KR20020073136A - 클라미디아 감염을 치료 및 진단하기 위한 화합물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
클라미디아(Chlamydia) 감염의 진단 및 치료용 화합물 및 방법을 개시한다. 제공된 화합물은 클라미디아 항원의 1종 이상의 항원 부분을 포함하는 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 또한, 이러한 폴리펩타이드 또는 DNA 서열을 포함하는 약제학적 조성물 및 백신 뿐만 아니라 이러한 폴리펩타이드에 대하여 유도되는 항체도 제공한다. 상기 폴리펩타이드 또는 DNA 서열과 적합한 검출 시약을 함유하는 진단 킷트는 환자 및 생물학적 시료 중의 클라미디아 감염을 검출하는데 사용할 수 있다.
Description
클라미디아는 사람 및 동물의 다양한 주요 감염의 원인이 되는 세포내 박테리아 병원균이다. 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)는 성적 접촉으로 감염되는 질환의 가장 일반적인 원인균 중 하나로서, 골반 염증 질환(PID)을 유도하여 결과적으로 관 폐색과 불임을 초래할 수 있다. 1990년, 미국에서 사용된 PID 치료 비용이 40억불로 추정되었다. 클라미디아 트라코마티스에 의한 눈의 감염이 원인인 트라코마는 전세계적으로 잘 알려진 예방가능한 실명의 주요 원인이다. 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia Pneumonia)는 사람의 급성 기도 감염의 주요 원인균이고, 더욱이 아테롬성동맥경화증, 특히 관상 심질환의 발병론에 큰 역할을하는 것으로 생각되고 있다. 클라미디아 뉴모니아에 대한 높은 역가의 항체를 가진 개체는 혈청반응음성 개체에 비하여 관상 심질환을 앓을 가능성이 2배 이상인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 클라미디아 감염은 미국 뿐 아니라 전세계적으로 중요한 보건 문제이다.
클라미디아 감염은 종종 무증후성이다. 예를 들어, 여성이 PID에 대한 의학적 처치를 시도할 때에는 이미 치료불가능한 손상이 일어나 불임이 되어 있을 수 있다. 따라서, 당해 기술 분야에서는 클라미디아 감염의 예방 및 치료를 위한 개선된 백신 및 약제학적 조성물을 필요로 하고 있다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키고 더 나아가 다른 관련된 잇점도 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 클라미디아 감염의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일 관점으로서, 본 발명은 클라미디아 항원의 면역원성 부분 또는 이러한 항원의 변형체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 부분 및 기타 변형체는, 항원-특이적 항혈청과 반응할 수 있는 그 변형체의 능력이 거의 감소되지 않을 정도로 면역원성인 것이다. 특정 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 (a) 서열 1, 15, 21 내지 25, 44 내지 64, 66 내지 76, 79 내지 88, 110 내지 119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 290; (b) 상기 서열의 상보체; 및 (c) 적당히 엄격한 조건하에 서열 (a) 또는 (b)에 하이브리드하는 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 5 내지 14, 17 내지 20, 26, 28, 30 내지 32, 39 내지 43, 65, 89 내지 109, 138 내지 158, 167, 168, 224 내지 262, 246, 247, 254 내지 256, 292, 294 내지 305에 기재된 서열 및 이의 변형체들로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 전술한 폴리펩타이드, 또는 이의 일부(예컨대, 클라미디아 단백질의 15개 이상의 아미노산 잔기를 암호화하는 일부)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 이 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
관련된 관점으로서, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 이 폴리뉴클레오타이드 서열의 1종 이상을 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 이러한 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포도 제공된다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 생리학적으로 허용되는 담체 또는 면역자극제와 함께, 약제학적 조성물 및 백신으로서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 또는 본 발명의 폴리펩타이드와 공지된 클라미디아 항원을 포함하는 융합 단백질 뿐만 아니라 이러한 융합 단백질들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 클라미디아 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 (b) 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 관점에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 1종 이상의 클라미디아 폴리펩타이드, 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 개시된 1종 이상의 폴리펩타이드 및 본 명세서에 규정된 바와 같은 면역자극제를 포함하는 예방 및 치료용 백신, 및 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 면역자극제를 포함하는 백신을 제공한다.
다른 관점으로서, 본 발명은 상기 1종 이상의 약제학적 조성물 또는 백신의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에게 방어 면역성을 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수득하는 단계, 이 PBMC를 본 발명의 폴리펩타이드(또는 이 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)와 항온처리하여 항온처리된 T 세포를 제공하는 단계 및 이와 같이 항온처리된 T 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 환자의 클라미디아 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항원-제시 세포와 본 발명의 폴리펩타이드(또는 이 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)를 항온처리하여 항온처리된 항원-제시 세포를 제공하는 단계 및 이와 같이 항온처리된 항원-제시 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 클라미디아 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 증식 세포는 환자에게 투여하기 전에 클로닝할 수 있으나, 반드시 필요한 것은 아니다. 특정 구체예에 있어서, 항원-제시 세포는 수지상 세포, 대식세포, 단핵구, B-세포 및 섬유아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 또한, 본발명의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 항온처리된 T 세포 또는 항원-제시 세포를 포함하는 클라미디아 감염 치료용 조성물도 제공된다. 이와 관련된 관점으로서, (a) 전술한 폴리펩타이드를 발현하는 항원-제시 세포 및 (b) 면역자극제를 포함하는 백신이 제공된다.
본 발명은 또한, 다른 관점으로서 클라미디아 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계를 포함하되, 이 시료로부터 상기 단백질을 발현하는 세포를 제거하기에 충분한 시간과 조건하에서 접촉 단계를 수행하는, 생물학적 시료로부터 클라미디아 감염 세포를 제거하는 방법을 제공한다.
관련된 관점으로서, 전술한 바와 같이 처리된 생물학적 시료를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 환자 중의 클라미디아 감염의 발생을 억제하는 방법을 제공한다. 또 다른 관점으로서, 본 발명은 환자의 클라미디아 감염 여부를 검출하는 방법 및 진단 킷트를 제공한다. 일 구체예로서, 이 방법은 (a) 본 명세서에 개시된 1종 이상의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질과 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 이 시료에서 나타나는 상기 폴리펩타이드 또는 융합 단백질에 결합하는 결합 인자의 존재를 검출하여, 생물학적 시료 중의 클라미디아 감염을 검출하는 단계를 포함한다. 적합한 생물학적 시료는 전혈, 객담, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 요를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 진단 킷트는 검출 시약과 함께 본 명세서에 개시된 1종 이상의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 진단 킷트는 본 발명의 폴리펩타이드와 결합하는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; (b) 폴리머라제 연쇄 반응중에 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적인 적어도 1종의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 포함하는 2종 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 상기 시료를 접촉시키는 단계; 및 (c) 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 존재하에 증폭하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 시료로부터 검출하는 단계를 포함하여, 클라미디아 감염을 검출하는 방법을 제공한다. 일 구체예로서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열 약 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드, 또는 이것에 하이브리드하는 서열을 포함한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; (b) 이 시료를 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브와 접촉시키는 단계; 및 (c) 이 올리고뉴클레오타이드 프로브에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 상기 시료로부터 검출하는 단계를 포함하여, 환자의 클라미디아 감염을 검출하는 방법을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열의 약 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드, 또는 이것에 하이브리드하는 서열을 포함한다.
이와 같은 본 발명의 관점 및 기타 다른 관점은 이하 상세한 설명을 참조하면 명백하게 알 수 있을 것이다. 본 명세서에 개시된 모든 참고문헌은 각각 개별적으로 내포되었지만 전반적으로 참고 인용된 것이다.
서열 동정
서열 1은 클라미디아 트라코마티스 클론 1-B1-66의 결정된 DNA 서열이다.
서열 2는 씨.트라코마티스 클론 4-D7-28의 결정된 DNA 서열이다.
서열 3은 씨.트라코마티스 클론 3-G3-10의 결정된 DNA 서열이다.
서열 4는 씨.트라코마티스 클론 10-C10-31의 결정된 DNA 서열이다.
서열 5는 1-B1-66의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 6은 4-D7-28의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 7은 3-G3-10의 1차 추정된 아미노산 서열이다.
서열 8은 3-G3-10의 2차 추정된 아미노산 서열이다.
서열 9는 3-G3-10의 3차 추정된 아미노산 서열이다.
서열 10은 3-G3-10의 4차 추정된 아미노산 서열이다.
서열 11은 3-G3-10의 5차 추정된 아미노산 서열이다.
서열 12는 10-C10-31의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 13은 합성 펩타이드 1-B1-66/48-67의 아미노산 서열이다.
서열 14는 합성 펩타이드 1-B1-66/58-77의 아미노산 서열이다.
서열 15는 씨.트라코마티스 혈청형(serovar) LGV II 클론 2C7-8의 결정된 DNA 서열이다.
서열 16은 2C7-8이 지도작성하는 씨.트라코마티스 혈청형 D 게놈의 영역 유래의 추정상의 오픈 리딩 프레임의 DNA 서열이다.
서열 17은 서열 16의 DNA 서열에 의해 암호화된 추정상의 아미노산 서열이다.
서열 18은 합성 펩타이드 CtC7.8-12의 아미노산 서열이다.
서열 19는 합성 펩타이드 CtC7.8-13의 아미노산 서열이다.
서열 20은 씨.트라코마티스 혈청형 D 유래의 제2의 추정상의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 추정상의 아미노산 서열이다.
서열 21은 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 클론 4C9-18의 결정된 DNA 서열이다.
서열 22는 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 리포아미드 탈수소효소에 상동성인 결정된 DNA 서열이다.
서열 23은 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 추정상의 단백질에 상동성인 결정된 DNA 서열이다.
서열 24는 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 유비퀴논 메틸트란스퍼라제에 상동성인 결정된 DNA 서열이다.
서열 25는 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 클론 4C9-18#2 BL21 pLysS의 결정된 DNA 서열이다.
서열 26은 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 4C9-18#2의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 27은 씨.뉴모니아 균주 TWAR 유래의 Cp-SWIB의 결정된 DNA 서열이다.
서열 28은 씨.뉴모니아 균주 TWAR 유래의 Cp-SWIB의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 29는 씨.뉴모니아 균주 TWAR 유래의 Cp-S13의 결정된 DNA 서열이다.
서열 30은 씨.뉴모니아 균주 TWAR 유래의 Cp-S13의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 31은 CtC7.8-12 및 CtC7.8-13 유래의 10량체 콘센서스 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 32는 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 클론 2C7-8의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 33은 클론 2C7-8에 상동성을 나타내는 씨.트라코마티스 혈청형 D 게놈(NCBI, BLASTN 조사)의 뉴클레오타이드 597304 내지 597145에 해당하는 DNA 서열이다.
서열 34는 서열 33의 서열에 의해 암호화된 추정된 아미노산 서열이다.
서열 35는 씨.뉴모니아 유래의 C.p.SWIB Nde(5' 프라이머)의 DNA 서열이다.
서열 36은 씨.뉴모니아 유래의 C.p.SWIB EcoRI(3' 프라이머)의 DNA 서열이다.
서열 37은 씨.뉴모니아 유래의 C.p.S13 Nde(5' 프라이머)의 DNA 서열이다.
서열 38은 씨.뉴모니아 유래의 C.p.S13 EcoRI(3' 프라이머)의 DNA 서열이다.
서열 39는 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 CtSwib 52 내지 67 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 40은 씨.뉴모니아 유래의 CpSwib 53 내지 68 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 41은 사람 SWI 도메인 유래의 HuSwib 288 내지 302 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 42는 씨.트라코마티스의 토포이소머라제-SWIB 융합체 유래의 CtSWI-T 822 내지 837 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 43은 씨.뉴모니아의 토포이소머라제-SWIB 융합체 유래의 CpSWI-T 828-842 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 44는 3' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19783.3,jen.seq(1>509)CTL2#11-3'의 1차 결정된 DNA 서열이다.
서열 45는 5' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19783.4,jen.seq(1>481)CTL2#11-5'의 2차 결정된 DNA 서열이다.
서열 46은 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19784CTL2_12콘센서스.seq(1>427)CTL2#12의 결정된 DNA 서열이다.
서열 47은 5' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19785.4,jen.seq(1>600)CTL2#16-5'의 결정된 DNA 서열이다.
서열 48은 3' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19786.3,jen.seq(1>600)CTL2#18-3'의 1차 결정된 DNA 서열이다.
서열 49는 5' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19786.4,jen.seq(1>600)CTL2#18-5'의 2차 결정된 DNA 서열이다.
서열 50은 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19788CTL2_21콘센서스.seq(1>406)CTL2#21의 결정된 DNA 서열이다.
서열 51은 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19790CTL2_23콘센서스.seq(1>602)CTL2#23의 결정된 DNA 서열이다.
서열 52는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19791CTL2_24콘센서스.seq(1>145)CTL2#24의 결정된 DNA 서열이다.
서열 53은 씨.트라코마티스 LGV II 클론 CTL2#4의 결정된 DNA 서열이다.
서열 54는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 CTL2#8b의 결정된 DNA 서열이다.
서열 55는 리포아마이드 탈수소효소 유전자 CT557에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 15-G1-89의 결정된 DNA 서열이다.
서열 56은 티올 특이적인 항산화제 유전자 CT603에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 14-H1-4의 결정된 DNA 서열이다.
서열 57은 추정상의 단백질 CT622에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 12-G3-83의 결정된 DNA 서열이다.
서열 58은 리포아마이드 탈수소효소 유전자 CT557에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 12-B3-95의 결정된 DNA 서열이다.
서열 59는 dnaK 유전자 CT396에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 11-H4-28의 결정된 DNA 서열이다.
서열 60은 PGP6-D 독성 단백질 및 L1 리보솜 유전자 CT318에 대한 부분적 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 11-H3-68의 결정된 DNA 서열이다.
서열 61은 말레이트 탈수소효소 유전자 CT376 및 글리코겐 가수분해효소 유전자 CT042에 대한 부분적 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 11-G1-34의 결정된 DNA 서열이다.
서열 62는 추정상의 단백질 CT610에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 11-G10-46의 결정된 DNA 서열이다.
서열 63은 OMP2 유전자 CT443에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 11-G12-91의 결정된 DNA 서열이다.
서열 64는 HAD 상위부류(superfamily) 유전자 CT103에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 11-A3-93의 결정된 DNA 서열이다.
서열 65는 티올 특이적인 항산화제 유전자 CT603에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 14-H1-4의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 66은 씨.트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#9의 결정된 DNA 서열이다.
서열 67은 씨.트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#7의 결정된 DNA 서열이다.
서열 68은 씨.트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#6의 결정된 DNA 서열이다.
서열 69는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#5의 결정된 DNA 서열이다.
서열 70은 씨.트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 71은 씨.트라코마티스 LGV II 클론 CtL2#1의 결정된 DNA 서열이다.
서열 72는 5' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 23509.2CtL2#3-5'의 1차 결정된 DNA 서열이다.
서열 73은 3' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 23509.1CtL2#3-3'의 2차 결정된 DNA 서열이다.
서열 74는 5' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 LGV II 클론22121.2CtL2#10-5'의 1차 결정된 DNA 서열이다.
서열 75는 3' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 22121.1CtL2#10-3'의 2차 결정된 DNA 서열이다.
서열 76은 5' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19787.6CtL2#19-5'의 결정된 DNA 서열이다.
서열 77은 씨.뉴모니아 LGV II 클론 CpS13-His의 결정된 DNA 서열이다.
서열 78은 씨.뉴모니아 LGV II 클론 Cp-SWIB-His의 결정된 DNA 서열이다.
서열 79는 L11, L10 및 L1 리보솜 단백질에 대한 부분적 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 23-G7-68의 결정된 DNA 서열이다.
서열 80은 pmpC 유전자에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 22-F8-91의 결정된 DNA 서열이다.
서열 81은 CT610-CT613 유전자에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 21-E8-95의 결정된 DNA 서열이다.
서열 82는 CT858 및 recA 유전자에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19-F12-57의 결정된 DNA 서열이다.
서열 83은 글루타밀 tRNA 신테타제를 암호하는 CT445 유전자에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19-F12-53의 결정된 DNA 서열이다.
서열 84는 잠재 플라스미드(cryptic plasmid) 유전자에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 19-A5-54의 결정된 DNA 서열이다.
서열 85는 OppC_2 및 pmpD 유전자에 대한 부분적 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 17-E11-72의 결정된 DNA 서열이다.
서열 86은 CT857 및 CT858 오픈 리딩 프레임에 대한 부분적 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 17-C1-77의 결정된 DNA 서열이다.
서열 87은 pmpD 및 SycE 유전자, 및 CT089 ORF에 대한 부분적 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 15-H2-76의 결정된 DNA 서열이다.
서열 88은 CT858 ORF에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 15-A3-26의 결정된 DNA 서열이다.
서열 89는 씨.뉴모니아 클론 Cp_SWIB-His의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 90은 씨.트라코마티스 LGV II 클론 CtL2_LPDA_FL의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 91은 씨.뉴모니아 클론 CpS13-His의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 92는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 CtL2_TSA-FL의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 93은 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 Ct-Swib 43-61 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 94는 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 Ct-Swib 48-67 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 95는 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 Ct-Swib 52 내지 71 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 96은 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 Ct-Swib 58 내지 77 펩타이드의아미노산 서열이다.
서열 97은 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 Ct-Swib 63 내지 82 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 98은 씨.트라코마티스 LGV II 유래의 Ct-Swib 51 내지 66 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 99는 씨.뉴모니아 유래의 Cp-Swib 52 내지 67 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 100은 씨.뉴모니아 유래의 Cp-Swib 37 내지 51 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 101은 씨.뉴모니아 유래의 Cp-Swib 32 내지 51 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 102는 씨.뉴모니아 유래의 Cp-Swib 37 내지 56 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 103은 씨.트라코마티스 유래의 Ct-Swib 36 내지 50 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 104는 씨.트라코마티스 유래의 Ct-S13 46 내지 65 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 105는 씨.트라코마티스 유래의 Ct-S13 60 내지 80 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 106은 씨.트라코마티스 유래의 Ct-S13 1 내지 20 펩타이드의 아미노산서열이다.
서열 107은 씨.트라코마티스 유래의 Ct-S13 46 내지 65 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 108은 씨.트라코마티스 유래의 Ct-S13 56 내지 75 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 109는 씨.뉴모니아 유래의 Cp-S13 56 내지 75 펩타이드의 아미노산 서열이다.
서열 110은 추정상의 단백질 CT875, CT229 및 CT228의 부분적 오픈 리딩 프레임을 포함하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 21-G12-69의 결정된 DNA 서열이다.
서열 111은 GroEL의 CT110 ORF에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 22-B3-53의 결정된 DNA 서열이다.
서열 112는 CT660 및 CT659 ORF에 대한 부분적 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 22-A1-49의 결정된 DNA 서열이다.
서열 113은 CT611 및 CT610 ORF에 대한 부분적 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 17-E2-9의 결정된 DNA 서열이다.
서열 114는 CT858 ORF에 대한 부분적 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 17-C10-31의 결정된 DNA 서열이다.
서열 115는 dnaK계 유전자에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 21-C7-66의 결정된 DNA 서열이다.
서열 116은 pmpB 유전자 CT413의 일부를 포함하는 씨.트라코마티스 LGV II클론 20-G3-45의 결정된 DNA 서열이다.
서열 117은 S1 리보솜 단백질 ORF에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 18-C5-2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 118은 CT431 및 CT430의 ORF 일부를 포함하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 17-C5-19의 결정된 DNA 서열이다.
서열 119는 포유동물 세포에 존재하는 성장용 플라스미드의 ORF3 및 ORF4의 부분 서열을 포함하는 씨.트라코마티스 LGV II 클론 16-D4-22의 결정된 DNA 서열이다.
서열 120은 씨.트라코마티스 혈청형 LGV II Cap1 유전자 CT529의 결정된 전장의 DNA 서열이다.
서열 121은 씨.트라코마티스 혈청형 LGV II Cap1 유전자 CT529의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 122는 씨.트라코마티스 혈청형 E Cap1 유전자 CT529의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 123은 씨.트라코마티스 혈청형 E Cap1 유전자 CT529의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 124는 씨.트라코마티스 혈청형 1A Cap1 유전자 CT529의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 125는 씨.트라코마티스 혈청형 1A Cap1 유전자 CT529의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 126은 씨.트라코마티스 혈청형 G Cap1 유전자 CT529의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 127은 씨.트라코마티스 혈청형 G Cap1 유전자 CT529의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 128은 씨.트라코마티스 혈청형 F1 NII Cap1 유전자 CT529의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 129는 씨.트라코마티스 혈청형 F1 NII Cap1 유전자 CT529의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 130은 씨.트라코마티스 혈청형 L1 Cap1 유전자 CT529의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 131은 씨.트라코마티스 혈청형 L1 Cap1 유전자 CT529의 결정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 132는 씨.트라코마티스 혈청형 L3 Cap1 유전자 CT529의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 133은 씨.트라코마티스 혈청형 L3 Cap1 유전자 CT529의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 134는 씨.트라코마티스 혈청형 Ba Cap1 유전자 CT529의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 135는 씨.트라코마티스 혈청형 Ba Cap1 유전자 CT529의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 136은 씨.트라코마티스 혈청형 MOPN Cap1 유전자 CT529의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 137은 씨.트라코마티스 혈청형 MOPN Cap1 유전자 CT529의 추정된 전장 DNA 서열이다.
서열 138은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #124 내지 139의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 139는 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #132 내지 147의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 140은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #138 내지 155의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 141은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #146 내지 163의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 142는 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #154 내지 171의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 143은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #162 내지 178의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 144는 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #138 내지 147의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 145는 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #139 내지 147의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 146은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #140 내지 147의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 147은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #138 내지 146의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 148은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #138 내지 145의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 149는 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 #F140->I의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 150은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 ##S139>Ga의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 151은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 Cap1 CT529 ORF 펩타이드 ##S138>Ga의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 152는 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 216aa ORF의 펩타이드 #2 C7.8-6의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 153은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 216aa ORF의 펩타이드 #2 C7.8-7의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 154는 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 216aa ORF의 펩타이드 #2 C7.8-8의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 155는 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 216aa ORF의 펩타이드 #2 C7.8-9의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 156은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 216aa ORF의 펩타이드 #2 C7.8-10의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 157은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 클론 2C7.8내에 존재하는 216aa ORF의 53개 아미노산 잔기 펩타이드의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 158은 씨.트라코마티스 혈청형 L2의 클론 2C7.8내에 존재하는 CT529 ORF의 52개 아미노산 잔기 펩타이드의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 159는 전장 CT529 혈청형 L2를 클로닝하기 위한 5'(정방향) 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 160은 전장 CT529 혈청형 L2를 클로닝하기 위한 5'(역방향) 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 161은 L2 및 MOPN 이외의 다른 혈청형의 전장 CT529를 클로닝하기 위한 5'(정방향) 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 162는 L2 및 MOPN 이외의 다른 혈청형의 전장 CT529를 클로닝하기 위한 5'(역방향) 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 163은 전장 CT529 혈청형 MOPN을 클로닝하기 위한 5'(정방향) 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 164는 전장 CT529 혈청형 MOPN을 클로닝하기 위한 5'(역방향) 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 165는 pBIB-KS의 5'(정방향) 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 166은 pBIB-KS의 5'(역방향) 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 167은 혈청형 L2 유래의 9량체 에피토프 펩타이드 Cap1#139-147의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 168은 혈청형 D 유래의 9량체 에피토프 펩타이드 Cap1#139-147의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 169는 씨.트라코마티스 pmpI 유전자의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 170은 씨.트라코마티스 pmpG 유전자의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 171은 씨.트라코마티스 pmpE 유전자의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 172는 씨.트라코마티스 pmpD 유전자의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 173은 씨.트라코마티스 pmpC 유전자의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 174는 씨.트라코마티스 pmpB 유전자의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 175는 씨.트라코마티스 pmpI 유전자의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 176은 씨.트라코마티스 pmpG 유전자의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 177은 씨.트라코마티스 pmpE 유전자의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 178은 씨.트라코마티스 pmpD 유전자의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 179는 씨.트라코마티스 pmpC 유전자의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 180은 씨.트라코마티스 pmpB 유전자의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 181은 씨.트라코마티스 pmpI 유전자의 시그널 서열을 제외한 결정된 DNA 서열이다.
서열 182는 씨.트라코마티스 pmpG 유전자의 후속으로 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 183은 씨.트라코마티스 pmpE 유전자의 시그널 서열을 제외한 결정된 DNA 서열이다.
서열 184는 씨.트라코마티스 pmpD 유전자의 카르복시 말단을 나타내는 1차 결정된 DNA 서열이다.
서열 185는 씨.트라코마티스 pmpD 유전자의 시그널 서열을 제외한 아미노 말단을 나타내는 2차 결정된 DNA 서열이다.
서열 186은 씨.트라코마티스 pmpC 유전자의 카르복시 말단을 나타내는 1차 결정된 DNA 서열이다.
서열 187은 씨.트라코마티스 pmpC 유전자의 시그널 서열을 제외한 아미노 말단을 나타내는 2차 결정된 DNA 서열이다.
서열 188은 Ra12와 융합 분자인 상태에서 씨.뉴모니아 혈청형 MOMPS pmp 유전자를 나타내는 결정된 DNA 서열이다.
서열 189는 씨.트라코마티스 pmpI 유전자의 시그널 서열을 제외한 추정된 아미노산 서열이다.
서열 190은 씨.트라코마티스 pmpG 유전자에 대하여 후속으로 추정된 아미노산 서열이다.
서열 191은 씨.트라코마티스 pmpE 유전자에 대한 시그널 서열을 제외한 추정된 아미노산 서열이다.
서열 192는 씨.트라코마티스 pmpD 유전자의 카르복시 말단을 나타내는 1차 추정된 아미노산 서열이다.
서열 193은 씨.트라코마티스 pmpD 유전자의 시그널 서열을 제외한 아미노 말단을 나타내는 2차 추정된 아미노산 서열이다.
서열 194는 씨.트라코마티스 pmpC 유전자의 카르복시 말단을 나타내는 1차 추정된 아미노산 서열이다.
서열 195는 씨.트라코마티스 pmpC 유전자의 아미노 말단을 나타내는 2차 추정된 아미노산 서열이다.
서열 196은 Ra12와 융합 분자인 상태에서 씨.뉴모니아 혈청형 MOMPS pmp 유전자를 나타내는 추정된 아미노산 서열이다.
서열 197은 SKB 백신 벡터에 씨.트라코마티스 pmpC 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 5' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 198은 SKB 백신 벡터에 씨.트라코마티스 pmpC 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 3' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 199는 SKB 백신 벡터에 씨.트라코마티스 pmpC 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 삽입 서열의 결정된 DNA 서열이다.
서열 200은 SKB 백신 벡터에 씨.트라코마티스 pmpD 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 5' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 201은 SKB 백신 벡터에 씨.트라코마티스 pmpD 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 3' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 202는 SKB 백신 벡터에 씨.트라코마티스 pmpD 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 삽입 서열의 결정된 DNA 서열이다.
서열 203은 SKB 백신 벡터에 씨.트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 5' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 204는 SKB 백신 벡터에 씨.트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 3' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 205는 SKB 백신 벡터에 씨.트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 5' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 206은 SKB 백신 벡터에 씨.트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 3' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 207은 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpC 유전자의 아미노 말단부를 클로닝하는데 사용하기 위한 5' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 208은 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpC 유전자의 아미노 말단부를 클로닝하는데 사용하기 위한 3' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 209는 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpC 유전자의 카르복시 말단부를 클로닝하는데 사용하기 위한 5' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 210은 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpC 유전자의 카르복시 말단부를 클로닝하는데 사용하기 위한 3' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 211은 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpD 유전자의 아미노 말단부를 클로닝하는데 사용하기 위한 5' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 212는 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpD 유전자의 아미노 말단부를 클로닝하는데 사용하기 위한 3' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 213은 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpD 유전자의 카르복시 말단부를 클로닝하는데 사용하기 위한 5' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 214는 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpD 유전자의 카르복시 말단부를 클로닝하는데 사용하기 위한 3' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 215는 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 5' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 216은 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 3' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 217은 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 삽입 서열의 결정된 DNA 서열이다.
서열 218은 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpE 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 삽입 서열의 아미노산 서열이다.
서열 219는 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 5' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 220은 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 3' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 221은 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 삽입 서열의 아미노산 서열이다.
서열 222는 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpI 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 5' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 223은 pET17b 벡터에 씨.트라코마티스 pmpI 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 3' 올리고 프라이머의 결정된 DNA 서열이다.
서열 224는 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 1-20의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 225는 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 6-25의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 226은 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 12-31의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 227은 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 17-36의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 228은 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 22-41의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 229는 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 27-46의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 230은 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 42-61의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 231은 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 46-65의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 232는 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 51-70의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 233은 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 56-75의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 234는 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 61-80의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 235는 씨.뉴모니아 Swib 펩타이드 66-87의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 236은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 103-122의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 237은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 108-127의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 238은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 113-132의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 239는 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 118-137의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 240은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 123-143의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 241은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 128-147의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 242는 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 133-152의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 243은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 137-156의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 244는 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 142-161의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 245는 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 147-166의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 246은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 152-171의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 247은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 157-176의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 248은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 162-181의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 249는 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 167-186의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 250은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 171-190의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 251은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 171-186의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 252는 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 175-186의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 253은 씨.트라코마티스 OMCB 펩타이드 185-198의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 254는 씨.트라코마티스 TSA 펩타이드 96-115의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 255는 씨.트라코마티스 TSA 펩타이드 101-120의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 256은 씨.트라코마티스 TSA 펩타이드 106-125의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 257은 씨.트라코마티스 TSA 펩타이드 111-130의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 258은 씨.트라코마티스 TSA 펩타이드 116-135의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 259는 씨.트라코마티스 TSA 펩타이드 121-140의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 260은 씨.트라코마티스 TSA 펩타이드 126-145의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 261은 씨.트라코마티스 TSA 펩타이드 131-150의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 262는 씨.트라코마티스 TSA 펩타이드 136-155의 결정된 아미노산 서열이다.
서열 263은 씨.트라코마티스 CT529/Cap1 유전자 혈청형 I의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 264는 씨.트라코마티스 CT529/Cap1 유전자 혈청형 I의 결정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 265는 씨.트라코마티스 CT529/CapI 유전자 혈청형 K의 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 266은 씨.트라코마티스 CT529/Cap1 유전자 혈청형 K의 추정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 267은 serD에 존재하는 DNA-지시된 RNA 폴리머라제 베타 아단위-CT315의 ORF 일부에 대한 상동성을 공유하는 씨.트라코마티스 클론 17-G4-36의 결정된 DNA 서열이다.
서열 268은 클론 2E10에 존재하는 씨.트라코마티스 CT016 유전자의 부분 서열에 대하여 결정된 DNA 서열이다.
서열 269는 클론 2E10에 존재하는 씨.트라코마티스 tRNA 신타제 유전자의 부분 서열에 대하여 결정된 DNA 서열이다.
서열 270은 클론 2E10에 존재하는 씨.트라코마티스 clpX 유전자의 부분 서열에 대하여 결정된 DNA 서열이다.
서열 271은 5' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-30의 1차 결정된 DNA 서열이다.
서열 272는 3' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-30의 2차 결정된 DNA 서열이다.
서열 273은 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-28의 결정된 DNA 서열이다.
서열 274는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-27의 결정된 DNA 서열이다.
서열 275는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-26의 결정된 DNA 서열이다.
서열 276은 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-24의 결정된 DNA 서열이다.
서열 277은 C,트라코마티스 클론 CtL2gam-23의 결정된 DNA 서열이다.
서열 278은 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-21의 결정된 DNA 서열이다.
서열 279는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-18의 결정된 DNA 서열이다.
서열 280은 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-17의 결정된 DNA 서열이다.
서열 281은 5' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-15의 1차 결정된 DNA 서열이다.
서열 282는 3' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-15의 2차 결정된 DNA 서열이다.
서열 283은 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-13의 결정된 DNA 서열이다.
서열 284는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-10의 결정된 DNA 서열이다.
서열 285는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-8의 결정된 DNA 서열이다.
서열 286은 5' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-6의 1차 결정된 DNA 서열이다.
서열 287은 3' 말단을 나타내는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-6의 2차 결정된 DNA 서열이다.
서열 288은 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-5의 결정된 DNA 서열이다.
서열 289는 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-2의 결정된 DNA 서열이다.
서열 290은 씨.트라코마티스 클론 CtL2gam-1의 결정된 DNA 서열이다.
