CN1244804A - 肽基免疫治疗剂 - Google Patents

肽基免疫治疗剂 Download PDF

Info

Publication number
CN1244804A
CN1244804A CN97181377A CN97181377A CN1244804A CN 1244804 A CN1244804 A CN 1244804A CN 97181377 A CN97181377 A CN 97181377A CN 97181377 A CN97181377 A CN 97181377A CN 1244804 A CN1244804 A CN 1244804A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
peptide
molecule
cell
hla class
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN97181377A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100364611C (zh
Inventor
曾根敏雄
粂晃智
大力一雄
纪光助
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meiji Co Ltd
Original Assignee
Meiji Dairies Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Dairies Corp filed Critical Meiji Dairies Corp
Publication of CN1244804A publication Critical patent/CN1244804A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100364611C publication Critical patent/CN100364611C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56977—HLA or MHC typing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

公开了可用于每个遭受变态反应的病人的肽免疫治疗剂以及用于对在选择可用于各个遭受变态反应的病人的肽免疫治疗剂中使用的病人HLA类Ⅱ分子进行分型检测的试剂。肽免疫治疗剂能实现对各个病人最佳的肽免疫治疗,这样在肽免疫治疗中可望有显著的改善。另一方面,可提供一种肽治疗剂,其中它还可用于通过在特定病人群中被识别的主要抗原肽的肽免疫治疗不能恢复的病人。进一步,还可方便地通过使用本发明的抗原肽进行遭受变态反应的病人的HLA类Ⅱ分子的分型。

Description

肽基免疫治疗剂
本发明涉及一种肽基免疫治疗剂。更具体地说，本发明涉及可用于具有与来自变应原的特定抗原肽结合的HLA类II分子的变态反应病人的肽基免疫治疗剂，它包含特定抗原肽作为有效成分。另外，本发明涉及用于识别HLA类II分子的试剂，它包含特异性地与特定的HLA类II分子反应的抗原肽。
变态反应是一种由抗体或敏化细胞对抗原产生应答导致的不希望的免疫反应。导致变态反应的抗原被具体地称为变应原。变应原包括广范围的物质，如花粉、螨虫、动物表皮、昆虫、食物、药物和化学品。变态反应通常特征在于包括对变应原的即刻反应以及随后的迟缓反应两个步骤。在变态反应的早期，变应原特异性的IgE抗体与外周血中的嗜碱性粒细胞和组织中的肥大细胞表面结合。当变应原进入体内时，嗜碱性粒细胞或肥大细胞表面的IgE抗体与变应原交叉反应。结果，释放包括组胺、前列腺素和白三烯的炎症介质。在对这些炎症介质产生应答时，局部聚集的淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞和嗜伊红性粒细胞被活化并释放导致组织损伤和组织中其它各种应答的介质，从而启动迟缓反应。
业已熟知变态反应受细胞因子控制。细胞因子不仅参与IgE产生的调控，而且参与效应细胞的活化和分化。这得到这样一观察结果的支持，即血液中的变应原特异性的IgE的水平是恒定的，即使变态反应病人的临床症状已通过脱敏作用得以缓解。
为治疗变态反应疾病的方法的脱敏作用包括对变态反应病人给药少量抗原(例如从柳杉花粉或螨虫中提取的抗原)并逐渐增加剂量。脱敏作用的成功被认为是减少的变态反应特异性T细胞的应答所造成的。脱敏作用被推测导致T细胞耐受性(T细胞无反应性)，结果不产生对于推进变态反应性级联放大非常重要的细胞因子。对变态反应的研究集中在早期的变应原特异性免疫反应，尤其是控制T细胞对变态反应应答的机理上。对包括变应原的外源抗原的变态反应性应答取决于免疫系统中的抗原呈递细胞而被启动。包括B细胞、巨噬细胞和树突细胞的抗原呈递细胞将外源抗原、外源抗原片段掺入抗原肽中(T细胞表位肽)，并在细胞表面表达断裂的抗原与MHC类II(人的HLA类II)一起来为抗原特异性CD4阳性辅助T细胞(Th细胞)提供抗原。
HLA类II分子(DR，DQ和DP)为由α、β链组成的细胞表面抗原。DR分子的α链由HLA-DRA基因编码；DR分子的β链由HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4或HLA-DRB5基因编码。DQ分子的α和β链分别由HLA-DQA1和HLA-DQB1基因编码，而DP分子的α和β链分别由HLA-DPA1和HLA-DPB1基因编码。除开HLA-DRA，每个基因包含许多等位基因。由α和β链组成的容纳抗原肽的袋状结构显示高度的多形性，它们的结构相互稍微有所不同。结果，与袋结合并被提供至T细胞的抗原肽的种类受其结构的限制。这可能导致各个免疫反应的不同。
接受抗原信息，通过T细胞受体(TCR)受HLA类II分子限制的细胞被活化并分泌各种细胞因子以自身增殖和使B细胞分化为浆细胞，从而诱导抗体的产生。同时，由非TCR分子介导的第二信号(共同刺激信号)对于活化T细胞是必需的。相反，没有该信号，则诱导Th细胞对抗原的免疫耐受性(June，C.等：今日免疫学，15：321，1994)。
对变应原的T细胞应答的减少与脱敏作用的成功相关。例如，与未治疗的病人相比，对美味食品发生变态反应的已有效脱敏十年的病人中的对美味食品变应原“Amb a 1”的体外T细胞应答显著降低。类似地，在对猫表皮抗原“Fel d 1”发生变态反应的病人中，对Fel d 1特异性的T细胞应答明显降低，因为脱敏作用显示了作用。在皮肤试验中，这种降低相对于敏感性的降低。而且，在治疗期间，Fel d 1特异性的IgG和IgE抗体保持恒定水平。这些结果表明可制备直接针对抗原特异性T细胞的变态反应治疗剂。
