CN1252087C - 一种结合了sars抗原肽的四聚体及其制备和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种结合了SARS抗原肽的四聚体及其制备和用途。该四聚体包括一分子链霉亲和素，结合于其上的四分子生物素，每一个生物素分子与一个HLA-A2.1分子的α3重链的氨基酸C末端相结合，该HLA-A2.1分子重链有三个功能区α1，α2、α3，其中α1和α2多肽形成的盒状结构中插入一段SARS抗原肽，该SARS抗原肽的氨基酸序列如Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示，或是此序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，且具有相同功能的多肽。该四聚体是通过将HLA-A2.1及人的β-微球蛋白基因的克隆、蛋白质的分离和纯化、蛋白折叠、浓缩及透析，最后形成四聚体制得。该结合了SARS抗原肽的四聚体可用于直接定量检测人外周血样品中对SARS病毒有特异反应性T细胞水平的高低，还可用于制备抗SARS病毒的免疫疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种结合了SARS抗原肽的四聚体及其制备和用途。
技术背景
1996年，Altman在Science上发表文章，首先提出四聚体的概念，他将人的MHCI(主要组织相容性抗原I类分子)HLA-A2(人白细胞抗原A基因座A2位点)组织的重链氨基酸C末端加上一段生物素酶识别的氨基酸片段，将HLA-A2重链，轻链，和两个主要的HLA-A2限制性HIV抗原决定簇Gag，或Pol折叠成单体，将此单体与藻红蛋白标记的去糖基化的链霉亲和素4∶1混合，形成四聚体。实验证明应用这两种HLA-A2/Gag，HLA-A2/Pol四聚体在体外可直接定量分析对Gag，Pol特定抗原有特异性的细胞毒性T细胞数量，(science，1996：274，94)，HLA-A2/Gag，Pol四聚体着色试剂还可识别抗原特异性的HLA-A2CD8+T细胞/Gag，Pol片段。因而MHC四聚体技术提供了定量抗原特异性T细胞群体频率的测定方法。通过流式细胞术，这些试剂还被直接应用于分析体内抗原特异性的T细胞的频率和表型。
其原理是MHC/小肽四聚体为由四个相同的、能刺激特异性的T细胞的核心蛋白组成的复合物，当T细胞识别了其临近细胞表面的靶蛋白的片段上的肽和MHC分子时，T细胞就被激活。目前与MHC/小肽四聚体有关的临床及基础研究发展十分迅速。MHC/小肽四聚体已被应用于：①定量分析机体对某一抗原肽具有反应性的T细胞水平；②确定机体患自身免疫性疾病的易感性(如II型糖尿病)；③预测某些疾病的发展及愈后；④调节机体细胞免疫力(诱导免疫耐受或产生抗肿瘤/病毒免疫反应的疫苗)。
SARS(严重急性呼吸道综合症)病毒是一种新近发现的冠状病毒，其表面蛋白可与细胞上的相应受体结合，导致人类发生严重急性呼吸道综合症。SARS病毒与常见的人类冠状病毒相比，其编码的蛋白中可以被人类免疫系统识别的抗原决定簇明显改变和减少。由此表明，SARS病毒引起人类产生严重疾病的原因可能与该病毒逃避机体免疫识别有关。因此，寻找一个对SARS感染患者的诊断、愈后的预测方法非常必要。
发明内容
本发明的目的在于利用MHC/小肽四聚体技术，提供一种能直接定量检测人外周血样品中对SARS病毒有特异反应性的T细胞水平高低，并能够引起抗SARS特异的免疫应答的结合了SARS抗原肽的四聚体。
本发明的另一目的在于提供所述结合了SARS抗原肽的四聚体的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述结合了SARS抗原肽的四聚体的用途。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：
本发明提供一种结合了SARS抗原肽的四聚体，包括一分子链霉亲和素，结合于其上的四分子生物素，每一个生物素分子通过生物素酶识别的氨基酸片段上的赖氨酸与一个HLA-A2.1(人白细胞抗原A基因座A2位点01亚型)分子的α3重链的氨基酸C末端相结合，该HLA-A2.1分子由一条43kd的重链多肽，及11kd的轻链多肽组成，其重链有三个功能区α1，α2、α3，其中α1和α2多肽通过多重的折叠，形成盒状结构，其特征在于：在α1和α2多肽形成的盒状结构内的空间中插入一段SARS抗原肽，该SARS抗原肽的氨基酸序列如下：
1)具有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示的氨基酸序列；
2)将1)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，且具有相同功能的多肽。
所述的生物素酶识别的氨基酸片段为Leu-Gly-Gly-Ile-Phe-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Leu-Arg-Asp。
所述的轻链为β-微管蛋白。
所述的SARS抗原肽为SARS病毒的N蛋白解旋酶的一段九肽。
本发明提供一种所述结合了SARS抗原肽的四聚体的制备方法，包括如下的步骤：
1)HLA-A2.1及人的β-微球蛋白基因的克隆：按常规方法，将人的白细胞离心沉淀后，使用mRNA提取试剂盒，分别制备HLA-A2.1及β-微球蛋白的mRNA，cDNA；然后通过基因重组的方法将生物素酶识别的氨基酸片段的cDNA序列与HLA-A2.1的α3重链基因连接后，经PCR克隆后插入表达载体，得到含有HLA-A2.1重链重组cDNA的质粒和含有β-微球蛋白cDNA的质粒；
2)蛋白质的分离和纯化：诱导步骤1)克隆的含有HLA-A2.1重链重组cDNA的质粒和含有β-微球蛋白cDNA的质粒分别在大肠杆菌体内大量合成HLA-A2.1重组重链蛋白，β-微球蛋白；收集菌体，纯化，得到初步提纯的含有HLA-A2.1重组重链蛋白和β-微球蛋白的包涵体蛋白，将此蛋白溶于6M尿素中，于-80℃冰箱中备用；
3)蛋白折叠：于10℃冷却的折叠缓冲液中，边搅拌边加入30mg/L的SARS抗原肽的DMSO(二甲基亚砜)溶液，再将含有步骤2)制得的1μM HLA-A2.1重组重链蛋白、2μM β-微球蛋白的注射缓冲液迅速加入反应体系，在常温下搅拌24～72小时，每24小时再加入1μM HLA-A2.1重组重链蛋白，得到折叠了的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体，10℃贮存备用；
4)浓缩及透析：经步骤3)折叠的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体蛋白进行超滤浓缩100～200倍；然后用生物素化缓冲液于4℃透析，直到透析袋中的沉淀溶解；将透析袋中的溶液离心，除去沉淀，加入400μM生物素，5mM ATP，200mMPMSF(苯甲基磺酰氟)，0.1μM生物素-蛋白连接酶，室温下孵育过夜，将此溶液经分子筛柱层析和离子交换柱层析提纯后，用含蛋白抑制剂的缓冲液透析并保存，得到生物素化的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体蛋白溶液；
