JP6124460B2

JP6124460B2 - 融合タンパク質を含む癌治療用医薬組成物

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Publication number: JP6124460B2
Application number: JP2013558744A
Authority: JP
Inventors: 昌実渡部; 裕巳公文; 保友那須
Original assignee: Okayama University NUC
Current assignee: Okayama University NUC
Priority date: 2012-02-16
Filing date: 2013-02-15
Publication date: 2017-05-10
Anticipated expiration: 2033-02-15
Also published as: CN104220085A; JPWO2013122178A1; WO2013122178A1; US20150284444A1

Description

本発明は、癌治療用医薬組成物に関する。

現在、新しい癌治療戦略としての「癌ワクチン」が注目され、樹状細胞療法やペプチドワクチン等が種々検討され、前立腺癌に対する癌抗原PAP(前立腺酸性フォスファターゼ; prostatic acid phosphatase)に対する樹状細胞ワクチンSipuleucel-T（Provenge（登録商標））が2011年4月に米国FDAで承認された（非特許文献１を参照）。この薬剤は、患者の末梢血単核球（PBMC）を採取して、融合タンパク質であるPAP-hGMCSF剤（昆虫細胞で産生）を添加して約２日間培養して作製される細胞医薬で、この細胞医薬が、同一の患者に静脈注射により投与される。

樹状細胞の分化を促進し、抗癌免疫を活性化させるサイトカインとして、IL2、IL4、IL7、GMCSFが報告されている（非特許文献２及び３を参照）。非特許文献２には、IL2、IL4、IL7、GMCSFが、ヒトの末梢血単核球（PBMC）に作用し、樹状細胞の分化を促進し、抗癌免疫を活性化させることが記載され、非特許文献３には、IL2、IL4、IL7が、ヒトの末梢血単核球（PBMC）に作用し、リンパ球の分化を促進し、抗癌免疫を活性化させることが記載されている。

しかしながら、Sipuleucel-Tによる治療効果である生存期間の改善は、4.1カ月と限られたものであり、より治療効果の強い治療法の開発が喫緊の課題となっている。また、非特許文献２及び非特許文献３に示されるサイトカインであるIL2、IL4、IL7及びGMCSFには、従来、抗腫瘍効果が期待されていたが、実際には、それぞれのサイトカインについて前立腺癌等の癌治療での有効な治療効果は報告されておらず、それぞれのサイトカインは前立腺癌等の癌治療の臨床の場では使用されていなかった。

Kantoff PW et al., N Engl J Med. 2010 Jul 29;363(5):411-22 Zou GM et al., Eur Cytokine Netw. 2002 Apr-Jun;13(2):186-99 Alderson MR et al. J Exp Med. 1990 Aug 1;172(2):577-87

本発明は、癌特異抗原とサイトカインの融合タンパク質を癌の予防又は治療剤として用いることを目的とする。特に前立腺特異抗原(PSA)、前立腺酸性フォスファターゼ(PAP)、前立腺特異膜抗原（PSMA)、MAGEA4（melanoma-associated antigen 4)、CD147又は癌胎児性抗原（CEA)である癌特異抗原とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)又はマウスGMCSF（mGMCSF)であるサイトカインの融合タンパク質を有効成分として含む癌の予防又は治療剤の提供を目的とする。

本発明者等は、前立腺癌を対象として、生体の抗癌活性を促進することによる癌治療法の開発について鋭意検討を行った。ヒトPSA又はヒトPAPとヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)又はマウスGMCSF（mGMCSF)の融合タンパク質の生体での抗癌免疫活性に対する効果を確認した。

その結果、ヒトPSA又はPAPとマウス由来のmGMCSF又はmIL4との融合タンパク質が、前立腺癌マウスモデルの治療実験で抗癌効果を示すこと、及びヒトPSA又はPAPとマウス由来のmGMCSFとmIL4との融合タンパク質が、マウス由来の末梢血単球において樹状細胞分化誘導能を持つことを見出した。このことは、ヒトPSA又はPAPとマウス由来のmGMCSF又はmIL4との融合タンパク質が、マウス前立腺癌モデルの体内において、ヒトPSA又はPAPを抗原提示するマウス樹状細胞の作用を増強させて、それら抗原を発現する癌細胞での抗腫瘍効果を誘導することを示す。さらに、本発明者等はヒトPSA又はPAPとヒト由来のhGMCSF又はhIL4との融合タンパク質が、ヒト由来の末梢血単球において樹状細胞分化誘導能を持つことを見出し、ヒト前立腺癌マウスモデルで認められたのと同様に、ヒトPSA又はPAPとヒト由来のhGMCSF又はhIL4との融合タンパク質が、ヒト前立腺癌患者においてもヒトPSA又はPAPに対する免疫に基づく抗癌治療効果を誘導することができることを見出した。さらに、ヒトPSA又はPAPとhIL2又はhIL7の融合タンパク質が同様にヒト前立腺癌患者においてもヒトPSA又はPAPに対する免疫に基づく抗癌治療効果を誘導することができることを見出した。本発明者等は、さらに、PSMA、MAGEA4、CD147及びCEAについても、サイトカインとの融合タンパク質を作製し、癌患者において、PSMA、MAGEA4、CD147又はCEAに対する免疫に基づく抗癌治療効果を誘導することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。

[１] 癌特異抗原とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)及びマウスGMCSF（mGMCSF)からなる群から選択されるサイトカインとの融合タンパク質の単独又は複数を有効成分として含む、癌の予防又は治療用医薬組成物。

[２] 癌特異抗原が前立腺特異抗原(PSA)又は前立腺酸性フォスファターゼ(PAP)であり予防又は治療する癌が前立腺癌である、[１]の癌の予防又は治療用医薬組成物。

[３] 癌特異抗原が前立腺特異膜抗原（PSMA）であり、予防又は治療する癌が前立腺癌である、[１]の癌の予防又は治療用医薬組成物。

[４] 癌特異抗原がMAGEA4、CD147及び癌胎児性抗原（CEA）からなる群から選択される癌特異抗原である、[１]の癌の予防又は治療用医薬組成物。

[５] 予防又は治療する癌が、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝細胞癌、口腔癌、リンパ腫・白血病等の血液癌、悪性リンパ腫、グリオーマ、メラノーマ、大腸癌、胆嚢癌、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮頸癌等の子宮癌、卵巣癌、乳癌、甲状腺髄様癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫及び中皮腫からなる群から選択される、[４]の癌の予防又は治療用医薬組成物。

[６] 免疫担当細胞に分化し得る細胞をin vitroで癌特異抗原とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)及びマウスGMCSF（mGMCSF)からなる群から選択されるサイトカインとの融合タンパク質の単独または複数の存在下で培養することを含む、抗癌免疫活性を有する免疫担当細胞を調製する方法。

[７] 癌特異抗原が前立腺特異抗原(PSA)又は前立腺酸性フォスファターゼ(PAP)であり予防又は治療する癌が前立腺癌である、[６]の抗癌免疫活性を有する免疫担当細胞を調製する方法。

[８] 癌特異抗原が前立腺特異膜抗原（PSMA）であり、予防又は治療する癌が前立腺癌である、[６]の抗癌免疫活性を有する免疫担当細胞を調製する方法。

[９] 癌特異抗原がMAGEA4、CD147及び癌胎児性抗原（CEA）からなる群から選択される癌特異抗原である、[６]の抗癌免疫活性を有する免疫担当細胞を調製する方法。

[１０] 予防又は治療する癌が、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝細胞癌、口腔癌、リンパ腫・白血病等の血液癌、悪性リンパ腫、グリオーマ、メラノーマ、大腸癌、胆嚢癌、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮頸癌等の子宮癌、卵巣癌、乳癌、甲状腺髄様癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫及び中皮腫からなる群から選択される、[９]の抗癌免疫活性を有する免疫担当細胞を調製する方法。

[１１] 免疫担当細胞に分化し得る細胞が末梢血、骨髄液又は臍帯血から得た単核球である、[６]〜[１０]のいずれかの抗癌免疫活性を有する免疫担当細胞を調製する方法。

[１２] 免疫担当細胞に分化し得る細胞が幹細胞である、[６]〜[１０]のいずれかの抗癌免疫活性を有する免疫担当細胞を調製する方法。

[１３] 免疫担当細胞が、抗原提示細胞又は活性化リンパ球である、[６]〜[１２]のいずれかの免疫担当細胞を調製する方法。

[１４] [６]〜[１３]のいずれかの方法で調製した免疫担当細胞を含む、癌の予防又は治療用医薬組成物。

[１５] 以下に示す構造を有する３つのコンストラクトのいずれかの挿入遺伝子の部分に、PSA-hIL2、PSA-hIL4、PSA-hIL7、PSA-hGMCSF、PSA-mIL4、PSA-mGMCSF、PAP-hIL2、PAP-hIL4、PAP-hIL7、PAP-hGMCSF、PAP-mIL4、PAP-mGMCSF、PSMA-hIL2、PSMA-hIL4、PSMA-hIL7、PSMA-hGMCSF、PSMA-mIL4、PSMA-mGMCSF、MAGEA4-hIL2、MAGEA4-hIL4、MAGEA4-hIL7、MAGEA4-hGMCSF、MAGEA4-mIL4、MAGEA4-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF、CEA-hIL2、CEA-hIL4、CEA-hIL7、CEA-hGMCSF、CEA-mIL4、CEA-mGMCSF、CEA1-hIL2、CEA1-hIL4、CEA1-hIL7、CEA1-hGMCSF、CEA1-mIL4、CEA1-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-hIL4、CEA2-hIL7、CEA2-hGMCSF、CEA2-mIL4及びCEA2-mGMCSFで表される４８種類の融合タンパク質をコードするDNAのいずれかを挿入したDNAコンストラクト：

、

、

、及び

。

[１６] [１５]のDNAコンストラクトを含むベクター。

[１７] [１６]のベクターを含む癌治療用製剤。

[１８] 脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝細胞癌、口腔癌、リンパ腫・白血病等の血液癌、悪性リンパ腫、グリオーマ、メラノーマ、大腸癌、胆嚢癌、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮頸癌等の子宮癌、卵巣癌、乳癌、甲状腺髄様癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫及び中皮腫からなる群から選択される癌の治療用である、[１７]の癌治療用製剤。

[１９] CD147とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)及びマウスGMCSF（mGMCSF)からなる群から選択されるサイトカインとの融合タンパク質の単独又は複数を有効成分として含む、CD147が関与する疾患の予防又は治療用医薬組成物。

[２０] 免疫担当細胞に分化し得る細胞をin vitroでCD147とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)及びマウスGMCSF（mGMCSF)からなる群から選択されるサイトカインとの融合タンパク質の単独または複数の存在下で培養することを含む、CD147が関与する疾患の予防又は治療に用い得る細胞を調製する方法。

[２１] CD147が関与する疾患が、肺疾患、悪性疾患、免疫関連疾患、心血管疾患、神経系疾患、線維症及び感染症からなる群から選択される[１９]の予防又は治療用医薬組成物、又は[２０]の予防若しくは治療に用い得る細胞を調製する方法。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-032073号及び日本国特許出願2012-126467号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147、CEA等の癌特異抗原とhIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSFの融合タンパク質は癌の予防又は治療に用いることができ、癌特異抗原としてPSA、PAP又はPSMAを用いた場合には、前立腺癌の特異的な予防又は治療に用いることができる。また、MAGEA4、CD147又はCEAを用いた場合には、大腸癌、膀胱癌、肺癌、胃癌等の広範囲な癌種の予防又は治療に用いることができる。これらの融合タンパク質は、生体の内外において免疫担当細胞の抗癌免疫活性（抗腫瘍活性）を高めることができる。該融合タンパク質は直接生体に投与して生体内で樹状細胞の抗癌免疫活性を高めることもできるし、生体から単離した単球や細胞傷害性リンパ球、ヘルパーＴリンパ球、Ｂリンパ球等のリンパ球を融合タンパク質の存在下で培養し、生体外で抗癌免疫活性を有する抗原提示細胞や活性化リンパ球を作製し、これらの免疫担当細胞を生体に戻すex vivoでの細胞治療にも用いることができる。さらに、本発明の融合タンパク質により免疫担当細胞に分化し得る幹細胞用いてex vivoでの治療も可能になる。

融合タンパク質を少なくとも第１のプロモーターの下流に、発現させようとするタンパク質の遺伝子（発現させようとする遺伝子）及びポリA付加配列を含むDNA構築物を含み、さらに該構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターが連結して含まれる構造を有する発現カセットを用いたシステムを利用して製造する場合、短期間で大量生産することができる。特に上記システムを利用することにより、ヒト細胞で効率的にヒトに対して安全な大量の融合タンパク質を作製することができる。

癌特異抗原とサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造を示す図である（その１）。癌特異抗原とサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造を示す図である（その２）。癌特異抗原とサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造を示す図である（その３）。癌特異抗原とサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造を示す図である（その４）。 PSAとサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である。 PSAとサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である(図４−１の続き）。 PAPとサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である。 PAPとサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である(図５−１の続き）。 PSA又はPAPとサイトカインの融合タンパク質の製造に用いたサイトカイン（human IL2、human GMCSF及びhuman IL7）の塩基配列を示す図である。 PSA又はPAPとサイトカインの融合タンパク質の製造に用いたサイトカイン（human IL4、mouse IL4及びmouse GMCSF）の塩基配列を示す図である。 pIDT-SMARTベクターの全塩基配列を示す図である。作製した融合タンパク質を電気泳動し、CBB染色した結果を示す図である。アフィニティー精製により得た融合タンパク質を電気泳動し、CBB染色した結果を示す図である。得られた融合タンパク質溶液中の融合タンパク質の濃度を示す図である。ヒト前立腺癌モデルマウスにおける経時的な血清中PSA又はPAPの上昇及び腫瘍形成を示す図である。図８aはPSA-RM9細胞を移植したマウスを示し、図８bはPAP-RM9細胞を移植したマウスを示す。ヒト前立腺癌モデルマウスを用いた融合タンパク質（腹腔内投与）の治療効果を示す図である。ヒト前立腺癌モデルマウスを用いた融合タンパク質（尾静脈から投与）の治療効果を示す図である。市販のhGMCSFタンパク質とhIL4タンパク質のヒトPBMCへの添加により、7日後に誘導されるヒト樹状細胞の形態を示す図である。 PSA-mGMCSFとPSA-mIL4を組合せ、又はPAP-mGMCSFとPAP-mIL4を組み合せ添加した場合のマウス末梢血単核球（PBMC）から誘導される樹状細胞の出現率を示す図である。 PSA-hGMCSFとPSA-hIL4を組み合せ、又はPAP-hGMCSFとPAP-hIL4を組み合せて添加した場合の、ヒト末梢血単核球（PBMC）から誘導される樹状細胞の出現率を示す図である。精製したPSA-hGMCSF及びPAP-hGMCSFのTF-1細胞における細胞増殖作用を、MTT assayにより解析した結果を示す図である。 PSA又はPAPを含む融合タンパク質を精製（濃縮）し、電気泳動し、CBB染色した結果を示す図である。図１２aは、PSA-hGMCSF、PAP-hGMCSF、PSA-hIL2及びPAP-hIL2の結果を示し、図１２bは、PSA-hIL4、PAP-hIL4、PSA-hIL7及びPAP-hIL７の結果を示す。 PSMAとサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である。 PSMAとサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である(図１３−１の続き）。 PSMAとサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である(図１３−２の続き）。 PSMA-hGMCSF融合タンパク質を精製し、電気泳動し、CBB染色した結果を示す図である。得られたPSMA-hGMCSF融合タンパク質溶液中のPSMA-hGMCSF融合タンパク質の濃度を示す図である。精製したPSMA-hGMCSFのTF-1細胞における細胞増殖作用を、MTT assayにより解析した結果を示す図である（PSA-hGMCSF及びPAP-hGMCSFの結果も含む）。 MAGEA4とサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である。 MAGEA4とサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である(図１６−１の続き）。 MAGEA4とサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である(図１６−２の続き）。 CD147とサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である。 CD147とサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である(図１７−１の続き）。 MAGEA4又はCD147とサイトカインの融合タンパク質を精製し、電気泳動し、CBB染色した結果を示す図である。得られたMAGEA4又はCD147とサイトカインの融合タンパク質溶液中の融合タンパク質の濃度を示す図である。 CEAとサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である。 CEAとサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である(図１９−１の続き）。 CEAとサイトカインの融合タンパク質の作製に用いる発現カセットの構造及び配列を示す図である(図１９−２の続き）。 CEA及びNCAのアミノ酸配列を示す図である。精製した融合タンパク質の純度を示す結果である。図２１AはCEA1と各サイトカインとの融合タンパク質の精製前と精製後の結果を示し、図２１BはCEA2と各サイトカインとの融合タンパク質の精製前と精製後の結果を示し、図２１Cは、PSMAと各サイトカインの融合タンパク質の精製後の結果を示す。各種融合タンパク質の精製後の濃度を示す図である。 PSA-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた場合の樹状細胞の誘導を示す図である。 PAP-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた場合の樹状細胞の誘導を示す図である。 PSMA-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた場合の樹状細胞の誘導を示す図である。 CD147-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた場合の樹状細胞の誘導を示す図である。 MAGEA4-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた場合の樹状細胞の誘導を示す図である。 CEA1-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた場合の樹状細胞の誘導を示す図である。 CEA2-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた場合の樹状細胞の誘導を示す図である。各種融合タンパク質及び融合タンパク質を組み合わせた場合の樹状細胞の誘導をフローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。各種融合タンパク質及び融合タンパク質を組み合わせた場合の細胞傷害性Ｔリンパ球（CD8陽性）の誘導をフローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。各種融合タンパク質及び融合タンパク質を組み合わせた場合のヘルパーＴリンパ球（CD4陽性）の誘導をフローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。各種融合タンパク質及び融合タンパク質を組み合わせた場合のＢリンパ球（CD19陽性）の誘導をフローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。融合タンパク質を用いた大腸癌に対する効果を示す実験のプロトコールを示す図である。融合タンパク質の大腸癌に対する効果を示す図である。融合タンパク質を用いた膀胱癌に対する効果を示す実験のプロトコールを示す図である。融合タンパク質の膀胱癌に対する効果を示す図である。融合タンパク質を用いた肺癌に対する効果を示す実験のプロトコールを示す図である。融合タンパク質の肺癌に対する効果を示す図である。融合タンパク質を用いた胃癌に対する効果を示す実験のプロトコールを示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、癌特異抗原又は癌細胞において正常細胞に比べて発現が増大している抗原とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)及びマウスGMCSF（mGMCSF)からなる群から選択されるサイトカインの融合タンパク質を有効成分として含む癌の予防又は治療用医薬組成物である。癌特異抗原又は癌細胞において正常細胞に比べて発現が増大している抗原と上記サイトカインの融合タンパク質は、癌特異抗原又は癌細胞において正常細胞に比べて発現が増大している抗原と融合したサイトカインが元々有している機能を有している。本発明において、癌特異抗原という場合、癌細胞において正常細胞に比べて発現が増大している抗原も含む。