生化分离和分析技术的发展使得能纯化各种变应原。尤其是，已克隆了一百多种变应原基因，并且已在最近几十年中使用分子生物学和遗传工程方法确定了它们的一级结构。还确定了其中一些变应原的T细胞表位位点。
已公开了使用包括变应原的T细胞表位的肽的肽基免疫治疗组合物(公开在日本号平7-502890，平8-502163和平8-507436的国际专利申请)。当猫变应原Fel d 1分子的T细胞表位的某些部分，并非其所有，被经皮下施用于小鼠时，据说诱导抗全Fel d 1攻击的抗原特异性T细胞耐受性(Briner，T.J.等：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7608-7612，1994)。然而，人的临床试验未证实是否主要的T细胞表位足够有效来降低对全变应原攻击的T细胞应答和是否这能缓解临床症状。
据报道，约3-16个T细胞表位位点存在于变应原分子中，其中约1-7个位点被病人识别。当在各个病人中HLA类II不同时，被各个病人识别的T细胞表位位点也不同。当HLA类II类型相同时，识别相同的T细胞表位位点。因此，使用仅含一种在特定病人群中被识别的变应原分子的主要表位的肽的上述肽基免疫治疗剂不能对所有病人有效。
本发明的一个目的是提供一种对各个变态反应病人有效的肽基免疫治疗剂。本发明的另一个目的是提供一种分型被用于选择对各个变态反应病人有效的肽基免疫治疗剂的病人HLA类II型分子的试剂。
本发明人将注意力集中在这一事实上。即每个病人识别变应原不同的T细胞表位。本发明人建立了一种使变态反应性分子的各种T细胞表位与限制该表位的病人的HLA类II分子类型相互关联的方法。他们实际上让变应原分子的各种T细胞表位与限制柳杉花粉中的变应原中的表位的病人HLA类II分子的类型相互关联，如下面的Cryj1和Cryj2。
根据已知的DR、DQ和DP的HLA结合基元(Rammensee，H.G.等：免疫遗传学41：178-228，1995)，变应原分子的T细胞表位位点可通过分析变应原分子的一级结构并检测HLA基元的存在来确定。因此，为了最大化T细胞表位位点被包含于将构建的肽中的可能性，根据已知的HLA结合基元估测表位位点，并使用所述估测的基元构建肽。然而，含有估测的HLA基元的肽不总是导致期望的变态反应症状。可用于肽基免疫治疗的抗原肽必须至少通过使用T细胞(外周血淋巴细胞、T细胞系或T细胞克隆)的实验确定。本发明人通过这种实验确定了可用于各种HLA类型的肽基免疫治疗的抗原肽。
本发明人用抗原呈递细胞和由约15-30个氨基酸残基组成(其中重叠部分为约5-10个残基)的覆盖变应原的整个一级结构的重叠肽培养来自对特定变应原敏感的病人的外周淋巴细胞，T细胞系或T细胞克隆。接着通过测定[3H]胸苷的摄取量来分析对这些肽的T细胞应答(通过细胞增殖来应答)。T细胞对其产生应答的肽被鉴定为含有至少一个T细胞表位的抗原肽。结果，本发明人通过使用各种T细胞系或T细胞克隆成功地建立了其它T细胞表位与限制该表位的病人的HLA类II分子的相互关系。
而且，本发明人确定了被特定小鼠识别的T细胞表位。本发明人发现给予了所述T细胞表位的相同小鼠显示明显被抑制的对含有所述T细胞表位的肽的免疫应答。根据这一结果，本发明人认为可通过从含有其限制性分子被识别的T细胞表位的肽中选择与病人特有的HLA类II分子类型相容的T细胞表位肽来提供对各个病人有效的肽基免疫治疗剂，从而完成了本发明。
另外，通过本发明的方法可检测对应于特定的HLA类II分子的特定的T细胞表位。本发明人考虑使用特定的T细胞表位作为定型病人HLA类II分子的试剂并完成了本发明。定型HLA类II分子的试剂可被有效地用于选择对各个病人有效的肽基免疫治疗剂。
具体地，本发明由各权利要求所述的发明构成。
本文使用的术语定义如下。
“T细胞表位”指由T细胞受体特异性识别(或应答)的结构。
“识别”指活化T细胞。T细胞活化与否可通过细胞因子，如IL-2、IL-4和IFN-γ的产生或通过DNA合成来观察。
“抗原肽”指起抗原作用并含有T细胞表位的肽。
“无反应性”指其中淋巴细胞未被抗原活化并且为功能性失活的状态。
“HLA单元型”指通常被遗传作为特定组的HLA类基因座的集合。
“连锁不平衡”指当不同的HLA基因座的等位基因单元型中在一个染色体或偶然具有比期望高的频率被识别时，不同基因之间发现的相互关系。通过期望值与测定值之间的差异(Δ)来测定连锁不平衡。
与特定HLA分子结合的肽通常在特定位点含有特定的氨基酸残基。“HLA-结合氨基酸基元”指对于与HLA-结合肽上的HLA分子结合非常重要的氨基酸残基(HLA锚定残基)位点和种类的集合。各个HLA等位基因产物含有其自身的基元。在本文中，HLA-结合氨基酸基元还被简单地称为HLA-结合基元。
在本发明中，可通过例如将来自对特定变应原敏感的病人的外周血淋巴细胞、T-细胞系或T-细胞克隆与抗原呈递细胞和由约15-30个氨基酸残基(其中重叠部分为约5-10个氨基酸残基)组成的覆盖所述变应原整个一级结构的重叠肽一起培养，通过测定[3H]胸苷的摄取量来确定对这些肽的T细胞应答(通过细胞增殖来应答)，并确定T细胞对其应答的肽来对变应原分子中的T-细胞表位进行作图。可通过接着缺失抗原肽的氨基或羧基末端氨基酸残基来合成缺失变体肽并监测对这些变体肽的T细胞应答的变化来确定准确的表位位点。或者，当多于两个的含有重叠区的肽产生T-细胞应答时，可通过合成含有部分或全部重叠区的新的T细胞表位肽，并监测T细胞应答的变化来确定准确的表位位点。本发明的抗原肽优选含有至少七个氨基酸残基。
对抗原肽的T细胞应答可通过计算表明对抗原肽的T细胞应答水平的刺激指数(SI)来检测。可通过将对肽应答的[3H]胸苷摄取值(cpm)除以使用不含肽的培养基所获得的值(cpm)来计算SI。可用于本发明的肽基免疫治疗剂的抗原肽的SI为至少2.0，优选至少2.5，更优选至少3.5，最优选至少5.0。
本发明的抗原肽对来自具有限制所述肽的HLA类II型分子的各个变态反应病人的外周血淋巴细胞、T细胞系或T细胞克隆具有体外增殖活性。本发明的抗原肽不与对从中产生所述肽的变应原敏感的病人的IgE抗体反应。通过施用抗原肽本发明的抗原肽可诱导抗原特异性T细胞无反应性，从而在当制造来自所述抗原肽的重组或天然变应原的攻击时，可随时诱导免疫耐受性。另一方面，一旦本发明的抗原肽被施用至被变应原敏化的个体，此后，当制造所述变应原的攻击时可随时诱导免疫耐受性。这些事实表明本发明的抗原肽在体外诱导抗原特异性免疫耐受性并可用于变态反应病人的肽基免疫治疗。
