CN1169835C

CN1169835C - 人b淋巴细胞刺激因子突变体及其构建方法和编码基因

Info

Publication number: CN1169835C
Application number: CNB02116374XA
Authority: CN
Inventors: 陈光宇; 王嘉玺
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2002-04-01
Filing date: 2002-04-01
Publication date: 2004-10-06
Anticipated expiration: 2022-04-01
Also published as: CN1448406A

Abstract

本发明涉及一种人B淋巴细胞刺激因子突变体。其突变体的氨基酸序列为序列表中序列2所示，核酸序列为序列表中序列1所示。该突变体在药物和临床诊断试剂开发等方面具有良好的应用前景。

Description

人B淋巴细胞刺激因子突变体及其构建方法和编码基因

所属技术领域

本发明涉及一种人B淋巴细胞刺激因子突变体，尤其涉及一种重组水溶型人B淋巴细胞刺激因子突变体。本发明还涉及该突变体的构建方法和编码基因。

背景技术

人B淋巴细胞刺激因子(human B lymphocyte stimulator，hBLyS)是于1999年发现并克隆的属于TNF家族的细胞因子，它能与B淋巴细胞特异结合并诱导其增殖、分化，使成熟的B淋巴细胞分泌IgG、IgA等免疫球蛋白，在体液免疫应答中发挥着重要的作用，因而在治疗常见的可变性免疫缺乏症(common variable immunodeficiency，CVID)和获得性免疫缺乏综合征(ADIS)等免疫缺陷疾病以及帮助肿瘤化疗病人恢复等方面显示了巨大的商业前景。目前，美国HGS药业公司正在对BlyS治疗蛋白进行临床I期实验。

目前，国内外的研究者对BlyS纷纷展开了生物功能研究及药物开发，为临床提供新一代的免疫调节剂起到了推波助澜的作用。同时，与BlyS相关的专利也应运而生。经检索分析，这些专利主要涉及用于诊断和预测疾病的BlyS结合蛋白、抗体、受体的结构及使用方法，重组人BlyS表达载体及构建方法以及治疗或预防与BlyS有关的机体异常的方法等，但有关BlyS突变体专利的报道，国内外均未检索到。同样，国内外关于能提高BlyS活性的突变体的报道迄今尚未见到。

hBLyS在体内以膜结合型和水溶型两种形式存在，后者是前者经蛋白酶切割释放而得。重组水溶型hBLyS(recombinant soluble hBLyS，rhsBLyS)的功能片段在HEK293和CHO等真核细胞中的表达已有报道。国内外研究者也多采用rhsBLyS进行相关研究.

hsBLyS含有3个Cys，它们分别位于N端第146位，第232位及第245位，hBLyS分子在后两个Cys之间形成了链内二硫键，第146位的Cys游离在二硫键外。在蛋白变性复性过程中，Cys^146th很可能造成链内或链间二硫键的错配，导致蛋白错误折叠从而形成无活性的hBLyS。另外，将hBlyS与TNF家族的其它成员进行氨基酸序列比较发现，在N端第146位40％左右是valine(Val)，40％左右是alanine(Ala)，根据进化理论，Val和Ala可能是进化选择的结果。

发明内容

为提供一种生物活性更高的人B淋巴细胞刺激因子突变体，基于上述理论，本发明的发明人将Cys^146th点突变成Val^146th，构建hsBLyS的突变体hsBY-V，能有效避免蛋白错误折叠的情况发生，希望得到活性更高的hsBLyS。hsBY-V的引物序列如下：