本発明で用いる癌特異抗原として、前立腺癌におけるヒト前立腺癌特異抗原（PSA)、ヒト前立腺酸性フォスファターゼ（PAP)及び前立腺特異膜抗原(PSMA：prostate specific membrane antigen)、大腸癌や消化器癌における癌胎児性抗原(CEA）、乳癌におけるHER2/neu、悪性黒色腫（メラノーマ）や他の各種癌におけるMAGEA4等のMAGE（Melanoma antigen)遺伝子ファミリーに属する抗原（MAGE)、白血病や各種癌におけるWT1ペプチド、肝細胞癌におけるグリピカン3（GPC3）、各種癌におけるMUC1(Mucin 1)、hTERT(human telomerase reverse transcriptase)、AKAP-4（A-kinase anchor protein-4）、Survivin（baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5）、NY-ESO-1（New York esophageal squamous cell carcinoma 1）、CD147等が挙げられる。

以下、PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147及びCEAを例として本願発明について説明する。PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147及びCEAの説明に基づいて、他の癌特異抗原とサイトカインとの融合タンパク質を作製することができ、かつ該融合タンパク質を癌治療に用いることができる。

PSAは、前立腺組織中に特異的に存在する分子量約34,000の単鎖の糖蛋白質である。血清PSA値は前立腺癌、前立腺肥大症、前立腺炎、その他の前立腺疾患において上昇し、特に前立腺癌において強く発現をしている。PAPは、前立腺、赤血球、血小板、白血球、脾臓、肝臓、腎臓、骨に存在し、酸性溶液中でリン酸エステルを水解する酵素であるフォスファターゼの１種である。PAPは前立腺上皮細胞で生成される糖蛋白で前立腺組織特異分画であり、特に前立腺癌において強く発現している。

前立腺特異膜抗原（PSMA：prostate specific membrane antigen)タンパク質は、前立腺上皮に特異的に発現し、前立腺癌で発現が亢進する。酵素活性も前立腺癌において、正常組織及び前立腺肥大症組織と比べ、上昇する。難治性前立腺癌である内分泌療法抵抗性前立腺癌となった進行した前立腺癌でも、多くの症例で発現が認められている。

Melanoma antigen(MAGE)遺伝子ファミリーは細胞傷害性T細胞によって特異的に認識される腫瘍退縮抗原をコードする遺伝子ファミリーである。MAGE遺伝子はMAGE‐1からMAGE‐12の12の遺伝子からなる多重遺伝子（multigene）ファミリーを形成しており、MAGEA4はその中に含まれる。同ファミリーは、正常組織では精巣・胎盤及び創傷治癒過程の皮膚以外に発現が見られず、広範な種類の癌種において高頻度に発現している。具体的には、メラノーマ、乳癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞癌、食道癌、脳腫瘍、血液癌等での発現が亢進している。

CD147タンパク質は、別名Bisigin、別名extracellular matrix metalloproteinase inducer(EMMPRIN)とも呼ばれ、27kDaの糖蛋白である。CD147は癌細胞のコラゲナーゼ活性を増強し、癌細胞の細胞接着に関与する分子である。CD147は多くの種類の癌細胞で高発現し、周囲の間葉系細胞にマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-1,-2,-3などを誘導し、癌の浸潤、転移、進展に強く関与している。CD147の発現が亢進している癌種としては、膀胱癌、乳癌、肺癌、口腔癌、食道癌、皮膚癌、悪性リンパ腫、グリオーマ、卵巣癌、メラノーマ、肝細胞癌等が挙げられる。

癌胎児性抗原（CEA：carcinoembryonic antigen)タンパク質は腫瘍マーカーの一つで、細胞接着因子に関係する糖タンパク質である。大腸癌、直腸癌、甲状腺癌、食道癌、胃癌、乳癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、甲状腺髄様癌等の広範な癌種で発現が亢進している。CEAは全長配列を用いてもよいし、部分配列を用いてよい。部分配列としては、配列番号１７にアミノ酸配列が示されるCEA1や配列番号１９にアミノ酸配列が示されるCEA2が挙げられる。また、CEAはアミノ酸配列同一性が高い他のタンパク質と共にCEAファミリーを形成し、NCA（non-specific cross^reacting antigen)やPSG（pregnancy-specific glycoprotein)等が含まれる。本発明において、これらのCEAファミリーに属するタンパク質も用いることができ、全長配列も上記のCEA1やCEA2に相当する断片も用いることができる。本発明において、CEAという場合、CEA1もCEA2も含まれる。また、CEAを用いることにより、上記のCEAファミリーに属するタンパク質をターゲットとして、癌治療や他の疾患に対して免疫療法を行うことができる。

融合タンパク質の作製に用いる癌特異抗原は全長アミノ酸配列を有していてもよいし、癌特異抗原が細胞膜貫通タンパク質である場合は、細胞外領域のアミノ酸配列を有していてもよい。例えば、PSMA及びCD147は細胞膜貫通タンパク質であり、PSMA又はCD147とサイトカインとの融合タンパク質は、PSMA又はCD147の細胞外領域とサイトカインを融合させたものを用いてもよい。

本発明の癌の予防又は治療用医薬組成物が有効成分として含む融合タンパク質の例として、ヒト前立腺癌特異抗原（PSA)、ヒト前立腺酸性フォスファターゼ（PAP)、前立腺特異膜抗原（PSMA）、MAGEA4、CD147及び癌胎児性抗原（CEA）からなる群から選択される癌特異抗原とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)及びマウスGMCSF（mGMCSF)からなる群から選択されるサイトカインの融合タンパク質を挙げることができる。本発明において、例えば、PSA又はPAPと上記の各サイトカインとの融合タンパク質をPSA-hIL2、PSA-hIL4、PSA-hIL7、PSA-hGMCSF、PSA-mIL4、PSA-mGMCSF、PAP-hIL2、PAP-hIL4、PAP-hIL7、PAP-hGMCSF、PAP-mIL4、PAP-mGMCSFと称する。また、PSMA、MAGEA4、CD147又はCEAと各サイトカインとの融合タンパク質を、それぞれ、PSMA-hIL2、PSMA-hIL4、PSMA-hIL7、PSMA-hGMCSF、PSMA-mIL4、PSMA-mGMCSF、MAGEA4-hIL2、MAGEA4-hIL4、MAGEA4-hIL7、MAGEA4-hGMCSF、MAGEA4-mIL4、MAGEA4-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF、CEA-hIL2、CEA-hIL4、CEA-hIL7、CEA-hGMCSF、CEA-mIL4、CEA-mGMCSFと称する。

本発明は、これらの３６種類の融合タンパク質及びそれらを含む医薬組成物を包含する。また、CEAはCEA1又はCEA2を用いてもよく、これらと各サイトカインとの融合タンパク質を、それぞれ、CEA1-hIL2、CEA1-hIL4、CEA1-hIL7、CEA1-hGMCSF、CEA1-mIL4、CEA1-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-hIL4、CEA2-hIL7、CEA2-hGMCSF、CEA2-mIL4、CEA2-mGMCSFと称する。本発明はこれらの融合タンパク質及びそれらを含む医薬組成物をも包含する。CEA1又はCEA2との融合タンパク質を加えて、４８種類の融合タンパク質が含まれる。

上記の融合タンパク質を得るにはPSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147又はCEAをコードする遺伝子と上記サイトカインをコードする遺伝子をインフレームで連結し、発現させればよい。遺伝子の連結は、通常の遺伝子組換えの手法により行うことができる。この際、適当な制限部位を導入して行うことができる。また、融合する遺伝子の間にストップコドンが現れないようにする。融合する遺伝子の間の距離は限定されず、両者の間にリンカーが含まれていてもよい。上記PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147又はCEAは、サイトカインのアミノ酸配列のN末端側に融合させてもよいし、C末端側に融合させてもよい。

このようにして作製した融合遺伝子を入手可能な適当な発現ベクターに組み込んで、発現させ、目的の融合タンパク質を回収、精製することができる。また、この際、無細胞系（セルフリーシステム）で発現させることもできる。

ベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。

DNAのベクターへの導入は、公知の方法で行うことができる。ベクターは、種々の制限部位をその内部に持つポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限部位を含んでいることが望ましい。ベクター中の特定の制限部位を特定の制限酵素で切断し、その切断部位にDNAを挿入することができる。融合遺伝子を含む発現ベクターを適切な宿主細胞の形質転換に用いて、宿主細胞に前記融合遺伝子がコードする融合タンパク質を発現、産生させることができる。

宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、真菌細胞、パン酵母、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞等が挙げられる。

形質転換は、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション等の公知の方法で行うことができる。

得られたリコンビナント融合タンパク質は、各種の分離精製方法により、分離・精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組合せて用いることができる。この際、発現産物がGST等との融合タンパク質として発現される場合は、目的タンパク質と融合しているタンパク質又はペプチドの性質を利用して精製することもできる。例えばGSTとの融合タンパク質として発現させた場合、GSTはグルタチオンに対して親和性を有するので、グルタチオンを担体に結合させたカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより効率的に精製することができる。また、ヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現させた場合、ヒスチジンタグを有するタンパク質はキレートカラムに結合するので、キレートカラムを用いて精製することができる。

本発明者らは、遺伝子発現が上昇した遺伝子発現システムを開発しており、該遺伝子発現システムを用いて上記融合タンパク質を作製するのが好ましい。該遺伝子発現システムはWO2011/062298号公報に記載されており、該公報の記載に従って、本発明の融合タンパク質を製造することができる。

具体的には、前記遺伝子発現システムを用いて以下のように融合タンパク質を発現させることができる。

上記遺伝子発現システムにおいては、少なくとも第１のプロモーターの下流に、発現させようとするタンパク質の遺伝子（発現させようとする遺伝子）及びポリA付加配列を含むDNA構築物を含み、さらに該構築物の下流にエンハンサー又は第２のプロモーターが連結して含まれる構造を有する発現カセットを用い、該発現カセットのマルチクローニングサイトに発現しようとする遺伝子を挿入して該遺伝子を発現させる。この場合、発現させようとする遺伝子をマルチクローニング部位（挿入部位）に制限酵素が認識する配列を利用して挿入すればよい。この際、マルチクローニング部位にPSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147又はCEA等の癌特異抗原をコードするDNAとサイトカインをコードするDANを連結したDNAを挿入してもよいし、あらかじめマルチクローニングサイトの上流又は下流にPSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147又はCEA等の癌特異抗原をコードするDNAを組み込んでおき、マルチクローニング部位に該癌特異抗原との融合タンパク質を作製しようとするサイトカインをコードするDNAのみを挿入してもよい。

より具体的には、上記の発現カセットは、(i) 第１のプロモーター、発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列をこの順で連結したDNA構築物、(ii) エンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーを、(i)及び(ii)の順で含み、ポリA付加配列の直ぐ下流にエンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーが連結した構造を有する。該発現カセットを用いた場合、エンハンサーを第１のプロモーターの上流に挿入したときと比べて遺伝子のタンパク質発現が増強される。また、好ましくは連結したエンハンサーの下流に他の遺伝子発現用の機構を有さず、発現させようとする遺伝子を第１のプロモーターとエンハンサーで挟んだ構造を有する。用いるプロモーターは限定されないが、好ましくがCMV iプロモーター、SV40プロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター又はCAGプロモーターが用いられる。プロモーターはプロモーター活性を有する最小配列からなるコアプロモーターの部分を用いてもよい。

ポリA付加配列（ポリアデニル化配列、polyA）の由来は限定されず、成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列、例えばウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列やヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリA付加配列、SV40ウイルス由来ポリA付加配列、ヒトやウサギのβグロビン遺伝子由来のポリA付加配列等が挙げられる。ポリA付加配列を発現用カセットに含ませることにより、転写効率が増大する。

ポリA付加配列の下流に連結するエンハンサーも限定されないが、好ましくはCMVエンハンサー、SV40エンハンサー、hTERT（Telomerase Reverse Transcriptase）エンハンサー等を用いることができる。エンハンサーは１種類でもよいが、２つ以上の同一のエンハンサーを複数用いたり、又は異なる複数のエンハンサーを組み合わせて用いてもよい。一例として、hTERTエンハンサー、SV40エンハンサー及びCMVエンハンサーをこの順で連結したものが挙げられる。エンハンサーの直ぐ上流にUASが連結されていてもよい。UASとは、GAL4遺伝子の結合領域であり、後にGAL4遺伝子を挿入することにより、タンパク質発現が上昇させられる。

さらに発現させようとするタンパク質をコードするDNA及びポリA付加配列を含むDNA構築物の上流に複数のエンハンサー、例えば１〜４個のエンハンサーが連結されていてもよい。この上流に連結するエンハンサーは限定されないが、CMVエンハンサーが好ましい。例えば、CMVエンハンサーを４つ連結した４×CMVエンハンサー等があげられる。エンハンサーを「プロモーター−発現させようとする遺伝子−poly A付加配列」からなるDNA構築物のすぐ下流に挿入すると、従来の一般の遺伝子発現システムと比べて、強力な発現させようとする遺伝子のタンパク質発現が可能となる。

さらに、RU5’が発現させようとするタンパク質をコードするDNAの直ぐ上流に連結されていてもよい。直ぐ上流とは、他の特定の機能を有するエレメントを介さず直接連結していることをいうが、リンカーとして短い配列が間に含まれていてもよい。RU5'はHTLV由来のLTRで、挿入することにより、タンパク質発現を上昇させるエレメントである（Mol.Cell.Biol.,Vol.8(1),p.466-472,1988）。

さらに、発現用カセットの最上流にSV40-oriが連結されていてもよい。SV40-oriはSV40遺伝子の結合領域であり、後にSV40遺伝子を挿入することにより、タンパク質発現が上昇する。

上記の各エレメントは、機能的に連結している必要がある。ここで、機能的に連結しているとは、それぞれのエレメントがその機能を発揮して、発現させようとする遺伝子の発現が増強されるように連結していることをいう。

発現用カセットを挿入するベクターとしては、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等のウイルスベクターや生分解性ポリマーなどの非ウイルスベクターが挙げられる。上記発現用カセットを導入したベクターを、感染、エレクトロポレーション等の公知の方法により細胞に導入すればよい。

また、この際、公知のトランスフェクション試薬を用いて導入してもよい。

本発明の発現用カセットを挿入したベクターを細胞に導入し、該細胞をトランスフェクトすることにより、該細胞で目的遺伝子を発現させ、目的タンパク質を産生することができる。本発明の発現カセットを導入し目的タンパク質を産生させるためには、真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞及び酵母細胞などの細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属細菌等の細菌細胞が挙げられる。好ましくは、Hela細胞、HEK293細胞、CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、Vero細胞等の哺乳類細胞が用いられる。特に上記システムを利用することにより、ヒト細胞で効率的に大量の融合タンパク質を作製することができる。形質転換された前記の宿主細胞をin vitro又はin vivoで培養して目的とするタンパク質を産生させることができる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM等の公知の培養用培地を使用することができる。発現されたタンパク質は、分泌タンパク質の場合は培養液中から、非分泌タンパク質の場合は細胞抽出物中から公知の方法で精製することができる。目的タンパク質を発現し生産する場合、細胞に別々の目的遺伝子を含む複数のベクターを同時にトランスフェクトさせた生産してもよい。このようにすることにより、一度に複数のタンパク質を産生することができる。