可如下分型与抗原肽结合的变态反应病人的HLA类II分子。将确定的抗原肽、用丝裂霉素C处理的自我衍生的EB细胞系(被Epstein-Barr病毒转化的B细胞株)和T细胞与抗HLA-DR抗体、抗HLA-DQ抗体或抗HLA-DP抗体一起培养以分析T细胞增殖应答的抑制，从而确定分子DR、DQ或DP中的哪种限制抗原肽。当确定的限制分子为DQ或DP时，可使用具有已知HLA单元型的EB细胞系作为抗原呈递细胞来确定限制分子的类型(DQ或DP)(Hori，T.等：组织抗原47：485-491，1996)。通过从B细胞系中提取DNA并将它进行第11届国际主要组织相容性会议[Tsuji，K.，Aizawa，M.和Sashazwuki，T编(1982)HLA-1991卷1 pp395-518]通过的PCR-SSO方法来进行HLAII型DNA的分类。由于DRB1*与DR超类型(DRB3*、DRB4*和DRB5*)之间的连锁不平衡，限制分子DR不能通过使用EB细胞系作为抗原呈递细胞来确定，因此，限制分子通过用DRB1*或仅一种类型的DR超类型转化小鼠L细胞并使用表达导入基因的转化体作为抗原呈递细胞来鉴定。
抗原肽和限制它们的HLA类II分子的实例如下。
目前已分离和纯化了柳杉花粉变应原的主要变应原Cryj1和Cryj2。两种变应原的cDNA已被分离，它们推测的一级结构已被公开(以日本平8-502163和平8-505284公开的国际专利申请)。根据分子的一级结构鉴定了Cryj1分子中的T细胞表位位点。公开了由作为有效成分的含有表位位点的肽组成的用于柳杉花粉变态反应的治疗组合物(在日本平8-502163公开的国际专利申请)。报道了多于90％的柳杉花粉变态反应的病人具有对Crtj1和Cryj2特异性的IgE抗体；其余10％的病人具有对Cryj1或Cryj2特异性的IgE抗原(Hashimoto，M等：临床实验变态反应44：840-841，1995)。
根据上面的报道，本发明人认为通过施用Cryj 1T细胞表位或Cryj 2T细胞表位的肽基免疫治疗不是足够地有效。本发明人提供对由HLA-DPB1*0501呈递的抗原肽导致的柳杉花粉变应反应的肽基免疫治疗有效的具有最小长度的多表位肽。HLA-DPB1*0501通常在遭受柳杉花粉变态反应的病人中存在并来自于Cryj1和CryJ2，以及由不同的HLA类II分子(DR、DQ或DP)呈递的抗原肽(日本专利申请号平8-80702)。
这种多表位肽可望增加变态反应病人中的有效性，但对不具有限制由所述表位肽组成的抗原肽的HLA分子的病人无效。为了有效的肽基免疫治疗，应将与各HLA类型相容的抗原肽施用至个体。
下面给出抗原肽与遭受柳杉花粉变态反应的病人中的HLA类II限制分子类型组合的实例。HLA类II分子以及其结合配偶体抗原肽的具体实例包括：
1)遭受柳杉花粉变态反应的病人的DRB5*0101与来自Cryj1的抗原肽p106-120(SEQ ID NO：3)和p109-117(SEQ ID NO：4)以及来自Cryj2的抗原肽p66-80(SEQ ID NO：14)和p236-250(SEQ ID NO：19)结合，
2)DRB4*0101与来自Cryj1的抗原肽p191-205(SEQ ID NO：7)以及来自Cryj2的抗原肽p186-200(SEQ ID NO：18)结合，
3)DQA1*0102-DQB1*0602与来自Cryj1的抗原肽p16-30(SEQ IDNO：1)、p146-160(SEQ ID NO：5)、p191-205(SEQ ID NO：7)、p251-265(SEQID NO：9和p326-340(SEQ ID NO：10)以及来自Cryj2的抗原肽p326-340(SEQID NO：21)和p341-355(SEQ ID NO：23)结合，
4)DPA1*0101-DPB1*0501与来自Cryj1的抗原肽p61-75(SEQ ID NO：2)和p221-225(SEQ ID NO：8)以及来自Cryj2的抗原肽p76-90(SEQ ID NO：15)结合，
5)DPA1*0202-DPB1*0501与来自Cryj2的抗原肽p336-350(SEQ IDNO：22)结合，
6)DPA1*0101-DPB*201与来自Cryj2的抗原肽p181-195(SEQ ID NO：17)结合，
7)DRB1*0901与来自Cryj1的抗原肽p151-165(SEQ ID NO：6)和p191-205(SEQ ID NO：7)以及来自Cryj2的抗原肽p16-30(SEQ ID NO：12)、p151-165(SEQ ID NO：16)和p321-335(SEQ ID NO：20)结合。
8)DRB1*1501与来自Cryj2的抗原肽p36-50(SEQ ID NO：13)和p236-250(SEQ ID NO：19)结合。
来自Cryj1的抗原肽p106-120(SEQ ID NO：3)的核心序列为p109-117(SEQ ID NO：4)。
Ikagawa等报道Cyj1抗原肽p335-346(SEQ IDNO：11)由DRB3*0301呈递(Ikagawa，S.等：变态反应临床免疫学杂志97：53-64，1996)。Hori等报道Cryj1抗原肽p214-222(SEQ ID NO：24)由DPA1*0202-DPB1*0501呈递(Hori等：组织抗原，47：481-491，1996)。
通常假设取决于抗原类型，在HLA类II基因座水平上限制分子存在偏差。上面的研究表明原则上所有DR、DQ和DP分子被没有偏见地用作提供来自Cryj1或Cryj2的抗原肽的限制分子。
与Cryj1中的特定抗原结合的主要HIA类II分子包括与p61-75(SEQ IDNO：2)结合的DPA1*0101-DPB1*0501、与p146-160(SEQ ID NO：5)结合的DQA1*0102-DQB1*0602和与p211-225(SEQ ID NO：8)结合的DPA1*0101-DPB1*0501。在Cryj2中，这些包括与p16-30(SEQ ID NO：12)结合的DRB1*0901、与p36-50(SEQ IDNO：13)结合的DRB1*1501、与p76-90(SEQID NO：15)结合的DPA1*0101-DPB1*0501、与p186-200(SEQ ID NO：18)结合的DRB4*0101，以及与p336-350(SEQ ID NO：22)结合的DPA1*0202-DPB1*0501。其它肽不仅可与确定的限制分子，而且开与其它分子结合，因此被称为多结合物肽。
通常，与特定HL分子结合的抗原肽包含共同的HLA结合氨基酸基元。HLA结合氨基酸基元对于抗原肽与HLA分子结合是必需的。虽然其它肽激素受体对于它们的配体具有高选择性，但HLA分子对于与抗原肽的结合不具有高选择性。因此，HLA分子可与各种可能的抗原肽结合。在HLA类II分子中，抗原肽的结合基元由具有1-2个氨基酸插入的隔开分布的3-5个氨基酸残基组成(Matsushita，S.等：实验医学杂志180：873-883，1994；Rammensee，H.-G.等：免疫遗传学41：178-228，1995)。使用这些已知的HLA类II结合基元，可进一步根据柳杉花粉变应原分子的一级结构来选择可与作为例证的HLA类II分子结合的抗原。因此，与遭受柳杉花粉变态反应的病人拥有的特定HLA类II型结合的本发明的抗原肽不局限于本发明指出作为例证的抗原肽，而包括被期望与特定HLA类II结合的抗原肽。
