JP4656937B2 - 腫瘍治療用の免疫複合体 - Google Patents
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Description
a)TNFを腫瘍内に送達し局在濃度を高めることのできる融合蛋白質の開発。例えば、TNF及び腫瘍特異性抗体からなる融合蛋白質が産生されている;
b)抗腫瘍活性を維持しつつ全身毒性の低下したTNF変異体の開発。このように1つの受容体だけを選択的に認識できる変異体が既に調製されている;
c)TNFの抗腫瘍活性を損なうことなくその毒性作用をいくらか低下させることのできる抗TNF抗体の利用。そのような抗体は文献にすでに記載されている;
d)半減期のより長いTNF誘導体(例えば、ポリエチレングリコールと複合したTNF)の利用。
化学療法剤は、固形腫瘍に到達するためには、腫瘍血管に入り、血管壁を通過し、最終的に間質を通って移動しなければならない。不均一な腫瘍灌流、血管透過性及び細胞密度並びに間質圧の増加が、腫瘍血管から離れた新生物細胞内への薬剤の浸透を制限し、その結果、化学療法の有効性を制限し得る決定的な障壁となり得る(1)。したがって、腫瘍内への薬剤浸透の改善を目指す方法には実験的及び臨床的に大きな関心が向けられている。
負のフィードバック機構が当業界に知られており、それには、可溶性受容体の流出並びに、本発明の標的誘導サイトカインの活性を直接的又は間接的に損なうような全身的又は局所濃度での他のサイトカイン類、ホルモン類又は生物学的作用物質の誘導を挙げることができる。可溶性阻害剤又はデコイ(decoy)受容体は直接的阻害剤の例である、IL10、TGFβ、又は他の抗炎症性サイトカイン類は、炎症性サイトカイン類によって引き起こされた事象のカスケードを間接的に防止し得る。
この用語は、サイトカイン受容体の細胞外ドメインを分離し、それを可溶性産物として循環内放出する細胞の能力に関する。多くの場合、これらの分離産物は、依然としてそれらのリガンドと結合する能力がある。しかし、これと対照的に、膜結合受容体の残りの部分は、もはやリガンドと結合せず、したがって、これらの細胞は、一定のサイトカインの作用に対して、脱感受性となる。このような可溶性受容体は、IL−4、6、6、IGF、TNFα及びTFNγなどの種々のサイトカイン類に関して記載されている。
本発明は、遺伝子融合又は化学結合によって形成された少なくともサイトカインに結合した少なくとも1つの標的指向蛋白質を含む分子である複合体に関する。「結合した」とは、第1の配列によって、第2の配列が標的細胞へと輸送されることが可能となるように、第1の配列と第2の配列とが結合していることを意味する。したがって、複合体は、輸送蛋白質をコードするDNA分子の遺伝子発現によるそのポリペプチド骨格を介して、輸送蛋白質がサイトカインと結合している融合蛋白質、直接合成された蛋白質及び予備形成した配列が架橋剤によって会合しているカップリング蛋白質を含む。この用語は、また、サイトカインと標的指向蛋白質との凝集体などの会合も含むものとしてここでは使用される。一実施形態によれば、該第2の配列は、ポリヌクレオチド配列を含み得る。この実施形態は蛋白質/核酸複合体として認め得る。
固形腫瘍化学療法の有効性にとって、新生物細胞内への薬剤浸透性は重要である。固形腫瘍内の癌細胞に到達するためには、化学療法剤は血管に入り、その血管壁を通過し、最終的には、間質を通って移動しなければならない。不均一な腫瘍灌流、血管透過性及び細胞密度並びに間質圧の増加が、新生物細胞内への薬剤の浸透を制限し、その結果、化学療法の有効性を制限し得る決定的な障壁となり得る。したがって、これらの要因に影響する作用を有するサイトカイン類が、本発明において有用である。本発明に使用し得るサイトカイン類の非限定的リストは、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL1、2、4、6、12、15、EMAPII、血管内皮増殖因子(VEGF)、PDGF、PD−ECGF又はケモカインである。
TNFは炎症性サイトカインであり、内皮バリア機能変化の誘導、腫瘍間質圧の低下及び化学療法剤浸透性の増大並びに腫瘍血管損傷の効果を有している。
免疫及び炎症応答の媒介におけるIL2/IL2R系の中心的役割のため、この系のモニタリングと操作が重要な診断的及び治療的意味を有していることは明らかである。IL2は、腫瘍攻撃性のLAK及びTIL(腫瘍浸潤リンパ球)細胞の増殖及び活性を刺激する能力の点で、抗癌剤としての有望性を示している。しかし、IL2毒性による問題に対してなお、懸念と利点調査がされている。本発明はこの問題を扱っている。
インターロイキン15(IL15)は、IL2と多くの生物学的性質を共有しているが、アミノ酸配列の相同性を欠いている新規のサイトカインである。IL15は、元々マウスT細胞系、CTLL2に対するサル腎臓上皮細胞系(CVI/EBNA)のマイトジェン活性に基づき、条件付けされた培地中に確認された。IL15はまた、T細胞増殖を刺激し、IL−Tと称された、ヒト成人T細胞白血病細胞系(Hut−102)によって産生されるサイトカインとして独立に発見された。T細胞、NK細胞、LAK細胞及びTIL類の刺激剤としての活性に関して、IL2は現在、癌及びウィルス感染の治療におけるその利用可能性を試験する臨床試験中である。IL15は同様な生物活性のため、同様の治療上の可能性を有しているはずである。
ケモカイン類は、リンパ球の輸送、補充及び再循環において機能する、多くは小型の分泌蛋白質のスーパーファミリーである。それらはまた、アレルギー応答、感染性及び自己免疫疾患、血管形成、炎症、腫瘍増殖及び血液形成発達などの多くの病理生理学的過程において重要な役割を演じている。この蛋白質の略80パーセントが、成熟形態において、66個から78個のアミノ酸(aa)を有している。残りのものは、蛋白質コアの上流に生じるか、又は伸長したC末端セグメントの一部として、追加のaaを有して、より大型である。ケモカイン類はすべて、7つの膜貫通ドメインG蛋白結合受容体を介してシグナル伝達する。少なくとも17種のケモカイン受容体が知られており、これらの受容体の多くはいくつかの異なったケモカインが同一の受容体を介してシグナル伝達できる無差別結合性を示す。