서열 291은 CT529 유전자의 씨.뉴모니아 동족체에 대하여 결정된 전장 DNA 서열이다.
서열 292는 CT529 유전자의 씨.뉴모니아 동족체에 대하여 결정된 전장 아미노산 서열이다.
서열 293은 SKB 백신 벡터에서 씨.트라코마티스 pmpG 유전자를 클로닝하는데 사용하기 위한 삽입 유전자의 결정된 DNA 서열이다.
서열 294는 클론 CT603의 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 295는 클론 CT875의 제1 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 296은 클론 CT875의 제2 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 297은 클론 CT858의 제1 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 298은 클론 CT858의 제2 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 299는 클론 CT622의 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 300은 클론 CT610의 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 301은 클론 CT396의 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 302는 클론 CT318의 오픈 리딩 프레임의 아미노산 서열이다.
서열 304는 변형된 N-말단 서열(6-His 태그)을 가진 씨.트라코마티스 혈청형 L2 rCt529c1-125의 아미노산 서열이다.
서열 305는 씨.트라코마티스 혈청형 L2 rCt529c1-125의 아미노산 서열이다.
서열 306은 PmpA(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 307은 PmpA(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 308은 PmpA(N-말단) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 309는 PmpA(N-말단) 융합 단백질을 암호화하는 아미노산 서열이다.
서열 310은 PmpA(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 311은 PmpA(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 312는 PmpA(C-말단) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 313은 PmpA(C-말단) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 314는 PmpF(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 315는 PmpF(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 316은 PmpF(N-말단) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 317은 PmpF(N-말단) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 318은 PmpF(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 319는 PmpF(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 320은 PmpF(C-말단) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 321은 PmpF(C-말단) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 322는 PmpH(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 323은 PmpH(N-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 324는 PmpH(N-말단) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 325는 PmpH(N-말단) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 326은 PmpH(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 327은 PmpH(C-말단) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 328은 PmpH(C-말단) 융합 단백질을 암호하하는 DNA 서열이다.
서열 329는 PmpH(C-말단) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 330은 PmpB(1) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 331은 PmpB(1) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 332는 PmpB(1) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 333은 PmpB(1) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 334는 PmpB(2) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 335는 PmpB(2) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 336은 PmpB(2) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 337은 PmpB(2) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 338은 PmpB(3) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 339는 PmpB(3) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 340은 PmpB(3) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 341은 PmpB(3) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 342는 PmpB(4) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 343은 PmpB(4) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 344는 PmpB(4) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 345는 PmpB(4) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 346은 PmpC(1) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 347은 PmpC(1) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 348은 PmpC(1) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 349는 PmpC(1) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 350은 PmpC(2) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 351은 PmpC(2) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 352는 PmpC(2) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 353은 PmpC(2) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 354는 PmpC(3) 융합 단백질의 합성에 사용되는 센스 프라이머이다.
서열 355는 PmpC(3) 융합 단백질의 합성에 사용되는 안티센스 프라이머이다.
서열 356은 PmpC(3) 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 357은 PmpC(3) 융합 단백질의 아미노산 서열이다.
본 발명은 일반적으로 클라미디아(Chlamydia) 감염의 검출 및 치료 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 클라미디아 항원을 포함하는 폴리펩타이드 및 클라미디아 감염의 혈청진단 및 치료에 사용하기 위한 상기 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다.
도 1은 클론 4C9-18#2를 발현하는 표적 세포에 의해 활성화된 클라미디아-특이적 T 세포주로부터 유래되는 INF-γ의 유도성을 도시한 것이다.
도 2는 코작 해독 개시 부위와 종결 코돈을 포함하도록 변형시킨 레트로바이러스 벡터 pBIB-KS1,2,3을 도시한 것이다.
도 3은 클라미디아 펩타이드 CtC7.8-12(서열 18) 및 CtC7.8-13(서열 19)으로펄스된 P815 세포의 크롬 방출 분석에서 나타나는 특이적 용균률을 도시한 것이다.
도 4는 씨.트라코마티스 SWIB 단백질로 면역화된 C57B1/6 마우스에서 나타내는 항체 동종형(isotype)의 역가를 도시한 것이다.
도 5는 씨.트라코마티스 SWIB 단백질로 면역화된 C3H 마우스의 비장세포에서 나타나는 클라미디아-특이적 T 세포 증식 반응을 도시한 것이다.
도 6은 씨.뉴모니아 유래의 SWIB 및 S13 유전자를 분리하는데 사용된 씨.뉴모니아로부터 디자인된 5' 프라이머 및 3' 프라이머 서열을 도시한 것이다.
도 7A 및 도 7B는 클라미디아 단백질을 발현하는 단핵구 유래의 수지상 세포에 의해 활성화시 씨.트라코마티스 및 씨.뉴모니아와 교차반응할 수 있는 사람 항-클라미디아 T-세포주(TCL-8)로부터 유래되는 IFN-γ의 유도성을 도시한 것이다.
도 8은 T-세포주 TCL 8 EB/DC를 이용한 클라미디아 리보솜 S13 단백질내의 T 세포 에피토프의 동정 결과를 도시한 것이다.
도 9는 씨.트라코마티스 SWIB 단백질을 제외한 재조합 씨.뉴모니아 SWIB 단백질에 대하여 씨.뉴모니아로 감염된 수지상 세포에 대해 발생된 CP-21 T-세포의 증식 반응성을 도시한 것이다.
도 10은 무증후성 공여자 유래의 1차 T-세포주(TCT-10EB)에 의한 씨.트라코마티스-특이적 SWIB 증식 반응을 도시한 것이다.
도 11은 항원 특이적 T-세포주(TCL-10 EB)를 이용한 씨.트라코마티스 SWIB내 T-세포 에피토프의 동정 결과를 도시한 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 개괄적으로 클라미디아 감염을 진단 및 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일 관점으로서, 본 발명의 조성물은 클라미디아 항원의 면역원성 부분을 적어도 하나 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체를 포함한다.
특정 구체예로서, 본 발명은 (a) 서열 1, 15, 21-25, 44-64, 66-76, 79-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 및 267-290에 기재된 뉴클레오타이드 서열, (b) 이 뉴클레오타이드 서열들의 상보체, 및 (c) 이 서열들의 변이체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 항원의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 개시한다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산 잔기가 공유 펩타이드 결합에 의해 결합된 전장 단백질(즉, 항원)을 비롯한 모든 길이의 아미노산쇄를 포함하는 것이다. 따라서, 본 발명의 항원 중 하나의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 전적으로 면역원성 부분으로만 이루어지거나 또는 부가 서열을 포함할 수 있다. 부가 서열은 본래의 클라미디아 항원에서 유래되는 것이거나 또는 이종성일 수 있으며, 이러한 서열은 면역원성일 수 있다(그러나, 반드시 면역원성일 필요는 없다).
본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 데옥시리보뉴클레오타이드 염기 또는 리보뉴클레오타이드 염기의 1본쇄 또는 2본쇄 중합체를 의미하는 것으로서, HnRNA 및 mRNA 분자, 센스 쇄와 안티센스 쇄를 포함하는 DNA 분자 및 이에 상응하는 RNA분자를 포함하며, 완전 합성 또는 부분 합성된 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 cDNA, 게놈 DNA 및 재조합 DNA도 포함한다. HnRNA 분자는 인트론을 포함하고 일반적으로 1:1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 것이다. mRNA 분자는 인트론이 삭제된 DNA 분자 및 HnRNA에 상응하는 것이다. 폴리뉴클레오타이드는 전체 유전자 또는 이의 임의의 일부분으로 이루어질 수 있다. 작동가능한 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 상응하는 폴리뉴클레오타이드의 단편을 포함할 수 있고, 따라서 "폴리뉴클레오타이드"의 정의는 이와 같은 모든 작동가능한 안티센스 단편을 포함한다.
항원의 "면역원성 부분"은 클라미디아에 감염된 개체에서 얻어진 혈청과 반응할 수 있는 부분(즉, 본 명세서에 개시된 대표적인 ELISA 분석에서 감염된 개체 유래의 혈청에 의해 얻어진 흡광도가 감염되지 않은 개체의 혈청에 의해 얻어진 흡광도 보다 3 이상의 표준 편차를 나타내는 부분)를 의미한다. 이와 같은 면역원성 부분은 일반적으로 약 5개 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 약 10개 이상, 가장 바람직하게는 약 20개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 서열이 공지된 항원의 면역원성 부분을 제조 및 동정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 문헌[Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., Raven Press, 1993, pp.243-247] 및 본 명세서에 인용된 참고문헌에 요약된 것들을 포함한다. 이 기술은 항원-특이적 항체, 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 특성에 대하여 폴리펩타이드를 스크리닝하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용된 항혈청 및 항체는 항원에 특이적으로 결합한다면(즉, ELISA 또는 다른 면역분석법에서 상기 단백질과 반응하고 관련이 없는 단백질에 의해서는 검출가능하게 반응하지 않는다면) "항원 특이적"인 것이다. 이러한 항혈청 및 항체는 공지된 기법을 사용하여 본 명세서에 설명된 바와 같이 제조할 수 있다. 천연 클라미디아 단백질의 면역원성 부분은 이와 같은 항혈청 및/또는 T-세포와 전장의 폴리펩타이드의 반응성(예컨대, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 분석에서) 보다 상당히 적지 않은 정도로 반응하는 부분이다. 이와 같은 면역원성 부분은 전장의 폴리펩타이드의 반응성과 유사하거나 또는 보다 큰 정도로 상기 분석에서 반응할 수 있다. 상기 스크리닝은 일반적으로 당업자에게 공지된 방법, 예컨대 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 설명된 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 고체 지지체 상에 고정한 후, 환자의 혈청과 접촉시켜 고정된 폴리펩타이드에 대하여 혈청에 존재하는 항체가 결합할 수 있도록 한다. 그 다음, 결합되지 않은 혈청은 제거하고 결합된 항체는 예를 들어125I-표지된 단백질 A를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명에 의해 고찰되는 항원의 면역원성 부분의 예로는 예컨대 서열 9, 10, 18, 19, 31, 39, 93 내지 96, 98, 100 내지 102, 106, 108, 138 내지 140, 158, 167, 168, 246, 247 및 254 내지 256에 제시된 T 세포 자극 에피토프를 포함한다. 본 명세서에 개시된 1종 이상의 클라미디아 항원의 최소한 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 단독으로 또는 혼합되어 환자의 클라미디아 감염을 측정하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물 및 방법은 상기 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 분자의 변이체를 포함한다. 이와 같은 변이체는 비제한적으로 본 발명에 따른 서열의 자연 발생의 대립유전자 변이체를 포함한다. 특히, 변이체에는 다른 클라미디아 혈청형, 예컨대 혈청형 D, E 및 F 뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드와 상동성을 공유하는 여러 LGV 혈청형을 포함한다. 혈청형 동족체는 본 명세서에 개시된 상응하는 폴리펩타이드 서열과 95 내지 99%의 상동성을 나타내는 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된 폴리펩타이드 "변이체"란 용어는 폴리펩타이드의 항원성은 유지되도록 인용된 폴리펩타이드와 보존적 치환 및/또는 변형에 의해서만 상이한 폴리펩타이드를 의미한다. 바람직한 구체예에서, 변이체 폴리펩타이드는 아미노산 5개 이하의 치환, 결실 또는 첨가에 의해서 동정된 서열과 상이한 것이 좋다. 이와 같은 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩타이드 서열의 하나를 변형시키고, 예를 들어 본 명세서에 기술된 대표적 절차를 사용하여 변형된 폴리펩타이드의 항원성을 평가하여 확인할 수 있다. 즉, 항원 특이적 항혈청과 반응하는 변이체의 특성은 천연 단백질과 비교하여 증가되거나 변동이 없거나 또는 천연 단백질과 비교하여 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만까지 감소될 수 있다. 이와 같은 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩타이드 서열의 하나를 변형시키고 본 명세서에 설명된 항원 특이적 항체 또는 항혈청과 변형된 폴리펩타이드의 반응성을 평가하여 확인할 수 있다. 바람직한 변형체는 1 이상의 부분, 예컨대 N-말단 리더 서열 또는막관통(transmenbrane) 도메인이 제거된 것을 포함한다. 다른 바람직한 변이체로는 소형 부분(예컨대, 1 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개 아미노산)이 성숙 단백질의 N 및/또는 C-말단으로부터 제거된 변이체가 포함된다.
본 명세서에 사용된 "보존적 치환"이란 용어는 펩타이드 화학 기술 분야의 전문가가 예상하기에 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치료(hydropathic) 성질이 거의 변화되지 않을 정도로 유사한 성질을 가진 다른 아미노산으로 치환된 것을 의미한다. 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성의 유사성에 근거하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음전하를 띤 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양하전을 띤 아미노산으로는 리신 및 아르기닌을 포함하며; 친수성이 비슷한 하전을 띠지 않는 극성 헤드 기를 가진 아미노산으로는 로이신, 이소로이신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 타이로신을 포함한다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 아미노산의 다른 그룹으로는 (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his을 포함한다. 변이체는 또한 또는 대안적으로 비보존적 변화를 포함할 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 변이체 폴리펩타이드는 5개 이하의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 천연 서열과 상이하다. 변이체는 또한(또는 대안적으로), 예를 들어 폴리펩타이드의 면역원성, 2차 구조 및 수치료성에 최소 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 첨가에 의해 변형될 수 있다. 변이체는 또한(또는 대안적으로) 폴리펩타이드의 항원성, 2차구조 및 수치료성에 최소 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 첨가를 비롯한 다른 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 해독과 동시에 또는 해독후에 단백질의 전이를 유도하는 단백질의 N-말단부에 시그널(또는 리더) 서열이 접합될 수 있다. 이 폴리펩타이드는 또한 폴리펩타이드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해, 또는 고체 지지체에 폴리펩타이드의 결합을 증가시키기 위해 링커 또는 다른 서열(예, 폴리-His)에 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 면역글로불린 Fc 영역과 접합할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 "변이체"는 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성이 천연 단백질과 비교하여 감소하지 않을 정도로 1 이상의 뉴클레오타이드 결실, 치환 또는 첨가를 가진 점이 인용된 뉴클레오타이드 서열과 상이한 서열이다. 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성에 미치는 영향은 일반적으로 본 명세서에 제시된 바와 같이 평가할 수 있다. 이와 같은 변형은 표준 돌연변이유발 기법, 예를 들어 문헌[Adelman et al., DNA, 2:183, 1983]에 교시된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 유도성 부위 특이적 돌연변이유발법 등을 사용하여 도입하기가 용이하다. 뉴클레오타이드 변이체는 이하 기술되는 바와 같은 천연의 대립유전자 변형체 또는 비천연의 변이체일 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 폴리펩타이드는 본 명세서에 구체적으로 인용된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상동성인 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 변이체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "실질적인 상동성"이란 적당히 엄격한 조건하에 하이브리드할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 적합한 적당히 엄격한 조건으로는 5XSSC, 0.5% SDS,1.0mM EDTA(pH 8.0) 용액으로 예비세척하는 단계; 50 내지 65℃에서 5XSSC로 하룻밤 동안 하이브리드화하거나, 또는 종간(cross-species) 상동성인 경우에는 45℃에서 0.5XSSC로 하이브리드하는 단계; 그 다음 0.1% SDS를 함유하는 2XSSC, 0.5XSSC 및 0.2XSSC로 각각 65℃에서 20분 동안 2회씩 세척하는 단계를 포함한다. 유전암호 축퇴성으로 인하여 본 발명의 폴리펩타이드와 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 마찬가지로, 상기와 같이 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열 역시 본 발명의 영역에 속한다.
2개의 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 두 서열내 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 서열이 하기 기술되는 바와 같이 최대의 상응도로 정렬했을 때 동일하다면 "동일"한 것이라 할 수 있다. 두 서열간의 비교는 일반적으로 비교창에 있는 서열을 비교하여 서열 유사성이 있는 국소 영역을 동정 및 비교하므로써 실시한다. 본 명세서에 사용된 "비교창"이란 두 서열을 최적 상태로 정렬한 후 한 서열을 동일한 수의 연속 위치를 가진 대조 서열과 비교할 수 있는 약 20개 이상의 연속 위치, 일반적으로 30 내지 약 75개, 40 내지 약 50개의 연속 위치를 가진 절편을 의미한다.
비교용 서열의 최적의 정렬은 디폴트(default) 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어(DNASTAR, Inc., 미국 위스콘신주 매드슨 소재)의 레이저진 스윗(Lasergene suite)에 있는 메가라인(Megalign) 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 이 프로그램은 다음과 같은 참조문헌에 기술된 여러 정렬 구성을 구체화한 바 있다[Dayhoff,M.O.(1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff,M.O.(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol.5, Suppl.3, pp.345-358; Hein J.(1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins,D.G. and Sharp, P.M.(1989) Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer CABIOS 5:151-153; Myers,E.W. and Muller W.(1988) Optimal alignments in linear space CABIOS 4:11-17; Robinson,E.D.(1971) Comb.Theor 11:105; Santou,N. Nes,M.(1987) The neighbor joining method. A new method for reconstructing phylogenetic trees Mol.Biol.Evol. 4:406-425; Sneath,P.H.A. and Sokal,R.R.(1973) Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur,W.J. and Lipman,D.J.(1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks, Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 80:726-730].
대안적으로, 비교용 서열의 최적 정렬은 스미드와 워터만[Smith and Waterman (1981) Add.APL.Math 2:482]의 국소 동일성 알고리듬, 니들만과 운쉬[Needleman and Wunsch(1970) J.Mol.Biol. 48:443]의 동일성 정렬 알고리듬, 피어슨과 립만[Pearson and Lipman(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A) 85:2444]의 유사성 방법에 대한 연구, 이 알고리듬들의 전산화 실행(GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics ComputerGroup(GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 검사(inspection)에 의해 수행할 수 있다.
서열 동일성% 및 서열 유사성%를 측정하기에 적합한 알고리듬의 한 예는 BLAST 알고리듬과 BLAST 2.0 알고리듬으로서, 각각 문헌[Altschul et al.(1977) Nuc.Acids Res. 25:3389-3402] 및 문헌[Altschul et al.(1990) J.Mol.Biol. 215:403-410]에 기술되어 있다. BLAST와 BLAST 2.0은 예컨대 본 명세서에 기술된 파라미터와 함께 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드들의 서열 동일성%를 측정할 수 있다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 입수용이하다. 한가지 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열에 대한 누적 스코어는 파라미터 M(정합 잔기쌍에 대한 보상 스코어; 항상 >0) 및 N(부정합 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 <0)을 사용하여 계산할 수 있다. 아미노산 서열인 경우에는 스코어링 행렬을 사용하여 누적 스코어를 계산할 수 있다. 누적 정렬 스코어가 최대 도달 값에서부터 X 양만큼 떨어지거나, 누적 스코어가 1 이상의 음의 스코어를 나타내는 잔기의 정렬이 누적되어 0 이하가 되거나, 또는 어느 한 서열의 말단부에 도달했을 때에는 각 방향으로의 워드 히트(word hits) 신장이 중지된다. BLAST 알고리듬의 변수 W, T 및 X는 정렬의 민감성과 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드길이(W) 11과 기대값(E) 10을 사용하고, BLOSUM62 스코어링 행렬(Henikoff and Henikoff(1989) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:10915) 정렬은 (B) 50, 기대값(E) 10, M=5, N=-4 및 양 쇄의 비교를 사용한다.
바람직하게는, "서열 동일성%"은 20 위치 이상의 비교창 상에서 최적 정렬된 두 서열을 비교하여 측정하는데, 비교창내의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 일부는 두 서열을 최적 정렬시키기 위하여 대조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하였을 때 20% 이하, 보통 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 이 %는 양 서열에 나타나는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기의 위치의 수를 측정하여 정합 위치의 수를 얻고, 이 정합 위치의 수를 대조 서열(즉, 비교창 크기)의 총 위치수로 나눈 뒤, 그 결과값에 100을 곱하여 서열 동일성%를 수득한다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 서열과 실질적인 동일성이 있는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 폴리펩타이드 서열을 제공하며, 예를 들어 본 명세서에 설명된 방법(예를 들어, 하기 기술되는 바와 같은 표준 파라미터를 사용하는 BLAST 분석)을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 비교했을 때 50% 이상, 바람직하게는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 포함하는 서열을 제공한다. 당업자라면 이 값들은 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 위치 결정 등을 고려하여, 두 개의 폴리뉴클레오타이드 서열이 암호화하는 해당 동일성의 단백질들을 결정하도록 적당하게 조정할 수 있음을 잘 알고 있을 것이다.
또 다른 구체예로서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 1 이상의 서열과 동일하거나 또는 상보적인 다양한 길이의 연속 신장 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 1 이상의 개시된 서열들의 약 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 또는 1000 이상의 연속 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 이 수치들 사이의 모든 중간 길이의 서열들을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "중간 길이"는 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등과 같이 인용된 수치 사이의 모든 길이; 뿐만 아니라 200 내지 500; 500 내지 1000 사이의 모든 정수 등의 길이를 의미한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편은 암호 서열 자체의 길이에 관계없이 다른 DNA 서열, 예를 들어 프로모터, 폴리아데닐화 시그널, 추가 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 암호 절편 등과 결합하여 총 길이는 상당히 달라질 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있으며, 총 길이는 의도한 재조합 DNA 프로토콜의 제조 및 사용의 용이성에 의해서만 제한되는 것이 바람직하다고 생각된다. 예를 들어, 총 길이가 약 10000, 약 5000, 약 3000, 약 2000, 약 1000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50 염기쌍(이 사이의 모든 중간 길이도 포함됨) 등인 예시적인 DNA 절편은 본 발명의 다양한 실시에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
또한, 본 발명의 영역에는 본 명세서에 설명된 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 유전자의 대립유전자도 포함된다. 본 명세서에 사용된 "대립유전자" 또는 "대립유전자 서열"이란 용어는 핵산 서열에 1 이상의 돌연변이로부터 나타날 수 있는 유전자의 대체 형태이다. 대립유전자는 구조 또는 기능이 변화되거나 변화되지않은 변화된 mRNA 또는 폴리펩타이드를 산출할 수 있다. 제시된 모든 유전자는 대립유전자 형태가 없거나 또는 1개 또는 다수의 대립유전자 형태를 가질 수 있다. 대립유전자를 생성하는 일반적인 돌연변이적 변화는 일반적으로 뉴클레오타이드의 자연 결실, 첨가 또는 치환에 의한 것이다. 이러한 유형의 변화는 각각 단독으로 또는 다른 변화와 함께 소정 서열내에서 1회 이상 일어날 수 있다. 특정 구체예에서 본 발명은 (a) 서열 1 내지 4, 15, 21 내지 25, 44 내지 64, 66 내지 76 및 79 내지 88로 이루어진 그룹에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열; (b) 이 DNA 서열의 보체; 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b) 서열에 실질적으로 상동성인 DNA 서열에 의해 암호화되는 1 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 클라미디아 항원(또는 이 항원의 변이체)의 면역원성 부분을 최소한 포함하는 폴리펩타이드를 개시한다. 하기 실시예에서 설명되는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 여러 클라미디아 항원은 클라미디아 트라코마티스와 클라미디아 뉴모니아에 의해 감염된 단핵구 유래의 수지상 세포를 인식하는 T 세포주를 인식하며, 이것은 클라미디아 트라코마티스와 클라미디아 뉴모니아에 의해 면역반응성 에피토프가 공유될 수 있음을 시사한다. 따라서, 상기 항원들은 씨.트라코마티스 생식관 감염 및 씨.뉴모니아 감염용 백신에 이용될 수 있다. 교차반응성의 정도를 측정하기 위한 클라미디아 트라코마티스 및 클라미디아 뉴모니아 유래의 상기 클라미디아 항원들의 특성에 대해서는 하기 실시예 6에 설명하기로 한다. 또한, 실시예 4는 클라미디아-특이적인 쥐의 CD8+ T 세포주를 자극할 수 있는 단백질(서열 17 내지 19 및 32)을 암호화하는 씨.트라코마티스에서 분리된 cDNA 단편(서열 15, 16 및 33)을 예시한다.
일반적으로, 클라미디아 항원 및 이 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 다양한 절차를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 클라미디아 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 하기 기술된 바와 같은 클라미디아 특이적 T 세포주로 스크리닝하여 클라미디아 게놈 또는 cDNA 발현 라이브러리로부터 분리하고, 당업자에게 잘 알려진 기법을 사용하여 서열분석할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드의 확인은 이하에 보다 상세하게 설명되는 바와 같이 클라미디아 관련 발현(즉, 본 명세서에 제시된 대표 분석법을 사용하여 측정했을 때 대조군에서 보다 클라미디아 감염 세포에서 2배 이상 큰 발현)에 대하여 cDNA 마이크로어레이를 스크리닝하여 실시할 수 있다. 이러한 스크리닝은 제조자의 지시에 따라 (그리고 실질적으로 Schena et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:10614-10619, 1996 및 Heller et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:2150-2155, 1997 에 기술된 바와 같이) 신테니(Synteni) 마이크로어레이(Palo Alto, CA)를 사용하여 수행할 수 있다. 또는, 본 명세서에 개시된 단백질을 발현하는 세포로부터 제조된 cDNA를 사용하여 폴리펩타이드를 증폭시킬 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭시킬 수 있다. 이 시도에서 서열 특이적 프라이머는 본 명세서에 제시된 서열에 기초하여 디자인할 수 있고, 구입하거나 합성할 수 있다.
항원은 하기 기재된 바와 같이 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입하고 이 항원을 적당한 숙주에서 발현시켜 재조합 방식으로 생산할 수 있다. 항원은 목적하는 성질, 예컨대 본 명세서에 제시된 바와 같이 클라미디아 감염 개체로부터 수득한 혈청과의 반응성 등에 대하여 평가하고, 예를들어전통적인 에드만 화학을 사용하여 서열분석할 수 있다[Edman and Berg, Eur.J.Biochem. 80:116-132, 1967].
항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 분리된 항원의 부분 아미노산 서열에서 유래된 축퇴성 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대하여 적당한 클라미디아 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하여 수득할 수 있다. 이러한 스크리닝에 유용한 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 서열은 디자인 및 합성할 수 있으며, 스크리닝은 문헌[예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY( 및 여기에 인용된 참조문헌)]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 또한, cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 핵산 프로브를 분리하기 위해서는 당해 기술분야에 공지된 방법 중에서 상기 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)이 이용될 수 있다. 그 다음 분리된 프로브를 사용하여 라이브러리를 스크리닝을 수행할 수 있다.
증폭된 부분은 공지의 기법을 사용하여 적합한 라이브러리(예, 클라미디아 cDNA 라이브러리)로부터 전장의 유전자를 분리하는데 사용할 수 있다. 이러한 기법에서, 라이브러리(cDNA 또는 게놈)는 증폭에 적합한 1 이상의 폴리뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 사용하여 스크리닝한다. 바람직하게는, 보다 큰 분자가 포함되도록 라이브러리를 크기 선별한다. 또한, 무작위로 프라이밍된 라이브러리는 유전자의 5' 영역과 상류 영역을 확인하는데 바람직할 수 있다. 게놈 라이브러리는 인트론을 얻어 5' 서열을 연장시키는데 바람직하다.
하이브리드화 기법에서 부분 서열은 공지의 기법을 사용하여 표지할 수 있다(예, 닉(nick) 해독 또는32P로 말단부 표지화). 그 다음, 변성된 박테리아 콜로니를 포함하는 필터(또는 파지 플라크가 깔아져 있는 배지)를 표지된 프로브와 하이브리드화하여 박테리아 또는 박테리오파지 라이브러리를 스크리닝한다[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989]. 하이브리드하는 콜로니 또는 플라크를 선택하여 증식시키고 추가 분석을 위하여 DNA를 분리한다. cDNA 클론은, 예를 들어 부분 서열 유래의 프라이머와 벡터 유래의 프라이머를 사용하는 PCR을 통해 추가 서열의 양을 분석, 측정할 수 있다. 제한 지도와 부분 서열을 얻어 1 이상의 중복 클론을 확인할 수 있다. 그 다음, 일련의 결실 클론을 만드는 것을 포함할 수 있는 표준 기법을 사용하여 완전한 서열을 결정할 수 있다. 그 결과 얻어지는 중복 서열을 조립하여 하나의 인접 서열을 얻을 수 있다. 전장의 cDNA 분자는 공지의 기법을 사용하여 적합한 단편을 연결하여 만들 수 있다.
또는, 부분 cDNA 서열로부터 전장의 암호 서열을 수득하는 방법에는 다양한 증폭 기법이 있다. 이러한 기법 중에서, 증폭은 일반적으로 PCR을 통해 수행한다. 이 증폭 단계는 다양한 시판용 킷트를 사용하여 실시할 수 있다. 프라이머는 당해 기술 분야에 공지된 기법[예를 들어, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989]을 사용하여 디자인할 수 있고, 당해 기술 분야에 공지된 소프트웨어를 사용할 수도 있다. 프라이머는 길이가 22 내지 30개인 뉴클레오타이드이고, GC 함량이 50% 이상이며 약 68℃ 내지 72℃의 온도에서 표적 서열에 어닐링하는 것이 바람직하다. 증폭된 영역은 전술한 바와 같이 서열분석하고, 중복 서열은 연속 서열로 조립할 수 있다.
이러한 증폭 기법 중 하나가 역 PCR(Triglia et al., Nucl.Acids Res. 16:8186, 1988)로서, 유전자의 공지 영역에 단편을 만들기 위한 제한 효소를 사용한다. 이 단편을 그 다음 분자내 결합을 통해 원형화하여 공지 영역 유래의 다양한 프라이머를 이용하는 PCR의 주형으로서 사용한다. 또 다른 시도로서, 공지 영역에 특이적인 프라이머와 링커 서열에 특이적인 프라이머를 이용하는 증폭으로 부분 서열에 인접한 서열을 회수할 수 있다. 이와 같이 증폭된 서열은 일반적으로 동일한 링커 프라이머와 공지 영역에 특이적인 제2 프라이머를 이용하는 2차 증폭 반응으로 처리한다. 공지 서열로부터 반대 방향으로 신장을 개시하는 두 프라이머를 이용한 상기 절차의 변형법은 WO 96/38591에 제시되어 있다. 또 다른 기법으로는 포획 PCR(Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991) 및 워킹 PCR(Parker et al., Nucl.Acids.Res. 19:3055-60, 1991)이 있다. 전사-매개 증폭(TMA)는 DNA, rRNA 또는 mRNA의 증폭에 사용할 수 있는 또 다른 방법으로서, 특허 PCT/US91/03184에 설명되어 있다. 이와 같은 자가촉매성이며 등온성인 비-PCR 계 방법은 2개의 프라이머와 2개의 효소, 즉 RNA 폴리머라제와 역전사효소를 이용한다. 한 프라이머는 RNA 폴리머라제의 프로모터 서열을 포함한다. 1차 증폭에서 프로모터-프라이머는 소정 부위에서 표적 rRNA에 하이브리드한다. 역전사효소는 프로모터-프라이머의 3' 말단부로부터 신장 반응에 의해 표적 rRNA의 DNA 복사체를 생성한다. 그 결과 얻어지는 복합체에서 RNA는 분해하고 DNA 복사체에 제2 프라이머를 결합시킨다. 이 프라이머의 말단부로부터 역전사효소를 이용하여 DNA의 새로운 쇄를 합성하여 2본쇄 DNA를 생성한다. RNA 폴리머라제는 DNA 주형에서 프로모터 서열을 인식하고 전사를 개시한다. 새로 합성된 RNA 앰플리콘들은 각각 TMA 과정에 재유입되어 또 다른 복제 과정의 주형으로 작용하여 RNA 앰플리콘을 지수적으로 증폭시킨다. 증폭을 이용하는 다른 방법들도 또한 전장 cDNA 서열을 얻는 방법으로서 사용할 수 있다.
특별한 경우에는 GenBank에서 입수할 수 있는 것과 같은 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스에서 제공된 서열의 분석을 통해 전장 cDNA 서열을 얻을 수 있다. 중복 EST의 조사는 일반적으로 공지 프로그램(예, NCBI BLAST 조사)을 통해 수행할 수 있으며, 이러한 EST를 사용하여 전장의 연속 서열을 얻을 수 있다. 또한, 전장의 cDNA 서열은 게놈 단편의 분석을 통해 수득할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 변이체는 일반적으로 고체상 포스포아미다이트(phosphoramidite) 화학 합성 등과 같은 화학 합성을 비롯하여 당해 기술 분야에 공지된 임의의 방법으로 제조할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 변형은 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 유래의 부위 특이적 돌연변이유발법(Adelman et al., DNA 2:183, 1983)과 같은 표준 돌연변이유발법을 사용하여 도입할 수 있다. 또는, DNA가 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터를 가진 벡터(예, T7 또는 SP6)속에 도입된다면 클라미디아 단백질을 암호화하는 DNA 서열또는 그 일부를 시험관내 또는 생체내 전사하여 RNA 분자를 만들 수도 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 암호화된 폴리펩타이드를 제조하기 위해서는 특정 부분을 사용할 수 있다. 또한, 또는 대안적으로 암호화된 폴리펩타이드가 생체내에서 생성되도록(예를 들어, 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포를 클라미디아 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 작제물로 형질감염시키고, 이와 같이 형질감염된 세포를 환자에게 투여하여 생성함) 특정 부분을 환자에게 투여할 수도 있다.