与特定HLA类II结合的上述抗原肽可被用作用于具有所述HLA类II类型的病人的肽基免疫治疗剂。当本发明的抗原肽被用作肽基治疗剂治疗变态反应的病人时，可将它与药物可接受赋形剂和载体混合。可通过简单的方法来给药产生的组合物，如注射(皮下或皮内)、滴入法、鼻内注射、口服、吸入法、经皮施用或透粘膜施用。剂量可由本领域技术人员通过常规方法确定。
为了选择适宜于每个病人的肽基免疫治疗剂，应确定病人的HLA类II类型。可通过使用特异性地与HLA类II分子反应的抗原肽作为试剂来确定病人的HLA类II类型。
具体地，可如下分型变态反应病人和健康个体的HLA类II分子。由于其高度的多形性，与各分子结合的抗原肽的氨基酸基元随HLA类II的类型而变化。病人和健康个体的HLA类II分子可因此通过用不同结合基元标记抗原肽并检测与HLA类II分子的特异性结合来进行分型。可通过将如放射性同位素、酶、荧光标记或发光标记的已知标记与非抗原肽的HLA锚定氨基酸残基的氨基酸残基(例如酪氨酸残基)结合来标记抗原肽。另一方面，用与上面标记结合的链霉抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)检测生物素化的抗原肽。可通过在存在各种来自变态原的抗原肽时培养个体的外周血淋巴细胞，通过例如将[3H]胸苷加入到培养基中并测定[3H]胸苷摄取量来监测T细胞应答以诊断变态反应病人。而且，如果可在个体(变态反应应答阳性病人)中发现T细胞应答，限制诱导T细胞应答的抗原肽的个体的HLA类II分子的类型可被确定为对所述变应原敏感的个体的HLA类II的类型。
病人HLA类II类型与由该方法确定的抗原肽之间的相互关系可被用来研究各种HLA类II的类型在启动变态反应中的作用或用来选择在变态反应病人的肽基免疫治疗剂中采用的抗原肽。
可通过选择与所述病人的HLA类型相容的抗原肽，测定使来自病人的外周血淋巴细胞增殖的对肽的应答，并比较肽的应答水平来制备用于其HLA类II分子类型的已被确定的具体变态反应病人的肽基免疫治疗剂。例如，描述在实施例6中的含有柳杉花粉变态反应的病人PB的HLA型I和型II的单元型为：A2/24-B39/55-Cw7/w3-DRB1*1501/0901-DRB4*0101-DRB5*0101和DQA1*0102/0301-DQB1*0602/0303-DPB1*0101/0101-DPB1*0501/0201。当选择用于所述病人的肽基免疫治疗的抗原肽时，在Cyj1中应选择由DPA1*0101-DPB1*0501呈递的抗原肽p211-225(SEQ ID NO：8)、由DBR5*0101呈递的p106-120(SEQ ID NO：3)、由DQA1*0102-DQB1*0602呈递的p191-205(SEQ ID NO：7)或p251-265(SEQ ID NO：9)；在Cryj2中，应选择由DPA1*0101-DPB1*0501呈递的p76-90(SEQ ID NO：15)、由DRB4*0101呈递的p186-200(SEQ ID NO：18)和由DRB5*0101呈递的p66-80(SEQ ID NO：14)。在使用这些抗原肽进行肽基免疫治疗之前，应测定对于这些抗原肽的使来自病人的外周血淋巴细胞增殖的应答以选择显示相对高增殖活性的抗原肽，其中该抗原将被用于肽基免疫治疗。
为了提高溶解性、治疗或预防效果以及效果的稳定性，可通过不损害它们的功能而置换、缺失或增加非HLA锚的氨基酸残基来修饰本发明的抗原肽。可适宜地用Ala、Ser、Glu或甲基氨基酸置换一些氨基酸，但置换的氨基酸不限于此。Cys残基通过二硫键形成二聚体并起多结合物的作用。因此，用含有Cys残基的肽免疫可导致最初不参与抗原性的位点的识别并由此产生新的表位。在这种情况下，Cys残基可被Ala、Ser、Thr、Leu或Glu置换。它还可被D氨基酸或非天然氨基酸置换。已研究出了能以多肽的形式表达即在其N或C末端具有组氨酸聚合物(例如组氨酸六聚体)的载体。甚至在变性剂存在下，可通过使用镍螯合柱的亲和层析纯化表达产物。这一具体实施方案也包括在本发明中。
本发明的抗原肽可来自一种变应原分子或两种或多种不同的分子。所有蛋白质变应原都可用于本发明，包括草本植物的花粉，如豚草、野茅和黑麦草的花粉；木本植物的花粉，如柳杉、扁柏和高山雪松的花粉；螨、动物；真菌；昆虫和食物。
图1显示Cryj1与病人T细胞表位位点之间的重叠肽。在图中，□说明2≤SI＜5，■说明5≤SI。从PB和PJ制备T细胞克隆。
图2显示Cryj2与病人T细胞表位位点之间的重叠肽。在图中，□说明2≤SI＜5，■说明5≤SI。从PB、PC和PR制备T细胞克隆。
图3显示被识别Cryj1的T细胞克隆识别的表位位点、限制所述克隆的分子、所述克隆的淋巴因子的产生以及所述克隆的Th类型。在图中，Th2代表IL-4/IFNγ＞10，Th1代表IFNγ/IL-4＞10，Th0代表其中的中间值。
图4显示被识别Cryj1的T细胞克隆识别的表位位点、所述克隆的限制分子、所述克隆的淋巴因子的产生以及所述克隆的Th类型。在图中，Th2代表IL-4/IFNg＞10，Th1代表IFNg/IL-4＞10，Th0代表其中的中间值和Thp代表没有淋巴因子产生。
图5显示当Cryj2的抗原肽p66-80施用于小鼠时，CB6F1小鼠对Cryj2的免疫应答。
图6显示当Cryj2的抗原肽p186-200施用于小鼠时，CB6F1小鼠对Cryjj2的免疫应答。
根据下面实施例说明本发明，但不认为其局限于此。
实施例1：柳杉花粉抗原的纯化
通过Yasueda等的方法(Yasueda，H.等，变态反应临床免疫学(1983)71：77-86)纯化Cryj1。通过将Cryj2基因(未审公开日本专利申请(JP-A)号平8-47392)插入到表达载体pQE9(Qiagen GmbH，德国)中，用载体转化大肠杆菌以表达基因，并通过使用Ni2+-NTA-琼脂糖(Quiagen有限公司，美国)的亲和柱层析纯化基因表达产物来纯化Cryj2(Komiyama，N.等生物化学与生物物理研究通讯(1994)201：1021-1028)。
实施例2重叠肽的合成
根据Cryj1(WO94/01560)和Cryj2(JP-A号平8-47392)的一级结构，使用肽合成仪(Shimadzu，PSSM-8型)合成69种Cryj1的重叠肽(图1)和74种Cryj2的重叠肽(图2)。这些重叠肽覆盖Cryj1或Cryj2的全部一级结构并由其中重叠部分具有10个残基的15个氨基酸残基组成。将肽溶解在含8M尿素的PBS中至2mM。当肽被加入到用于分析T细胞增殖应答的培养体系中时，将肽稀释500倍以消除尿素的影响。
实施例3：建立抗原呈递细胞