・CXCケモカインとも称されるαサブファミリーは、最初の2つのシステイン残基を分けている1個のaaを有している。このグループは、最初のシステイン残基のすぐ前にあるglu−leu−arg(ELR)aaモチーフが存在するかしないかに基づいて、さらに小さく分けることができる。現在5種のCXC特異的受容体があり、それらはCXCR1〜CXCR5と称されている。ELR+ケモカイン類は、CXCR2と結合し、一般に好中球化学誘引剤及び活性剤として作用する。ELRケモカイン類は、CXCR3〜CXCR5に結合し、主にリンパ球に対して作用する。本文執筆時に、科学文献にCXCケモカイン類をコードする14種の異なったヒト遺伝子が、場合によってはスプライシングにより与えられたさらなる多様性を有して報告された。
・CCケモカイン類とも称されるβファミリーにおいては、最初の2つのシステインが介入aaなしに互いに隣接している。現在、24種のヒトβサブファミリーメンバーが識別されている。このグループの受容体は、CCR1〜CCR11と称される。種々のCCファミリーメンバーの標的細胞としては、白血球の大抵の型が挙げられる。
・α及びβサブファミリーに入らないケモカイン相同性を有する2つの蛋白質が知られている。リンホタクチンは、第1と第3のシステインを欠いたγクラス(Cケモカイン)の単独メンバーである。リンホタクチン受容体は、XCR1と称される。デルタクラス(CX3Cケモカイン)の唯一のメンバーであるフラクタルカインは、最初の2つのシステイン残基の間に3個の介入aaを有している。この分子は、長いムチン様の柄に融合したN末端ケモカインドメインを有する膜貫通蛋白質であるという点で、ケモカイン類の中でも独特である。フラクタルカイン受容体は、CX3CR1として知られている。
本発明はまた、血管内皮増殖因子(VEGF)にも適用できる。新血管形成は、先に存在する血管系から新たな血管が発達する過程である。それは、胚の発達、組織の正常な成長、傷の治癒、女性の生殖サイクル(すなわち、排卵、月経及び胚盤発達)における必須の役割並びに多くの疾患において主要な役割を演じている。特に関心が集中するのは癌に対してである。なぜなら、腫瘍は、新しい血液供給の発達がなければ、数ミリメートルの大きさ以上には増殖できないからである。また、新血管形成は腫瘍細胞転移の拡散と増殖にも必要である。
内皮単球活性化ポリペプチドII(EMAPII)は、腫瘍血管発達における抗血管形成因子であるサイトカインであり、腫瘍の増殖を強力に阻害する。組み換えヒトEMAPIIは166個のアミノ酸残基を含有する18.3kDaの蛋白質である。EMAPIIもまた、内皮血管透過性を高めることが判明している。
血小板由来の増殖因子(PDGF)アンタゴニストが、一般的な固形腫瘍において広範囲の抗腫瘍剤の薬剤取り込みと治療効果を高め得ることも示唆されている。PDGFは、30kDAのサイトカインであり、創傷時に血小板により放出され、近隣の細胞が増殖して傷を修復することを促す。
その名称に示唆されるように、血小板由来の内皮細胞増殖因子(PD−ECGF)は、最初は内皮細胞における有糸分裂を誘導する血小板の能力に基づいて、血小板から単離された。その関連蛋白質はグリオスタチンである。
本発明者らは、腫瘍血管に対するサイトカイン標的化の方向付けによってサイトカイン類の治療指数を高めることができることを見出した。さらに、腫瘍細胞は、腫瘍血管系の内層の一部を形成し得ることが知られていることから、本発明は腫瘍細胞の血管系と同様、腫瘍細胞を直接標的にすることも包含する。任意の便利な腫瘍又は腫瘍血管系、特定の内皮細胞、標的指向部分が、本発明の複合体において使用できる、このような多くの標的指向部分が知られており、これら及び引き続いて利用可能な任意のものが本発明の範囲内に包含される。一実施形態において、標的指向部分は、腫瘍細胞によって発現した受容体のリガンドなどの結合相手又は腫瘍細胞に伴う細胞外マトリックスのマーカー又は成分に対する抗体などの結合相手である。より具体的には、標的指向部分は、腫瘍関連血管によって発現した受容体のリガンドなどの結合相手、又は血管形成脈管に伴う細胞外マトリックスの内皮マーカー又は成分に対する抗体などの結合相手である。用語の結合相手は、本発明では最も広い意味で用いられ、リガンドや抗体又はその結合断片などの天然、合成双方の結合ドメインを含む。したがって、前記結合相手は、受容体、細胞の細胞外成分のマーカーに結合できるFab、Fv、1本鎖Fv、ペプチド、又はペプチド模倣物、すなわちペプチド様分子などの抗体又はその断片となり得る。
驚くべきことに、アミノペプチダーゼ−N受容体(CD13)のリガンドとのカップリングによって、ある一定のサイトカイン類の治療指数が著しく改善でき、その免疫療法特性が増強できることが判明した。CD13は、様々な種において保存性の高い150kDaの膜貫通糖蛋白質である。それは正常な細胞並びに骨髄腫瘍系、血管形成内皮及びいくつかの上皮において発現する。CD13受容体は、通常、そのペプチドリガンドがアミノ酸の「NGR」モチーフを共有している「NGR」受容体として同定される。前記リガンドはNGRモチーフを含む、CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、シクロCVLNGRMEC又はシクロCNGRCなどの直鎖又は環状ペプチドであることが好ましく、ペプチドCNGRCであることがより好ましい。さらに詳細は、参照として本明細書に組み込まれている本発明者らのWO01/61017に見ることができる。
TNFスーパーファミリーのメンバーと同様に、TNF受容体スーパーファミリー(TNFRSF)のメンバーもまた共通の特徴を多く共有している。特に、TNFRSFの分子はすべて、それらの細胞外ドメインに1つから6つのリガンド結合、40aa残基のシステインの多いモチーフを含有するI型(N末端細胞外)膜貫通糖蛋白質である。また、機能性TNFRSFのメンバーは、通常、システイン内ジスルフィド結合によって安定化している三量体又は多量体の複合体である。TNFSFの多くのメンバーと違って、TNFRSFのメンバーは、膜結合形態と可溶性形態の双方において存在する。最後に、前記スーパーファミリーメンバーの細胞質ドメインにおけるaa配列の相同性は25%を超えないが、多くの受容体が様々な細胞にアポトーシスのシグナルを導入することができ、共通の機能を示唆している。