5)四聚体的形成：在室温、避光条件下，将链霉亲和素偶联物的水溶液缓慢加入步骤4)的生物素化的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体蛋白溶液中，得到结合了SARS抗原肽的四聚体，并于4℃避光保存。
所述步骤1)的生物素酶识别的氨基酸片段为Leu-Gly-Gly-Ile-Phe-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Leu-Arg-Asp。
所述步骤1)的表达载体为pET载体(Novogen)，cDNA插入该质粒的EcoR I和BamH I酶切位点之间。
所述步骤2)的诱导是将步骤1)克隆的含有HLA-A2.1重链重组cDNA的质粒和含有β-微球蛋白cDNA的质粒，分别转化到大肠杆菌BL21菌株，通过加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，使细菌在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中扩增至OD值0.5～1.0，诱导含有HLA-A2.1重链重组cDNA的质粒和含有β-微球蛋白cDNA质粒在大肠杆菌体内大量合成HLA-A2.1重组重链蛋白，此诱导过程重复3～4次。
所述步骤2)的纯化是将收集到的菌体，重悬于重悬液，边搅拌边滴入1.2ml 50mg/ml的溶菌酶(终浓度为1mg/ml)，300μl 1.0M MgCl2(终浓度5mM)，1.0ml 2mg/mlDNA酶(溶于50％甘油，75mM NaCl)，600μl Triton-X100(终浓度为1％)，600μDTT(二硫苏糖醇)1M (终浓度10mM)；超声波破碎，离心分离，得到初步提纯的含有HLA-A2.1重组重链蛋白，β-微球蛋白的包涵体蛋白。
所述步骤2)的重悬液为50mM Tris-HCL(pH 8.0)，25％(w/v)蔗糖，1mM EDTA，0.1％(w/v)叠氮钠，10mM DTT。
所述步骤3)的SARS抗原肽的氨基酸序列如下：
1)具有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示的氨基酸序列；
2)将1)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加且具有相同功能的多肽。
所述步骤3)的折叠缓冲液为400mM L-Arginine，100mM Tris，2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，pH 8.3的水溶液，临用前加入终浓度为5mM的还原型谷胱甘肽，终浓度为0.5mM的氧化谷胱甘肽，终浓度为0.2mM的PMSF。
所述步骤3)注射缓冲液为3M盐酸胍，10mM己酸钠，10mM EDTA，pH 4.2的水溶液。
所述步骤4)生物素化缓冲液为100mM Tris(pH 7.5)，200mM NaCl，5mM MgCl2的水溶液。
所述步骤4)的含蛋白抑制剂的缓冲液为1*PBS，含1μg/ml亮肽素，1μM胃酶抑素和2mM己二胺四乙酸。
本发明提供一种所述结合了SARS抗原肽的四聚体的用途，该四聚体可用于直接定量检测人外周血样品中对SARS病毒有特异反应性T细胞水平的高低。
本发明提供一种所述结合了SARS抗原肽的四聚体的用途，该四聚体可用于制备抗SARS病毒的免疫疫苗。
本发明提供的结合了SARS抗原肽的四聚体的优益之处在于：
1、HLA-A2.1是典型的MHC I类组织相容性抗原蛋白亚型，在人群中有较高频率，HLA-A2.1/SARS抗原肽四聚体能够模拟靶细胞表面HLA-A2.1/SARS抗原肽复合物因而该结合了SARS抗原肽的四聚体特异性更强；
2、该结合了SARS抗原肽的四聚体对SARS病毒有特异性，可以检测机体对SARS病毒细胞免疫力高低及应答状态，迅速的测试新的疫苗的活性或确定入侵的微生物的哪些部分刺激了免疫反应的产生；
3、该结合SARS抗原肽的四聚体与T细胞的结合比单体更牢固，时间更长，因而在用于直接定量检测人外周血样品中对SARS病毒有特异反应性T细胞水平的高低时，更具有特异性高、敏感准确(可达千分之几)、方便可行(仅需病人血样)等优点；该实验方法的建立将有助于临床SARS的诊治及其愈后的预测。具有现实的临床意义；
4、该结合了SARS抗原肽的四聚体对与T细胞受体具有高亲合力，可应用制备SARS病毒的免疫疫苗；与SARS DNA疫苗相比，该疫苗具有制备更简易，并且对于免疫细胞具有更高的亲和力，更强的特异性，应用更安全，方便等优点。
附图说明
图1是本发明提供的结合了SARS抗原肽的四聚体的结构示意图；
其中，链霉亲和素分子1；生物素分子2；
生物素酶识别序列的赖氨酸结合位点3，其通过化学键与生物素分子结合；
HLA-A2.1分子的轻链4； HLA-A2.1分子α1重链5；
HLA-A2.1分子α2重链6； HLA-A2.1分子α3重链7；
插入的SARS抗原肽8；
图2是实施例1制备的结合了SARS抗原肽的四聚体HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体诱导HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数图；其中□代表空白对照组；■代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组；
图3是实施例1制备的结合了SARS抗原肽的四聚体HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体体外诱导HLA-A2.1+小鼠外周血淋巴细胞增殖的刺激指数图；其中■代表空白对照组；□代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组；
图4是实施例1制备的结合了SARS抗原肽的四聚体HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞CD69的表达情况；其中a代表空白对照组；b代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组；
图5是实施例1制备的结合了SARS抗原肽的四聚体HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率；其中a代表空白对照组；b代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组；
图6是实施例1制备的结合了SARS抗原肽的四聚体HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体刺激后，HLA-A2.1+人外周血CD8+细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率；其中a代表空白对照组；b代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组。