さらに、発現した融合タンパク質を宿主細胞の外に分泌させるために、融合タンパク質にシグナルペプチドをコードするDNAを連結してもよい。シグナルペプチドをコードするDNAとしてPSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147又はCEA等の癌特異抗原のシグナルペプチドをコードするDNAを用いてもよいが、REIC/Dkk-3遺伝子のシグナルペプチドをコードするDNAを用いるのが好ましく、該シグナルペプチドを用いることにより、宿主細胞として293細胞等の哺乳類細胞を用いた場合でも、大量の融合タンパク質を細胞外に分泌された状態で得ることができる。REIC/Dkk-3遺伝子の塩基配列は、例えば、WO2008/050898に開示されている。また、上記の発現カセットのマルチクローニングサイトの上流にあらかじめPSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147又はCEA等の癌特異抗原をコードするDNAを導入しておいてもよい。マルチクローニングサイトにサイトカインをコードするDNAを挿入することにより、上記発現システムを用いてPSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147又はCEA等の癌特異抗原とサイトカインとの融合タンパク質を作製することができる。

このような発現カセットの構造の例を図１、図２、図３−１及び図３−２に示す。本発明は、図１、図２、図３−１及び図３−２に示す発現カセットの挿入遺伝子の部分に、PSA-hIL2、PSA-hIL4、PSA-hIL7、PSA-hGMCSF、PSA-mIL4、PSA-mGMCSF、PAP-hIL2、PAP-hIL4、PAP-hIL7、PAP-hGMCSF、PAP-mIL4、PAP-mGMCSF、PSMA-hIL2、PSMA-hIL4、PSMA-hIL7、PSMA-hGMCSF、PSMA-mIL4、PSMA-mGMCSF、MAGEA4-hIL2、MAGEA4-hIL4、MAGEA4-hIL7、MAGEA4-hGMCSF、MAGEA4-mIL4、MAGEA4-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF、CEA-hIL2、CEA-hIL4、CEA-hIL7、CEA-hGMCSF、CEA-mIL4、CEA-mGMCSF、CEA1-hIL2、CEA1-hIL4、CEA1-hIL7、CEA1-hGMCSF、CEA1-mIL4、CEA1-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-hIL4、CEA2-hIL7、CEA2-hGMCSF、CEA2-mIL4、CEA2-mGMCSFで表される４８種類の融合タンパク質のいずれかをコードするDNAを挿入したDNAコンストラクトも包含する。さらに、該コンストラクトを含むプラスミド、ベクターも包含する。さらに、本発明は、これらのプラスミド、ベクターを含む遺伝子治療に用い得る癌治療用製剤である医薬製剤も包含する。

図４−１及び図４−２にはPSAをコードするDNAを含む発現カセットの配列を示し（配列番号１）、図５−１及び図５−２にはPAPをコードするDNAを含む発現カセットの配列を示す（配列番号２）。さらに、図１３−１、図１３−２及び図１３−３にはPSMAをコードするDNAを含む発現カセットの配列を示し（配列番号１０）、図１６−１、図１６−２及び図１６−３にはMAGEA4をコードするDNAを含む発現カセットの配列を示し（配列番号１１）、図１７−１及び図１７−２にはCD147をコードするDNAを含む発現カセットの配列を示し（配列番号１２）、図１９−１、図１９−２及び図１９−３にはCEAをコードするDNAを含む発現カセットの配列を示す（配列番号１３）。

このようにして得られた癌特異抗原と各サイトカインとの融合タンパク質の作用は、癌特異抗原が、融合された各サイトカインの受容体を通して抗原提示前駆細胞（単球等）に取り込まれること、及び各サイトカイン自体の有する抗癌免疫活性化機能に基づく。

以下、癌特異抗原がPSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147又はCEAの場合の作用及び用途について詳細に述べる。

癌特異抗原としてPSAを用いた場合、PSAを発現するヒト前立腺癌の治療と再発予防に有用である。PSAとサイトカインとの融合タンパク質は、融合タンパク質を投与した被験体の体内で、樹状細胞等の抗原提示細胞がPSAを他の免疫担当細胞に提示し、PSAを抗原とする免疫を活性化させることにより、結果としてPSAを発現する癌細胞に対する免疫を活性化し、前立腺癌腫瘍を縮小させることができる。PSAと各サイトカインとの融合タンパク質は、具体的には、PSA-hGMCSFはヒトPBMC中の単球に作用し、PSAを抗原提示できる樹状細胞への分化を促進し、PSA-hIL4はヒトPBMC中の単球とリンパ球に作用し、PSAを抗原提示できる樹状細胞の分化を促進し、同時に抗癌作用を持つリンパ球を活性化し、PSA-hIL2はヒトPBMC中のリンパ球と単球に作用し、抗癌作用を持つリンパ球を活性化し、同時にPSAを抗原提示できる樹状細胞の分化を促進し、PSA-hIL7はヒトPBMC中のリンパ球と単球に作用し、抗癌作用を持つリンパ球を活性化し、同時にPSAを抗原提示できる樹状細胞の分化を促進する。

癌特異抗原として、PAPを用いた場合、PAPを発現するヒト前立腺癌の治療と再発予防に有用である。PAPとサイトカインとの融合タンパク質は、融合タンパク質を投与した被験体の体内で、樹状細胞等の抗原提示細胞がPAPを他の免疫担当細胞に提示し、PAPを抗原とする免疫を活性化させることにより、結果としてPAPを発現する癌細胞に対する免疫を活性化し、前立腺癌腫瘍を縮小させることができる。PAPと各サイトカインとの融合タンパク質は、具体的には、PAP-hGMCSFはヒトPBMC中の単球に作用し、PAPを抗原提示できる樹状細胞への分化を促進し、PAP-hIL4はヒトPBMC中の単球とリンパ球に作用し、PAPを抗原提示できる樹状細胞の分化を促進し、同時に抗癌作用を持つリンパ球を活性化し、PAP-hIL2はヒトPBMC中のリンパ球と単球に作用し、抗癌作用を持つリンパ球を活性化し、同時にPAPを抗原提示できる樹状細胞の分化を促進し、PAP-hIL7はヒトPBMC中のリンパ球と単球に作用し、抗癌作用を持つリンパ球を活性化し、同時にPAPを抗原提示できる樹状細胞の分化を促進する。

癌特異抗原として、PSMAを用いた場合、PSMAを発現するヒト前立腺癌の治療と再発予防に有用である。PSMAとサイトカインとの融合タンパク質は、融合タンパク質を投与した被験体の体内で、樹状細胞等の抗原提示細胞がPSMAを他の免疫担当細胞に提示し、PSMAを抗原とする免疫を活性化させることにより、結果としてPSMAを発現する癌細胞に対する免疫を活性化し、前立腺癌腫瘍を縮小させることができる。各サイトカインとの融合タンパク質の作用効果は、PSAやPAPと同様である。

癌特異抗原として、MAGEA4を用いた場合、MAGEA4を発現するメラノーマ、乳癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞癌、食道癌、脳腫瘍、血液癌等の広範な種類の癌種の治療と再発予防に有用である。MAGEA4とサイトカインとの融合タンパク質は、融合タンパク質を投与した被験体の体内で、樹状細胞等の抗原提示細胞がMAGEA4を他の免疫担当細胞に提示し、MAGEA4を抗原とする免疫を活性化させることにより、結果としてMAGEA4を発現する癌細胞に対する免疫を活性化し、前立腺癌腫瘍を縮小させることができる。各サイトカインとの融合タンパク質の作用効果は、PSAやPAPと同様である。

癌特異抗原として、CD147を用いた場合、CD147を発現する膀胱癌、乳癌、肺癌、口腔癌、食道癌、皮膚癌、悪性リンパ腫、グリオーマ、卵巣癌、メラノーマ、肝細胞癌等の広範な癌種の治療と再発予防に有用である。CD147とサイトカインとの融合タンパク質は、融合タンパク質を投与した被験体の体内で、樹状細胞等の抗原提示細胞がCD147を他の免疫担当細胞に提示し、CD147を抗原とする免疫を活性化させることにより、結果としてCD147を発現する癌細胞に対する免疫を活性化し、前立腺癌腫瘍を縮小させることができる。各サイトカインとの融合タンパク質の作用効果は、PSAやPAPと同様である。

癌特異抗原として、CEAを用いた場合、CEAを発現する大腸癌、直腸癌、甲状腺癌、食道癌、胃癌、乳癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、甲状腺髄様癌等の広範な癌種の治療と再発予防に有用である。CEAとサイトカインとの融合タンパク質は、融合タンパク質を投与した被験体の体内で、樹状細胞等の抗原提示細胞がCEAを他の免疫担当細胞に提示し、CEAを抗原とする免疫を活性化させることにより、結果としてCEAを発現する癌細胞に対する免疫を活性化し、前立腺癌腫瘍を縮小させることができる。各サイトカインとの融合タンパク質の作用効果は、PSAやPAPと同様である。

また、hIL4の代わりにマウスIL4（mIL4)を用いた場合、被験体がヒトである場合も上記のPSA-hIL4又はPAP-hIL4と同様の作用を発揮し、hGMCSFの代わりにマウスGMCSF(mGMCSF）を用いた場合、被験体がヒトである場合も上記のPSA-hGMCSF又はPAP-hGMCSFと同様の作用を発揮することができる。癌特異抗原として、PSMA、MAGEA4、CD147又はCEAを用いた場合も同様である。

上記のPSA又はPAPとサイトカインの融合タンパク質をそれぞれ単独で、又は複数を組み合わせて、前立腺癌患者に直接投与（皮下・筋肉内注射、静脈内注射等）することにより、前立腺癌治療剤として使用できる。組合せはサイトカインが同じ融合タンパク質であって癌特異抗原が異なるもの同士を組み合わせてもよいし、又は癌特異抗原が同じ融合タンパク質であってサイトカインが異なるもの同士を組み合わせてもよい。例えば、PSA-hIL2、PSA-hIL4、PSA-hIL7、PSA-hGMCSF、PSA-mIL4、PSA-mGMCSF、PAP-hIL2、PAP-hIL4、PAP-hIL7、PAP-hGMCSF、PAP-mIL4及びPAP-mGMCSFの１２種類を任意に２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類又は１２種類組み合せて前立腺癌治療に用いることができる。さらに、前立腺癌の治療剤として、PSA又はPAPとサイトカインの融合タンパク質の他にPSMAとサイトカインとの融合タンパク質を用いることができ、単独で用いてもよいし、PSA又はPAPとサイトカインの融合タンパク質と組合せて用いてもよい。例えば、上記のPSA又はPAPとサイトカインの融合タンパク質１２種類に、PSMA-hIL2、PSMA-hIL4、PSMA-hIL7、PSMA-hGMCSF、PSMA-mIL4及びPSMA-mGMCSFの６種類の融合タンパク質を加えた１８種類を任意に、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類、１６種類、１７種類又は１８種類組み合せて前立腺癌治療に用いることができる。

さらに、MAGEA4、CD147又はCEAと各種サイトカインとの融合タンパク質を組合せて用いてもよい。例えば、MAGEA4-hIL2、MAGEA4-hIL4、MAGEA4-hIL7、MAGEA4-hGMCSF、MAGEA4-mIL4、MAGEA4-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF、CEA-hIL2、CEA-hIL4、CEA-hIL7、CEA-hGMCSF、CEA-mIL4、CEA-mGMCSF、CEA1-hIL2、CEA1-hIL4、CEA1-hIL7、CEA1-hGMCSF、CEA1-mIL4、CEA1-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-hIL4、CEA2-hIL7、CEA2-hGMCSF、CEA2-mIL4、CEA2-mGMCSFの３０種類を任意に、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類、１６種類、１７種類、１８種類、１９種類、２０種類、２１種類、２２種類、２３種類、２４種類、２５種類、２６種類、２７種類、２８種類、２９種類又は３０種類組み合せて各種癌治療に用いることができる。

また、ヒトの末梢血、骨髄液、臍帯血等から得た単核球等の血液系細胞の培養液中に、これらの融合タンパク質製剤をそれぞれ単独で、又は複数を組み合わせて添加して培養し、ex vivo（生体外で）で単球とリンパ球等を同時に活性化させた後に、これらの活性化された抗癌免疫細胞を患者体内に投与して前立腺癌等の癌治療を行うこともできる。該方法においては、PSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147、CEA等の癌特異抗原とサイトカインとの融合タンパク質とヒトの末梢血等から得たPBMC等の血液系細胞を培養することにより抗腫瘍活性を有する樹状細胞等の抗原提示細胞や細胞傷害性Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、Ｂリンパ球等の活性化リンパ球を含む免疫担当細胞を調製することができる。本発明は、これらの融合タンパク質を用いて強力な抗原提示能に基づく抗腫瘍活性を有する樹状細胞をin vitroで調製する方法も包含する。このようにして得られた樹状細胞はPSA、PAP、PSMA、MAGEA4、CD147、CEA等の癌特異抗原を提示しており、生体に投与した場合に抗癌免疫活性を示す。本発明において、抗癌免疫活性を有する樹状細胞を抗癌免疫活性化樹状細胞といい、上記の融合タンパク質は樹状細胞の抗癌免疫活性化剤としても用いることができる。この場合、癌を予防又は治療しようとする被験体本人の血液系細胞を用い、処理した細胞を該被験体に戻せばよい。さらに、上記の血液系細胞に代えて、血液系細胞である免疫担当細胞に分化し得る細胞、すなわち幹細胞を用いることもできる。このような細胞として、iPS(Induced pluripotent stem）細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、骨髄中の造血幹細胞を含む血球系幹細胞、間葉系幹細胞、各種の組織特異的幹細胞やその他の多能性幹細胞が挙げられる。これらの幹細胞を用いる場合、幹細胞を本発明の融合タンパク質をex vivoで処理し、処理後の幹細胞を免疫療法に用いることができる。

ヒトの末梢血、骨髄液、臍帯血等から得た単核球等の血液系細胞も上記の血液系細胞に分化し得る細胞も免疫担当細胞に分化し得るので、本発明においてはこれらの細胞を免疫担当細胞に分化し得る細胞という。

上記のように、本願発明は、アフェレーシス(apheresis)により被験体から採取した血液系細胞に本発明の融合タンパク質を添加して培養し、再度該被験体体内に戻すことを含む、抗癌免疫療法を包含する。

本発明においては、抗原タンパク質又はそれを発現する細胞を治療ターゲットとするが、それぞれのターゲットに対する免疫の活性化の機序として、各融合タンパク質（群）により、細胞傷害性Ｔリンパ球（CD8陽性）及びＢリンパ球（CD19陽性）の両方を誘導できることが重要である。すなわち、癌抗原（CD147では、癌抗原としてのみならず、幅広い疾患の病態の原因・関連抗原として）に対する細胞性免疫[細胞傷害性Ｔリンパ球（CD8陽性）による作用]及び液性免疫[Bリンパ球（CD19陽性）による抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）等の抗体機能に基づく作用]の両方の働きの活性化が期待できる。また、各融合タンパク質（群）による樹状細胞（CD86陽性）およびヘルパーＴリンパ球（CD4陽性）の誘導は、これらの細胞性免疫および液性免疫の両方の活性化に寄与する。

上記のように、癌特異抗原として、PSA、PAP又はPSMAを用いた場合、予防又は治療対象となる癌は前立腺癌であるが、上記のMAGEA4、CD147、CEA等の癌特異抗原を選択することにより、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝細胞癌、口腔癌、リンパ腫・白血病等の血液癌、悪性リンパ腫、グリオーマ、メラノーマ、大腸癌、胆嚢癌、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮頸癌等の子宮癌、卵巣癌、乳癌、甲状腺髄様癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が対象となる。

また、CD147は種々の組織の細胞上に発現される免疫グロブリンスパーファミリーのメンバーであり、胎児発生、網膜機能、Ｔ細胞の成熟等に関与している。CD147
は、腫瘍、子宮内膜、胎盤、皮膚及び血管新生を受けている領域内で発現され、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）及びVEGF産生を刺激する。CD147は単球分化により誘導され、ヒトアテローム内で発現される。CD147は、腫瘍周囲の間質細胞によるMMP及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子系の誘導を介して、異なる腫瘍型の浸潤や転移の促進にも関与している。さらに、CD147は、血管新生、アノイキス耐性、乳酸放出、多剤耐性、及び癌細胞における細胞増殖にも関与している。CD147の過剰発現や機能の過剰は、炎症反応、肺線維症、関節リウマチ、エリテマトーデス、心不全、アルツハイマー病、並びにリンパ球内でのヒト免疫不全ウイルス及びコロナウイルスの感染性サイクルなどの他の病理過程にも関連している。このように、CD147は癌細胞に特異的に発現するだけでなく、癌以外の種々の疾患に関与している。すなわち、CD147は、腫瘍細胞による神経芽細胞からのMMPの刺激、VEGFの放出、及び血管新生の促進等の、悪性疾患に関連しており、本発明のCD147との融合タンパク質を用いることによりCD147の生物活性を阻害することによりCD147活性が発症に関与する疾患の治療又は予防を行うことが可能である。従って、CD147を用いた場合、癌以外の疾患の原因となるような細胞群を標的として、当該疾患を幅広く治療できる。種々の疾患について、CD147の存在、発現、発現上昇、活性化等が、その疾患の病態の発症、維持、悪化に関与していることが報告されている（例えば、WO2010/036460）。CD147が関与する疾患として、癌の他に、血栓形成性疾患（心筋梗塞、脳梗塞等）、ＣＯＰＤ、ＭＳ、ＡＬＳ、炎症性疾患、マラリヤ、肝硬変、治療としてＴregの抑制が望まれる疾患、全身性硬化症（ＳＳ）、リウマチ性関節炎、アルツハイマー病等が挙げられる。

