CN104220085A - 包含融合蛋白的癌症治疗用药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于将癌特异性抗原与细胞因子的融合蛋白用作癌症的预防剂或治疗剂。一种癌的预防或治疗用药物组合物，其包含癌特异性抗原与选自由人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)和小鼠GMCSF(mGMCSF)组成的组中的细胞因子的融合蛋白作为有效成分。

Description

包含融合蛋白的癌症治疗用药物组合物

技术领域

本发明涉及癌症治疗用药物组合物。

背景技术

目前，作为新的癌症治疗战略的“癌症疫苗”受到瞩目，对树突细胞疗法及肽疫苗等进行了各种研究，2011年4月美国食品药品监督管理局通过了对于针对前列腺癌的癌抗原PAP(前列腺酸性磷酸酶；prostatic acid phosphatase)的树突细胞疫苗Sipuleucel-T(Provenge(注册商标))(参照非专利文献1)。该药剂是采集患者的外周血单核细胞(PBMC)并添加作为融合蛋白的PAP-hGMCSF剂(在昆虫细胞中产生)培养约2天所制作的细胞药物，该细胞药物通过静脉注射给药至同一患者中。

作为促进树突细胞的分化、使抗癌免疫活化的细胞因子，报道了IL2、IL4、IL7、GMCSF(参照非专利文献2和3)。非专利文献2中记载了：IL2、IL4、IL7、GMCSF作用于人的外周血单核细胞(PBMC)，促进树突细胞的分化，使抗癌免疫活化；非专利文献3中记载了：IL2、IL4、IL7作用于人的外周血单核细胞(PBMC)，促进淋巴细胞的分化，使抗癌免疫活化。

但是，Sipuleucel-T所产生的改善生存期间的治疗效果仅限为4.1个月，开发出治疗效果更强的治疗法成为了紧迫的课题。另外，对于非专利文献2和非专利文献3所示的作为细胞因子的IL2、IL4、IL7和GMCSF，一直以来期待具有抗肿瘤效果，但实际上关于各个细胞因子并未报道在前列腺癌等癌症治疗中具有有效的治疗效果，各个细胞因子并未用于前列腺癌等癌症治疗的临床中。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Kantoff PW et al.,N Engl J Med.2010Jul 29；363(5):411-22

非专利文献2：Zou GM et al.,Eur Cytokine Netw.2002Apr-Jun；13(2):186-99

非专利文献3：Alderson MR et al.J Exp Med.1990Aug 1；172(2):577-87

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于将癌特异性抗原和细胞因子的融合蛋白用作癌的预防剂或治疗剂。特别是，目的在于提供一种癌的预防剂或治疗剂，其包含癌特异性抗原与细胞因子的融合蛋白作为有效成分，癌特异性抗原为前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、MAGEA4(人类黑色素瘤相关抗原4)、CD147或癌胚抗原(CEA)，细胞因子为人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)或小鼠GMCSF(mGMCSF)。

用于解决课题的方案

本发明人以前列腺癌为对象，对基于促进生物体的抗癌活性的癌症治疗法的开发进行了深入研究。确认了人PSA或人PAP与人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)或小鼠GMCSF(mGMCSF)的融合蛋白在生物体中对于抗癌免疫活性的效果。

结果发现：人PSA或PAP与小鼠来源的mGMCSF或mIL4的融合蛋白在前列腺癌小鼠模型的治疗实验中显示出抗癌效果；以及人PSA或PAP与小鼠来源的mGMCSF和mIL4的融合蛋白在小鼠来源的外周血单核细胞中具有树突细胞分化诱导能力。该结果表明，人PSA或PAP与小鼠来源的mGMCSF或mIL4的融合蛋白在小鼠前列腺癌模型的体内可增强对人PSA或PAP进行抗原提呈的小鼠树突细胞的作用，诱导表达这些抗原的癌细胞中的抗肿瘤效果。此外，本发明人发现，人PSA或PAP与人来源的hGMCSF或hIL4的融合蛋白在人来源的外周血单核细胞中具有树突细胞分化诱导能力，与在人前列腺癌小鼠模型中确认到的情况同样地，发现人PSA或PAP与人来源的hGMCSF或hIL4的融合蛋白在人前列腺癌患者中也可以诱导基于对人PSA或PAP的免疫的抗癌治疗效果。此外发现，人PSA或PAP与hIL2或hIL7的融合蛋白同样地在人前列腺癌患者中也可以诱导基于对人PSA或PAP的免疫的抗癌治疗效果。本发明人进一步对PSMA、MAGEA4、CD147和CEA也制作了与细胞因子的融合蛋白，发现在癌症患者中可以诱导基于对PSMA、MAGEA4、CD147或CEA的免疫的抗癌治疗效果，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[1]一种癌的预防或治疗用药物组合物，其包含癌特异性抗原与下述细胞因子的融合蛋白中的单独一种或两种以上作为有效成分，该细胞因子选自由人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)和小鼠GMCSF(mGMCSF)组成的组。

[2]如[1]所述的癌的预防或治疗用药物组合物，其中，癌特异性抗原为前列腺特异性抗原(PSA)或前列腺酸性磷酸酶(PAP)，所要预防或治疗的癌为前列腺癌。

[3]如[1]所述的癌的预防或治疗用药物组合物，其中，癌特异性抗原为前列腺特异性膜抗原(PSMA)，所要预防或治疗的癌为前列腺癌。

[4]如[1]所述的癌的预防或治疗用药物组合物，其中，癌特异性抗原为选自由MAGEA4、CD147和癌胚抗原(CEA)组成的组中的癌特异性抗原。

[5]如[4]所述的癌的预防或治疗用药物组合物，其中，所要预防或治疗的癌选自由脑·神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝细胞癌、口腔癌、淋巴瘤·白血病等血液癌、恶性淋巴瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、大肠癌、胆囊癌、结肠癌、胰腺癌、肛门·直肠癌、食道癌、宫颈癌等子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨瘤·骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤和间皮瘤组成的组。

[6]一种制备具有抗癌免疫活性的免疫活性细胞的方法，其包括以下步骤：在体外(in vitro)，在癌特异性抗原与选自由人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)和小鼠GMCSF(mGMCSF)组成的组中的细胞因子的融合蛋白中的单独一种或两种以上的存在下，对可分化为免疫活性细胞的细胞进行培养。

[7]如[6]所述的制备具有抗癌免疫活性的免疫活性细胞的方法，其中，癌特异性抗原为前列腺特异性抗原(PSA)或前列腺酸性磷酸酶(PAP)，所要预防或治疗的癌为前列腺癌。

[8]如[6]所述的制备具有抗癌免疫活性的免疫活性细胞的方法，其中，癌特异性抗原为前列腺特异性膜抗原(PSMA)，所要预防或治疗的癌为前列腺癌。

[9]如[6]所述的制备具有抗癌免疫活性的免疫活性细胞的方法，其中，癌特异性抗原为选自由MAGEA4、CD147和癌胚抗原(CEA)组成的组中的癌特异性抗原。

[10]如[9]所述的制备具有抗癌免疫活性的免疫活性细胞的方法，其中，所要预防或治疗的癌选自由脑·神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝细胞癌、口腔癌、淋巴瘤·白血病等血液癌、恶性淋巴瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、大肠癌、胆囊癌、结肠癌、胰腺癌、肛门·直肠癌、食道癌、宫颈癌等子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨瘤·骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤和间皮瘤组成的组。

[11]如[6]～[10]的任一项所述的制备具有抗癌免疫活性的免疫活性细胞的方法，其中，可分化为免疫活性细胞的细胞为由外周血、骨髓液或脐带血得到的单核细胞。

[12]如[6]～[10]的任一项所述的制备具有抗癌免疫活性的免疫活性细胞的方法，其中，可分化为免疫活性细胞的细胞为干细胞。

[13]如[6]～[12]的任一项所述的制备免疫活性细胞的方法，其中，免疫活性细胞为抗原提呈细胞或活化淋巴细胞。

[14]一种癌的预防或治疗用药物组合物，其包含利用[6]～[13]的任一项所述的方法所制备的免疫活性细胞。

[15]一种DNA构建体，其在具有以下所示的结构的3个构建体中的任一个插入基因的部分插入有编码以PSA-hIL2、PSA-hIL4、PSA-hIL7、PSA-hGMCSF、PSA-mIL4、PSA-mGMCSF、PAP-hIL2、PAP-hIL4、PAP-hIL7、PAP-hGMCSF、PAP-mIL4、PAP-mGMCSF、PSMA-hIL2、PSMA-hIL4、PSMA-hIL7、PSMA-hGMCSF、PSMA-mIL4、PSMA-mGMCSF、MAGEA4-hIL2、MAGEA4-hIL4、MAGEA4-hIL7、MAGEA4-hGMCSF、MAGEA4-mIL4、MAGEA4-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF、CEA-hIL2、CEA-hIL4、CEA-hIL7、CEA-hGMCSF、CEA-mIL4、CEA-mGMCSF、CEA1-hIL2、CEA1-hIL4、CEA1-hIL7、CEA1-hGMCSF、CEA1-mIL4、CEA1-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-hIL4、CEA2-hIL7、CEA2-hGMCSF、CEA2-mIL4和CEA2-mGMCSF表示的48种融合蛋白的DNA中的任一种：

[16]一种载体，其包含[15]所述的DNA构建体。

[17]一种癌症治疗用制剂，其包含[16]所述的载体。

[18]如[17]所述的癌症治疗用制剂，其用于治疗选自由脑·神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝细胞癌、口腔癌、淋巴瘤·白血病等血液癌、恶性淋巴瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、大肠癌、胆囊癌、结肠癌、胰腺癌、肛门·直肠癌、食道癌、宫颈癌等子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨瘤·骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤和间皮瘤组成的组中的癌。

[19]一种CD147参与的疾病的预防或治疗用药物组合物，其包含CD147与下述细胞因子的融合蛋白中的单独一种或两种以上作为有效成分，所述细胞因子选自由人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)和小鼠GMCSF(mGMCSF)组成的组。

[20]一种制备可用于CD147参与的疾病的预防或治疗的细胞的方法，其包括以下步骤：在体外(in vitro)，在CD147与选自由人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)和小鼠GMCSF(mGMCSF)组成的组中的细胞因子的融合蛋白中的单独一种或两种以上的存在下，对可分化为免疫活性细胞的细胞进行培养。

[21]如[19]所述的预防或治疗用药物组合物、或如[20]所述的制备可用于预防或治疗的细胞的方法，其中，CD147参与的疾病选自由肺疾病、恶性疾病、免疫相关疾病、心血管疾病、神经系统疾病、纤维化和感染症组成的组。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2012-032073号和日本国专利申请2012-126467号的说明书和/或附图所记载的内容。

发明的效果

PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147、CEA等癌特异性抗原与hIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSF的融合蛋白能够用于癌症的预防或治疗，在使用PSA、PAP或PSMA作为癌特异性抗原的情况下，能够用于前列腺癌的特异性预防或治疗。另外，在使用MAGEA4、CD147或CEA的情况下，能够用于大肠癌、膀胱癌、肺癌、胃癌等宽范围的癌种的预防或治疗。这些融合蛋白可以在生物体的内外提高免疫活性细胞的抗癌免疫活性(抗肿瘤活性)。该融合蛋白还可以直接给药至生物体而在生物体内提高树突细胞的抗癌免疫活性，也可以在融合蛋白的存在下对由生物体分离出的单核细胞或细胞毒性淋巴细胞、辅助T淋巴细胞、B淋巴细胞等淋巴细胞进行培养，制作在生物体外具有抗癌免疫活性的抗原提呈细胞或活化淋巴细胞，在将这些免疫活性细胞返回至生物体的间接体内疗法(ex vivo)中的细胞治疗中使用。此外，还可以利用本发明的融合蛋白，使用可分化为免疫活性细胞的干细胞，进行间接体内疗法的治疗。

在利用下述系统制造融合蛋白的情况下，可以在短时间内大量生产，该系统使用了具有下述结构的表达盒：至少在第1启动子的下游含有包含所要表达的蛋白质的基因(所要表达的基因)和聚A附加序列的DNA构建物，进而在该构建物的下游连结含有增强子或第2启动子。特别是，通过利用上述系统，可以在人细胞中高效地制作大量的对人安全的融合蛋白。

附图说明

图1是示出癌特异性抗原与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构的图(其1)。

图2是示出癌特异性抗原与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构的图(其2)。

图3-1是示出癌特异性抗原与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构的图(其3)。

图3-2是示出癌特异性抗原与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构的图(其4)。

图4-1是示出PSA与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图。

图4-2是示出PSA与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图(图4-1的续图)。

图5-1是示出PAP与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图。

图5-2是示出PAP与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图(图5-1的续图)。

图6-1是示出PSA或PAP与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的细胞因子(human IL2、human GMCSF和human IL7)的碱基序列的图。

图6-2是示出PSA或PAP与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的细胞因子(human IL4、mouse IL4和mouse GMCSF)的碱基序列的图。

图6-3是示出pIDT-SMART载体的全部碱基序列的图。

图7-1是示出对所制作的融合蛋白进行电泳和CBB染色后的结果的图。

图7-2是示出对由亲和纯化得到的融合蛋白进行电泳和CBB染色后的结果的图。

图7-3是示出所得到的融合蛋白溶液中的融合蛋白的浓度的图。

图8是示出人前列腺癌模型小鼠中经时血清中PSA或PAP的上升和肿瘤形成的图。图8a示出移植了PSA-RM9细胞的小鼠，图8b示出移植了PAP-RM9细胞的小鼠。

图9-1是示出使用了人前列腺癌模型小鼠的融合蛋白(腹腔内给药)的治疗效果的图。

图9-2是示出使用了人前列腺癌模型小鼠的融合蛋白(从尾静脉给药)的治疗效果的图。

图10-1是示出通过市售的hGMCSF蛋白和hIL4蛋白在人PBMC中的添加而在7天后诱导的人树突细胞的形态的图。

图10-2是示出在将PSA-mGMCSF与PSA-mIL4组合、或将PAP-mGMCSF与PAP-mIL4组合添加的情况下由小鼠外周血单核细胞(PBMC)诱导的树突细胞的出现率的图。

图10-3是示出在将PSA-hGMCSF与PSA-hIL4组合、或将PAP-hGMCSF与PAP-hIL4组合添加的情况下由人外周血单核细胞(PBMC)诱导的树突细胞的出现率的图。

图11是示出通过MTT分析对纯化的PSA-hGMCSF和PAP-hGMCSF在TF-1细胞中的细胞增殖作用进行解析的结果的图。

图12是示出对包含PSA或PAP的融合蛋白进行纯化(浓缩)、电泳、CBB染色后的结果的图。图12的a示出PSA-hGMCSF、PAP-hGMCSF、PSA-hIL2和PAP-hIL2的结果，图12的b示出PSA-hIL4、PAP-hIL4、PSA-hIL7和PAP-hIL7的结果。

图13-1是示出PSMA与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图。

图13-2是示出PSMA与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图(图13-1的续图)。

图13-3是示出PSMA与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图(图13-2的续图)。

图14-1是示出对PSMA-hGMCSF融合蛋白进行纯化、电泳、CBB染色后的结果的图。

图14-2是示出所得到的PSMA-hGMCSF融合蛋白溶液中的PSMA-hGMCSF融合蛋白的浓度的图。

图15是示出通过MTT分析对纯化的PSMA-hGMCSF在TF-1细胞中的细胞增殖作用进行解析的结果的图(还包括PSA-hGMCSF和PAP-hGMCSF的结果)。

图16-1是示出MAGEA4与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图。

图16-2是示出MAGEA4与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图(图16-1的续图)。

图16-3是示出MAGEA4与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图(图16-2的续图)。

图17-1是示出CD147与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图。

图17-2是示出CD147与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图(图17-1的续图)。

图18-1是示出对MAGEA4或CD147与细胞因子的融合蛋白进行纯化、电泳、CBB染色后的结果的图。

图18-2是示出所得到的MAGEA4或CD147与细胞因子的融合蛋白溶液中的融合蛋白的浓度的图。

图19-1是示出CEA与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图。

图19-2是示出CEA与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图(图19-1的续图)。

图19-3是示出CEA与细胞因子的融合蛋白的制作中所用的表达盒的结构和序列的图(图19-2的续图)。

图20是示出CEA和NCA的氨基酸序列的图。

图21是示出纯化后的融合蛋白的纯度的结果。图21的A示出CEA1与各细胞因子的融合蛋白的纯化前和纯化后的结果，图21的B示出CEA2与各细胞因子的融合蛋白的纯化前和纯化后的结果，图21的C示出PSMA与各细胞因子的融合蛋白的纯化后的结果。