具体实施方式
实施例1、制备插有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚体
1)HLA-A2.1及人的β-微球蛋白基因的克隆：
将人的白细胞离心沉淀后，使用mRNA提取试剂盒(Pharmacia)，按常规方法分别制备HLA-A2.1及β-微球蛋白的mRNA，cDNA；通过基因重组的方法将生物素酶识别的氨基酸片段Leu-Gly-Gly-Ile-Phe-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Leu-Arg-Asp的cDNA序列与HLA-A2.1的α3重链基因连接后，将此重组的HLA-A2.1重链连有生物素酶识别序列的cDNA和β-微球蛋白的cDNA经PCR克隆后插入表达载体pET(Novogen)的EcoR I和BamH I酶切位点之间，得到含有HLA-A2.1重链连有生物素酶识别序列cDNA的质粒和含有β-微球蛋白cDNA的质粒；
2)蛋白质的分离和纯化：
将步骤1)克隆的含有HLA-A2.1连有生物素酶识别序列cDNA的质粒和含有β-微球蛋白cDNA的质粒，分别转化到大肠杆菌BL21，通过加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，使细菌在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中扩增至OD值0.75，诱导含有HLA-A2.1cDNA的质粒和含有β-微球蛋白cDNA质粒在大肠杆菌体内大量合成HLA-A2.1重组重链蛋白，β-微球蛋白，经4次的诱导后，离心收集菌体，重悬于60ml重悬液(50mM Tris-HCL(pH 8.0)，25％(w/v)蔗糖，1mM EDTA，0.1％(w/v)叠氮钠，10mM DTT)，倒入100ml烧杯，在磁力搅拌器中搅拌，边搅拌边滴入1.2ml 50mg/ml的溶菌酶(终浓度为1mg/ml)，300μl.0M MgCl2(终浓度5mM)，1.0ml 2mg/ml DNA酶(溶于50％甘油，75mM NaCl)，600μl Triton-X100(终浓度为1％)，600μl 1M DTT(终浓度10mM)，超声波破碎，离心分离，得到初步提纯的含有HLA-A2.1重组重链蛋白，β-微球蛋白的包涵体蛋白，收集此蛋白，于6M尿素中溶解，存于-80℃冰箱中备用；
3)蛋白复性(折叠)：
预先在1L的烧杯中准备1L折叠缓冲液(400mM L-Arginine，100mM Tris，2mMEDTA，5mM的还原型谷胱甘肽，0.5mM的氧化谷胱甘肽，0.2mM的PMSF，pH 8.3的水溶液)，内放一个磁力搅拌棒，置于10℃水浴冷却，将装有折叠缓冲液的烧杯置磁力搅拌器上高速搅拌，将SARS特异抗原小肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val用500μl DMSO稀释，用吸管加入反应体系，终浓度为30mg/L，将步骤2)所述的HLA-A2.1重组重链蛋白、β-微球蛋白分别加入5.0ml注射缓冲液(3M盐酸胍，10mM己酸钠，10mM EDTA，pH 4.2的水溶液)，在室温下分别吸入两支注射器，急速用26号针头注入反应体系，其终浓度分别为1μM，2μM，在常温下搅拌72小时，每24小时再加入1μM HLA-A2.1重组重链蛋白，得到折叠了含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体，10℃贮存备用；
4)浓缩样本及透析：
经步骤3)折叠的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体蛋白用超滤装置(Amiconl)进行常规超滤浓缩，浓缩100倍，然后用IL生物素化缓冲液(100mM Tris(pH 7.5)，200mMNaCl，5mM MgCl2的水溶液)4℃透析，直到透析袋中的沉淀溶解。吸出透析袋中的样品，在低温台式离心机中以最大速度离心，以除去沉淀；在上述样品中加入生物素(Tris-base稀释)，终浓度为400μM；ATP，终浓度为5mM；PMSF终浓度为200mM；生物素-蛋白连接酶，终浓度为0.1μM，室温下孵育过夜，生物素和含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体蛋白在生物素-蛋白连接酶的作用下结合，收集样品；经S-300分子筛柱层析，分离提纯，进一步以离子交换柱层析(mono Q HR5/5柱)，经收集的样品，用ultrafree-4离心过滤器浓缩到体积100-300μl，用含蛋白抑制剂的缓冲液(1*PBS，含1μg/ml亮肽素，1μM胃酶抑素和2mM EDTA)透析，置换缓冲液，保存在含蛋白抑制剂的PBS缓冲液中；
5)四聚体的形成
在室温黑暗中，将1mg/ml链霉亲和素偶联物水溶液320μl分10次缓慢加入浓度为2mg/ml的经上述过程制备的生物素化的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体蛋白100μl中，每个链霉亲和素分子都有4个生物素结合位点，即可以结合4个上述单体，形成四聚体；将上述得到的结合了SARS抗原肽的四聚体避光，4℃保存。
上述方法所制备的结合了SARS抗原肽的四聚体——HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体其结构示意图如图1所示，对该结合了SARS抗原肽的四聚体进行如下的实验：
实验1-1、诱导HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖实验
取HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞与HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体共培养4天，另设一不加HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体的空白对照组，用3H惨入法测定其增殖率。结果如图2所示，其中□代表空白对照组；■代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组，加入HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组的脾淋巴细胞刺激指数为3.23，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖。
实验1-2、体外诱导HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴细胞增殖实验