具体的には、本発明のCD147との融合タンパク質であるCD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSFは単独で、又は組合せて、以下に挙げる疾患や状態の治療又は予防に用いることができる。

また、ヒトの末梢血、骨髄液、臍帯血等から得た単核球等の血液系細胞の培養液中に、CD147の融合タンパク質製剤をそれぞれ単独で、又は複数を組み合わせて添加して培養し、ex vivo（生体外で）で単球とリンパ球等を同時に活性化させた後に、これらの活性化された細胞を患者体内に投与してCD147が関与する疾患の治療を行うこともできる。該方法においては、CD147とサイトカインとの融合タンパク質とヒトの末梢血等から得たPBMC等の血液系細胞を培養することによりCD147を発現する細胞を標的とする樹状細胞等の抗原提示細胞や細胞傷害性Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、Ｂリンパ球等の活性化リンパ球を含む免疫担当細胞を調製することができる。本発明は、CD147の融合タンパク質を用いて強力な抗原提示能に基づくCD147を発現する細胞を標的とする樹状細胞をin vitroで調製する方法も包含する。このようにして得られた樹状細胞はCD147を提示しており、生体に投与した場合にCD147を発現する細胞を攻撃する活性を示す。この場合、CD147が関与する疾患を予防又は治療しようとする被験体本人の血液系細胞を用い、処理した細胞を該被験体に戻せばよい。さらに、上記の血液系細胞に代えて、血液系細胞である免疫担当細胞に分化し得る細胞、すなわち幹細胞を用いることもできる。このような細胞として、iPS(Induced pluripotent stem）細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、骨髄中の造血幹細胞を含む血球系幹細胞、間葉系幹細胞、各種の組織特異的幹細胞やその他の多能性幹細胞が挙げられる。これらの幹細胞を用いる場合、幹細胞を本発明のCD147の融合タンパク質をex vivoで処理し、処理後の幹細胞を免疫療法に用いることができる。

上記のように、本願発明は、アフェレーシス(apheresis)により被験体から採取した血液系細胞に本発明のCD147の融合タンパク質を添加して培養し、再度該被験体体内に戻すことを含む療法を包含する。

CD147が関与する疾患、状態の治療又は予防に用いることができ、CD147が関与する状態として、例えば組織再増殖、新生物疾病、転移性疾病、及び線維化状態におけるような細胞遊走及び組織リモデリングにより仲介される疾病又は状態が挙げられる。これらの疾患や状態には、悪性及び神経系の疾患等が含まれる。CD147が関連する状態は、炎症性又は自己免疫疾患、心血管疾患、又は感染症を含む。また、本発明のCD147との融合タンパク質は、血管形成が関与する疾患の治療に有用であり、例えば眼疾患、腫瘍性疾患、再狭窄等の組織再形成やある種の細胞型の増殖、特に上皮及び扁平上皮細胞癌の治療に有用である。さらに、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、癌転移、関節リウマチ、糖尿病性網膜症や黄斑変性症の治療にも用いることができる。さらに、骨粗鬆症において見られる、又は一部の腫瘍によるPTHrP過剰発現の結果生じる、骨吸収や骨分解の予防又は治療にも用いることができる。さらに、特発性肺線維症、糖尿病性腎症、肝炎、及び肝硬変等の線維症の治療又は予防にも用いることができる。

さらに、CD147との融合タンパク質は以下の疾患の治療にも用いることができる。

肺疾患
肺炎；肺膿瘍；粉塵、ガス又は飛沫の形をした作用物質を原因とする職業性肺疾患；喘息、閉塞性線維性細気管支炎、呼吸不全、過敏性肺炎（外因性アレルギー性肺胞炎）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、及び薬物反応を含む肺の過敏性疾患；成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、グッドパスチャー症候群、慢性閉塞性気道疾患（COPD）、特発性間質性肺疾患（例えば特発性肺線維症及びサルコイドーシス、剥離性間質性肺炎、急性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連間質性肺疾患、気質性肺炎を伴う特発性閉塞性細気管支炎、リンパ球性間質性肺炎、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、特発性肺ヘモジデリン沈着症）；急性気管支炎、肺胞タンパク症、気管支拡張症、胸膜疾患、無気肺、嚢胞性線維症、肺腫瘍、及び肺栓塞症。

悪性疾患
白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はFAB ALL、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（MDS）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、原疾患又は転移性疾患のような固形腫瘍、カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、中皮腫を含む肺癌、乳癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、腺癌、扁平上皮細胞癌、肉腫、悪性黒色腫、特に転移性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、及び癌関連骨痛。

免疫関連疾患
関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎（ankylosing spondilitis）、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、突発性肺線維症、全身性血管炎／ウェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管復元術（vasectomy reversal procedure）、アレルギー性／アトピー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植片、器官移植拒絶、移植片対宿主病、全身性炎症性応答症候群、敗血症症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、やけど、電離放射線暴露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、関節リウマチ、アルコール性肝炎、慢性炎症性病態、サルコイドーシス、クローン病（Crohn’s pathology）、鎌状赤血球貧血、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性疾患、過敏反応、アレルギー性鼻炎、花粉症（hay fever）、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、蕁麻疹、全身アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、任意の器官又は組織の移植片拒絶、腎臓移植拒絶、心臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植（BMT）拒絶、移植皮膚拒絶、軟骨移植拒絶、骨移植片拒絶、小腸移植拒絶、胎児胸腺移植拒絶、副甲状腺移植拒絶、任意の器官又は組織の異種移植拒絶、同種移植片拒絶、抗受容体過敏反応、グレーブス病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体介在細胞毒性、ＩＩＩ型過敏反応、全身性エリテマトーデス、POEMS症候群（多発ニューロパチー、臓器肥大、内分泌疾患、単クローン性γグロブリン血症、及び皮膚変化症候群）、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合性結合組織病、特発性アジソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変（primary billiary cirrhosis）、白斑、血管炎、ＭＩ心臓切開術後症候群（post-MI cardiotomy syndrome）、ＩＶ型過敏症、接触性皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植片拒絶、細胞内微生物による肉芽腫、薬物感受性、代謝性／突発性、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス（hemachromatosis）、α−１−抗トリプシン欠乏症、糖尿病性網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価（hypothalamic-pituitary-adrenal axis evaluation）、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性食血細胞性リンパ組織球症（familial hematophagocytic lymphohistiocytosis）、皮膚科学的状態、乾癬、脱毛症、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、ＯＫＴ３療法、抗CD3療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（例えば喘息、貧血、悪液質等）、慢性サリチル酸塩中毒。

心血管疾患
心機能不全症候群（cardiac stun syndrome）、心筋梗塞、うっ血性心不全、卒中、虚血発作、出血、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化性疾患（diabetic ateriosclerotic disease）、高血圧、動脈性高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、不整脈、心房異所性拍動、心房粗動、心房細動（持続性又は発作性）、還流後症候群、心肺バイパス炎症応答、無秩序型又は多源性心房頻脈、規則的狭ＱＲＳ頻脈（regular narrow QRS tachycardia）、固有不整脈（specific arrythmias）、心室細動、ヒス束不整脈（His bundle arrythmias）、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性疾患、冠動脈疾病、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁膜症、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈瘤又は末梢動脈瘤、大動脈切開、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分岐の閉塞、末梢血管疾患、閉塞性動脈疾患、末梢アテローム硬化性疾患、閉塞性血栓性血管炎、機能性末梢動脈疾患、レイノー現象及び疾患、先端チアノーゼ、紅痛症、静脈性疾患、静脈血栓症、静脈瘤、動静脈瘻、リンパ浮腫（lymphederma）、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再灌流傷害、ポンプ後症候群（post pump syndrome）、虚血再灌流障害。

神経系疾患
神経変性疾患、多発性硬化症、片頭痛、AIDS認知症症候群、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎（acute transverse myelitis）などの脱髄性疾患；皮質脊髄系の病変などの錐体外路及び小脳の疾患；基底核の疾患又は小脳疾患；ハンチントン舞踏病及び老人性舞踏病などの運動過剰障害；CNSドーパミン受容体を遮断する薬物により誘導されるものなどの薬剤性運動異常症；パーキンソン病などの運動低下障害；進行性核上性麻痺；小脳の器質的病変；脊髄性運動失調、フリードライヒ失調症、脊髄小脳変性症、多系統変性症（multiple systems degenerations）（Mencel、Dejerine-Thomas、Shi-Drager,and Machado-Joseph）などの脊髄小脳変性症；全身疾患（レフサム病、無βリポタンパク質血症、運動失調、毛細血管拡張症及びミトコンドリア多系疾患（mitochondrial multi． system disorder））；多発性硬化症、急性横断性脊髄炎などの脱髄コア疾患（demyelinating core disorders）；神経性筋萎縮（筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症などの前角細胞変性）などの運動単位の疾患；アルツハイマー病；中年におけるダウン症候群；びまん性レビー小体病；レビー小体型の老年認知症；ウェルニッケ・コルサコフ症候群；慢性アルコール症；クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン−スパッツ病（Hallerrorden-Spatz disease）；並びに拳闘家認知症。

その他の疾患
肝臓線維症（アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己免疫性肝炎等）；肺線維症（強皮症、特発性肺線維症等）；腎臓線維症（強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎を含むがこれらに限定されない）；皮膚線維症（強皮症、肥厚性及びケロイド瘢痕、火傷等）；骨髄線維症；神経線維腫症；線維腫；腸線維症；及び外科手術の結果としての線維化付着などの種々の線維性疾患。

急性又は慢性細菌感染症、細菌、ウイルス、及び菌感染を含む急性及び慢性寄生又は感染プロセス、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、髄膜炎、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣなど）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、大腸菌、溶血性尿毒症症候群、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、中毒性ショック症候群、連鎖球菌筋炎、ガス壊疽、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、ニューモシスティス・カリニ肺炎、骨盤感染症、精巣炎／精巣上体炎、レジオネラ、ライム病、Ａ型インフルエンザ、エプスタイン・バーウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎。

本発明の融合タンパク質を被験体に投与する、癌の予防又は治療用医薬組成物として用いる場合、融合タンパク質並びに薬理学的に許容され得る担体、希釈剤若しくは賦形剤を含んでいてもよい。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。

該医薬組成物は、種々の形態で投与することができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬、スプレー剤、点眼剤、経鼻投与剤、貼付剤などによる非経口投与を挙げることができる。該医薬組成物は、局所投与することも可能であり、例えば癌部位に注射により投与することによりその効果を発揮し得る。好ましくは、癌病変局所に１回又は複数回、癌病変全体に本剤が行き渡るように直接注入を行う。

その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、数日又は数週間又は数ヶ月おきに１回あたり、0.001mg〜100mgを静脈注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射等によって投与すればよい。

また、本発明の融合タンパク質をex vivoでの治療に用いる場合、例えば、PBMCを10⁴〜10⁷細胞/mlの濃度で用い、融合タンパク質を１〜50μg/mlの濃度で添加して培養すればよい。

さらに、上記の本発明の融合タンパク質をコードするDNAを遺伝子治療に用いることができる。このためには、本発明の融合タンパク質をコードするDNAを適切なベクターに挿入して、該ベクターを生体に投与し、生体内で融合タンパク質を発現させればよい。例えば、PSA-hIL2、PSA-hIL4、PSA-hIL7、PSA-hGMCSF、PSA-mIL4、PSA-mGMCSF、PAP-hIL2、PAP-hIL4、PAP-hIL7、PAP-hGMCSF、PAP-mIL4、PAP-mGMCSF、PSMA-hIL2、PSMA-hIL4、PSMA-hIL7、PSMA-hGMCSF、PSMA-mIL4、PSMA-mGMCSF、MAGEA4-hIL2、MAGEA4-hIL4、MAGEA4-hIL7、MAGEA4-hGMCSF、MAGEA4-mIL4、MAGEA4-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-hIL4、CD147-hIL7、CD147-hGMCSF、CD147-mIL4、CD147-mGMCSF、CEA-hIL2、CEA-hIL4、CEA-hIL7、CEA-hGMCSF、CEA-mIL4、CEA-mGMCSF、CEA1-hIL2、CEA1-hIL4、CEA1-hIL7、CEA1-hGMCSF、CEA1-mIL4、CEA1-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-hIL4、CEA2-hIL7、CEA2-hGMCSF、CEA2-mIL4、CEA2-mGMCSFで表される４８種類の融合タンパク質をコードするDNAを、図１、図２、図３−１又は図３−２の発現カセットの挿入遺伝子の部分に挿入し、DNAコンストラクトを構築し、該DNAコンストラクトをプラスミド、ベクターに導入し、生体に投与すればよい。

前記DNAコンストラクトを導入するプラスミド、ベクターとしては、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等のウイルスベクターや生分解性ポリマーなどの非ウイルスベクターが挙げられる。上記DNAコンストラクトを導入したベクターを、感染等により細胞に導入すればよい。この際、公知のトランスフェクション試薬を用いて導入してもよい。

上記の、融合タンパク質をコードするDNAを導入したプラスミド、ベクターは、遺伝子治療の分野において使用可能な方法、例えば、静脈内投与や動脈内投与などの血管内投与、経口投与、腹腔内投与、気管内投与、気管支内投与、皮下投与、経皮投与等により投与することができる。

融合タンパク質をコードするDNAを導入したプラスミド、ベクターは、治療上有効量を投与すればよい。治療上の有効量は、遺伝子治療分野の当業者であれば容易に決定することができる。さらに、投与量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣等によって適宜変更することができる。例えば、融合タンパク質をコードするDNAを導入したアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターを、0.5×10¹¹〜2.0×10¹²viral genome／kg体重、好ましくは1.0×10¹¹〜1.0×10¹²viral genome／kg体重、さらに好ましくは1.0×10¹¹〜5.0×10¹¹viral genome／kg体重の量で投与すればよい。viral genomeは、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスのゲノムの分子数（ウイルス粒子数）を表し、particleということもある。製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。

本発明の融合タンパク質をコードするDNAをプラスミド、ベクターに導入しての遺伝子治療は、例えば、国際公開第WO2011/062298号公報の記載に従って行うことができる。

さらに、本発明は癌特異抗原を高発現するヒトの癌細胞を移植したヒト癌モデル非ヒト動物を包含する。非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、サル等を含み、好ましくはマウス又はラット等のげっ歯類動物である。該ヒト癌モデル非ヒト動物は、ヒト癌細胞株を癌特異抗原で形質転換し、該形質転換癌細胞株を非ヒト動物に移植すればよい。ヒト癌細胞株の形質転換は、上記の(i) 第１のプロモーター、発現させようとする遺伝子及びポリA付加配列をこの順で連結したDNA構築物、(ii) エンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーを、(i)及び(ii)の順で含み、ポリA付加配列の直ぐ下流にエンハンサー又は上流にUASが連結したエンハンサーが連結した構造を有する発現カセットに癌特異抗原をコードするDNAを挿入し、該発現カセットを導入したプラスミドを用いて癌細胞株を形質転換すればよい。この際、発現カセットにはネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を組み込むことにより形質転換細胞株の選択を行うことができる。用いる癌特異抗原は癌細胞株の癌種に特異的な癌特異抗原を用いればよい。例えば、RM-9細胞株等の前立腺癌細胞株をPSA又はPAPをコードするDNAを含むプラスミドで形質転換することができる。このような形質転換細胞株をPSA-RM9細胞又はPAP-RM9細胞と呼ぶ。得られた形質転換細胞株を非ヒト動物に移植することにより、癌が形成され、かつ癌特異抗原を発現し、ヒトの癌の病態と類似した病態を示すヒト癌モデル非ヒト動物を得ることができる。該ヒト癌モデル非ヒト動物は、癌治療薬のスクリーニングや評価等に用いることができる。

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

実施例１ PSA又はPAPを含む融合タンパク質の製造
PSA（prostate specific antigen)又はPAP(prostatic acid phosphatase)とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)又はマウスGMCSF（mGMCSF)の融合タンパク質を製造した。