通过Ficoll-paque(Pharmacia)比重离心法从含有柳杉花粉变态反应的病人的外周血中分离外周血淋巴细胞。将含有Esptein-Barr(EB)病毒的B95-8细胞(来自绒猴，ATCC CRL1612)的培养上清加入到1×106外周血淋巴细胞中以用EB病毒感染外周血淋巴细胞中的B细胞。将感染的B细胞在含200ng/ml环孢菌素A和20％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基中培养约20天以建立转化的B细胞系。
实施例4：建立T细胞系和T细胞克隆
将4×106外周血淋巴细胞悬浮在2ml补充有20％人血清的RPMI-1640培养基中，并在存在50ug/ml Cryj1或2-10ug/ml Cryj2时培养8天以活化识别Cryj1或Cryj2的T细胞。
当活化的T细胞出现时，通过将培养基用含200U/ml IL-2(Boehringer-Mannheim)和15％人血清的RPMI-1640培养基代替并将细胞再培养14天来建立特异性地识别Cryj1或Cryj2的T细胞系。
如下建立特异性识别Cryj1或Cryj2的T细胞克隆。当活化的T细胞出现时，将T细胞铺展在一个10cm培养皿中，并使用微量移液管逐一进行选择。将被EB病毒感染的相同的未活化细胞用丝裂霉素C(Kyowa HakkoKogyo)处理，接种到96井微量培养平板的各井中至1×105细胞/井。将上面活化的T细胞转移至96井平板中，其中为1个细胞/井。再将另外50ug/mlCryj1或2-10ug/ml Cryj2加入到各井中并培养7天用于攻击。将攻击以7天的间隔重复2或3次以建立T细胞克隆。
实施例5：鉴定Cryj1和Cryj2 T细胞表位
用Cryj1或Cryj2攻击来自18位遭受柳杉花粉变态反应的病人的外周血淋巴细胞以建立特异性识别各个病人的Cryj1或Cryj2的T细胞系。在96孔微量平板中，将5×104自我衍生的用丝裂霉素C处理的B细胞系的细胞，2um重叠肽和2×104T细胞系的细胞在补充有0.2ml 15％血清的RPMI-1640培养基中培养2天。加入0.5uCi[3H]胸苷，再将培养基培养18小时。将细胞收集在安有细胞收集器的玻璃滤器中，用液体闪烁计数器测定[3H]胸苷的摄取。能识别Cryj1或Cryj2以及HLA类II分子的抗原信息的T细胞增殖，并将[3H]胸苷摄入细胞中。显示2或更高的刺激指数的细胞被认为是加入的抗原肽。
在使用识别Cryj1的T细胞系确定的T细胞表位位点中，各病人识别的T细胞表位位点的数目平均为9.8±3.0，变化范围为4≤15表位。使用识别cryj2的T细胞系，各病人识别的T细胞表位位点的数目平均为8.7±3.3，变化范围为2≤13表位。由于Cryj1由353个氨基酸组成(公开在日本号平8-502163中的国际专利申请)，Cryj2由379个氨基酸组成(JP-A号平8-47392)，因此，上面的结果意味着每100个氨基酸存在约2.3-2.8个T细胞表位位点。每位病人具有不同的HLA类II类型，因此取决于HLA类II的类型而识别不同的T细胞表位。通过标记在被每位病人识别位于Cryjj1或Cryj2分子上的Cryj1或Cryj2分子T细胞表位位点中的T细胞表位位点来制得表位图谱。结果示于图1和2中。
实施例6：识别T细胞克隆的T细胞表位的鉴定
在18位遭受柳杉花粉变态反应的病人中，选择2位识别cryj1的抗原肽p211-225和p106-120[病人B(下文称为PB)和病人J(下文称为PJ)]、3位识别cryj2的抗原肽p66-80、p186-200、p236-250和p341-355[PB，病人C(下文称为PC)和病人R(下文称为PR)]。通过用Cryj1或Cryj2刺激这些柳杉花粉变态反应病人的外周淋巴细胞建立识别Cryj1或Cryj2的T细胞克隆。4位病人的HLA类I和II类型如下：PB：A2/24-B39/55-Cw7/w3-DRB1*1501/0901-DRB4*0101-DRB5*0101、DQA1*0102/0301-DQB1*0602/0303-DPA1*0101/0101-DPB1*0501/0201；PJ：A24/--B61/51-Cw3/--DRB1*1501/0802-DRB5*0101，DQA1*0102/0401-DQB1*0602/0402-DPA1*-/--DPB1*0501/0402；PC：A-2/2-B54/51-Cw1/-、DRB1*0405/1501-DRB4*0101-DRB5*0101-DQA1*0301/0102-DQB1*0401/0602-DPA1*0202/0202-DPB1*0201/0501；PR：A-11/--B60/35-Cw7/w3-DRB1*0901/1501-DRB4*0101-DRB5*0101-DQA1*0301/0102-DQB1*0303/0602-DPA1*01/0202-DPB1*0201/0201。
分别从来自PB和PJ的外周血淋巴细胞建立35和14种类型的特异性识别Cryj1的T细胞克隆。类似地，分别从来自PB、PC和PR的外周血淋巴细胞建立31、10和17种类型的特异性识别Cryj2的T细胞克隆。所有这些T细胞克隆为CD3+、CD4+、CD8-、TCRαβ+、TCRγδ-，因此限制细胞被发现为HLA类II分子。在96井微量平板中，将自我衍生I的用丝裂霉素C处理的5×104B细胞系、2um重叠肽和2×104T细胞克隆在补无有0.2ml 15％血清的RPMI-1640培养基中培养2天。在加入0.5uCi[3H]胸苷后，将细胞进一步培养18小时。将细胞收集在安有细胞收集器的玻璃滤器中，用液体闪烁计数器测定[3H]胸苷的摄取。通过上面操作确定每个T细胞克隆识别的T细胞表位。测得69％(34/49)的识别Cryj1的T细胞克隆对含T细胞表位的肽和抗原肽刺激产生应答而增殖。类似地，在69％(40/58)的识别Cryj2的T细胞克隆中测出了抗原肽。特异性识别Cryj1的T细胞克隆识别肽p16-30、p61-75、p91-105、p106-120、p146-160、p151-165、p191-205、p211-225、p251-265、p326-340和p331-346。特异性识别Cryj2的T细胞克隆识别肽p16-30、p21-35、p36-50、p66-80、p76-90、p81-95、p151-165、p181-195、p186-200、p236-250、p321-335、p326-340、p336-350、p341-355和p346-360。结果总结在图1和2中(中间的直方图)。
实施例7：在基因座水平上的HLA类II限制分子的鉴定
通过将特异性与HLA类II-DR、HLA-型II-DQ或HLA型DP反应的单克隆抗体加入到实施例4建立的T细胞克隆的增殖应答体系中以抑制T细胞增殖应答来在基因座水平上鉴定HLA类II限制分子。
将自我衍生I的用丝裂霉素C处理的2×104B细胞系、2um重叠肽、3ug/ml抗DR、DQ或DP单克隆抗体(Becton/Dickinson)和2×104T细胞克隆在补充有0.2ml 15％血清的RPMI-1640培养基中培养2天。在加入0.5uCi[5H]胸苷后，将细胞进一步培养18小时。将细胞收集在装有细胞收集器的玻璃滤器中，用液体闪烁计数器测定[3H]胸苷的摄取。