取HLA-A2.1+转基因老鼠外周血淋巴细胞与HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体共培养4天，另设一不加HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体的空白对照组，用3H惨入法测定其增殖率。结果如图3所示，其中■代表空白对照组；□代表HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组，加入HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组的外周血淋巴细胞刺激指数为3.22，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠外周血淋巴细胞增殖。
实验1-3、使用实施例1制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
取HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞与HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体共培养3天，另设一不加HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体的空白对照组，用流式细胞仪测定其HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率。结果如图5所示，其中a代表空白对照组；b代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组，用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组四聚体的阳性细胞百分率为15.1％，空白对照组为4.4％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。实验1-4、使用实施例1制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞CD69的表达情况
取HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞与HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体共培养3天，另设一不加HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体的空白对照组，用流式细胞仪测定其T细胞活化标志抗原，CD69抗原的活化情况。结果如图4所示，其中a代表空白对照组；b代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组，用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组CD69抗原表达值为10.1％，空白对照组为3.4％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞活化。
实验1-5、使用实施例1制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+人外周血CD8+细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
取HLA-A2.1+人外周血淋巴细胞细胞与HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体共培养3天，另设一不加HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体的空白对照组，用流式细胞仪测定其HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率。结果如图6所示，其中a代表空白对照组；b代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组，用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组阳性细胞百分率为11.6％，空白对照组为1.80％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
由上述实验结果，可知：HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体具有激发免疫反应的能力，可用于制备抗SARS病毒的免疫疫苗。
实施例2、制备插有Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚体
将SARS抗原肽Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val(与实施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val仅在第2位不同，由Val取代了Leu)，按实施例1所述制备方法制备结合了SARS抗原肽Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val的四聚体。
用上述制备的HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体进行如下的实验：
实验2-1、诱导HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-1所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组的脾淋巴细胞刺激指数为4.02，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARSIle-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖。
实验2-2、体外诱导HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-2所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组的外周血淋巴细胞刺激指数为3.53，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARSIle-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠外周血淋巴细胞增殖。
实验2-3、使用实施例2制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-3所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组四聚体的阳性细胞百分率为12.8％，空白对照组为2.6％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