또한, 암호 서열에 상보적인 서열의 일부(즉, 안티센스 폴리뉴클레오타이드)를 프로브로서 또는 유전자 발현을 조절하는 용도로 사용할 수 있다. 안티센스 RNA로 전사될 수 있는 cDNA 작제물은 또한 안티센스 RNA의 생성을 용이하게 하는 조직의 세포로 도입시킬 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기술된 바와 같이 클라미디아 단백질의 발현을 억제하는데 사용할 수 있다. 안티센스 기법은 폴리머라제, 전사 인자 또는 조절 분자가 결합하기에 충분하게 개열되는 2중 나선의 성질을 억제시키는 3중 나선 형성을 통해 유전자 발현을 조절하는데 사용할 수 있다[Gee et al., In Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co.(Mt.Kisco, NY;1994]. 또는, 안티센스 분자는 조절 영역의 유전자(예, 프로모터, 인핸서 또는 전사 개시 부위)와 하이브리드하여 유전자의 전사를 차단하거나; 또는 리보솜에 대한 전사체의 결합을 억제하여 해독을 차단하도록 디자인할 수 있다.
암호 서열 또는 상보성 서열의 일부는 유전자 발현을 검출하기 위한 프로브 또는 프라이머로서 디자인할 수 있다. 프로브는 다양한 리포터 기, 예컨대 방사성핵종 및 효소로 표지할 수 있으며, 길이는 바람직하게는 뉴클레오타이드 10개 이상, 보다 바람직하게는 20개 이상, 보다 더 바람직하게는 30개 이상인 것이 좋다. 전술한 바와 같이 프라이머는 길이가 22 내지 30개인 뉴클레오타이드가 바람직하다.
모든 폴리뉴클레오타이드는 생체내에서 안정성을 증가시키기 위하여 추가 변형시킬 수 있다. 가능한 변형으로는 5' 및/또는 3' 말단부에 측면 서열의 첨가; 주쇄내 포스포디에스터라제 결합 이외의 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용; 및/또는 비통상적인 염기, 예를 들어 이노신, 퀘오신(queosine) 및 위부토신(wybutosine) 뿐만 아니라 아세틸, 메틸, 티오 및 다른 변형 형태의 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 도입 방법이 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 설명된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열은 기존의 재조합 DNA 기법을 사용하여 다양한 다른 뉴클레오타이드 서열에 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드를 다양한 클로닝 벡터, 예컨대, 플라스미드, 파지미드, 람다 파지 유도체 및 코스미드에 클로닝할 수 있다. 특별한 목적의 벡터로는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 서열분석 벡터가 있다. 일반적으로, 벡터는 1 이상의 유기체에서 기능성인 복제 기점과, 편리한 제한 효소 부위 및 1 이상의 선택성 마커를 포함한다. 목적 용도에 따라 다른 요소도 포함할 수 있으며, 당업자라면 잘 알 수 있다.
아미노산이 약 100개 이하, 일반적으로 약 50개 이하인 합성 폴리펩타이드는당해 기술 분야에 공지된 기법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 이 폴리펩타이드는 상용화된 고체상 기법, 예를 들어 아미노산이 성장하는 아미노산쇄에 연속적으로 첨가되는 메리필드 고체상 합성법[Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85:2149-2146, 1963]을 사용하여 합성할 수 있다. 폴리펩타이드의 자동 합성 장치는 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)과 같은 제조사에서 입수할 수 있으며 제조자의 지시에 따라 조작할 수 있다.
전술한 바와 같이, 클라미디아 항원의 면역원성 부분은 공지의 기법, 예컨대 문헌[Paul, Fundamental Immunology, 3d ed., Raven Press, 1993, pp.243-247 및 여기에 인용된 문헌]에 요약된 바와 같은 기법으로 제조하고 확인할 수 있다. 이러한 기법으로는 천연 항원의 폴리펩타이드 부분을 면역원성에 대하여 스크리닝하는 방법을 포함한다. 이러한 스크리닝에는 일반적으로 본 명세서에 설명된 대표적인 ELISA를 사용할 수 있다. 폴리펩타이드의 면역원성 부분은 이러한 대표적인 분석법에서 전장 항원에 의해 생성되는 시그널과 실질적으로 유사한 시그널을 상기 분석법에서 생성하는 부분이다. 즉, 클라미디아 항원의 면역원성 부분은 본 명세서에 기술된 바와 같은 모델 ELISA에서 전장의 항원에 의해 유도된 시그널의 약 20% 이상, 바람직하게는 약 100%를 생성하는 것이다.
클라미디아 항원의 부분 및 다른 변이체는 합성이나 재조합 수단에 의해 제조할 수 있다. 천연 항원의 변이체는 일반적으로 표준 돌연변이유발 기법, 예컨대 올리고뉴클레오타이드-유도성 부위 특이적 돌연변이유발법을 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부를 표준 기법에 따라 제거하여 절두형(truncated) 폴리펩타이드를 제조할 수도 있다.
천연 항원 부분 및/또는 변이체를 포함하는 재조합 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 다양한 기법을 사용하여 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들어, 먼저 재조합 단백질을 배양 배지로 분비하는 적합한 숙주/벡터 시스템으로부터 시판용 필터를 사용하여 상청액을 농축시킬 수 있다. 농축 후, 농축액을 친화성 매트릭스와 같은 적합한 정제 매트릭스 또는 이온 교환 수지에 적용할 수 있다. 마지막으로, 1회 이상의 역상 HPLC 단계를 사용하여 재조합 단백질을 추가 정제할 수 있다.
본 명세서에 제시된 재조합 폴리펩타이드를 발현시키기 위하여 당업자에게 공지된 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 발현은 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 적당한 모든 숙주 세포에서 수행할 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵세포, 효모 및 고등 진핵 세포가 있다. 사용된 숙주 세포로는 이. 콜라이, 효모 또는 COS나 CHO와 같은 포유동물 세포주가 바람직하다. 이 방식으로 발현된 DNA 서열은 천연 항원, 천연 항원의 부분 또는 다른 변이체를 암호할 수 있다.
일반적으로 제조 방법과는 무관하게 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 분리되고 실질적으로 정제된 형태로 제조한다. 폴리펩타이드의 순도는 약 80% 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상이다.
특정 구체예에서 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 다수의 폴리펩타이드를포함하거나 본 명세서에 개시된 1 이상의 폴리펩타이드와 공지의 클라미디아 단백질과 같은 비관련 서열을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 융합 파트너는 예를 들어 T 헬퍼 에피토프(면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 사람에 의해 인식되는 T 헬퍼 에피토프의 제공을 보조하거나 또는 본래의 재조합 단백질 보다 높은 수율로의 상기 단백질(발현 인핸서)의 발현에 보조 역할을 할 수 있다. 일부 바람직한 융합 파트너는 면역원성이며 발현 증강성 융합 파트너이다. 다른 융합 파트너로서 단백질의 용해성을 증가시키거나 단백질을 목적하는 세포내 구획으로 유도할 수 있는 것을 선택할 수 있다. 또 다른 융합 파트너로는 단백질의 정제를 용이하게 하는 친화성 태그가 있다. 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 예를 들어 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 별도의 DNA 서열을 적당한 발현 벡터에 조립하는 공지의 재조합 DNA 기법을 사용하여 작제할 수 있다. 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 3' 말단부를 펩타이드 링커를 사용하거나 사용함이 없이 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단부에 이 서열들의 리딩 프레임을 맞추어 두 DNA 서열들의 mRNA가 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 모두의 생물학적 활성을 보유하는 하나의 융합 단백질로 해독될 수 있도록 결합시킨다.
펩타이드 링커 서열은 제1 및 제2 폴리펩타이드가 각각 2차 구조 및 3차 구조로 폴딩되기에 충분한 간격으로 양 폴리펩타이드를 분리시키는데 사용될 수 있다. 이러한 펩타이드 링커 서열은 당해 기술 분야에 공지된 표준 기법을 통해 융합 단백질에 포함된다. 적합한 펩타이드 링커 서열은 다음과 같은 요인에 근거하여 선택할 수 있다: (1) 유연하고 신장된 형태를 형성할 수 있는 특성; (2) 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 상의 기능적 에피토프들과 상호작용할 수 있는 2차 구조를 형성하지 못하도록 하는 성질; 및 (3) 상기 폴리펩타이드 기능적 에피토프들과 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 하전을 띤 잔기들의 결실. 바람직한 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. 다른 거의 중성인 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala도 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열에는 문헌[Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8562, 1986; 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호]에 개시된 것들이 있다. 링커 서열은 길이가 1 내지 약 50개의 아미노산일 수 있다. 펩타이드 링커 서열의 사용(필요한 경우)에 대한 대안책으로서 기능적 도메인을 분리하고 입체 방해를 방지하기 위하여 제1 및 제2 폴리펩타이드 상에 비필수 N-말단 아미노산 영역(존재하는 경우)을 이용할 수 있다.
연결된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절 인자에 작동가능하게 결합시킨다. DNA의 발현에 큰 역할을 하는 조절 인자는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 5'쪽에만 배치한다. 이와 마찬가지로, 해독을 종결시키는데 필요한 종결 코돈 및 전사 종결 시그널은 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 3'쪽에만 제공한다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드와 함께 비관련 면역원성 단백질을 포함하는 융합 단백질도 제공한다. 상기 면역원성 단백질은 리콜(recall) 반응을 유인할 수있는 것이 바람직하다. 이러한 단백질의 예로는 파상풍, 결핵 및 간염 단백질이 있다(예컨대, Stoute et al., New Engl.J.Med., 336:86-91, 1997).
바람직한 구체예에서, 면역학적 융합 파트너는 그람 음성 박테리아인 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza) B(WO 91/18926)의 표면 단백질인 단백질 D에서 유래되는 것이다. 단백질 D 유도체는 이 단백질의 대략 처음 1/3(예컨대, 처음 N-말단 100 내지 110개 아미노산)을 포함하는 것이 바람직하고, 단백질 D 유도체는 지질화될 수 있다. 특정한 바람직한 구체예에서, 지단백질 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기는 N-말단 상에 포함시키면 또 다른 외인성 T-세포 에피토프를 가진 폴리펩타이드를 제공하고 이. 콜라이에서의 발현율을 증가시킬 수 있다(따라서 발현 인핸서로서 작용함). 지질 테일(tail)은 항원-제시 세포가 항원을 최적 제공할 수 있도록 한다. 다른 융합 파트너로는 인플루엔자 바이러스의 비구조성 단백질, NS1(헤마글루티닌)이 있다. T-헬퍼 에피토프를 포함하는 다양한 단편들을 사용할 수 있지만, 보통 N-말단의 81개 아미노산을 사용하는 것이 일반적이다.
또 다른 구체예에서, 면역학적 융합 파트너로는 LYTA로 알려진 단백질 또는 이의 일부분(바람직하게는 C-말단 부)이 있다. LYTA는 스트렙토코커스 뉴모니아에서 유래되는 것으로서, 아미다제 LYTA로 알려진 N-아세틸-L-알라닌 아미다제를 합성한다(LytA 유전자에 의해 암호화됨; Gene 43:265-292, 1986). LYTA는 펩티도글리칸 주쇄에서 특정 결합을 특이적으로 분해하는 자가융해소(antolysin)이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 DEAE와 같은 콜린이나 일부 콜린 유사체에 대한 친화성에 주 역할을 한다. 이러한 성질을 이용하여 융합 단백질을 발현시키는데 유용한 이. 콜라이 C-LYTA 발현 플라스미드가 개발되었다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 포함하는 하이브리드 단백질의 정제도 발표되어 있다(Biotechnology 10:795-798, 1992). 바람직한 구체예로서, LYTA의 반복 부분을 융합 단백질에 도입시킬 수 있다. 반복 부분은 잔기 178에서부터 시작하는 C-말단 영역에서 찾을 수 있다. 특히 바람직한 반복 부분은 잔기 188 내지 305를 포함한다.
또 다른 구체예에서는, 마이코박테리움 튜버큐로시스 유래의 Ra12 폴리뉴클레오타이드가 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중 적어도 면역원성 부분에 결합된다. 이종 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 향상시키는데 사용되는 Ra12 조성물 및 방법은 미국 특허 출원 60/158,585호에 개시되어 있고, 그 개시 내용은 본 발명에 전반적으로 참고 인용된다. 간략히 설명하면, Ra12는 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) MTB32A 핵산의 준서열(subsequence)인 폴리뉴클레오타이드 영역을 의미한다. MTB32A는 엠.튜버큐로시스의 독성 균주 및 비독성 균주에서 한 유전자에 의해 암호화되는 32KD 분자량의 세린 프로테아제이다. MTB32A의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 본 명세서에 참고 인용되는 문헌[미국 특허출원 60/158,585; Skeiky et al., Infection and Immun.(1999) 67:3998-4007]에 기술되어 있다. 일 구체예에서, 융합 폴리펩타이드 생산에 사용된 Ra12 폴리펩타이드는 함께 융합된 이종의 클라미디아 항원성 폴리펩타이드의 발현 및/또는 면역원성을 향상시키는데 효과적인 MTB32A 암호 서열의 C-말단 단편을 포함한다. 또 다른 구체예에서, Ra12 폴리펩타이드는 MTB32A의 아미노산 잔기 192 내지 323 중 일부 또는 전체를 포함하는 MTB32A의 약 14kD C-말단 단편에 상응하는것이다.
Ra12 폴리펩타이드와 목적하는 이종의 클라미디아 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 핵산은 통상의 유전공학 기법으로 용이하게 작제할 수 있다. 재조합 핵산은 바람직하게는 Ra12 폴리뉴클레오타이드 서열이 선택된 이종 클라미디아 폴리뉴클레오타이드 서열의 5'쪽에 배치되도록 작제한다. 또한, Ra12 폴리뉴클레오타이드 서열을 선택된 이종 폴리뉴클레오타이드 서열의 3'쪽에 배치하거나 이종 폴리뉴클레오타이드 서열을 Ra12 폴리뉴클레오타이드 서열 내의 일정 부위에 삽입하는 적당한 경우도 있다.
또한, Ra12 또는 이의 일부분이나 이것의 다른 변형체를 암호화하는 임의의 적합한 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 개시된 1종 이상의 클라미디아 폴리뉴클레오타이드와 Ra12를 포함하는 재조합 융합 폴리뉴클레오타이드를 작제하는데 사용될 수 있다. 바람직한 Ra12 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 Ra12 폴리펩타이드의 일부분을 암호화하는 약 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드, 약 30개 이상의 뉴클레오타이드, 약 60개 이상의 뉴클레오타이드, 약 100개 이상의 뉴클레오타이드, 약 200개 이상의 뉴클레오타이드 또는 약 300개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다.
Ra12 폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, Ra12 폴리펩타이드 또는 그 일부분을 암호화하는 내인성 서열)이나 이 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오타이드 변이체는 천연의 Ra12 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드와 비교했을 때 암호화된 융합 폴리펩타이드의 생물학적 활성이 실질적으로 감소되지 않는 정도의 1 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있는 것이다. 변이체는 천연의 Ra12 폴리펩타이드 또는 이의 일부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 바람직하게는 약 70% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을 나타낸다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 클라미디아 감염에 대한 방어 면역성을 환자에게 유도하기 위하여 상기 1종 이상의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질(또는 이 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)을 사용하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "환자"는 모든 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 의미한다. 환자는 질병이 있을 수도 있고, 또는 검출가능한 질병 및/또는 감염이 없을 수도 있다. 즉, 방어 면역성은 클라미디아 감염을 예방하거나 치료하기 위하여 유도할 수 있다.
이러한 관점에서, 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드 분자는 일반적으로 약제학적 조성물이나 백신으로 제공된다. 약제학적 조성물은 상기 서열(또는 이의 변이체)을 1종 이상 각각 포함할 수 있는 1종 이상의 폴리펩타이드와 생리적 허용성 담체를 포함할 수 있다. 백신은 1종 이상의 상기 폴리펩타이드와 면역자극제, 예컨대 보조제 또는 리포솜(폴리펩타이드 도입용)을 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물과 백신은 또한 다른 클라미디아 항원들을 복합 폴리펩타이드로 포함하거나 별도의 폴리펩타이드에 제공된 상태로 함유할 수 있다.
또는, 백신은 동일계에서 폴리펩타이드가 생성되도록 전술한 1종 이상의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.이러한 백신에서 폴리뉴클레오타이드는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 전달 시스템인, 핵산 발현 시스템, 박테리아 및 바이러스 발현 시스템 등에 제공될 수 있다. 적당한 핵산 발현 시스템은 환자 중에서의 발현에 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열(예컨대, 적합한 프로모터 및 종결 시그널)을 포함한다. 박테리아 전달 시스템은 폴리펩타이드의 면역원성 부분을 그 세포 표면상에 발현하는 박테리아(예, 바실러스-칼멧-구에린((Bacillus-Calmette-Guernin); BCG)의 투여를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 비병원성(결손형) 바이러스가 사용되기도 하는 바이러스 발현 시스템(예, 종두 또는 다른 수두 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입시킬 수 있다. 이러한 발현 시스템에 폴리뉴클레오타이드를 병입시키는 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 이 폴리뉴클레오타이드들은 예를 들어 문헌[Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993]에 기재되고, 문헌[Cohen, Science 259:1691-1692, 1993]에서 검토된 바와 같은 "나출형" 플라스미드 벡터로서 투여할 수 있다. DNA를 이러한 벡터에 도입시키는 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 레트로바이러스 벡터는 또한 선택성 마커(형질도입된 세포의 동정이나 선택용) 및/또는 표적 부분(예컨대 특정 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드를 암호화하는 유전자)용 유전자를 전달하거나 포함하여 표적 특이적인 벡터를 제공할 수 있다. 또한, 표적화는 당업자에게 공지된 방법에 의해 항체를 사용하여 수행할 수 있다.
치료 목적의 다른 제제에는 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀과 같은지질계 시스템이 포함된다. 시험관내 및 생체내 전달 부형제로서 사용하기에 바람직한 콜로이드성 시스템은 리포좀(즉, 인공 막 소포체)이다. 나출형 폴리뉴클레오타이드의 흡수는 세포로 효과적으로 전달되는 생분해성 비드 내 및/또는 비드 상에 상기 폴리뉴클레오타이드를 도입시켜 증가시킬 수 있다. 이러한 시스템의 제조 및 사용에 대해서는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
관련된 관점으로서, 전술한 폴리뉴클레오타이드 백신은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 공지의 클라미디아 항원과 동시에 또는 후속적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 전술한 바와 같은 전달 시스템에 포함되거나 "나출형"인 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 투여한 후에는 백신의 방어 면역 효과를 증강시키기 위하여 항원을 투여할 수 있다.
본 명세서에 개시된 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 또한 클라미디아 감염을 치료하기 위한 입양 면역요법(adoptive immunotherapy)에 사용할 수 있다. 입양 면역요법은 대략적으로 능동 면역요법과 수동 면역요법으로 분류할 수 있다. 능동 면역요법에서 치료는 면역반응 변형제(예, 백신, 박테리아 보조제 및/또는 사이토카인)를 투여하여 내인성 숙주 면역계를 생체내 자극하는 것이다.
수동 면역요법에서 치료는 항클라미디아 효과를 직접 또는 간접적으로 매개할 수 있고 본래의 숙주 면역계에 반드시 의존하지는 않는 소정의 면역 반응성이 있는 생물 반응자(예컨대, 작동인자(effector) 세포 또는 항체)를 전달하는 것을 포함한다. 작동인자 세포의 예로는 T 림프구(예, CD8+ 세포독성 T-림프구, CD4+ T-헬퍼), 킬러 세포(예, 천연 킬러 세포, 림포카인에 의해 활성화되는 킬러 세포),B 세포 또는 개시된 항원을 발현하는 항원-제시 세포(예, 수지상 세포 및 대식세포)를 포함한다. 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 수동 면역요법에 사용하기 위한 항체 또는 항이디오타입(anti-idiotypic) 항체(예, 미국 특허 제4,918,164호)를 생성하는데 사용할 수 있다.
입양 면역요법에서 적당한 수의 T 세포를 제공하기에 바람직한 방법은 시험관내에서 면역 T 세포를 증폭시키는 것이다. 생체내에서 항원 인식성이 유지되는 단일 항원-특이적 T 세포를 수십억개로 증폭시키기 위한 배양 조건은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이와 같은 시험관내 배양 조건은 일반적으로 종종 사이토카인, 예컨대 IL-2의 존재하에 항원 및 비분열성 피더(feeder) 세포로 간헐적으로 자극하는 것이다. 전술한 바와 같이, 본 명세서에 제시된 면역반응성 폴리펩타이드는 면역요법에 필요한 충분한 수의 세포를 얻기 위하여 항원 특이적 T 세포 배양물을 급속하게 증폭시키는데 사용할 수 있다. 구체적으로, 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 대식세포, 단핵구, 섬유아세포 또는 B-세포를 면역반응성 폴리펩타이드로 자극(펄스)하거나, 또는 당해 기술 분야에 공지딘 다양한 표준 기법을 사용하여 항원-제시 세포에 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 항원-제시 세포를, 발현 증가에 적당한 프로모터 영역을 포함하고 재조합 바이러스 또는 다른 발현 시스템의 일부분으로 발현될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질감염시키거나 형질도입시킬 수 있다. 수두(pox) 바이러스, 종두(vaccinia) 바이러스 및 아데노바이러스를 비롯한 항원-제시 세포를 형질도입시키기 위하여 여러 바이러스 벡터를 사용할 수 있고, 또한 다양한 수단, 예컨대 유전자총 기법, 지질매개 전달, 전기천공, 삼투압 충격 및 미립자 전달 기작 등으로 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열을 이용하여 항원-제시 세포를 형질감염시켜 당업자가 측정했을 때 효과적이고 허용되는 발현 정도를 얻을 수 있다. 배양된 T 세포가 치료에 효과적이도록 하기 위해서는 배양된 T 세포는 생체내에서 증식하여 다양하게 분배되고 장기간 동안 생존할 수 있어야 한다. 배양된 T-세포가 생체내에서 증식 유도되고 IL-2가 보충된 항원에 의한 반복 자극으로 장기간 동안 실질적인 수로 생존될 수 있음은 연구를 통해 입증되어 있다[예를 들어, Cheever, M. et al., "Therapy With Cultured T Cells: Principles Revisited" Immunological Reviews, 157:177, 1997).
본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 클라미디아 반응성 T 세포를 생성 및/또는 분리하는데 사용한 후, 환자에게 투여할 수 있다. 한 방법으로서, 개시된 폴리펩타이드의 면역원성 부분에 상응하는 짧은 펩타이드로 생체내 면역화하여 항원-특이적인 T 세포주를 얻을 수 있다. 그 결과 얻어지는 항원 특이적 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 클론을 환자로부터 분리한 후, 표준 조직 배양 기법으로 증폭시키고 환자에게 재투여할 수 있다.
또는, 폴리펩타이드의 면역원성 부분에 상응하는 펩타이드를 이용하여 선택적으로 자가 T 세포를 시험관내 자극 및 증폭시켜 클라미디아 반응성 T 세포 아군을 생성하므로써, 예컨대 문헌[Chang et al., Crit.Rev.Oncol.Hematol., 22(3), 213, 1996]에 기재된 바와 같이 환자에게 후속적으로 전달할 수 있는 항원-특이적 T 세포를 제공할 수 있다. T 세포와 같은 면역 시스템의 세포는 환자의 말초 혈액으로부터 시판용 세포 분리 시스템, 예컨대 Isolex™ System(Nexell Therapeutics, Inc. Irvine, CA 시판품)을 사용하여 분리할 수 있다. 분리된 세포는 미소구와 같은 전달 비히클에 포함된 1종 이상의 면역반응성 폴리펩타이드로 자극하여 항원 특이적 T 세포를 제공할 수 있다. 그 다음, 항원 특이적 T 세포의 개체수를 표준 기법을 사용하여 증폭시키고, 증폭된 세포를 환자에게 다시 투여한다.
다른 구체예에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드에 특이적인 항체 수용체 및/또는 T 세포는 클로닝하여 증폭시킨 뒤 다른 벡터 또는 작동인자 세포에 전달하여 입양 면역요법에 사용할 수 있다. 구체적으로, 세포외 인식 요소로서 클라미디아 특이적 모노클로날 항체 유래의 가변 도메인을 발현하기에 적당한 유전자를 이용하여 T 세포를 형질감염시킨 후, T 세포 수용체 시그널링 쇄에 결합시키면 T 세포 활성화, 특이적 용균 및 사이토킨 방출 효과를 얻을 수 있다. 이것은 T 세포의 특이성을 MHC 독립 방식으로 재유도하는 효과가 있다[예컨대, Eshhar,Z., Cancer Immunol Immunother, 45(3-4):131-6, 1997 및 Hwu, P., et al., Cancer Res, 55(15):3369-73, 1995]. 다른 구체예로서 클라미디아 항원 특이적 알파 및 베타 T 세포 수용체 쇄를 교대로 T 세포에 형질감염시킬 수도 있다[Cole, DJ, et al., Cancer Res, 55(4):748-52-1995].
또 다른 구체예로서, 동계(syngeneic) 또는 자가 수지상 세포를 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 적어도 면역원성 부분에 해당하는 펩타이드로 자극할 수 있다. 그 결과 얻어지는 항원-특이적 수지상 세포를 환자에게 전달하거나 T 세포를 자극하여 항원 특이적 T 세포를 얻고 이것을 결과적으로 환자에게 투여하는데 사용할 수 있다. 항원-특이적 T 세포를 생성하기 위한 펩타이드 자극을 받은 수지상 세포의 사용 및 그 다음 이러한 항원-특이적 T 세포를 사용한 쥐 모델에서의 질병 근절 방법에 대해서는 문헌[Cheever et al., Immunological Reviews, 157:177, 1997]에 입증되어 있다. 또한, 개시된 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 벡터는 환자에게서 채취한 줄기 세포에 도입시켜 시험관내에서 클론에 의해 증식시킨 후 동일한 환자에게 다시 자가 이식할 수 있다.
특정 관점에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, T 세포 및/또는 결합 인자는 약제학적 조성물 또는 면역원성 조성물(즉, 백신)에 함유될 수 있다. 또는, 약제학적 조성물은 항원-제시 세포가 클라미디아 폴리펩타이드를 발현하도록 클라미디아 폴리뉴클레오타이드로 형질감염된 항원-제시 세포(예, 수지상 세포)를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 이러한 1종 이상의 화합물과 생리적 허용성 담체를 포함한다. 백신은 이러한 1종 이상의 화합물과 면역자극제를 포함할 수 있다. 면역자극제는 외인성 항원에 대한 면역 반응을 증강시키거나 강화시키는 모든 물질이다. 면역자극제의 예로는 보조제, 생물분해성 미소구(예, 폴리락틱 갈락타이드) 및 리포좀(이속에 화합물이 도입된다; Fullerton, 미국 특허 제4,235,877호)이 있다. 백신 제조에 대해서는 일반적으로, 예컨대 문헌[M.F.Powell and M.J.Newman, eds., "Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press(NY, 1995)]에 기술되어 있다. 본 발명의 영역에 속하는 약제학적 조성물 및 백신은 또한 생물학적 활성 또는 불활성일 수 있는 다른 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 클라미디아 항원의 1종 이상의 면역원성 부분이 융합 폴리펩타이드에 도입된 상태로 또는 별도의 화합물로서 조성물이나 백신에 제공될 수 있다.
약제학적 조성물 또는 백신은 동일계(in situ)에서 폴리펩타이드를 생성할 수 있도록 전술한 바와 같은 1종 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이, 이 DNA는 당업자에게 공지된 다양한 전달 시스템, 예컨대 핵산 발현 시스템, 박테리아 및 바이러스 발현 시스템에 제공될 수 있다. 다양한 유전자 전달 기법이 잘 알려져 있으며, 그 예로는 문헌[Rolland, Crit.Rev.Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998] 및 여기에 인용된 문헌에 개시되어 있다. 적당한 핵산 발현 시스템은 환자내에서 발현시키는데 필요한 DNA 서열(예컨대, 적합한 프로모터 및 종결 시그널)을 포함한다. 박테리아 전달 시스템은 상기 폴리펩타이드의 면역원성 부분을 세포 표면 상에 발현하거나 그 에피토프를 분비하는 박테리아(예, 바실러스-칼멧-구에린)의 투여를 포함한다.
바람직한 구체예에서, DNA는 바이러스 발현 시스템(예, 종두 또는 다른 수두 바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 바큘로바이러스(baculovirus), 토가바이러스(togavirus), 박테리오파아지 등)을 통해 도입될 수 있는데, 비병원성(결손형) 복제 컴피턴트(competent) 바이러스의 사용을 포함하기도 한다.
예를 들어, 많은 바이러스 발현 벡터가 레트로바이러스 부류의 바이러스들로부터 유래된다. 이러한 부류는 쥐 백혈병 바이러스, 마우스 유방암 바이러스, 사람 거품형성(foamy) 바이러스, 로우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스, 및 예를 들어 사람, 원숭이 및 고양이과의 면역결핍성 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스 발현 벡터를 디자인할 때 고려해야 할 사항에 대해서는 문헌[Comstock et al., (1997)]에 설명되어 있다.
우수한 쥐 백혈병 바이러스(MLV)계 바이러스 발현 벡터가 김(Kim) 등(1998)에 의해 개발된 바 있다. MLV 벡터 작제시, 김 등은 인접 상류 영역과 함께 전체 gag 서열이 바이러스 팩키징 또는 유전자 발현에 큰 영향을 미침이 없이 결실될 수 있음을 발견하였다. 또한, 거의 전체 U3 영역이 유해한 영향없이 사람 사이토메가로바이러스의 즉시-초기(immediately-early)형 프로모터로 대체될 수 있음을 발견하였다. 또한, MCR과 내부 리보솜 도입 부위(IRES: Internal Ribosome Entry Sites)도 부작용없이 첨가될 수 있다. 이러한 관찰에 근거하여 김 등은 전술한 1종 이상의 특징들을 포함하는 일련의 MLV 계 발현 벡터를 디자인하였다.
사람 거품형성 바이러스(HFV)에 대하여 많은 특징이 알려져 있듯이, 발현 벡터로서 사용하기에 유리한 HFV의 특징이 발견되었다. 이 특징으로는 스플라이싱에 의한 pol의 발현과 한정된 개시 코돈에서의 해독 개시가 있다. HFV 바이러스 발현 벡터의 다른 관점은 보뎀(Bodem) 등(1997)에 의해 검토되었다.
무라카미(Murakami) 등(1997)은 고농도로 이종 유전자를 발현하는 로우스 육종 바이러스(RSV)계 복제 컴피턴트 조류 레트로바이러스 벡터, IR1 및 IR2를 개시한다. 이 벡터에는 뇌척수심근염 바이러스(EMCV) 유래의 IRES가 env 유전자와 이종 유전자 사이에 삽입되어 있다. IR1 벡터는 env 유전자의 하류에 존재하는 스플라이스-수용체 부위를 보유하는 반면, IR2 벡터는 이 부위가 없다. 무라카미 등은 이 벡터들에 의한 여러 다른 이종 유전자들의 고도 발현을 밝힌 바 있다.
최근에는 다수의 렌티바이러스(lentivirus)계 레트로바이러스 발현 벡터가 개발되었다. 카프리(Kafri) 등(1997)은 사람 면역결핍 바이러스(HIV)계 발현 벡터에 의해 간 및 근육에 직접 전달된 유전자의 지속적 발현에 대하여 밝힌 바 있다. 이 시스템의 한가지 잇점은 비분열 세포를 형질도입시키는 HIV의 고유 특성이다. 카프리 등의 바이러스는 소포성 구내염 바이러스 G 당단백질(VSVG)로 슈도타입(pseudotype)화되어 있기 때문에 다양한 조직과 세포 종류를 형질도입시킬 수 있다.