实施例8：HLA类II分子的每种类型的鉴定
在基因座水平确定了其限制分子的T细胞克隆的各种HLA类II类型的限制分子可通过使用作为抗原呈递细胞的DR基因转化的小鼠L细胞和具有与DQ或DP相同的单元型的B细胞系来进行鉴定。
将用丝裂霉素C处理的5×104上述小鼠L细胞或与B细胞系匹配的单元型、2um重叠肽、3ug/ml抗DR、DQ或DP单克隆抗体(Becton/Dickinson)和2×104T细胞克隆在补充有0.2ml 15％血清的RPMI-1640培养基中培养2天。在加入0.5uCi[3H]胸苷后，将细胞进一步培养18小时。使用细胞收集器将细胞收集在玻璃滤器中，用液体闪烁计数器测定[3H]胸苷的摄取。当观察到T细胞克隆的增殖应答时测定增殖细胞。分析结果示于图3和4中。
实施例9：T细胞克隆的Th类型的鉴定
Th2细胞被推测参与变态反应的启动。仍未揭示出对抗原刺激产生应答的T细胞分化成Th1或Th2细胞是否受特定表位肽或HLA类II基因座的控制。如果在被用于选择抗原肽的肽刺激后主要诱导+Th2细胞，那么由于该肽的施用将加重柳杉花粉变态反应。为了检验上面的假设，通过用T细胞识别的表位肽刺激克隆，并测定IL-2、IL-4和IF-Nγ的产生来确定实施例4中制备的T细胞克隆的类型。
具体地，将自我衍生I的用丝裂霉素C处理的1×105B细胞系、2um重叠肽和5×105T细胞克隆在含有1ml 10％血清的RPMI-1640培养基中培养24小时，接着通过离心获得上清。使用可商购的ELISA盒[IL-2(R&D)、IL-4(Medojenics)和IFNγ(Otsuka分析实验室)]测定上清中的IL-2、IL-4和IFNγ。
图3和4显示每个克隆的IL-2、IL-4、IFNγ的产生和Th类型。在Th2细胞中，识别Cryj1的T细胞克隆的数目为12，在Th1细胞中为1，在Th0细胞中为16，因此Th2的数目大于Th1的数目。相反，在Th2细胞中，识别Cryj2的T细胞克隆的数目为10，在Th1细胞中为8，在Th0细胞中为8，因此Th1的数目几乎与Th2的数目相同。比较识别各种T细胞克隆的T细胞表位、限制分子和Th类型，每种细胞克隆在Th2、Th1和Th0类型上不相同。对于一些识别相同表位和相同抗原呈递分子的T细胞克隆，确定了Th2和Th1细胞。这些发现表明Cryj1或Cryj2刺激后的T细胞分化成Th2、Th1或Th0细胞不由特定T细胞表位或特定限制分子的混合物决定。换句话说，任何含有T细胞表位位点的肽可刺激T细胞并可被选择作为用作肽基免疫治疗剂的肽。
实施例10：CB6F1小鼠中的T细胞表位的鉴定
每两周将8周龄雄性CB6F1小鼠用10ug重组Cryj2(rCryj2)与佐剂(Imject Alum，PIERCE)一起免疫一次，共计3次(ip)。最后一次免疫一周后，从三只小鼠中制备脾细胞并混合。在96井平板(Falcon)的各井中，将5×106脾细胞与0.115uM 74种类型的由15个氨基酸残基组成的重叠肽一起培养在0.2ml RPMI培养基中(10％FCS，2mML-谷胺酰胺，50U/ml青霉素和59ug/ml链霉素)。作为对照，评价对PBS、50ugml Cryj1、0.3ug/mlrCryj2的应答。将每种试剂接种在三个井中，将细胞在37C，5％CO2下培养三天。在最后6小时用0.5uCi/井[3H]胸苷进行脉冲标记，使用细胞收集器(Inoteck，Bertold日本)将细胞收集在玻璃滤器中。干燥细胞后，用液体闪烁计数器(TRI-CARB4530，Packard日本)测定[3H]胸苷的摄取。
用rCryj2免疫的CB6F1小鼠显示强的对rCryj2抗原的应答，但不对其它柳杉花粉主要变应原Cryj1产生应答，表明该系统为抗原特异性反应。用rCryj2免疫的CB6F1小鼠显示在测试的90种重叠肽中显著的对p66-80(SEQ ID NO：14)和p236-250(SEQ ID NO：48)的应答。这些结果表明在CB6F1小鼠中，p66-80和p236-250作为主要的T细胞表位参与抗原呈递。在人类，p66-180(SEQ ID NO：14)和p236-250(SEQ ID NO：48)也为主要的T细胞表位肽。因此，CB6F1小鼠可作为有用的模型动物来评价用于柳杉花粉变态反应的肽基免疫治疗的肽组合物的有效性。
实施例11：抗原肽p66-80(SEQ ID NO：14)的体内免疫反应
以5天的间隔将3mg溶解在生理盐水的p66-80肽(SEQ ID NO：14)经皮下对8周龄雄性小鼠给药两次。类似地，将相同体积(100ul)的生理盐水给药至对照组小鼠。每一给药肽组和对照组均有8只小鼠。在第二次给药肽5天后，将与佐剂Imject Alum混合的50ug rCryj2经皮下给药至所有小鼠中以进行免疫。免疫一周后，从各小鼠中制备脾细胞。在96井平板(Falcon)的各井中，将5×106脾细胞与3ug/ml rCryj2一起培养在0.2ml RPMI培养基中(10％FCS，2mML-谷胺酰胺，50U/ml青霉素和50ug/ml链霉素)。作为对照，将细胞培养在相同的不含rCryj2的培养基中。如实施例10所述测定[3H]胸苷的摄取。
当在rCryj2抗原刺激之前将p66-80(SEQ ID NO：14)经皮下给药至CB6F1小鼠时，与给药生理盐水组比较，T细胞的免疫应答被显著抑制(p＜0.01)。该结果表明在小鼠模型中，p66-80(SEQ ID NO：14)体系在用于治疗柳杉花粉变态反应的肽基免疫治疗中显示预防作用。
实施例12：抗原肽p236-250(SEQ ID NO：48)的体内免疫反应
以5天的间隔将3mg溶解在生理盐水的p236-250肽(SEQ ID NO：48)经皮下对6周龄雄性小鼠给药两次。作为对照，以如上的相同方式将相同体积(200ul)的生理盐水给药至小鼠。每一给药肽组和对照组均有8只小鼠。在第二次给药肽5天后，将与佐剂Imject Alum混合的50ug rCryj2经皮下给药至所有小鼠中以进行免疫。免疫一周后，从各小鼠中制备脾细胞。在96井平板(Falcon)的各井中，将5×106脾细胞与3ug/ml rCryj2一起培养在0.2ml RPMI培养基中(10％FCS，2mML-谷胺酰胺，50U/ml青霉素和50ug/ml链霉素)。作为对照，将细胞培养在相同的不含rCryj2的培养基中。如实施例10所述测定[3H]胸苷的摄取。
当在rCryj2抗原刺激之前将p66-80(SEQ ID NO：14)经皮下给药至CB6F1小鼠时，与给药生理盐水组比较，T细胞的免疫应答被显著抑制(p＜0.05)。该结果表明在小鼠模型中，p236-250(SEQ ID NO：48)体系在用于治疗柳杉花粉变态反应的肽基免疫治疗中显示预防作用(图6)。