实验2-4、使用实施例2制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞CD69的表达情况
如实施例1中的实验1-4所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组CD69抗原表达值为14.1％，空白对照组为3.9％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARSIle-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞活化。实验2-5、使用实施例2制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+人外周血CD8+细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-5所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组阳性细胞百分率为10.25％，空白对照组为2.43％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
由上述实验结果，可知：HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体具有激发免疫反应的能力，可用于制备抗SARS病毒的免疫疫苗。
实施例3、制备插有Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚体
将SARS抗原肽Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val(与实施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val仅在第2位不同，由Ala取代了Leu)，按实施例1所述制备方法制备结合了SARS抗原肽Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val的四聚体。
用上述制备的HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体进行如下的实验：
实验3-1、诱导HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-1所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARSIle-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组的脾淋巴细胞刺激指数为4.29，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖。
实验3-2、体外诱导HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-2所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组的外周血淋巴细胞刺激指数为4.31，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARSIle-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠外周血淋巴细胞增殖。
实验3-3、使用实施例3制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-3所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组四聚体的阳性细胞百分率为15.1％，空白对照组为2.6％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
实验3-4、使用实施例3制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞CD69的表达情况
如实施例1中的实验1-4所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组CD69抗原表达值为14.2％，空白对照组为4.0％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞活化。
实验3-5、使用实施例3制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+人外周血CD8+细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-5所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS四聚体组阳性细胞百分率为9.01％，空白对照组为1.24％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
由上述实验结果，可知：HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体具有激发免疫反应的能力，可用于制备抗SARS病毒的免疫疫苗。
实施例4、制备插有Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚体
将SARS抗原肽Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val(与实施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val仅在第2位不同，由Met取代了Leu)，按实施例1所述制备方法制备结合了SARS抗原肽Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val的四聚体。
用上述制备的HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体进行如下的实验：
实验4-1、诱导HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-1所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组的脾淋巴细胞刺激指数为4.51，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖。
实验4-2、体外诱导HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-2所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组的外周血淋巴细胞刺激指数为3.84，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠外周血淋巴细胞增殖。