图22是示出各种融合蛋白的纯化后的浓度的图。

图23-1是示出将PSA-hGMCSF和各种融合蛋白组合时的树突细胞的诱导的图。

图23-2是示出将PAP-hGMCSF和各种融合蛋白组合时的树突细胞的诱导的图。

图23-3是示出将PSMA-hGMCSF和各种融合蛋白组合时的树突细胞的诱导的图。

图23-4是示出将CD147-hGMCSF和各种融合蛋白组合时的树突细胞的诱导的图。

图23-5是示出将MAGEA4-hGMCSF和各种融合蛋白组合时的树突细胞的诱导的图。

图23-6是示出将CEA1-hGMCSF和各种融合蛋白组合时的树突细胞的诱导的图。

图23-7是示出将CEA2-hGMCSF和各种融合蛋白组合时的树突细胞的诱导的图。

图24是示出用流式细胞术对各种融合蛋白和将融合蛋白组合的情况下的树突细胞的诱导进行解析的结果的图。

图25-1是示出用流式细胞术对各种融合蛋白和将融合蛋白组合的情况下的细胞毒性T淋巴细胞(CD8阳性)的诱导进行解析的结果的图。

图25-2是示出用流式细胞术对各种融合蛋白和将融合蛋白组合的情况下的辅助T淋巴细胞(CD4阳性)的诱导进行解析的结果的图。

图25-3是示出用流式细胞术对各种融合蛋白和将融合蛋白组合的情况下的B淋巴细胞(CD19阳性)的诱导进行解析的结果的图。

图26是示出使用融合蛋白表现抗大肠癌的效果的实验的方案的图。

图27是示出融合蛋白对于大肠癌的效果的图。

图28是示出使用融合蛋白表现抗膀胱癌的效果的实验的方案的图。

图29是示出融合蛋白对于膀胱癌的效果的图。

图30是示出使用融合蛋白表现抗肺癌的效果的实验的方案的图。

图31是示出融合蛋白对于肺癌的效果的图。

图32是示出使用融合蛋白表现抗胃癌的效果的实验的方案的图。

具体实施方式

下面，详细说明本发明。

本发明涉及一种癌的预防或治疗用药物组合物，其包含下述融合蛋白作为有效成分，该融合蛋白为癌特异性抗原或在癌细胞中与正常细胞相比表达增大的抗原与选自由人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)和小鼠GMCSF(mGMCSF)组成的组中的细胞因子的融合蛋白。癌特异性抗原或在癌细胞中与正常细胞相比表达增大的抗原与上述细胞因子的融合蛋白中，与癌特异性抗原或在癌细胞中与正常细胞相比表达增大的抗原融合后的细胞因子具有原本具有的功能。本发明中，提及癌特异性抗原的情况下，还包括在癌细胞中与正常细胞相比表达增大的抗原。

作为本发明中使用的癌特异性抗原，可以举出前列腺癌中的人前列腺癌特异性抗原(PSA)、人前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性膜抗原(PSMA：prostate specificmembrane antigen)、大肠癌或消化器官癌中的癌胚抗原(CEA)、乳腺癌中的HER2/neu、恶性黑色素瘤(黑色素瘤)或其它各种癌中的MAGEA4等属于MAGE(黑色素瘤抗原)基因家族的抗原(MAGE)、白血病或各种癌中的WT1肽、肝细胞癌中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、各种癌中的MUC1(粘蛋白1)、hTERT(人端粒酶逆转录酶)、AKAP-4(激酶A锚定蛋白-4)、生存素(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing5，细胞凋亡抑制因子5抗体)、NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌1)、CD147等。

下面，以PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147和CEA为例，对本申请发明进行说明。基于PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147和CEA的说明，可以制作其它的癌特异性抗原与细胞因子的融合蛋白，并且可以将该融合蛋白用于癌症治疗。

PSA是在前列腺组织中特异性存在的分子量约为34,000的单链糖蛋白。血清PSA值在前列腺癌、前列腺肥大症、前列腺炎、其它前列腺疾病中上升，特别是在前列腺癌中强烈地表达。PAP存在于前列腺、红血球、血小板、白血球、脾脏、肝脏、肾脏、骨中，是作为在酸性溶液中水解磷酸酯的酶的磷酸酶的1种。PAP是在前列腺上皮细胞中生成的糖蛋白，是前列腺组织特异性组分，特别是在前列腺癌中强烈地表达。

前列腺特异性膜抗原(PSMA：prostate specific membrane antigen)蛋白在前列腺上皮特异性地表达，因前列腺癌而表达亢进。关于酶活性，在前列腺癌中也比正常组织和前列腺肥大症组织升高。在作为难治性前列腺癌的内分泌疗法抵抗型前列腺癌这种恶化的前列腺癌中，也在许多病例中确认到了表达。

黑色素瘤抗原(MAGE)基因家族是编码通过细胞毒性T细胞而特异性地识别的肿瘤退缩抗原的基因家族。MAGE基因形成了由MAGE-1至MAGE-12的12种基因构成的多基因(multigene)家族，MAGEA4包含于其中。该家族在正常组织中在睾丸·胎盘和伤口愈合过程的皮肤以外未见表达，在广泛种类的癌种中高频率地表达。具体来说，在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞癌、食道癌、脑肿瘤、血液癌等中的表达亢进。

CD147蛋白也被称为别名Bisigin、别名细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer)(EMMPRIN)，是27kDa的糖蛋白。CD147是增强癌细胞的胶原酶活性、参与癌细胞的细胞粘着的分子。CD147在多种癌细胞中高度表达，在周围的间充质细胞中诱导基质金属蛋白酶(MMP)-1,-2,-3等，强烈参与癌的浸润、转移、发展。作为CD147的表达亢进的癌种，可以举出膀胱癌、乳腺癌、肺癌、口腔癌、食道癌、皮肤癌、恶性淋巴瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝细胞癌等。

癌胚抗原(CEA：carcinoembryonic antigen)蛋白是肿瘤标记物之一，是与细胞粘着因子有关的糖蛋白。在大肠癌、直肠癌、甲状腺癌、食道癌、胃癌、乳腺癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、甲状腺髓样癌等广泛的癌种中表达亢进。CEA可以使用全长序列，也可以使用部分序列。作为部分序列，可以举出序列号17中示出氨基酸序列的CEA1、序列号19中示出氨基酸序列的CEA2。另外，CEA与氨基酸序列同源性高的其它蛋白质一同形成CEA家族，包含NCA(非特异性交叉反应抗原)和PSG(妊娠特异性糖蛋白)等。本发明中，也可以使用这些属于CEA家族的蛋白质，可以使用全长序列，也可以使用与上述CEA1或CEA2相当的片段。本发明中，在称为CEA的情况下，还包括CEA1和CEA2。另外，通过使用CEA，将属于上述CEA家族的蛋白质作为靶标，可以进行癌症治疗或对其它疾病进行免疫疗法。

融合蛋白的制作中所用的癌特异性抗原可以具有全长氨基酸序列，在癌特异性抗原为跨膜蛋白的情况下，也可以具有细胞外区域的氨基酸序列。例如，PSMA和CD147为跨膜蛋白，PSMA或CD147与细胞因子的融合蛋白可以使用将PSMA或CD147的细胞外区域与细胞因子融合而成的蛋白。

作为本发明的癌的预防或治疗用药物组合物中作为有效成分包含的融合蛋白的例子，可以举出选自由人前列腺癌特异性抗原(PSA)、人前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、MAGEA4、CD147和癌胚抗原(CEA)组成的组中的癌特异性抗原与选自由人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)和小鼠GMCSF(mGMCSF)组成的组中的细胞因子的融合蛋白。本发明中，例如，将PSA或PAP与上述各细胞因子的融合蛋白称为PSA-hIL2、PSA-hIL4、PSA-hIL7、PSA-hGMCSF、PSA-mIL4、PSA-mGMCSF、PAP-hIL2、PAP-hIL4、PAP-hIL7、PAP-hGMCSF、PAP-mIL4、PAP-mGMCSF。另外，将PSMA、MAGEA4、CD147或CEA与各细胞因子的融合蛋白分别称为PSMA-hIL2、PSMA-hIL4、PSMA-hIL7、PSMA-hGMCSF、PSMA-mIL4、PSMA-mGMCSF、MAGEA4-hIL2、MAGEA4-hIL4、MAGEA4-hIL7、MAGEA4-hGMCSF、MAGEA4-mIL4、MAGEA4-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF、CEA-hIL2、CEA-hIL4、CEA-hIL7、CEA-hGMCSF、CEA-mIL4、CEA-mGMCSF。

本发明包含这些36种融合蛋白和含有它们的药物组合物。另外，CEA可以使用CEA1或CEA2，将它们与各细胞因子的融合蛋白分别称为CEA1-hIL2、CEA1-hIL4、CEA1-hIL7、CEA1-hGMCSF、CEA1-mIL4、CEA1-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-hIL4、CEA2-hIL7、CEA2-hGMCSF、CEA2-mIL4、CEA2-mGMCSF。本发明还包括这些融合蛋白和含有它们的药物组合物。除了与CEA1或CEA2的融合蛋白外，还包含48种融合蛋白。

为了得到上述融合蛋白，将编码PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147或CEA的基因与编码上述细胞因子的基因用框连结，并使其表达即可。基因的连结可以通过通常的基因重组的手法进行。此时，可以导入适当的限制位点来进行。另外，不使融合的基因之间出现终止密码子。对融合的基因之间的距离没有限定，可以在两者之间包含接头。上述PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147或CEA可以在细胞因子的氨基酸序列的N端侧融合，也可以在C端侧融合。

可以将如此制作的融合基因插入可获得的适当的表达载体中，使其表达，然后回收、纯化目标融合蛋白。另外，此时，也可以在无细胞系统(cell-free系统)中表达。

作为载体，只要是质粒、噬菌体、病毒等能够在宿主细胞中复制的载体则可以使用任意载体。载体包含复制起点、选择标记物、启动子，根据需要还可以包含增强子、转录终止序列(终止子)、核糖体结合位点、多聚腺苷酸信号等。

DNA向载体中的导入可以利用公知的方法进行。对于载体，希望包含其内部具有各种限制位点的多聚接头，或者包含单一的限制位点。可以将载体中的特定限制位点用特定的限制酶切断，在其切断部位插入DNA。可以将包含融合基因的表达载体用于适当的宿主细胞的转化，在宿主细胞中表达、产生上述融合基因所编码的融合蛋白。

作为宿主细胞，可以举出大肠杆菌、链霉菌、枯草菌等细菌细胞、真菌细胞、面包酵母、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳类细胞等。

转化可以利用氯化钙、磷酸钙、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、脂质转染等公知的方法进行。

所得到的重组融合蛋白可以通过各种分离纯化方法进行分离·纯化。例如，可以将硫铵沉淀、凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色谱等单独或适宜组合使用。此时，在表达产物作为与GST等的融合蛋白表达的情况下，也可以利用与目标蛋白质融合的蛋白质或肽的性质来进行纯化。例如在作为与GST的融合蛋白表达的情况下，由于GST对谷胱甘肽具有亲和性，因而可以通过使用将谷胱甘肽与载体结合的柱的亲和色谱来高效地进行纯化。另外，在作为与组氨酸标签的融合蛋白表达的情况下，由于具有组氨酸标签的蛋白质与螯合柱结合，因而可以使用螯合柱进行纯化。

本发明人开发了基因表达提高的基因表达系统，优选利用该基因表达系统制作上述融合蛋白。该基因表达系统记载于WO2011/062298号公报中，可以根据该公报的记载来制造本发明的融合蛋白。

具体来说，可以使用上述基因表达系统如下表达融合蛋白。

上述基因表达系统中，使用具有下述结构的表达盒，在该表达盒的多克隆位点插入希望表达的基因而使该基因表达，该结构为：至少在第1启动子的下游含有包含所要表达的蛋白质的基因(所要表达的基因)和聚A附加序列的DNA构建物，进而在该构建物的下游连结含有增强子或第2启动子。此时，利用限制酶识别的序列，将所要表达的基因插入多克隆位点(插入部位)即可。此时，可以在多克隆位点插入编码PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147或CEA等癌特异性抗原的DNA与编码细胞因子的DAN连结而成的DNA，也可以预先在多克隆位点的上游或下游插入编码PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147或CEA等癌特异性抗原的DNA，在多克隆位点仅插入编码希望制作与该癌特异性抗原的融合蛋白的细胞因子的DNA。

更具体来说，上述表达盒具有以下结构：按照(i)和(ii)的顺序包含(i)依次连结第1启动子、所要表达的基因和聚A附加序列而成的DNA构建物和(ii)增强子或在上游连结有UAS的增强子，在聚A附加序列的紧随下游连结有增强子或上游连结有UAS的增强子。在使用该表达盒的情况下，与将增强子插入第1启动子的上游时相比，基因的蛋白质表达增强。另外，优选具有以下结构：在连结的增强子的下游不具有其它基因表达用的机构，用第1启动子和增强子夹持所要表达的基因。对所使用的启动子没有限定，优选使用CMV i启动子、SV40启动子、hTERT启动子、β肌动蛋白启动子或CAG启动子。启动子可以使用具有启动子活性的最小序列构成的核心启动子的部分。

对聚A附加序列(多聚腺苷酸化序列、polyA)的来源没有限定，可以举出生长激素基因来源的聚A附加序列、例如牛生长激素基因来源的聚A附加序列或人生长激素基因来源的聚A附加序列、SV40病毒来源的聚A附加序列、人或兔的β球蛋白基因来源的聚A附加序列等。通过使表达用盒包含聚A附加序列，转录效率增大。

对在聚A附加序列的下游连结的增强子也没有限定，可以优选使用CMV增强子、SV40增强子、hTERT(端粒酶逆转录酶)增强子等。增强子可以为1种，也可以将2个以上的相同增强子使用复数个，或者将复数个不同的增强子组合使用。作为一例，可以举出依次连结hTERT增强子、SV40增强子和CMV增强子而成的增强子。在增强子的紧随上游可以连结有UAS。UAS是指GAL4基因的结合区域，通过在后面插入GAL4基因，蛋白表达提高。

进而在包含编码所要表达的蛋白质的DNA和聚A附加序列的DNA构建物的上游可以连结有多个增强子、例如1～4个增强子。对在该上游连结的增强子没有限定，优选CMV增强子。例如，可以举出将4个CMV增强子连结而成的4×CMV增强子等。若将增强子插入由“启动子-所要表达的基因-聚A附加序列”构成的DNA构建物的紧随下游，与现有的一般基因表达系统相比，能够使所要表达的基因强劲地进行蛋白质表达。

此外，在编码所要表达的蛋白质的DNA的紧随上游可以连结有RU5’。紧随上游是指不夹杂其它具有特定功能的单元而直接连结，但作为接头可以在其间包含短的序列。RU5'是HTLV来源的LTR，是通过插入而使蛋白质表达提高的单元(Mol.Cell.Biol.,Vol.8(1),p.466-472,1988)。

此外，可以在表达用盒的最上游连结有SV40-ori。SV40-ori为SV40基因的结合区域，通过在后面插入SV40基因使蛋白质表达提高。

上述各单元需要功能性地连结。此处，功能性地连结是指按照各个单元可发挥其功能、所要表达的基因的表达得以增强的方式进行连结。

作为插入表达用盒的载体，可以举出质粒、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体等病毒载体及生物降解性聚合物等非病毒载体。利用感染、电穿孔等公知的方法将导入有上述表达用盒的载体导入细胞即可。

另外，此时可以使用公知的转染试剂进行导入。

通过将插入有本发明的表达用盒的载体导入细胞，对该细胞进行转染，可以在该细胞中表达目标基因，产生目标蛋白质。为了导入本发明的表达盒并产生目标蛋白质，可以使用真核细胞或原核细胞系。作为真核细胞，可以举出例如所建立的哺乳类细胞系、昆虫细胞系、丝状真菌细胞和酵母细胞等的细胞等，作为原核细胞，可以举出例如大肠杆菌、枯草菌、短芽孢杆菌属细菌等的细菌细胞。优选使用Hela细胞、HEK293细胞、CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、Vero细胞等哺乳类细胞。特别是，通过利用上述系统，可以在人细胞中高效地制作大量的融合蛋白。在体外或体内对转化后的上述宿主细胞进行培养，可以产生作为目标的蛋白质。宿主细胞的培养根据公知的方法进行。例如，作为培养液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等公知的培养用培养基。对于表达的蛋白质，在为分泌蛋白质的情况下，可以利用公知的方法从培养液中进行纯化，在为非分泌蛋白质的情况下，可以利用公知的方法从细胞提取物中进行纯化。在表达、生产目标蛋白质的情况下，可以将包含不同目标基因的2个以上的载体同时转染到细胞，从而进行生产。通过这样，可以一次产生2种以上的蛋白质。