VEGF受容体ファミリーには3つの受容体がある。それらは、複数のIgG様細胞外ドメイン及びチロシンキナーゼ活性という共通の性質を有している。VEGF受容体1(VEGFR1、Flt−1としても知られる)、VEGFR2(KDR又はFlk−1としても知られる)及びVEGFR3(Flk−4としても知られる)の酵素ドメインは、挿入配列によって分けられている。内皮細胞は、その他のVEGF受容体であるニューロピリン−1とニューロピリン−2も発現する。VEGF−Aは、VEGFR1とVEGFR2並びにニューロピリン−1とニューロピリン−2に結合する。PIGFとVEGF−BはVEGFR1とニューロピリン−1に結合する。VEGF−CとVEGF−Dとは、VEGFR3とVEGFR2に結合する。HIV−tatとそれに由来するペプチドもまた、VEGFRを標的にすることが判っている。
PDGF受容体は、多くの一般的な固形腫瘍における間質画分に発現する。ラット結腸癌モデルにおいて間質に発現したPDGF受容体を阻害すると、腫瘍間質液圧が低下し、腫瘍の毛細管輸送が増加する。
前立腺特異的膜抗原(PSMA)もまた、優れた腫瘍内皮マーカーであり、PSMA抗体を生成できる。
細胞接着分子(CAM類)は、細胞、通常は、白血球を互いに、内皮細胞に、又は細胞外マトリックスに結合することに関与している細胞表面蛋白質である。創傷や感染に応じて産生された特定のシグナルが、ある一定のこれら接着分子の発現と活性化を制御する。次にこれらCAM類の、それらの受容体/リガンドに対する結合によって開始された相互作用や応答が、これら損傷に対する生体防衛の一系列を構成する炎症反応及び免疫反応の媒介において重要な役割を演じる。今までに特定されたCAM類の多くは、3つの一般的な蛋白質ファミリーに分けられる。すなわち、免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリー、インテグリンファミリー又はセレクチンファミリーである。
IgスーパーファミリーCAM類は、カルシウム非依存性膜貫通糖蛋白質である。Igスーパーファミリーのメンバーとしては、細胞間接着分子(ICAM類)、血管細胞接着分子(VCAM−1)、血小板−内皮−細胞接着分子(PECAM−1)及び神経細胞接着分子(NCAM)が挙げられる。各IgスーパーファミリーCAMは、いくつかのIg様鎖内ジスルフィド結合したループを含有する細胞外ドメインと、保存されたシテイン残基、膜貫通ドメイン、細胞骨格と相互作用する細胞内ドメインを有している。典型的には、それらは、インテグリン類又は他のIgスーパーファミリーCAM類と結合する。ニューロンのCAM類は、ニューロンのパターン形成に関係していた。内皮CAM類は免疫応答及び炎症に重要な役割を演じている。
インインテグリン類は、α及びβサブユニットの非共有結合したヘテロ二量体である。現在までに、16αサブユニットと8βサブユニットが同定されている。これらは、様々な仕方で結合して、種々のタイプのインテグリン受容体を形成することができる。いくつかのインテグリンに関するリガンドには、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン類及びラミニンなどの細胞外接着マトリックス(ECM)蛋白質がある。多くのインテグリン類は、フィブロネクチンや他の接着蛋白質に存在している、それらが結合するアミノ酸配列、RGD(アルギニン−グリシン−アスパラギン酸)を認識する。RGD配列を含有するペプチド及び蛋白質断片をRGD認識インテグリンの活性を調節するために使用できる。したがって、本発明は、標的指向部分として、インテグリンに認識されるペプチドを使用できる。これらのペプチドは従来「RGD含有ペプチド」として知られている。これらのペプチドは、インテグリンに結合するペプチドモチーフとして同定されたものを含む。これらのモチーフはアミノ酸配列:DGR、NGR及びCRGDCを含む。前記ペプチドモチーフは線状でも環状でもよい。このようなモチーフは、RGDペプチドの記載に関連して参照として本明細書に組み込まれている以下の特許に、より詳細に記載されている:米国特許第5,536,814号は、シクラサイズ化CRGDCL、CRGDCA及びGACRGDCLGAを記載している。米国特許第4,578,079号は、XとYがアミノ酸である式X−RGD−T/C−Yの合成ペプチドに関する。米国特許第5,547,936号は、Xがアミノ酸となり得る配列X−RGD−XXを含むペプチドを記載している。米国特許第4,988,621号は、多数のRGDを含むペプチドを記載している。米国特許第4,879,237号は、Yがアミノ酸であるRGD−Yの一般的ペプチド及びペプチドG−RGD−APを記載している。米国特許第5,169,930号は、αvβ1インテグリンに結合するペプチドRGDSPKを記載している。米国特許第5,498,694号及び米国特許第5,700,908号は、配列RDGを含有しているが、厳密に言えばRGD含有ペプチドではないβ3インテグリンサブユニットの細胞質ドメインに関する。WO97/08203は、構造的模倣体又はRGD結合部位である環状ペプチドを記載している。米国特許第5,612,311号は、C−C結合か、若しくはペニシルアミン又はメカプトプロピオン酸類縁体などの他の基を介して環化され得る15個のRGD含有ペプチドを記載している。米国特許第5,672,585号は、RGD含有ペプチドを包含する一般式を記載している。好ましいペプチド群は、RGDのアスパラギン酸残基がO−メトキシチロシン誘導体へと誘導化されるものである。米国特許第5,120,829号は、RGD細胞接着促進結合部位及び疎水性接着ドメインを記載している。米国特許第5,587,456号には、D体が記載されている。米国特許第5,648,330号は、GPIib/IIIaに高親和性を有する環状RGD含有ペプチドを記載している。
ActRIIを発現することが知られている細胞としては、内皮細胞が挙げられる。ActRIIBの発現は、ActRIIの発現と類似しており、やはり内皮細胞において見られる。ActRIを発現することが知られている細胞としては、血管内皮細胞が挙げられる。ActRIBもまた内皮細胞において確認された。
アンジオゲニン(ANG)は、新血管増殖を誘導する能力に関して名付けられた14kDaの非グリコシル化ポリペプチドである。