内引物b：5′gcaa aac gtc ttg agt gac tgt ttc ttc3′

内引物c：5′aca gtc act caa gac gtt ttg caa ctg att gca gac ag 3′

外引物a：5′gct aaa aga tct ctc acc tac 3′

外引物d：5′cg gga tcc tta tca cag cag ttt caa tgc acc 3′

核酸序列(即序列表中序列1所示)为：

GCCGTTCAGGGTCCAGAAGAAACAGTCACTCAAGACGTTTTGCAA

CTGATTGCAGACAGTGAAACACCAACTATACAAAAAGGATCTTACACAT

TTGTTCCATGGCTTCTCAGCTTTAAAAGGGGAAGTGCCCTAGAAGAAAA

AGAGAATAAAATATTGGTCAAAGAAACTGGTTACTTTTTTATATATGGTC

AGGTTTTATATACTGATAAGACCTACGCCATGGGACATCTAATTCAGAGG

AAGAAGGTCCATGTCTTTGGGGATGAATTGAGTCTGGTGACTTTGTTTC

GATGTATTCAAAATATGCCTGAAACACTACCCAATAATTCCTGCTATTCA

GCTGGCATTGCAAAACTGGAAGAAGGAGATGAACTCCAACTTGCAATA

CCAAGAGAAAATGCACAAATATCACTGGATGGAGATGTCACATTTTTTG

GTGCATTGAAACTGCTGTGA

氨基酸序列(即序列表中序列2所示)为：

avqgpee tvtqdvlqli adsetptiqk gsytfvpwll sfkrgsalee kenkilvket gyffiygqvlytdktyamgh liqrkkvhvf gdelslvtlf rciqnmpetl pnnscysagi akleegdelq laiprenaqisldgdvtffg alkll

本发明的发明人将Cys^146th点突变成Ala^146th，构建hsBLyS的突变体hsBY-A。hsBY-A的内引物序列如下：

内引物b：5′gcaa agc gtc ttg agt gac tgt ttc ttc 3′

内引物c：5′aca gtc act caa gac gct ttg caa ctg att gca gac ag 3′

外引物a：5′gct aaa aga tct ctc acc tac 3′

外引物d：5′cg gga tcc tta tca cag cag ttt caa tgc acc 3′

突变体hsBY-A核酸序列(即序列表中序列3所示)为：

GCCGTTCAGGGTCCAGAAGAAACAGTCACTCAAGACGCTTTGCAA

CTGATTGCAGACAGTGAAACACCAACTATACAAAAAGGATCTTACACAT

TTGTTCCATGGCTTCTCAGCTTTAAAAGGGGAAGTGCCCTAGAAGAAAA

AGAGAATAAAATATTGGTCAAAGAAACTGGTTACTTTTTTATATATGGTC

AGGTTTTATATACTGATAAGACCTACGCCATGGGACATCTAATTCAGAGG

AAGAAGGTCCATGTCTTTGGGGATGAATTGAGTCTGGTGACTTTGTTTC

GATGTATTCAAAATATGCCTGAAACACTACCCAATAATTCCTGCTATTCA

GCTGGCATTGCAAAACTGGAAGAAGGAGATGAACTCCAACTTGCAATA

CCAAGAGAAAATGCACAAATATCACTGGATGGAGATGTCACATTTTTTG

GTGCATTGAAACTGCTGTGA

氨基酸序列(即序列表中序列4所示)为：

avqgpee tvtqdalqli adsetptiqk gsytfvpwll sfkrgsalee kenkilvket gyffiygqvlytdktyamgh liqrkkvhvf gdelslvtlf rciqnmpetl pnnscysagi akleegdelq laiprenaqisldgdvtffg alkll

利用重叠延伸PCR法进行定点突变。以pBV220-hsBlyS为模板设计特异引物，采用重叠PCR法，产生hsBlyS N端第146位半胱氨酸残基(cystine，Cys)点突变成缬氨酸(valine，Val)(tgc→gtt)、丙氨酸残基(alanine，Ala)(tgc→gct)等其它氨基酸残基的。

获得突变体基因片段后，经过EcoRI和BamHI双酶切鉴定，构建测序载体。将构建的测序载体送交大连宝生物公司进行序列分析。

按CaCl₂转化法将表达载体pBV220/hsBlyS、pBV220/hsBY-V或pBV220/hsBY-A等转化E.coli DH5α。采用42℃温度诱导法在DH5α中诱导三种蛋白的表达，再经过变性、复性手段纯化目的蛋白。

生物活性试验结果表明，突变体hsBY-V的促B细胞增殖活性明显高于野生型hsBLyS。

附图说明

图1为利用重叠PCR法进行定点突变的过程示意图

图中黑方块表示突变点

图2为突变体hsBY-V和hsBY-A促B淋巴细胞增殖活性检测结果

具体实施方式

实施例1.野生型hsBlyS测序克隆的构建

1.1自健康人外周血白细胞提取总RNA

新鲜外周血用含2mmol/L EDTA的PBS稀释2倍后，轻轻铺于等体积淋巴细胞分离液上，离心使之分层，然后用毛细管吸出灰白层细胞。用Hank’s液洗涤2-3次后，细胞总RNA用Promega公司的总RNA提取试剂盒提取，操作按说明书进行。

1.2从白细胞总RNA中钓取水溶型hsBlyS的基因

根据文献报道的hsBlyS cDNA序列，以第134-285位氨基酸所对应的cDNA序列为模板，在上游引物中加入EcoRI的酶切位点，在下游引物中加入BamHI的酶切位点。引物由上海博亚生物工程有限公司合成，序列如下：