此外，为了使表达的融合蛋白分泌到宿主细胞外，可以在融合蛋白上连结编码信号肽的DNA。作为编码信号肽的DNA，可以使用编码PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147或CEA等癌特异性抗原的信号肽的DNA，优选使用编码REIC/Dkk-3基因的信号肽的DNA，通过使用该信号肽，即使在使用293细胞等哺乳类细胞作为宿主细胞的情况下，也能够以分泌到细胞外的状态得到大量的融合蛋白。REIC/Dkk-3基因的碱基序列例如公开于WO2008/050898中。另外，也可以预先在上述表达盒的多克隆位点的上游导入编码PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147或CEA等癌特异性抗原的DNA。通过在多克隆位点插入编码细胞因子的DNA，可以利用上述表达系统制作PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147或CEA等癌特异性抗原与细胞因子的融合蛋白。

将这样的表达盒的结构的例子示于图1、图2、图3-1和图3-2。本发明还包括一种DNA构建体，其在图1、图2、图3-1和图3-2所示的表达盒的插入基因的部分插入有编码以PSA-hIL2、PSA-hIL4、PSA-hIL7、PSA-hGMCSF、PSA-mIL4、PSA-mGMCSF、PAP-hIL2、PAP-hIL4、PAP-hIL7、PAP-hGMCSF、PAP-mIL4、PAP-mGMCSF、PSMA-hIL2、PSMA-hIL4、PSMA-hIL7、PSMA-hGMCSF、PSMA-mIL4、PSMA-mGMCSF、MAGEA4-hIL2、MAGEA4-hIL4、MAGEA4-hIL7、MAGEA4-hGMCSF、MAGEA4-mIL4、MAGEA4-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF、CEA-hIL2、CEA-hIL4、CEA-hIL7、CEA-hGMCSF、CEA-mIL4、CEA-mGMCSF、CEA1-hIL2、CEA1-hIL4、CEA1-hIL7、CEA1-hGMCSF、CEA1-mIL4、CEA1-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-hIL4、CEA2-hIL7、CEA2-hGMCSF、CEA2-mIL4、CEA2-mGMCSF表示的48种融合蛋白中的任一种的DNA。此外，本发明还包括含有该构建体的质粒、载体。此外，本发明还包括含有这些质粒、载体的可用于基因治疗的作为癌症治疗用制剂的药物制剂。

图4-1和图4-2中示出包含编码PSA的DNA的表达盒的序列(序列号1)，图5-1和图5-2中示出包含编码PAP的DNA的表达盒的序列(序列号2)。此外，图13-1、图13-2和图13-3中示出包含编码PSMA的DNA的表达盒的序列(序列号10)，图16-1、图16-2和图16-3中示出包含编码MAGEA4的DNA的表达盒的序列(序列号11)，图17-1和图17-2中示出包含编码CD147的DNA的表达盒的序列(序列号12)，图19-1、图19-2和图19-3中示出包含编码CEA的DNA的表达盒的序列(序列号13)。

如此得到的癌特异性抗原与各细胞因子的融合蛋白的作用基于：癌特异性抗原通过融合后的各细胞因子的受体而进入抗原提呈前体细胞(单核细胞等)、以及各细胞因子自身所具有的抗癌免疫活化功能。

下面，对癌特异性抗原为PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147或CEA时的作用和用途进行详细说明。

在使用PSA作为癌特异性抗原的情况下，对于表达PSA的人前列腺癌的治疗和复发预防有用。关于PSA与细胞因子的融合蛋白，在给与了融合蛋白的待测体的体内，树突细胞等抗原提呈细胞将PSA提呈到其它免疫活性细胞，使以PSA为抗原的免疫活化，其结果可以将针对表达PSA的癌细胞的免疫活化，可以使前列腺癌肿瘤缩小。关于PSA与各细胞因子的融合蛋白，具体来说，PSA-hGMCSF作用于人PBMC中的单核细胞，促进向能够抗原提呈PSA的树突细胞的分化；PSA-hIL4作用于人PBMC中的单核细胞和淋巴细胞，促进能够抗原提呈PSA的树突细胞的分化，同时将具有抗癌作用的淋巴细胞活化；PSA-hIL2作用于人PBMC中的淋巴细胞和单核细胞，将具有抗癌作用的淋巴细胞活化，同时促进能够抗原提呈PSA的树突细胞的分化；PSA-hIL7作用于人PBMC中的淋巴细胞和单核细胞，将具有抗癌作用的淋巴细胞活化，同时促进能够抗原提呈PSA的树突细胞的分化。

在使用PAP作为癌特异性抗原的情况下，对于表达PAP的人前列腺癌的治疗和复发预防有用。关于PAP与细胞因子的融合蛋白，在给与了融合蛋白的待测体的体内，树突细胞等抗原提呈细胞将PAP提呈到其它免疫活性细胞，使以PAP为抗原的免疫活化，其结果可以将针对表达PAP的癌细胞的免疫活化，可以使前列腺癌肿瘤缩小。关于PAP与各细胞因子的融合蛋白，具体来说，PAP-hGMCSF作用于人PBMC中的单核细胞，促进向能够抗原提呈PAP的树突细胞的分化；PAP-hIL4作用于人PBMC中的单核细胞和淋巴细胞，促进能够抗原提呈PAP的树突细胞的分化，同时将具有抗癌作用的淋巴细胞活化；PAP-hIL2作用于人PBMC中的淋巴细胞和单核细胞，将具有抗癌作用的淋巴细胞活化，同时促进能够抗原提呈PAP的树突细胞的分化；PAP-hIL7作用于人PBMC中的淋巴细胞和单核细胞，将具有抗癌作用的淋巴细胞活化，同时促进能够抗原提呈PAP的树突细胞的分化。

在使用PSMA作为癌特异性抗原的情况下，对于表达PSMA的人前列腺癌的治疗和复发预防有用。关于PSMA与细胞因子的融合蛋白，在给与了融合蛋白的待测体的体内，树突细胞等抗原提呈细胞将PSMA提呈到其它免疫活性细胞，使以PSMA为抗原的免疫活化，其结果可以将针对表达PSMA的癌细胞的免疫活化，可以使前列腺癌肿瘤缩小。关于与各细胞因子的融合蛋白的作用效果，与PSA和PAP相同。

在使用MAGEA4作为癌特异性抗原的情况下，对于表达MAGEA4的黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞癌、食道癌、脑肿瘤、血液癌等广泛种类的癌种的治疗和复发预防有用。关于MAGEA4与细胞因子的融合蛋白，在给与了融合蛋白的待测体的体内，树突细胞等抗原提呈细胞将MAGEA4提呈到其它免疫活性细胞，使以MAGEA4为抗原的免疫活化，其结果可以将针对表达MAGEA4的癌细胞的免疫活化，可以使前列腺癌肿瘤缩小。关于与各细胞因子的融合蛋白的作用效果，与PSA和PAP相同。

在使用CD147作为癌特异性抗原的情况下，对于表达CD147的膀胱癌、乳腺癌、肺癌、口腔癌、食道癌、皮肤癌、恶性淋巴瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝细胞癌等广泛癌种的治疗和复发预防有用。关于CD147与细胞因子的融合蛋白，在给与了融合蛋白的待测体的体内，树突细胞等抗原提呈细胞将CD147提呈到其它免疫活性细胞，使以CD147为抗原的免疫活化，其结果可以将针对表达CD147的癌细胞的免疫活化，可以使前列腺癌肿瘤缩小。关于与各细胞因子的融合蛋白的作用效果，与PSA和PAP相同。

在使用CEA作为癌特异性抗原的情况下，对于表达CEA的大肠癌、直肠癌、甲状腺癌、食道癌、胃癌、乳腺癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、甲状腺髓样癌等广泛癌种的治疗和复发预防有用。关于CEA与细胞因子的融合蛋白，在给与了融合蛋白的待测体的体内，树突细胞等抗原提呈细胞将CEA提呈到其它免疫活性细胞，使以CEA为抗原的免疫活化，其结果可以将针对表达CEA的癌细胞的免疫活化，可以使前列腺癌肿瘤缩小。关于与各细胞因子的融合蛋白的作用效果，与PSA和PAP相同。

另外，在代替hIL4而使用小鼠IL4(mIL4)的情况下，即使在待测体为人时也可发挥与上述PSA-hIL4或PAP-hIL4同样的作用；在代替hGMCSF而使用小鼠GMCSF(mGMCSF)的情况下，即使在待测体为人时也可发挥与上述PSA-hGMCSF或PAP-hGMCSF同样的作用。使用PSMA、MAGEA4、CD147或CEA作为癌特异性抗原的情况也相同。

可以通过将上述PSA或PAP与细胞因子的融合蛋白分别单独或组合复数个而直接给药(皮下·肌肉内注射、静脉内注射等)至前列腺癌患者，从而作为前列腺癌治疗剂使用。组合时可以将细胞因子相同的融合蛋白(癌特异性抗原不同)的物质彼此组合，或者可以将癌特异性抗原相同的融合蛋白(细胞因子不同)的物质彼此组合。例如，可以将PSA-hIL2、PSA-hIL4、PSA-hIL7、PSA-hGMCSF、PSA-mIL4、PSA-mGMCSF、PAP-hIL2、PAP-hIL4、PAP-hIL7、PAP-hGMCSF、PAP-mIL4和PAP-mGMCSF这12种任意组合2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种或12种而用于前列腺癌治疗。此外，作为前列腺癌的治疗剂，除了PSA或PAP与细胞因子的融合蛋白外还可以使用PSMA与细胞因子的融合蛋白，可以单独使用，也可以和PSA或PAP与细胞因子的融合蛋白组合使用。例如，可以在上述PSA或PAP与细胞因子的12种融合蛋白中加上PSMA-hIL2、PSMA-hIL4、PSMA-hIL7、PSMA-hGMCSF、PSMA-mIL4和PSMA-mGMCSF这6种融合蛋白，将这18种任意组合2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种或18种，从而用于前列腺癌治疗。

此外，也可以将MAGEA4、CD147或CEA与各种细胞因子的融合蛋白组合使用。例如，可以将MAGEA4-hIL2、MAGEA4-hIL4、MAGEA4-hIL7、MAGEA4-hGMCSF、MAGEA4-mIL4、MAGEA4-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF、CEA-hIL2、CEA-hIL4、CEA-hIL7、CEA-hGMCSF、CEA-mIL4、CEA-mGMCSF、CEA1-hIL2、CEA1-hIL4、CEA1-hIL7、CEA1-hGMCSF、CEA1-mIL4、CEA1-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-hIL4、CEA2-hIL7、CEA2-hGMCSF、CEA2-mIL4、CEA2-mGMCSF这30种任意组合2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种或30种而用于各种癌症治疗。

另外，也可以将这些融合蛋白制剂分别单独或组合两种以上添加到由人的外周血、骨髓液、脐带血等得到的单核细胞等血液系细胞的培养液中进行培养，在exvivo(生物体外)使单核细胞和淋巴细胞等同时活化后，将这些活化后的抗癌免疫细胞给药至患者体内，进行前列腺癌等的癌症治疗。该方法中，可以通过对PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147、CEA等癌特异性抗原与细胞因子的融合蛋白和由人的外周血等得到的PBMC等血液系细胞进行培养，从而制备包含具有抗肿瘤活性的树突细胞等抗原提呈细胞或细胞毒性T淋巴细胞、辅助T淋巴细胞、B淋巴细胞等活化淋巴细胞的免疫活性细胞。本发明还包括使用这些融合蛋白在体外(in vitro)制备具有基于强大的抗原提呈能力的抗肿瘤活性的树突细胞的方法。如此得到的树突细胞提呈PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147、CEA等癌特异性抗原，在给药至生物体时显示出抗癌免疫活性。本发明中，将具有抗癌免疫活性的树突细胞称为抗癌免疫活化树突细胞，上述融合蛋白也可以作为树突细胞的抗癌免疫活化剂使用。该情况下，使用希望预防或治疗癌的待测体本人的血液系细胞，并将处理后的细胞返回至该待测体即可。此外，代替上述血液系细胞，也可以使用可分化为作为血液系细胞的免疫活性细胞的细胞、即干细胞。作为这样的细胞，可以举出诱导多能干细胞、胚性干细胞(ES细胞)、包括骨髓中的造血干细胞的血球系干细胞、间充质干细胞、各种组织特异性的干细胞及其它多能性干细胞。在使用这些干细胞的情况下，对于干细胞，可以在活体外(ex vivo)处理本发明的融合蛋白，将处理后的干细胞用于免疫疗法。

由人的外周血、骨髓液、脐带血等得到的单核细胞等血液系细胞、以及可分化为上述血液系细胞的细胞均可分化为免疫活性细胞，因而本发明中将这些细胞称为可分化为免疫活性细胞的细胞。

如上所述，本申请发明还包括下述抗癌免疫疗法，其包括以下步骤：向通过血浆分离置换法(apheresis)从待测体采集的血液系细胞中添加本发明的融合蛋白进行培养，再次返回到该待测体体内。

本发明中，将抗原蛋白或表达抗原蛋白的细胞作为治疗靶标，但作为针对各靶标的免疫的活化机制，能够通过各融合蛋白(组)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CD8阳性)和B淋巴细胞(CD19阳性)这两者是很重要的。即，可以期待对于癌抗原(在CD147的情况下，不仅作为癌抗原，还作为广泛疾病的病情的原因·关联抗原)的细胞性免疫[基于细胞毒性T淋巴细胞(CD8阳性)的作用]和体液免疫[基于B淋巴细胞(CD19阳性)所致的抗体依赖性细胞毒效应(ADCC)等抗体功能的作用]这两者的作用的活化。另外，基于各融合蛋白(组)的树突细胞(CD86阳性)和辅助T淋巴细胞(CD4阳性)的诱导有助于这些细胞性免疫和体液免疫两者的活化。

如上所述，在使用PSA、PAP或PSMA作为癌特异性抗原的情况下，作为预防或治疗对象的癌为前列腺癌，通过选择上述MAGEA4、CD147、CEA等癌特异性抗原，脑·神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝细胞癌、口腔癌、淋巴瘤·白血病等血液癌、恶性淋巴瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、大肠癌、胆囊癌、结肠癌、胰腺癌、肛门·直肠癌、食道癌、宫颈癌等子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨瘤·骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、间皮瘤等成为对象。

另外，CD147是在各种组织的细胞上表达的免疫球蛋白超家族的成员，参与了胎儿发育、视网膜功能、T细胞的成熟等。CD147在肿瘤、子宫内膜、胎盘、皮肤和接受血管生成的区域内表达，刺激基质金属蛋白酶(MMP)和VEGF产生。CD147被单核细胞分化所诱导，在人动脉粥样化病内表达。CD147还藉由肿瘤周围的间质细胞所致的MMP和尿激酶型纤溶酶原活化因子系的诱导，参与促进不同的肿瘤型的浸润和转移。此外，CD147还参与血管生成、抗脱落凋亡、乳酸释放、多药抗性、和癌细胞中的细胞增殖。CD147的过剩表达和功能的过剩还与炎症反应、肺纤维化、类风湿关节炎、红斑狼疮、心力衰竭、阿尔茨海默氏病、以及淋巴细胞内的人免疫缺陷病毒和冠状病毒的感染性循环等其它病理过程有关。这样，CD147不仅在癌细胞中特异性地表达，还参与癌以外的各种疾病。即，CD147与肿瘤细胞所致的由成神经细胞的MMP的刺激、VEGF的释放、和血管生成的促进等恶性疾病有关，通过使用本发明的与CD147的融合蛋白，能够抑制CD147的生物活性，从而能进行CD147活性参与发病的疾病的治疗或预防。因此，在使用CD147的情况下，以成为癌以外的疾病的原因的细胞群作为靶标，可以广泛地治疗该疾病。关于各种疾病，报道了CD147的存在、表达、表达提高、活化等与该疾病的病情的发生、维持、恶化有关的内容(例如，WO2010/036460)。作为CD147参与的疾病，除了癌以外，还可以举出血栓形成性疾病(心肌梗塞、脑梗塞等)、COPD、MS、ALS、炎性疾病、疟疾、肝硬化、作为治疗希望抑制Treg的疾病、系统性硬化症(SS)、类风湿关节炎、阿尔茨海默氏病等。