アネキシンVは、血管抗凝集活性を有する蛋白質のカルシウム及びリン脂質結合ファミリーのメンバーである。アネキシンVには種々の同義語がある。すなわち、胎盤蛋白4(PP4)、胎盤抗凝集蛋白I(PAPI)、カルホビンジンI(CPB−I)、カルシウム依存リン脂質結合蛋白33(CaBP33)、血管抗凝集蛋白α(VACa)、アンコリンCII、リポコルチンV、エンドネキシンII、及びトロンボプラスチン阻害剤である、アネキシンVに対する結合部位の数は腫瘍細胞では6〜24×106/細胞、そして内皮細胞では、8.8×106/細胞と報告されている。
白血球接着事象に明らかに関与している他の分子はCD44であり、これは造血細胞及び非造血細胞の双方に偏在して発現する分子である。CD44は、場合によっては、スプライシングされた形態(その多くは活性が異なる)を生成させる能力が顕著である。腫瘍細胞が増殖と転移によって首尾よく発達するために用いる方法のいくつかにおいて、CD44がその性質を変化させて、ある役割を演じているという推測が、この顕著な柔軟性から導かれた。CD44は、80〜250kDaのI型(細胞外N末端)膜貫通糖蛋白質である。CD44を発現することが知られている細胞としては、血管内皮細胞が挙げられる。
「線維芽細胞増殖因子(FGF)」という名称は、このサイトカインファミリーの限定的な表現である。FGF類の機能は、細胞増殖に限定されていない。いくつかのFGF類は、確かに線維芽細胞の増殖を誘導するが、元々のFGF分子(FGF−2又はFGF塩基)は、内皮細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、メラニン細胞、並びに他の細胞の増殖も誘導することが現在知られている。それはまた、脂肪細胞の分化を促進し、マクロファージ及び線維芽細胞IL6の産生を誘導し、星状細胞の移動を刺激し、ニューロンの生存を延長化することができる。現在までのところ、FGFスーパーファミリーは、23のメンバーからなり、それらはすべて、6個の散在した同一アミノ酸を含有する120アミノ酸(aa)の保存コア部位を含有する。
IL1は、特定の受容体に結合することによりその作用を発揮する。2つの異なるIL1受容体結合性蛋白質に加え、非結合性シグナル伝達付属蛋白質が同定されている。各々が3つの細胞外免疫グロブリン様(Ig様)ドメインを有しているこから、IV型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーになっている。2つの受容体結合蛋白質は、それぞれI型IL1受容体(IL1RI)、II型IL1受容体(IL1RII)と称される。ヒト(IL1RI)は、内皮細胞から単離された552aa、80kDaの膜貫通糖蛋白質である。
受容体チロシンキナーゼ(RTK)の新規のファミリーであるEph受容体とそれらのリガンドであるエフリン類は、血管の組立て、血管形成、腫瘍形成及び転移に関与していることが判っている。クラスAのEph受容体とそれらのリガンド類が、腫瘍及び関連血管系において増加することも判っている。
マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)類は、腫瘍の増殖、血管形成、浸潤及び転移に関与していた。それらを腫瘍マーカーとして利用することも示唆されている。
NG2は、最初、未成熟神経細胞によって発現した細胞表面分子として同定された大型の膜構成硫酸コンドロイチンプロテオグリカンである。その後、NG2は、多種多様な未成熟細胞並びに悪性度の高いいくつかのタイプの腫瘍によって発現することが判った。NG2は、腫瘍血管系における標的分子として示唆されている。特に、コラゲナーゼ1(C1)は新たに形成された微小血管に存在する主なマトリックスメタロプロテイナーゼであり、新生血管形成のマーカーとして役立つ。
フィブロネクチン(Fn−f)の癌退治性断片の発現が血管形成時に増加することも判っており、腫瘍血管形成のマーカーとして示唆されている。一実施形態において、TTMは、フィブロネクチンの癌退治性ED−Bドメインに対する抗体又はその断片である。このような抗体及びIL12との複合体の調製は、Halinら、(2002)Nature Biotechnology 20:264〜269頁に記載されている。
テネイシンは、脳腫瘍、乳癌及び黒色腫などの悪性腫瘍に見られるマトリックス糖蛋白質である。その発現は悪性であるが、十分には分化されていない腫瘍であり、腫瘍血管との関連があることから悪性腫瘍生物学、血管形成の双方を理解する上で重要な標的となっているだけでなく、癌の治療標的又はマーカーでもある。
標的指向部分は、一般に1個または複数の結合ドメインを含むか又はそれで構成されている表面分子に対して、結合相手(BP)の形態をとる。
本発明の標的指向部分はリガンドの形態をとることができる。前記リガンドは、天然又は合成となり得る。用語「リガンド」は、また化学的に修飾されたリガンドも言う。BPの1つ以上の結合ドメインは、例えば、受容体に対する天然リガンドからなってもよく、その天然リガンドは、前記受容体に結合親和性を保持している接着分子、又は増殖因子受容体リガンド(例えば、表面増殖因子)又は天然リガンドの断片となり得る。
或いは、結合ドメインは、免疫グロブリン(Ig)可変部位の重鎖配列及び軽鎖配列に由来してもよい。このような可変部位は、天然ヒト抗体又はげっし動物の抗体などの他の種からの抗体に由来し得る。或いは、前記可変部位は、ヒト化抗体などの設計抗体、若しくは免疫化又は非免疫化動物又は変異誘発ファージディスプレイライブラリーからのファージディスプレイライブラリーに由来し得る。第2の代替として前記可変部位は、一本鎖可変断片(scFv)に由来し得る。前記BPは、多量体得るため、又は結合ドメイン間のスペーサーとして作用するための他の配列、若しくはIgヒンジ配列又は新規スペーサーなどのBPをコードする遺伝子内で制限部位の挿入から生じた配列及び設計リンカー配列を含有し得る。
一態様において、本発明は腫瘍又は腫瘍血管系細胞表面分子に結合することできる試剤をスクリーニングする方法に関するものであって、この方法は、前記細胞表面分子と試剤とを接触させ、前記試剤が、前記細胞表面分子と結合するかどうかを決定することを含む。