上面结果揭示出在人中使用柳杉花粉提取物的常规的脱敏作用是基于由T细胞表位介导的机理。
工业可实用性
根据本发明，与每个变态反应病人的HLA类II分子的单元型匹配的抗原肽可被用作用于相同病人的肽基免疫治疗剂。本发明能实现对每位病人的最佳的肽基免疫治疗，因此肽基免疫治疗的有效性可望被显著提高。另一方面，本发明提供对不能通过使用在特定病人群中被识别的主要抗原肽的肽基免疫治疗来进行治疗的病人有效的肽基免疫治疗。
此外，可使用本发明的抗原肽简单而容易地进行变态反应病人的HLA类II分子的分型。
序列表(1)申请人姓名：MEIJI MILK PRODUCTS CO.，LTD.(2)发明名称：肽基免疫治疗剂(3)参考号：M1-808PCT(4)申请号：(5)申请日：(6)提出优先权申请的国家以及申请的申请号：日本，号平8-302053(7)优先权日：1996，11，13(8)序列数：24SEQ ID NO：1：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：1Q N R M K L A D C A V G F G S1       5         10        15SEQ ID NO：2：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：2G A T R D R P L W I I F S G N1       5         10        15SEQ ID NO：3：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：3P C V F I K R V S N V I I H G1       5         10        15SEQ ID NO：4：信息序列长度：9序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：4F I K R V S N V I1       5SEQ ID NO：5：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：5H P Q D G D A L T L R T A T N1       5         10        15SEQ ID NO：6：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：6D A L T L R T A T N I W I D H1       5         10        15SEQ ID NO：7：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：7L F F N H H K V M L L G H D D1       5         10        15SEQ ID NO：8：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：8K S M K V T V A F N Q F G P N1       5         10        15SEQ ID NO：9：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：9Y A I G G S S N P T I L S E G1       5         10        15SEQ ID NO：10：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：10A F N V E N G N A T P Q L T K1       5         10        15SEQ ID NO：11：信息序列长度：11序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：11T P Q L T K N A G V L1       5         10SEQ ID NO：12：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：12G K H D C T E A F S T A W Q A1       5         10        15SEQ ID NO：13：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：13S A M L L V P G S K K F V V N1       5         10        15SEQ ID NO：14：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：14V D G I I A A Y Q N P A S W K1       5         10        15SEQ ID NO：15：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID N0：15P A S W K N N R I W L Q F A K1       5         10        15SEQ ID NO：16：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：16P E F H L V F G N C E G V K I1       5         10        15SEQ ID NO：17：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：17G I D I F A S K N F H L Q K N1       5         10        15SEQ ID NO：18：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：18A S K N F H L Q K N T I G T G1       5         10        15SEQ ID NO：19：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：19S R A E V S Y V H V N G A K F1       5         10        15SEQ ID NO：20：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：20A T A A A I Q L K C S D S M P1       5         10        15SEQ ID NO：21：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：21I Q L K C S D S M P C K D I K1       5         10        15SEQ ID NO：22：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：22C K D I K L S D I S L K L T S1       5         10        15SEQ ID NO：23：信息序列长度：15序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：23L S D I S L K L T S G K I A S1       5         10        15SEQ ID NO：24：信息序列长度：9序列类型：氨基酸拓扑学：线性分子类型：肽序列描述：SEQ ID NO：24K V T V A F N Q F1       5