아데노바이러스계 발현 벡터는 주로 유전자요법 적용 분야에서 이 벡터들이 제공하는 잇점들로 인하여 다수의 벡터가 개발되어 있다. 아데노바이러스 발현 벡터와 이 벡터들을 사용하는 방법은 미국 특허 제5,698,202호, 제5,616,326호, 제5,585,362호 및 제5,518,913호(모두 본 명세서에 참고 인용됨)를 비롯한 다수의 미국 특허문헌의 주제이다.
또 다른 아데노바이러스 작제물에 대해서는 카트리(Khatri) 등(1997)과 토마닌(Tomanin) 등(1997)에 설명되어 있다. 카트리 등은 신규한 양의 아데노바이러스 발현 벡터 및 이들의 간, 전립선, 유방, 결장 및 망막 세포주 뿐만 아니라 소의 비측 갑개골 및 토끼의 신장 세포 감염성에 대하여 설명하고 있다. 토마닌 등은 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제시한다. 이 벡터는 T7 프로모터에 작동가능하게 결합된 이종 유전자를 포함하는 세포에 도입시켰을 때 T7 프로모터로부터 유전자 발현을 유도할 수 있었다. 토마닌 등은 이 시스템이 세포독성 단백질을 암호화하는 유전자의 클로닝 및 발현에 유용할 수 있다고 제안하였다.
수두바이러스는 포유동물 세포에서 이종 유전자를 발현시키는데 널리 사용되는 것이다. 여러해 동안, 이 벡터는 이종 유전자를 고농도로 발현하고 다중 이종 유전자의 단일 분자로의 통합을 단순화하기 위하여 개량되었다. 세포병원성 효과를 감소시키고 안전성을 증가시키기 위한 노력의 일환으로, 포유동물 세포에 비진행성 감염을 나타내는 종두 바이러스 돌연변이체 및 다른 수두 바이러스가 특별한 관심을 얻고 있다(Oertli et al., 1997). 발현 벡터로서 수두바이러스의 사용에 대해서는 문헌[Carroll and Moss(1997)]에서 검토된 바 있다.
알파바이러스 발현 벡터를 포함하는 토가바이러스 발현 벡터는 단백질의 구조 및 기능을 연구하고 단백질 생산을 위해 사용된 바 있다. 토가바이러스 발현 벡터의 바람직한 특징은 신속하고 효과적인 유전자 발현, 광범위한 숙주 범위, RNA 게놈(Huang, 1996)이다. 또한, 알파바이러스 발현 벡터를 기초로 한 재조합 백신은 면역학적 기억 및 예방 효과가 우수한 강한 체액성, 세포성 면역반응을 유도하는 것으로 밝혀져 있다(Tubulekas et al., 1997). 알파바이러스 발현 벡터 및 그 용도는 예를 들어 문헌[Lundstrom(1997)]에 개시되어 있다.
한 연구에서, 리와 가로프(Li and Garoff, 1996)는 레트로바이러스 유전자를 발현하여 BHK-21 세포에서 레트로바이러스 입자를 생성하기 위하여 셈리키 포레스트 바이러스(SHV) 발현 벡터를 사용하였다. 이 방법에 의해 생성된 입자는 프로테아제 및 역전사효소 활성이 있고 감염성이었다. 또한, 이 바이러스 모액에서는 헬퍼 바이러스가 전혀 검출되지 않았다. 따라서, 이 시스템은 유전자 요법 프로토콜에 사용하기에 바람직한 특징을 갖는 것이다.
바큘로바이러스 발현 벡터는 통상적으로 곤충 세포에서 이종 단백질을 발현하는데 사용되었다. 단백질의 예로는 포유동물 케모틴 수용체(Wang et al., 1997), 녹색 형광 단백질과 같은 리포터 단백질(Wu et al., 1997) 및 FLAG 융합 단백질(Wu et al., 1997; Koh et al., 1997)이 있다. 비리온 제시 벡터의 사용과 포유동물 세포에서의 발현을 비롯하여 최근 개발된 바큘로바이러스 발현 벡터 기술에 대해서는 포제(Possee, 1997)에 의해 검토되었다. 또 다른 바큘로바이러스 발현 벡터에 대한 문헌으로는 존스와 모리카와(Jones and Morikawa, 1996) 및 오레일리(O'Reilly, 1997)의 문헌이 있다.
다른 적합한 바이러스 발현 시스템은 예컨대 문헌[Fisher-Hoch et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann.N.Y. Acad.Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호 및 제5,017,487호; WO 89/01973; 미국 특허 제4,777,127호; 영국 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; 및 Guzman et al., Cir.Res. 73:1202-1207, 1993]에 개시되어 있다. 이러한 발현 시스템에 DNA를 도입시키는 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 다른 시스템에서는, DNA를 예컨대 문헌[Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993]에 설명되고 문헌[Cohen, Science 259:1691-1692, 1993]에 검토된 바와 같이 "나출형" DNA로서 도입시킬 수 있다. 나출형 DNA의 흡수는 세포에 효과적으로 전달되는 생물분해성 비드 상에 DNA를 코팅하여 증가시킬 수 있다.
백신은 필요한 경우 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 성분을 포함할 수 있음은 잘 알려져 있다. 또한, 백신은 본 명세서에 제공된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드의 약제학적 허용성 염을 포함할 수 있다. 이러한 염은 유기 염기(예, 1차, 2차 및 3차 아민의 염 및 염기성 아미노산) 및 무기 염기(예, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염)를 비롯한 약제학적 허용성의 비독성 염기로부터 제조할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에는 당업자에게 공지된 모든 적합한 담체가 사용될 수 있지만 담체의 종류는 투여 방식에 따라 달라진다. 본 발명의 조성물은 임의의 적합한 투여 방식, 예컨대 국소, 경구, 비측, 정맥내, 두개골내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여용으로 제형화할 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여시에는 담체에 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충액을 포함하는 것이 바람직하다. 경구 투여용의 경우, 상기 임의의 담체 또는 고형 담체, 예컨대 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈컴, 셀룰로스, 글루코스, 슈크로스 및 탄산마그네슘을 이용할 수 있다. 생물분해성 미소구(예, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트) 역시 본 발명의 약제학적 조성물에 유용한 담체로서 사용할 수 있다. 적합한 생물분해성 미소구는 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 개시되어 있다.
이러한 조성물은 또한 완충액(예, 중성 완충 식염수 또는 인산염 완충 식염수), 탄수화물(예, 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 글리신과 같은 아미노산, 항산화제, 정균제, EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트화제, 보조제(예, 수산화알루미늄), 수용체의 혈액과 등장성, 저장성, 또는 약고장성인 제제를 만들기 위한 용질, 현탁화제, 증점제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 또는, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제조될 수 있다. 또한, 화합물은 공지의 기법을 사용하여 리포좀에 캡슐화될 수 있다.
본 발명의 백신에는 다양한 임의의 면역자극제를 이용할 수 있다. 예를 들어, 보조제를 함유할 수 있다. 대부분의 보조제는 신속한 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 디자인된 물질, 예컨대 수산화알루미늄 또는 광유, 및 면역 반응의 자극제, 예컨대 지질 A, 브로타델라 퍼투시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 튜버큘로시스 유래의 단백질을 포함한다. 적합한 보조제는 상용화되어 있고, 예를 들어 프로인트 불완전 보조제 및 완전 보조제(Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvant 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2(SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); 수산화알루미늄 겔(명반) 또는 알루미늄 인산염과 같은 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 타이로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온 또는 음이온적으로 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생물분해성 미소구; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼(quil) A가 있다. 사이코카인, 예컨대 GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7 또는 -12 역시 보조제로서 사용할 수 있다.
본 명세서에 제시된 백신의 경우, 극상의 조건하에 보조제 조성물은 주로Th1형 또는 Th2형의 면역 반응을 유도하도록 디자인할 수 있다. 고농도의 Th1형 사이토카인(예, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개의 면역 반응을 유리하게 유도하는 경향이 있다. 이와 반대로, 고농도의 Th2형 사이토카인(예, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응을 유리하게 유도하는 경향이 있다. 본 명세서에 제시된 바와 같은 백신의 투여 후, 환자는 Th1형 및 Th2형 반응을 비롯한 면역 반응을 유지한다. 바람직한 구체예에서, 반응이 주로 Th1형인 경우에는 Th1형 사이토카인의 농도가 Th2형 사이토카인의 농도 보다 훨씬 많이 증가할 것이다. 이러한 사이토카인의 농도는 표준 분석법으로 용이하게 평가할 수 있다. 사이토카인 종류에 대해서는 문헌[Mosmann and Coffman, Ann.Res.Immunol. 7:145-173, 1989]에 검토되어 있다.
주로 Th1형의 반응을 유도하는데 바람직한 보조제로는 예컨대 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-디-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)과 알루미늄 염의 조합물을 포함한다. MPL 보조제는 코릭사 코포레이션(Seattle, WA; 미국 특허 제4,436,727호; 제4,877,611호; 제4,866,034호 및 제4,912,094호]으로부터 입수용이하다. CpG-함유 올리고뉴클레오타이드(CpG 디뉴클레오타이드가 비메틸화되어 있음)는 또한 주로 Th1형 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 공지되어 있고, 예컨대 WO 96/02555 및 WO 99/33488에 설명되어 있다. 면역자극성 DNA 서열 역시 예컨대 문헌[Sato et al., Science 273:352, 1996]에 제시되어 있다. 또 다른 바람직한 보조제는 사포닌, 바람직하게는 QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)로서, 단독으로 또는 다른 보조제와 복합적으로 사용될 수있다. 예를 들어, 증강된 시스템으로는 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 조합물, 예컨대 WO 94/00153에 개시된 바와 같은 QS21과 3D-MPL의 조합물, 또는 WO 96/33739에 제시된 바와 같은 QS21이 콜레스테롤에 의해 반응정지된 반응유발성(reactogenic)이 적은 조성물이 있다. 다른 바람직한 제형물로서 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함하는 것이 있다. QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 수중유 에멀젼에 포함하는 특히 강력한 보조제 조성물은 WO 95/17210에 개시되어 있다.
다른 바람직한 보조제로는 Montanide ISA 720(Seppic, France), SAF(Chiron, California, US), ISCOMS(CSL), MF-59(Chiron), SBAS류의 보조제(예, SBAS-2 또는 SBAS-4, 스미드클라임 비참(Smith kline Beecham; Rixensart, Belgium)에서 입수용이함), Detox(Corixa Corporation; Seattle, WA), RC-529(Corixa Corporation; Seattle, WA), 및 다른 아미노알킬 글루코스아미나이드 4-포스페이트(AGPs), 예컨대 본 명세서에 참고 인용되는 공동계류중인 미국 특허출원 일련 번호 08/853,826 및 09/074,720에 개시된 것들을 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 모든 백신은 항원, 면역자극제 및 적합한 담체 또는 부형제의 조합물을 제공하는 공지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물은 지속 방출형 제형[즉, 투여 후 화합물의 방출을 지연시키는 캡슐, 스폰지 또는 겔(예컨대 다당류로 구성됨)과 같은 제형]의 형태로서 투여될 수 있다. 이러한 제형은 일반적으로 공지의 기법(예컨대, Coombes et al., Vaccine 14:1429-1438, 1996)을 사용하여 제조하고, 예를 들어 경구, 직장 또는 피하 이식이나 목적하는 표적 부위에 이식하여 투여할 수 있다. 지속 방출형 제형은 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체를 담체 매트릭스에 분산시키고/거나 속도 조절 막으로 둘러싸인 저장소에 내포시켜 제조할 수 있다.
이러한 제형에 사용되는 담체는 생체적합성이고, 생물분해성이어야 하며, 바람직하게는 제제가 비교적 일정한 속도의 활성 성분을 방출할 수 있도록 하는 것이어야 한다. 이러한 담체로는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)의 미립자, 뿐만 아니라 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로스 및 덱스트란이 있다. 다른 지연 방출형 담체로는 비지질 친수성 코어(예, 가교된 다당류 또는 올리고당)와 경우에 따라 인지질과 같은 양친매성 화합물을 함유하는 외부층을 포함하는 초대분자 생물벡터가 있다(예컨대, 미국 특허 제5,151,254호 및 PCT 출원 WO 94/20078, WO 94/23701 및 WO 96/06638). 지속 방출형 제형에 포함되는 활성 화합물의 양은 이식 부위, 방출 속도 및 예상 지속 시간, 및 치료 또는 예방되는 질환의 특성에 따라 달라진다.
약제학적 조성물과 백신에는 클라미디아 감염 세포를 표적으로 하는 항원 특이적 면역 반응의 생성을 용이하게 하는 다양한 전달 비히클을 이용할 수 있다. 전달 비히클로는 항원-제시 세포(APC), 예컨대 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 단핵구 및 효과적인 APC가 되도록 조작된 다른 세포가 있다. 이러한 세포들은 항원을 제공하는 능력을 증가시키고, T 세포 반응의 활성화 및/또는 보존성을 향상시키며, 그 자체가 항클라미디아 효과가 있고/거나 수용자와 면역학적으로 적합하도록(즉, 정합성 HLA 반수체형) 유전자 변형시킬 수 있다. APC는 일반적으로 임의의 다양한 생물학적 유체 및 기관으로부터 분리할 수 있고, 자가 세포, 동종이형 세포,동계 세포, 또는 이종 세포일 수 있다.
본 발명의 바람직한 특정 구체예는 항원-제시 세포로서 수지상 세포 또는 이의 선조 세포를 이용한다. 수지상 세포는 매우 강력한 APC로서(Banchereau and Steinman, Nature 392:245-251, 1998), 예방 또는 치료 면역성을 유인하기 위한 생리적 보조제로서 효과적인 것으로 밝혀져 있다[Timmerman and Levy, Ann.Rev.Med. 50:507-529, 1999]. 일반적으로, 수지상 세포는 전형적인 형태(동일계에서 방사상이고, 시험관내에서 뚜렷한 세포질 과정(수지상)이 확인가능함), 고효율로 항원을 흡수, 처리하여 제공하는 성질, 및 천연 T 세포 반응을 활성화시키는 능력에 기초하여 확인할 수 있다. 수지상 세포는 물론 생체내 또는 생체외 수지상 세포에서 일반적으로 발견되지 않는 특이적인 세포 표면 수용체 또는 리간드를 발현하도록 조작할 수 있으며, 이러한 변형된 수지상 세포 역시 본 발명에 포함된다. 수지상 세포의 대체물로서, 분비형 소포체 항원이 적재된 수지상 세포(엑소좀이라 불림)을 백신에 사용할 수 있다(Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998).
수지상 세포 및 선조 세포는 말초 혈액, 림프절, 비장, 피부, 제대 혈액, 또는 다른 모든 적합한 조직 또는 유체로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα와 같은 사이토카인의 복합물을 말초 혈액에서 수확한 단핵구 배양물에 첨가하여 생체외에서 분화시킬 수 있다. 또는, 말초 혈액, 제대 혈액 또는 골수에서 수확한 CD34 양성 세포를 GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 수지상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도하는 다른 화합물의 배양 배지 조합물에 첨가하여 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.
수지상 세포는 특성이 다른 두 표현형을 구분하기 위한 단순한 방식으로 편리하게 "미숙" 및 "성숙" 세포로 분류한다. 하지만, 이 명칭은 가능한 모든 분화 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 미숙한 수지상 세포는 항원 흡수 및 처리 능력이 큰 APC로서, 높은 Fcγ수용체 및 만노스 수용체의 발현과 상호관련이 있다. 성숙한 표현형은 일반적으로 이 마커들의 발현은 낮지만, T 세포 활성화에 주역할을 하는 세포 표면 분자, 예컨대 I형 및 II형 MHC, 부착 분자(예, CD54 및 CD11), 및 공동자극 분자(예, CD40, CD80, Cd86 및 4-1BB)는 고농도 발현을 특징으로 한다.
APC는 일반적으로 클라미디아 폴리펩타이드 또는 이것의 면역원성 부분이 세포 표면상에 발현되도록 클라미디아 단백질(또는 이의 일부 또는 다른 변형체)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염될 수 있다. 이러한 형질감염은 생체외에서 실시할 수 있고, 이와 같이 형질감염된 세포를 함유하는 조성물이나 백신은 본 명세서에 설명된 바와 같이 치료용으로 사용할 수 있다. 또는, 수지상 세포 또는 다른 항원-제시 세포를 표적으로 하는 유전자 전달 비히클을 환자에게 투여하여 생체내에서 형질감염이 일어나도록 할 수 있다. 수지상 세포의 생체내 및 생체외 형질감염은 일반적으로 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 WO 97/24447에 기술된 방법이나, 문헌[Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75:456-460, 1997]에 기술된 유전자 총 시도를 사용하여 실시할 수 있다. 수지상 세포의 항원 적재는 수지상 세포 또는 선조 세포를 클라미디아 폴리펩타이드, DNA(나출형 또는 플라스미드 벡터 함유) 또는 RNA와 항온처리하거나 또는 항원 발현 재조합 박테리아 또는 바이러스(예, 종두, 계두(fowlpox), 아데노바이러스, 또는 렌티바이러스 벡터)와 항온처리하여 얻을 수 있다. 적재하기 전에, 폴리펩타이드는 T 세포 헬퍼(예, 담체 분자)를 제공하는 면역학적 파트너에 공유 결합시킬 수 있다. 또는, 수지상 세포는 비결합성 면역학적 파트너에 의해 자극되거나 폴리펩타이드의 존재하에 자극될 수 있다.
약제학적 조성물과 백신의 투여 경로 및 횟수, 뿐만 아니라 투여량은 개개인마다 상이할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하)하거나, 비측(예, 흡입) 또는 경구 투여할 수 있다. 1 내지 36주 동안에는 1 내지 3회의 투여량으로 투여할 수 있다. 3 내지 4개월에는 3회 투여가 바람직하며, 그 후 주기적으로 추가 예방접종을 실시할 수 있다. 각 환자마다 교번적인 프로토콜이 적당한 경우도 있다. 적합한 투여량은 전술한 바와 같이 투여했을 때 적어도 1 내지 2년 동안 클라미디아 감염으로부터 환자를 예방하기에 충분한 면역반응을 면역화된 환자로부터 유발할 수 있는 폴리펩타이드 또는 DNA의 양이다. 일반적으로, 투여량에 존재하는 폴리펩타이드의 양(또는 투여량에 존재하는 DNA에 의해 동일계에서 생성되는 양)은 숙주 1㎏당 약 1pg 내지 약 100㎎ 범위, 일반적으로 약 10pg 내지 약 1㎎, 바람직하게는 약 100pg 내지 약 1㎍ 범위이다. 적합한 투여량의 부피는 환자의 체격에 따라 달라지지만 일반적으로 약 0.1㎖ 내지 약 5㎖ 범위이다.
본 발명의 약제학적 조성물에는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 담체를 사용할 수 있지만 투여 방식에 따라 담체의 종류는 달라진다. 경피 주사와 같은 비경구 투여의 경우, 담체로는 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충액이 바람직하다. 경구 투여의 경우, 상기 담체 모두와 고형 담체, 예컨대 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈컴, 셀룰로스, 글루코스, 슈크로스 및 탄산마그네슘을 이용할 수 있다. 또한, 생물분해성 미소구(예, 폴리락틱 갈락타이드)도 본 발명의 약제학적 조성물에 담체로서 사용할 수 있다. 적합한 생물분해성 미소구는 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 개시되어 있다.
일반적으로, 적당한 투여량 및 치료 방법은 치료 및/또는 예방적 잇점을 제공하기에 충분한 양으로 활성 화합물을 제공한다. 이러한 반응은 모니터하여 비치료 환자와 비교했을 때 치료 환자에서 나타나는 개선된 임상 결과를 얻을 수 있다. 클라미디아 단백질에 대한 기존의 면역 반응이 증가하는 것은 일반적으로 개선된 임상 결과와 관련있는 것이다. 이러한 면역 반응은 일반적으로 치료 전후에 환자로부터 수득한 시료를 사용하여 수행할 수 있는 표준 증식 분석, 세포독성 분석 또는 사이토카인 분석을 사용하여 평가할 수 있다.
다른 관점으로서, 본 발명은 클라미디아 감염을 진단하기 위하여 전술한 폴리펩타이드를 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 관점으로서, 1종 이상의 상기 폴리펩타이드를 단독으로 또는 혼합물로서 사용하여 생물학적 시료내의 클라미디아 감염을 측정하는 방법이 제공된다. 명료한 이해를 위하여, 본 발명의 진단 방법에 관한 특정 구체예를 설명할 때에는 "폴리펩타이드"란 용어를 사용하지만, 본 발명의 융합 단백질도 이 방법에 사용될 수 있다는 것은 당업자에게는 자명한 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "생물학적 시료"란 환자로부터 수득한 임의의 항체 함유 시료를 의미한다. 시료는 바람직하게는 전혈, 객담, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 요이다. 보다 바람직하게는, 시료는 환자로부터 수득한 혈액, 혈청 또는 혈장 시료이다. 시료내 폴리펩타이드(들)에 대한 항체의 존재 유무를 소정의 컷오프값과 비교하여 측정하기 위하여 이하에 기술된 바와 같은 분석법에 폴리펩타이드를 사용한다. 이러한 항체의 존재는 이미 클라미디아 항원에 대한 감작이 있었음을 시사하는 것으로 클라디미아 감염을 나타낼 수 있다.
1종 이상의 폴리펩타이드가 사용되는 구체예에서, 사용된 폴리펩타이드는 상보성(즉, 한 성분의 폴리펩타이드에 의해 감염이 검출되지 않는 시료에서 다른 성분의 폴리펩타이드에 의해 감염이 검출되는 경향이 있음)인 것이 바람직하다. 상보성 폴리펩타이드는 일반적으로 클라디미아로 감염된 것으로 알려진 일련의 환자로부터 수득한 혈청 시료를 평가하는데 각 폴리펩타이드를 개별적으로 사용하여 확인할 수 있다. 시료가 양성인지 각 폴리펩타이드로 시험한 후(하기 기술된 바와 같이), 시험된 시료 대부분 또는 전부에서 감염을 검출할 수 있는 2종 이상의 폴리펩타이드의 혼합물을 제조할 수 있다.
시료에 존재하는 항체를 검출하기 위하여 1종 이상의 폴리펩타이드를 이용하는 다양한 분석 방식은 당업자에게 잘 알려져 있다[예컨대, 참고 인용되는 문헌, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 바람직한 구체예로서, 분석법은 고체 지지체 상에 고정시킨 폴리펩타이드를 이용하여 시료의 항체를 결합시켜 제거하는 것을 포함한다. 결합된 항체는 그 다음 리포터 기를 함유하는 검출 시약을 사용하여 검출할 수 있다. 적합한 검출 시약은 항체/폴리펩타이드 복합체에 결합하는 항체와 리포터기로 표지된 유리 폴리펩타이드를 포함한다(즉, 반경쟁적 분석법). 또는, 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 리포터 기로 표지하고, 시료와 항원의 항온처리후 고정화된 항원에 항체가 결합하도록 하는 경쟁적 분석법을 사용할 수도 있다. 시료의 성분들이 폴리펩타이드에 대한 표지된 항체의 결합을 억제하는 정도는 고정화된 폴리펩타이드와 시료의 반응성을 나타낸다.
고체 지지체는 항원이 부착될 수 있는 당업자에게 공지된 모든 고체 물질일 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 미량역가 평판의 시험 웰이거나, 니트로셀룰로스 또는 다른 적합한 막일 수 있다. 또는, 지지체는 비드 또는 디스크, 예컨대 유리, 섬유유리, 라텍스 또는 폴리스티렌이나 폴리비닐클로라이드와 같은 플라스틱 물질일 수 있다. 또한, 지지체는 예를 들어 미국 특허 제5,359,681호에 개시된 바와 같은 자기 입자 또는 섬유 광학 센서일 수 있다.
폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 다양한 기법을 통해 고체 지지체에 결합시킬 수 있다. 본 발명의 내용 중에서, "결합"이란 용어는 비공유 결합, 예컨대 흡착 및 공유 부착(항원과 지지체 상의 작용기 간의 직접적인 결합이나 가교제를 통한 결합일 수 있음) 모두를 의미한다. 미량역가 평판의 웰이나 막에 대한 흡착에 의한 결합이 바람직하다. 이와 같은 경우에, 흡착은 폴리펩타이드를 적합한 완충액 중에서 고체 지지체와 적합한 시간 동안 접촉시키므로써 완성할 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 달라지지만, 일반적으로 약 1 시간 내지 1일 사이이다. 일반적으로, 적당량의 항원을 결합시키는 데에는 플라스틱 미량역가 평판(예컨대 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)의 웰을 약 10ng 내지 약 1㎍ 범위, 바람직하게는 약 100ng의 폴리펩타이드와 접촉시키면 충분하다.
고체 지지체에 대한 폴리펩타이드의 공유 부착은 일반적으로 먼저 지지체 및 폴리펩타이드 상의 작용기, 예컨대 하이드록실기 또는 아미노기와 모두 반응하는 이가작용성 시약과 지지체를 반응시켜 실시한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 벤조퀴논을 사용하여 적당한 중합체 코팅을 가진 지지체에 결합되거나 또는 아민을 가진 지지체 상의 알데하이드기와 폴리펩타이드 상의 활성 수소의 축합에 의해 결합될 수 있다[예를 들어, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13).
특정 구체예에서, 분석법은 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA)이다. 이 분석법은 먼저 고체 지지체, 일반적으로 미량역가 평판의 웰 상에 고정시킨 폴리펩타이드 항원을 시료와 접촉시켜 시료내에 있는 폴리펩타이드에 대한 항체가, 고정된 폴리펩타이드에 결합하도록 하여 수행할 수 있다. 그 다음 결합되지 않은 시료는 고정화된 폴리펩타이드로부터 제거하고, 고정화된 항체-폴리펩타이드 복합체에 결합할 수 있는 검출 시약을 첨가한다. 그 다음, 고체 지지체 상에 결합된 상태를 유지하는 검출 시약의 양을 특정 검출 시약에 적당한 방법을 사용하여 측정한다.
보다 구체적으로, 일단 폴리펩타이드가 전술한 바와 같이 지지체 상에 고정되면, 일반적으로 지지체 상의 나머지 단백질 결합 부위는 차단한다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 차단제로서 소혈청 알부민(BSA) 또는 Tween 20™(SigmaChemical Co., St. Louis, MO) 등을 사용할 수 있다. 그 다음, 고정화된 폴리펩타이드를 시료와 함께 항온처리하고, 항체가 항원과 결합할 수 있도록 한다. 시료는 항온처리 전에 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 적합한 희석제로 희석할 수 있다. 일반적으로, 적당한 접촉 시간(즉, 항온처리 시간)은 HGE 감염된 시료내에서 항체의 존재를 검출하기에 충분한 시간이다. 바람직하게는, 접촉 시간은 결합 정도가 결합 항체와 비결합 항체가 평형상태에 도달했을 때의 95% 이상을 얻기에 충분한 정도인 것이 좋다. 당업자라면 일정 시간 동안 일어나는 결합 정도를 측정하여 평형에 도달하는데 필요한 시간을 용이하게 측정할 수 있음을 잘 알고 있다. 일반적으로, 실온에서 항온처리 시간이 약 30분이면 충분하다.
그 다음, 비결합 시료는 적당한 완충액, 예컨대 0.1% Tween 20™을 함유하는 PBS를 사용하여 고체 지지체를 세척하여 제거할 수 있다. 그 다음, 검출 시약을 고체 지지체에 첨가한다. 검출 시약은 고정화된 항체-폴리펩타이드 복합체에 결합하고 당업자에게 공지된 다양한 수단에 의해 검출될 수 있는 화합물이 적당하다. 바람직하게는, 검출 시약은 리포터기가 접합된 결합제(예컨대, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린, 렉틴 또는 유리 항원)를 포함한다. 바람직한 리포터 기로는 효소(예, 양고추냉이 퍼옥시다제), 기질, 보조인자, 억제제, 염료, 방사성핵종, 발광기, 형광기 및 비오틴이 있다. 리포터 기에 대한 결합제의 접합은 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 완성할 수 있다. 일반적인 결합제는 또한 많은 시판원(예, Zymed Laboratories, San Francisco, CA 및 Pierce, Rockford, IL)에서 다양한 리포터기에 접합시킨 상태로 구입할 수도 있다.
그 다음, 검출 시약은 결합된 항체를 검출하기에 충분한 시간동안 고정화된 항체-폴리펩타이드 복합체와 항온처리한다. 적당한 시간은 일반적으로 제조자의 지시에 따라 또는 일정 시간 동안 일어나는 결합 정도를 분석하여 결정할 수 있다. 그 다음, 결합되지 않은 검출 시약을 제거하고 결합된 검출 시약을 리포터기를 사용하여 검출한다. 리포터기를 검출하는데 사용되는 방법은 리포터기의 특성에 달려있다. 방사성 기인 경우에는 일반적으로 신틸레이션 계수법이나 자동방사능측정 방법이 적당하다. 분광분석법은 염료, 발광기 및 형광기를 검출하는데 사용할 수 있다. 비오틴은 여러 리포터 기(일반적으로 방사성 기 또는 형광성 기 또는 효소)에 결합된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 효소 리포터 기는 일반적으로 기질을 첨가한 뒤(일반적으로 소정 시간 동안), 반응 생성물을 분광분석이나 다른 분석법으로 분석하여 검출할 수 있다.
시료에 존재하는 항클라디미아 항체의 유무를 측정하기 위하여 고체 지지체에 결합된 상태를 유지하는 리포터 기로부터 검출되는 시그널을 일반적으로 소정의 컷오프값에 상응하는 시그널과 비교한다. 바람직한 일 구체예에서, 컷오프값은 고정화된 항원을 감염되지 않은 환자의 시료와 항온처리했을 때 얻어지는 평균 시그널값이다. 일반적으로, 소정의 컷오프값 보다 표준편차가 3이 높은 시그널을 생성하는 시료는 클라미디아 감염 양성으로 간주한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 컷오프값은 문헌[Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, pp. 106-107]의 방법에 따라 리시버 오퍼레이터 곡선(Receiver Operator Curve)을 사용하여 결정한다. 간략히 설명하면, 이 구체예에서, 컷오프값은 진단 시험 결과마다 각각 가능한 컷오프값에 상응하는 가성 양성률(100% 특이성)과 진정 양성률(즉, 민감성) 쌍의 플롯으로부터 측정할 수 있다. 플롯에서 상부 좌측 모서리쪽에 가장 가까운 컷오프값(즉, 가장 넓은 영역을 차지하는 값)이 가장 정확한 컷오프값이고, 이 방법으로 측정한 컷오프값보다 큰 시그널을 생성하는 시료는 양성으로 간주할 수 있다. 또는, 컷오프값을 플롯을 따라 좌측으로 이동시켜 가성 양성률을 최소화하거나 또는 우측으로 이동시켜 가성 음성률을 최소화할 수 있다. 일반적으로 이 방법으로 측정한 컷오프값 보다 큰 시그널을 생성하는 시료는 클라미디아 감염 양성으로 간주한다.
이와 관련있는 구체예로서, 항원을 니트로셀룰로스와 같은 막 위에 고정시킨 급속 유출(rapid flow-through) 또는 스트립 테스트 방식(strip test format)으로 분석을 실시한다. 이 유출 테스트에서 시료내의 항체는 시료가 막을 통해 통과할 때 고정화된 폴리펩타이드에 결합한다. 그 다음, 검출 시약(예, 단백질 A-콜로이드성 금)을 함유하는 용액을 막을 통해 통과시키면 검출 시약은 항체-폴리펩타이드 복합체에 결합한다. 그 다음, 결합된 검출 시약은 전술한 바와 같이 측정할 수 있다. 스트립 테스트 방식의 경우에는, 폴리펩타이드가 결합된 막의 한쪽 말단부를 시료를 함유하는 용액에 침지시킨다. 시료는 검출 시약을 함유하는 영역을 통해 고정화된 폴리펩타이드의 영역으로 이동한다. 폴리펩타이드로 이동된 검출 시약의 농축은 시료내 클라미디아 항체의 존재를 나타낸다. 일반적으로, 특정 부위에서의 검출 시약의 농축은 선과 같은 패턴을 나타내어 육안으로 판독할 수 있다. 이러한 패턴이 없다면 음성 결과를 나타낸다. 일반적으로, 막에 고정시킨 폴리펩타이드의양은 생물학적 시료가 전술한 바와 같은 ELISA에서 양성 시그널을 생성하기에 충분한 항체의 농도를 포함할 때 육안으로 확인가능한 패턴을 생성하도록 선택한다. 막에 고정시킨 폴리펩타이드의 양은 약 25ng 내지 약 1㎍ 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 50ng 내지 약 500ng 범위이다. 이러한 테스트들은 일반적으로 극소량(예, 한방울)의 환자 혈청이나 혈액으로 수행할 수 있다.
