ITMI20012527A1 - Proteine di fusione contenenti peptidi tlp - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

"PROTEINE DI FUSIONE CONTENENTI PEPTIDI TLP"

La presente invenzione riguarda proteine di fusione ottenute dalla combinazione di peptidi TLP e interleuchina-2 (IL-2), e il loro impiego nell’immunoterapia del cancro.

Con l’acronimo TLP (“Tumor Liberated Particles”) si identificano complessi proteici isolati da tessuti tumorali secondo la procedura inizialmente descritta in EP 283433. Sono stati caratterizzati diversi peptidi e proteine formanti il complesso TLP. In Oncology, 1983 (40:248-253) si descrive una proteina TLP di 214 kDa espressa prevalentemente da carcinoma polmonare. Epitopi di tale proteina ed anticorpi contro gli stessi sono descritti in WO98/01462. EP649433 descrive una proteina TLP di 100 kDa isolata da carcinoma polmonare e peptidi immunogenici da essa derivati. Tali peptidi sono stati utilizzati per generare anticorpi monoclonali e policlonali che hanno trovato impiego nella caratterizzazione del pattern di espressione di TLP in tessuti di varia origine e nella convalida delle proteine TLP come antigeni tumorali (WO94/01458 e W098/15282).

Nella domanda di brevetto MI2001A001380 viene descritta una metodica per la preparazione di TLP che ne consente l’utilizzo nella diagnosi precoce del tumore.

Nella pubblicazione di brevetto WOOl/62786 si descrive l’isolamento del cDNA codificante un peptide del complesso TLP lOOkDa e l’uso di quest’ultimo nella immunoterapia del tumore.

Si è ora trovato che la risposta immunitaria indotta dai peptidi TLP precedentemente descritti può essere aumentata mediante combinazione degli stessi con un frammento attivo di interleuchina 2 (IL-2). In particolare si è visto che proteine di fusione ottenute dall’unione delle sequenze amminoacidiche di peptidi TLP e di IL-2 inducono una risposta citotossica contro cellule tumorali superiore a quella osservata con i soli peptidi TLP.

E’ pertanto oggetto della presente invenzione una proteina o polipeptide di fusione ottenuto dalla combinazione della sequenza amminoacidica di un peptide TLP e la sequenza amminoacidica di un frammento attivo di IL-2.

I peptidi TLP che possono essere usati secondo l’invenzione sono descritti in WO98/01462, W098/1458, W098/15282, EP649433 e in WOOl/62786, qui interamente incorporati per riferimento, e hanno le seguenti sequenze amminoacidiche:

S’intendono compresi nell’ambito dell’invenzione anche derivati dei precedenti peptidi ottenuti per delezione, aggiunta o sostituzione di uno o più amminoacidi che conservino la stessa attività immunogenica dei peptidi di partenza.

Per “frammento attivo di IL-2” s’intende una regione della molecola comprendente i primi 90, preferibilmente i primi 100 aminoacidi a partire dal residuo ammino-terminale.

IL-2 può essere di origine umana o animale, naturale o ricombinante. E’ preferita la forma umana la cui sequenza è depositata in GenBank al numero NP_000577. Inoltre, possono essere utilizzate varianti di sequenza di IL-2 (Cytokine (1997) 7:488-498) che ne conservino lo spettro di attività, che siano cioè in grado di indurre la crescita di linfociti T, di regolare l’attività di linfociti T helper e di stimolare cellule T CD8 citotossiche e cellule NK (Theze et al., 1996, Immunol. Today, 17:481-486).

Con il termine “proteina o polipeptide di fusione” secondo l’invenzione s’intende una molecola (poli)peptidica costituita in parte dalla sequenza amminoacidica di un frammento attivo di IL-2, e per la rimanente parte della sequenza da un peptide TLP come sopra specificato. Anche se le due sequenze possono essere combinate con qualsiasi orientazione reciproca, è preferibile che i domini ammino- e carbossi-terminali siano occupati rispettivamente da IL-2 e dal peptide TLP. Inoltre, tra le due sequenze può essere inserito un linker avente una lunghezza di sequenza tale da consentire il corretto avvolgimento delle due subunità. Preferibilmente il linker comprenderà da 10 a 30 amminoacidi neutri e privi di catene laterali ingombranti, più preferibilmente conterrà residui Gly e Ser.