具体来说，作为与本发明的CD147的融合蛋白的CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF可以单独或组合用于以下列举的疾病或状态的治疗或预防中。

另外，也可以将CD147的融合蛋白制剂分别单独或组合两种以上添加到由人的外周血、骨髓液、脐带血等得到的单核细胞等血液系细胞的培养液中进行培养，在ex vivo(生物体外)使单核细胞和淋巴细胞等同时活化后，将这些活化后的细胞给药至患者体内，进行CD147参与的疾病的治疗。该方法中，可以通过对CD147与细胞因子的融合蛋白和由人的外周血等得到的PBMC等血液系细胞进行培养，从而制备包含以表达CD147的细胞为靶标的树突细胞等抗原提呈细胞或细胞毒性T淋巴细胞、辅助T淋巴细胞、B淋巴细胞等活化淋巴细胞的免疫活性细胞。本发明还包括使用CD147的融合蛋白在体外(in vitro)制备基于强大的抗原提呈能力的以表达CD147的细胞为靶标的树突细胞的方法。如此得到的树突细胞提呈CD147，在给药至生物体时显示出攻击表达CD147的细胞的活性。该情况下，使用希望预防或治疗CD147参与的疾病的待测体本人的血液系细胞，并将处理后的细胞返回至该待测体即可。此外，代替上述血液系细胞，也可以使用可分化为作为血液系细胞的免疫活性细胞的细胞、即干细胞。作为这样的细胞，可以举出诱导多能干细胞、胚性干细胞(ES细胞)、包括骨髓中的造血干细胞的血球系干细胞、间充质干细胞、各种组织特异性的干细胞及其它多能性干细胞。在使用这些干细胞的情况下，对于干细胞，可以在活体外(ex vivo)处理本发明的CD147的融合蛋白，将处理后的干细胞用于免疫疗法。

由人的外周血、骨髓液、脐带血等得到的单核细胞等血液系细胞、以及可分化为上述血液系细胞的细胞均可分化为免疫活性细胞，因而本发明中将这些细胞称为可分化为免疫活性细胞的细胞。

如上所述，本申请发明还包括下述疗法，其包括以下步骤：向通过血浆分离置换法(apheresis)从待测体采集的血液系细胞中添加本发明的CD147的融合蛋白进行培养，再次返回到该待测体体内。

作为能够在CD147参与的疾病、状态的治疗或预防中应用的CD147参与的状态，可以举出例如组织再增殖、新生物疾病、转移性疾病、和纤维化状态下的细胞迁移和组织重构所中介的疾病或状态。这些疾病和状态包括恶性和神经系统的疾病等。CD147关联的状态包括炎性或自我免疫疾病、心血管疾病、或感染症。另外，本发明的与CD147的融合蛋白对血管形成参与的疾病的治疗有用，例如对眼病、肿瘤性疾病、再狭窄等组织再形成及某种细胞类型的增殖、特别是上皮和鳞状细胞癌的治疗有用。此外，还可以用于动脉粥样化病性动脉硬化症、再狭窄、癌转移、类风湿关节炎、糖尿病性视网膜症及黄斑变性症的治疗。此外，还可以用于在骨质疏松症中观察到的、或一部分肿瘤导致的PTHrP过度表达的结果所产生的骨吸收及骨分解的预防或治疗。此外，还可以用于特发性肺纤维化、糖尿病性肾病、肝炎、和肝硬化等纤维化的治疗或预防。

此外，与CD147的融合蛋白还可以用于以下疾病的治疗。

肺病

肺炎；肺脓肿；粉尘、气体或飞沫的形态的作用物质为原因的职业性肺病；哮喘、阻塞性纤维性细支气管炎、呼吸衰竭、过敏性肺炎(外源性过敏性肺泡炎)、过敏性支气管肺曲霉菌病、和包含药物反应的肺的过敏性疾病；成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺出血肾炎综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性间质性肺疾病(例如特发性肺纤维化和结节病、脱屑性间质性肺炎、急性间质性肺炎、呼吸性细支气管炎伴间质性肺病、伴有气质性肺炎的特发性阻塞性支气管炎、淋巴细胞性间质性肺炎、朗格汉斯细胞肉芽肿、特发性肺含铁血黄素沉着症)；急性支气管炎、肺泡蛋白沉积症、支气管扩张、胸膜疾病、肺不张、囊性纤维化、肺肿瘤、和肺栓塞。

恶性疾病

白血病、急性白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、B细胞、T细胞或FAB ALL、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤原发疾病或转移性疾病之类的实体瘤、卡波济氏肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、肾细胞癌、包含间皮瘤的肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增生症、恶性的副肿瘤综合征/高钙血症、腺癌、鳞状细胞癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、特别是转移性黑色素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌相关骨吸收、和癌相关骨痛。

免疫相关疾病

类风湿关节炎、幼年型类风湿关节炎、全身发作性青少年类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎(ankylosing spondilitis)、胃溃疡、血清阴性关节病、变形性关节病、炎性肠病、溃疡性大肠炎、系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、特发性肺间质纤维化、系统性血管炎/韦格纳肉芽肿、结节病、睾丸炎/输精管还原手术(vasectomy reversal procedure)、过敏性/特应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、过敏性接触性皮炎、过敏性结膜炎、过敏性肺炎、移植物、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身炎症反应综合征、脓毒病综合征、革兰氏阳性菌脓毒症、革兰氏阴性脓毒症、培养阴性脓毒症、真菌脓毒症、中性粒细胞减少发热、尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、创伤/出血、烧伤、电离辐射暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合症、类风湿性关节炎、酒精性肝炎、慢性炎性病变、结节病、克隆氏病(Crohn’s pathology)、镰状细胞贫血、糖尿病、肾病、特应性疾病、过敏反应、过敏性鼻炎、花粉症(枯草热)、常年性鼻炎、结膜炎、子宫内膜异位、哮喘、荨麻疹、全身性过敏反应、皮炎、恶性贫血、溶血性疾病、血小板减少症、任意器官或组织的移植物排斥、肾脏移植排斥、心脏移植排斥、肝脏移植排斥、胰脏移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、移植皮肤排斥、软骨移植排斥、骨移植物排斥、小肠移植排斥、胎儿胸腺移植排斥、甲状旁腺移植排斥、任意器官或组织的异种移植排斥、同种异体移植物排斥、抗受体过敏反应、格雷夫斯病、雷诺氏病、B型胰岛素抵抗糖尿病、哮喘、重症肌无力、抗体介导的细胞毒性、III型超敏反应、系统性红斑狼疮，POEMS综合征(多发性神经病、脏器肿大、内分泌失调、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、抗磷脂综合征、天疱疮、硬皮病、混合性结缔组织病、原发性阿狄森氏病、糖尿病、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化(primary billiary cirrhosis)、白癜风、血管炎、MI心切开术后综合征(post-MI cardiotomy syndrome)、IV型超敏反应、接触性皮炎、过敏性肺炎、同种异体移植物排斥、由于细胞内微生物导致的肉芽肿、药物过敏、代谢病/特发病、威尔逊氏病、血色素沉着症(hemachromatosis)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖尿病性视网膜病、桥本氏甲状腺炎、骨质疏松症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价(hypothalamic-pituitary-adrenal axis evaluation)、原发性胆汁性肝硬化、甲状腺炎、脑脊髓炎、恶病质、囊性纤维化、新生儿慢性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(familial hematophagocyticlymphohistiocytosis)、皮肤病学状况、牛皮癣、斑秃、肾病综合征、肾炎、肾小球肾炎、急性肾功能衰竭、血液透析、尿毒症、中毒、先兆子痫、OKT3疗法、抗CD3疗法、细胞因子疗法、化学疗法、放射疗法(例如哮喘、贫血、恶病质等)、慢性水杨酸盐中毒。

心血管疾病

心脏顿抑综合征(cardiac stun syndrome)、心肌梗死，充血性心脏衰竭、中风、缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病性动脉硬化性疾病(diabeticateriosclerotic disease)、高血压、动脉性高血压、肾血管性高血压、晕厥、休克、心血管系统梅毒、心脏衰竭、肺源性心脏病、原发性肺动脉高血压、心律失常、心房异位搏动、心房扑动、心房颤动(持续性或突发性)、灌注后综合征、心肺分流术炎症反应、紊乱性或多源性房性心动过速、规律性窄QRS心动过速(regular narrow QRStachycardia)、特殊心律失常(specific arrythmias)、心室颤动、希氏束心律失常(His bundlearrythmias)、房室性传导阻滞、束支传导阻滞、心肌缺血性疾病、冠状动脉疾病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张型充血性心肌病、限制性心肌病、心脏瓣膜疾病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动脉或周围性动脉瘤、主动脉壁夹层形成、主动脉炎症、腹主动脉及其分支闭塞、外周血管病症、闭塞性动脉病症、周围动脉粥样硬化疾病、血栓闭塞性脉管炎、功能性外周动脉疾病、雷诺氏现象和疾病、手足发绀、红斑性肢痛、静脉疾病、血栓静脉炎、静脉曲张、动静脉瘘、淋巴水肿(lymphederma)、脂肪水肿、不稳定心绞痛、再灌注损伤、泵后综合征(post pump syndrome)、缺血再灌注损伤。

神经系统疾病

神经变性疾病、多发性硬化、偏头痛、AIDS痴呆综合征、多发性硬化和急性横贯性脊髓炎(acute transverse myelitis)等脱髓鞘性疾病；皮质脊髓系统损害等锥体束外和小脑的疾病；基底核的疾病或小脑疾病；亨廷顿氏舞蹈病和老年性舞蹈病等运动机能亢进障碍；阻断CNS多巴胺受体的药物所诱发的病症等药物诱发的运动障碍；帕金森病等运动不足症；进行性核上性麻痺；小脑的器质性病变；脊髓性共济失调、弗里德赖希氏共济失调、脊髄小脑变性症、多系统变性病(multiple systemsdegenerations)(Mencel、Dejerine-Thomas、Shi-Drager和Machado-Joseph)等脊髄小脑变性症；全身性疾病(雷弗素姆氏病、无β脂蛋白血症、共济失调、毛细血管拡張扩张症和线粒体多系统疾病(mitochondrial multi.system disorder))；多发性硬化、急性横断性脊髄炎等脱髓鞘核疾病(demyelinating core disorders)；神经性肌萎缩(肌萎缩性侧索硬化症、婴儿型脊髓性肌萎缩和青少年脊髓性肌萎缩等前角细胞变性)等运动单元疾病；阿尔茨海默氏病；中年人中的唐氏综合征；弥漫性雷维小体病；雷维小体型老年性痴呆；韦尼克-科尔萨科夫综合征；慢性酒精中毒；克罗伊茨费尔特-雅各布病；亚急性硬化性全脑炎、Hallerrorden-Spatz病；以及拳击员痴呆。

其它疾病

肝纤维化(酒精性肝硬化、病毒性肝硬化、自身免疫性肝炎等)；肺纤维化(硬皮病、特发性肺纤维化等)；肾脏纤维化(包括硬皮病、糖尿病性肾炎、肾小球肾炎、狼疮性肾炎，但不限定于这些)；皮肤纤维化(硬皮病、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩、烧伤等)；骨髓纤维化；神经纤维瘤；纤维瘤；肠纤维化；和作为外科手术的结果的纤维化粘连等各种纤维性病变。

急性或慢性细菌感染、包括细菌、病毒和真菌感染的急性和慢性寄生或传染过程、HIV感染/HIV神经病变、脑膜炎、肝炎(甲型、乙型或丙型等)、脓毒性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌、溶血性尿毒症综合征、疟疾、登革出血热、利什曼病、汉森病、中毒性休克综合征、链球菌肌炎、气性坏疽、人型结核杆菌、鸟型结核杆菌、卡氏肺囊虫性肺炎、盆腔炎、睾丸炎/附睾炎、军团杆菌、莱姆病、甲型流感、爱泼斯坦巴尔病毒、病毒相关的噬血细胞综合征、病毒性脑炎/无菌脑膜炎。

将本发明的融合蛋白以给药至待测体的、癌的预防或治疗用药物组合物的形式使用的情况下，可以包含融合蛋白以及药理学上可允许的载体、稀释剂或赋形剂。例如，作为片剂用的载体、赋形剂，使用乳糖、硬脂酸镁等。作为注射用的水性液体，使用生理盐水、包含葡萄糖或其它辅助剂的等渗溶液等，也可以合用适当的溶解辅助剂、例如醇、丙二醇等多元醇、非离子表面活性剂等。作为油性液体，使用芝麻油、大豆油等，作为溶解辅助剂，可以合用苯甲酸苄酯、苯甲醇等。

该药物组合物可以以各种形态给药，可以举出利用片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等的经口给药；或者利用注射剂、点滴剂、栓剂、喷雾剂、滴眼液、经鼻给药剂、贴附剂等的非经口给药。该药物组合物还可以进行局部给药，例如可以通过注射给药至癌部位来发挥其效果。优选在癌病变局部直接注入1次或2次以上本剂，在癌病变整体以本剂遍布的方式进行直接注入。

其给药量根据症状、年龄、体重等而不同，可以每隔几天或几周或几个月一次，每次通过静脉注射、腹腔内注射、皮下注射、肌肉注射等给药0.001mg～100mg。

另外，将本发明的融合蛋白用于活体外(ex vivo)的治疗时，例如，以10⁴～10⁷细胞/ml的浓度使用PBMC，以1～50μg/ml的浓度添加融合蛋白进行培养即可。

此外，可以将编码上述本发明的融合蛋白的DNA用于基因治疗。为此，可以将编码本发明的融合蛋白的DNA插入适当的载体中，将该载体给药至生物体，在生物体内表达融合蛋白。例如，可以将编码PSA-hIL2、PSA-hIL4、PSA-hIL7、PSA-hGMCSF、PSA-mIL4、PSA-mGMCSF、PAP-hIL2、PAP-hIL4、PAP-hIL7、PAP-hGMCSF、PAP-mIL4、PAP-mGMCSF、PSMA-hIL2、PSMA-hIL4、PSMA-hIL7、PSMA-hGMCSF、PSMA-mIL4、PSMA-mGMCSF、MAGEA4-hIL2、MAGEA4-hIL4、MAGEA4-hIL7、MAGEA4-hGMCSF、MAGEA4-mIL4、MAGEA4-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF、CEA-hIL2、CEA-hIL4、CEA-hIL7、CEA-hGMCSF、CEA-mIL4、CEA-mGMCSF、CEA1-hIL2、CEA1-hIL4、CEA1-hIL7、CEA1-hGMCSF、CEA1-mIL4、CEA1-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-hIL4、CEA2-hIL7、CEA2-hGMCSF、CEA2-mIL4、CEA2-mGMCSF表示的48种融合蛋白的DNA插入图1、图2、图3-1或图3-2的表达盒的插入基因的部分，构建DNA构建体，将该DNA构建体导入质粒、载体，并给药至生物体。

作为导入上述DNA构建体的质粒、载体，可以举出质粒、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体等病毒载体及生物降解性聚合物等非病毒载体。通过感染将导入有上述DNA构建体的载体导入细胞即可。此时，可以使用公知的转染试剂进行导入。

上述导入有编码融合蛋白的DNA的质粒、载体可以通过能够在基因治疗的领域中使用的方法、例如静脉内给药或动脉内给药等血管内给药、经口给药、腹腔内给药、气管内给药、支气管内给药、皮下给药、经皮给药等进行给药。

导入有编码融合蛋白的DNA的质粒、载体可以以治疗上的有效量给药。基因治疗领域的技术人员可以容易地确定治疗上的有效量。此外，给药量可以根据待测者的病情的严重程度、性别、年龄、体重、习惯等适宜变更。例如，对于导入有编码融合蛋白的DNA的腺病毒载体或腺相关病毒载体，以0.5×10¹¹～2.0×10¹²病毒基因组/kg体重、优选以1.0×10¹¹～1.0×10¹²病毒基因组/kg体重、进一步优选以1.0×10¹¹～5.0×10¹¹病毒基因组/kg体重的量进行给药即可。病毒基因组表示腺病毒或腺相关病毒的基因组的分子数(病毒颗粒数)，有时也称为颗粒(particle)。包含在制剂领域中通常使用的载体、稀释剂、赋形剂。例如，作为片剂用的载体、赋形剂，使用乳糖、硬脂酸镁等。作为注射用的水性液体，使用生理盐水、包含葡萄糖或其它辅助剂的等渗溶液等，也可以合用适当的溶解辅助剂、例如醇、丙二醇等多元醇、非离子表面活性剂等。作为油性液体，使用芝麻油、大豆油等，作为溶解辅助剂，可以合用苯甲酸苄酯、苯甲醇等。