물론, 본 발명의 폴리펩타이드들에 사용하기에 적합한 다른 분석 프로토콜들은 다수 존재하며, 상기 설명은 단지 예시하기 위한 것이다. 이러한 방법들 중에 유용하게 사용될 수 있는 다른 분석 프로토콜의 또 한 예는 웨스턴 블롯으로서, 이 분석에서는 생물학적 시료 중에 존재하는 단백질이 결합제에 노출되기 전에 겔 상에서 분리된다. 이 기법은 당업자에게 잘 알려진 기술이다.
본 발명은 또한 클라미디아 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편과 같은 인자를 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이란, 검출가능한 농도에서(예컨대 ELISA의 경우) 클라미디아 단백질과 반응하면 클라미디아 단백질에 "특이적으로 결합"하고 유사한 조건하에서 비관련 단백질과는 검출가능하게 반응하지 않는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "결합"이란 용어는 복합체가 형성되도록 별도의 두 분자 사이에 비공유 결합이 형성된 것을 의미한다. 결합력은 예를 들어 복합체를 형성하는 결합 상수를 측정하여 평가할 수 있다. 결합 상수는 복합체의 농도를 성분 농도의 곱으로 나눈 값이다. 일반적으로 복합체 형성의 결합 상수가 약 103L/mol을 초과하면본 발명에서는 두 화합물이 "결합"하였다고 한다. 결합 상수는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
결합제는 또한 본 명세서에 제시된 대표 분석법에 따라 클라미디아 감염된 환자와 비감염 환자를 구별할 수 있다. 즉, 항체 또는 클라미디아 단백질에 결합하는 다른 결합제는 질병이 있는 환자의 약 20% 이상에서 클라미디아 감염의 존재를 나타내는 시그널을 생성하고, 감염되지 않은 개체의 약 90% 이상에서 질병이 없음을 나타내는 음성 시그널을 생성한다. 결합제가 이러한 조건을 만족시키는지를 측정하기 위하여 클라미디아 감염 환자 및 비감염 환자(표준 임상 테스트로 측정했을 때)로부터 얻은 생물학적 시료(예, 혈액, 혈청, 가래, 요 및/또는 조직 생검)를, 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 존재에 대하여 본 명세서에 설명된 바와 같이 분석할 수 있다. 분명한 것은, 질병이 있는 시료와 없는 시료가 통계적으로 유의적인 수만큼 분석되어야 한다는 것이다. 각 결합제는 상기 기준을 만족시켜야만 하지만, 민감성을 향상시키기 위하여 결합제를 조합하여 사용할 수도 있음을 당업자라면 잘 알 것이다.
상기 조건을 만족시키는 모든 제제는 결합제일 수 있다. 예를 들어, 결합제는 펩타이드 성분, RNA 분자 또는 폴리펩타이드를 갖거나 갖지 않은 리보솜일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 결합제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 항체는 당업자에게 공지된 다양한 기법으로 제조할 수 있다[예, Harlow and Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로 항체는 본 명세서에 설명된 바와 같은 모노클로날 항체의 생성을 비롯한 세포 배양 기법이나 또는 재조합 항체를 생성시키는 안정한 박테리아 또는 포유동물 세포 숙주내로 항체 유전자의 형질감염을 통해 수득할 수 있다. 한가지 기법으로서, 폴리펩타이드를 함유하는 면역원을 먼저 다양한 포유동물(예, 마우스, 래트, 토끼, 양 또는 염소) 중 어느 하나에 주사한다. 이 단계에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 변형없이 면역원으로서 작용할 수 있다. 또는, 특히 비교적 짧은 폴리펩타이드의 경우에는 폴리펩타이드가 소혈청 알부민이나 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 담체 단백질에 결합된다면 우수한 면역 반응이 유인될 수 있다. 이 면역원을 동물 숙주에게, 바람직하게는 1회 이상의 추가 면역화를 포함하는 소정의 스케줄에 따라 주사하고, 주기적으로 동물의 혈액을 채혈한다. 그 다음, 적합한 고체 지지체에 결합된 폴리펩타이드를 사용하여 친화성 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 상기 항혈청으로부터 폴리펩타이드에 특이적인 폴리클로날 항체를 정제할 수 있다.
당해의 항원성 폴리펩타이드에 특이적인 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein, Eur.J.Immunol. 6:511-519, 1976]에 기술된 기법 및 이의 개선안에 따라 제조할 수 있다. 간략히 설명하면, 이 방법은 목적하는 특이성(즉, 당해 폴리펩타이드와의 반응성)을 가진 항체를 생성할 수 있는 무한증식성 세포주를 제조하는 단계를 포함한다. 이러한 세포주는 예를 들어 전술한 바와 같이 면역화된 동물에게서 수득한 비장 세포로부터 얻을 수 있다. 비장 세포는 그 다음 예를 들어 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계인 세포와의 융합을 통해 무한증식화한다. 융합 기법은 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 비장 세포와 골수종 세포를 3 내지 4분 동안 비이온성 세정제로 결합시킨후, 골수종 세포는 성장하지 않고 하이브리드 세포의 성장만을 지지하는 선택 배지에 저밀도로 평판배양한다. 충분한 시간, 일반적으로 약 1 내지 2주 후에 하이브리드 콜로니를 관찰한다. 단일 콜로니들을 선택하여 그 배양 상청액을 폴리펩타이드에 대한 결합 활성에 대하여 시험한다. 반응성과 특이성이 높은 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체는 증식하는 하이브리도마 콜로니의 상청액으로부터 분리할 수 있다. 또한, 다양한 기법을 이용하여 수율을 향상시킬 수 있는데, 예를 들어 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복강내로 하이브리도마 세포주를 주사한다. 그 다음, 복수액이나 혈액으로부터 모노클로날 항체를 수확할 수 있다. 오염물은 통상의 기법, 예컨대 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출에 따라 항체로부터 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 예컨대 친화성 크로마토그래피 단계와 같은 정제 과정에 사용할 수 있다.
특정 구체예에서, 항체의 항원 결합 단편을 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 단편으로는 표준 기법에 따라 제조할 수 있는 Fab 단편이 있다. 간략히 설명하면, 단백질 A 비드 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피로 토끼 혈청으로부터 면역글로불린을 정제하고[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 파파인으로 분해하여 Fab 단편과 Fc 단편을 수득한다. Fab 및 Fc 단편은 단백질 A 비드 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피로 분리할 수 있다,
본 발명의 모노클로날 항체는 1종 이상의 치료제와 결합될 수 있다. 이 때적합한 제제로는 방사성핵종, 분별 유도체, 약물, 독소 및 이의 유도체가 있다. 바람직한 방사성핵종으로는90Y,123I,125I,131I,186Re,188Re,211At 및212Bi가 있다. 바람직한 약물로는 메토트렉세이트, 피리미딘과 퓨린 유사체가 있다. 바람직한 구별 유도체로는 포르볼 에스테르 및 부티르산이 있다. 바람직한 독소로는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 젤로닌, 슈도모나스 외독소, 시겔라(Shigella) 독소 및 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질이 있다.
치료제는 적합한 모노클로날 항체에 직접 또는 간접적으로(예컨대, 링커기를 통해) 결합될 수 있다(예컨대 공유 결합). 제제와 항체 사이의 직접적인 반응은 그 각각의 서로 반응할 수 있는 치환체를 보유하는 경우에 가능하다. 예를 들어, 한 분자 상의 아미노기 또는 설프하이드릴기와 같은 친핵기는 다른 분자 상의 무수물 또는 산 할라이드와 같은 카르보닐 함유기 또는 우수한 이탈기(예, 할라이드)를 함유하는 알킬기와 반응할 수 있다.
또는, 치료제와 항체를 링커기를 통해 결합시키는 것이 바람직할 수도 있다. 링커기는 결합력을 방해하지 않도록 하기 위해 항체를 제제로부터 일정 거리를 두기 위한 이격자(spacer)로서 작용할 수 있다. 링커기는 또한 제제 또는 항체 상에 있는 치환체의 화학적 반응성을 증가시키고, 이에 따라 결합 효율을 증가시키는 작용을 할 수 있다. 화학 반응성의 증가는 가능하지 않을 수도 있는 제제의 사용이나 제제상의 작용기의 사용을 용이하게 할 수 있다.
당업자라면 동종작용성이며 이종작용성인 다양한 이가작용성 또는 다가작용성 시약[예컨대, Pierce Chemical Co.,(Rockford, IL)의 카탈로그에 기재된 것]을 링커기로서 이용할 수 있다. 결합은 예를 들어, 아미노기, 카르복실기, 설프하이드릴기 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통해 실시될 수 있다. 이러한 방법에 관한 설명이 있는 문헌은 다수가 있다(예컨대 미국 특허 제4,671,958호, Rodwell et al.).
치료제가 본 발명의 면역접합체의 항체 부분으로부터 유리될 때 보다 강력해지는 경우에는, 세포에 내재화되는 동안이나 내재화된 즉시 분열되는 링커기를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 많은 여러 절단성 링커기가 제공되어 있다. 이러한 링커기로부터 제제가 세포내 해리되는 기작은 이황화 결합의 환원에 의해 절단(예, 미국 특허 제4,489,710호, Spitler), 광불안정성 결합의 광조사(예, 미국 특허 제4,625,014호, Senter et al.), 유도체화된 아미노산 측쇄의 가수분해(예, 미국 특허 제4,638,045호, Kohn et al.), 혈청 보체-매개의 가수분해(예, 미국 특허 제4,671,958호, Rodwell et al.), 및 산촉매화된 가수분해(예, 미국 특허 제4,569,789호, Blattler et al.)가 있다.
항체에는 1 이상의 제제를 결합시키는 것이 바람직할 수 있다. 일 구체예에서는 한 제제의 다수 분자를 한 항체 분자에 결합시킨다. 다른 구체예에서는 1종 이상의 제제를 한 항체에 결합시킬 수 있다. 특정 구체예에 관계없이 1 이상의 제제를 가진 면역접합체는 다양한 방식으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 1 이상의 제제는 항체 분자에 직접 결합시키거나 또는 다수의 부착 부위를 제공하는 링커를 사용할 수 있다. 또는, 담체를 사용할 수도 있다.
담체는 직접 또는 링커기를 통해 공유 결합하는 등의 다양한 방식으로 제제를 보유할 수 있다. 적합한 담체로는 알부민(예, 미국 특허 제4,507,234호, Kato et al), 펩타이드 및 아미노덱스트란과 같은 다당류(예, 미국 특허 제4,699,784, Shih et al.)가 있다. 담체는 또한 비공유 결합이나 캡슐화, 예컨대 리포좀 소포체(예, 미국 특허 제4,429,008호 및 제4,873,088호) 등으로 제제를 보유할 수 있다. 방사성핵종 제제에 특이적인 담체는 방사성할로겐화된 소분자 및 킬레이트화 화합물을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,735,792호는 대표적인 방사성할로겐화된 소분자 및 이의 합성법을 개시하고 있다. 방사성핵종 킬레이트는 금속, 또는 금속 산화물, 방사성핵종을 결합시키기 위한 공여체 원자로서 질소 및 황 원자를 함유하는 것을 포함하는 킬레이트화 화합물로부터 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,673,562호(Davison et al.)는 대표적인 킬레이트화 화합물과 이의 합성법을 개시한다.
항체와 면역접합체를 투여하는 경로로는 다양한 경로를 사용할 수 있다. 일반적으로 투여는 정맥내, 근육내, 피하 또는 부위 특이적 영역으로 적당한 방법에 의해 실시할 수 있다. 항체/면역접합체의 정확한 투여량은 사용된 항체, 항원 밀도 및 항체의 소거율에 따라 달라진다는 것은 자명하다.
항체는 전술한 바와 유사한 분석법 및 당업자에게 공지된 다른 기법을 사용하여 클라미디아 항원의 존재를 검출하는 진단 시험에 사용할 수 있어서, 환자 중의 클라미디아 감염을 검출하는 방법을 제공한다,
본 발명의 진단 시약은 또한 상기 1종 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는DNA 서열 또는 이의 1종 이상의 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2종 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)계 분석법에 이용하여 생물학적 시료 유래의 클라미디아 특이적인 cDNA를 증폭시킬 수 있다. 이 때 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 1종 이상은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자에 특이적인 것이다. 증폭된 cDNA의 존재는 그 다음 겔 전기영동과 같은 당해 기술 분야에 공지된 기법을 사용하여 측정한다. 이와 마찬가지로, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브는 하이브리드화 분석에 사용하여 생물학적 시료 중의 본 발명의 폴리펩타이드의 존재를 검출할 수 있다,
본 명세서에 사용된 바와 같은, "DNA 분자에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머/프로브"는 문제의 DNA 분자와 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상인 올리고뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 진단 방법에 유용하게 사용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 프로브는 적어도 약 10 내지 40개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 하나를 암호화하는 DNA 분자 중 약 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 진단 방법에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드 프로브는 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드 중 하나를 암호화하는 DNA 분자의 약 15개 이상의 연속 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것이 좋다. PCR계 분석 및 하이브리드화 분석의 기법은 당해 기술 분야에공지되어 있다(예컨대, Mullis et al. 상기 문헌 참조; Ehrlich, 상기 문헌 참조). 따라서, 프라이머 또는 프로브는 생물학적 시료내의 클라미디아 특이적 서열을 검출하는데 사용할 수 있다. 전술한 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 프로브 또는 프라이머는 단독으로 또는 상호 조합하여 사용할 수 있다.
다음 실시예는 예시하기 위한 것으로 제한하는 것이 아니다.
실시예 1
클라미디아 항원을 암호화하는 DNA 서열의 분리
본 발명의 클라미디아 항원은 대부분 문헌[Sanderson et al., J.Exp.Med., 1995, 182:1751-1757]에 기재된 바와 같이 클라미디아 트라코마티스 LGV II의 게놈 DNA 라이브러리를 발현 클로닝하여 분리하였고, 면역반응성 T 세포주내에 IFNγ 및 PBMC 증식을 유도하는 것으로 관찰되었다.
클라미디아 특이적인 T 세포주는 클라미디아 트라코마티스 LGV II의 기본소체에 의한 클라미디아 생식관 감염의 이력이 없는 정상 공여체로부터 PBMV를 자극하여 수득하였다. TCL-8이라고 하는 이 T 세포주는 클라미디아 트라코마티스 및 클라미디아 뉴모니아에 의해 감염된 단핵구 유래의 수지상 세포를 인식하는 것으로 관찰되었다.
클라미디아 트라코마티스 LGV II의 무작위로 전단한 게놈 라이브러리를 람다 ZAP(Stratagene, La Jolla, CA)에 작제하고, 증폭된 라이브러리를 30클론/웰의 밀도로 96웰 미량역가 평판에 플레이팅하였다. 박테리아는 2mM IPTG의 존재하에 3시간 동안 재조합 단백질을 발현하도록 유도한 뒤, 펠릿화한 다음, RPMI 10% FBS 200㎕에 재현탁하였다. 유도된 박테리아 현탁액 10㎕를 자가 단핵구 유래의 수지상 세포를 함유하는 96웰 평판에 전달하였다. 2시간 동안 항온처리한 후, 수지상 세포를 세척하여 유리 이. 콜라이를 제거하고, 클라미디아 특이적인 T 세포를 첨가하였다. 수집물에 대한 반응으로 T 세포의 증식 및 IFN-γ 생성을 측정하여 양성의 이. 콜라이 수집물을 확인하였다.
4개의 양성 수집물을 확인하고, 파쇄하여 4개의 순수 클론(1-B1-66, 4-D7-28, 3-G3-10 및 10-C10-31이라 명칭함)을 수득하고, 이들의 삽입 크기를 확인한 결과 각각 481bp, 184bp, 110bp 및 1400bp였다. 1-B1-66, 4-D7-28, 3-G3-10 및 10-C10-31에 대하여 측정한 DNA 서열은 각각 서열 1 내지 4에 제시하였다. 클론 1-B1-66은 대략 씨.트라코마티스 게놈의 영역 536690에 존재하는 것이다(NCBI 씨.트라코마티스 데이터베이스). 클론 1-B1-66 내에서는 이미 동정되어 있는 9kDa 단백질(Stephens, et al., Genebank 수탁번호 AE001320)을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 확인되었다(뉴클레오타이드 115 내지 375). 이 서열은 서열 5에 제시한다. 클론 4-D7-28은 상기와 동일한 ORF의 보다 작은 영역(1-B1-66의 아미노산 22-82)이다. 클론 3-G3-10은 대략 씨.트라코마티스 게놈의 영역 74559에 존재하는 것이다. 삽입체는 게놈내에서의 배향에 대하여 안티센스 배향으로 클로닝되어 있다. 클론 10-C10-31은 이미 공개되어 있는 클라미디아 트라코마티스의 S13 리보솜 단백질의 서열(Gu, L. et al. J.Bacteriology, 177:2594-2601, 1995)에 상응하는 오픈리딩 프레임을 포함한다. 4-D7-28 및 10-C10-31에 대한 추정된 단백질 서열은 각각 서열 6 및 12에 제시하였다. 3-G3-10의 추정된 단백질 서열들은 서열 7 내지 11에 제시하였다.
관련된 일련의 스크리닝 연구로서, 다른 T 세포주를 사용하여 전술한 클라미디아 트라코마티스 LGV II의 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 클라미디아 특이적인 T 세포주(TCT-1)는 클라미디아 트라코마티스 LGV II의 기본소체로 감염된 자가 단핵구 유래의 수지상 세포로 환자의 PBMC를 자극하여 클라미디아 생식관 감염이 있는 환자로부터 수득하였다. 1256bp 삽입체를 함유하는 클론 4C9-18(서열 21)은 표준 증식 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 클라미디아 특이적인 T 세포주 TCT-1로부터 특이적인 면역 반응을 유도하였다. 이후 추가 분석을 통해 이 클론이 3개의 공지 서열을 포함하는 것으로 관찰되었다: 서열 22에 제시한 리포아마이드 탈수소효소(Genebank 수탁번호 AE001326); 서열 23에 제시한 추정상의 단백질 CT429(Genebank 수탁번호 AE001316); 및 서열 24에 제시한 유비퀴논 메틸트란스퍼라제 CT428의 오픈 리딩 프레임의 일부분(Genebank 수탁 번호 AE 001316).
클론 4C9-18(서열 21)과 관련된 추가 연구를 위하여, 씨.트라코마티스(LGV II) 유래의 리포아마이드 탈수소효소의 전장 아미노산 서열(서열 22)을 클론 CtL2-LPDA-FL(서열 90)에서 발현시켰다.
T 세포 자극 에피토프를 함유하는 오픈 리딩 프레임을 추가 분석하기 위하여, 아미노 말단에 6X-히스티딘 태그를 암호화하는 cDNA 서열을 가진 클론 4C9-18의 뉴클레오타이드 1 내지 695를 함유하는 cDNA 단편을 pET17b 벡터(Novagen,Madison, WI)의 NdeI/EcoRI 부위에 서브클로닝하고, 클론 4C9-18#2 BL21 pLysS(서열 25, 상응하는 아미노산 서열이 서열 26에 제시됨)로 명칭하였으며, 이. 콜라이를 형질전환시켰다. 형질전환된 이. 콜라이를 2mM IPTG를 이용하여 3시간 동안 선택적 유도하여, 표준 쿠마시 염색 SDS-PAGE로 확인되는 바와 같이 클론 4C9-18#2 BL21 pLysS로부터 26kDa 단백질을 발현시켰다. 클론 4C9-18#2 BL21 pLysS에 의해 암호화된 단백질의 면역원성을 측정하기 위하여 26kDa 단백질을 발현하는 이. 콜라이를 1x104단핵구 유래의 수지상 세포 상에 적정하고 2시간 동안 항온처리하였다. 수지상 세포 배양물을 세척하고 2.5x104T 세포(TCT-1)를 첨가하여 72시간 동안 더 항온처리하였다. 그 다음, 배양 상청액 중의 IFN-γ의 농도를 ELISA로 측정하였다. 도 1에 도시한 바와 같이, T 세포주 TCT-1은 IFN-g에 의해 결정된 바와 같이 유도된 배양물에 반응하는 것으로 관찰되었고, 이것은 리포아마이드 탈수소효소 서열에 대한 클라미디아 특이적인 T 세포 반응을 나타낸다. 이와 마찬가지로, 클론 4C9-18#2 BL21 pLysS에 의해 암호화된 단백질은 표준 증식 분석을 통해 TCT-1 T 세포주를 자극하는 것으로 관찰되었다.
전술한 CD4+ T-세포 발현 클로닝 기법을 사용하여 또 다른 클라미디아 트라코마티스 항원을 동정하는 추가 연구를 통해 또 다른 클론을 수득하였다. TCP-21 T 세포주 뿐만 아니라 TCT-1 및 TCL-8 클라미디아 특이적인 T-세포주를 이용하여 클라미디아 트라코마티스 LGVII 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. TCP-21 T 세포주는 클라미디아 뉴모니아에 대한 체액성 면역 반응이 있는 환자로부터 유도되었다. TCT-1 세포주는 37개의 양성 수집물을 확인하였고, TCT-3 세포주는 41개의 양성 수집물을 확인하였으며, TCP-21 세포주는 2개의 양성 수집물을 확인하였다. 이와 같은 10개의 양성 수집물로부터 다음과 같은 클론이 얻어졌다: TCP-21 세포주에 의해 확인된 클론 11-A3-93(서열 64)은 HAD 상위부류(CT103)에 대한 상동성을 공유하는 1339bp의 게놈 단편이다. 동일 클론 중의 또 다른 삽입체는 보체 가닥에 존재하는 fab I 유전자(CT104)와 상동성을 공유한다. TCP-21 세포주를 사용하여 확인한 클론 11-C12-91(서열 63)은 OMP2 유전자(CT443)의 일부분인 269bp 삽입체를 갖고 있으며, 씨.뉴모니아의 60kDa의 시스테인 풍부한 외막 단백질과 상동성을 공유한다.
TCT-3 세포주를 사용하여 확인한 클론 11-G10-46(서열 62)은 추정상의 단백질 CT610과 상동성을 공유하는 688bp 삽입체를 함유한다. TCT-3 세포주를 사용하여 확인한 클론 11-G1-34(서열 61)는 삽입크기가 1215bp인 2개의 부분 오픈 리딩 프레임(ORF)을 갖고 있다. 한 ORF는 말레이트 탈수소효소 유전자(CT376)과 상동성을 공유하고, 다른 ORF는 글리코겐 가수분해효소 유전자(CT042)와 상동성을 공유한다. TCT-3 세포주를 사용하여 확인한 클론 11-H3-68(서열 60)은 총 삽입 크기가 1180bp인 2개의 ORF를 갖고 있다. 제1의 부분 ORF는 플라스미드에 의해 암호화된 PGP6-D 독성 단백질을 암호화하고 제2의 ORF는 L1 리보솜 유전자(CT318)의 완전한 ORF이다. TCT-3 세포주를 사용하여 확인한 클론 11-H4-28(서열 59)은 삽입 크기가 552bp이며 dnaK 유전자(CT396)의 ORF의 일부분이다. TCT-1 세포주를 사용하여 확인한 클론 12-B3-95(서열 58)는 삽입 크기가 463bp이고 리포아마이드 탈수소효소유전자(CT557)의 ORF의 일부분이다. TCT-1 세포주를 사용하여 확인한 클론 15-G1-89 및 12-B3-95는 동일한 것이고(각각 서열 55 및 58), 삽입 크기가 463bp이며 리포아마이드 탈수소효소 유전자(CT577)의 ORF의 일부분이다. TCT-1 세포주를 사용하여 확인한 클론 12-G3-83(서열 57)은 삽입 크기가 1537bp이고 추정상의 단백질 CT622의 ORF의 일부분이다.
TCT-3 세포주를 사용하여 확인한 클론 23-G7-68(서열 79)은 950 bp 삽입체를 함유하고, L11 리보솜 ORF의 소형 부분, L1 리보솜 단백질의 전체 ORF 및 L10 리보솜 단백질의 ORF의 일부분을 포함한다. TCT-1 세포주를 사용하여 확인한 클론 22-F8-91(서열 80)은 클론의 상보 가닥에 pmpC ORF의 일부분을 함유하는 395bp 삽입체를 포함한다. TCT-3 세포주를 사용하여 확인한 클론 21-E8-95(서열 81)는 CT613 ORF의 일부분, CT612의 전체 ORF, CT611의 전체 ORF 및 CT610의 ORF 일부분을 포함하는 2085bp의 삽입체를 함유한다. TCT-3 세포주를 사용하여 확인한 클론 19-F12-57(서열 82)은 CT858 ORF의 일부분과 recA ORF의 소형 부분을 포함한다. TCT-3 세포주를 사용하여 확인한 클론 19-F12-53(서열 83)은 글루타밀 tRNA 합성효소를 암호화하는 CT455의 ORF 일부분인 379bp 삽입체를 포함한다. TCT-3 세포주를 사용하여 확인한 클론 19-A5-54(서열 84)는 잠재적 플라스미드의 ORF 중 일부분인 715bp 삽입체를 포함한다. TCT-1 세포주를 사용하여 확인한 클론 17-E11-72(서열 85)는 Opp_2 및 pmpD의 ORF 일부분인 476bp 삽입체를 함유한다. 이 클론의 pmpD 영역은 클론 15-H2-76의 pmpD 영역에도 적용된다. TCT-3 세포주를 사용하여 확인한 클론 17-C1-77(서열 86)은 CT858ORF의 일부분 뿐만 아니라 CT857 ORF의 일부분인 1551bp삽입체를 포함한다. TCT-1 세포주를 사용하여 확인한 클론15-H2-76(서열 87)은 pmpD ORF의 대형 부분, CT089 ORF의 일부분, 뿐만 아니라 SycE ORF의 일부분을 포함한다. 클론 15-A3-26(서열 88)은 CT858 ORF 일부분을 포함하는 976bp 삽입체를 함유한다. TCT-10 세포주로 확인된 클론 17-G4-36(서열 267)은 플라스미드내 베타-gal과 정확한 프레임으로 배치되고 DNA 지향성 RNA 폴리머라제 베타 아단위(SerD의 CT315)의 ORF 일부분과 상동성을 공유하는 680bp 삽입체를 함유한다.
전술한 여러 클론들은 다양한 다형성 막 단백질과 상동성을 공유한다. 클라미디아 트라코마티스의 게놈 서열은 pmp라고 하는 9가지 다형성 막 단백질 유전자 군을 포함한다. 이 유전자들은 pmpA, pmpB, pmpC, pmpD, pmpE, pmpF, pmpG, pmpH, 및 pmpI라 명명하였다. 이 유전자들에서 발현된 단백질은 클라미디아 감염에 대한 방어 면역 반응 생성시 생물학적 관련성이 있는 것으로 추정된다. 특히, pmpC, pmpD, pmpE, pmpE 및 pmpI는 추정가능한 시그널 펩타이드를 포함하여, 외막 단백질임을 암시하며, 따라서 강력한 면역학적 표적이다.
클라미디아 트라코마티스 LGVII 혈청형 서열에 기초하여, 프라이머 쌍을 디자인하여 pmpC, pmpD, pmpE, pmpG, pmpH 및 pmpI의 전장 단편을 PCR 증폭시켰다. 그 결과 얻어지는 단편은 DNA 백신 벡터 JA4304 또는 변형 링커를 가진 JA4304인 JAL(스미드클라인 비참, London, England)에 서브클로닝하였다. 구체적으로, PmpC는 각각 서열 197과 198로 제시된 5' 올리고 GAT AGG CGC GCC GCA ATC ATG AAA TTT ATG TCA GCT ACT GCT G 및 3' 올리고 CAG AAC GCG TTT AGA ATG TCA TAC GAGCAC CGC A를 사용하여 JAL 벡터에 서브클로닝하였다. 먼저, ATG의 상류에 짧은 뉴클레오타이드 서열 GCAATC(서열 199)을 삽입하여 코작계 서열을 만든 뒤, 당해 기술 분야에 공지된 조건하에서의 유전자의 PCR 증폭과 JAL 벡터의 5'ASCI/3'MluI 부위로의 연결을 수행하였다. 그 결과 얻어지는 발현 벡터에는 187kD 단백질(서열 179)을 암호화하는 추정 시그널 서열을 포함하는 5325 뉴클레오타이드를 함유한 전장 pmpC 유전자가 포함되었다. 이 pmpD 유전자는 다음과 같은 올리고: 5' 올리고-TGC AAT CAT GAG TTC GCA GAA AGA TAT AAA AAG C(서열 200)과 3' 올리고-CAG AGC TAG CTT AAA AGA TCA ATC GCA ATC CAG TAT TC(서열 201)를 사용하여 유전자를 PCR 증폭한 후 JA4304 백신 벡터에 서브클로닝하였다. 이 유전자를 당해 기술 분야에 공지된 표준 기법을 사용하여 JA4304 백신 벡터의 5' 평활말단화된 HIII/3' MluI 부위에 연결시켰다. ATG의 상류에 CAATC(서열 202)를 삽입하여 코작계 서열을 만들었다. 이 클론은 코작계 서열의 마지막 글리신과 마찬가지로 HindIII 부위의 마지막 트레오닌이 평활말단화 절차로 인해 결실되어 있다는 점이 독특하다. 이 삽입체, 4593 뉴클레오타이드 단편(서열 172)은 161kD 단백질(서열 178)을 암호화하는 추정 시그널 서열을 함유한 pmpD의 전장 유전자이다. PmpE는 5' 올리고-TGC AAT CAT GAA AAA AGC GTT TTT CTT TTT C(서열 203) 및 3' 올리고-CAG AAC GCG TCT AGA ATC GCA GAG CAA TTT C(서열 204)를 사용하여 JA4304 벡터에 서브클로닝하였다. PCR 증폭 후, 이 유전자는 JA4304의 5' 평활말단화된 HIII/3'MluI 부위에 연결시켰다. 이 절차의 용이성을 위해, 개시 코돈의 상류에 짧은 뉴클레오타이드 서열 TGCAATC(서열 293)을 첨가하여 코작계 서열을 만들고 HindIII 부위를 재구성하였다. 삽입체는 추정 시그널 서열을 함유하는 전장 pmpE 유전자(서열 171)이다. pmpE 유전자는 105kD 단백질(서열 177)을 암호화한다. pmpG 유전자는 5' 올리고-GTG CAA TCA TGA TTC CTC AAG GAA TTT ACG(서열 205) 및 3' 올리고-CAG AAC GCG TTT AGA ACC GGA CTT TAC TTC C(서열 206)를 사용하여 PCR 증폭시키고 JA4304 벡터에 서브클로닝하였다. pmpI 및 pmpK 유전자에 대해서도 유사한 클로닝 전략을 실시하였다. 또한, pmp 유전자들의 전장 서열이나 중복 단편을 PCR 증폭시키기 위하여 프라이머 쌍을 디자인한 후, 단백질 발현을 위해 pET17b 벡터(Novagen, Madison, WI)에 서브클로닝한 뒤 발현을 위해 이. 콜라이 BL21 pLysS를 형질감염시키고 이어서 노바겐에서 제공하는 히스티딘-니켈 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제하였다. 하기 제시된 바와 같이 재조합 단백질을 암호화하는 여러 유전자에는 단백질의 발현을 용이하게 하기 위하여 천연의 시그널 서열이 결실되어 있다. pmpC의 전장 단백질 발현은 아미노 말단과 카르복시 말단을 나타내는 2개의 중복 단편을 발현시켜 완성하였다. 시그널 서열이 결실된 pmpC-아미노 말단부(서열 187, 상응하는 아미노산 서열이 서열 195에 제시됨)의 서브클로닝은 5' 올리고-CAG ACA TAT GCA TCA CCA TCA CCA TCA CGA GGC GAG CTC GAT CCA AGA TC(서열 207) 및 3' 올리고-CAG AGG TAC CTC AGA TAG CAC TCT CTC CTA TTA AAG TAG G(서열 208)를 사용하여 벡턱의 5'NdeI/3'KPN 클로닝 부위에 실시하였다. 이 유전자의 카르복시 말단 부인 pmpC-카르복시 말단 단편(서열 186, 상응하는 아미노산 서열이 서열 194에 제시됨)은 다음과 같은 프라이머: 5' 올리고-CAG ACG TAG CAT GCA TCA CCA TCA CCA TCACGT TAA GAT TGA GAA CTT CTC TGG C(서열 209) 및 3' 올리고-CAG AGG TAC CTT AGA ATG TCA TAC GAG CAC CGC AG(서열 210)를 사용하여 발현 벡터의 5' NheI/3' KPN 클로닝 부위에 서브클로닝하였다. PmpD 역시 2개의 중복 단백질로서 발현되었다. 시그널 서열이 결실된 pmpD-아미노 말단부(서열 185, 상응하는 아미노산 서열이 서열 193에 제시됨)는 pET17b의 개시 코돈을 포함하고 80kD 단백질로서 발현된다. 단백질 발현과 정제를 위하여, 히스티딘 태그를 개시 코돈 다음에 배치하고 유전자의 28번째 아미노산(뉴클레오타이드 84)에 융합시킨다. 벡터의 5'NdeI/3'KPN 클로닝 부위에 결합시키기 위하여 다음과 같은 프라이머를 사용하였다; 5' 올리고-CAG ACA TAT GCA TCA CCA TCA CCA TCA CGG GTT AGC(서열 211), 3'올리고-CAG AGG TAC CTC AGC TCC TCC AGC ACA CTC TCT TC(서열 212). pmpD-카르복시 말단부(서열 184)는 92kD 단백질(서열 192)로서 발현되었다. 발현과 후속 정제를 위하여 개시 코돈과 pET17b 벡터의 처음 두 아미노산을 나타내는 메티오닌, 알라닌 및 세린을 추가로 포함시켰다. 이 메티오닌, 알라닌 및 세린의 하류에 6개의 히스티딘 태그를 배치하고 유전자의 691번째 아미노산(뉴클레오타이드 2073)에 융합시켰다. 발현 벡터의 5'NheI/3'KPN 클로닝 부위에 삽입체를 서브클로닝하기 위하여 5' 올리고-CAG AGC TAG CCA TCA CCA TCA CCA TCA CGG TGC TAT TTC TTG CTT ACG TGG(서열 213) 및 3' 올리고-CAG AGG TAC TTn AAA AGA TCA ATC GCA ATC CAG TAT TCG(서열 214)를 사용하였다. PmpE는 106kD 단백질(서열 183, 상응하는 아미노산 서열이 서열 191에 제시됨)로서 발현되었다. pmpE 삽입체 역시 천연의 시그널 서열이 결실되어 있다. 이 유전자를 당해 기술 분야에 공지된 조건하에 PCR 증폭시키기 위하여 다음과 같은 올리고 프라이머를 사용하였다: 5' 올리고-CAG AGG ATC CAC ATC ACC ATC ACC ATC ACG GAC TAG CTA GAG AGG TTC(서열 215) 및 3' 올리고-CAG AGA ATT CCT AGA ATC GCA GAG CAA TTT C(서열 216). 증폭된 삽입체는 JA4304의 5'BamHI/3'EcoRI 부위에 연결시켰다. 서열 217에 제시된 바와 같은 짧은 뉴클레오타이드 서열을 개시 코돈의 상류에 삽입하여 코작계 서열을 만들고 HindIII 부위를 재구성하였다. 발현된 단백질은 개시 코돈 및 pET17b 발현 벡터의 하류 21개 아미노산, 즉 MASMTGGQQMGRDSSLVPSSDP(서열 218)을 포함한다. 또한, 상기 서열의 상류에 6개 히스티딘 태그를 첨가하고 유전자의 28번째 아미노산(뉴클레오타이드 84)에 융합시켰으며, 이로써 추정 시그널 펩타이드는 제거된다. 서열 183에 제시된 서열(상응하는 아미노산 서열이 서열 191에 제시됨)은 이러한 추가 서열을 포함하지 않는 것이다. pmpG 유전자(서열 182, 상응하는 아미노산 서열이 서열 190에 제시됨)는 당해 기술 분야에 공지된 조건하에 다음과 같은 올리고 프라이머; 5' 올리고-CAG AGG TAC CGC ATC ACC ATC ACC ATC ACA TGA TTC CTC AAG GAA TTT ACG(서열 219) 및 3' 올리고-CAG AGC GGC CGC TTA GAA CCG GAC TTT ACT TCC(서열 220)를 사용하여 PCR 증폭시키고, 그 다음 발현 벡터의 5'KPN/3'NotI 클로닝 부위에 연결시켰다. 발현된 단백질은 아미노 말단부에 추가 아미노산 서열을 포함하며, 즉 MASMTGGQQNGRDSSLVPHHHHHH(서열 221), 이것은 pET17b 발현 벡터 유래의 개시 코돈과 추가 서열을 포함하는 것이다. pmpI 유전자(서열 181, 상응하는 아미노산 서열이 서열 189에 제시됨)는 다음과 같은 올리고 프라이머: 5' 올리고-CAG AGC TAG CCA TCA CCA TCA CCA TCA CCT CTT TGG CCA GGA TCC C(서열 222) 및 3' 올리고-CAGAAC TAG TCT AGA ACC TGT AAG TGG TCC(서열 223)를 사용하여 당해 기술 분야에 공지된 조건하에 PCR 증폭시키고, 발현 벡터의 5' NheI/3'SpeI 클로닝 부위에 연결시켰다. 95kD의 발현 단백질은 이 단백질의 아미노 말단부에 pET17b 벡터 유래의 추가 알라닌 및 세린과 개시 코돈을 포함한다. 또한, 유전자의 21번째 아미노산에 6개 히스티딘 태그를 융합시켜 추정 시그널 펩타이드를 제거하였다.