实验4-3、使用实施例4制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-3所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARSIle-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组四聚体的阳性细胞百分率为14.7％，空白对照组为2.0％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
实验4-4、使用实施例4制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞CD69的表达情况
如实施例1中的实验1-4所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组CD69抗原表达值为13.5％，空白对照组为3.4％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞活化。
实验4-5、使用实施例4制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+人外周血CD8+细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-5所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组阳性细胞百分率为8.11％，空白对照组为1.22％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
由上述实验结果，可知：HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体具有激发免疫反应的能力，可用于制备抗SARS病毒的免疫疫苗。
实施例5、制备插有Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚体
将SARS抗原肽Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val(与实施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val仅在第2位不同，由Ile取代了Leu)，按实施例1所述制备方法制备结合了SARS抗原肽Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val的四聚体。
用上述制备的HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体进行如下的实验：
实验5-1、诱导HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-1所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组的脾淋巴细胞刺激指数为4.58，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖。
实验5-2、体外诱导HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-2所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组的外周血淋巴细胞刺激指数为3.74，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARSIle-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠外周血淋巴细胞增殖。
实验5-3、使用实施例5制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-3所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组四聚体的阳性细胞百分率为15.8％，空白对照组为2.3％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
实验5-4、使用实施例5制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞CD69的表达情况
如实施例1中的实验1-4所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组CD69抗原表达值为14.2％，空白对照组为2.7％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞活化。
实验5-5、使用实施例5制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+人外周血CD8+细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-5所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体组阳性细胞百分率为9.05％，空白对照组为2.10％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARSIle-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
由上述实验结果，可知：HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚体具有激发免疫反应的能力，可用于制备抗SARS病毒的免疫疫苗。
实施例6、制备插有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala所示序列的SARS抗原小肽的四聚体
将SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala(与实施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val仅在第9位不同，由Ala取代了Val)，按实施例1所述制备方法制备结合了SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala的四聚体。
用上述制备的HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚体进行如下的实验：
实验6-1、诱导HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-1所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚体组的脾淋巴细胞刺激指数为5.01，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖。