用語の「蛋白質」は、一本鎖ポリペプチド分子、並びに個々の構成ポリペプチドが共有結合的手段又は非共有結合的手段によって結合している複数のポリペプチド複合体を含む。用語「ポリペプチド」は、2個以上のアミノ酸長さ、典型的には5、10、又は20個のアミノ酸長さのペプチドを含む。
本発明に用いられるポリペプチド配列は特定の配列又はその断片に限定されず、任意の供給源から入手される相同配列、例えば、関連ウィルス/細菌蛋白質、細胞相同体及び合成ペプチド類並びにそれらの変異体又は誘導体も含むことは理解されよう。本発明のポリペプチド配列は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドも含む。
本発明のアミノ酸配列に関連する用語「変異体」又は「誘導体」は、好ましくは、標的活性、好ましくは配列表に示されたポリペプチドの少なくとも25%から50%の前記活性、より好ましくは実質的に同一の前記活性を有するアミノ酸配列を結果として提供する配列からの、又はその配列への、1個(又はそれ以上)のアミノ酸の置換、変化、修飾、交換、削除又は添加を含む。
本発明のペプチド類は、患者に対し、治療用に投与し得る。例えば、免疫原生を低下させるため、患者体内での循環半減期を増加させるため、生物学的利用能を高めるため、及び/又は有効性及び/又は特異性を高めるために、単に天然アミノ酸からなるのではなく、修飾したペプチドを用いることが好ましい。
本発明のさらなる態様は、腫瘍抗原又は他の腫瘍血管形成マーカー類、例えばα−インテグリン類、メタロプロテイアーゼ類又は血管増殖因子或いは抗テネイシン抗体又は抗フィブロネクチンEDBドメインなどの細胞マトリックスの成分に向けられた抗体又はその断片に対してTTMで修飾されたサイトカイン類が抗体又はその断片と複合している二官能性誘導体によって提供される。胃線癌及び卵巣線癌によって発現する腫瘍関連TAG72抗原に対するTNFとmAbのヒンジ部との間の融合蛋白質の調製が最近報告された。
本発明に使用するポリヌクレオチド類は、本発明のポリペプチド複合体をコードする核酸配列を含む。遺伝コードの縮重の結果、多数の異なったポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードできることは当業者に理解されるであろう。さらに、本発明のポリペプチドを発現すべきいずれか特定の宿主生物のコドン使用を反映させるために、本発明のポリヌクレオチド類にコードされたポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を、当業者が慣例的方法を用いて実施できることを理解すべきである。
本発明のポリヌクレオチドは、複製可能な組み換えベクター内へ組み込むことができる。前記ベクターは、適合性宿主細胞内の核酸を複製するために使用できる。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクター内に導入し、そのベクターを適合性宿主細胞内へ導入し、そのベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって、本発明のポリヌクレオチド類を製造する方法を提供する。このベクターは宿主細胞から回収できる。好適な宿主細胞としては、大腸菌などの細菌、酵母、哺乳動物細胞系及び他の真菌細胞系、例えば昆虫Sf9細胞が挙げられる。
ベクター/ポリヌクレオチドを複製し、及び/又は本発明のポリヌクレオチドによってコードされた本発明の蛋白質を発現させるために、本発明のベクター及びポリヌクレオチドを宿主細胞に導入できる。本発明の蛋白質は宿主細胞として原核細胞を用いて産生できるが、真核細胞、例えば酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞、特に哺乳動物の細胞を用いることが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本発明の蛋白質を発現させるために使用できる。宿主細胞は、本発明の蛋白質が発現できる好適な条件下で培養できる。本発明の蛋白質の発現は、継続的に産生されるように構成的であるか、又は誘導的で、発現の開始に刺激を必要としてもよい。誘導発現の場合、例えば、培養培地に誘導物質、例えばデキサメタゾン又はIPTGの添加により、必要な時に開始できる。
本発明の蛋白質は、本発明の組成物を産生するために、種々の成分と組み合わせることが好ましい。前記組成物は、製薬組成物(ヒト又は動物用でもよい)を産生するために、製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせることが好ましい。好適な担体及び希釈剤として、等張塩類溶液、例えばリン酸緩衝塩類液が挙げられる。賦形剤についての詳細は、The Handbook of Pharmaceutical Excipients、第2版、編集者Wade & Weller、American Pharmaceutical Associationに見ることができる。本発明の組成物は、直接注射により投与できる。前記組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口又は経皮投与のために製剤化できる。典型的には、各蛋白質は、0.5ng/kgから500ng/kg、好ましくは1ng/kgから50ng/kg、より好ましくは5ng/kgから15ng/kgの範囲の用量で投与できる。
好ましい実施形態において、前記複合体は、ウィルスベクター、より好ましくはレトロウィルスベクターを用いて投与される。
本発明に使用するレトロウィルスベクターは、任意の好適なレトロウィルスから誘導され得るか、又は誘導可能となり得る。多数の種々のレトロウィルスが同定されている。例としては、ネズミ白血病ウィルス(MLV)、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)、サル免疫不全ウィルス、ヒトT細胞白血病ウィルス(HTLV)、ウマ伝染性貧血症ウィルス(EIAV)、マウス乳腺腫瘍ウィルス(MMTV)、ラウス肉腫ウィルス(RSV)、フジナミ肉腫ウィルス(FuSV)、モロニーネズミ白血病ウィルス(Mo−MLV)、FBRネズミ骨肉腫ウィルス(FBRMSV)、モロニーネズミ肉腫ウィルス(Mo−MSV)、アベルソンネズミ白血病ウィルス(A−MLV)、鳥類骨髄球腫症ウィルス−29(MC29)及び鳥類赤芽球腫症ウィルス(AEV)が挙げられる。レトロウィルスのより詳細なリストは、Coffinら、1997年、「retroviruses」、Cold Sprinng Harbour Laboratory Press、編集者:JM Coffin、SM Hughes、HE Varmus 758〜763頁に見ることができる。
