
12. Fraker, D. L. , H. R. Alexander, and H. I. Pass. 1995. Biologic therapy with TNF: systemic administration and isolation-perfusion. In Biologic therapy of cancer: principles and practice. V. De Vita, S. Hellman and S. Rosenberg, editors. J. B. Lippincott Company, Philadelphia 329-345.
13. Corti, A. , and F. Marcucci. 1998. J. Drug Targ. 5: 403-413.
14. Curnis, F., Aet al.2000.Nat. Biotechnol. 18: 1185-1190.
15. Moro, M. , et al. 1997.CancerRes. 57: 1922-1928.
16. Corti, A. , et al. 1999. Infect Immun. 67: 5762-5767.
17. Pelagi, M. , et al. 2000. Eur. Cytokine Net. 11: 580-588.
18. Corti, A. , et al. 1994.J. Immunol. Meth. 177: 191-198.
19. Smith, R. A. , and C. Baglioni. 1987. J. Biol. Chem. 262: 6951-6954.
20. Gasparri, A. , et al. 1999. Cancer Res. 59: 2917-2923.
21. Aderka, D. , et al. 1998. J. Clin. Invest. 101:650-659.
22. Tartaglia, L. A. , et al. 1991.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 9292-9296.
23. Luk, C. K. , andI. F. Tannock. 1989. J.Natl. Cancer Inst. 81: 55-59.
24. Sella, A. , et al. 1995. Cancer Biother. 10: 225-235.
25. Brett, J. , et al. 1989.J. Exp. Med. 169: 1977-1991.
26. Goldblum, S. E. , and W. L. Sun. 1990. Am.J.Physiol. 258: L57-67.
27. Clauss, M., et al. 1992. Modulation of endothelial cell hemostatic properties by TNF: insights into the role of endothelium in the host response to inflammatory stimuli. In Tumour necrosis factors: the molecules and their emerging roles in medicine. B. Beutler, editor, Raven Press, New York. 49-63.
28. Cumis, F. , et al. 2002. CancerRes. : 62 : 867-874.
29. Arap, W., et al. 1998. Science. 279: 377-380.

Claims (25)

  1. 시토킨과 종양 표적화 잔기(TTM)의 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 시토킨이 네거티브 피드백 메카니즘을 유발하지 않는 양으로 존재하는 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 시토킨이 가용성 시토킨 수용체 유출을 유발하지 않는 양으로 존재함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 접합체가 0.5 내지 500 ng/kg 범위의 용량을 제공하는 양으로 존재함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 접합체가 1 내지 50 ng/kg 범위의 용량을 제공하는 양으로 존재함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 접합체가 5 내지 15 ng/kg 범위의 용량을 제공하는 양으로 존재함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 접합체가, 접합체 또는 이의 대사산물이, 치료할 환자의 혈액 혈장에, 환자 70kg에 대해 약 35,000 ng/일 이하의 양으로 제공되도록 하는 양으로 존재함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 시토킨이 염증성 시토킨임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 시토킨이 화학요법상 시토킨임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 시토킨이 TNFα, TNFβ, IFNα, IFNβ, IFNγ,IL-1, 2, 4, 6, 12, 15, EMAP II, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), PDGF, PD-ECGF 또는 케모킨임을 특징으로 하는 약제학적 조성물
  10. 제9항에 있어서, 시토킨이 TNF-α, TNF-β 또는 IFN-γ임을 특징으로 하는 약제학적 조성물,
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, TTM이 종양 혈관 표적 잔기(TVTM)임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, TTM이 종양 혈관계 수용체, 마커 또는 기타 세포외 성분의 결합 파트너임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, TTM이 종양 수용체, 마커 또는 기타 세포외 성분의 결합 파트너임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, TTM이 항체 또는 리간드, 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, TTM이 NGR 또는 RGD 모티프 를 함유하거나, HIV-tat, 아넥신 V, 오스테오폰틴, 피브로넥틴, 콜라겐 타입 I 또는 IV, 히알루론산염 또는 에프린이거나, 종양태아성 피브로넥틴의 결합 파트너; 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, TTM이 NGR 모티프를 함유함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, TTM이 CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, 사이클로CVLNGRMEC, 선형 또는 사이클릭 CNGRC를 함유함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  18. 제15항에 있어서, TTM이 NGR 모티프를 함유함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  19. 제14항에 있어서, TTM이 VEGFR, ICAM 1, 2 또는 3, PECAM-1, CD31, CD13, VCAM-1, 셀렉틴, Act RII, ActRIIB, ActRI, ActRIB, CD44, 아미노펩티다제 A, 아미노펩티다제 N(CD13), αvβ3 인테그린, αvβ5 인테그린, FGF-1, 2, 3, 또는 4, IL-1R, EPHR, MMP, NG2, 테나신, 종양태아성 피브로넥틴, PD-ECGFR, TNFR, PDGFR 또는 PSMA에 표적됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항중의 어느 한 항에 있어서, 접합체가 융합 단백질 형태임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제19항중의 어느 한 항에 있어서, 접합체가 핵산 단백질 형태임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 다른 항종양제 또는 진단적 종양 영상화 화합물을 추가로 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 추가의 항종양제가 독소루비신, 멜팔란 또는 시스플라틴임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  24. 암 치료 또는 진단용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제23항에서 정의된 접합체 또는 제1항 내지 제23항에 따르는 약제학적 조성물의 용도.
  25. 네거티브 피드백 메카니즘을 유발하지 않는 유효량의 제1항 내지 제23항에서 정의된 접합체 또는 제1항 내지 제23항에 따르는 약제학적 조성물을 암 치료 또는 진단이 필요한 환자에게 투여함을 포함하는 암의 치료 또는 진단 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100835879B1 (ko) * 2006-10-10 2008-06-09 학교법인 한림대학교 아넥신 융합 단백질