实验6-2、体外诱导HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-2所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚体组的外周血淋巴细胞刺激指数为3.37，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠外周血淋巴细胞增殖。
实验6-3、使用实施例6制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-3所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚体组四聚体的阳性细胞百分率为14.4％，空白对照组为2.1％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
实验6-4、使用实施例6制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞CD69的表达情况
如实施例1中的实验1-4所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚体组CD69抗原表达值为15.5％，空白对照组为2.6％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚体能够非常明显的刺激T细胞活化。
实验6-5、使用实施例6制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+人外周血CD8+细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-5所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚体组阳性细胞百分率为8.31％，空白对照组为1.77％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
由上述实验结果，可知：HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚体具有激发免疫反应的能力，可用于制备抗SARS病毒的免疫疫苗。
实施例7、制备插有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile所示序列的SARS抗原小肽的四聚体
将SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile(与实施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val仅在第9位不同，由Ile取代了Val)，按实施例1所述制备方法制备结合了SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile的四聚体。
用上述制备的HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚体进行如下的实验：
实验7-1、诱导HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-1所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚体组的脾淋巴细胞刺激指数为4.33，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠脾淋巴细胞增殖。
实验7-2、体外诱导HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴细胞增殖实验
如实施例1中的实验1-2所述方法进行实验，结果为加入HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚体组的外周血淋巴细胞刺激指数为3.87，空白对照组为1.00，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚体能够非常明显的刺激HLA-A2.1+转基因老鼠外周血淋巴细胞增殖。
实验7-3、使用实施例7制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-3所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚体组四聚体的阳性细胞百分率为13.6％，空白对照组为1.6％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
实验7-4、使用实施例7制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+转基因老鼠CD8细胞CD69的表达情况
如实施例1中的实验1-4所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS 四聚表达值为13.7％，空白对照组为2.5％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚体能够非常明显的刺激T细胞活化。
实验7-5、使用实施例7制备的四聚体刺激后HLA-A2.1+人外周血CD8+细胞HLA-A2.1/SARS四聚体的阳性细胞百分率
如实施例1中的实验1-5所述方法进行实验，结果为用HLA-A2.1/SARS四聚体刺激后，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚体组阳性细胞百分率为8.76％，空白对照组为1.56％，两者比较有非常显著的差异，说明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚体能够非常明显的刺激T细胞发生免疫应答。
由上述实验结果，可知：HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚体具有激发免疫反应的能力，可用于制备抗SARS病毒的免疫疫苗。
实施例8、制备插有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚体
与实施例1中的制备方法相同，只是在步骤2)蛋白质的分离和纯化时，使细菌在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中扩增至OD值0.5；诱导过程重复4次；在步骤3)蛋白复性时，将混合液在常温下搅拌48小时；在步骤4)浓缩及透析时，将经步骤3)折叠的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体蛋白超滤浓缩200倍。
实施例9、制备插有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚体