本発明の複合体は、1種又は複数の細胞毒性剤などの1種又は複数の他の活性剤と併用できる。したがって、本発明の一態様では、本法は、細胞毒性剤などの他の有効製薬成分を、前記複合体との組合せ剤形で、又は別の剤形で投与することをさらに含む。このような別の細胞毒性剤の剤形としては、経口固体、経口溶液、シロップ、エリキシル、注射用、経皮、経粘膜又は他の剤形を挙げることができる。前記複合体及び他の有効な製薬成分は、1つの剤形に組み合わせるか、或いは、一緒に又は順に使用できる別々の剤形で供給することもできる。
本発明を以下の非限定的な実施例と図を参照してさらに説明する。
マウスのB16F1黒色腫細胞及びRMA−Tリンパ腫細胞を前記のとおり培養した(14、15)。産生されたMAb6G1(ラット抗p75mTNF受容体アンタゴニスト)を前記のとおり特定した(16、17)。MAbV1q(ラット抗mTNF)は、D.Mannel博士(ドイツ国レーゲンスブルク大学)より恵与された。メルファラン(アルケラン)は、Glaxo−Wellcome(英国ロンドン)から入手した。ドキソルビシン(アドリブラスチナ)は、Pharmacia−Upjohn(イタリー国ミラノ)から購入した。
ヒト及びマウスのTNF及びNGR−TNF(CNGRCGのC末端と融合させたTNFからなる)を、(14)に記載されたとおり組み換えDNA法により調製し、大腸菌細胞抽出物から精製した。クロマトグラフィー段階で用いた溶液はすべて滅菌したエンドトキシンのない水であった(Salf、イタリー国ベルガモ)。蛋白質濃度は、市販の蛋白質定量アッセイキット(Pierce、イリノイ州ロックフォード)で測定した。L−Mマウス線維芽細胞(18)による標準的細胞可溶性アッセイから予想したヒトTNF(hTNF)のインビトロ細胞可溶性活性は5.4×107単位/mgであり、一方、精製NGR−hTNFのそれは1.4×108単位/mgであった。マウスTNF(mTNF)の細胞可溶性活性は、7.6×107単位/mgであり、一方、NGR−mTNFのそれは9.1×107単位/mgであった。Superdex75HRカラム(Pharmacia、スウェーデン国)上ゲルろ過クロマトグラフィーにより、NGR−mTNF、NGR−hTNF及びmTNFの流体力学的体積は、相同三量体蛋白質であるhTNF(19)と同様であった。各生成物の電気スプレー質量分析により、以下の分子量が測定された:NGR−hTNF、17937.6±1.9Da(CNGRCG−hTNF1〜157単量体についての予想値17939.4Da);hTNF、17349±1.3(hTNF1〜157についての予想値17350.7);NGR−mTNF、17841.16±2.5(CNGRCG−mTNF1〜156についての予想値17844.2)、mTNF、17384.9±2(Met−mTNF1〜156についての予想値17386.7)。定量的色素産生カブトガニ変形細胞ライゼート(LAL)試験(BioWhittaker)を用いて測定した各生成物のエンドトキシン含量は、NGR−hTNF、0.079単位/μg;hTNF、0.117単位/μg;NGR−mTNF、0.082単位/μg;mTNF、1.61単位/μgであった。
動物モデルに対する研究は、San Raffaele H Scientific Instituteの倫理委員会により承認され、規定されたガイドラインに従って実施された。C57BL/6マウス(Charles River Laboratories、イタリー国カルコ)(16〜18g)を5×104RMA−T又はB16F1生細胞の各々で、左腹皮下注射により誘発した。4〜12日後、マウスをTNF又はNGR−TNF溶液(100μl)で処理し、その2時間後、メルファラン又はドキソルビシン溶液(100μl)を投与した。特記しない限り、薬剤はすべて腹腔内(i.p.)に投与した。0.9%塩化ナトリウムだけで希釈したドキソルビシンを除くすべての薬剤は、100μg/mlのエンドトキシンのないヒト血清アルブミン(Farma−Biagini、イタリア国ルッカ)を含む0.9%塩化ナトリウムで希釈した。腫瘍の増殖は、以前記載したとおり(20)、カリパスで腫瘍を測定することにより毎日モニターした。腫瘍が直径1.0〜1.5cmに達する前にマウスを殺処理した。腫瘍サイズは平均±SE(5匹/群)として示してある。
マウス血清中の可溶性p55−TNF受容体(sTNF−R1)及び可溶性p75−TNF受容体(sTNF−R2)を、Quantikine Mキット(R & D Systems、ミネアポリス、MN55413)を用いて測定した。
B16F1腫瘍又はRMA−T腫瘍(直径0.5〜1cm)を有するC57/BL6マウスを、NGR−mTNF(0.1ng、i.p.)で処理するか、又は処理なしで、2時間後、ドキソルビシン(320μg、i.p.)で処理した。2時間後、マウスを殺処理し、腫瘍を切除した。各腫瘍を秤量し、固まりを解き、冷リン酸緩衝塩類液(PBS)中に再懸濁し、70μmフィルターを通してろ過した。細胞を冷PBS(50ml)によって再懸濁し、遠心分離し(1500rpm、10分、4℃)、冷PBS(2.5ml/腫瘍組織1g)中に再懸濁し、新鮮調製した8%ホルムアルデヒド含有PBS(2.5ml/組織1g)と混合した。前記細胞を4℃で暗所に一晩保存してから、FACSによって分析した。FACScan(Becton−Dickinson)は、未処理腫瘍から回収した細胞で較正した。次に各試料をFL−3ろ過器及びCell Questソフトウェアを用いて解析した。