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA011859B9 (ru) * 2004-01-05 2013-07-30 Емд Лексиген Ресерч Сентер Корп. Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени
CN101124243A (zh) * 2004-12-23 2008-02-13 莫尔梅德股份有限公司 缀合产物
US7723472B2 (en) * 2005-02-28 2010-05-25 The Regents Of The University Of California Extracellular matrix binding chimeric proteins and methods of use thereof
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
GB0708864D0 (en) * 2007-05-08 2007-06-13 Molmed Spa Cytokine Conjugate
WO2009001219A2 (en) * 2007-06-28 2008-12-31 Philogen S.P.A Immunocytokines for cancer treatment in combination with chemotherapeutic agents
EP3783019A1 (en) * 2007-10-30 2021-02-24 Philogen S.p.A. An antigen associated with rheumatoid arthritis
GB0803076D0 (en) * 2008-02-20 2008-03-26 Univ Ghent Mucosal Membrane Receptor and uses thereof
DK2297304T3 (da) * 2008-05-07 2017-11-06 Bone Therapeutics Sa Humane knogledannende celler til behandling af tilstande og knoglesygdomme forbundet med immunodefekt eller immunsuppression
EA201791940A3 (ru) 2008-11-26 2018-04-30 Амген Инк. Варианты полипептидов рецептора iib активина и их использование
WO2010078916A1 (en) * 2008-12-19 2010-07-15 Philogen S.P.A. Immunocytokines for tumour therapy with chemotherapeutic agents
WO2011027980A2 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University Tumor cell-killing peptides
US20150359850A1 (en) 2009-11-25 2015-12-17 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an anti-activin-a compound to a subject
SG10201605027XA (en) 2011-12-19 2016-08-30 Amgen Inc Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
CA2873112A1 (en) * 2012-05-11 2013-11-14 Alexander Krantz Site-specific labeling and targeted delivery of proteins for the treatment of cancer
EP2903629B1 (en) 2012-10-03 2019-07-10 Philogen S.p.A. Antibody conjugate for use in treating inflammatory bowel disease
TWI602577B (zh) * 2015-08-27 2017-10-21 國立陽明大學 雙重標靶融合蛋白
CN105622759A (zh) * 2016-01-04 2016-06-01 深圳精准医疗科技有限公司 IL-12/CD107a融合蛋白增强CTL抗肿瘤效果的治疗剂及其制法和用途
WO2017194782A2 (en) * 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Therapeutic targeting of non-cellular structures
WO2018067879A1 (en) * 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Alk4:actriib heteromultimers and uses thereof
EP3886913A4 (en) * 2018-11-30 2023-01-11 Prism | Proteogenomics Research Institute for Systems Medicine IMPROVED TARGETED DELIVERY OF THERAPEUTICS
CN117683140A (zh) * 2022-09-09 2024-03-12 北京昌平实验室 肿瘤靶向的以白介素2为活性成分的融合蛋白型药物前体