TCT-3 세포주를 사용하여 확인되는 클론 14H1-4(서열 56)는 티올 특이적 항산화제-CT603인 TSA 유전자의 완전한 ORF를 포함한다(이 CT603 ORF는 씨.뉴모니아 유래의 CPn0778의 동족체이다). 클론 14-H1-4 내의 TSA 오픈 리딩 프레임은 발현된 단백질이 추가 메티오닌과 6개 히스티딘 태그(아미노 말단부)를 함유하도록 증폭시켰다. 이와 같이 증폭된 삽입체를 pET17b 벡터의 Nde/EcoRI 부위에 서브클로닝하였다. 이 클론을 IPTG로 유도시 Ni-NTA 아가로스 친화성 크로마토그래피로부터 22.6kDa의 단백질이 정제되었다. TSA 유전자를 암호화하는 클론 14-H1-4의 195개 아미노산 ORF의 결정된 아미노산 서열은 서열 65에 제시하였다. 추가 분석하여 TSA 유전자에 대한 전장 클론을 수득하여 CTL2-TSA-FL이라 명명하고 전장의 아미노산 서열은 서열 92에 제시하였다.
추가 연구를 통해 전술한 바와 같이 TCT-1 T 세포주와 TCT-3 T 세포주에 의해 확인되는 10개의 추가 클론을 수득하였다. TCT-1 세포주에 의해 확인되는 클론은 16-D4-22, 17-C5-19, 18-C5-2, 20-G3-45 및 21-C7-66이고; TCT-3 세포주에 의해 확인되는 클론은 17-C10-31, 17-E2-9, 22-A1-49 및 22-B3-53이었다. 클론 21-G12-60은 TCT-1 및 TCT-3 T 세포주 모두에 의해 인식되었다. 클론 16-D4-22(서열 119)는 2개의 유전자, 즉 포유동물 세포에서의 증식을 위한 씨.트라코마티스 플라스미드의 오픈 리딩 프레임 3(ORF3)의 일부분과 ORF4를 포함하는 953bp 삽입체를 함유한다. 클론 17-C5-19(서열 118)는 clpP_1 프로테아제를 암호화하는 DT431 ORF의 일부분과 CT430(디아미노피멜레이트 에피머라제) ORF의 일부분을 함유하는 951bp 삽입체를 포함한다. 클론 18-C5-2(서열 117)는 TCT-1 세포주에 의해 확인되는 446bp 삽입체를 가진 S1 리보솜 단백질의 ORF 일부분이다. TCT-1 세포주에 의해 확인되는 클론 20-G3-45(서열 116)는 pmpB 유전자(CT413)의 일부분인 437bp 삽입체를 포함한다. TCT-1 세포주에 의해 확인되는 클론 21-C7-66(서열 115)은 dnaK 유사 단백질의 일부분을 암호화하는 995bp 삽입체를 포함한다. 이 클론의 삽입체는 dnaK 유전자 CT396의 일부분인 것으로 확인된 TCT-3 클론 11-H4-28(서열 59)의 삽입체와 중복되지 않는다. TCT-3 세포주에 의해 확인되는 클론 17-C10-31(서열 114)은 976bp 삽입체를 포함한다. 이 클론은 IRBP와 DHR 도메인을 포함하는 프로테아제인 CT858 ORF의 일부분을 함유한다. 클론 17-E2-9(서열 113)는 1142bp 삽입체에 걸쳐서 두 유전자 CT611과 CT610의 ORF 일부분을 포함한다. TCT-3 세포주에 의해 확인되는 클론 22-A1-49(서열 112) 역시 698bp 삽입체 중에 2개의 유전자를 포함한다. CT660(DNA 자이라제{gyrA_2}) ORF의 일부분은 추정상의 단백질 CT659의 완전한 ORF가 상보성 쇄에 존재할 때 상부 쇄에 제공된다. TCT-1 세포주에 의해 확인되는 클론 22-B3-53(서열 111)은 GroEL(CT110) ORF의 일부분을 암호화하는 267bp 삽입체를 갖고 있다. TCT-1 및 TCT-3 세포주 모두에 의해 확인되는 클론 21-G12-60(서열 110)은 추정상의 단백질 CT875, CT229 및 CT228의 부분 ORF들을 포함하는 1461 bp 삽입체를 함유한다.
또 다른 클라미디아 항원은 람다 스크린(Lambda Screen)-1 벡터(Novagen, Madison, WI) 중의 클라미디아 트라코마티스(LGV II 혈청형) 게놈 발현 라이브러리를 여러 클라미디아 감염 개체로부터 수집한 혈청으로 당해 기술 분야에 공지된 기법에 따라 스크리닝하여 수득하였다. 다음과 같은 면역반응성 클론을 확인하고 클라미디아 유전자를 함유하는 삽입체를 서열분석하였다: CTL2#1(서열 71); CTL2#2(서열 70); CTL2#3-5'(서열 72, 5' 말단부를 나타내는 2차 결정된 게놈 서열); CTL2#3-3'(서열 73, 3' 말단부를 나타내는 2차 결정된 게놈 서열); CTL2#4(서열 53); CTL2#5(서열 69); CTL2#6(서열 68); CTL2#7(서열 67); CTL2#8b(서열 54); CTL2#9(서열 66); CTL2#10-5'(서열 74, 5' 말단부를 나타내는 1차 결정된 게놈 서열); CTL2#10-3'(서열 75, 3' 말단부를 나타내는 1차 결정된 게놈 서열); CTL2#11-5'(서열 45, 5' 말단부를 나타내는 1차 결정된 게놈 서열); CTL2#11-3'(서열 44, 3' 말단부를 나타내는 2차 결정된 게놈 서열); CTL2#12(서열 46); CTL2#16-5'(서열 47); CTL2#18-5'(서열 49, 5' 말단부를 나타내는 1차 결정된 게놈 서열); CTL2#18-3'(서열 48, 3' 말단부를 나타내는 2차 결정된 게놈 서열); CTL2#19-5'(서열 76, 5' 말단부를 나타내는 결정된 게놈 서열); CTL2#21(서열 50); CTL2#23(서열 51); 및 CTL2#24(서열 52).
또 다른 클라미디아 트라코마티스 항원은 혈청학적 발현 클로닝을 통해 확인하였다. 이 연구에는 전술한 바와 같이 클라미디아 감염된 여러 개체에서 수집한 혈청을 사용하였으나, 제2 항체로서 IgG 외에도 IgA 및 IgM 항체를 사용하였다.이 방법으로 스크리닝한 클론은 클라미디아 감염에 대한 조기 면역 반응에 의해 인식되는 항원 검출 반응, 즉 점막 체액성 면역 반응을 향상시킨다. 다음과 같은 면역반응성 클론을 특성규명하고 클라미디아 유전자를 함유하는 삽입체를 서열분석하였다: CTL2gam-1(서열 290), CTL2gam-2(서열 289), CTL2gam-5(서열 288), CTL2gam-6-3'(서열 287, 3' 단부를 나타내는 2차 결정된 게놈 서열), CTL2gam-6-5'(서열 286, 5' 단부를 나타내는 1차 결정된 게놈 서열), CTL2gam-8(서열 285), CTL2gam-10(서열 284), CTL2gam-13(서열 283), CTL2gam-15-3'(서열 282, 3' 말단부를 나타내는 2차 결정된 게놈 서열), CTL2gam-15-5'(서열 281, 5' 말단부를 나타내는 1차 결정된 게놈 서열), CTL2gam 17(서열 280), CTL2gam-18(서열 279), CTL2gam-21(서열 278), CTL2gam-23(서열 277), CTL2gam-24(서열 276), CTL2gam-26(서열 275), CTL2gam-27(서열 274), CTL2gam-28(서열 273), CTL2gam-30-3'(서열 272, 3' 말단부를 나타내는 2차 결정된 게놈 서열) 및 CTL2gam-30-5'(서열 271, 5' 말단부를 나타내는 1차 결정된 게놈 서열).
실시예 2
클라미디아 트라코마티스 항원에 의한 T 세포 증식 및 인터페론-γ 생성의 유도
T 세포 증식 및 인터페론-γ 생성을 유도하는 재조합 클라미디아 트라코마티스 항원의 특성은 다음과 같이 측정하였다.
단백질은 IPTG로 유도하고 Ni-NTA 아가로스 친화성 크로마토그래피로 정제하였다(Webb et al., J.Immunology 157:5034-5041, 1996). 그 다음, 정제된 폴리펩타이드를 가지고 PBMC 제조물에서 T 세포 증식을 유도하는 활성을 스크리닝하였다. 씨.트라코마티스 환자 유래의 PBMC와 클라미디아 항원에 대한 반응으로 증식하는 것으로 알려진 T 세포를 가진 정상 공여체 유래의 PBMC를, 10% 수집된 사람 혈청과 젠타마이신 50㎍/㎖이 보충된 RPMI 1640을 함유하는 배지에서 배양하였다. 정제된 폴리펩타이드는 0.5 내지 10㎍/㎖의 농도로 이중으로 첨가하였다. 96웰 둥근바닥 평판에서 200㎕의 부피로 6일 동안 배양한 후, 각 웰로부터 배지 50㎕를 채취하여 하기 기술되는 바와 같이 IFN-γ 농도를 측정하였다. 그 다음, 평판은 3중수소화된 티미딘 1μCi/웰로 18시간 동안 더 표지하고 수거한 뒤, 기체 신틸레이션 계수기로 3중 수소 흡수율을 측정하였다. 양 복제물에서, 배지에서만 배양시킨 세포에서 관찰되는 증식율의 3배 이상의 증식율이 나타나는 분획은 양성으로 간주한다.
IFN-γ는 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA)로 측정하였다. ELISA 평판은 사람 IFN-γ에 대해 유도된 마우스 모노클로날 항체(PharMingen, San Diego, CA)의 PBS 용액으로 실온에서 4시간 동안 코팅하였다. 그 다음, 웰을 5%(W/V) 탈지분유를 함유하는 PBS로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 이 평판을 PBS/0.2% TWEEN-20으로 6회 세척하고 ELISA 평판에서 배양 배지로 1:2 희석한 시료를 실온에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 이 평판을 다시 세척하고 폴리클로날 토끼 항-사람 IFN-γ 혈청을 PBS/10% 정상 염소 혈청으로 1:3000배로 희석하여 각 웰에 첨가하였다. 그 다음 평판을 실온에서 2시간 동안 항온처리하고 세척한 뒤 양고추냉이 퍼옥시다제가 결합된 항-토끼 IgG(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)을 PBS/5% 탈지분유에 1:2000으로 희석하여 첨가하였다. 실온에서 2시간 더 항온처리한 후, 평판을 세척하고 TMB 기질을 첨가하였다. 20분 후 1N 황산으로 반응을 정지시켰다. 광학밀도는 대조 파장으로서 570nm를 사용하여 450nm에서 측정하였다. 양 복제물에서, 배지에서만 배양시킨 세포의 평균 OD값보다 2배 이상의 OD값과 3의 표준 편차를 나타내는 분획은 양성으로 간주한다.
이와 같은 방법을 사용하여 서열 5의 아미노산 잔기 48 내지 67(서열 13; 1-B1-66/48-67) 및 58-77(서열 14; 1B1-66/58-77)에 각각 상응하는 2개의 합성 펩타이드들 뿐만 아니라 재조합 1B1-66 단백질(서열 5)이 씨.트라코마티스 LGVII의 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 클라미디아 특이적인 T 세포주에서 증식 반응과 IFN-γ 생성 반응을 유도한다는 것을 확인하였다.
또 다른 연구에서는 리보솜 S13 단백질 중의 씨.트라코마티스 특이적인 T 세포 에피토프를 동정하였다. 당해 기술 분야에 잘 알려진 표준 에피토프 지도작성 기법을 이용하여 리보솜 S13 단백질(rS13) 중의 2개의 T 세포 에피토프를 공여체 CL-8 유래의 클라미디아 특이적인 T 세포주(TCL-8 EB/DC)로 확인하였다. 도 8은 제1 펩타이드 rS13 1-20(서열 106)이 상응하는 씨.뉴모니아 서열과 100% 동일하다는 것을 예시하며, 이로써 재조합 씨.트라코마티스-rS13과 씨.뉴모니아-rS13에 대한 T 세포주의 교차 반응성이 설명될 수 있다. 제2 펩타이드 rS13 56-75(서열 108)에 대한 반응은 씨.트라코마티스 특이적인 것으로서, 건강한 무증후성 공여체에서 나타나는 rS13 반응은 씨.뉴모니아 또는 다른 임의의 미생물 감염이 아닌 씨.트라코마티스에 대한 노출로 유도된다는 것을 나타낸다.
실시예 1에 예시한 바와 같이, TCP-21 세포주에 의해 확인되는 클론 11-C12-91(서열 63)은 OMP2 유전자(CT443)의 일부분인 269bp 삽입체를 갖고 있고, OMCB라고 불리는 씨.뉴모니아의 60kDa 시스테인 풍부한 외막 단백질과 상동성을 공유한다. 반응성 에피토프(들)에 대하여 보다 상세히 연구하기 위하여 일련의 중복 펩타이드와 전술된 면역분석법을 통해 에피토프 지도작성을 실시하였다. 간략히 설명하면, 증식 반응은 2.5x104TCP-21 T 세포를 1x104단핵구 유래의 수지상 세포의 존재하에 씨.트라코마티스 및 씨.뉴모니아 유래의 비감염성 기본소체 또는 씨.트라코마티스 또는 씨.뉴모니아 OMCB 단백질의 단백질 서열 유래의 펩타이드(0.1㎍/㎖)로 자극하여 측정하였다. TCP-21 T 세포는 에피토프 CT-OMCB #167-186, CT-OMCB #171-190, CT-OMCB #171-186, 및 보다 낮은 정도로 CT-OMCB #175-186(각각 서열 249 내지 252)에 반응하였다. 특히, TCP-21 T 세포주는 상동성인 씨.뉴모니아 펩타이드 CP-OMCB#171-186(서열 253)에 대하여 씨.트라코마티스 펩타이드에 대한 반응과 동일하거나 그 이상으로 증식 반응을 나타내었다. 또한, 2번 위치(즉, Glu 대신 Asp) 및 4번 위치(즉, Ser 대신 Cys)의 아미노산 치환은 T 세포의 증식 반응을 변화시키지 않았고, 따라서 이 에피토프가 씨.트라코마티스와 씨.뉴모니아 사이에 교차반응성인 에피토프라는 것을 알 수 있었다.
전술한 에피토프를 더욱 연구하기 위하여 또 다른 T 세포주인 TCT-3을 에피토프 지도작성 실험에 사용하였다. 면역분석은 전술한 바와 같이 실시하였으나, 단 씨.트라코마티스 유래의 펩타이드들만 시험하였다. T 세포는 두 펩타이드, CT-OMCB #152-171 및 CT-OMCB #157-176(각각 서열 246 및 247)에 대하여 증식 반응을나타내어, 씨.트라코마티스의 시스테인 풍부한 외막 단백질에 추가 면역원성 에피토프가 있음을 확인하였다.
클론 14H1-4(서열 56, 상응하는 전장 아미노산 서열은 서열 92에 제시됨)는 전술한 CD4 T 세포 발현 클로닝 시스템에서 TCT-3 세포주를 사용하여 확인하였고, TSA라고 불리는 티올 특이적 항산화제 유전자(CT603)의 완전한 ORF를 포함하는 것으로 나타났다. 에피토프 지도작성 면역분석을 전술한 바와 같이 실시하여 에피토프를 보다 상세히 연구하였다. TCT-3 T 세포주는 중복 펩타이드 CT-TSA #96-115, CT-OSA #101-120 및 CT-TSA #106-125(각각 서열 254 내지 256)에 대하여 강한 증식 반응을 나타내어, 씨.트라코마티스 혈청형 LGVII의 티올 특이적 항산화제 유전자 중에 면역반응성 에피토프가 존재함을 입증하였다.
실시예 3
합성 폴리펩타이드의 제조
폴리펩타이드는 HPTU(O-벤조트리아졸-N,N,N'N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 활성화를 이용한 FMOC 화학을 통해 밀리포어(Millipore) 9050 펩타이드 합성기로 합성할 수 있다. 펩타이드의 아미노 말단에 Gly-Cys-Gly 서열을 부착시켜 펩타이드를 접합하거나 표지화하는 방법을 제공한다. 고체 지지체로부터 펩타이드의 절단은 다음과 같은 절단 혼합물, 트리플루오로아세트산:에탄디티올:티오아니솔:물:페놀(40:1:2:2:3)을 사용하여 실시할 수 있다. 2시간 동안 절단한 후, 펩타이드는 저온 메틸-t-부틸-에테르로 침전시킬 수 있다. 펩타이드 펠릿을그 다음 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 함유하는 물에 용해시키고 C18 역상 HPLC로 정제하기 전에 동결건조시켰다. 0 내지 60% 아세토니트릴(0.1% TFA 함유)과 물(0.1% TFA)의 구배를 사용하여 펩타이드를 용출시켰다. 순수한 분획을 동결건조한 후, 펩타이드는 전자분무 질량 분광분석법 및 아미노산 분석법으로 분석할 수 있다.
실시예 4
레트로바이러스 발현 벡터 시스템을 이용한 클라미디아 항원을 암호화하는 DNA 서열의 분리 및 특성규명과 후속적인 면역학적 분석
클라미디아 트라코마티스 LGVII의 게놈 라이브러리는 BamHI, BglII, BstYi 및 MboI 제한 효소를 사용하여 분해한 분해물로 작제하였다. 제한 분해 단편을 그 다음 레트로바이러스 벡터 pBIB-KS1,2,3의 BamHI 부위에 연결시켰다. 이 벡터 세트에 코작 해독 개시 부위와 종결 코돈을 삽입하여 변형시키므로써 도 2에 제시된 바와 같이 짧은 DNA 게놈 단편으로부터 단백질이 발현될 수 있도록 하였다. 80 클론의 DNA 수집물(pool)을 제조하고 레트로바이러스 패키징주 Phoenix-Ampho를 문헌[Pear, W.S., Scott, M.L. and Nolan, G.P., Generation of High Titre, Helper-free Retroviruses by Transient Transfection. Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, pp41-57]에 기재된 바와 같이 형질감염시켰다. 레트로바이러스 형태의 클라미디아 라이브러리를 그 다음 H2-Ld를 발현하는 P815세포로 형질도입시키고, 그 후 표적 세포로서 사용하여항원 특이적 T 세포주를 자극하였다.
클라미디아 특이적인 쥐 H2d제한된 CD8+ T 세포주는 문헌[Starnbach, M., J.Immunol., 153:5183, 1994]에 기재된 바와 같이 광조사된 씨.트라코마티스 감염된 J774 세포 및 광조사된 동계의 비장 세포로 반복 자극하여 배양 증식시켰다. 이 클라미디아 특이적인 T 세포주를 사용하여 상기 레트로바이러스에 의해 형질도입된 P815 세포에 의해 발현되는 상기 클라미디아 게놈 라이브러리를 스크리닝하였다. 엘리스팟(Elispot) 분석(Lalvani et al., J.Experimental Medicine 186:859-865, 1997)을 사용하여 IFN-γ 생성을 측정하여 양성 DNA 수집물을 확인하였다.
2개의 양성 수집물, 2C7 및 2E10을 IFN-γ 엘리스팟 분석으로 확인하였다. 수집물 2C7에서 얻은 P815 세포의 안정한 형질도입체는 한계 희석법으로 클로닝하고 각 클론을 클라미디아 특이적인 CTL 주로부터 IFN-γ 생성을 유도하는 활성에 기초하여 선발하였다. 이 스크리닝으로 4개의 양성 클론을 선발하여 2C7-8, 2C7-9, 2C7-19 및 2C7-21이라 지칭하였다. 이와 유사하게, 양성 수집물 2E10도 스크리닝하여 3개의 삽입체를 함유하는 또 다른 양성 클론을 수득하였다. 3개의 삽입체는 CT016, tRNA 합성효소 및 clpX 유전자의 단편이다(각각 서열 268 내지 270).
이와 같은 4개의 양성 2C7 클론으로부터 얻은 유전자전이된(transgenic) DNA는 클라미디아 DNA 삽입체를 선택적으로 증폭시키기 위하여 pBIB-KS 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 증폭된 삽입체는 겔 정제하고 서열분석하였다. 면역반응성 클론 2C7-8(서열 15, 추정되는 아미노산 서열이 서열 32에 제시됨)은클라미디아 트라코마티스 혈청형 D(NCBI, BLASTN 조사; 서열 33, 추정되는 아미노산 서열은 서열 34에 제시됨)의 뉴클레오타이드 597304 내지 597145와 상동성이 있는 160bp의 단편이다. 클론 2C7-8 지도의 서열은 전술한 상동성이 높은 영역에서의 2개의 추정상의 오픈 리딩 프레임에서 나타나는 것으로서, 특히 298 아미노산 단편(서열 16, 추정되는 아미노산 서열이 서열 17에 제시됨)으로 이루어진 하나의 오픈 리딩 프레임은 면역학적 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
혈청형 L2 유래의 298개 아미노산의 단편(CT529 및/또는 Cap1 유전자라 지칭함)의 전장 클로닝은 프라이머로서 5'-tttgaagcaggtaggtgaatatg(정방향)(서열 159) 및 5'-ttaagaaatttaaaaaatccctta(역방향)(서열 160)를 사용하고 주형으로서 정제된 씨.트라코마티스 L2 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭시켜 수득하였다. 이 PCR 생성물을 겔 정제하고, 서열분석을 위해 pCRBlunt(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝한 후 발현을 위해 pBIB-KS의 유도체인 pBIB-KMS의 EcoRI 부위에 서브클로닝하였다. CT529의 클라미디아 뉴모니아 동족체는 서열 291에 제시하고 상응하는 아미노산 서열은 서열 292에 제시하였다.
다양한 CT529 혈청형을 암호화하는 전장 DNA는 거의 문헌[Denamur,E., C.Sayada, A.Souriau, J.Orfila, A Rodolakis and J.Elion.1991, J.Gen.Microbiol. 137:2525]에 기재된 바와 같이 105IFU를 함유하는 박테리아 용균물로부터 PCR 증폭시켰다. 다음과 같은 혈청형을 기재된 바대로 증폭시켰다: Ba(서열 134, 상응하는 추정 아미노산 서열이 서열 135에 제시됨); E(BOUR) 및 E(MTW447)(서열 122, 상응하는 추정 아미노산 서열이 서열 123에 제시됨); F(NI1)(서열 128, 상응하는 추정 아미노산 서열이 서열 129에 제시됨); G(서열 126, 상응하는 추정 아미노산 서열이 서열 127에 제시됨); Ia(서열 124, 상응하는 추정 아미노산 서열이 서열 125에 제시됨); L1(서열 130, 상응하는 추정 아미노산 서열이 서열 131에 제시됨); L3(서열 132, 상응하는 추정 아미노산 서열이 서열 133에 제시됨); I(서열 263, 상응하는 추정 아미노산 서열이 서열 264에 제시됨); K(서열 265, 상응하는 추정 아미노산 서열이 서열 266에 제시됨); 및 MoPn(서열 136, 상응하는 추정 아미노산 서열이 서열 137에 제시됨). PCR 반응은 혈청형 L2 DNA에 특이적인 프라이머(ORF 외부서열)를 사용하여 어드밴티지 게노믹 PCR 키트(Advantage Genomic PCR Kit, Clontech, Palo Alto, CA)로 실시하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다: 5'-ggtataatatctctctaaattttg(정방향-서열 161) 및 5'-agataaaaaaggctgtttc(역방향-서열 162). 단, MoPn의 경우에는 5'-ttttgaagcaggtaggtgaatatg(정방향-서열 163)과 5'-tttacaataagaaaagctaagcactttgt(역방향-서열 164)를 필요로 하였다. PCR 증폭된 DNA는 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 정제하고 pCR2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝하여 서열분석하였다.
면역반응성 클론의 PCR 증폭된 삽입체에서 얻어지는 DNA의 서열분석은 pBIB-KS 특이적인 정방향 프라이머 5'-ccttacacagtcctgctgac(서열 165)와 역방향 프라이머 3'-gtttccgggccctcacattg(서열 166)를 사용하여 자동 서열분석기(ABI 377)로 실시하였다. CT529 혈청형 L2를 암호하는 DNA를 클로닝한 PCRBlunt 및 CT529 혈청형 Ba, E(BOUR), E(MTW447), F(NI1), G, Ia, K, L1, L3 및 MoPn을 암호하는 DNA를 클로닝한 pCR2.1은 T7 프로모터 프라이머와 유니버설 M13 정방향 및 M13 역방향 프라이머를 사용하여 서열분석하였다.
이러한 두가지 추정상의 오픈 리딩 프레임(서열 16 및 20)이 관련된 면역학적 기능이 있는 단백질을 암호화하는지를 측정하기 위하여, 두 오픈 리딩 프레임의 길이를 따라 존재하는 중복 펩타이드(17 내지 20개의 아미노산 길이)를 실시예 3에서와 같이 합성하였다. 펩타이드에 의해 추적되고 H2d로 제한분해된 표적 세포의 비용균률을 측정하기 위하여 표준 크롬 방출 분석법을 사용하였다. 이 분석에서, P815 세포(H2d)의 일정량을 37℃에서 제시된 펩타이드 1㎍/㎖의 존재 또는 부재하에51Cr 100μCi로 1시간 동안 표지하였다. 이와 같이 항온처리한 후, 표지된 P815 세포를 세척하여 과량의51Cr과 펩타이드를 제거하고, 그 다음 미량배양 평판에 1000 세포/웰의 농도로 2반복으로 평판배양하였다. 작동인자 CTL(클라미디아 특이적인 CD8 T 세포)은 소정의 작동인자:표적의 비로 첨가하였다. 4시간 항온처리한 후, 상청액을 수확하고 감마 계수기를 사용하여 상청액내로 방출된51Cr의 양을 측정하였다. 298개 아미노산의 오픈 리딩 프레임 유래의 2개의 중복 펩타이드가 CTL 세포주를 특이적으로 자극하였다. 서열 138 내지 156에 제시된 펩타이드들이 합성되었고, CT529(Cap1 유전자)의 혈청형 D 오픈리딩 프레임의 L2 동족체 및 216 아미노산 오픈 리딩 프레임이 해독된 것으로 나타난다. 도 3에 도시된 바와 같이, 펩타이드 CtC7.8-12(서열 18, 또한 Cap1#132-147이라 지칭, 서열 139) 및 CtC7.8-13(서열 19, 또한 Cap1#138-155라 지칭, 서열 140)는 작동인자 대 표적인자 비 10:1에서 각각 38 내지 52%의 특이적용균율을 유도할 수 있었다. 특히, 이 두 펩타이드간의 중복 영역에는 추정상의 H2d(Kd및 Ld) 결합 펩타이드가 포함되어 있다. 이 중복 서열에 상응하도록 10개의 아미노산 펩타이드를 합성하였고(서열 31), 엘리스팟 분석을 통해 항클라미디아 CTL 세포주로부터 강한 면역 반응을 유도하는 것으로 관찰되었다. 특히, 가장 최근의 Genbank 데이터베이스를 조사한 결과 종래에 이 유전자에 대해서 설명된 단백질이 전혀 없다는 것을 확인하였다. 따라서, 클론 2C7-8(서열 15)을 암호화하는 추정상의 오픈 리딩 프레임은 MHC-1 제한 방식으로 항원 특이적인 CD8+ T 세포를 자극할 수 있는 클라미디아 유래의 항원을 포함하는 유전자를 한정하는 바, 이 항원을 클라미디아 백신 개발에 사용할 수 있음을 입증하였다.