上游引物：5′cgg aat tca tgg ccg ttc agg gtc cag aag 3′

下游引物：5′cgg gat cct tat cac agc agt ttc aat gca cc 3′

以白细胞总RNA为模板，用上述引物进行RT-PCR，扩增得到hsBlyScDNA序列。

1.3野生型hsBlyS测序克隆的构建

RT-PCR产物用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化，与经过同样处理的载体pBV220连接，转化E.coliDH5α，利用氨苄青霉素抗性筛选重组克隆。提取阳性克隆的质粒DNA，进行EcoRI和BamHI双酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳分析。初步鉴定正确的重组子克隆送交大连宝生物公司进行序列分析。其中质粒DNA的提取、酶切反应、连接反应、感受态的制备及转化等操作均参照《分子克隆实验指南》。

实施例2.突变体hsBY-V基因片段的获得

图1显示了进行重叠延伸PCR法进行定点突变的过程。b和c分别为与靶序列一侧末端互补配对的侧翼引物(内引物)，a和d为不包含突变部位序列的外引物。重叠使每个片段中的一条链可以作为另一片段中一条链的引物，随后的延伸则可产生定点突变产物，延伸得到的少量突变体片段在后续的PCR反应中得到大量扩增。引物序列如下：

内引物b：5′gcaa aac gtc ttg agt gac tgt ttc ttc 3′

内引物c：5′aca gtc act css gac gtt ttg css ctg att gca gac ag3′

外引物a：5′gct aaa aga tct ctc acc tac 3′

外引物d：5′cg gga tcc tta tca cag cag ttt caa tgc acc 3′

PCR体系如下：

10×buffer 5μL

dNTP 4μL(终浓度200μM)

引物a(或b) 0.5μL(终浓度0.5μM)

引物c(或d) 0.5μL(终浓度0.5μM)

pBV220-hsBlyS 1μL

Taq酶 0.25μL(5U/μL)

水加到50μL

进行第一轮PCR反应，分别得到ac和bd片段，再以两者为模板进行第二轮PCR。

10×buffer 5μL

dNTP 4μL

引物a 0.5μL

引物d 0.5μL

ac 1μL

bd 1μL

Taq酶 0.25μL

水加到50μL

两次PCR反应参数均为：

共35个循环

实施例3.野生型hsBlyS及其突变体在大肠杆菌中的表达与纯化

按CaCl₂转化法^[6]将表达载体pBV220/hsBlyS及pBV220/hsBY-V转化E.coliDH5α。转化菌落经30℃过夜活化，次日以2％比例接种于LB培养基，30℃培养至对数生长期(OD₆₀₀＝0.4～0.6)，立即转入42℃水浴摇床，200rpm培养4hr，诱导目的蛋白在E.coliTDH5α中表达。诱导表达培养物于4℃，12,000rpm离心15min，将沉淀重悬于适量PB(100mmol/L Na₂HPO₄，100mmol/LNaH₂PO₄)中，以超声波破碎菌体，离心分别收取沉淀和上清，进行15％SDS-PAGE，分析目的蛋白在DH5α中的表达分布情况。结果表明目的蛋白在DH5α中以包涵体形式表达。超声处理后得到的包涵体经2mol/L尿素洗涤2次，8mol/L尿素变性溶解，以Sephacryl-200(S-200)为柱填料，对溶解上清进行凝胶过滤层析，采用15％SDS-PAGE分析各洗脱峰对应的样品纯度。纯化的样品在复性缓冲液(100mmol/L Na₂HPO₄，100mmol/L NaH₂PO₄，0.1mmol/LGSSG，1mmol/L GSH，0.1％PEG)存在的情况下4℃稀释复性72hr，之后以PEG 6000缓慢浓缩得到一定浓度的蛋白样品。

实施例4.重组蛋白的促B淋巴细胞增殖的活性检测

用淋巴细胞分离液自健康人外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，再用贴壁培养、过尼龙毛柱等方法得到外周血B淋巴细胞；用RPMI1640(含10％FBS)调细胞密度为1×10⁶细胞/mL，在96孔培养板上每孔加50μL，再分组依次加入一定量的重组蛋白溶液及anti-IgM溶液，以不加anti-IgM和重组蛋白溶液的培养细胞为阴性对照，在37℃，5％CO培养箱中培养72hr，之后采用MTT法测细胞密度。