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2005A (en) * 1841-03-16 Improvement in the manner of constructing molds for casting butt-hinges
US2006A (en) * 1841-03-16 Clamp for crimping leather
US4578079A (en) * 1982-08-04 1986-03-25 La Jolla Cancer Research Foundation Tetrapeptide
DE3423234A1 (de) 1984-06-23 1986-02-06 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Synergistische mischungen von interferonen und tumor-nekrose-faktor
US4650674A (en) 1984-07-05 1987-03-17 Genentech, Inc. Synergistic cytotoxic composition
US4988621A (en) * 1985-05-24 1991-01-29 La Jolla Cancer Research Foundation Peptides in cell detachment and aggregation
US4879237A (en) * 1985-05-24 1989-11-07 La Jolla Cancer Research Foundation Use of peptides in control of cell attachment and detachment
US5547936A (en) * 1985-06-17 1996-08-20 La Jolla Cancer Research Foundation Inhibition of cell migration with synthetic peptides
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4863713A (en) 1986-06-23 1989-09-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. Univ. Method and system for administering therapeutic and diagnostic agents
DE3716513A1 (de) * 1987-05-16 1988-11-24 Basf Ag Proteine mit tnf-wirkung
US5214131A (en) * 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
US5091176A (en) * 1988-11-02 1992-02-25 W. R. Grace & Co.-Conn. Polymer-modified peptide drugs having enhanced biological and pharmacological activities
AU5342290A (en) 1989-03-15 1990-10-09 David R. Kaplan Cd8-based pharmaceuticals
US5120829A (en) * 1989-03-20 1992-06-09 La Jolla Cancer Research Foundation Hydrophobic attachment site for adhesion peptides
IE63847B1 (en) * 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5498694A (en) * 1989-05-25 1996-03-12 La Jolla Cancer Research Foundation Peptides of the cytoplasmic domain of integrin
US5169930A (en) * 1990-01-05 1992-12-08 La Jolla Cancer Research Foundation Fibronectin receptor
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5672585A (en) * 1990-04-06 1997-09-30 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating thrombosis
US5612311A (en) * 1990-04-06 1997-03-18 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating thrombosis
US5648330A (en) * 1990-04-06 1997-07-15 La Jolla Cancer Research Foundation Method and composition for treating vascular graft occlusion
AU660297B2 (en) * 1990-11-09 1995-06-22 Stephen D. Gillies Cytokine immunoconjugates
US5650150A (en) * 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
IT1245748B (it) 1990-12-21 1994-10-14 Mini Ricerca Scient Tecnolog Preparazione includente anticorpi monoclonali biotinilati, avidina e biotina, per la diagnosi di affezioni tumorali e suo impiego
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5811512A (en) * 1991-08-22 1998-09-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Non-peptide peptidomimetics and related cyclic hexapeptides
US5258517A (en) 1992-08-06 1993-11-02 Sepracor, Inc. Method of preparing optically pure precursors of paroxetine
US5536814A (en) * 1993-09-27 1996-07-16 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
WO1995015979A1 (en) 1993-12-07 1995-06-15 Neorx Corporation Pretargeting methods and compounds
JP2820016B2 (ja) 1993-12-28 1998-11-05 日本電気株式会社 電子回路
US5580853A (en) 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5888814A (en) 1994-06-06 1999-03-30 Chiron Corporation Recombinant host cells encoding TNF proteins
AU3374795A (en) * 1994-08-29 1996-03-22 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of vascular endothelial growth factor with targeted agents
EP0833665A1 (en) 1995-05-16 1998-04-08 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Compositions containing nucleic acids and ligands for therapeutic treatment
US5811388A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Cibus Pharmaceutical, Inc. Delivery of drugs to the lower GI tract
US5891418A (en) * 1995-06-07 1999-04-06 Rhomed Incorporated Peptide-metal ion pharmaceutical constructs and applications
US5817750A (en) 1995-08-28 1998-10-06 La Jolla Cancer Research Foundation Structural mimics of RGD-binding sites
UY24367A1 (es) 1995-11-23 2000-10-31 Boehringer Ingelheim Int Vacunas contra tumores y procedimiento para su produccion
WO1998010795A2 (en) 1996-09-10 1998-03-19 The Burnham Institute Tumor homing molecules, conjugates derived therefrom, and methods of using same
US6576239B1 (en) 1996-09-10 2003-06-10 The Burnham Institute Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom
US6759509B1 (en) * 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US6180084B1 (en) * 1998-08-25 2001-01-30 The Burnham Institute NGR receptor and methods of identifying tumor homing molecules that home to angiogenic vasculature using same
EP1015884B1 (en) 1997-09-10 2008-08-06 The Burnham Institute Methods of identifying molecules that home to angiogenic vasculature in tumors
WO2000009143A1 (en) * 1998-08-13 2000-02-24 G.D. Searle & Co. Multivalent avb3 and metastasis-associated receptor ligands
DK1156823T3 (da) * 1999-02-12 2009-01-19 Scripps Research Inst Fremgangsmåder til behandling af tumorer og metastaser ved anvendelse af en kombination af anti-angiogene terapier og immunoterapier
US7309694B2 (en) * 2000-02-15 2007-12-18 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
US7109303B2 (en) 2000-02-15 2006-09-19 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
IT1317835B1 (it) * 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.
AU2001239470A1 (en) * 2000-02-24 2001-09-03 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
EP1297112A2 (en) * 2000-05-22 2003-04-02 PHARMACIA &amp; UPJOHN COMPANY Novel matrix metalloproteinases
CA2414650A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Isolation of a cell-specific internalizing peptide that infiltrates tumor tissue for targeted drug delivery
EP1217070A1 (en) 2000-12-22 2002-06-26 CellGenix Technologie Transfer GmbH Selective cytotoxic fusion proteins
US20030077818A1 (en) * 2001-03-08 2003-04-24 Dickerson Erin B. Compositions and methods for targeting interleukin-12 to malignant endothelium
US20040110933A1 (en) * 2002-09-13 2004-06-10 Dyax Corporation CD44-binding ligands