将编码本发明的融合蛋白的DNA导入质粒、载体的基因治疗例如可以根据国际公开第WO2011/062298号公报的记载来进行。

此外，本发明包括移植了高表达癌特异性抗原的人的癌细胞的人癌模型非人动物。非人动物包含小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、猴等，优选为小鼠或大鼠等啮齿类动物。对于该人癌模型非人动物，可以用癌特异性抗原转化人癌细胞株，将该转化癌细胞株移植到非人动物。关于人癌细胞株的转化，可以将编码癌特异性抗原的DNA插入下述表达盒，利用导入有该表达盒的质粒转化癌细胞株，上述表达盒具有以下结构：按照(i)和(ii)的顺序包含(i)依次连结第1启动子、所要表达的基因和聚A附加序列而成的DNA构建物和(ii)增强子或在上游连结有UAS的增强子，在聚A附加序列的紧随下游连结有增强子或上游连结有UAS的增强子。此时，通过在表达盒插入新霉素抗性基因等耐药基因，从而可以进行转化细胞株的选择。所使用的癌特异性抗原使用对癌细胞株的癌种特异性的癌特异性抗原即可。例如，可以用包含编码PSA或PAP的DNA的质粒转化RM-9细胞株等前列腺癌细胞株。将这样的转化细胞株称为PSA-RM9细胞或PAP-RM9细胞。通过将所得到的转化细胞株移植到非人动物，可以得到形成癌、且表达癌特异性抗原、显示出与人癌的病情类似的病情的人癌模型非人动物。该人癌模型非人动物可以用于癌症治疗药的筛选和评价等中。

实施例

通过以下的实施例来具体说明本发明，但本发明不被这些实施例所限定。

实施例1包含PSA或PAP的融合蛋白的制造

制造了PSA(前列腺特异性抗原)或PAP(前列腺酸性磷酸酶)与人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)或小鼠GMCSF(mGMCSF)的融合蛋白。

本实施例中，使用了图4-1和4-2以及图5-1和图5-2所示(分别在序列号1和序列号2中示出序列)的表达用盒。图4-2所示的序列为图4-1所示的序列的下文，在图4-1所示的序列与图4-2所示的序列之间，利用限制酶位点插入有编码细胞因子的DNA。同样地，图5-2所示的序列为图5-1所示的序列的下文，在图5-1所示的序列与图5-2所示的序列之间，利用限制酶位点插入有编码细胞因子的DNA。图4-1、图4-2、图5-1和图5-2所示的序列是连续的序列，但为了表示各单元为何单元而分别示出各单元，在各单元后以及图4-1和图5-1的上方的结构图上附上数字，表示序列中的各单元为何单元。这些表达盒是以图1中示出结构的表达盒为基础而制成的，具有图4-1或图5-1的上方所示的结构。在图4-1或图5-1的上方的表示结构的图中，SV40ori(2)表示SV40基因的结合区域，UAS(3)表示GAL4基因的结合区域，CMVi(4)表示CMVi启动子，RU5'(5)表示HTLV来源的LTR，REIC信号肽(7)表示编码REIC/Dkk-3基因序列的信号肽的DNA。此外，PSA或PAP(8)表示编码PSA或PAP的DNA，BGHpA(13)表示BGH(牛生长激素基因来源的聚A附加序列，hTERT enh(15)表示hTERT增强子，SV40enh(16)表示SV40增强子，CMV enh(17)表示CMV增强子。另外，在图中的序列中用框包围的序列分别为Bgl II限制酶位点(10)和Xba I限制酶位点(11)，形成多克隆位点，在该限制酶位点之间的多克隆位点插入编码上述hIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSF的DNA中的任一种即可。在图4-1和图4-2以及图5-1和图5-2中，(1)中所示的DNA序列表示成为所用的基因表达系统的骨架的pIDT-SMART载体的碱基序列的一部分，(6)中所示的序列表示连结RU5'与编码REIC信号肽的DNA序列时所用的接头的序列，(9)中所示的序列表示连结编码PSA或PAP的DNA序列与编码细胞因子的DNA序列时所用的接头的序列，(12)中所示的序列为包含tag、tga、taa这3个终止密码子的DNA序列，(18)中所示的序列表示成为所用的基因表达系统的骨架的pIDT-SMART载体的碱基序列的一部分。通过在图4-1和图4-2以及图5-1和图5-2所示的表达盒中插入编码hIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSF的DNA并导入质粒中，可以利用该质粒制造PSA或PAP与hIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSF中的任一种的融合蛋白。需要说明的是，REIC信号肽是为了使在293细胞中大量表达的融合蛋白被分泌到培养液中而插入的。此时，去除编码PSA或PAP蛋白自身的信号肽的序列，而插入编码REIC信号肽的DAN。将包含插入至上述表达盒的编码hIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSF的DNA的碱基序列分别示于序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7和序列号8、以及图6-1和图6-2中。如图6-1和图6-2所示，序列号3～8所示的序列为了插入至上述表达盒中而在前后具有限制酶位点，进而在编码各细胞因子的DNA的下游包含编码由6个组氨酸构成的氨基酸序列的DNA。在图6-1的上方示出DNA的结构。该结构图中，BglII(1)和XbaI(6)表示限制酶位点，Cytokine(2)表示编码各细胞因子的DNA，6×His标签(4)表示编码6个组氨酸的DNA，终止密码子(5)表示终止密码子。另外，在编码细胞因子的DNA与6×His标签之间的用(3)表示的序列表示用于连结编码细胞因子的DNA与6×His标签的接头的序列。

作为PSA-hIL2、PAP-hIL2、PSA-hIL4、PAP-hIL4、PSA-hIL7、PAP-hIL7、PSA-hGMCSF、PAP-hGMCSF、PSA-mIL4、PAP-mIL4、PSA-mGMCSF和PAP-mGMCSF的共计12种融合蛋白的分泌表达的宿主细胞，将处于对数增殖期的30mL人肾脏来源细胞FreeStyle 293-F细胞(Invitrogen社)以5～6×10⁵细胞/mL的浓度接种到125mL烧瓶中，在37℃、8％CO₂的存在下用Freestyle 293Expression 1Media(Invitrogen社)振荡培养一晩(125rpm)。第二天，对于调整为1×10⁶细胞/mL的浓度、将20mL接种到125mL烧瓶中的293-F细胞，将各20μg的包含在序列号1表示的表达盒中分别插入有序列号3～8表示的任一种DNA而成的DNA构建物的质粒DNA(6种)、以及包含在序列号2表示的表达盒中分别插入有序列号3～8表示的任一种DNA而成的DNA构建物的质粒DNA(6种)的共计12种用于产生融合蛋白的质粒DNA与基因导入试剂293Fectin(Invitrogen社)混合，进行基因导入。作为质粒，使用了pIDT-SMART载体(无启动子的克隆用质粒载体(IDT社))。将pIDT-SMART载体的全部碱基序列示于图6-3(序列号9)。转染后，在37℃、8％CO₂的存在振荡培养5天，回收培养上清。将该培养上清中的18μL用SDS-PAGE分离，通过CBB染色检测出各分子量(PSA和PAP有糖链附加)的融合蛋白。该结果示于图7-1。

为了估计融合蛋白的生产量，使用组氨酸亲和性柱色谱(TALON-亲和树脂(Clontech社))对转染5天后回收的培养上清中所分泌的PSA-hGMCSF和PAP-hGMCSF融合蛋白进行纯化，使用SDS-PAGE对纯化后的融合蛋白洗脱液进行分离，通过CBB染色确认了融合蛋白的纯度。该结果示于图7-2。

进而，通过Bradford法和SDS-PAGE的CBB染色中得到的条带对12种融合蛋白的蛋白量进行定量，由培养20mL时的纯化蛋白量计算出培养1L时得到的蛋白量。该结果示于图7-3。

如图7-1、图7-2和图7-3所示，由人293细胞中的培养第5天的上清中得到了12种高浓度的融合蛋白溶液。特别是，如图7-1和图7-2所示，若使用上述融合蛋白的制作方法，即使不使用通过His-标签柱等进行亲和纯化而得到纯化蛋白的方法，也可以由培养上清得到纯度极高的融合蛋白溶液。另外，通过使用该方法，可以制作12种大容量的融合蛋白。

实施例2人前列腺癌模型小鼠的制作

(1)PSA-RM9细胞和PAP-RM9细胞的确立

将RM-9细胞株作为母株，确立了作为新细胞株的PSA-RM9细胞和PAP-RM9细胞。PSA-RM9细胞和PAP-RM9细胞分别为持续表达人PSA或人PAP的细胞株。作为母株的RM9细胞株是C57BL/6小鼠的前列腺来源的癌细胞株，由贝勒医学院的汤普森教授提供。已确认RP9细胞株不表达PSA和PAP。

PSA-RM9细胞和PAP-RM9细胞通过以下的方法确立。

首先，为了确立PSA-RM9细胞和PAP-RM9细胞，构建了PSA-RM9细胞用质粒和PAP-RM9细胞用质粒。关于该质粒，与实施例1同样地用WO2011/062298号公报中记载的方法构建外来基因表达用盒，作为包含该盒的质粒进行构建。

PSA-RM9细胞用质粒

在CMV enh的序列后依次插入CMV启动子序列、新霉素耐性基因和SV40聚A序列的碱基序列，构建了PSA-RM9细胞用质粒。通过将该质粒导入细胞，可以使对象细胞表达PSA蛋白，并且使其具有新霉素耐性。

PAP-RM9细胞用质粒

在CMV enh的序列后依次插入CMV启动子序列、新霉素耐性基因和SV40聚A序列的碱基序列，构建了PAP-RM9细胞用质粒。通过将该质粒导入细胞，可以使对象细胞表达PAP蛋白，并且使其具有新霉素耐性。

在6孔板中接种RM9细胞，第二天，对于用于稳定表达PSA或PAP的上述2种质粒(PSA-RM9细胞用质粒和PAP-RM9细胞用质粒)，以每1孔5μg的量分别用Lipofectamine2000转染RM9细胞。

第二天，在15cm培养皿中继代，在包含遗传霉素(G418硫酸盐)的培养基(浓度500μg/ml)中进行培养。约2周后，筛选菌落，将此处的细胞作为克隆株移至6孔板。PSA-RM9细胞株、PAP-RM9细胞株均分别增殖10克隆以上，并进行液氮保存。

关于保存的所有PSA-RM9细胞克隆株和PAP-RM9细胞克隆株，通过测定培养上清的PSA值或PAP值，从而确认了分别为持续表达人PSA或人PAP的克隆株。关于保存的PSA-RM9细胞克隆株和PAP-RM9细胞克隆株，选择PSA或PAP的表达量高的各克隆株，用于人前列腺癌模型小鼠的制作。

(2)人前列腺癌模型小鼠的制作

将PSA-RP9细胞或PAP-RM9细胞(500万个/100μL PBS)移植到8周龄的C57/BL6雄性小鼠的右大腿皮下。关于各细胞，使用了4只小鼠。将移植日作为第0天，在第7天和第14天分别各处死2只小鼠，用ELISA法测定了小鼠血清中的PSA或PAP。在第0天，用ELISA测定了各2只正常小鼠的血清中的PSA或PAP。另外，测定了所形成的皮下肿瘤的肿瘤重量。

结果示于图8。图8的曲线图的值为2只小鼠的测定值的平均值。图8的a是PSA-RP9细胞移植小鼠的结果，图8的b是PAP-RP9细胞移植小鼠的结果。如图8所示，肿瘤越大则血中的PSA或PAP浓度越增加。该现象与人前列腺癌患者的病情非常类似，表示PSA-RP9细胞或PAP-RP9细胞对于人前列腺癌模型小鼠的制作是有用的。

实施例3使用人前列腺癌模型小鼠的治疗实验

使用实施例2中制作的C57/BL6人前列腺癌模型小鼠进行了治疗实验。

治疗实验1

将小鼠分成以下的组A～E，每组5只，将实施例1中制作的融合蛋白用作试剂。

组A(5只)未给药

组B(5只)PSA-mGMCSF：5μg(用PBS调整为100μl)

组C(5只)PAP-mGMCSF：5μg(用PBS调整为100μl)

组D(5只)PSA-mGMCSF：1.25μg、PSA-mIL4：1.25μg、PSA-hIL2：1.25μg、PSA-hIL7：1.25μg(用PBS调整为100μl)

组E(5只)PAP-mGMCSF：1.25μg、PAP-mIL4：1.25μg、PAP-hIL2：1.25μg、PAP-hIL7：1.25μg(用PBS调整为100μl)

在第0天给与试剂，开始实验，在第2天、第4天进一步给与试剂。在第7天向C57/BL6小鼠的两侧大腿部的皮下分别移植PSA-RM9细胞(左侧：0.8×10⁶个)和PAP-RM9细胞(右侧：1.5×10⁶个)(分别在100μl PBS中悬浮细胞并进行了移植)。之后，在第7天实施了第4次的各试剂的腹腔内给药。此外，在第9天、第14天、第16天和第18天给与了试剂(试剂共计以9次进行给药)。在第21天确认到肿瘤形成，进而进行了肿瘤大小的测定。

治疗实验2

将小鼠分成以下的组F和G，每组5只，使用实施例1中制作的融合蛋白制作细胞试剂，在第0天从尾静脉给药。

组F(5只)以PSA-mGMCSF：2.5μg/ml、PSA-mIL4：2.5μg/ml、PSA-hIL2：2.5μg/ml、PSA-hIL7：2.5μg/ml的条件，在LGM-3培养基中将小鼠PBMC(小鼠外周血单核细胞)培养3天，对于每1只，从尾静脉给与1次PBMC(1×10⁶个/500μl PBS)。

组G(5只)以PAP-mGMCSF：2.5μg/ml、PAP-mIL4：2.5μg/ml、PAP-hIL2：2.5μg/ml、PAP-hIL7：2.5μg/ml的条件，在LGM-3培养基中将小鼠PBMC培养3天，对于每1只，从尾静脉给与1次PBMC(1×10⁶个/500μl PBS)。

在第7天，向C57BL6小鼠的两侧大腿部的皮下分别移植PSA-RM9细胞(左侧：0.8×10⁶个)和PAP-RM9细胞(右侧：1.5×10⁶个)(分别在100μl PBS中悬浮细胞并进行了移植)。在第21天确认到肿瘤形成，进而进行了肿瘤大小的测定。治疗实验2中，也将治疗实验1的组A的结果作为对照。

在图9-1和图9-2中示出结果。图9-1表示治疗实验1的结果，a～e分别表示组A～E的结果。图9-2表示治疗实验2的结果，a～c分别表示组A、组F和组G的结果。统计分析中，关于“皮下肿瘤大小(mm³)[与组A相比以％表示]”，在2组间进行无对应的学生t检验，在p<0.05时判定为具有显著性差异。另外，关于“皮下肿瘤形成的频率(％)”，进行卡方检验，在p<0.05时判定为具有显著性差异。

如图9-1所示，在组B～E中，在表达与给药药剂相同的抗原(PSA或PAP蛋白)的RM9癌细胞中确认到了针对肿瘤的形成·增大的治疗效果。

在治疗实验1中，特别是在组D和E中确认到了比组B和C更显著的治疗效果(在肿瘤形成的抑制上具有显著性差异)。该结果表明，通过多种融合蛋白的组合的给药，与基于GMCSF的单剂时相比抗癌治疗效果增强。认为这是由于，通过同时将多种融合蛋白给药至小鼠，融合蛋白中包含的各抗癌细胞因子的作用在生物体内协同地发挥，与单剂时相比可以更强地活化抗癌免疫。

另外，如图9-2所示，治疗实验2中，在组F和G中，在表达与给药药剂相同的抗原(PSA或PAP蛋白)的RM9癌细胞中确认到了针对肿瘤的形成·增大的显著治疗效果。

实施例4PAP或PSA的融合蛋白所导致的树突细胞的诱导

对在人或小鼠单核细胞中组合添加PSA-mGMCSF和PSA-mIL4的情况下、以及组合添加PAP-mGMCSF和PAP-mIL4的情况下的、由外周血单核细胞(PBMC)的单核细胞诱导的树突细胞的出现率进行测定。