先ず、化学療法剤不在下で、NGR−mTNF及びmTNFの抗腫瘍活性を特定した。NGR−mTNF及びmTNFの用量応答曲線を比較するため、本発明者らは、RMA−Tリンパ腫又はB16F1黒色腫を有するマウスに対し、種々の用量(0.01ngから10000ng)でのNGR−mTNF及びmTNFの単回投与又は反復投与(i.p.)に基づくいくつかの実験を行った。単回投与(図1A)又は反復投与(図1B)のいずれによっても、高用量(10000ng)で投与された時に、マウスTNFは腫瘍増殖を遅延化し(図1A)、100ng未満の用量では効果が誘発されなかった。NGR−mTNFは際立って、より強力であった。この場合、僅か0.01ngの低用量で抗腫瘍効果が見られた(図1A、B)。しかし、用量応答曲線はより複雑である。例えば、驚くべきことに、10ngの効果は、0.01ng〜0.1ngの効果、及び1000〜10000ngの効果よりも低かった。RMA−Tモデル並びにB16F1黒色腫モデルにおいて行われたいくつかの他の実験において、釣鐘型の用量応答曲線が見られた(示していない)。これらの結果は以下のことを示唆している:1)低用量のNGR−mTNFの有効性は、mTNFの有効性よりも際立って高いこと、そして2)1〜10ngより多い用量のNGR−mTNFは、その潜在的腫瘍活性を阻害する負のフィードバック機構を活性化すること。
次にNGR−mTNFの釣鐘型用量応答曲線の原因となる防御機構を調べた。外来投与TNFがインビボでの可溶性TNF受容体(sTNF−Rs)流出を誘発するため(21)、10ngのNGR−TNFのより低い有効性は、TNF−R1及び/又はsTNF−R2の誘発、そして結果的に膜受容体との相互作用の中和化に関連すると本発明者らは仮定した。
次に本発明者らは、腫瘍血管に対する低用量NGR−mTNFの標的誘導送達が化学療法剤の抗腫瘍活性を増強し得るかどうかを調べた。これらの実験は、免疫原性がごく少なく、メルファランに対して低感受性であることを特徴とする自発性のマウス黒色腫であるB16F1モデルにおいて行われた。メルファラン(90μg)単独で注射された場合は、腫瘍増殖に影響を与えることはできなかった(図3A)。同様にmTNF(0.1ng単独、i.p.)は実際に不活性であったが、同用量のNGR−mTNFは、少しだけ腫瘍増殖を遅延化した(図3B、上部パネル)。メルファランと0.1ngのNGR−mTNFとの併用が単剤よりも強力な抗腫瘍効果を発揮し、相乗効果を示している(図3C)。注目すべきことに、メルファランと0.1ngのNGR−mTNFとの併用は、5000ngのmTNFとの併用よりも効果的であった(図3C〜D)。NGR−mTNF(0.1ng)が静脈内注射された場合でもこの相乗作用が見られた(示していない)。
各処理の有効性/毒性比を予想するために、処理後の毎日のマウス体重及びマウスの生存率をモニターした。mTNFの治療用量(10000ng)は、RMA−Tを有するマウスに著しい体重減少を引き起こした(図1C、左)が、NGR−mTNFの治療用量(0.01〜1ng)は体重減少を生じなかった(図1C、右)。さらに、NGR−mTNFとmTNFの双方とも(各1ng)、RNA−T腫瘍を有するマウスにおいて、メルファランの致死量200μgを増加させなかった(表1)。
次に低用量のNGR−mTNFと化学療法剤との間の相乗作用の機構を調べた。
前記相乗作用が、腫瘍細胞に対する直接の細胞毒性によるものか否かを評価するために、各化合物単独、又は併用の培養B16F1細胞に対する効果を測定した。インビトロアッセイにおいて、メルファラン又はNGR−mTNFは、単独、又は併用で、双方とも48時間内に、これらの細胞を死滅させなかった(示していない)。同様に、NGR−mTNFは、インビトロでドキソルビシンの細胞毒性を増大させなかった(示していない)。これらの結果は、インビボで見られる相乗作用は、腫瘍細胞に対する細胞毒作用に直接依存しておらず、腫瘍支質、例えば、腫瘍血管の内皮内張りの成分の間接的役割を指していることを示唆している。
次に、NGR−mTNFが腫瘍内への化学療法剤の浸透を増加し得るかどうかを調べた。これを目的としてドキソルビシン投与2時間後に、この薬剤の蛍光特性を利用して、B16F1腫瘍及びRMA−T腫瘍に浸透したドキソルビシンの量を測定した(23)。予備実験では、インビトロでB16F1細胞をドキソルビシンに曝露させた後、B16F1細胞の核が蛍光を放つことが示された(図6A)。FACSで測定した蛍光シグナルは用量依存的であり、前記細胞をホルムアルデヒドで固定し、4℃で保持する場合、少なくとも24時間安定である(図6B)。このように、処理後のマウスから回収した腫瘍細胞の蛍光強度は、腫瘍に浸透したドキソルビシン量の表示である。ドキソルビシンの2時間前に投与された0.1ngのNGR−mTNFが、処理の2時間後にB16F1腫瘍及びRMA−T腫瘍双方から回収された陽性細胞の蛍光強度とパーセンテージを増大させることが認められた(2〜5倍、図6C〜H)。このことは、NGR−mTNFが、ドキソルビシンが到達した細胞数並びに薬剤の細胞内の量を増加させたことを示唆する。
RMA−T細胞を有するC57/BL6マウス(5匹/群)を、腹腔内注射により、メルファラン単独で、若しくはRGD−TNF又はNGR−TNFと併用して処理した。腫瘍体積に及ぼす効果を図8Aに示し、マウス体重に及ぼす効果を図8Bに示している。これらの結果は、RGD−TNFもまた、ピコグラム範囲で有効であることを立証している。
RMAリンパ腫を有するC57/BL6マウスをIFNγ(3ng)又はIFNγ−NGR(3ng)で処理したか、又は処理なしとした。21日後、マウスを殺処理した。腫瘍体積及びマウス体重の減少は図9A及び9Bに見ることができる。また、RMAリンパ腫を有するC57/BL6マウスをIFNγ(3ng)、IFNγ−NGR(3ng)、IFNγ−NGR(3ng)プラス抗CD13R3−63mAb(25μg)又はIFNγ−NGR(3ng)プラスmAB19E12(50μg)で処理したか、又は処理なしとした。mAB19E12は、この実験における陰性対照として用いた無関係のIgGである。この結果は、IFNγ−NGRがピコグラム範囲で有効であることを証明している。
本発明者らは、低用量のNGR−TNFの標的送達が抗癌剤、シスプラチンの抗腫瘍活性を増大し得るかどうかを調べた。これらの実験は、当初8週齢のRMA−T腫瘍を有するC57/BL6/Nマウスにおいて実施した。マウスを10日目にシスプラチンで処理したか、又は処理なし、又はNGR−mTNFと共に処理した。その結果は図10に示してある。この図でCys=シスプラチノテバ(Cisplatino Teva)溶液0.5mg/ml;NGR=NGR−mTNF。希釈剤は0.9%NaCl中100mg/mlHASであった。この結果は、シスプラチンの治療効果増大にはピコグラム用量のNGR−TNFで十分であることを示している。