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100835879B1 (ko) * 2006-10-10 2008-06-09 학교법인 한림대학교 아넥신 융합 단백질

Also Published As

Publication number Publication date
IL164896A0 (en) 2005-12-18
DK1499730T3 (da) 2014-01-13
US20160074537A1 (en) 2016-03-17
NO20045237L (no) 2005-01-28
WO2003093478A9 (en) 2004-12-09
CA2462879A1 (en) 2003-11-13
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US20100310506A1 (en) 2010-12-09
EA200401446A1 (ru) 2005-06-30
US20050033026A1 (en) 2005-02-10
US9119886B2 (en) 2015-09-01
EP1499730B1 (en) 2013-10-02
ES2441193T3 (es) 2014-02-03
NO332827B1 (no) 2013-01-21
EA007396B1 (ru) 2006-10-27
US9782496B2 (en) 2017-10-10
AU2003228057A1 (en) 2003-11-17
HK1072443A1 (en) 2005-08-26
EP1499730A1 (en) 2005-01-26
WO2003093478A1 (en) 2003-11-13
JP2005526117A (ja) 2005-09-02
JP4656937B2 (ja) 2011-03-23
CN1665933B (zh) 2010-05-26
GB0209896D0 (en) 2002-06-05
AU2003228057B2 (en) 2008-08-28
CN1665933A (zh) 2005-09-07
SI1499730T1 (sl) 2014-02-28
CY1114730T1 (el) 2016-10-05
IL164896A (en) 2012-04-30
PT1499730E (pt) 2013-12-17

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