人和小鼠的PBMC(外周血单核细胞)通过使用Ficoll-Paque离心分离的标准方法由健康的人和小鼠的血液中采集。利用台盼蓝排除法计测细胞的回收率，确认到生存率为95％以上。为了制备单核细胞，将PBMC再悬浮于LGM-3培养基(淋巴细胞增殖培养基-3、不含有血清、Lonza)中，将附着于塑料上的细胞(在37℃的温度下用6孔碟温育2小时)作为单核细胞使用。所得到的人和小鼠的单核细胞在上述融合蛋白(各以5μg/ml的浓度)的组合、或GM-CSF(R&D Systems)+IL-4(R&D Systems)(分别为2ng/ml)的存在下进行培养。用相位差显微镜观察细胞。

在各培养的第7天，测定树突细胞在全部细胞中所占的比例。通过显微镜观察，将通过向人单核细胞中添加市售的hGMCSF蛋白和hIL4蛋白而在7天后诱导的人树突细胞的形态作为阳性对照，将在与该形态同样的细胞中确认到树状突起的细胞在各添加组中作为树突细胞来计测。在各融合蛋白添加组中，分化诱导的树突细胞在全部细胞中所占的比例如下测定。即，在各添加后第7天，用显微镜以100倍的倍率在直视下、在随机的共计5个视野中分别对各100个细胞进行目视，计测其每100个中包含的树突细胞的个数(个)。

结果示于图10-1、图10-2和图10-3。图10-1中示出将市售的hGMCSF蛋白和hIL4蛋白组合添加到人PBMC中时的7天后诱导的人树突细胞的形态。图10-1中，箭头表示的细胞为树突细胞。

图10-2示出将PSA-mGMCSF与PSA-mIL4组合、或PAP-mGMCSF与PAP-mIL4组合添加时的由小鼠外周血单核细胞(PBMC)诱导的树突细胞的出现率。如图10-2所示，在不添加融合蛋白的情况下进行培养时的树突细胞样细胞的比例为百分之几，但在各融合蛋白存在下进行培养时，观察到树突细胞以超过20％的比例被诱导。即，通过融合蛋白的添加，确认到了树突细胞的诱导这种值得期待的生理活性。该结果表明，即使融合了PSA或PAP，也可保持各细胞因子(mGMCSF和mIL4)的本来的功能(树突细胞的诱导)。

图10-3示出将PSA-hGMCSF与PSA-hIL4组合、或PAP-hGMCSF与PAP-hIL4组合添加时的由人外周血单核细胞(PBMC)诱导的树突细胞的出现率。如图10-3所示，在不添加融合蛋白的情况下进行培养时的树突细胞样细胞的比例为百分之几，但在作为阳性对照的市售的hGM-CSF+hIL-4存在下进行培养时为约25％，另外，在各融合蛋白存在下进行培养时，观察到树突细胞以超过45％的比例被诱导。即，通过融合蛋白的添加，确认到了树突细胞的诱导这种值得期待的生理活性。该结果表明，即使融合了PSA或PAP，也可保持各细胞因子(mGMCSF和hIL4)的本来的功能(树突细胞的诱导)。

实施例5PSA-hGMCSF和PAP-hGMCSF对于TF-1细胞的细胞增殖作用

利用纯化后的PSA-hGMCSF和PAP-hGMCSF，通过MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物)分析解析了对于TF-1细胞的细胞增殖作用。

将TF-1细胞以10⁴细胞/孔接种到96孔板，此外，关于各融合蛋白，以摩尔浓度为300pM、100pM、33.3pM、11.1pM、3.7pM、1.2pM、0.41pM的方式以3倍系列进行稀释并添加。培养3天后，使用市售的细胞增殖分析试剂进行MTT分析，测定570nm的吸光度，从而对各孔中的细胞增殖进行了解析。

结果示于图11。如图11所示，在10pM以上的浓度下，在PSA-hGMCSF和PAP-hGMCSF这2种融合蛋白中确认到了TF-1细胞的增殖活性这种hGMCSF蛋白的生理活性。这表明，即使融合了PSA或PAP，也可保持细胞因子(hGMCSF)的本来的功能。

实施例6包含PSA或PAP的融合蛋白的纯化(浓缩)

通过实施例1中记载的方法制造PSA-hGMCSF、PAP-hGMCSF、PSA-hIL2、PAP-hIL2、PSA-hIL4、PAP-hIL4、PSA-hIL7和PAP-hIL7这8种融合蛋白，使用组氨酸亲和性柱色谱对培养上清进行纯化，使用SDS-PAGE对纯化后的融合蛋白洗脱液进行分离，通过CBB染色确认了融合蛋白的纯度。另外，与实施例1同样地，通过Bradford法和SDS-PAGE的CBB染色中得到的条带对融合蛋白的蛋白量进行了定量。CBB染色的结果示于图12。图12的a示出PSA-hGMCSF、PAP-hGMCSF、PSA-hIL2和PAP-hIL2的结果，图12的b示出PSA-hIL4、PAP-hIL4、PSA-hIL7和PAP-hIL7的结果，关于各融合蛋白，示出浓缩前(左侧的条带)和浓缩后(右侧的条带)的情况。PSA-hGMCSF、PAP-hGMCSF、PSA-hIL2、PAP-hIL2、PSA-hIL4、PAP-hIL4、PSA-hIL7和PAP-hIL7这8种融合蛋白的蛋白浓度分别为0.52mg/ml、0.7mg/ml、0.31mg/ml、0.68mg/ml、0.53mg/ml、1.17mg/ml、0.13mg/ml和0.23mg/ml。

关于本发明的融合蛋白，得到了临床上可使用的水平非常高的浓度的融合蛋白。需要说明的是，在Sipuleucel-T(Provenge(注册商标))中，在细胞培养中添加的蛋白质以10μg/ml的浓度使用，关于本发明的融合蛋白组，将它们稀释，从而可以比Sipuleucel-T中使用的细胞培养中的浓度10μg/ml更高的浓度添加到细胞中。

实施例7包含PSMA的融合蛋白的制造和对于TF-1的增殖作用的解析

(1)PSMA-hGMCSF融合蛋白的制造

制造PSMA(前列腺特异性膜抗原)与人GMCSF(hGMCSF)的融合蛋白。

本实施例中，使用了图13-1、图13-2和图13-3所示的(序列示于序列号10)表达用盒。图13-2所示的序列为图13-1所示的序列的下文，图13-3所示的序列为图13-2所示的序列的下文。在图13-2所示的序列与图13-3所示的序列之间，利用限制酶位点插入了编码hGMCSF的DNA。图13-1、图13-2和图13-3所示的序列的含义和各单元除了PSMA为编码PSMA的序列这点以外，与实施例1的包含PSA的表达用盒(图4-1和图4-2)和包含PAP的表达用盒(图5-1和图5-2)相同。需要说明的是，作为PSMA使用了PSMA的细胞外区域。包含插入至该表达盒的编码hGMCSF的DNA的碱基序列示于序列号6。

PSMA与hGMCSF的融合蛋白是利用与实施例1中记载的方法同样的方法制作并进行纯化的。将通过纯化得到的融合蛋白3μg供于SDS-PAGE，通过CBB染色确认了融合蛋白的纯度。该结果示于图14-1。图14-1示出实施例1中制造的PSA-hGMCSF、PAP-GMCSF和本实施例中制造的PMSA-hGMCSF的结果。

通过Bradford法和SDS-PAGE的CBB染色中得到的条带对融合蛋白的蛋白量进行了定量，由培养20mL时的纯化蛋白量计算出培养1L时得到的蛋白量。该结果示于图14-2。

如图14-1和图14-2所示，可以从培养上清得到纯度高的PSMA-hGMCSF融合蛋白溶液。由于PSMA为前列腺癌的癌抗原，因而PMSA-hGMCSF可以用于前列腺癌的癌免疫疗法中。

(2)PSMA-hGMCSF融合蛋白对于TF-1细胞的增殖作用的解析

通过与实施例5中记载的方法同样的方法，使用纯化后的PSMA-hGMCSF，利用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物)分析解析了对于TF-1细胞的细胞增殖作用。

结果示于图15。图15中还示出PAP-hGMCSF、PSA-hGMCSF和GMCSF(对照)的结果。如图15所示，与PAP-hGMCSF和PSA-hGMCSF同样地，即使将hGMCSF与PSMA融合，PSMA-hGMCSF融合蛋白也保持了细胞因子(hGMCSF)的本来的功能。这表明，PSMA-hGMCSF能够有效地用于对于前列腺癌的癌免疫疗法。

实施例8包含MAGEA4或CD147的融合蛋白的制作

制造了MAGEA4(人类黑色素瘤相关抗原4)或CD147与人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)或小鼠GMCSF(mGMCSF)的融合蛋白。

制造通过与实施例1中记载的方法同样的方法进行。本实施例中，使用了图16-1、图16-2和图16-3以及图17-1和图17-2中所示的(分别在序列号11和序列号12中示出序列)表达用盒。图16-2所示的序列为图16-1所示的序列的下文，图16-3所示的序列为图16-2所示的序列的下文。在图16-2所示的序列与图16-3所示的序列之间，利用限制酶位点插入了编码细胞因子的DNA。同样地，图17-2所示的序列为图17-1所示的序列的下文，在图17-1所示的序列与图17-2所示的序列之间，利用限制酶位点插入了编码细胞因子的DNA。图16-1、图16-2和图16-3以及图17-1和图17-2所示的序列的含义和各单元分别是MAGEA4为编码MAGEA4的序列(图16-1、图16-2和图16-3)、CD147为编码CD147的序列(图17-1和图17-2)，除此以外与实施例1的包含PSA的表达用盒(图4-1和图4-2)和包含PAP的表达用盒(图5-1和图5-2)相同。需要说明的是，作为CD147使用了CD147的细胞外区域。包含插入至上述表达盒的编码hIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSF的DNA的碱基序列分别示于序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7和序列号8、以及图6-1和图6-2中。

将利用与实施例1中记载的方法同样的方法所纯化的融合蛋白供于SDS-PAGE，通过CBB染色确认了融合蛋白的纯度。该结果示于图18-1。另外，与实施例1同样地，通过Bradford法和SDS-PAGE的CBB染色中得到的条带对融合蛋白的蛋白量进行了定量，由培养20mL时的纯化蛋白量计算出培养1L时得到的蛋白量。该结果示于图18-2。如图18-1和图18-2所示，关于12种融合蛋白(MAGEA4-hGMCSF、CD147-hGMCSF、MAGEA4-hIL2、CD147-hIL2、MAGEA4-hIL4、CD147-hIL4、MAGEA4-hIL7、CD147-hIL7、MAGEA4-mGMCSF、CD147-mGMCSF、MAGEA4-mIL4和CD147-mIL4)，在使用了人293细胞的培养第5天的上清中以高浓度获得。

MAGEA4和CD147蛋白在广泛癌种的癌细胞中作为癌抗原发挥功能，成为癌靶标治疗的标记物，因此可以将MAGEA4或CD147蛋白与各种细胞因子的融合蛋白用于针对广泛癌种的癌免疫疗法中。

实施例9包含CEA1或CEA2的融合蛋白的制作

制造了CEA1或CEA2与人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)或小鼠GMCSF(mGMCSF)的融合蛋白。

人癌胚抗原(CEA,CD66e)是在以结肠癌为首的、主要在消化道的腺癌中确认到的约180kDa的糖蛋白(糖含量50～60％、氨基酸为702个(包含信号肽)、Gene存在于19q13.2)。其表达不是消化道癌特异性的，被用作肺、乳腺等各种脏器的上皮性肿瘤的标记物。在正常的大肠粘膜也可少量观察到，在腺管表面可观察到反应，在癌中甚至在细胞质也强烈地反应。

另外，存在与人CEA的氨基酸残基的序列显示出极高的同源性的被称为人NCA(非特异性交叉反应抗原)或人PSG(妊娠特异性糖蛋白)的蛋白组，将这些蛋白组与CEA一并称为CEA家族。包含CEA的这些基因均在染色体19q13.1-q13.3上接近地存在，作为生理活性，具有粘附分子的功能。另外，这些CEA家族的蛋白组在各种癌中表达。

本实施例是为了示出以CEA家族的蛋白组为靶抗原的癌免疫疗法有用而进行的。

非特异性交叉反应抗原(NCA,CD66c)是在粒细胞系白血球等中也表达的由344个(包含信号肽)的氨基酸构成的约37kDa(前体形式)的粘附分子。与CEA成为家族，如下页所示，NCA以可称为CEA的一部分的程度与氨基酸残基的序列具有高同源性(下划线部分)，容易引起免疫学上的交叉反应。

本实施例中，为了将包含NCA的这些CEA家族的蛋白组总括地作为免疫疗法中的靶抗原，将图20的A中以下划线示出的由668氨基酸构成的CEA蛋白的氨基酸序列(序列号15、序列号14中示出编码该氨基酸序列的DNA的碱基序列)的222氨基酸构成的部分作为“CEA1”(序列号17、序列号16中示出编码该氨基酸序列的DNA的碱基序列)以及将由223氨基酸构成的部分作为“CEA2”(序列号19、序列号18中示出编码该氨基酸序列的DNA的碱基序列)，由此进行分割并使用，从而制作了CEA1和CEA2的融合蛋白。需要说明的是，图20的A的第1位～第34位氨基酸序列为信号肽序列(用框包围的部分)，在本发明的融合蛋白的制造时除去该信号序列。图20的B中示出NCA的氨基酸序列(序列号20)。与将上述CEA1和CEA2合在一起的序列部分同源的NCA的氨基酸序列在图20的B中以下划线示出(序列号20)。图20的B的第1位～第34位氨基酸序列为信号肽序列(用框包围的部分)，在本发明的融合蛋白的制造时该信号序列被除去。

利用与实施例1中记载的方法同样的方法进行制造。即，在图4-1和图4-2中示出了序列的表达盒的PSA表示的插入基因的部分中插入编码CEA1和CEA2的DNA，从而使用。需要说明的是，在图4-1所示的序列与图4-2所示的序列之间，利用限制酶位点插入编码细胞因子的DNA。

将利用与实施例1中记载的方法同样的方法所纯化的融合蛋白供于SDS-PAGE，通过CBB染色确认了融合蛋白的纯度。另外，同时也确认了纯化前的融合蛋白的纯度。该结果示于图21中。图21的A示出CEA1与各细胞因子的融合蛋白的纯化前和纯化后的结果，图21的B示出CEA2与各细胞因子的融合蛋白的纯化前和纯化前的结果。

上述作为“CEA1”和“CEA2”分割使用的粗字表示的CEA蛋白的氨基酸序列的部分不仅对NCA、而且对CEA家族的蛋白组大多显示出高同源性，因而通过将CEA1和CEA2的融合蛋白(细胞因子)组进行组合，可以实施总括地将CEA家族的蛋白组为靶抗原的治疗。需要说明的是，为了进一步增加所得到的融合蛋白的收获量，出于减小表达蛋白的大小的目的，还具有将该部位分割成CEA1和CEA2的意义。

通过将如上设计并制作的CEA1和CEA2的融合蛋白单独或组合使用，可以实施针对广泛地将CEA家族的蛋白组作为靶标的癌和其它疾病的免疫疗法。

实施例10包含PMSA的融合蛋白的制作(其2)

制造了PMSA与人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)或人GMCSF(hGMCSF)的融合蛋白。

制造通过与实施例1中记载的方法同样的方法进行。即，实施例7中制造了PSMA与人GMCSF(hGMCSF)的融合蛋白，利用同样的方法，改变细胞因子，制造了PMSA与人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)或人GMCSF(hGMCSF)的融合蛋白。

将利用与实施例1中记载的方法同样的方法所纯化的融合蛋白供于SDS-PAGE，通过CBB染色确认了融合蛋白的纯度。该结果示于图21的C。

实施例11各种融合蛋白的纯化后的浓度的测定

测定了利用本发明的方法所制造的各种融合蛋白的纯化后的浓度。

通过Bradford法和SDS-PAGE的CBB染色中得到的条带对各种融合蛋白的蛋白量进行了定量，由培养20mL时的纯化蛋白量计算出培养1L时得到的蛋白量。该结果示于图22。