本実施例においては、図４−１及び４−２並びに図５−１及び図５−２に示す（それぞれ、配列番号１及び配列番号２に配列を示す）発現用カセットを用いた。図４−２に示す配列は図４−１に示す配列の続きであり、図４−１に示す配列と図４−２に示す配列の間に制限酵素部位を利用してサイトカインをコードするDNAが挿入される。同様に図５−２に示す配列は図５−１に示す配列の続きであり、図５−１に示す配列と図５−２に示す配列の間に制限酵素部位を利用してサイトカインをコードするDNAが挿入される。図４−１、図４−２、図５−１及び図５−２に示す配列は連続した配列であるが、それぞれのエレメントが何かを示すためにエレメントごとに示してあり、各エレメントの後ろ、並びに図４−１及び図５−１の上の構造図には数字を付し配列中の各エレメントが何かを示してある。これらの発現カセットは図１に構造を示す発現カセットをベースに作成したものであり、図４−１又は図５−１の上に示す構造を有している。図４−１又は図５−１の上の構造を示す図において、SV40 ori（２）はSV40遺伝子の結合領域を、UAS（３）はGAL4遺伝子の結合領域を、CMVi（４）はCMViプロモーターを、RU5'（５）はHTLV由来のLTRを、REIC signal peptide（７）はREIC/Dkk-3遺伝子配列のsignal peptideをコードするDNAを示す。さらに、PSA又はPAP（８）はPSA又はPAPをコードするDNAを、BGH pA（１３）はBGH（ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリA付加配列を、hTERT enh（１５）はhTERTエンハンサーを、SV40 enh（１６）はSV40エンハンサーを、CMV enh（１７）はCMVエンハンサーを、それぞれ示す。また、図中の配列において枠で囲んだ配列は、それぞれBgl II制限酵素部位（１０）及びXba I制限酵素部位（１１）であり、マルチクローニングサイトを形成し、該制限酵素部位の間のマルチクローニングサイトに上記のhIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSFをコードするDNAのいずれかを挿入すればよい。図４−１及び図４−２並びに図５−１及び図５−２中、（１）で示すDNA配列は用いた遺伝子発現システムの骨格となるpIDT-SMARTベクターの塩基配列の一部を示し、（６）で示す配列はRU5'とREIC signal peptideをコードするDNA配列を連結する際に用いるリンカーの配列を示し、（９）で示す配列はPSA又はPAPをコードするDNA配列とサイトカインをコードするDNA配列を連結する際に用いるリンカーの配列を示し、（１２）で示す配列はtag、tga、taaの３つのストップコドンを含むDNA配列であり、（１８）で示す配列は用いた遺伝子発現システムの骨格となるpIDT-SMARTベクターの塩基配列の一部を示す。図４−１及び図４−２並びに図５−１及び図５−２に示す発現カセットにhIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSFをコードするDNAを挿入してプラスミドに導入することにより該プラスミドを用いてPSA又はPAPとhIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSFのいずれかの融合タンパク質を製造することができる。なお、REIC signal peptideは、293細胞で大量に発現された融合タンパク質が、培養液中に分泌されるように挿入されている。この際、PSAやPAPタンパク質自身のシグナルペプチドをコードする配列は取り除き、その代わりにREIC signal peptideをコードするDANを組み込んだ。上記発現カセットに挿入するhIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSFをコードするDNAを含む塩基配列をそれぞれ、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８、並びに図６−１及び図６−２に示す。配列番号３〜８に示す配列は、図６−１及び図６−２に示すように、上記の発現カセットに挿入するために前後に制限酵素部位を有し、さらにそれぞれのサイトカインをコードするDNAの下流にヒスチジン６個からなるアミノ酸配列をコードするDNAを含む。図６−１の上にDNAの構造を示す。該構造図において、BglII（１）及びXbaI（６）は制限酵素部位を示し、Cytokine（２）は各サイトカインをコードするDNAを示し、６×His tag（４）は６個のヒスチジンをコードするDNAを示し、stop codon（５）はストップコドンを示す。また、サイトカインをコードするDNAと６×His tagの間の（３）で示される配列はサイトカインをコードするDNAと６×His tagを連結するのに用いたリンカーの配列を示す。

PSA-hIL2、PAP-hIL2、PSA-hIL4、PAP-hIL4、PSA-hIL7、PAP-hIL7、PSA-hGMCSF、PAP-hGMCSF、PSA-mIL4、PAP-mIL4、PSA-mGMCSF及びPAP-mGMCSFの計12種類の融合タンパク質の分泌発現の宿主細胞として、対数増殖期にあるヒト腎臓由来細胞：FreeStyle 293-F細胞（Invitrogen社)を5〜6×10⁵細胞/mLの濃度で125mLフラスコに30mL幡種し、37℃、８％CO₂存在下でFreestyle 293 Expression 1Media （Invitrogen社)を用いて一晩振とう培養(125rpm)した。翌日、1×10⁶細胞/mLの濃度に調整し、125mLフラスコに20mL幡種した293-F細胞に対し、各20μgの配列番号１で表される発現カセットに配列番号３〜８で表されるいずれかのDNAをそれぞれ組み込んだDNA構築物を含むプラスミドDNA（6種）、並びに配列番号２で表される発現カセットに配列番号３〜８で表されるいずれかのDNAをそれぞれ組み込んだDNA構築物を含むプラスミドDNA（6種）の計12種の融合タンパク質産生のためのプラスミドDNAを遺伝子導入試薬：293 Fectin （Invitrogen社)と混合して遺伝子導入を行った。プラスミドとしては、pIDT-SMARTベクター（プロモーターの無いクローニング用プラスミドベクター（IDT社））を用いた。pIDT-SMARTベクターの全塩基配列を図６−３（配列番号９）に示す。トランスフェクト後、5日間、37℃、８％CO₂存在下にて振とう培養し、培養上清を回収した。この培養上清のうち18μLをSDS-PAGEを用いて分離し、CBB染色によってそれぞれの分子量（PSAとPAPには糖鎖付加あり）の融合タンパク質を検出した。この結果を図７−１に示す。

融合タンパク質の生産量を見積もるために、トランスフェクション5日後に回収した培養上清中に分泌されたPSA-hGMCSF及びPAP-hGMCSF融合タンパク質を、ヒスチジン親和性カラムクロマトグラフィー(TALON-Affinity Resin (Clontech社））を用いて精製し、精製した融合タンパク質溶出液をSDS-PAGEを用いて分離し、CBB染色によって融合タンパク質の純度を確認した。この結果を図７−２に示す。

さらに12種類の融合タンパク質のタンパク質量を、Bradford法及びSDS-PAGEのCBB染色で得られたバンドにより定量し、20mL培養時の精製タンパク質量から、1L培養時に得られるタンパク質量を算出した。この結果を図７−３に示す。

図７−１、図７−２及び図７−３に示すように、12種類の高濃度の融合タンパク質溶液が、ヒト293細胞での培養5日目の上清中から得られた。特に、図７−１と図７−２が示すように、上記の融合タンパク質の作製方法を用いると、His-tag column等によりアフィニティー精製を行い精製タンパク質を得る方法を用いなくても、極めて純度の高い融合タンパク質溶液を培養上清から得ることができた。また、この方法を用いることにより、12種類の大容量の融合タンパク質を作製することが可能となった。

実施例２ヒト前立腺癌モデルマウスの作出
（１）PSA-RM9細胞及びPAP-RM9細胞の確立
RM9細胞株を親株として、新規な細胞株であるPSA-RM9細胞及びPAP-RM9細胞を確立した。PSA-RM9細胞とPAP-RM9細胞は、それぞれヒトPSA又はヒトPAPを持続的に発現する細胞株である。親株であるRM9細胞株は、C57BL/6マウスの前立腺由来の癌細胞株であり、ベイラー医科大学のトンプソン教授より供与を受けた。RM9細胞株がPSAもPAPも発現していないことは確認されている。

PSA-RM9細胞及びPAP-RM9細胞は以下の方法で確立した。

まず、PSA-RM9細胞及びPAP-RM9細胞確立のために、PSA-RM9細胞用プラスミド及びPAP-RM9細胞用プラスミドを構築した。該プラスミドは、実施例１と同様にWO2011/062298号公報に記載の方法で、外来遺伝子発現用カセットを構築し、該カセットを含むプラスミドとして構築した。

PSA-RM9細胞用プラスミド
CMV enhの配列の後に、CMV promoter配列、neomycin耐性遺伝子及びSV40 polyA配列をこの順で塩基配列を組み込み、PSA-RM9細胞用プラスミドを構築した。該プラスミドを細胞に導入することにより、対象細胞にPSAタンパク質を発現させることができ、かつneomycin耐性を持たせることができる。

PAP-RM9細胞用プラスミド
CMV enhの配列の後に、CMV promoter配列、neomycin耐性遺伝子及びSV40 polyA配列」をこの順で塩基配列を組み込み、PAP-RM9細胞用プラスミドを構築した。該プラスミドを細胞に導入することにより、対象細胞にPAPタンパク質を発現させることができ、かつneomycin耐性を持たせることができる。

6 wellプレートにRM9細胞を播き、翌日、PSA又はPAPを安定発現させるための上記の2種類のプラスミド（PSA-RM9細胞用プラスミド及びPAP-RM9細胞用プラスミド）を、1 well あたり5μgずつ、リポフェクタミン2000を用いてRM9細胞をトランスフェクションした。

翌日、15cmシャーレに継代し、Geneticin (G418 Sulphate)を含む培地(濃度500μg/ml）で培養した。約２週間後、コロニーを選び、そこにある細胞をクローン株として6wellプレートに移した。PSA-RM9細胞株、PAP-RM9細胞株とも、それぞれ10クローン以上を増殖させて液体窒素保存した。

保存されたすべてのPSA-RM9細胞クローン株とPAP-RM9細胞クローン株について、それぞれヒトPSA又はヒトPAPを持続的に発現するクローン株であることを、培養上清のPSA値又はPAP値を測定することにより確認した。保存されたPSA-RM9細胞クローン株とPAP-RM9細胞クローン株について、PSA又はPAPの発現量の高いそれぞれのクローン株を選び、ヒト前立腺癌モデルマウスの作出に利用した。

（２）ヒト前立腺癌モデルマウスの作出
PSA-RM9細胞又はPAP-RM9細胞（500万個/100μL PBS）を８週齢のC57/BL6オスマウスの右大腿皮下に移植した。各細胞について４匹のマウスを使用した。移植の日をday 0とし、day 7とday 14にそれぞれ2匹ずつ犠牲にして、マウス血清中のPSA又はPAPをELISA法で測定した。day 0においては、正常マウスの血清中のPSA又はPAPをそれぞれ2匹ずつELISAで測定した。また、形成された皮下腫瘍の腫瘍重量を測定した。

結果を図８に示す。図８のグラフの値は２匹のマウスの測定値の平均である。図８aはPSA-RM9細胞移植マウスの結果であり、図８bはPAP-RM9細胞移植マウスの結果である。図８に示すように、腫瘍が大きくなるほど、血中のPSA又はPAP濃度が増加した。この現象はヒト前立腺癌患者の病態と良く類似しており、PSA-RM9細胞又はPAP-RM9細胞がヒト前立腺癌モデルマウスの作出に有用であることを示している。

実施例３ヒト前立腺癌モデルマウスを用いた治療実験
実施例２で作出したC57/BL6ヒト前立腺癌モデルマウスを用いて治療実験を行った。

治療実験１
マウスを５匹ずつ以下のグループA〜Eに分け、実施例１で作製した、融合タンパク質を試薬として用いた。

グループA （5 匹）投与無し
グループB （5 匹） PSA-mGMCSF : 5μg (PBSで100μlに調整)
グループC （5 匹） PAP-mGMCSF : 5μg (PBSで100μlに調整)
グループD （5 匹） PSA-mGMCSF : 1.25μg, PSA-mIL4 : 1.25μg, PSA-hIL2 : 1.25μg, PSA-hIL7 : 1.25μg (PBSで100μlに調整)
グループE （5 匹） PAP-mGMCSF : 1.25μg, PAP-mIL4 : 1.25μg, PAP-hIL2 : 1.25μg, PAP-hIL7 : 1.25μg (PBSで100μlに調整)
Day 0に試薬を投与して実験を開始し、Day 2、Day 4にさらに試薬を投与した。Day 7に、C57/BL6マウスの両側大腿部の皮下に、それぞれPSA-RM9細胞（左側：0.8×10⁶個）とPAP-RM9細胞（右側：1.5×10⁶個）を移植した（それぞれ100μl PBSに細胞を懸濁して移植した）。その後、Day 7に4回目の各試薬の腹腔内投与を実施した。さらに、Day 9、Day 14、Day 16及びDay 18に試薬を投与した（試薬は計９回で投与した）。Day 21に腫瘍形成の確認をし、さらに腫瘍サイズの測定を行った。

治療実験２
マウスを５匹ずつ以下のグループF及びGに分け、実施例１で作製した融合タンパク質を用いた細胞試薬を作製して、Day 0に尾静脈から投与した。

グループF （5 匹） PSA-mGMCSF : 2.5μg/ml, PSA-mIL4 : 2.5μg/ml, PSA-hIL2 : 2.5 μg/ml, PSA-hIL7 : 2.5μg/mlで、LGM-3培地でマウスPBMC（マウス末梢血単核球）を3日間培養し、1匹あたりにPBMC（1×10⁶個/500μl PBS）を、尾静脈から1回投与した。

グループG （5 匹） PAP-mGMCSF : 2.5μg/ml, PAP-mIL4 : 2.5μg/ml, PAP-hIL2 : 2.5μg/ml, PAP-hIL7 : 2.5μg/mlで、LGM-3培地でマウスPBMCを3日間培養し、1匹あたりにPBMC（1×10⁶個/500μl PBS）を、尾静脈から1回投与した。

Day 7に、C57BL6マウスの両側大腿部の皮下に、それぞれPSA-RM9細胞（左側：0.8×10⁶個）とPAP-RM9細胞（右側：1.5×10⁶個）を移植した（それぞれ100μl PBSに細胞を懸濁して移植した）。Day 21に腫瘍形成の確認をし、さらに腫瘍サイズの測定を行った。治療実験２においても、治療実験１のグループAの結果をコントロールとした。

図９−１及び図９−２に結果を示す。図９−１は治療実験１の結果を示し、a〜eは、それぞれ、グループA〜Eの結果を示す。図９−２は治療実験２の結果を示し、a〜cはそれぞれ、グループA、グループF及びグループGの結果を示す。統計分析は、「皮下腫瘍サイズ（mm³）[グループAと比較して％表示]」については、２群間で、対応のないStudent t検定を行い、p <0.05のとき有意差があると判定した。また、「皮下腫瘍形成の頻度（％）」については、カイ2乗検定を行い、p <0.05のとき有意差があると判定した。

図９−１に示すように、グループB〜Eで、投与薬剤と同じ抗原（PSA又はPAPタンパク質）を発現するRM9癌細胞で、腫瘍の形成・増大に対する治療効果が確認された。

治療実験１においては、特にグループDとEで、グループBとCと比べて顕著な治療効果（腫瘍形成の抑制では有意差あり）が確認された。この結果は、複数の融合タンパク質の組み合わせの投与により、GMCSFベースの単剤の時よりも抗癌治療効果が増強されることを示す。これは、複数の融合タンパク質を同時にマウスに投与することにより、融合タンパク質に含まれる各抗癌サイトカインの作用が生体内において相乗的に発揮され、単剤の時よりもさらに強く抗癌免疫を活性化できるからだと考えられる。

また、図９−２に示すように、治療実験２において、グループFとGで、投与薬剤と同じ抗原（PSA又はPAPタンパク質）を発現するRM9癌細胞で、腫瘍の形成・増大に対する顕著な治療効果が確認された。

実施例４ PAP又はPSAの融合タンパク質による樹状細胞の誘導
ヒト又はマウス単球に、PSA-mGMCSFとPSA-mIL4を組み合せて添加した場合、及びPAP-mGMCSFとPAP-mIL4を組み合せて添加した場合の、末梢血単核球（PBMC）の単球から誘導される樹状細胞の出現率を測定した。

ヒト及びマウスのPBMC(末梢血単核球)は健康なヒト及びマウスの血液からFicoll-Paque遠心分離を用いた標準的方法で採取した。細胞の回収率をトリパンブルー排除法で計測し、95％以上の生存率であることを確認した。単球の調製のために、PBMCをLGM-3培地(リンパ球増殖培地-3、血清非含有、Lonza)に再懸濁し、プラスチックに付着した細胞(2時間、37℃、6 wellディッシュでインキュベート)を単球として使用した。得られたヒト及びマウスの単球は、上記の融合タンパク質（各5μg/mlの濃度で)の組み合わせ、又はGM-CSF (R&D Systems) + IL-4 (R&D Systems)（それぞれ、2ng/ml)の存在下で培養した。細胞は位相差顕微鏡で観察した。

それぞれの培養の７日目において、樹状細胞の全細胞に占める割合を測定した。顕微鏡観察により、市販のhGMCSFタンパク質とhIL4タンパク質のヒト単球への添加により、7日後に誘導されるヒト樹状細胞の形態を陽性コントロールとして、この形態と同様の細胞で樹状突起が認められる細胞を、それぞれの添加群において樹状細胞として計測した。それぞれの融合タンパク質添加群において、分化誘導される樹状細胞の全細胞に占める割合は、以下のように測定した。すなわち、それぞれの添加後7日目に、顕微鏡で100倍の倍率で直視下に、ランダムな計５視野においてそれぞれ100個ずつの細胞を目視し、その100個あたりに含まれる樹状細胞の数（個）を計測した。

結果を図１０−１、図１０−２及び図１０−３に示す。図１０−１には、市販のhGMCSFタンパク質とhIL4タンパク質を組み合わせてヒトPBMCへ添加した場合の7日後に誘導されるヒト樹状細胞の形態を示す。図１０−１中、矢印で示した細胞が樹状細胞である。