Secondo una realizzazione preferita la proteina di fusione contiene un peptide scelto tra (2) e (5) fuso con un frammento attivo di IL-2. Maggiormente preferita è la proteina di fusione SEQ ID No. 1 (Fig. 1), in cui la sequenza 1-100 di IL-2 è fusa con il peptide (2).

Le due porzioni (poli)peptidiche possono essere fuse con metodi chimici o con tecniche di DNA ricombinante. Nel secondo caso, il cDNA codificante IL-2 viene unito “in frame” al cDNA codificante il peptide TLP e, dopo inserimento del cDNA ricombinante in opportuno vettore, la proteina di fusione è espressa in un sistema di espressione eucariota o procariota. In alternativa, il cDNA codificante il prodotto di fusione può essere preparato mediante PCR usando opportuni primers per ramplificazione.

E’ inoltre possibile preparare la proteina di fusione mediante sintesi in soluzione o in fase solida (Merrifield, 1986, Science 232:341-347, e Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meiehnhofer, eds N.Y. Academic Press, 1989, pp. 1-284), o con un sintetizzatore automatico (Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Rockford 111., Pierce Chemical Co., 1984).

L’attività delle proteine di fusione secondo l’invenzione è stata valutata in saggi di citotossicità. In particolare, sono stati condotti due test: nel primo si è dosata l’attività dei linfociti T citotossici (CTL) contro una linea cellulare tumorale singenica esprimente naturalmente il TLP umano, nel secondo si è valutata la reattività di un siero immune di coniglio anti-TLP umano contro diverse linee tumorali umane. I dettagli degli esperimenti sono riportati negli esempi. I risultati mostrano chiaramente che le proteine di fusione IL-2/TLP, rispetto ai singoli peptidi TLP, sono maggiormente efficaci nell’ indurre una risposta immunitaria citotossica antigene-specifica contro cellule tumorali.

Pertanto, secondo un altro aspetto l’invenzione è diretta all’uso dei polipeptidi di fusione IL-2/TLP per la preparazione di una composizione farmaceutica utile nel trattamento preventivo o terapeutico del tumore. Le composizioni secondo l’invenzione conterranno una quantità efficace di proteina di fusione insieme a veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili. Per “quantità efficace” si intende una quantità sufficiente ad attivare i linfociti ed a scatenare una risposta citotossica contro il tumore. Secondo una realizzazione preferita, dette composizioni sono indicate per la vaccinazione preventiva di soggetti a rischio di sviluppo neoplastico o nella vaccinazione terapeutica di pazienti neoplastici. Le tecniche di preparazione ed uso dei vaccini sono note all’esperto del settore e sono descritte per esempio in Paul, Fundamental Immunology, Raven Press, New York (1989) o Cryz, S.J., Immunotherapy and Vaccines, VCH Verlagsgesselshaft (1991). Normalmente i vaccini sono in forma di preparazione iniettabile, sospensione o soluzione, ma possono essere preparati anche in forma di preparazione solida o a base di liposomi. Gli ingredienti attivi possono essere miscelati con eccipienti quali agenti emulsificanti, tamponanti e adiuvanti, aumentando così l’efficacia del vaccino.

Le composizioni farmaceutiche secondo l’invenzione sono particolarmente indicate per il trattamento preventivo o terapeutico di tumori del polmone, colon-retto, rene, vescica, testicolo, ovaie, prostata, seno, cervice.

ESEMPIO 1 - preparazione del polipeptide di fusione IL2 (aa. 1-100)TLP(aa. RTNKEASI

Isolamento e clonaggio del cDNA

RT-PCR

L’RNA totale è stato estratto da varie linee cellulari: A549 (Ca -polmone) HGC-27 (Ca gastrico); DU-145 (Ca prostata); PA-1 (Teratocarcinoma ovario); HT29 (Adeno Ca colon) con il reagente RNAzol B (TEL-TEST, Ine.) e retrotrascritto usando la reverse Transcription condotta in 35 cicli (1 minuto a 95°C, 2 minuti a 40°C e 1 minuto a 72°C) usando un oligonucleotide degenerato a monte: ACN AAY AAR GAR GCN TCN ATH TC, che corrisponde alla sequenza aminoacidica TNKEASI, e esameri causali come premier a valle. I prodotti di PCR sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di agarosio all' 1 % contenente bromuro di etidio. I prodotti di PCR sono stati clonati nel vettore pGEM-T easy vector (Promega).