利用His-标签柱对包含各种融合蛋白的125ml培养上清进行亲和纯化，从而可以得到各4ml的上述浓度的纯化融合蛋白溶液。此外，使用一般所用的蛋白质的超滤法，从而可以更高效地(更重视收获量地)对各种融合蛋白进行浓缩。

实施例12各种融合蛋白和将融合蛋白组合时的树突细胞的诱导

(1)对实施例4中记载的方法进行修饰，将PSA-hGMCSF和各种融合蛋白组合来诱导树突细胞。即，在人外周血的CD14阳性单核细胞中加入市售的细胞因子的hGMCSF和hIL4(均以2ng/ml的浓度添加)([hGMCSF，hIL4]组)、或融合蛋白PSA-hGMCSF(以1μg/ml的浓度添加)([PSA-hGMCSF]组)、或在PSA-hGMCSF基础上进一步追加1种融合蛋白(均以1μg/ml的浓度添加)，培养3天并测定树突细胞的出现率。图23-1中示出各处置组中的诱导的树突细胞的出现率。

如图23-1所示，在单独使用PSA-hGMCSF的情况下(图的*)，与[hGMCSF,hIL4]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与使用未融合的hGMCSF和hIL4的情况相比，单独使用融合蛋白PSA-hGMCSF的情况更有用。另外，在PSA-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况下(图的)，与[PSA-hGMCSF]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与单独使用融合蛋白PSA-hGMCSF的情况相比，在PSA-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况更有用。

(2)与(1)同样地，将PAP-hGMCSF和各种融合蛋白组合来诱导树突细胞。在(1)中，将PSA-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合，在(2)中，将PAP-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合。图23-2中示出各处置组中的诱导的树突细胞的出现率。

如图23-2所示，在单独使用PAP-hGMCSF的情况下(图的*)，与[hGMCSF,hIL4]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与使用未融合的hGMCSF和hIL4的情况相比，单独使用融合蛋白PAP-hGMCSF的情况更有用。另外，在PAP-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况下(图的)，与[PAP-hGMCSF]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与单独使用融合蛋白PAP-hGMCSF的情况相比，在PAP-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况更有用。

(3)与(1)同样地，将PSMA-hGMCSF和各种融合蛋白组合来诱导树突细胞。在(1)中，将PSA-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合，在(3)中，将PSMA-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合。图23-3中示出各处置组中的诱导的树突细胞的出现率。

如图23-3所示，在单独使用PSMA-hGMCSF的情况下(图的*)，与[hGMCSF,hIL4]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与使用未融合的hGMCSF和hIL4的情况相比，单独使用融合蛋白PSMA-hGMCSF的情况更有用。另外，在PSMA-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况下(图的)，与[PSMA-hGMCSF]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与单独使用融合蛋白PSMA-hGMCSF的情况相比，在PSMA-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况更有用。

(4)与(1)同样地，将CD147-hGMCSF和各种融合蛋白组合来诱导树突细胞。在(1)中，将PSA-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合，在(4)中，将CD147-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合。图23-4中示出各处置组中的诱导的树突细胞的出现率。

如图23-4所示，在单独使用CD147-hGMCSF的情况下(图的*)，与[hGMCSF,hIL4]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与使用未融合的hGMCSF和hIL4的情况相比，单独使用融合蛋白CD147-hGMCSF的情况更有用。另外，在CD147-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况下(图的)，与[CD147-hGMCSF]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与单独使用融合蛋白CD147-hGMCSF的情况相比，在CD147-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况更有用。

(5)与(1)同样地，将MAGEA4-hGMCSF和各种融合蛋白组合来诱导树突细胞。在(1)中，将PSA-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合，在(5)中，将MAGEA4-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合。图23-5中示出各处置组中的诱导的树突细胞的出现率。

如图23-5所示，在单独使用MAGEA4-hGMCSF的情况下(图的*)，与[hGMCSF,hIL4]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与使用未融合的hGMCSF和hIL4的情况相比，单独使用融合蛋白MAGEA4-hGMCSF的情况更有用。另外，在MAGEA4-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况下(图的)，与[MAGEA4-hGMCSF]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与单独使用融合蛋白MAGEA4-hGMCSF的情况相比，在MAGEA4-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况更有用。

(6)与(1)同样地，将CEA1-hGMCSF和各种融合蛋白组合来诱导树突细胞。在(1)中，将PSA-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合，在(6)中，将CEA1-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合。图23-6中示出各处置组中的诱导的树突细胞的出现率。

如图23-6所示，在单独使用CEA1-hGMCSF的情况下(图的*)，与[hGMCSF,hIL4]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与使用未融合的hGMCSF和hIL4的情况相比，单独使用融合蛋白CEA1-hGMCSF的情况更有用。另外，在CEA1-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况下(图的)，与[CEA1-hGMCSF]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与单独使用融合蛋白CEA1-hGMCSF的情况相比，在CEA1-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况更有用。

(7)与(1)同样地，将CEA2-hGMCSF和各种融合蛋白组合来诱导树突细胞。在(1)中，将PSA-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合，在(7)中，将CEA2-hGMCSF和各种融合蛋白进行了组合。图23-7中示出各处置组中的诱导的树突细胞的出现率。

如图23-7所示，在单独使用CEA2-hGMCSF的情况下(图的*)，与[hGMCSF,hIL4]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与使用未融合的hGMCSF和hIL4的情况相比，单独使用融合蛋白CEA2-hGMCSF的情况更有用。另外，在CEA2-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况下(图的)，与[CEA2-hGMCSF]组相比树突细胞的出现率显著地上升。即，与单独使用融合蛋白CEA2-hGMCSF的情况相比，在CEA2-hGMCSF基础上进一步追加添加1种融合蛋白的情况更有用。

由实施例12示出：通过将融合蛋白的2剂组合使用，从而与单剂时相比对树突细胞的分化诱导更有用。

实施例13各种融合蛋白和将融合蛋白组合时的树突细胞的诱导(基于流式细胞术(FCM)的解析)

关于实施例11的融合蛋白的组合中的代表例，进行了对作为树突细胞的细胞表面标记物的CD86进行检测的流式细胞术(FCM)解析。在人外周血的CD14阳性单核细胞中以1μg/ml的浓度添加各1种融合蛋白，或者进一步追加另1种融合蛋白(共计2种、均以1μg/ml的浓度添加)，并培养12天，利用流式细胞术对此时的各处置组中的诱导的树突细胞(CD86阳性)进行了解析。

具体来说，在6孔板中以190万个/1孔准备人外周血的CD14阳性单核细胞，立即添加图24中记载的各种融合蛋白。以该状态培养12天，使用附加FITC的抗人CD86抗体(BD Pharmingen社：555657)进行了染色。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson)，通过1次流式细胞术(FCM)解析了5000个细胞。

在图24中示出结果。图24的A～E分别示出5个解析的结果。各结果表示处置A、处置B和处置C的结果，处置A表示无添加的CD14阳性单核细胞(培养12天后)的结果，处置B表示单独1种融合蛋白的结果，处置C表示将2种融合蛋白组合添加的结果。在图24的A的处置B中单独使用了CD147-hGMCSF，在处置C中组合使用了CD147-hGMCSF和MAGEA4-hIL4。在图24的B的处置B中单独使用了MAGEA4-hGMCSF，在处置C中组合使用了MAGEA4-hGMCSF和CD147-hIL4。在图24的C的处置B中单独使用了CEA1-hGMCSF，在处置C中组合使用了CEA1-hGMCSF和CEA2-hIL4。在图24的D的处置B中单独使用了CEA2-hGMCSF，在处置C中组合使用了CEA2-hGMCSF和CEA1-hIL4。在图24的E的处置B中单独使用了PSA-hGMCSF，在处置C中组合使用了PSA-hGMCSF和PAP-hIL4。

如图24所示，在处置B组或处置C组中，与处置A组相比显著地确认到曲线图的右位移(比CD86阳性的树突细胞[DC]多)。即，从可分化诱导更多的树突细胞(DC)的方面出发，处置B或处置C是有用的。进而在这方面，与单独使用融合蛋白的处置B相比，组合使用2种融合蛋白的处置C更有用。

实施例14各种融合蛋白和将融合蛋白组合时的细胞毒性T淋巴细胞(CD8阳性)、辅助T淋巴细胞(CD4阳性)或B淋巴细胞(CD19阳性)的诱导(基于流式细胞术(FCM)的解析)

(1)细胞毒性T淋巴细胞(CD8阳性)的诱导

在人外周血的单核细胞中以1μg/ml的浓度添加各1种融合蛋白，或者进一步追加另1种融合蛋白(共计2种、均以1μg/ml的浓度添加)，并培养4天，利用流式细胞术对此时的各处置组中的诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CD8阳性)进行了解析。

具体来说，在6孔板中以75万个/1孔准备人外周血的单核细胞，立即添加图25-1中记载的各种融合蛋白。以该状态培养4天，使用附加FITC的抗人CD8抗体(BDPharmingen社：551347)进行了染色。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson)，通过1次流式细胞术(FCM)解析了20,000个细胞。

在图25-1中示出结果。图25-1的A～E分别示出5个解析的结果。各结果表示处置A、处置B和处置C的结果，处置A表示无添加的外周血单核细胞(培养4天后)的结果，处置B表示单独1种融合蛋白的结果，处置C表示将2种融合蛋白组合添加的结果。在图25-1的A的处置B中单独使用了PSA-hIL2，在处置C中组合使用了PSA-hIL2和PAP-hIL7。在图25-1的B的处置B中单独使用了PAP-hIL2，在处置C中组合使用了PAP-IL2和PSA-hIL7。在图25-1的C的处置B中，单独使用了CD147-hIL2，在处置C中组合使用了CD147-IL2和MAGEA4-hIL7。在图25-1的D的处置B中单独使用了MAGEA4-hIL2，在处置C中组合使用了MAGEA4-hIL2和CD147-hIL7。在图25-1的E的处置B中单独使用了CEA1-IL2，在处置C中组合使用了CEA1-hIL2和CEA2-hIL7。

如图25-1所示，在处置B组或处置C组中，与处置A组相比显著地确认到曲线图的右位移(比CD8阳性的细胞毒性T淋巴细胞[CTL]多)。即，从可分化诱导更多的CTL的方面出发，处置B或处置C是有用的。进而在这方面，与单独使用融合蛋白的处置B相比，组合使用2种融合蛋白的处置C更有用。

(2)辅助T淋巴细胞(CD4阳性)的诱导

在人外周血的单核细胞中以1μg/ml的浓度添加各1种融合蛋白，或者进一步追加另1种融合蛋白(共计2种、均以1μg/ml的浓度添加)，并培养4天，利用流式细胞术对此时的各处置组中的诱导的辅助T淋巴细胞(CD4阳性)进行了解析。

具体来说，在6孔板中以75万个/1孔准备人外周血的单核细胞，立即添加图25-2中记载的各种融合蛋白。以该状态培养4天，使用附加FITC的抗人CD4抗体(BDPharmingen社：555346)进行了染色。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson)，通过1次流式细胞术(FCM)解析了20,000个细胞。

在图25-2中示出结果。图25-2的A～E分别示出5个解析的结果。各结果表示处置A、处置B和处置C的结果，处置A表示无添加的外周血单核细胞(培养4天后)的结果，处置B表示单独1种融合蛋白的结果，处置C表示将2种融合蛋白组合添加的结果。在图25-2的A的处置B中单独使用了PSA-hIL2，在处置C中组合使用了PSA-hIL2和PAP-hIL7。在图25-2的B的处置B中单独使用了PAP-hIL2，在处置C中组合使用了PAP-IL2和PSA-hIL7。在图25-2的C的处置B中单独使用了CD147-hIL2，在处置C中组合使用了CD147-IL2和MAGEA4-hIL7。在图25-2的D的处置B中单独使用了MAGEA4-hIL2，在处置C中组合使用了MAGEA4-hIL2和CD147-hIL7。在图25-2的E的处置B中单独使用了CEA2-IL2，在处置C中组合使用了CEA2-hIL2和CEA1-hIL7。

如图25-2所示，在处置B组或处置C组中，与处置A组相比显著地确认到曲线图的右位移(比CD4阳性的辅助T淋巴细胞多)。即，从可分化诱导更多的辅助T淋巴细胞L的方面出发，处置B或处置C是有用的。进而在这方面，与单独使用融合蛋白的处置B相比，组合使用2种融合蛋白的处置C更有用。

(3)B淋巴细胞(CD19阳性)的诱导

在人外周血的单核细胞中以1μg/ml的浓度添加各1种融合蛋白，或者进一步追加另1种融合蛋白(共计2种、均以1μg/ml的浓度添加)，并培养4天，利用流式细胞术对此时的各处置组中的诱导的B淋巴细胞(CD19阳性)进行了解析。

具体来说，在6孔板中以75万个/1孔准备人外周血的单核细胞，立即添加图25-3中记载的各种融合蛋白。以该状态培养4天，使用附加FITC的抗人CD19抗体(BDPharmingen社：555412)进行了染色。使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson)，通过1次流式细胞术(FCM)解析了20,000个细胞。

在图25-3中示出结果。图25-3的A～E分别示出5个解析的结果。各结果表示处置A、处置B和处置C的结果，处置A表示无添加的外周血单核细胞(培养4天后)的结果，处置B表示单独1种融合蛋白的结果，处置C表示将2种融合蛋白组合添加的结果。在图25-3的A的处置B中单独使用了PSA-hIL2，在处置C中组合使用了PSA-hIL2和PAP-hIL4。在图25-3的B的处置B中单独使用了PAP-hIL2，在处置C中组合使用了PAP-IL2和PSA-hIL4。在图25-3的C的处置B中单独使用了CD147-hIL2，在处置C中组合使用了CD147-IL2和PAP-hIL4。在图25-3的D的处置B中单独使用了MAGEA4-hIL2，在处置C中组合使用了MAGEA4-hIL2和CD147-hIL4。在图25-3的E的处置B中单独使用了CEA2-hIL2，在处置C中组合使用了CEA2-hIL2和CEA1-hIL4。

如图25-3所示，在处置B组或处置C组中，与处置A组相比显著地确认到曲线图的右位移(比CD19阳性的B淋巴细胞多)。即，从可分化诱导更多的辅助T淋巴细胞L的方面出发，处置B或处置C是有用的。进而在这方面，与单独使用融合蛋白的处置B相比，组合使用2种融合蛋白的处置C更有用。

实施例15使用了融合蛋白的小鼠模型中的治疗实验(对于大肠癌的效果)

图26中示出本实施例的治疗实验的方案。

将实验开始日作为第0天，在第0天、第3天和第6天对Balb/c小鼠(雄性、6～8周龄)共计3次腹腔内给与融合蛋白。此时，作为治疗组设定了处置1至处置3。处置1为对5只小鼠1只1次给与PBS100μl(对照)。处置2为对5只小鼠以1只1次5μg/PBS100μl给与CD147-mGMCSF。处置3为对5只小鼠分别以1只1次1.25μg/PBS100μl给与CD147-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-mIL4、CD147-hIL7。

在第10天，分别用100μl的PBS在Balb/c小鼠的左右大腿部皮下移植强制表达GFP蛋白的小鼠CT26大肠癌细胞50万个(左侧)和强制表达人CD147蛋白的CT26大肠癌细胞50万个(右侧)，分别通过表达GFP蛋白的小鼠大肠癌细胞形成皮下肿瘤，并且通过表达人CD147蛋白的小鼠大肠癌细胞形成皮下肿瘤。各表达基因是在即将移植前用电穿孔设备(NEPA21，NEPA GENE CO.,LTD.Chiba,JAPAN)通过质粒载体导入的。在第24天进行肿瘤形成的确认和肿瘤大小的测定。

结果示于图27。图27的A示出表达GFP的肿瘤的大小，图27的B示出表达CD147的肿瘤的大小。如图27的A所示，关于表达GFP的肿瘤，在处置间未确认到肿瘤大小具有显著性差异。如图27的B所示，与处置1相比，在处置2和处置3中显著地抑制了肿瘤增殖。即，处置2和处置3更有用。该结果表明，通过处置2和处置3，确立了对于CD147蛋白的特异性的生物体免疫。

另外，关于能够确认到GFP表达肿瘤的小鼠的频率，在处置1中为5只中的5只(100％)，在处置2中为5只中的5只(100％)，在处置3中为5只中的5只(100％)。如该结果所示，在处置间未确认到肿瘤的发生频率具有显著性差异。