이와 같은 결과를 확인하고 추가로 에피토프를 지도작성하기 위하여 절두형 펩타이드(서열 138 내지 156)를 만들고 IFN-g ELISPOT 분석으로 T 세포가 인식하는지 시험하였다. Ser139(Cap1#140-147, 서열 146) 또는 Leu147(Cap1#138-146, 서열 147)의 절두는 T 세포 인식을 제거하였다. 이러한 결과는 9량체 펩타이드 Cap1#139-147(SFIGGITYL, 서열 145)이 클라미디아 특이적인 T 세포에 의해 인식되는 최소 에피토프라는 것을 나타낸다.
씨.트라코마티스의 선발된 혈청형에서 얻어진 Cap1(CT529)의 서열(서열 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137 및 139)을 정렬한 결과 하나의 아미노산차이가 제안된 에피토프의 2번 위치에서 관찰되는 것으로 나타난다. 상동성 혈청형 D 펩타이드는 SIIGGITYL(서열 168)이다. 클라미디아 특이적인 T 세포에 의한 인식과 관련하여 표적 세포에 대한 SFIGGITYL 및 SIIGGITYL의 활성을 비교하였다. 각 펩타이드의 일련의 희석물을 P815 세포와 항온처리하고 전술한 바와 같인51Cr 방출 분석법으로 T 세포에 의한 인식성을 시험하였다. 클라미디아 특이적인 T 세포는 최소 농도 1nM에서 혈청형 L2 펩타이드를 인식하고 최소 농도 10nM에서 혈청형 D 펩타이드를 인식하였다.
보다 상세한 연구 결과, Cap1#139-147 특이적인 T 세포 클론이 씨.트라코마티스 감염 세포를 인식한다는 것을 확인하였다. 클라미디아 감염 세포의 표면 상에 Cap1139-147이 존재하는지를 확인하기 위하여 Balb-3T3(H-2d) 세포를 씨.트라코마티스 혈청형 L2로 감염시키고 이 세포가 Cap1#139-147 에피토프(서열 145)에 특이적인CD8+ T 세포 클론에 의해 인식되는지를 시험 측정하였다. Cap1#139-147 에피토프에 특이적인 T 세포 클론은 69 T 세포주를 한계 희석하여 수득하였다. T 세포 클론은 특이적으로 클라미디아 감염 세포를 인식하였다. 이 실험에서 표적 세포는 작동인자 대 표적인자 비 30:1, 10:1 및 3:1에서 각각 45%, 36% 및 30%의 비용균율을 나타내는 씨.트라코마티스 감염(양성 대조군) 또는 비감염된 Balb/3T3 세포; 또는 작동인자 대 표적인자 비 30:1, 10:1 및 3:1에서 각각 83%, 75% 및 58%의 비용균율을 나타내는 Cap1#139-147 에피토프(서열 145) 코팅되거나 미처리된 P815 세포(각 경우마다 음성 대조군은 용균율이 5% 미만인 것임)이다. 이 데이터는 에피토프가 감염동안 발현된다는 것을 암시한다.
생체내 연구를 통해 쥐의 씨.트라코마티스 감염 동안 Cap1#139-147 에피토프 특이적인 T 세포가 자극되는 것을 확인하였다. 씨.트라코마티스에 의한 감염이 Cap1#139-147 에피토프 특이적인 T 세포 반응을 자극하는지를 측정하기 위하여 마우스를 씨.트라코마티스 혈청형 L2 108IFU로 복강내 감염시켰다. 감염 2주후, 마우스를 죽이고 비장 세포를, Cap1#139-147 에피토프 펩타이드로 충격을 준 광조사된 동계 비장 세포상에서 자극하였다. 자극 5일 후, 배양물 중에 Cap1#139-147 에피토프 특이적인 T 세포가 존재하는지를 측정하기 위하여 배양물을 사용하여 표준51Cr 방출 분석법을 실시하였다. 구체적으로, 씨.트라코마티스 혈청형 L2 면역화된 마우스 또는 PBS 주사된 대조용 마우스 유래의 비장 세포는 Cap1#139-147 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있는 CD8+ T 세포 및 Cap1#139-147 펩타이드 코팅된 동계 비장 세포와 5일간 배양한 후 작동인자 대 표적인자 비 30:1, 10:1 및 3:1에서 각각 73%, 60% 및 32%의 비용균율을 나타내었다. 대조용 마우스는 작동인자 대 표적인자 비 30:1에서 약 10%의 용균율을 나타냈으며, E:T 비가 낮아질수록 일정하게 감소하였다. 표적 세포는 Cap1#139-147 펩타이드 코팅되거나 미처리된 P815 세포였다. 이 데이터는 Cap1#139-147 펩타이드 특이적인 T 세포가 쥐의 씨.트라코마티스 감염동안 자극된다는 것을 암시한다.
Ct529(본 명세서에서는 Cap-1이라 지칭함)가 씨.트라코마티스 감염 세포의 봉입체 막에 위치하고 기본소체 또는 망상체와는 관련이 없는지를 입증하기 위하여연구를 실시하였다. 전술한 바와 같이, Cap-1은 CD8+ CTL을 자극하는 클라미디아의 생성물로서 확인되었다. 이 CTL은 쥐의 감염 모델에서 예방적이어서 Cap-1은 우수한 백신 물질로서 사용될 수 있을 것이다. 또한, 이 CTL은 MHC-I 제한성이므로, Cap-1 유전자는 감염된 세포의 세포질에 접근할 수 있어야 하는데, 이는 특정 클라미디아 유전자 생성물의 고유 특징일 수 있다. 따라서, 유전자 생성물의 세포내 국재화의 측정은 백신 물질로서 Cap-1의 특성을 나타내는데 유용할 것이다. Cap-1의 세포내 국재화를 측정하기 위하여 Cap-1의 N 말단 125개 아미노산을 포함하는 재조합 폴리펩타이드에 대하여 유도된 토끼의 폴리클로날 항체를 사용하여 클라미디아로 감염된 McCoy 세포를 염색하였다.
Cap-1의 N-말단부를 포함하는 재조합 폴리펩타이드, rCt529c1-125(서열 305)로 토끼를 과면역화하여 토끼-항Cap-1 폴리클로날 항체를 수득하였다. 재조합 rCt529e1-125 단백질은 Cap-1의 N 말단 1-125 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 1-375를 암호하는 pET 발현 플라스미드(전술한 바와 같음)에 의해 형질전환된 이. 콜라이으로부터 수득하였다. 재조합 단백질은 당해 기술 분야에 공지된 기법을 사용하여 Ni-NTA로 정제하였다. 양성 대조용 항혈청으로서, 정제된 씨.트라코마티스 기본소체로 토끼를 면역화하여 기본소체에 대하여 유도된 폴리클로날 항혈청을 제조하였다(Biodesign, Sacco, Maine). Cap-1 폴리펩타이드로 면역화하기 전에 토끼로부터 얻은 예비면역 혈청은 음성 대조군으로서 사용하였다.
면역조직화학은 씨.트라코마티스 혈청형 L2 또는 씨.프시타시 균주 6BC를106IFU(봉입체 형성 유닛)/㎖의 농도로 접종하여 유리 커버슬립 상에서 증식시킨 McCoy 세포 단층을 가지고 실시하였다. 2시간 후, 배지를 흡입제거하고 사이클로헥스이미드(1.0㎍/㎖)를 보충한 RP-10 새배지로 대체하였다. 감염 세포는 7% CO2에서 24시간 동안 항온처리하고 배지를 흡입제거하고, 세포를 PBS로 1회 세척한 뒤 5분 동안 메탄올 고정시켰다. 항원 염색을 위하여 고정된 세포 단층을 PBS로 세척하고 1:100 희석율의 특이적 또는 대조용 항혈청과 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 세포를 PBS로 세척하고 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 항토끼 IgG(KPL, Gaithersburg)와 1시간 동안 항온처리한 뒤 PBS 중의 에반스 블루(0.05%)로 염색하였다. 형광성은 100X 대물렌즈(Zeiss 형광현미경)으로 관찰하고 사진촬영(Nikon UFX-11A 카메라)하였다.
이 연구 결과는 Cap-1이 씨.트라코마티스 감염된 세포의 봉입체막에 위치한다는 것을 입증하였다. Cap-1 특이적 항체는 씨.트라코마티스 감염된 세포의 봉입체 막을 표지하였고, 이 봉입체에 함유된 클라미디아 기본소체 또는 고정화 과정동안 방출된 봉입체는 표지하지 않았다. 이와 반대로, 항기본소체 항체는 봉입체내에 있는 박테리아 소체 뿐만 아니라 고정화 과정 동안 방출된 소체도 분명하게 표지하였다. 항Cap-1 항체의 특이성은 씨.프시타시 감염된 세포를 염색하지 않는 것으로부터 입증된다. Cap-1 표지화의 특이성은 또한 예비면역 혈청에서 반응성이 나타나지 않는 것으로부터 확인된다. 이와 같은 결과는 Cap-1이 박테리아로부터 방출되어 클라미디아 봉입막에 결합된다는 것을 암시한다. 따라서, Cap-1은 클라미디아에 의해 유발되는 감염에 대한 백신 개발시에 CD8+ T 세포 자극에 유용한 유전자 생성물이다.
클라미디아 감염에 대한 백신에 가능한 CTL 항원으로서 Cap-1 유전자의 관련성은 2가지 추가 연구를 통해 예시한다. 첫째, 씨.트라코마티스의 Cap-1 CT529#138-147 펩타이드(서열 144)의 MHC-I 에피토프에 특이적인 CTL은 자연 감염동안 높은 빈도수로 자극되는 것으로 관찰되었다. 구체적으로, 씨.트라코마티스 혈청형 L2 106IFU를 Balb/C 마우스에게 접종하였다. 2주 후, 비장을 수확하고 엘리스팟 분석으로 Cap-1#138-147 펩타이드 충격을 받은 항원-제시 세포에 대한 반응으로 나타나는 IFN-γ 분비 세포의 수를 정량하였다. 두 실험에서 105비장세포에 존재하는 IFN-γ 분비 세포의 수는 총 CD8+ T 세포의 약 1%였다. 이와 같은 MHC-1 에피토프(Cap-1 CT529#138-147 펩타이드)에 대한 반응성 CD8+ CTL의 높은 빈도수는 Cap-1이 감염시 고효율의 면역원성임을 암시한다.
두 번째 연구 결과는 Cap-1 단백질이 감염시 거의 그 즉시 숙주 세포의 세포질에 접근할 수 있다는 것을 나타내었다. 이것은 Cap-1 CT529#138-147 펩타이드 발현의 시간 경과 시험에서 관찰되었다. 간략히 설명하면, 다양한 시간 동안 3T3 세포를 씨.트라코마티스 혈청형 L2로 감염시킨 후, Cap-1 CT529#138-147 펩타이드 특이적 CTL로 인식되는지를 시험하였다. 그 결과, 감염 2시간만에 항원 특이적인 CTL에 의해 씨.트라코마티스 감염된 3T3 세포가 인식되는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는, Cap-1이 씨.트라코마티스 기본소체가 망상체로 발생시 합성되는 조기단백질임을 암시하는 것이다. 감염 초기에 발현되는 유전자 생성물에 대하여 유도되는 CD8+ CTL 면역반응은 클라미디아 감염에 대한 백신에 특히 효과적일 수 있다.
실시예 5
클라미디아 항원으로 면역화된 마우스에서의 항체 생성 및 T 세포 반응
면역원성 연구는 몬타나이트 보조제로 제조한 정제된 SWIB 또는 S13 단백질로 면역화하거나 또는 SWIB나 S13의 DNA 서열을 함유하는 pcDNA-3 발현 벡터로 DNA계 면역화한 마우스에서의 항체 및 CD4+ T 세포 반응을 실시하여 측정하였다. SWIB는 또한 클론 1-B1-66(서열 1, 상응하는 아미노산 서열이 서열 5에 제시됨)이라 지칭하기도 하고, S13 리보솜 단백질은 클론 10-C10-31(서열 4, 상응하는 아미노산 서열이 서열 12에 제시됨)이라 지칭하기도 한다. 1차 실험에서 3마리 C57BL/6 마우스 그룹을 면역화시키고 항체 및 CD4+ T 세포 반응에 대하여 모니터하였다. DNA 면역화는 꼬리 기저부를 통해 피하 투여하여 실시하고 폴리펩타이드 면역화는 경피 경로로 투여하여 실시하였다. 면역화된 마우스의 비장 세포에 대한 표준3H 도입 분석 결과, 정제된 재조합 SWIB 폴리펩타이드(서열 5)로 면역화된 그룹에서 강한 증식 반응이 나타났다. 추가로, 전술한 바와 같은 사이토킨 유도 분석에서는 SWIB 폴리펩타이드로 면역화된 그룹이 측정가능한 정도의 IFN-γ 및 IL-4 반응을 나타내는 것으로 확인되었다. 이어서, SWIB 폴리펩타이드로 면역화된 실험 그룹에서 우세한 항체 이소타입 반응을 측정하기 위한 ELISA계 분석을 실시하였다.도 4는 SWIB 면역화 그룹이 주로 IgG1인 체액성 반응을 나타낸다는 것을 예시하고 있다.
제2 실험에서는 C3H 마우스를, PBS 또는 몬타나이드 중에 제조한 정제된 SWIB 단백질(또한 클론 1-B1-66으로도 지칭함, 서열 5) 10㎍으로 3주 간격으로 3회 면역화시키고 3회째 면역화한지 2주 후에 수확하였다. SWIB 단백질에 대하여 유도되는 항체 역가는 당해 기술 분야에 공지된 표준 ELISA계 기법으로 측정하였고, 그 결과 몬타나이드 보조제로 제조한 SWIB 단백질이 강한 체액성 면역 반응을 유도한다는 것을 확인하였다. T 세포 증식 반응은 XTT계 분석(Scudiero, et al., Cancer Research, 1988, 48:4827)으로 측정하였다. 도 5에 예시된 바와 같이, SWIB 폴리펩타이드 + 몬타나이드로 면역화한 마우스의 비장세포는 항원 특이적인 증식 반응을 유도하였다. 또한, 면역화된 동물의 비장세포에서 가용성 재조합 SWIB 폴리펩타이드에 대한 반응으로 IFN-γ를 분비하는 활성은 전술한 바와 같이 사이토킨 유도 분석으로 측정하였다. 몬타나이드 보조제로 제조한 SWIB 폴리펩타이드로 면역화시킨 그룹에 속하는 모든 동물의 비장세포는 SWIB 클라미디아 항원에 대한 노출 반응시 IFN-γ를 분비하였고, 클라미디아 특이적 면역반응을 입증하였다.
또 다른 실험으로, C3H마우스를 SBAS2 보조제(스미드클라인 비참, London, England)로 제조한 정제된 SWIB 또는 S13 단백질(씨.트라코마티스, SWIB 단백질, 클론 1-B1-66, 서열 5 및 S13 단백질, 클론 10-C10-31, 서열 4) 10㎍으로 꼬리 기저부를 통해 각각 다른 시간에 3회 면역화시켰다. 항원 특이적 항체 역가는 ELISA로 측정하였고, 그 결과 두 폴리펩타이드 모두 1x10-4내지 1x10-5역가 범위의 강한 IgG 반응을 유도한다는 것을 확인하였다. 이 반응에서 IgG1 및 IgG2a 성분은 거의 동일한 양으로 존재하였다. 면역화된 마우스에서 분리한 비장 세포를 가지고 표준3H 도입 분석으로 측정한 결과 항원 특이적인 T 세포 증식 반응이 SWIB의 경우에는 다소 강하고(음성 대조군 보다 50000cpm), s13의 경우에는 훨씬 더 강한(음성 대조군 보다 100000cpm) 것으로 나타났다. IFNγ 생성은 증식 배양물의 상청액으로부터 표준 ELISA 기법으로 분석하였다. 배양물을 S13 단백질로 시험관내에서 재자극한 결과 음성 대조군에서는 2ng/㎖인데 비하여 약 25ng/㎖으로서 높은 IFNγ 생성률을 유도하였다. 또한, SWIB 단백질을 이용한 재자극 결과 그 정도는 낮았지만 IFNγ를 유도하였다.
관련 실험으로서, C3H 마우스를 콜레라 독소 10㎍과 혼합한 정제된 SWIB 또는 S13 단백질(씨.트라코마티스, SWIB 단백질, 클론 1-B1-66, 서열 5 및 S13 단백질, 클론 10-C10-31, 서열 4) 10㎍으로 각각 다른 시간에 3회 면역화시켰다. 점막 면역화는 비내 접종을 통해 실시하였다. 항원 특이적인 항체 반응은 표준 ELISA 기법으로 분석하였다. 항원 특이적인 IgG 항체는 SWIB 면역화된 마우스의 혈액내에 1x10-3내지 1x10-4역가 범위로 존재하였지만, S13 면역화된 마우스에서는 검출되지 않았다. IFNγ 생성으로 측정한, 분리된 비장세포의 항원 특이적인 T 세포 반응은 방금 전술한 전신 면역화에서와 유사한 결과를 나타냈다.
CT529 혈청형 LGVII CTL 에피토프의 면역원성을 측정하기 위하여 H2-Kd 제한성 CTL 에피토프로서 확인된 CT529 10량체 콘센서스 펩타이드(CSFIGGITYL-서열 31)로 동물 연구를 실시하였다. 이 펩타이드 25㎍을 다양한 보조제와 혼합하여 BALB/c 마우스(그룹당 마우스 3마리)를 3회 면역화시켰다. 펩타이드는 SKB 보조제 SBAS-2", SBAS-7(스미드클라인 비참, London, England) 또는 몬타나이드를 통해 꼬리 기저부로 전신 투여하였다. 또한, 콜레라 독소(CT) 10㎍과 혼합하여 비내로 투여하기도 하였다. 순수 마우스는 대조군으로 사용하였다. 3회째 면역화하고 4주 후에 비장 세포를, CT529 10량체 콘센서스 펩타이드 10㎍/㎖로 펄스처리한 LPS-아세포로 1x106세포/㎖에서 LPS-아세포에 대한 작동인자 비를 6, 1.5 및 0.4로 하여 재자극하였다. 2회 재자극한 후, 작동인자 세포를 가지고 표준 크롬 방출 분석을 통해 펩타이드 펄스처리된 P815 세포의 용균 활성에 대하여 시험하였다. 음성 대조군으로서, 계란 오브알부민의 비관련 펩타이드를 사용하였다. 그 결과, CT529 10량체 콘센서스 펩타이드에 대하여 유의적인 면역 반응이 유도되고 펩타이드 펄스처리된 표적을 용균할 수 있는 항원 특이적인 T 세포가 펩타이드에 의한 면역화 반응으로 유인된다는 것을 확인하였다. 구체적으로, 항원 특이적인 용균 활성은 SBAS-7 및 CT 보조제가 사용된 그룹에서는 관찰되었으나, 몬타나이드 및 SBAS-2"는 CTL 에피토프 면역화를 보조하지 못하는 것으로 관찰되었다.
실시예 6
클라미디아 뉴모니아 유전자의 발현 및 특성규명
실시예 1에 제시된 사람 T 세포주, TCL-8은 클라미디아 뉴모니아 뿐만 아니라 클라미디아 트라코마티스로 감염시킨 단핵구 유래의 수지상 세포를 인식하여, 클라미디아 트라코마티스와 뉴모니아가 교차반응성 T 세포 에피토프를 암호화할 수 있음을 암시한다. SWIB(서열 1)로도 지칭되는 클라미디아 트라코마티스 LGV II 클론 및 S13 리보솜 단백질(서열 4)로도 지칭되는 클론 10C10-31에 상동성인 클라미디아 뉴모니아 유전자를 분리하기 위하여 HeLa 229 세포를 씨.뉴모니아 균주 TWAR(CDC/CWL-029)로 감염시켰다. 3일간 항온처리한 후, 씨.뉴모니아로 감염된 HeLa 세포를 수거하고, 세척한 뒤 물 200㎕에 재현탁시킨 다음, 비등수조에서 20분 동안 가열하였다. 파쇄된 세포 현탁액 10㎕를 PCR 주형으로서 사용하였다.
씨.뉴모니아 특이적 프라이머는 클론 1B1-66 및 10C10-31이 5' 말단부에 6X-히스티딘 태그를 갖고 NdeI 부위가 삽입되며, 3' 말단부에 종결 코돈이 오고 BamHI 부위를 포함하도록 디자인하였다(도 6). PCR 생성물은 당해 기술 분야에 공지된 표준 기법에 따라 증폭시키고 서열분석하였다. 씨.뉴모니아 특이적인 PCR 생성물은 발현 벡터 pET17B(Novagen, Madison, WI)에 클로닝한 후, 발현과 노바겐 제품인 히스티틴-니켈 크로마토그래피 방법을 이용한 정제를 위하여 이. 콜라이 BL21 pLysS를 형질감염시켰다. 결과적으로, 씨.뉴모니아로부터 2개의 단백질, CpSWIB로 지칭되는 10 내지 11kDa 단백질(서열 27 및 6X His 태그를 가진 것은 서열 78, 상응하는 아미노산 서열이 서열 28에 제시됨)과 CpS13으로 지칭되는 15kDa 단백질(서열 29m 6X His 태그를 가진 것은 서열 77, 상응하는 아미노산 서열이 서열 30과 91에 각각 제시됨)을 생성하였다.
실시예 7
클라미디아 뉴모니아 항원에 의한 T 세포 증식 및 인터페론-γ 생성 유도
재조합 클라미디아 뉴모니아 항원이 T 세포 증식 및 인터페론-γ 생성을 유도하는지는 다음과 같이 측정하였다.
단백질은 IPTG로 유도하고 Ni-NTA 아가로스 친화성 크로마토그래피로 정제하였다(Webb et al., J.Immunology 157:5034-5041, 1996). 그 다음, 정제된 폴리펩타이드를 가지고 PBMC 제조물에서 T 세포 증식을 유도하는 활성을 스크리닝하였다. 씨.뉴모니아 환자 유래의 PBMC와 클라미디아 항원에 대한 반응으로 증식하는 것으로 알려진 T 세포를 가진 정상 공여체 유래의 PBMC를, 10% 수집된 사람 혈청과 젠타마이신 50㎍/㎖이 보충된 RPMI 1640을 함유하는 배지에서 배양하였다. 정제된 폴리펩타이드는 0.5 내지 10㎍/㎖의 농도로 2반복으로 첨가하였다. 96웰 둥근바닥 평판에서 200㎕의 부피로 6일 동안 배양한 후, 각 웰로부터 배지 50㎕를 채취하여 하기 기술되는 바와 같이 IFN-γ 농도를 측정하였다. 그 다음, 평판은 3중수소화된 티미딘 1μCi/웰로 18시간 동안 더 표지하고 수거한 뒤, 기체 신틸레이션 계수기로 3중 수소 흡수율을 측정하였다. 양 복제물에서, 배지에서만 배양시킨 세포에서 관찰되는 증식율의 3배 이상의 증식율이 나타나는 분획은 양성으로 간주한다.
IFN-γ는 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA)로 측정하였다. ELISA 평판은 사람 IFN-γ에 대해 유도된 마우스 모노클로날 항체(PharMingen, San Diego, CA)의 PBS 용액으로 실온에서 4시간 동안 코팅하였다. 그 다음, 웰을 5%(W/V) 탈지분유를 함유하는 PBS로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 이 평판을 PBS/0.2% TWEEN-20으로 6회 세척하고 ELISA 평판에서 배양 배지로 1:2 희석한 시료를 실온에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 이 평판을 다시 세척하고 폴리클로날 토끼 항-사람 IFN-γ 혈청을 PBS/10% 정상 염소 혈청으로 1:3000배로 희석하여 각 웰에 첨가하였다. 그 다음 평판을 실온에서 2시간 동안 항온처리하고 세척한 뒤 양고추냉이 퍼옥시다제가 결합된 항-토끼 IgG(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)을 PBS/5% 탈지분유에 1:2000으로 희석하여 첨가하였다. 실온에서 2시간 더 항온처리한 후, 평판을 세척하고 TMB 기질을 첨가하였다. 20분 후 1N 황산으로 반응을 정지시켰다. 광학밀도는 다조 파장으로서 570nm를 사용하여 450nm에서 측정하였다. 양 복제물에서, 배지에서만 배양시킨 세포의 평균 OD값보다 2배 이상의 OD값과 3의 표준 편차를 나타내는 분획은 양성으로 간주한다.
씨.트라코마티스와 씨.뉴모니아에 교차반응할 수 있는 사람 항클라미디아 T 세포주(TCL-8)를 사용하여 상기 실시예에 기술된 발현 단백질(즉, CpSWIB, 서열 27 및 6X His 태그를 가진 것은 서열 78, 상응하는 아미노산 서열이 서열 28 및 CpS13으로 지칭되는 15kDa 단백질, 서열 29, 6X His 태그를 가진 것은 서열 77, 상응하는 아미노산 서열이 서열 30과 91에 각각 제시됨)이 씨.트라코마티스 및 씨.뉴모니아 모두에 공통적인 T 세포 에피토프를 함유하는지를 측정하였다. 간략히 설명하면, 클라미디아 단백질을 발현하는 이. 콜라이를 1x104단핵구 유래의 수지상 세포 상에 적정하였다. 2시간 후, 수지상 세포 배양물을 세척하고 2.5x104T세포(TCL-8)를 첨가하여 72시간 동안 더 항온처리하였다. 그 다음, 배양 상청액 중의 IFN-γ의 양을 ELISA로 측정하였다. 도 7A 및 7B에 도시한 바와 같이, T 세포주 TCL-8은 IFN-γ의 항원 특이적인 유도 반응에 의해 입증되는 바와 같이 씨.트라코마티스와 씨.뉴모니아 유래의 S13 리보솜 단백질을 특이적으로 인식하는 반면, SWIB 단백질은 씨.트라코마티스 유래의 것만을 인식하였다. 이러한 결과를 입증하기 위하여, 씨.트라코마티스 SWIB의 T 세포 에피토프를 일련의 중복 펩타이드 및 T 세포주 TCL-8로 펄스처리한 표적 세포를 사용하여 에피토프 지도작성하여 확인하였다.3H-티미딘 도입 분석을 통해, C.t.SWIB52-67(서열 39)로 지칭되는 펩타이드가 TCL-8 세포주의 가장 강한 증식을 유도하는 것으로 확인하였다. 씨.뉴모니아의 SWIB 서열(서열 40), 씨.뉴모니아의 토포이소머라제-SWIB 융합 서열(서열 43) 및 씨.트라코마티스의 토포이소머라제-SWIB 융합 서열(서열 42) 뿐만 아니라 사람 SWI 도메인(서열 41)에 상응하는 상동성 펩타이드들을 합성하여 상기 분석법으로 시험하였다. T 세포주 TLC-8은 서열 39의 씨.트라코마티스 펩타이드만을 인식하였고, 상응하는 씨.뉴모니아 펩타이드(서열 40) E는 전술한 다른 상응하는 펩타이드(서열 41 내지 43)는 인식하지 못하였다.
클라미디아 특이적인 T 세포주는 공여체의 PBMC를 씨.트라코마티스 또는 씨.뉴모니아로 감염된 단핵구 유래의 수지상 세포로 각각 자극하여 씨.뉴모니아에 대한 양성 혈청 역가를 가진 공여체 CP-21로부터 수득하였다. 씨.뉴모니아에 대하여 수득한 T 세포는 재조합 씨.뉴모니아-SWIB에 반응하고 씨.트라코마티스-SWIB에는반응하지 않는 반면, 씨.트라코마티스에 대하여 수득한 T 세포주는 씨.트라코마티스-SWIB 및 씨.뉴모니아-SWIB 모두와 반응하지 않았다(도 9). 공여체 CP-21의 씨.뉴모니아-SWIB 특이적 면역 반응은 씨.뉴모니아 감염을 입증하고, 생체내 씨.뉴모니아 감염 동안 씨.뉴모니아-SWIB 특이적인 T 세포가 유도된다는 것을 시사하였다.
씨.뉴모니아-SWIB에 대한 T 세포 반응을 통한 에피토프 지도작성은 Cp-SWIB 특이적인 T 세포가 중복 펩타이드 Cp-SWIB 32-51(서열 101) 및 Cp-SWIB 37-56(서열 102)에 반응하므로써 씨.뉴모니아-SWIB-특이적인 T 세포 에피토프가 Cp-SWIB 37-51(서열 100)임을 시사하였다.
또 다른 실험에서, 씨.뉴모니아 혈청양성 공여체인 공여체 CP1로부터 PBMC를 씨.트라코마티스 및 씨.뉴모니아 유래의 비감염성 기본소체로 각각 자극하여 T 세포주를 수득하였다. 구체적으로, 증식 반응은 1x104단핵구 유래의 수지상 세포의 존재하에 2.5x104T 세포를 씨.트라코마티스 및 씨.뉴모니아 유래의 비감염성 기본소체 또는 재조합 씨.트라코마티스 또는 씨.뉴모니아 SWIB 단백질로 자극하여 측정하였다. SWIB에 대한 T 세포 반응은 씨.트라코마티스-SWIB가 아닌 씨.뉴모니아-SWIB에 의해 씨.뉴모니아 T 세포주에 의한 반응이 유인된다는 점에서 CP-21 유래의 T 세포주로부터 얻어지는 데이터와 유사한 결과를 나타내었다. 또한, 씨.트라코마티스 T 세포주는 CT 및 CP기본소체에 대한 반응으로는 증식하였지만 씨.트라코마티스 또는 씨.뉴모니아 SWIB에 대한 반응으로는 증식하지 않았다. 실시예 1에 예시한 바와 같이, TCP-21 세포주에 의해 확인되는 클론 11-C12-91(서열 63)은 OMP2 유전자(CT443)의 일부분인 269bp 삽입체를 갖고 있고, OMCB라고 불리는 씨.뉴모니아의 60kDa 시스테인 풍부한 외막 단백질과 상동성을 공유한다. 반응성 에피토프에 대하여 보다 상세히 연구하기 위하여 일련의 중복 펩타이드와 전술된 면역분석법을 통해 에피토프 지도작성을 실시하였다. 간략히 설명하면, 증식 반응은 2.5x104TCP-21 T 세포를 1x104단핵구 유래의 수지상 세포의 존재하에 씨.트라코마티스 및 씨.뉴모니아 유래의 비감염성 기본소체 또는 씨.트라코마티스 또는 씨.뉴모니아 OMCB 단백질의 단백질 서열 유래의 펩타이드(0.1㎍/㎖)로 자극하여 측정하였다. TCP-21 T 세포는 에피토프 CT-OMCB #167-186, CT-OMCB #171-190, CT-OMCB #171-186, 및 보다 낮은 정도로 CT-OMCB #175-186(각각 서열 249 내지 252)에 반응하였다. 특히, TCP-21 T 세포주는 상동성인 씨.뉴모니아 펩타이드 CP-OMCB#171-186(서열 253)에 대하여 씨.트라코마티스 펩타이드에 대한 반응과 동일하거나 그 이상으로 증식 반응을 나타내었다. 또한, 2번 위치(즉, Glu 대신 Asp) 및 4번 위치(즉, Ser 대신 Cys)의 아미노산 치환은 T 세포의 증식 반응을 변화시키지 않았고, 따라서 이 에피토프가 씨.트라코마티스와 씨.뉴모니아 사이에 교차반응성인 에피토프라는 것을 알 수 있었다.