I cloni plasmidici risultanti sono stati sequenziati con il metodo di terminazione di catena usando il sequenziatore Applied Biosystems modello 373A. E’ stata così determinata la fase di lettura aperta corrispondente a SEQ ID No.l.

ESEMPIO 2 - test di citotossicità 1

In questo studio sono stati utilizzati ratti BDIX singenici alle cellule della linea cellulare BDH/K12 esprimenti naturalmente il TLP umano. La linea BDH/K12 è costituita da cellule tumorali di cancro del colon retto di ratto.

Scopo di questo esperimento è di rilevare sperimentalmente mediante un test di citotossicità, la produzione di linfociti T-citotossici (CTL) in ratti BDIX in seguito a vaccinazione, mediante inoculo di una dose prestabilita di TLP/IL-2, secondo una procedura convenzionale.

Descrizione del metodo

Gli animali vaccinati con il prodotto in esame, producono dei linfociti citotossici (CTL) contro L antigene specifico.

Si sacrificano gli animali vaccinati e si prelevano le milze contenenti i CTL.

Le cellule di milza (cellule effettrici) degli animali vaccinati sono cocoltivate con cellule target radiomarcate, che esprimono in superficie il TAA. Come conseguenza del contatto CTL/cellula si ha lisi cellulare con conseguente rilascio di radioattività nel mezzo culturale.

La radioattività del mezzo culturale, rilevata con un γ-counter è direttamente proporzionale all’ attività dei CTL e quindi direttamente proporzionale all’efficacia vaccinogena della sostanza in esame.

Procedimento

Il test è stato disegnato in 4 cicli distinti e separati di prove di immunizzazione. Ogni ciclo di immunizzazione è stato eseguito in un gruppo formato da 4 ratti BDIX dell’età di 8 settimane e del peso di circa 250 g ciascuno. Si è utilizzato il prodotto dell’esempio 1.

Giorno 0 (zero):

ratto 1: inoculo sottocutaneo di 0,5 mi di fisiologica (controllo) ratto 2: imoculo sottocutaneo di 0,5 mi di fisiologica contenente 70 pg di TLP/IL-2

ratto 3: inoculo sottocutaneo di 0,5 mi di fisiologica 70 pg di IL-2 (controllo)

ratto 4: inoculo sottocutaneo di 0,5 mi di fisiologica contenente 70 pg di peptide TLP (controllo)

Al 14° giorno dalla prima immunizzazione, i ratti vengono nuovamente inoculati con la stessa modalità (I richiamo).

Richiami successivi (II e III) sono effettuati rispettivamente al giorno 21 e al giorno 28. Dopo una settimana dall’ultima immunizzazione (giorno 35), gli animali sono sacrificati e privati delle milze che saranno utilizzate in seguito per l allestimento del test citotossico necessario per il rilevamento dell’attività litica dei linfociti T specifici anti-TLP (CTL). Quest’ultima è determinata mediante misurazione del rilascio di cromo 51 nel mezzo culturale da parte di cellule DHD/K12 esprimenti TLP.

La prima fase del test prevede la conta e la marcatura radioattiva delle cellule DHD/K12.

La seconda fase prevede la conta delle cellule di milza provenienti da un animale precedentemente vaccinato.

La terza fase prevede la messa in contatto delle cellule di milza (cellule effettrici) con cellule target marcate, nei rapporti di 100:1, 50:1, 25:1. Le cellule target DHD/K12 sono seminate in numero fisso di 10000 per coltura.

La quarta fase prevede l’azione litica con conseguente rilascio di cromo 51 che viene rivelato nel terreno di coltura attraverso l’uso di γ-counter.

La radioattività misurata rappresenta l’indice di attività citotossica (espressa come percentuale di tossicità) dei CTL specifici ponendo uguale a 0 la citotossicità misurata nella cultura test del ratto 1 e uguale a 100 quella utilizzata per radiomarcare le cellule target in coltura.