与实施例1中的制备方法相同，只是在步骤2)蛋白质的分离和纯化时，使细菌在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中扩增至OD值1.0；诱导过程重复3次；在步骤3)蛋白复性时，将混合液在常温下搅拌24小时；在步骤4)浓缩及透析时，将经步骤3)折叠的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体蛋白超滤浓缩150倍。
Claims (9)
1、一种结合了SARS抗原肽的四聚体，包括一分子链霉亲和素，结合于其上的四分子生物素，每一个生物素分子通过生物素酶识别的氨基酸片段上的赖氨酸与一个HLA-A2.1分子的α3重链的氨基酸C末端相结合，该HLA-A2.1分子由一条43kd的重链多肽，及11kd的轻链多肽组成，其重链有三个功能区α1，α2、α3，其中α1和α2多肽通过多重的折叠，形成盒状结构，其特征在于：在α1和α2多肽形成的盒状结构内的空间中插入一段SARS抗原肽，该SARS抗原肽的氨基酸序列如下：
1)由Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示的氨基酸序列组成；
2)将1)中的氨基酸序列在第2或第9位上经过一个氨基酸残基的取代，且具有相同功能的多肽。
2、如权利要求1所述的结合了SARS抗原肽的四聚体，其特征在于，所述的生物素酶识别的氨基酸片段为Leu-Gly-Gly-Ile-Phe-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Leu-Arg-Asp。
3、一种权利要求1所述的结合了SARS抗原肽的四聚体的制备方法，包括如下的步骤：
1)HLA-A2.1及人的β-微球蛋白基因的克隆：按常规方法，将人的白细胞离心沉淀后，使用mRNA提取试剂盒，分别制备HLA-A2.1及β-微球蛋白的mRNA，cDNA；然后通过基因重组的方法将生物素酶识别的氨基酸片段的cDNA序列与HLA-A2.1的α3重链基因连接后，经PCR克隆后插入表达载体，得到含有HLA-A2.1重链重组cDNA的质粒和含有β-微球蛋白cDNA的质粒；
2)蛋白质的分离和纯化：诱导步骤1)克隆的含有HLA-A2.1重链重组cDNA的质粒和含有β-微球蛋白cDNA的质粒分别在大肠杆菌体内大量合成HLA-A2.1重组重链蛋白，β-微球蛋白；收集菌体，纯化，得到初步提纯的含有HLA-A2.1重组重链蛋白和β-微球蛋白的包涵体蛋白，将此蛋白溶于6M尿素中，于-80℃冰箱中备用；
3)蛋白折叠：于10℃冷却的折叠缓冲液中，边搅拌边加入30mg/L的SARS抗原肽的DMSO溶液，再将含有步骤2)制得的1μM HLA-A2.1重组重链蛋白、2μMβ-微球蛋白的注射缓冲液迅速加入反应体系，在常温下搅拌24～72小时，每24小时再加入1μM HLA-A2.1重组重链蛋白，得到折叠了的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体，10℃贮存备用；
4)浓缩及透析：经步骤3)折叠的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体蛋白进行超滤浓缩100～200倍；然后用生物素化缓冲液于4℃透析，直到透析袋中的沉淀溶解；将透析袋中的溶液离心，除去沉淀，加入400μM生物素，5mM ATP，200mMPMSF，0.1μM生物素-蛋白连接酶，室温下孵育过夜，将此溶液经分子筛柱层析和离子交换柱层析提纯后，用含蛋白抑制剂的缓冲液透析并保存，得到生物素化的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体蛋白溶液；
5)四聚体的形成：在室温、避光条件下，将链霉亲和素偶联物的水溶液缓慢加入步骤4)的生物素化的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子单体蛋白溶液中，得到结合了SARS抗原肽的四聚体，并于4℃避光保存。
4、如权利要求3所述的结合了SARS抗原肽的四聚体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的生物素酶识别的氨基酸片段为Leu-Gly-Gly-Ile-Phe-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Leu-Arg-Asp。
5、如权利要求3所述的结合了SARS抗原肽的四聚体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)的诱导是将步骤1)克隆的含有HLA-A2.1重链重组cDNA的质粒和含有β-微球蛋白cDNA的质粒，分别转化到大肠杆菌BL21菌株，通过加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷，使细菌在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中扩增至OD值0.5～1.0，诱导含有HLA-A2.1重链重组cDNA的质粒和含有β-微球蛋白cDNA质粒在大肠杆菌体内大量合成HLA-A2.1重组重链蛋白，此诱导过程重复3～4次；所述步骤2)的纯化是将收集到的菌体，重悬于重悬液，边搅拌边滴入1.2ml 50mg/ml的溶菌酶，300μl 1.0M MgCl2，1.0ml 2mg/ml DNA酶，600μl Triton-X100，600μl 1M；超声波破碎，离心分离，得到初步提纯的含有HLA-A2.1重组重链蛋白，β-微球蛋白的包涵体蛋白；所述步骤2)的重悬液为50mM Tris-HCL，25w/v％蔗糖，1mMEDTA，0.1w/v％叠氮钠，10mM DTT。
6、如权利要求3所述的结合了SARS抗原肽的四聚体的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的折叠缓冲液为400mM L-Arginine，100mM Tris，2mM EDTA，pH8.3的水溶液，临用前加入终浓度为5mM的还原型谷胱甘肽，终浓度为0.5mM的氧化谷胱甘肽，终浓度为0.2mM的PMSF；所述步骤3)注射缓冲液为3M盐酸胍，10mM已酸钠，10mM EDTA，pH4.2的水溶液。
7、如权利要求3所述的结合了SARS抗原肽的四聚体的制备方法，其特征在于，所述步骤4)生物素化缓冲液为100mM Tris，200mM NaCl，5mM MgCl2的水溶液；所述步骤4)的含蛋白抑制剂的缓冲液为PBS，含1μg/ml亮肽素，1μM胃酶抑素和2mM EDTA。
8、一种权利要求1所述的结合了SARS抗原肽的四聚体的用途，该四聚体可用于直接定量检测人外周血样品中对SARS病毒有特异反应性T细胞水平的高低。
9、一种权利要求1所述的结合了SARS抗原肽的四聚体的用途，该四聚体可用于制备抗SARS病毒的免疫疫苗。
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