采用Bradford法测得三种蛋白浓度分别为rhsBLyS(57mg/L)，rhsBY-V(122mg/L)，rhsBY-A(239mg/L)，以anti-IgM(10g/L)为共增殖剂进行B淋巴细胞活性测定。结果如图2所示：

(1)与阴性对照相比，单独加入anti-IgM(30mg/L)时，B淋巴细胞的增殖无明显变化；而随着重组蛋白浓度的增加，B淋巴细胞的增殖加强，且在1mg/L时，三种蛋白的促B细胞增殖活性最高，之后活性开始下降，至2mg/L后，B细胞增殖出现平台效应。

(2)在anti-IgM浓度一定的情况下，同样的蛋白浓度，经rhsBY-V作用后的B细胞增殖最快，rhsBY-A次之，rhsBLyS最低；将所测OD值分别进行统计学检验表明rhsBY-V与野生型rhsBLyS的促B细胞增殖活性相比具有显著性差异(P＜0.05)，前者活性显著高于后者。说明rhsBLyS N端第146位Cys点突变成Val后，提高了促B淋巴细胞增殖的活性。突变体hsBY-A与野生型hsBLyS相比无显著差异，这可能是蛋白纯化时的变性、复性过程导致蛋白活性损失较大，此点尚须进一步研究确证。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

<120>人B淋巴细胞刺激因子突变体及其构建方法和编码基因

<130>

<150>02116374.x

<151>2002-04-01

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>459

<212>DNA

<213>人

<400>1

gccgttcagg gtccagaaga aacagtcact caagacgttt tgcaactgat tgcagacagt 60

gaaacaccaa ctatacaaaa aggatcttac acatttgttc catggcttct cagctttaaa 120

aggggaagtg ccctagaaga aaaagagaat aaaatattgg tcaaagaaac tggttacttt 180

tttatatatg gtcaggtttt atatactgat aagacctacg ccatgggaca tctaattcag 240

aggaagaagg tccatgtctt tggggatgaa ttgagtctgg tgactttgtt tcgatgtatt 300

caaaatatgc ctgaaacact acccaataat tcctgctatt cagctggcat tgcaaaactg 360

gaagaaggag atgaactcca acttgcaata ccaagagaaa atgcacaaat atcactggat 420

ggagatgtca cattttttgg tgcattgaaa ctgctgtga 459

<210>2

<211>152

<212>PRT

<213>人

<400>2

Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Val Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe

20 25 30

Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys

35 40 45

Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly

50 55 60

Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gln

65 70 75 80

Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu

85 90 95

Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys

100 105 110

Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu

115 120 125

Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp Val Thr

130 135 140

Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu

145 150

<210>3

<211>459

<212>DNA

<213>人

<400>3

gccgttcagg gtccagaaga aacagtcact caagacgctt tgcaactgat tgcagacagt 60

gaaacaccaa ctatacaaaa aggatcttac acatttgttc catggcttct cagctttaaa 120

aggggaagtg ccctagaaga aaaagagaat aaaatattgg tcaaagaaac tggttacttt 180

tttatatatg gtcaggtttt atatactgat aagacctacg ccatgggaca tctaattcag 240

aggaagaagg tccatgtctt tggggatgaa ttgagtctgg tgactttgtt tcgatgtatt 300

caaaatatgc ctgaaacact acccaataat tcctgctatt cagctggcat tgcaaaactg 360

gaagaaggag atgaactcca acttgcaata ccaagagaaa atgcacaaat atcactggat 420

ggagatgtca cattttttgg tgcattgaaa ctgctgtga 459

<210>4

<211>152

<212>PRT

<213>人

<400>4

Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Ala Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe

20 25 30

Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys

35 40 45

Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly

50 55 60

Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gln

65 70 75 80

Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu

85 90 95

Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys

100 105 110

Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu

115 120 125

Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp Val Thr

130 135 140

Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu

145 150

Claims

1、人B淋巴细胞刺激因子突变体，其特征在于具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。

2、编码权利要求1的人B淋巴细胞刺激因子突变体的基因，其特征在于具有序列表中序列1所示的核酸序列。

3、构建权利要求1所述的人B淋巴细胞刺激因子突变体的方法，其特征在于将野生型人B淋巴细胞刺激因子的第146位半胱氨酸残基点突变为缬氨酸残基。

4、权利要求1所述的人B淋巴细胞刺激因子突变体在制备用于治疗常见的可变性免疫缺乏症(common variableimmunodeficiency，CVID)、获得性免疫缺乏综合症等免疫缺陷疾病或帮助肿瘤化疗病人恢复的药物中的用途。