図１０−２は、PSA-mGMCSFとPSA-mIL4を組合せ、又はPAP-mGMCSFとPAP-mIL4を組み合せ添加した場合のマウス末梢血単核球（PBMC）から誘導される樹状細胞の出現率を示す。図１０−２に示すように、融合タンパク質の添加無しで培養した場合の樹状細胞様細胞の割合は数％であったが、それぞれの融合タンパク質存在下で培養した場合では、20％を越える割合で樹状細胞が誘導されているのが観察された。すなわち、融合タンパク質の添加により、樹状細胞の誘導という期待された生理活性が確認された。この結果は、PSA又はPAPが融合されても、各サイトカイン（mGMCSFとmIL4）の本来の機能（樹状細胞の誘導）は保持されていることを示す。

図１０−３は、PSA-hGMCSFとPSA-hIL4を組み合せ、又はPAP-hGMCSFとPAP-hIL4を組み合せて添加した場合の、ヒト末梢血単核球（PBMC）から誘導される樹状細胞の出現率を示す。図１０−３に示すように、融合タンパク質の添加無しで培養した場合の樹状細胞様細胞の割合は数％であったが、陽性コントロールである市販のhGM-CSF+hIL-4存在下で培養した場合は約25 ％であり、また、それぞれの融合タンパク質存在下で培養した場合では、45％を越える割合で樹状細胞が誘導されているのが観察された。すなわち、融合タンパク質の添加により、樹状細胞の誘導という期待された生理活性が確認された。この結果は、PSA又はPAPが融合されても、各サイトカイン（mGMCSFとhIL4）の本来の機能（樹状細胞の誘導）は保持されていることを示す。

実施例５ PSA-hGMCSF及びPAP-hGMCSFのTF-1細胞に対する細胞増殖作用
精製したPSA-hGMCSF及びPAP-hGMCSFを用いてTF-1細胞に対する細胞増殖作用を、MTT(3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assayにより解析した。

TF-1細胞を10⁴ cells/wellで96 well plateへ播種し、さらに、それぞれの融合タンパク質についてモル濃度が300pM、100pM、33.3pM、11.1pM、3.7pM、1.2pM、0.41pMなるように3倍系列で希釈し添加した。３日間培養した後、市販の細胞増殖アッセイ試薬を用いてMTT assayを行い、570nmの吸光度を測定することにより、それぞれのwellでの細胞増殖を解析した。

結果を図１１に示す。図１１に示すように、10pM以上の濃度において、PSA-hGMCSF及びPAP-hGMCSFの２種類の融合タンパク質で、TF-1細胞の増殖活性というhGMCSFタンパク質の生理活性が確認された。このことは、PSAやPAPが融合されても、サイトカイン（hGMCSF）の本来の機能は保持されていることを示す。

実施例６ PSA又はPAPを含む融合タンパク質の精製（濃縮）
実施例１に記載の方法で、PSA-hGMCSF、PAP-hGMCSF、PSA-hIL2、PAP-hIL2、PSA-hIL4、PAP-hIL4、PSA-hIL7及びPAP-hIL７の８種類の融合タンパク質を製造し、培養上清をヒスチジン親和性カラムクロマトグラフィーにより精製し、精製した融合タンパク質溶出液をSDS-PAGEを用いて分離し、CBB染色によって融合タンパク質の純度を確認した。また、実施例１と同様に融合タンパク質のタンパク質量を、Bradford法及びSDS-PAGEのCBB染色で得られたバンドにより定量した。CBB染色の結果を図１２に示す。図１２aは、PSA-hGMCSF、PAP-hGMCSF、PSA-hIL2及びPAP-hIL2の結果を、図１２bは、PSA-hIL4、PAP-hIL4、PSA-hIL7及びPAP-hIL７の結果を示し、それぞれの融合タンパク質について濃縮前（左側のレーン）と濃縮後（右側のレーン）について示す。PSA-hGMCSF、PAP-hGMCSF、PSA-hIL2、PAP-hIL2、PSA-hIL4、PAP-hIL4、PSA-hIL7及びPAP-hIL７の８種類の融合タンパク質のタンパク質濃度は、それぞれ、0.52mg/ml、0.7mg/ml、0.31mg/ml、0.68mg/ml、0.53mg/ml、1.17mg/ml、0.13mg/ml及び0.23mg/mlであった。

本発明の融合タンパク質について、臨床で使用可能なレベルの非常に高い濃度の融合タンパク質が得られた。なお、Sipuleucel-T(Provenge（登録商標））では、細胞培養において添加するタンパク質が10μg/mlの濃度で使用されており、本発明の融合タンパク質群については、これらを希釈することにより、Sipuleucel-Tで使われている細胞培養での濃度10μg/mlよりも高い濃度で、細胞に添加することが可能である。

実施例７ PSMAを含む融合タンパク質の製造及びTF-1に対する増殖作用の解析
（１）PSMA-hGMCSF融合タンパク質の製造
PSMA(prostate specific membrane antigen)とヒトGMCSF(hGMCSF）の融合タンパク質を製造した。

本実施例においては、図１３−１、図１３−２及び図１３−３に示す（配列を配列番号１０に示す）発現用カセットを用いた。図１３−２に示す配列は図１３−１に示す配列の続きであり、図１３−３に示す配列は図１３−２に示す配列の続きである。図１３−２に示す配列と図１３−３に示す配列の間に制限酵素部位を利用してhGMCSFをコードするDNAが挿入される。図１３−１、図１３−２及び図１３−３に示す配列の意味及び各エレメントは、PSMAがPSMAをコードする配列である点以外は、実施例１のPSAを含む発現用カセット（図４−１及び図４−２）及びPAPを含む発現用カセット（図５−１及び図５−２）と同じである。なお、PSMAとしては、PSMAの細胞外領域を用いた。該発現カセットに挿入するhGMCSFをコードするDNAを含む塩基配列は配列番号６に示す。

PSMAとhGMCSFの融合タンパク質は、実施例１に記載の方法と同様の方法で作製し、精製を行った。精製により得られた融合タンパク質３μgをSDS-PAGEに供し、CBB染色によって融合タンパク質の純度を確認した。この結果を図１４−１に示す。図１４−１には、実施例１で製造したPSA-hGMCSF、PAP-GMCSF及び本実施例で製造したPMSA-hGMCSFの結果を示す。

融合タンパク質のタンパク質量を、Bradford法及びSDS-PAGEのCBB染色で得られたバンドにより定量し、20mL培養時の精製タンパク質量から、1L培養時に得られるタンパク質量を算出した)。この結果を図１４−２に示す。

図１４−１と図１４−２が示すように、純度の高いPSMA-ｈGMCSF融合タンパク質溶液を培養上清から得ることができた。PSMAは、前立腺癌の癌抗原であるため、PMSA-hGMCSFは前立腺癌の癌免疫療法に用いることが可能である。

（２）PSMA-hGMCSF融合タンパク質のTF-1細胞に対する増殖作用の解析
実施例５に記載の方法と同様の方法により、精製したPSMA-hGMCSFを用いてTF-1細胞に対する細胞増殖作用を、MTT(3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assayにより解析した。

結果を図１５に示す。図１５には、PAP-hGMCSF、PSA-hGMCSF及びGMCSF（コントロール）の結果も示す。図１５に示すように、PAP-hGMCSF及びPSA-hGMCSFと同様に、hGMCSFをPSMAと融合しても、PSMA-hGMCSF融合タンパク質は、サイトカイン（hGMCSF）の本来の機能を保持していた。このことは、PSMA-hGMCSFが前立腺癌に対する癌免疫療法に有効に用い得ることを示す。

実施例８ MAGEA4又はCD147を含む融合タンパク質の作製
MAGEA4（melanoma-associated antigen 4)又はCD147とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)又はマウスGMCSF（mGMCSF)の融合タンパク質を製造した。

製造は、実施例１に記載の方法と同様の方法で行った。本実施例においては、図１６−１、図１６−２及び図１６−３並びに図１７−１及び図１７−２に示す（それぞれ、配列番号１１及び配列番号１２に配列を示す）発現用カセットを用いた。図１６−２に示す配列は図１６−１に示す配列の続きであり、図１６−３に示す配列は図１６−２に示す配列の続きである。図１６−２に示す配列と図１６−３に示す配列の間に制限酵素部位を利用してサイトカインをコードするDNAが挿入される。同様に図１７−２に示す配列は図１７−１に示す配列の続きであり、図１７−１に示す配列と図１７−２に示す配列の間に制限酵素部位を利用してサイトカインをコードするDNAが挿入される。図１６−１、図１６−２及び図１６−３並びに図１７−１及び図１７−２に示す配列の意味及び各エレメントは、ぞれぞれ、MAGEA4がMAGEA4をコードする配列であり（図１６−１、図１６−２及び図１６−３）、CD147がCD147をコードする配列である（図１７−１及び図１７−２）点以外は、実施例１のPSAを含む発現用カセット（図４−１及び図４−２）及びPAPを含む発現用カセット（図５−１及び図５−２）と同じである。なお、CD147としては、CD147の細胞外領域を用いた。上記発現カセットに挿入するhIL2、hIL4、hIL7、hGMCSF、mIL4、mGMCSFをコードするDNAを含む塩基配列をそれぞれ、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８、並びに図６−１及び図６−２に示す。

実施例１に記載の方法と同様の方法で精製した融合タンパク質をSDS-PAGEに供し、CBB染色によって融合タンパク質の純度を確認した。この結果を図１８−１に示す。また、実施例１と同様に、融合タンパク質のタンパク質量を、Bradford法及びSDS-PAGEのCBB染色で得られたバンドにより定量し、20mL培養時の精製タンパク質量から、1L培養時に得られるタンパク質量を算出した。この結果を図１８−２に示す。図１８−１及び図１８−２に示すように、12種類の融合タンパク質（MAGEA4-hGMCSF、CD147-hGMCSF、MAGEA4-hIL2、CD147-hIL2、MAGEA4-hIL4、CD147-hIL4、MAGEA4-hIL7、CD147-hIL7、MAGEA4-mGMCSF、CD147-mGMCSF、MAGEA4-mIL4及びCD147-mIL4）について、ヒト293細胞を用いた培養５日目の上清中に高濃度で得られた。

MAGEA4及びCD147タンパク質は、幅広い癌種の癌細胞において癌抗原として機能し、癌標的治療のマーカーとなるため、MAGEA4又はCD147タンパク質と各種サイトカインの融合タンパク質を幅広い癌種に対する癌免疫療法に用いることができる。

実施例９ CEA1又はCEA2を含む融合タンパク質の作製
CEA1又はCEA2とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)又はマウスGMCSF（mGMCSF)の融合タンパク質を製造した。

ヒトCarcinoembryonic antigen (CEA, CD66e)は、結腸癌をはじめ、主に消化管の腺癌に認められる約180kDaの糖タンパク質（糖含有量50〜60％、アミノ酸は702個（シグナルペプチド含む）、Geneは19q13.2に存在）である。その発現は、消化管癌に特異的ではなく、肺、乳腺など種々の臓器の上皮性腫瘍のマーカーとして利用される。正常の大腸粘膜にもわずかながら見られ腺管表面に反応が見られるが、癌では細胞質まで強く反応する。

また、ヒトCEAのアミノ酸残基の配列に極めて高い相同性示すヒトNCA（non-specific cross-reacting antigen）やヒトPSG（pregnancy-specific glycoprotein）と呼ばれるタンパク質群が存在し、これらのタンパク質群とCEAと併せてCEAファミリーと呼ばれている。CEAを含めたこれらの遺伝子はいずれも染色体19q13.1-q13.3上に近接して存在し、生理活性としては接着分子としての機能を持つ。また、これらCEAファミリーのタンパク質群は、多彩な癌において発現している。

本実施例は、CEAファミリーのタンパク質群をターゲット抗原とした癌免疫療法が有用であることを示すために行った。

Non-specific cross-reacting antigen（NCA, CD66c）は、顆粒球系白血球等にも発現している344個（シグナルペプチドを含む）のアミノ酸から成る、約37kDa（前駆体として）の接着分子である。CEAとはファミリーを成し、次ページに示すようにNCAはCEAの一部と言って良いくらいアミノ酸残基の配列に高い相同性（下線部分）があり、免疫学的な交差反応を起こしやすい。

本実施例では、NCAを含めたこれらのCEAファミリーのタンパク質群を、包括して免疫療法におけるターゲット抗原とするために、図２０Aに下線で示した６６８アミノ酸からなるCEAタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１５、配列番号１４に該アミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を示す）の２２２アミノ酸からなる部分を「CEA1」（配列番号１７、配列番号１６に該アミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を示す）及び２２３アミノ酸からなる部分を「CEA2」（配列番号１９、配列番号１８に該アミノ酸配列をコードするDNAの塩基配列を示す）として分割して用いることにより、CEA1及びCEA2の融合タンパク質を作製した。なお、図２０Aの１番目〜３４番目のアミノ酸配列は、シグナルペプチド配列であり（枠で囲んだ部分）、本発明の融合タンパク質の製造の際には、該シグナル配列は除かれる。図２０BにNCAのアミノ酸配列を示す（配列番号２０）。上記のCEA1及びCEA2を合わせた配列部分に相同するNCAのアミノ酸配列は、図２０Bに下線で示す（配列番号２０）。図２０Bの１番目〜３４番目のアミノ酸配列は、シグナルペプチド配列（枠で囲んだ部分）であり、本発明の融合タンパク質の製造の際には、該シグナル配列は除かれる。

製造は、実施例１に記載の方法と同様の方法で行った。すなわち、図４−１及び図４−２に配列が示される発現カセットのPSAで表される挿入遺伝子の部分にCEA1及びCEA2をコードするDNAを挿入して用いた。なお、図４−１に示す配列と図４−２に示す配列の間に制限酵素部位を利用してサイトカインをコードするDNAが挿入される。

実施例１に記載の方法と同様の方法で精製した融合タンパク質をSDS-PAGEに供し、CBB染色によって融合タンパク質の純度を確認した。また、同時に精製前の融合タンパク質の純度も確認した。この結果を図２１に示す。図２１AはCEA1と各サイトカインとの融合タンパク質の精製前と精製後の結果を示し、図２１BはCEA2と各サイトカインとの融合タンパク質の精製前と精製前の結果を示す。

上記の「CEA1」及び「CEA2」として分割して用いた太字で示したCEAタンパク質のアミノ酸配列の部分は、NCAのみならずCEAファミリーのタンパク質群の多くに高い相同性を示すため、CEA1及びCEA2の融合タンパク質（サイトカイン）群を組み合わせることにより、包括してCEAファミリーのタンパク質群をターゲット抗原とする治療を実施できる。なお、得られる融合タンパク質の収穫量をより増やすために、発現タンパク質のサイズを小さくする目的で、当該部位をCEA1及びCEA2に分割する意義もある。

以上のように設計されて作製したCEA1及びCEA2の融合タンパク質を、単独または組み合わせて使用することにより、CEAファミリーのタンパク質群を幅広くターゲットとした癌及びその他の疾患に対する免疫療法を実施することが可能となる。

実施例１０ PMSAを含む融合タンパク質の作製（その２）
PMSAとヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)又はヒトGMCSF(hGMCSF）の融合タンパク質を製造した。

製造は、実施例１に記載の方法と同様の方法で行った。すなわち、実施例７では、PSMAとヒトGMCSF(hGMCSF）の融合タンパク質を製造したが、同様の方法でサイトカインを変え、PMSAとヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)又はヒトGMCSF(hGMCSF）の融合タンパク質を製造した。

実施例１に記載の方法と同様の方法で精製した融合タンパク質をSDS-PAGEに供し、CBB染色によって融合タンパク質の純度を確認した。この結果を図２１Cに示す。

実施例１１各種融合タンパク質の精製後の濃度の測定
本発明の方法で製造した各種融合タンパク質の精製後の濃度を測定した。

各種融合タンパク質のタンパク質量を、Bradford法及びSDS-PAGEのCBB染色で得られたバンドにより定量し、20mL培養時の精製タンパク質量から、1L培養時に得られるタンパク質量を算出した。この結果を図２２に示す。

各種融合タンパク質を含む125mlの培養上清を、His-tag columnによりアフィニティー精製することにより、上記の濃度の精製融合タンパク質溶液：各４mlを得ることが可能である。さらに、一般に用いられているタンパク質の限外濾過法を用いるにより、各種融合タンパク質のより効率的な（より収穫量重視の）濃縮が可能となる。

実施例１２各種融合タンパク質及び融合タンパク質を組み合わせた場合の樹状細胞の誘導
（１）実施例４の記載の方法を修飾し、PSA-hGMCSFと各種融合タンパク質を組みあわせて樹状細胞を誘導した。すなわち、ヒト末梢血のCD14陽性単球に、市販のサイトカインのhGMCSFとhIL4（いずれも、２ng/mlの濃度で添加）（[hGMCSF,hIL4]群）、又は、融合タンパク質：PSA-hGMCSF（１μg/mlの濃度で添加）（[PSA-hGMCSF]群）、又は、PSA-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加（いずれも、１μg/mlの濃度で添加）して、３日間培養して樹状細胞の出現率を測定した。図２３−１にそれぞれの処置群における、誘導される樹状細胞の出現率を示す。