TNF単独、又は化学療法剤と併用したTNFの抗腫瘍活性にとって、血管透過性と間質圧の変化、内皮細胞損傷及びフィブリン沈着は重要な機構である。TNFもまた、動物又は患者への注入後、これらの効果の多くを中和する負のフィードバック機構を誘発できる。例えば、TNFは、それほど多くない用量でも膜受容体との相互作用を妨げ得る可溶性p55及びp75TNF受容体の放出を誘発できる(21、24)。これらの可溶性阻害因子は、このサイトカインの有害な作用から身体を防御できるが、その抗腫瘍活性もまた妨げ、有効な治療のために高用量のTNFを必要とする原因の一部となっていると言える。この研究では、低用量のTNFを腫瘍血管に向かわせることが、毒性反応、並びに負のフィードバック機構を避ける一方、化学療法との相乗作用を保持する新規な方法となると本発明者らは仮定した。この仮定を確証するため、本発明者らは、皮下RMA−Tリンパ腫及びB16F1黒色腫腫瘍に基づく2つのマウスモデルにおいて、ピコグラム量からマイクログラム量の範囲の高用量と低用量のNGR−mTNF及びmTNFの抗腫瘍活性を調べた。これらのサイトカインを単独で、若しくはメルファラン又はドキソルビシンと併用して試験を実施した。mTNFは、100〜1000ng未満の低用量では、これらのモデルにおいて実際に有効でなかったが、NGR−mTNFは単独でも、わずか0.01〜0.1ngの低用量で抗腫瘍効果を誘発し得ることを見出した。mTNFとNGR−mTNFのLD50値は同様であり、RMA−T腫瘍を有するマウスにおいて約50,000ngに相当するため(14)、これらの結果は、NGR−mTNFの有効性/毒性比がmTNFのそれの104〜105倍高いことを示している。
Claims (21)
- サイトカインとNGRモチーフ又はRGDモチーフを含有する少なくとも1つの腫瘍標的指向部分(TTM)との複合体、及び製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含み、サイトカインがTNF又はIFNγであり、複合体が5〜15ng/kgの範囲の量で投与されることを特徴とする、癌の治療用組成物。
- 前記サイトカインが、TNFα又はTNFβである請求項1に記載の癌の治療用組成物。
- 前記TTMが、腫瘍血管系標的指向部分(TVTM)である請求項1又は2に記載の癌の治療用組成物。
- 前記TVTMが、腫瘍血管系の受容体、マーカー又は他の細胞外成分に対する結合相手である請求項3に記載の癌の治療用組成物。
- 前記TTMが、腫瘍の受容体、マーカー又は他の細胞外成分に対する結合相手である請求項1又は2に記載の癌の治療用組成物。
- 前記TTMが、NGRモチーフを含有する請求項1〜5のいずれかに記載の癌の治療用組成物。
- 前記TTMが、CNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、シクロCVLNGRMEC、線状又は環状CNGRCである請求項6に記載の癌の治療用組成物。
- 前記TTMが、アミノペプチダーゼN(CD13)、αvβ3インテグリン又はαvβ5インテグリンを標的とする請求項1〜7のいずれかに記載の癌の治療用組成物。
- サイトカインが、スペーサーを介してTTMに結合している、請求項1〜8のいずれかに記載の癌の治療用組成物。
- スペーサーが、単一のアミノ酸、アミノ酸配列、又は有機残基である、請求項9に記載の癌の治療用組成物。
- サイトカインがTNFであり、TTMがCNGRCであり、TNFのアミノ末端がスペーサーG(グリシン)を介してCNGRCペプチドと結合している、請求項9に記載の癌の治療用組成物。
- 前記複合体が、融合蛋白質の形態をとる請求項1〜11のいずれかに記載の癌の治療用組成物。
- 前記組成物が、他の抗腫瘍剤又は診断用腫瘍画像形成化合物をさらに含む請求項1〜12のいずれかに記載の癌の治療用組成物。
- 抗腫瘍剤が、さらにドキソルビシン、メルファラン又はシスプラチンである請求項13に記載の癌の治療用組成物。
- (i)サイトカインとNGRモチーフ又はRGDモチーフを含有する少なくとも1つの腫瘍標的指向部分(TTM)との複合体、と
(ii)さらに抗腫瘍剤又は診断用腫瘍画像形成化合物、及び製薬上許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む癌の治療用組成物であって、
サイトカインがTNF又はIFNγであり、前記複合体が5〜15ng/kgの範囲の量で投与されることを特徴とする、癌の治療用組成物。 - (i)サイトカインとNGRモチーフ又はRGDモチーフを含有する少なくとも1つの腫瘍標的指向部分(TTM)との複合体、及び製薬上許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤を含む癌の治療用組成物であって、サイトカインがTNF又はIFNγであり、前記複合体が5〜15ng/kgの範囲の量で投与されることを特徴とする、癌の治療用組成物と、
(ii)さらなる抗腫瘍剤又は診断薬の異なる製剤
とを含む癌の治療用組成物。 - サイトカインがTNFであり、TTMがNGRモチーフを含有する、請求項15又は16に記載の癌の治療用組成物。
- TTMがCNGRCVSGCAGRC、NGRAHA、GNGRG、シクロCVLNGRMEC、線状又は環状CNGRCである、請求項15〜17のいずれかに記載の癌の治療用組成物。
- サイトカインがTNFであり、TTMがCNGRCであり、TNFのアミノ末端がスペーサーG(グリシン)を介してCNGRCペプチドと結合している、請求項18に記載の癌の治療用組成物。
- さらなる抗腫瘍剤が、ドキソルビシン、メルファラン又はシスプラチンである、請求項15〜19のいずれかに記載の癌の治療用組成物。
- サイトカインとNGRモチーフ又はRGDモチーフを含有する少なくとも1つの腫瘍標的指向部分(TTM)との複合体の、請求項1〜20のいずれかに記載の癌の治療用組成物の調製における使用。
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