关于能够确认到CD147表达肿瘤的的小鼠的频率，在处置1中为5只中的5只(100％)，在处置2中为5只中的5只(100％)，在处置3中为5只中的1只(20％)。如该结果所示，与处置2相比，在处置3中显著地抑制了肿瘤植入。即，处置3更有用。

本实施例的结果表明：与单独CD147-mGMCSF相比，在同时使用CD147的4种融合蛋白的情况下，可以更牢固地确立对于CD147蛋白的特异性的生物体免疫。

由本实施例表明，本实施例中使用的融合蛋白对大肠癌治疗有用。

需要说明的是，曾认为：融合了CD147蛋白的各蛋白质通过小鼠的生物体内给药有可能会引起CD147蛋白本身的作用(显示出活性)。但是，在包含该CD147蛋白成分的融合蛋白的给药组(处置2和处置3)中，与对照组(处置1)相比并未确认到显示出副作用等的症状·观察结果。

实施例16使用了融合蛋白的小鼠模型中的治疗实验(对于膀胱癌的效果)

图28中示出本实施例的治疗实验的方案。

将实验开始日作为第0天，在第0天、第3天和第6天对C3H/HeN小鼠(雄性、6～8周龄)共计3次腹腔内给与融合蛋白。此时，作为治疗组设定了处置4至处置6。处置4为对5只小鼠1只1次给与PBS100μl(对照)。处置5为对5只小鼠以1只1次5μg/PBS100μl给与CD147-mGMCSF。处置6为对5只小鼠分别以1只1次1.25μg/PBS 100μl给与CD147-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-mIL4、CD147-hIL7。

在第10天，分别用100μl的PBS在C3H/HeN小鼠的左右大腿部皮下移植强制表达GFP蛋白的小鼠MBT2膀胱癌细胞50万个(左侧)和强制表达人CD147蛋白的MBT2膀胱癌细胞50万个(右侧)，分别通过表达GFP蛋白的小鼠膀胱癌细胞形成皮下肿瘤，并且通过表达人CD147蛋白的小鼠膀胱癌细胞形成皮下肿瘤。各表达基因是在即将移植前用电穿孔设备(NEPA21，NEPA GENE CO.,LTD.Chiba,JAPAN)通过质粒载体导入的。在第24天进行肿瘤形成的确认和肿瘤大小的测定。

结果示于图29。图29的A示出表达GFP的肿瘤的大小，图29的B示出表达CD147的肿瘤的大小。如图29的A所示，关于表达GFP的肿瘤，在处置间未确认到肿瘤大小具有显著性差异。如图29的B所示，与处置4相比，在处置5和处置6中显著地抑制了肿瘤增殖。即，处置5和处置6更有用。该结果表明，通过处置5和处置6，确立了对于CD147蛋白的特异性的生物体免疫。

另外，关于能够确认到GFP表达肿瘤的小鼠的频率，在处置4中为5只中的5只(100％)，在处置5中为5只中的5只(100％)，在处置6中为5只中的5只(100％)。如该结果所示，在处置间未确认到肿瘤的发生频率具有显著性差异。

关于能够确认到CD147表达肿瘤的的小鼠的频率，在处置4中为5只中的5只(100％)，在处置5中为5只中的5只(100％)，在处置6中为5只中的2只(40％)。如该结果所示，与处置5相比，在处置6中显著地抑制了肿瘤植入。即，处置6更有用。

本实施例的结果表明：与单独CD147-mGMCSF相比，在同时使用CD147的4种融合蛋白的情况下，可以更牢固地确立对于CD147蛋白的特异性的生物体免疫。

由本实施例表明，本实施例中使用的融合蛋白对膀胱癌治疗有用。

需要说明的是，曾认为：融合了CD147蛋白的各蛋白质通过小鼠的生物体内给药有可能会引起CD147蛋白本身的作用(显示出活性)。但是，在包含该CD147蛋白成分的融合蛋白的给药组(处置5和处置6)中，与对照组(处置4)相比并未确认到显示出副作用等的症状·观察结果。

实施例17使用了融合蛋白的小鼠模型中的治疗实验(对于肺癌的效果)

图30中示出本实施例的治疗实验的方案。

将实验开始日作为第0天，在第0天，在处置1～4这4组中，对于由其它C57BL/6小鼠的骨髓得到的血球系干细胞添加各融合蛋白，开始活体外(ex vivo)的处理。在第3天，在处置1～4这4组中，从C57BL/6小鼠(雄性、6～8周龄)尾静脉给与利用各融合蛋白进行了处理的作为上述小鼠骨髓来源细胞的各细胞试剂。处置1(小鼠5只)中使用的细胞试剂是将由其它C57BL/6小鼠的骨髓得到的血球系干细胞用LGM-3培养基培养3天后的细胞。处置2(小鼠5只)中使用的细胞试剂是在处置1的培养液中以10μg/ml添加CD147-mGMCSF并培养3天后的细胞。处置3(小鼠5只)中使用的细胞试剂是在处置1的培养液中以10μg/ml添加MAGAE4-mGMCSF并培养3天后的细胞。处置4(小鼠5只)中使用的细胞试剂是在处置1的培养液中分别以5μg/ml添加CD147-mGMCSF和MAGEA4-mGMCSF并培养3天后的细胞。治疗仅进行这1次。关于给与细胞数，每1只小鼠给与100万个(在200μl PBS中)细胞。

在第10天，分别用100μl的PBS在C57BL/6小鼠的左右大腿部皮下移植强制表达人CD147蛋白的小鼠LL2肺癌细胞100万个(左侧)和强制表达人MAGEA4蛋白的LL2肺癌细胞100万个(右侧)，分别通过表达人CD147蛋白的小鼠肺癌细胞形成皮下肿瘤，并且通过表达人MAGEA4蛋白的小鼠肺癌细胞形成皮下肿瘤。各表达基因是在即将移植前用电穿孔设备(NEPA21，NEPA GENE CO.,LTD.Chiba,JAPAN)通过质粒载体导入的。在第19天进行肿瘤形成的确认和肿瘤大小的测定。

结果示于图31。图31的A示出表达CD147的肿瘤的大小，图31的B示出表达MAGEA4的肿瘤的大小。如图31的A所示，关于表达CD147的肿瘤，与处置1和处置3相比，在处置2和处置4中显著地抑制了肿瘤增殖。即，处置2和处置4更有用。该结果表明，通过处置2和处置4，确立了对于CD147蛋白的特异性的免疫。另外，如图31的B所示，与处置1和处置2相比，在处置3和处置4中，显著地抑制了肿瘤增殖。即，处置3和处置4更有用。该结果表明，通过处置3和处置4，确立了对于MAGEA4蛋白的特异性的免疫。

关于能够确认到CD147表达肿瘤的小鼠的频率，在处置1中为5只中的5只(100％)，在处置2中为5只中的5只(100％)，在处置3中为5只中的5只(100％)，在处置4中为6只中的2只(33.3％)。如该结果所示，与处置2相比，在处置4中显著地抑制了肿瘤的植入。即，处置4更有用。与单独CD147-mGMCSF相比，同时使用CD147-mGMCSF和MAGEA4-mGMCSF这2种的情况下，可以更牢固地确立对于该肿瘤的生物体免疫。这表明，在处置4中对于该肿瘤的免疫在全身强烈地得到了活化，对于CD147以外的其它肿瘤抗原的生物体免疫得到了活化。

关于能够确认到MAGEA4表达肿瘤的小鼠的频率，在处置1中为5只中的5只(100％)，在处置2中为5只中的5只(100％)，在处置3中为5只中的5只(100％)，在处置4中为6只中的2只(33.3％)。如该结果所示，与处置3相比，在处置4中显著地抑制了肿瘤的植入。即，处置4更有用。与单独MAGEA4-mGMCSF相比，同时使用CD147-mGMCSF和MAGEA4-mGMCSF这2种的情况下，可以更牢固地确立对于该肿瘤的生物体免疫。这表明，在处置4中对于该肿瘤的免疫在全身强烈地得到了活化，对于MAGEA4以外的其它肿瘤抗原的生物体免疫得到了活化。

由本实施例表明，本实施例中使用的融合蛋白对肺癌治疗有用。

另外，本实施例中，使用融合蛋白在活体外(ex vivo)对可分化为免疫活性细胞的干细胞进行处置，显示出使用处置后的细胞的免疫疗法的有用性、特别是使用了干细胞的治疗的有用性。

需要说明的是，在给与了用融合蛋白进行了处理的上述细胞的小鼠的治疗组(处置1～4)中，与对照组(未治疗的小鼠)相比，未确认到显示出副作用等的症状·观察结果。

实施例18使用了融合蛋白的小鼠模型中的治疗实验(对于胃癌的效果)

图32中示出本实施例的治疗实验的方案。

将实验开始日作为第0天，在第0天、第3天和第6天对裸小鼠(雄性、6～8周龄)共计3次腹腔内给与融合蛋白。此时，作为治疗组设定了处置1至处置3。处置1为对5只小鼠1只1次给与PBS100μl(对照)。处置2为对5只小鼠分别以1只1次5μg/PBS100μl给与CEA1-mGMCSF和CEA2-mGMCSF。处置3为对5只小鼠分别以1只1次1μg/PBS 100μl给与CEA1-mGMCSF、CEA1-hIL2、CEA1-mIL4、CEA1-hIL7、CEA2-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-mIL4、CEA2-hIL7。

在第10天，分别用100μl的PBS在裸小鼠的左右大腿部皮下移植强制表达人CEA蛋白(全长的668氨基酸)的人MKN1胃癌细胞100万个，通过表达人CEA蛋白的人胃癌细胞形成皮下肿瘤。各表达基因是在即将移植前用电穿孔设备(NEPA21，NEPAGENE CO.,LTD.Chiba,JAPAN)通过质粒载体导入的。在第19天进行肿瘤形成的确认和肿瘤大小的测定。

关于能够确认到CEA(全长)表达肿瘤的小鼠的频率，在处置1中为5只中的5只(100％)，在处置2中为5只中的0只(0％)，在处置3中为5只中的0只(0％)。与处置1相比，在处置2和处置3中显著地抑制了肿瘤植入。即，处置2和3更有用。

本实施例的结果表明，通过处置2和处置3，确立了对于CEA蛋白的特异性的免疫。由本实施例表明，本实施例中使用的融合蛋白对胃癌治疗有用。另外，本实施例中，由于使用了裸小鼠，因而体内不存在细胞毒性T细胞。因此，可以认为：若一并考虑作为体外(in vitro)实验的实施例13和14的结果，则本实施例中确立的对于CEA蛋白的特异性的免疫是基于B淋巴细胞介导的体液免疫的活化的。

工业实用性

本发明的癌特异性抗原与细胞因子的融合蛋白能够用作癌症治疗药。使用PSA、PAP或PSMA作为癌特异性抗原的情况下，能够用作前列腺癌治疗药。另外，使用MAGEA4、CD147或CEA作为癌特异性抗原的情况下，能够用作广泛癌种的治疗药。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请直接作为参考而援引到本说明书中。

序列表自由文本

序列号1～13合成

Claims (16)

1.一种癌的预防或治疗用药物组合物，其包含癌特异性抗原与下述细胞因子的融合蛋白中的单独一种或两种以上作为有效成分，该细胞因子选自由人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)和小鼠GMCSF(mGMCSF)组成的组。

2.如权利要求1所述的癌的预防或治疗用药物组合物，其中，癌特异性抗原为前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)，所要预防或治疗的癌为前列腺癌。

3.如权利要求1所述的癌的预防或治疗用药物组合物，其中，癌特异性抗原为选自由MAGEA4、CD147和癌胚抗原(CEA)组成的组中的癌特异性抗原，所要预防或治疗的癌选自由脑·神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝细胞癌、口腔癌、淋巴瘤·白血病等血液癌、恶性淋巴瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、大肠癌、胆囊癌、结肠癌、胰腺癌、肛门·直肠癌、食道癌、宫颈癌等子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨瘤·骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤和间皮瘤组成的组。

4.一种制备具有抗癌免疫活性的免疫活性细胞的方法，其包括以下步骤：在体外，在癌特异性抗原与选自由人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)和小鼠GMCSF(mGMCSF)组成的组中的细胞因子的融合蛋白中的单独一种或两种以上的存在下，对可分化为免疫活性细胞的细胞进行培养。

5.如权利要求4所述的制备具有抗癌免疫活性的免疫活性细胞的方法，其中，癌特异性抗原为前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)，所要预防或治疗的癌为前列腺癌。

6.如权利要求4所述的制备具有抗癌免疫活性的免疫活性细胞的方法，其中，癌特异性抗原为选自由MAGEA4、CD147和癌胚抗原(CEA)组成的组中的癌特异性抗原，所要预防或治疗的癌选自由脑·神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝细胞癌、口腔癌、淋巴瘤·白血病等血液癌、恶性淋巴瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、大肠癌、胆囊癌、结肠癌、胰腺癌、肛门·直肠癌、食道癌、宫颈癌等子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨瘤·骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤和间皮瘤组成的组。

7.如权利要求4～6的任一项所述的制备具有抗癌免疫活性的免疫活性细胞的方法，其中，可分化为免疫活性细胞的细胞为从外周血、骨髓液或脐带血得到的单核细胞；或选自由诱导多能干细胞、胚性干细胞(ES细胞)、包括骨髓中的造血干细胞的血球系干细胞、间充质干细胞和组织特异性干细胞组成的组中的干细胞。

8.如权利要求4～7的任一项所述的制备免疫活性细胞的方法，其中，免疫活性细胞为选自由树突细胞、细胞毒性T淋巴细胞、辅助T淋巴细胞和B淋巴细胞组成的组中的免疫活性细胞。

9.一种癌的预防或治疗用药物组合物，其包含利用权利要求4～8的任一项所述的方法所制备的免疫活性细胞。

10.一种DNA构建体，其在具有以下所示的结构的3个构建体中的任一个插入基因的部分插入有对以PSA-hIL2、PSA-hIL4、PSA-hIL7、PSA-hGMCSF、PSA-mIL4、PSA-mGMCSF、PAP-hIL2、PAP-hIL4、PAP-hIL7、PAP-hGMCSF、PAP-mIL4、PAP-mGMCSF、PSMA-hIL2、PSMA-hIL4、PSMA-hIL7、PSMA-hGMCSF、PSMA-mIL4、PSMA-mGMCSF、MAGEA4-hIL2、MAGEA4-hIL4、MAGEA4-hIL7、MAGEA4-hGMCSF、MAGEA4-mIL4、MAGEA4-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF、CEA-hIL2、CEA-hIL4、CEA-hIL7、CEA-hGMCSF、CEA-mIL4、CEA-mGMCSF、CEA1-hIL2、CEA1-hIL4、CEA1-hIL7、CEA1-hGMCSF、CEA1-mIL4、CEA1-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-hIL4、CEA2-hIL7、CEA2-hGMCSF、CEA2-mIL4和CEA2-mGMCSF表示的48种融合蛋白进行编码的DNA中的任一种：

11.一种载体，其包含权利要求10所述的DNA构建体。

12.一种癌症治疗用制剂，其包含权利要求11所述的载体。

13.如权利要求12所述的癌症治疗用制剂，其用于治疗选自由脑·神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝细胞癌、口腔癌、淋巴瘤·白血病等血液癌、恶性淋巴瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、大肠癌、胆囊癌、结肠癌、胰腺癌、肛门·直肠癌、食道癌、宫颈癌等子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肾上腺癌、肾癌、肾盂输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、骨瘤·骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤和间皮瘤组成的组中的癌。

14.一种CD147参与的疾病的预防或治疗用药物组合物，其包含CD147与下述细胞因子的融合蛋白中的单独一种或两种以上作为有效成分，所述细胞因子选自由人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)和小鼠GMCSF(mGMCSF)组成的组。

15.一种制备可用于CD147参与的疾病的预防或治疗的细胞的方法，其包括以下步骤：在体外，在CD147与选自由人IL2(hIL2)、人IL4(hIL4)、人IL7(hIL7)、人GMCSF(hGMCSF)、小鼠IL4(mIL4)和小鼠GMCSF(mGMCSF)组成的组中的细胞因子的融合蛋白中的单独一种或两种以上的存在下，对可分化为免疫活性细胞的细胞进行培养。

16.如权利要求14所述的预防或治疗用药物组合物、或如权利要求15所述的制备可用于预防或治疗的细胞的方法，其中，CD147参与的疾病选自由肺疾病、恶性疾病、免疫相关疾病、心血管疾病、神经系统疾病、纤维化和感染症组成的组。