図２３−１に示すように、PSA-hGMCSFを単独で用いた場合（図の＊）、[hGMCSF,hIL4]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合していないhGMCSFとhIL4を用いた場合より、融合タンパク質PSA-hGMCSFを単独で用いた場合の方がより有用であった。また、PSA-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合（図の†）、[PSA-hGMCSF]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合タンパク質PSA-hGMCSFを単独で用いた場合よりもPSA-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合の方がより有用であった。

（２）（１）と同様に、PAP-hGMCSFと各種融合タンパク質を組みあわせて樹状細胞を誘導した。（１）においては、PSA-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせたが、（２）においては、PAP-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた。図２３−２にそれぞれの処置群における、誘導される樹状細胞の出現率を示す。

図２３−２に示すように、PAP-hGMCSFを単独で用いた場合（図の＊）、[hGMCSF,hIL4]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合していないhGMCSFとhIL4を用いた場合より、融合タンパク質PAP-hGMCSFを単独で用いた場合の方がより有用であった。また、PAP-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合（図の†）、[PAP-hGMCSF]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合タンパク質PAP-hGMCSFを単独で用いた場合よりもPAP-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合の方がより有用であった。

（３）（１）と同様に、PSMA-hGMCSFと各種融合タンパク質を組みあわせて樹状細胞を誘導した。（１）においては、PSA-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせたが、（３）においては、PSMA-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた。図２３−３にそれぞれの処置群における、誘導される樹状細胞の出現率を示す。

図２３−３に示すように、PSMA-hGMCSFを単独で用いた場合（図の＊）、[hGMCSF,hIL4]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合していないhGMCSFとhIL4を用いた場合より、融合タンパク質PSMA-hGMCSFを単独で用いた場合の方がより有用であった。また、PSMA-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合（図の†）、[PSMA-hGMCSF]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合タンパク質PSMA-hGMCSFを単独で用いた場合よりもPSMA-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合の方がより有用であった。

（４）（１）と同様に、CD147-hGMCSFと各種融合タンパク質を組みあわせて樹状細胞を誘導した。（１）においては、PSA-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせたが、（４）においては、CD147-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた。図２３−４にそれぞれの処置群における、誘導される樹状細胞の出現率を示す。

図２３−４に示すように、CD147-hGMCSFを単独で用いた場合（図の＊）、[hGMCSF,hIL4]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合していないhGMCSFとhIL4を用いた場合より、融合タンパク質CD147-hGMCSFを単独で用いた場合の方がより有用であった。また、CD147-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合（図の†）、[CD147-hGMCSF]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合タンパク質CD147-hGMCSFを単独で用いた場合よりもCD147-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合の方がより有用であった。

（５）（１）と同様に、MAGEA4-hGMCSFと各種融合タンパク質を組みあわせて樹状細胞を誘導した。（１）においては、PSA-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせたが、（５）においては、MAGEA4-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた。図２３−５にそれぞれの処置群における、誘導される樹状細胞の出現率を示す。

図２３−５に示すように、MAGEA4-hGMCSFを単独で用いた場合（図の＊）、[hGMCSF,hIL4]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合していないhGMCSFとhIL4を用いた場合より、融合タンパク質MAGEA4-hGMCSFを単独で用いた場合の方がより有用であった。また、MAGEA4-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合（図の†）、[MAGEA4-hGMCSF]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合タンパク質MAGEA4-hGMCSFを単独で用いた場合よりもMAGEA4-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合の方がより有用であった。

（６）（１）と同様に、CEA1-hGMCSFと各種融合タンパク質を組みあわせて樹状細胞を誘導した。（１）においては、PSA-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせたが、（６）においては、CEA1-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた。図２３−６にそれぞれの処置群における、誘導される樹状細胞の出現率を示す。

図２３−６に示すように、CEA1-hGMCSFを単独で用いた場合（図の＊）、[hGMCSF,hIL4]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合していないhGMCSFとhIL4を用いた場合より、融合タンパク質CEA1-hGMCSFを単独で用いた場合の方がより有用であった。また、CEA1-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合（図の†）、[CEA1-hGMCSF]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合タンパク質CEA1-hGMCSFを単独で用いた場合よりもCEA1-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合の方がより有用であった。

（７）（１）と同様に、CEA2-hGMCSFと各種融合タンパク質を組みあわせて樹状細胞を誘導した。（１）においては、PSA-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせたが、（７）においては、CEA2-hGMCSFと各種融合タンパク質を組み合わせた。図２３−７にそれぞれの処置群における、誘導される樹状細胞の出現率を示す。

図２３−７に示すように、CEA2-hGMCSFを単独で用いた場合（図の＊）、[hGMCSF,hIL4]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合していないhGMCSFとhIL4を用いた場合より、融合タンパク質CEA2-hGMCSFを単独で用いた場合の方がより有用であった。また、CEA2-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合（図の†）、[CEA2-hGMCSF]群と比較して樹状細胞の出現率は有意に上昇した。すなわち、融合タンパク質CEA2-hGMCSFを単独で用いた場合よりもCEA2-hGMCSFに更に１種類の融合タンパク質を追加して添加した場合の方がより有用であった。

実施例１２により融合タンパク質の２剤を組み合わせて用いることにより、単剤の場合よりも樹状細胞の分化誘導に有用であることが示された。

実施例１３各種融合タンパク質及び融合タンパク質を組み合わせた場合の樹状細胞の誘導（フローサイトメトリー（FCM)による解析）
実施例１１の融合タンパク質の組み合わせのうち代表例について樹状細胞の細胞表面マーカーであるCD86を検出するフローサイトメトリー（FCM）解析を行った。ヒト末梢血のCD14陽性単球に、それぞれの融合タンパク質：１種類を１μｇ/ｍｌの濃度で添加、又は、更にもう１種類の融合タンパク質を追加（計２種類、いずれも、１μｇ/ｍｌの濃度で添加）して、１２日間培養した場合の、それぞれの処置群における、誘導される樹状細胞（CD86陽性）をフローサイトメトリーで解析した。

具体的には、ヒト末梢血のCD14陽性単球を、6穴plateに190万個/1 wellで準備し、直ちに図２４に記載の各種融合タンパク質を添加した。そのまま１２日間培養し、FITC付加の抗ヒトCD86抗体（BD Pharmingen社： 555657）を用いて染色した。FACSCalibur flow cytometer (Becton-Dickinson)を用いて、１回のフローサイトメトリー（FCM）で、5000個の細胞を解析した。

図２４に結果を示す。図２４A〜Eのそれぞれは、５つの解析の結果を示す。各結果は処置A、処置B及び処置Cの結果を示し、処置Aは無添加のCD14陽性単球（１２日間培養後）の結果、処置Bは１種類の融合タンパク質単独の結果、処置Cは２種類の融合タンパク質を組み合わせて添加した結果を示す。図２４Aの処置Bにおいては、CD147-hGMCSFを単独で用い、処置CにおいてはCD147-hGMCSFとMAGEA4-hIL4を組み合わせて用いた。図２４Bの処置Bにおいては、MAGEA4-hGMCSFを単独で用い、処置CにおいてはMAGEA4-hGMCSFとCD147-hIL4を組み合わせて用いた。図２４Cの処置Bにおいては、CEA1-hGMCSFを単独で用い、処置CにおいてはCEA1-hGMCSFとCEA2-hIL4を組み合わせて用いた。図２４Dの処置Bにおいては、CEA2-hGMCSFを単独で用い、処置CにおいてはCEA2-hGMCSFとCEA1-hIL4を組み合わせて用いた。図２４Eの処置Bにおいては、PSA-hGMCSFを単独で用い、処置CにおいてはPSA-hGMCSFとPAP-hIL4を組み合わせて用いた。

図２４に示すように、処置B群又は処置C群で、処置A群と比較して有意にグラフの右方変位（CD86陽性の樹状細胞[DC]がより多い）が認められた。すなわち、処置B又は処置Cは、より多くの樹状細胞（DC）を分化誘導させるという点で、有用であった。さらにこの点で、融合タンパク質を単独で用いる処置Bに比べて２種類の融合タンパク質を組み合わせて用いる処置Cの方が、より有用であった。

実施例１４各種融合タンパク質及び融合タンパク質を組み合わせた場合の細胞傷害性Ｔリンパ球（CD8陽性）、ヘルパーＴリンパ球（CD4陽性）又はＢリンパ球（CD19陽性）の誘導（フローサイトメトリー（FCM)による解析）
（１）細胞傷害性Ｔリンパ球（CD8陽性）の誘導
ヒト末梢血の単核球に、それぞれの融合タンパク質：１種類を１μg/mlの濃度で添加、または、更にもう１種類の融合タンパク質を追加（計２種類、いずれも、１μg/mlの濃度で添加）して、４日間培養した場合の、それぞれの処置群における、誘導される細胞傷害性Ｔリンパ球（CD8陽性）をフローサイトメトリーで解析した。

具体的には、ヒト末梢血の単核球を、6穴plateに75万個/1 wellで準備し、直ちに図２５−１に記載の各種融合タンパク質を添加した。そのまま４日間培養し、FITC付加の抗ヒトCD8抗体（BD Pharmingen社： 551347を用いて染色した。FACSCalibur flow cytometer (Becton-Dickinson)を用いて、１回のフローサイトメトリー（FCM）で、20,000個の細胞を解析した。

図２５−１に結果を示す。図２５−１A〜Eのそれぞれは、５つの解析の結果を示す。各結果は処置A、処置B及び処置Cの結果を示し、処置Aは無添加の末梢血単核単球（４日間培養後）の結果、処置Bは１種類の融合タンパク質単独の結果、処置Cは２種類の融合タンパク質を組み合わせて添加した結果を示す。図２５−１Aの処置Bにおいては、PSA-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはPSA-hIL2とPAP-hIL7を組み合わせて用いた。図２５−１Bの処置Bにおいては、PAP-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはPAP-IL2とPSA-hIL7を組み合わせて用いた。図２５−１Cの処置Bにおいては、CD147-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはCD147-IL2とMAGEA4-hIL7を組み合わせて用いた。図２５−１Dの処置Bにいおいては、MAGEA4-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはMAGEA4-hIL2とCD147-hIL7を組み合わせて用いた。図２５−１Eの処置Bにおいては、CEA1-IL2を単独で用い、処置CにおいてはCEA1-hIL2とCEA2-hIL7を組み合わせて用いた。

図２５−１に示すように処置B群又は処置C群で、処置A群と比較して有意にグラフの右方変位（CD8陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球[CTL]がより多い）が認められた。すなわち、処置B又は処置Cは、より多くのCTLを分化誘導させるという点で、有用であった。さらにこの点で、融合タンパク質を単独で用いる処置Bに比べて２種類の融合タンパク質を組み合わせて用いる処置Cの方が、より有用であった。

（２）ヘルパーＴリンパ球（CD4陽性）の誘導
ヒト末梢血の単核球に、それぞれの融合タンパク質：１種類を１μg/mlの濃度で添加、または、更にもう１種類の融合タンパク質を追加（計２種類、いずれも、１μg/mlの濃度で添加）して、４日間培養した場合の、それぞれの処置群における、誘導されるヘルパーＴリンパ球（CD4陽性）をフローサイトメトリーで解析した。

具体的には、ヒト末梢血の単核球を、6穴plateに75万個/1 wellで準備し、直ちに図２５−２に記載の各種融合タンパク質を添加した。そのまま４日間培養し、FITC付加の抗ヒトCD4抗体（BD Pharmingen社： 555346）を用いて染色した。FACSCalibur flow cytometer (Becton-Dickinson)を用いて、１回のフローサイトメトリー（FCM）で、20,000個の細胞を解析した。

図２５−２に結果を示す。図２５−２A〜Eのそれぞれは、５つの解析の結果を示す。各結果は処置A、処置B及び処置Cの結果を示し、処置Aは無添加の末梢血単核単球（４日間培養後）の結果、処置Bは１種類の融合タンパク質単独の結果、処置Cは２種類の融合タンパク質を組み合わせて添加した結果を示す。図２５−２Aの処置Bにおいては、PSA-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはPSA-hIL2とPAP-hIL7を組み合わせて用いた。図２５−２Bの処置Bにおいては、PAP-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはPAP-IL2とPSA-hIL7を組み合わせて用いた。図２５−２Cの処置Bにおいては、CD147-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはCD147-IL2とMAGEA4-hIL7を組み合わせて用いた。図２５−２Dの処置Bにおいては、MAGEA4-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはMAGEA4-hIL2とCD147-hIL7を組み合わせて用いた。図２５−２Eの処置Bにおいては、CEA2-IL2を単独で用い、処置CにおいてはCEA2-hIL2とCEA1-hIL7を組み合わせて用いた。

図２５−２に示すように処置B群又は処置C群で、処置A群と比較して有意にグラフの右方変位（CD4陽性のヘルパーＴリンパ球がより多い）が認められた。すなわち、処置B又は処置Cは、より多くのヘルパーＴリンパ球Lを分化誘導させるという点で、有用であった。さらにこの点で、融合タンパク質を単独で用いる処置Bに比べて２種類の融合タンパク質を組み合わせて用いる処置Cの方が、より有用であった。

（３）Ｂリンパ球（CD19陽性）の誘導
ヒト末梢血の単核球に、それぞれの融合タンパク質：１種類を１μg/mlの濃度で添加、または、更にもう１種類の融合タンパク質を追加（計２種類、いずれも、１μg/mlの濃度で添加）して、４日間培養した場合の、それぞれの処置群における、誘導されるＢリンパ球（CD19陽性）をフローサイトメトリーで解析した。

具体的には、ヒト末梢血の単核球を、6穴plateに75万個/1 wellで準備し、直ちに図２５−３に記載の各種融合タンパク質を添加した。そのまま４日間培養し、FITC付加の抗ヒトCD19抗体（BD Pharmingen社： 555412）を用いて染色した。FACSCalibur flow cytometer (Becton-Dickinson)を用いて、１回のフローサイトメトリー（FCM）で、20,000個の細胞を解析した。

図２５−３に結果を示す。図２５−３A〜Eのそれぞれは、５つの解析の結果を示す。各結果は処置A、処置B及び処置Cの結果を示し、処置Aは無添加の末梢血単核単球（４日間培養後）の結果、処置Bは１種類の融合タンパク質単独の結果、処置Cは２種類の融合タンパク質を組み合わせて添加した結果を示す。図２５−３Aの処置Bにおいては、PSA-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはPSA-hIL2とPAP-hIL4を組み合わせて用いた。図２５−３Bの処置Bにおいては、PAP-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはPAP-IL2とPSA-hIL4を組み合わせて用いた。図２５−３Cの処置Bにおいては、CD147-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはCD147-IL2とPAP-hIL4を組み合わせて用いた。図２５−３Dの処置Bにおいては、MAGEA4-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはMAGEA4-hIL2とCD147-hIL4を組み合わせて用いた。図２５−３Eの処置Bにおいては、CEA2-hIL2を単独で用い、処置CにおいてはCEA2-hIL2とCEA1-hIL4を組み合わせて用いた。

図２５−３に示すように処置B群又は処置C群で、処置A群と比較して有意にグラフの右方変位（CD19陽性のBリンパ球がより多い）が認められた。すなわち、処置B又は処置Cは、より多くのヘルパーＴリンパ球Lを分化誘導させるという点で、有用であった。さらにこの点で、融合タンパク質を単独で用いる処置Bに比べて２種類の融合タンパク質を組み合わせて用いる処置Cの方が、より有用であった。

実施例１５融合タンパク質を用いたマウスモデルでの治療実験（大腸癌に対する効果）
図２６に本実施例の治療実験のプロトコールを示す。

実験開始日をDay0とし、Day0、Day3及びDay6にBalb/cマウス（オス、6〜8週齢）に融合タンパク質を計３回腹腔内投与した。この際、治療群として処置１から処置３を設定した。処置１は５匹のマウスに１匹１回当たりPBS100μlを投与した（コントロール）。処置２は５匹のマウスにCD147-mGMCSFを１匹１回当たり５μg/PBS 100μlで投与した。処置３は５匹のマウスにCD147-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-mIL4、CD147-hIL7をそれぞれ１匹１回当たり1.25μg/PBS 100μlで投与した。

Day10に、Balb/cマウスの左右の大腿部皮下に、GFPタンパク質を強制発現させたマウスCT26大腸癌細胞50万個（左側）と、ヒトCD147タンパク質を強制発現させたCT26大腸癌細胞50万個（右側）を、それぞれ100μlのPBSで移植し、それぞれ、GFPタンパク質を発現するマウス大腸癌細胞により皮下腫瘍を形成させ、かつヒトCD147タンパク質を発現するマウス大腸癌細胞により皮下腫瘍を形成させた。それぞれの発現遺伝子は、移植直前に、エレクトロポレーション機器（NEPA21, NEPA GENE CO., LTD. Chiba, JAPAN）を用いて、プラスミドベクターにより導入した。Day24に腫瘍形成の確認及び腫瘍サイズの測定を行った。