실시예 8
클라미디아 항원에 대한 사람 PBMC 및 T 세포주의 면역반응
본 명세서에 제시된 실시예들은 씨.트라코마티스로 감염되고 씨.트라코마티스 감염을 제어하는 방어 면역반응을 산출하는 일반 개체 중에서 건강한 공여체 군이 있다는 것을 암시한다. 이 공여체들은 임상적으로 무증후성이고 씨.트라코마티스 혈청 음성반응을 나타낸다. CD4 발현 클로닝에 의해 확인된 클라미디아 항원들에 대한 정상 공여체들의 면역 반응을 분석하기 위하여, 12명의 건강한 공여체로부터 수득한 PBMC를 가지고 재조합 클라미디아 항원 패널, 예컨대 씨.트라코마티스-SWIB, 씨.뉴모니아-SWIB, 씨.트라코마티스-S13 및 씨.뉴모니아-S13에 대하여 시험하였다. 그 결과 데이터는 이하 표 I에 요약하였다. 모든 공여체는 C,트라코마티스 혈청음성인 반면, 6/12명은 양성 씨.뉴모니아 역가를 나타냈다. 양성 반응으로서 >4의 자극 지수를 사용하여, 검체중 11/12명은 씨.트라코마티스 기본소체에 대하여 반응하였고, 12/12명은 씨.뉴모니아 기본소체에 대하여 반응하였다. 한 공여체인 AD104는 재조합 씨.뉴모니아-S13 단백질에 반응하였으나 재조합 씨.트라코마티스-S13 단백질에 대해서는 반응하지 않아, 씨.뉴모니아 특이적 반응을 나타내었다. 3/12명의 공여체는 씨.트라코마티스-SWIB 특이적 반응을 나타냈으나, 씨.뉴모니아-SWIB 특이적 반응은 나타내지 않아서 씨.트라코마티스 감염임을 확인하였다. 씨.트라코마티스 및 씨.뉴모니아-S13은 8/12명의 공여체에서 반응을 유도하여 클라미디아 감염을 암시하였다. 이러한 데이터는 SWIB 및 S13이 일반 연구 검체의 PBMC에서 T 세포 반응을 유인하는 활성이 있음을 증명하는 것이다.
CT=클라미디아 트라코마티스; CP=클라미디아 뉴모니아; EB=클라미디아 기본소체; Swib=재조합 클라미디아 Swib 단백질; S13=재조합 클라미디아 S13 단백질; lpdA=재조합 클라미디아 lpdA 단백질; TSA=재조합 클라미디아 TSA 단백질. 결과 값은 표준 증식 분석의 결과를 나타낸 것이다. 증식 반응은 각각 재조합 항원 또는 기본소체(EB)와 전배양한 1x104단핵구 유래의 수지상 세포로 3x105PBMC를 자극하여 측정하였다. 분석물은 6일 후 수거하였으며, 마지막 18시간 동안3H-티미딘 충격을 주었다.
SI: 자극지수
+/-: SI~ 4
+: SI> 4
++: SI 10-30
+++: SI> 30
1차 실험에서, 전술한 바와 같은 씨.트라코마티스 LGV II 기본소체로 T 세포를 자극하여 씨.트라코마티스에 생식관이 노출된 이력이 있는 건강한 여성(CT-10)으로부터 T 세포주를 수득하였다. 본 연구의 검체는 씨.트라코마티스에 노출되었지만 혈청전환을 일으키지 않아 임상 증후는 나타내지 않았으며, 이것은 공여체 CT-10에 씨.트라코마티스에 대한 방어 면역반응이 형성되었음을 암시한다. 도 10에 제시한 바와 같이 공여체 CT-10 유래의 1차 클라미디아 특이적인 T 세포주는 씨.트라코마티스-SWIB 재조합 단백질에 반응하지만, 씨.뉴모니아-SWIB 재조합 단백질에는 반응하지 않는 것으로 보아 CT-10이 씨.트라코마티스에 노출되었음을 알 수 있었다. 씨.트라코마티스-SWIB에 대한 T 세포 반응의 에피토프 지도작성 결과, 이 공여체가 T 세포주 TCL-8과 마찬가지로 에피토프 Ct-SWIB 52-67(서열 39)에 반응하는 것을 확인하였다(도 11).
다양한 씨.트라코마티스 환자로부터 전술한 바와 같이 다른 T 세포주를 수득하였다. 환자의 임상 프로필과 다양한 씨.트라코마티스 및 씨.뉴모니아 기본소체 및 재조합 단백질에 대한 증식 반응은 하기 표 II에 요약하였다.
NGU=비임균성 요도염; BV=박테리아 질균증; CT=클라미디아 트라코마티스; CP=클라미디아 뉴모니아; EB=클라미디아 기본소체; Swib=재조합 클라미다아 Swib 단백질; S13=재조합 클라미디아 S13 단백질; lpdA=재조합 클라미디아 lpdA 단백질; TSA=재조합 클라미디아 TSA 단백질.
결과 값은 표준 증식 분석의 결과를 나타낸 것이다. 증식 반응은 각각 재조합 항원 또는 기본소체(EB)와 전배양한 1x104단핵구 유래의 수지상 세포로 3x105PBMC를 자극하여 측정하였다. 분석물은 6일 후 수거하였으며, 마지막 18시간 동안3H-티미딘으로 펄스처리하였다.
SI: 자극지수
+/-: SI~ 4
+: SI> 4
++: SI 10-30
+++: SI> 30
표 I과 표 II에 요약한 바와 같이 무증후성(전술한 바 있음) 연구 검체와 C,트라코마티스 환자의 패널을 사용하여 두 그룹에서 얻은 PBMC의 면역반응에 대한 광범위한 연구를 수행하였다. 간략히 설명하면, 정상 공여체 뿐만 아니라 씨.뉴모니아 환자로부터 수집한 PBMC를, 10% 수집된 사람 혈청과 젠타마이신 50㎍/㎖이 보충된 RPMI 1640을 함유하는 배지에서 배양하였다. 정제된 폴리펩타이드들, 즉 씨.트라코마티스-, 씨.뉴모니아-SWIB 및 S13 뿐만 아니라 씨.트라코마티스 lpdA 및 TSA를 비롯한 재조합 클라미디아 항원들을 0.5 내지 10㎍/㎖의 농도로 2회 반복 첨가하였다. 96웰 둥근바닥 평판에서 200㎕의 부피로 6일 동안 배양한 후, 각 웰로부터 배지 50㎕를 채취하여 하기 기술되는 바와 같이 IFN-γ 농도를 측정하였다. 그 다음, 평판은 3중수소화된 티미딘 1μCi/웰로 18시간 동안 더 표지하고 수거한 뒤, 기체 신틸레이션 계수기로 3중 수소 흡수율을 측정하였다. 양 복제물에서, 배지에서만 배양시킨 세포에서 관찰되는 증식율의 3배 이상의 증식율이 나타나는 분획은 양성으로 간주한다.
재조합 클라미디아 항원에 대한 증식 반응 결과, 무증후성 공여체 및 씨.트라코마티스 환자의 대부분이 씨.트라코마티스 S13 항원(8/12)을 인식하고 씨.트라코마티스 환자의 대부분이 씨.뉴모니아 S13 항원(8/12)을 인식하며, 또한 4/12명의 무증후성 공여체가 씨.뉴모니아 S13 항원을 인식하는 것을 확인하였다. 또한, 씨.트라코마티스 환자 6/12명과 무증후성 공여체 4/12명은 씨.트라코마티스 lpdA 항원에 대하여 증식 반응을 나타내었다. 이와 같은 결과는 씨.트라코마티스 및 씨.뉴모니아 S13 항원, 씨.트라코마티스 Swib 항원 및 씨.트라코마티스 lpdA 항원이 무증후성 공여체에 의해 인식되는 바, 이들 항원이 클라미디아에 노출된 동안 인식되어 이들에 대한 면역반응이 유도되었다는 것을 시사한다. 이는 이 항원들이 사람 숙주에 방어 면역성을 부여할 수 있음을 암시하는 것이다. 또한, 씨.트라코마티스 및 씨.뉴모니아 S13항원은 씨.트라코마티스 환자들 중에서 거의 동일하게 인식되므로, S13 단백질에는 씨.트라코마티스와 씨.뉴모니아 사이에 공유되는 에피토프가 있을 수 있음을 나타낸다. 이와 같은 연구의 결과를 이하 표 III에 요약하였다.
무증후성 공여체 및 씨.트라코마티스 환자로부터 단기간에 생성된 T 세포주에 대한 세포 면역반응을 측정하기 위하여 일련의 연구를 개시하였다. 세포 면역반응은 실시예 7에 기재된 바와 같이 표준 증식 분석과 IFN-γ로 측정하였다. 구체적으로, 항원의 대부분은 클라미디아 항원을 발현하는 단독 이. 콜라이 클론의 형태였으며, 일부 재조합 단백질도 이 분석에 사용하였다. 단독 이. 콜라이 클론은 1x104단핵구 유래의 수지상 세포 상에서 적정하고, 2시간 후 배양물을 세척하고 2.5x104T 세포를 첨가하였다. 재조합 단백질을 이용한 분석은 전술한 바와 같이 실시하였다. 증식은 4일 후 측정하였으며, 마지막 18시간 동안 표준3H-티미딘 충격을 주었다. 4일 후 수확한 배양 상청액으로부터 전술한 바와 같은 표준 ELISA 분석을 통해 IFN-γ 유도를 측정하였다. 그 결과, C.T.Swib를 제외한 시험한 모든 씨.트라코마티스 항원들은 씨.트라코마티스 환자 유래의 1종 이상의 여러 T 세포주로부터 증식 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, 증식 반응은 다음과 같은 클라미디아 유전자 CT622, groEL, pmpD, CT610 및 rS13에 대하여 씨.트라코마티스 환자 및 무증후성 공여체 모두로부터 유도되었다.
12G3-83 클론은 또한 CT622 외에도 CT734 및 CT764에 대한 서열을 포함한다. 따라서, 이 유전자 서열도 역시 면역반응성 에피토프를 가질 수 있다. 이와 마찬가지로, 클론 21G12-60은 CT875외에도 추정상의 단백질 유전자 CT229 및 CT228에 대한 서열을 포함하고; 15H2-76도 또한 CT812 및 CT088 유래의 서열을 포함할 뿐만 아니라 sycE 유전자에 대한 상동성을 공유한다. 클론 11H3-61도 또한 PGP6-D 독성 단백질에 대한 상동성을 공유하는 서열을 포함한다.
실시예 9
클라미디아 항원을 이용한 방어 연구
방어 연구는 클라미디아 항원에 의한 면역화가 클라미디아 접종후 나타나는 생식관 질환에 영향을 미칠 수 있는지를 측정하기 위하여 마우스에 대하여 수행하였다. 2가지 모델, 즉 클라미디아 프시타시(Chlamydia psittaci)(MTW447) 균주를 함유하는 사람 분리물을 이용하는 질내 접종 모델 및 클라미디아 트라코마티스 혈청형 F(균주 NI1)로서 확인된 사람 분리물을 포함하는 자궁내 접종 모델을 사용하였다. 두 균주는 여성에서 나타나는 클라미디아 트라코마티스 유발성 자궁내막염 및 난관염과 유사하게 상부 생식관에 염증을 유도한다. 1차 실험으로서, C3H 마우스(그룹 당 마우스 4마리)를 씨.트라코마티스 SWIB DNA(서열 1, 상응하는 아미노산 서열은 서열 5에 제시됨)를 함유하는 pcDNA-3 발현 벡터 100㎍으로 3회 면역화시켰다. 전신 면역화를 위하여 접종은 꼬리 기저부에 실시하였다. 최종 면역화 2주 후에 동물을 프로제스테론으로 처리하고 질을 통해 또는 자궁내 접종물을 주사하여 감염시켰다. 감염 2주 후에 마우스를 죽이고 생식관을 절제하여 염색한 뒤 조직병리학 검사를 실시하였다. 염증 정도는 + 매우 약함에서부터 +++++ 매우 심함까지 등급을 매겼다. 각각 난관/난소에 매겨진 스코어를 합하여 조사한 기관의 수로 나누어 그룹의 평균 스코어를 수득하였다. 자궁 접종 모델에서 공(empty) 벡터를 투여한 음성 대조군에 의해 면역화된 동물은 난관/난소 평균 염증 스코어가 6.12로 지속적인 염증을 나타냈으나, DNA로 면역화된 그룹에서는 2.62를 나타내었다. 질내 접종하고 감염 정도를 상승시킨 모델에서는 음성 대조군으로 면역화된 마우스가 8.37의 난관/난소 평균 염증 스코어를 나타내고 DNA로 면역화된 그룹에서는 5.00을 나타내었다. 또한, 질내 접종하고 감염 정도를 상승시킨 모델에서 예방접종된 마우스는 난관 폐색의 증후를 전혀 나타내지 않은 반면 음성 대조군으로 예방접종된 마우스는 난관 내강에 염증 세포를 나타내었다.
2차 실험에서, C3H 마우스(그룹당 4마리)를 폴리락타이드 코글리콜라이드 미소구(PLG)로 캡슐화한 씨.트라코마티스 SWIB DNA(서열 1, 상응하는 아미노산 서열은 서열 5에 제시함)를 함유하는 pcDNA-3 발현 벡터 50㎍으로 3회 면역화시켰다.최종 면역화 2주 후에, 동물을 프로제스테론으로 처리하고 질을 통해 씨.프시타시를 접종하여 감염시켰다. 감염 2주 후에 마우스를 죽이고 생식관을 절제하여 염색한 뒤 조직병리학 검사를 실시하였다. 염증 정도는 전술한 바와 같이 등급을 매겼다. 각각 난관/난소에 매겨진 스코어를 합하여 조사한 기관의 수로 나누어 그룹의 평균 스코어를 수득하였다. PLG 캡슐화된 공 벡터를 투여한 음성 대조군에 의해 면역화된 동물은 난관/난소 평균 염증 스코어가 7.28로 지속적인 염증을 나타냈으나, PLG 캡슐화된 DNA로 면역화된 그룹에서는 5.71을 나타내었다. 복막내 염증은 예방접종된 그룹에서는 1.75였고, 대조군에서는 3.75였다.
3차 실험에서, C3H 마우스(그룹당 4마리)를 콜레라 독소(CT)와 혼합된 정제된 재조합 단백질, SWIB(서열 1, 상응하는 아미노산 서열이 서열 5에 제시됨) 또는 S13(서열 4, 상응하는 아미노산 서열이 서열 12에 제시됨) 10㎍으로 3회 면역화하고; 제조물을 20㎕의 부피로 마취 즉시 비내로 투여하였다. 최종 면역화 2주 후에, 동물을 프로제스테론으로 처리하고 질을 통해 씨.프시타시를 접종하거나 자궁내로 씨.트라코마티스 혈청형 F를 주사하여 감염시켰다. 감염 2주 후에 마우스를 죽이고 생식관을 절제하여 염색한 뒤 조직병리학 검사를 실시하였다. 염증 정도는 전술한 바와 같이 등급을 매겼다. 각각 난관/난소에 매겨진 스코어를 합하여 조사한 기관의 수로 나누어 그룹의 평균 스코어를 수득하였다. 자궁 접종 모델에서 콜레라 독소만을 투여한 음성 대조군 면역화 동물은 난소/난관 평균 염증 스코어가 4.25(마우스 2마리만의 분석치; 다른 2마리는 사망함)로 나타난 반면, s13+콜레라 독소로 면역화된 그룹에서는 5.00, SWIB+콜레라 독소로 면역화된 그룹에서는 1.00으로 나타났다. 처리되지 않고 감염된 동물에서는 난소/난관 평균 염증 스코어가 7로 나타났다. 질내 접종하고 감염 정도를 상승시킨 모델에서는 음성 대조군으로 면역화된 마우스가 7.37의 난관/난소 평균 염증 스코어를 나타내고 s13+콜레라 독소로 면역화된 그룹에서는 6.75, SWIB+콜레라 독소로 면역화된 그룹에서는 5.37로 나타났다. 처리되지 않고 감염된 동물에서는 난소/난관 평균 염증 스코어가 8이었다.
전술한 3가지 실험은 SWIB 특이적인 방어가 수득될 수 있음을 암시한다. 이와 같은 방어 효과는 동종의 감염 모델에서 더욱 뛰어났고, 씨.프시타시에 의한 이종 감염시에도 여전히 존재하였다.
실시예 10
PMP/RA12 융합 단백질
다양한 Pmp/Ra12 융합 작제물은 먼저 NotI 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 Pmp 유전자의 PCR 단편을 합성하여 제조하였다. 각 PCR 단편을 그 다음 pCRX1의 NotI 제한 부위에 연결시켰다. pCRX1 벡터는 융합체의 6HisRa12 부분을 포함한다. 융합 작제물의 Ra12부분은 본 명세서에 참고 인용되는 미국 특허 출원 60/158,585호에 설명된 바와 같이 마이코박테리움 튜버큘로시스 MTB32A의 아미노산 잔기 192-323에 상응하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 각 삽입체의 정확한 배양은 제한효소 패턴으로 측정하고 그 서열을 확인하였다. 하기 기재되는 바와 같이 PmpA, PmpB, PmpC, PmpF 및 PmpH에 대한 다중 융합 작제물을 작제하였다.
PmpA 융합 단백질
PmpA는 982aa를 함유하는 107kD 단백질로서, 혈청형 E로부터 클로닝하였다. PmpA 단백질은 2개의 중복 단편, PmpA(N-말단)과 (C-말단)부로 분할된다.
PmpA(N-말단)는 다음과 같은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCATGTTTATAACAAAGGAACTTATG(서열 306)
GAGAGCGGCCGCTTACTTAGGTGAGAAGAAGGGAGTTTC(서열 307)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 308에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpA의 절편 1 내지 473을 발현하는 66kD 단백질(619aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 309에 제시한 바와 같다.
PmpA(C-말단)은 다음과 같은 센스 프라이머와 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCCATTCTATTCATTTCTTTGATCCTG(서열 310)
GAGAGCGGCCGCTTAGAAGCCAACATAGCCTCC(서열 311)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 312에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpA의 절편 438 내지 982를 발현하는 74kD 단백질(691aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 313에 제시한 바와 같다.
PmpF 융합 단백질
PmpF는 1034aa를 함유하는 112kD 단백질로서, 혈청형 E로부터 클로닝하였다. PmpF 단백질은 2개의 중복 단편, PmpF(N-말단)과 (C-말단)부로 분할된다.
PmpF(N-말단)는 다음과 같은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCATGATTAAAAGAACTTCTCTATCC(서열 314)
GAGAGCGGCCGCTTATAATTCTGCATCATCTTCTATGCC(서열 315)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 316에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpF의 절편 1 내지 499를 발현하는 69kD 단백질(646aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 317에 제시한 바와 같다.
PmpF(C-말단)은 다음과 같은 센스 프라이머와 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCGACATACGAACTCTGATGGG(서열 318)
GAGAGCGGCCGCTTAAAAGACCAGAGCTCCTCC(서열 319)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 320에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpF의 절편 466 내지 1034aa을 발현하는 77kD 단백질(715aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 321에 제시한 바와 같다.
PmpH 융합 단백질
PmpH는 1016aa을 함유하는 108kD 단백질로서, 혈청형 E로부터 클로닝하였다. PmpH 단백질은 2개의 중복 단편, PmpF(N-말단)과 (C-말단)부로 분할된다.
PmpH(N-말단)는 다음과 같은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCATGCCTTTTTCTTTGAGATCTAC(서열 322)
GAGAGCGGCCGCTTACACAGATCCATTACCGGACTG(서열 323)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 324에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpH의 절편 1 내지 484를 발현하는 64kD 단백질(631aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 325에 제시한 바와 같다.
PmpH(C-말단)은 다음과 같은 센스 프라이머와 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCGATCCTGTAGTACAAAATAATTCAGC(서열 326)
GAGAGCGGCCGCTTAAAAGATTCTATTCAAGCC(서열 327)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 328에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpH의 절편 449 내지 1016aa을 발현하는 77kD 단백질(715aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 329에 제시한 바와 같다.
PmpB 융합 단백질
PmpB는 1750aa을 함유하는 183kD 단백질로서, 혈청형 E로부터 클로닝하였다. PmpB 단백질은 4개의 중복 단편, PmpB(1),(2),(3) 및 (4)로 분할된다.
PmpB(1)은 다음과 같은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCATGAAATGGCTGTCAGCTACTGCG(서열 330)
GAGGCGGCCGCTTACTTAATGCGAATTTCTTCAAG(서열 331)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 332에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpB의 절편 1 내지 372aa를 발현하는 53kD 단백질(518aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 333에 제시한 바와 같다.
PmpB(2)는 다음과 같은 센스 프라이머와 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCGGTGACCTCTCAATTCAATCTTC(서열 334)
GAGAGCGGCCGCTTAGTTCTCTGTTACAGATAAGGAGAC(서열 335)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 336에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpB의 절편 330 내지 767aa을 발현하는 60kD 단백질(585aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 337에 제시한 바와 같다.
PmpB(3)은 다음과 같은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCGACCAACTGAATATCTCTGAGAAC(서열 338)
GAGCGGCCGCTTAAGAGACTACGTGGAGTTCTG(서열 339)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 340에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpB의 절편 732 내지 1236aa을 발현하는 67kD 단백질(654aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 341에 제시한 바와 같다.
PmpB(4)는 다음과 같은 센스 프라이머와 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCGGAACTATTGTGTTCTCTTCTG(서열 342)
GAGAGCGGCCGCTTAGAAGATCATGCGAGCACCGC(서열 343)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 344에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpB의 절편 1160 내지 1750aa을 발현하는 76kD 단백질(700aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 345에 제시한 바와 같다.
PmpC 융합 단백질
PmpC는 1774aa을 함유하는 187kD 단백질로서, 혈청형 E/L2로부터 클로닝하였다. PmpC 단백질은 3개의 중복 단편, PmpC(1),(2) 및 (3)으로 분할된다.
PmpC(1)은 다음과 같은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCATGAAATTTATGTCAGCTACTGC(서열 346)
GAGAGCGGCCGCTTACCCTGTAATTCCAGTGATGGTC(서열 347)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 348에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpC의 절편 1 내지 340aa을 발현하는 51kD 단백질(487aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 349에 제시한 바와 같다.
PmpC(2)는 다음과 같은 센스 프라이머와 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCGATACACAAGTATCAGAATCACC(서열 350)
GAGAGCGGCCGCTTAAGAGGACGATGAGACACTCTCG(서열 351)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 352에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpC의 절편 305 내지 741aa을 발현하는 60kD 단백질(583aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 353에 제시한 바와 같다.
PmpC(3)은 다음과 같은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로 증폭시켰다:
GAGAGCGGCCGCTCGATCAATCTAACGAAAACACAGACG(서열 354)
GAGAGCGGCCGCTTAGACCAAAGCTCCATCAGCAAC(서열 355)
그 결과 얻어지는 융합 작제물은 서열 356에 제시된 DNA 서열을 갖고 있고, PmpC의 절편 714 내지 1250aa을 발현하는 70kD 단백질(683aa)을 암호화한다. 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 357에 제시한 바와 같다.
이상, 본 발명을 이해의 명료함을 위하여 예시와 실시예를 통해 일면 상세히기술하였지만, 이의 변형 및 수정이 본 발명의 영역을 벗어나지 않는 한도내에서 가능하며, 본 발명의 범위는 첨부되는 청구의범위에 의해서만 한정된다.
Claims (71)
- (a) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 290에 제시된 서열; (b) 상기 서열 (a)에 상보적인 서열; 및 (c) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (a) 또는 (b)에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아(Chlamydia) 항원의 면역원성 부분을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 서열 175 내지 180, 189 내지 196, 264 및 266으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제3항에 기재된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제4항에 기재된 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제5항에 있어서, 이. 콜라이, 효모 및 포유동물 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 숙주 세포.
- 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
- 제7항에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염된 숙주 세포내에서 융합 단백질의 발현을 증가시키는 발현 인핸서를 포함하는 융합 단백질.
- 제7항에 있어서, 제1항의 폴리펩타이드 중에 존재하지 않는 T 헬퍼 에피토프를 포함하는 융합 단백질.
- 제7항에 있어서, 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질.
- 제7항에 기재된 융합 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제1항에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이 폴리뉴클레오타이드 서열 중 어느 한 서열의 상보체에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 기재된 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제3항에 기재된 폴리뉴클레오타이드 분자 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- (a) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (b) 상기 서열 (a)에 상보적인 서열; 및 (c) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (a) 또는 (b)에 하이브리드하는 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 암호화되는 폴리펩타이드와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- (a) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (b) 상기 서열 (a)에 상보적인 서열; 및 (c) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (a) 또는 (b)에 하이브리드하는 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- (a) 제7항에 기재된 융합 단백질;(b) 제11항에 기재된 폴리뉴클레오타이드; 및(c) 제12항에 기재된 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1종 이상의 성분과 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항에 기재된 폴리펩타이드 및 면역자극제를 포함하는 백신.
- 제3항에 기재된 폴리뉴클레오타이드 분자 및 면역자극제를 포함하는 백신.
- (a) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (b) 상기 서열 (a)에 상보적인 서열; 및 (c) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (a) 또는 (b)에 하이브리드하는 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드와 면역자극제를 포함하는 백신.
- (a) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (b) 상기 서열 (a)에 상보적인 서열; 및 (c) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (a) 또는 (b)에 하이브리드하는 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열을 포함하는 DNA 분자와 면역자극제를 포함하는 백신.
- (a) 제7항에 기재된 융합 단백질;(b) 제11항에 기재된 폴리뉴클레오타이드; 및(c) 제12항에 기재된 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 1종 이상의 성분과 면역자극제를 포함하는 백신.
- 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극제가 보조제인 백신.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에게 방어 면역성을 유도하는 방법.
- 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에게 방어 면역성을 유도하는 방법.
- 제1항에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이 폴리뉴클레오타이드 서열 중 어느 한 서열의 상보체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 폴리클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- (a) 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;(b) (i) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (ii) 상기 서열 (i)에 상보적인 서열; 및 (iii) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 항원의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드와 상기 시료를 접촉시키는 단계; 및(c) 상기 폴리펩타이드에 결합하는 항체의 존재를 측정하는 단계를 포함하여, 환자의 클라미디아 감염을 검출하는 방법.
- (a) 환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;(b) (i) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (ii) 상기 서열 (i)에 상보적인 서열; 및 (iii) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 항원의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질과 상기 시료를 접촉시키는 단계; 및(c) 상기 융합 단백질에 결합하는 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하여, 환자의 클라미디아 감염을 검출하는 방법.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 생물학적 시료가 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 요로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
- (a) 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 1종 이상이 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 2종 이상과 생물학적 시료를 폴리머라제 연쇄 반응에서 접촉시키는 단계; 및(b) 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 존재하에 증폭하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 상기 시료 중에서 검출하여 클라미디아 감염을 검출하는 단계를 포함하여, 생물학적 시료로부터 클라미디아 감염을 검출하는 방법.
- 제30항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 1종 이상이 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 약 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 특징인 방법.
- (a) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 특이적인 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및(b) 시료 중에서 상기 올리고뉴클레오타이드 프로브에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 검출하여, 클라미디아 감염을 검출하는 단계를 포함하여, 생물학적 시료로부터 클라미디아 감염을 검출하는 방법.
- 제32항에 있어서, 프로브가 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 약 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 특징인 방법.
- (a) (i) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (ii) 상기 서열 (i)에 상보적인 서열; 및 (iii) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 항원의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 결합제와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및(b) 상기 결합제에 결합하는 폴리펩타이드를 상기 시료 중에서 검출하여, 생물학적 시료 중의 클라미디아 감염을 검출하는 단계를 포함하여, 생물학적 시료 중의 클라미디아 감염을 검출하는 방법.
- (a) (i) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (ii) 상기 서열 (i)에 상보적인 서열; 및 (iii) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 항원의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질에 결합할 수 있는 결합제와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계;(b) 상기 결합제에 결합하는 폴리펩타이드를 상기 시료 중에서 검출하여 생물학적 시료 중의 클라미디아 감염을 검출하는 단계를 포함하여, 생물학적 시료 중의 클라미디아 감염을 검출하는 방법.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 결합제가 모노클로날 항체인 것이 특징인 방법.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 결합제가 폴리클로날 항체인 것이 특징인 방법.
- 제34항 또는 제35항에 있어서, 생물학적 시료가 전혈, 객담, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 요로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
- (a) (i) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (ii) 상기 서열 (i)에 상보적인 서열; 및 (iii) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 항원의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드; 및(b) 검출 시약을 포함하는 진단 킷트.
- (a) (i) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (ii) 상기 서열 (i)에 상보적인 서열; 및 (iii) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 항원의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질; 및(b) 검출 시약을 포함하는 진단 킷트.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 폴리펩타이드가 고체 지지체에 고정화되는 진단 킷트.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, 검출 시약이 결합제에 접합된 리포터기를 포함하는 진단 킷트.
- 제42항에 있어서, 결합제가 항면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 및 렉틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 진단 킷트.
- 제42항에 있어서, 리포터기가 방사성 동위원소, 형광기, 발광기, 효소, 비오틴 및 염료 입자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 진단 킷트.
- 1종 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 2종 이상을 포함하는 진단 킷트.
- 제43항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 1종 이상이 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291의 서열 중 약 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 진단 킷트.
- 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 1종 이상 포함하는 진단 킷트.
- 제47항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 프로브가 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 약 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 진단 킷트.
- (a) 제22항에 기재된 1종 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및(b) 검출 시약을 포함하는 진단 킷트.
- (a) 환자로부터 말초 혈액 세포를 수득하는 단계;(b) (i) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (ii) 상기 서열 (i)에 상보적인 서열; 및 (iii) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 항원의 면역원성 부분을 포함하는 1종 이상의 폴리펩타이드의 존재하에 상기 세포를 항온처리하여 T 세포를 증식시키는 단계; 및(c) 증식된 T 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 환자의 클라미디아 감염을 치료하는 방법.
- (a) 환자로부터 말초 혈액 세포를 수득하는 단계;(b) (i) 서열 169 내지 174, 181 내지 188, 263, 265 및 267 내지 291에 제시된 서열; (ii) 상기 서열 (i)에 상보적인 서열; 및 (iii) 적당히 엄격한 조건하에서 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드의 존재하에 상기 세포를 항온처리하여 T 세포를 증식시키는 단계; 및(c) 증식된 T 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 환자의 클라미디아 감염을 치료하는 방법.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, T 세포를 항온처리하는 단계가 1회 이상 반복되는 것이 특징인 방법.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, 단계 (a)가 추가로 말초 혈액 세포로부터 T 세포를 분리하는 단계를 포함하고, 단계 (b)에서 항온처리한 세포가 T 세포인 것이특징인 방법.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, 단계 (a)가 추가로 말초 혈액 세포로부터 CD4+ 세포 또는 CD8+ T 세포를 분리하는 단계를 포함하고, 단계 (b)에서 증식된 세포가 CD4+ 또는 CD8+ T 세포인 것이 특징인 방법.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, 단계 (a)가 추가로 말초 혈액 세포로부터 감마/델타 T 림프구를 분리하는 단계를 포함하고, 단계 (b)에서 증식된 세포가 감마/델타 T 림프구인 것이 특징인 방법.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, 단계 (b)가 추가로 상기 폴리펩타이드의 존재하에 증식되는 1종 이상의 T 세포를 클로닝하는 단계를 포함하는 것이 특징인 방법.
- 제1항에 기재된 폴리펩타이드의 존재하에 증식된 T 세포와 함께 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 클라미디아 감염 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
- 제3항에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 존재하에 증식된 T 세포와 함께 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 클라미디아 감염 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
- (a) 제1항에 기재된 1종 이상의 폴리펩타이드의 존재하에 항원-제시 세포를 항온처리하는 단계; 및(b) 항온처리된 항원-제시 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 클라미디아 감염 환자를 치료하는 방법.
- (a) 제3항에 기재된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 항원-제시 세포로 도입시키는 단계; 및(b) 당해 항원-제시 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 클라미디아 감염 환자를 치료하는 방법.
- 제59항 또는 제60항에 있어서, 항원-제시 세포가 수지상 세포, 대식세포, B세포, 섬유아세포, 단핵구 세포 및 줄기 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 특징인 방법.
- 제1항에 기재된 폴리펩타이드의 존재하에 항온처리된 항원-제시 세포와 함께 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 클라미디아 감염 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
- 제3항에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 존재하에 항온처리된 항원-제시 세포와 함께 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 클라미디아 감염 환자를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
- 서열 246, 247 및 254 내지 256의 서열을 포함하는 클라미디아 항원의 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드.
- 서열 246, 247 또는 254 내지 256의 서열을 포함하는, 클라미디아 항원의 면역원성 에피토프.
- 서열 224 내지 262, 246, 247, 254 내지 256, 292 및 294 내지 305 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
- Ra12 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 클라미디아 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 융합 폴리펩타이드.
- 제67항에 있어서, 클라미디아 폴리펩타이드가 Pmp 폴리펩타이드인 재조합 융합 폴리펩타이드.
- 제67항에 있어서, 클라미디아 폴리펩타이드가 PmpA, PmpF, PmpH, PmpB 또는PmpC인 재조합 융합 폴리펩타이드.
- 제67항에 있어서, 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 서열 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353 및 357로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열인 재조합 융합 폴리펩타이드.
- 제67항에 기재된 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 DNA 분자.
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