Si riportano di seguito i risultati dell’ esperimento:

ESEMPIO 3 Test di citotossicità 2

In questo studio 2 conigli sono stati vaccinati con Γ antigene TLP/IL-2 (Esempio 1) come segue:

giorno 0: a) si preleva un campione di siero dall'animale (siero pre- immune) b) si procede con la prima immunizzazione mediante l'inoculo sottocutaneo in 6 punti del dorso dell'animale di 0,6 mi totali di fisiologica contenenti 0,5 mg di D.TLP//IL-2.

Giorno 14: I richiamo

Giorno 21 : II richiamo

Giorno 28: III richiamo

Giorno 35: Salasso dell'animale per sanguinamento della vena dell'orecchio e raccolta del siero immune.

Il siero immune, preparato come sopra, viene a questo punto utilizzato

in un test di citotossicità in vitro su diverse linee cellulari di tumore umano.

Metodo:

1) seminare nel pozzetto di una micropiasta a 96 pozzetti, 10 μΐ di siero immune in esame scomplementato;

2) aggiungere le cellule in 100 μΐ di terreno completo (il numero delle cellule seminate per pozzetto è di 5000 per tutte le linee tranne che per le Jurkat che è di 35000);

3) incubare la piastra a 37°C ovemight;

4) aggiungere ad ogni pozzetto 40 μΐ di MTT<1>;

5) incubare la piastra a 37°C per 4 ore;

6) aspirare il surnatante e sciogliere i granuli con 100 μΐ di soluzione di SDS<2>;

7) incubare la piastra per Ih a 37°C;

8) leggere la piastra a 540nm.

La percentuale di citotossicità viene poi calcolata:

Note:

1) La soluzione di MITT è così costituita: 0,5g di tiazolil blu in 100ml di PBS. Si filtra su 0,45u e si conserva al buio a 4°C.

2) La soluzione di SDS è così costituita: 50 mi dimetilformammide 50 mi di H20 20g SDS in agitazione su piastra riscaldante. Il pH non deve superare pH 7,4, altrimenti si tampona con una soluzione di 49 mi di H20 1 mi acido acetico 0,125 mi di acido cloridrico.

Risultati

I risultati dello studio sono riportati nella seguente tabella e nelle Figure 2 e 3.

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Proteina di fusione ottenuta dalla combinazione di un frammento di IL-2 comprendente i primi 90 aminoacidi a partire dall’estremità N-terminale, e un peptide TLP scelto dal gruppo comprendente: GPPEVQNAN; RTKNEASI; NQRNRD; GPPEVQNAN; TNKEASICPSVYLSTLPSIHSFTNSSIYYPCIHL SISLSVHPPLIHPSIYPSYSSIHSSSHHPCTHLSTHSVINPVKNFEHLLPIRP CTWTLG.
2. 2. Proteina di fusione secondo la rivendicazione 1, contenente la sequenza amminoacidica 1-100 di IL-2 umana.
3. 3. Proteina di fusione secondo la rivendicazione 2, in cui detto frammento di IL-2 è legato al peptide TLP di sequenza RTNKEASI.
4. 4. Proteina di fusione secondo le rivendicazioni 1-3, in cui il frammento di IL-2 e il peptide TLP contengono l’estremità N-terminale e, rispettivamente, carbossi-terminale della proteina di fusione.
5. 5. Proteina di fusione secondo le rivendicazioni 3 e 4, di sequenza SEQ ID No. 1.
6. 6. Proteina di fusione secondo le rivendicazioni 1-5, in cui tra il frammento IL-2 e il peptide TLP è interposta una catena spaziatrice contenente da 10 a 30 amminoacidi.
7. 7. Proteina di fusione secondo la rivendicazione 6, in cui detti amminoacidi sono scelti tra Gly e Ser.
8. 8. Composizione farmaceutica contenente una quantità efficace di una proteina di fusione secondo le rivendicazioni 1-7.
9. 9. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8, in forma di vaccino.
10. 10. Composizione secondo le rivendicazioni 8-9, per uso nel trattamento preventivo o terapeutico di tumori del polmone, colon-retto, rene, vescica, testicolo, ovaie, prostata, seno, cervice.