結果を図２７に示す。図２７AはGFPを発現する腫瘍のサイズを示し、図２７BはCD147を発現する腫瘍のサイズを示す。図２７Aに示すように、GFPを発現する腫瘍については処置間で腫瘍サイズに有意差は認められなかった。図２７Bに示すように、処置１と比べ、処置２及び処置３で、有意に腫瘍増殖を抑制できた。すなわち、処置２及び処置３は、より有用であった。この結果は、処置２及び処置３により、CD147タンパク質に対する特異的な生体免疫が確立されたことを示している。

また、GFP発現の腫瘍の確認ができたマウスの頻度は、処置１で５匹中５匹（100％）、処置２で５匹中５匹（100％）、処置３で５匹中５匹（100％）であった。この結果が示すように処置間で腫瘍の発生頻度に有意差は認められなかった。

CD147発現の腫瘍の確認ができたマウスの頻度は、処置１で５匹中５匹（100％）、処置２で５匹中５匹（100％）、処置３で５匹中１匹（20％）であった。この結果が示すように、処置２と比べ、処置３で、有意に（†）腫瘍生着を抑制できた。すなわち、処置３は、より有用であった。

本実施例の結果は、CD147-mGMCSF単独より、CD147の融合タンパク質４種を同時に使用したほうが、CD147タンパク質に対する特異的な生体免疫を、より強固に確立することができることを示している。

本実施例により、本実施例で用いた融合タンパク質が大腸癌治療に有用であることが示された。

なお、CD147タンパク質を融合した各タンパク質はマウスの生体内投与により、CD147タンパク質そのものの作用を引き起こす（活性を示す）可能性が考えられた。しかしながら、このCD147タンパク質成分を含む融合タンパク質の投与群（処置２及び処置３）において、対照群（処置１）と比べて、副作用等を示す症状・所見は認められなかった。

実施例１６融合タンパク質を用いたマウスモデルでの治療実験（膀胱癌に対する効果）
図２８に本実施例の治療実験のプロトコールを示す。

実験開始日をDay0とし、Day0、Day3及びDay6にC3H/HeNマウス（オス、6〜8週齢）に融合タンパク質を計３回腹腔内投与した。この際、治療群として処置４から処置６を設定した。処置４は５匹のマウスに１匹１回当たりPBS100μlを投与した（コントロール）。処置５は５匹のマウスにCD147-mGMCSFを１匹１回当たり５μg/PBS 100μlで投与した。処置６は５匹のマウスにCD147-mGMCSF、CD147-hIL2、CD147-mIL4、CD147-hIL7をそれぞれ１匹１回当たり1.25μg/PBS 100μlで投与した。

Day10に、C3H/HeNマウスの左右の大腿部皮下に、GFPタンパク質を強制発現させたマウスMBT2膀胱癌細胞50万個（左側）と、ヒトCD147タンパク質を強制発現させたMBT2膀胱癌細胞50万個（右側）を、それぞれ100μlのPBSで移植し、それぞれ、GFPタンパク質を発現するマウス膀胱癌細胞により皮下腫瘍を形成させ、かつヒトCD147タンパク質を発現するマウス膀胱癌細胞により皮下腫瘍を形成させた。それぞれの発現遺伝子は、移植直前に、エレクトロポレーション機器（NEPA21, NEPA GENE CO., LTD. Chiba, JAPAN）を用いて、プラスミドベクターにより導入した。Day24に腫瘍形成の確認及び腫瘍サイズの測定を行った。

結果を図２９に示す。図２９AはGFPを発現する腫瘍のサイズを示し、図２９BはCD147を発現する腫瘍のサイズを示す。図２９Aに示すように、GFPを発現する腫瘍については処置間で腫瘍サイズに有意差は認められなかった。図２９Bに示すように、処置４と比べ、処置５及び処置６で、有意に腫瘍増殖を抑制できた。すなわち、処置５及び処置６は、より有用であった。この結果は、処置５及び処置６により、CD147タンパク質に対する特異的な生体免疫が確立されたことを示している。

また、GFP発現の腫瘍の確認ができたマウスの頻度は、処置４で５匹中５匹（100％）、処置５で５匹中５匹（100％）、処置６で５匹中５匹（100％）であった。この結果が示すように処置間で腫瘍の発生頻度に有意差は認められなかった。

CD147発現の腫瘍の確認ができたマウスの頻度は、処置４で５匹中５匹（100％）、処置５で５匹中５匹（100％）、処置６で５匹中２匹（40％）であった。この結果が示すように、処置５と比べ、処置６で、有意に（†）腫瘍生着を抑制できた。すなわち、処置６は、より有用であった。

本実施例の結果は、CD147-mGMCSF単独より、CD147の融合タンパク質４種を同時に使用したほうが、CD147タンパク質に対する特異的な生体免疫を、より強固に確立にすることができることを示している。

本実施例により、本実施例で用いた融合タンパク質が膀胱癌治療に有用であることが示された。

なお、CD147タンパク質を融合した各タンパク質はマウスの生体内投与により、CD147タンパク質そのものの作用を引き起こす（活性を示す）可能性があった。しかしながら、このCD147タンパク質成分を含む融合タンパク質の投与群（処置５及び処置６）において、対照群（処置４）と比べて、副作用等を示す症状・所見は認められなかった。

実施例１７融合タンパク質を用いたマウスモデルでの治療実験（肺癌に対する効果）
図３０に本実施例の治療実験のプロトコールを示す。

実験開始日をDay0とし、Day0に、処置１〜４の４群で、他のC57BL/6マウスの骨髄から得られた血球系幹細胞に対して、各融合タンパク質を添加してのex vivoでの処理を開始した。Day3に、処置１〜４の４群で、各融合タンパク質により処理された上述のマウス骨髄由来細胞である各細胞試薬をC57BL/6マウス（オス、6〜8週齢）尾静脈から投与した。処置１（マウス５匹）において用いた細胞試薬は、他のC57BL/6マウスの骨髄から得られた血球系幹細胞をLGM-3培地で３日間培養した細胞であった。処置２（マウス５匹）において用いた細胞試薬は、処置１の培養液に、CD147-mGMCSFを10μg/mlで添加して３日間培養した細胞であった。処置３（マウス５匹）において用いた細胞試薬は、処置１の培養液に、MAGAE4-mGMCSFを10μg/mlで添加して３日間培養した細胞であった。処置４（マウス５匹）において用いた細胞試薬は、処置１の培養液に、CD147-mGMCSF及びMAGEA4-mGMCSFを、それぞれ５μg/mlで添加して３日間培養した細胞であった。治療は、この1回のみ行った。投与細胞数は、マウス1匹あたり、100万個（in PBS 200μｌ）の細胞を投与した。

Day10に、C57BL/6マウスの左右の大腿部皮下に、ヒトCD147タンパク質を強制発現させたマウスLL2肺癌細胞100万個（左側）と、ヒトMAGEA4タンパク質を強制発現させたLL2肺癌細胞100万個（右側）を、それぞれ100μlのPBSで移植し、それぞれ、ヒトCD147タンパク質を発現するマウス肺癌細胞により皮下腫瘍を形成させ、かつヒトMAGEA4タンパク質を発現するマウス肺癌細胞により皮下腫瘍を形成させた。それぞれの発現遺伝子は、移植直前に、エレクトロポレーション機器（NEPA21, NEPA GENE CO., LTD. Chiba, JAPAN）を用いて、プラスミドベクターにより導入した。Day19に腫瘍形成の確認及び腫瘍サイズの測定を行った。

結果を図３１に示す。図３１AはCD147を発現する腫瘍のサイズを示し、図３１BはMAGEA4を発現する腫瘍のサイズを示す。図３１Aに示すように、CD147を発現する腫瘍については、処置１及び処置３と比べ、処置２及び処置４で有意に腫瘍増殖を抑制することができた。すなわち、処置２及び処置４は、より有用であった。この結果は、処置２及び処置４により、CD147タンパク質に対する特異的な免疫が確立されたことを示している。また、図３１Bに示すように、処置１及び処置２と比べ、処置３及び処置４で、有意に腫瘍増殖を抑制することができた。すなわち、処置３及び処置４はより有用であった。この結果は、処置３及び処置４により、MAGEA4タンパク質に対する特異的な免疫が確立されたこを示している。

CD147発現の腫瘍の確認ができたマウスの頻度は、処置１で５匹中５匹（100％）、処置２で５匹中５匹（100％）、処置３で５匹中５匹（100％）、処置４で６匹中２匹（33.3％）であった。この結果が示すように、処置２と比べ、処置４で、有意に（†）腫瘍の生着を抑制できた。すなわち、処置４はより有用であった。CD147-mGMCSF単独より、CD147-mGMCSFとMAGEA4-mGMCSFの２種類を同時に使用した方が、当該腫瘍に対する生体免疫をより強固に確立することができる。これは、処置４では全身で強力に当該腫瘍に対する免疫が活性化され、CD147以外の他の腫瘍抗原に対する生体免疫が活性化されたことを示している。

MAGEA4発現の腫瘍の確認ができたマウスの頻度は、処置１で５匹中５匹（100％）、処置２で５匹中５匹（100％）、処置３で５匹中５匹（100％）、処置４で６匹中２匹（33.3％）であった。この結果が示すように、処置３と比べ、処置４で、有意に（†）腫瘍の生着を抑制できた。すなわち、処置４はより有用であった。MAGEA4-mGMCSF単独より、CD147-mGMCSFとMAGEA4-mGMCSFの２種類を同時に使用した方が、当該腫瘍に対する生体免疫をより強固に確立することができる。これは、処置４では全身で強力に当該腫瘍に対する免疫が活性化され、MAGEA4以外の他の腫瘍抗原に対する生体免疫が活性化されたことを示している。

本実施例により、本実施例で用いた融合タンパク質が肺癌治療に有用であることが示された。

また、本実施例は、免疫担当細胞に分化し得る幹細胞を融合タンパク質を用いて ex vivoで処置して、処置後の細胞を用いる免疫療法の有用性、特に幹細胞を用いた治療の有用性を示している。

なお、融合タンパク質で処理した上記細胞を投与したマウスの治療群（処置１〜４）において、対照群（未治療のマウス）と比べて、副作用等を示す症状・所見は認められなかった。

実施例１８融合タンパク質を用いたマウスモデルでの治療実験（胃癌に対する効果）
図３２に本実施例の治療実験のプロトコールを示す。

実験開始日をDay0とし、Day0、Day3及びDay6にヌードマウス（オス、6〜8週齢）に融合タンパク質を計３回腹腔内投与した。この際、治療群として処置１から処置３を設定した。処置１は５匹のマウスに１匹１回当たりPBS100μlを投与した（コントロール）。処置２は５匹のマウスに１匹１回当り、CEA1-mGMCSF及びCEA2-mGMCSFを、それぞれ５μg/PBS 100μlで投与した。処置３は５匹のマウスにCEA1-mGMCSF、CEA1-hIL2、CEA1-mIL4、CEA1-hIL7、CEA2-mGMCSF、CEA2-hIL2、CEA2-mIL4、CEA2-hIL7をそれぞれ１匹１回当たり１μg/PBS 100μlで投与した。

Day10に、ヌードマウスの左右の大腿部皮下に、ヒトCEAタンパク質（全長の668アミノ酸）を強制発現させたヒトMKN1胃癌細胞100万個を、100μlのPBSで移植し、ヒトCEAタンパク質を発現するヒト胃癌細胞により皮下腫瘍を形成させた。それぞれの発現遺伝子は、移植直前に、エレクトロポレーション機器（NEPA21, NEPA GENE CO., LTD. Chiba, JAPAN）を用いて、プラスミドベクターにより導入した。Day19に腫瘍形成の確認及び腫瘍サイズの測定を行った。

CEA（full length)発現の腫瘍の確認ができたマウスの頻度は、処置１で５匹中５匹（100％）、処置２で５匹中０匹（0％）、処置３で５匹中０匹（0％）であった。処置１と比べ、処置２及び処置３で、有意に（†）腫瘍生着を抑制できた。すなわち、処置２及び３は、より有用であった。

本実施例の結果は、処置２及び処置３により、CEAタンパク質に対する特異的な免疫が確立されたことを示している。本実施例により本実施例で用いた融合タンパク質が胃癌治療に有用であることが示された。また、本実施例においては、ヌードマウスを使用しているので、細胞傷害性Ｔ細胞は体内に存在しない。従って、本実施例で確立されたCEAタンパク質に対する特異的な免疫は、in vitro実験である実施例１３及び１４の結果を併せて考慮すると、Ｂリンパ球を介した液性免疫の活性化に基づくものであると考えられる。

本発明の癌特異抗原とサイトカインの融合タンパク質は癌治療薬として利用することができる。癌特異抗原としてPSA、PAP又はPSMAを用いた場合は、前立腺癌治療薬として利用することができる。また、癌特異抗原としてMAGEA4、CD147又はCEAを用いた場合は、広範な癌種の治療薬として利用することができる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

配列番号１〜１３合成

Claims

MAGEA4、CD147及び癌胎児性抗原（CEA）からなる群から選択される癌特異抗原とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)及びマウスGMCSF（mGMCSF)からなる群から選択されるサイトカインとの融合タンパク質の複数を有効成分として含み、予防又は治療する癌が、MAGEA4、CD147又は癌胎児性抗原（CEA）を発現する脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝細胞癌、口腔癌、リンパ腫・白血病等の血液癌、悪性リンパ腫、グリオーマ、メラノーマ、大腸癌、胆嚢癌、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮頸癌等の子宮癌、卵巣癌、乳癌、甲状腺髄様癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫及び中皮腫からなる群から選択される、癌の予防又は治療用医薬組成物。
CD147とヒト若しくはマウスGMCSFとの融合タンパク質、CD147とヒトIL2との融合タンパク質、CD147とヒト若しくはマウスIL4との融合タンパク質、並びにCD147とヒトIL7との融合タンパク質を有効成分として含み、予防又は治療する癌がCD147を発現する大腸癌又は膀胱癌である、請求項１記載の癌の予防又は治療用医薬組成物。
CD147とヒト若しくはマウスGMCSFとの融合タンパク質、及びMAGEA4とヒト若しくはマウスGMCSFとの融合タンパク質を有効成分として含み、予防又は治療する癌がCD147又はMAGEA4を発現する肺癌である、請求項１記載の癌の予防又は治療用医薬組成物。
CEA-1とヒト若しくはマウスGMCSFとの融合タンパク質、及びCEA-2とヒト若しくはマウスGMCSFとの融合タンパク質を有効成分として含み、予防又は治療する癌がCEAを発現する胃癌である、請求項１記載の癌の予防又は治療用医薬組成物。
CEA-1とヒト若しくはマウスGMCSFとの融合タンパク質、CEA-1とヒトIL2との融合タンパク質、CEA-1とヒト若しくはマウスIL4との融合タンパク質、CEA-1とヒトIL7との融合タンパク質、CEA-2とヒト若しくはマウスGMCSFとの融合タンパク質、CEA-2とヒトIL2との融合タンパク質、CEA-2とヒト若しくはマウスIL4との融合タンパク質、並びにCEA-2とヒトIL7との融合タンパク質を有効成分として含み、予防又は治療する癌がCEAを発現する胃癌である、請求項１記載の癌の予防又は治療用医薬組成物。
免疫担当細胞に分化し得る細胞をin vitroで前立腺特異抗原(PSA)、前立腺酸性フォスファターゼ(PAP)、前立腺特異膜抗原（PSMA）、MAGEA4、CD147及び癌胎児性抗原（CEA）からなる群から選択される癌特異抗原とヒトIL2（hIL2)、ヒトIL4(hIL4)、ヒトIL7（hIL7)、ヒトGMCSF(hGMCSF）、マウスIL4(mIL4)及びマウスGMCSF（mGMCSF)からなる群から選択されるサイトカインとの融合タンパク質の複数の存在下で培養することを含む、抗癌免疫活性を有する免疫担当細胞を調製する方法。
癌特異抗原が前立腺特異抗原(PSA)、前立腺酸性フォスファターゼ(PAP)又は前立腺特異膜抗原（PSMA）であり癌が前立腺癌である、請求項６記載の抗癌免疫活性を有する免疫担当細胞を調製する方法。
癌特異抗原がMAGEA4、CD147及び癌胎児性抗原（CEA）からなる群から選択される癌特異抗原であり、癌が、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、肝細胞癌、口腔癌、リンパ腫・白血病等の血液癌、悪性リンパ腫、グリオーマ、メラノーマ、大腸癌、胆嚢癌、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮頸癌等の子宮癌、卵巣癌、乳癌、甲状腺髄様癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫及び中皮腫からなる群から選択される、請求項６記載の抗癌免疫活性を有する免疫担当細胞を調製する方法。
免疫担当細胞に分化し得る細胞が末梢血、骨髄液若しくは臍帯血から得た単核球、又はiPS(Induced pluripotent stem）細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、骨髄中の造血幹細胞を含む血球系幹細胞、間葉系幹細胞及び組織特異的幹細胞からなる群から選択される幹細胞である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の抗癌免疫活性を有する免疫担当細胞を調製する方法。
免疫担当細胞が、樹状細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球及びＢリンパ球からなる群から選択される免疫担当細胞である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の免疫担当細胞を調製する方法。