Claims (15)

1.一种用于治疗具有与来自变应原的特定抗原肽结合的特定HLA类II分子的变态反应病人的肽基免疫治疗剂，其中所述治疗剂包含所述特定抗原作为有效成分。
2.权利要求1的肽基治疗剂，其中所述变应原为柳杉花粉变应原Cryj1和/或Cryj2。
3.权利要求2的肽基免疫治疗剂，其中抗原肽为来自Cryj1的p106-120(SEQ ID NO：3)或p109-117(SEQ ID NO：4)或来自Cryj2的p66-88(SEQ IDNO：14)或p236-250(SEQ ID NO：19)，并且所述特定HLA类II分子为DRB5*0101。
4.权利要求2的肽基免疫治疗剂，其中抗原肽为来自Cryj2的p186-200(SEQ ID NO：18)，并且特定HLA类II分子为DRB4*0101。
5.权利要求2的肽基免疫治疗剂，其中抗原肽为来自Cryj1的p16-30(SEQ ID NO：1)、p146-160(SEQ ID NO：5)、p191-205(SEQ ID NO：7)、p251-265(SEQ ID NO：9)或p326-340(SEQ ID NO：10)或来自Cryj2的p326-340(SEQ ID NO：21)或p341-355(SEQ ID NO：23)，并且所述特定HLA类II分子为DQA1*0102-DQB1*0602。
6.权利要求2的肽基免疫治疗剂，其中抗原肽为来自Cryj1的p61-75(SEQ ID NO：2)或p221-225(SEQ ID NO：8)或来自Cryj2的p76-90(SEQ IDNO：15)，并且所述特定HLA类II分子为DPA1*0101-DPB1*0501。
7.权利要求2的肽基免疫治疗剂，其中抗原肽为来自Cryj2的p336-350(SEQ ID NO：22)，并且所述特定HLA类II分子为DPA1*0202-DPB1*0501。
8.权利要求2的肽基免疫治疗剂，其中所述抗原肽为来自Cryj2的p181-195(SEQ ID NO：17)，并且所述特定HLA类II分子为DPA1*0101-DPB1*0201。
9.权利要求2的肽基免疫治疗剂，其中所述抗原肽为来自Cryj1的p151-165(SEQ ID NO：6)或p191-205(SEQ ID NO：7)或来自Cryj2的抗原肽p16-30(SEQ ID NO：12)、p151-165(SEQ ID NO：16)或p321-335(SEQ IDNO：20)，并且所述特定HLA类II分子为DRB1*0901。
10.权利要求2的肽基免疫治疗剂，其中所述抗原肽为来自Cryj2的p36-50(SEQ ID NO：13)和p236-250(SEQ ID NO：19)，并且所述特定HLA类II分子为DRB1*1501。
11.一种鉴定HLA类II分子的试剂，包含特异性地与特定的HLA类II分子反应的抗原肽。
12.一种鉴定HLA类II分子的试剂，包含来自Cryj1的p16-30(SEQ IDNO：1)、p61-75(SEQ ID NO：2)、p106-120(SEQ ID NO：3)、p109-117(SEQID NO：4)、p146-160(SEQ ID NO：5)、p151-165(SEQ ID NO：6)、p191-205(SEQ ID NO：7)、p211-225(SEQ ID NO：8)、p251-265(SEQ ID NO：9)或p326-340(SEQ ID NO：10)或来自Cryj2的p16-30(SEQ ID NO：12)、p36-50(SEQ ID NO：13)、p66-80(SEQ ID NO：14)、p76-90(SEQ IDNO：15)、p151-165(SEQ ID NO：16)、p181-195(SEQ ID NO：17)、p186-200(SEQ IDNO：18)、p236-250(SEQ ID NO：19)、p321-335(SEQ ID NO：20)、p326-340(SEQ ID NO：21)、p336-350(SEQ ID NO：22)或p341-355(SEQ IDNO：23)。
13.一种鉴别HLA类II分子的方法，它包括将具有不同HLA结合氨基酸基元的标记的抗原肽与待测的HLA类II分子接触，并选择特异性地与该HLA类II分子结合的抗原肽。
14.来自变应原的特定的抗原肽在制备用于治疗具有与特定肽结合的特定HLA类II分子的变态反应病人的肽基免疫治疗剂中的用途。
15.一种肽基免疫治疗方法，它包括对具有与所述特定抗原肽结合的特定HLA类II分子的变态反应病人施用特定的抗原肽。
CNB971813779A 1996-11-13 1997-11-12 肽基免疫治疗剂 Expired - Fee Related CN100364611C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP302053/96 1996-11-13
JP30205396 1996-11-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1244804A true CN1244804A (zh) 2000-02-16
CN100364611C CN100364611C (zh) 2008-01-30

Family

ID=17904350

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB971813779A Expired - Fee Related CN100364611C (zh) 1996-11-13 1997-11-12 肽基免疫治疗剂

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7025964B1 (zh)
EP (1) EP0958834B1 (zh)
JP (1) JP4218987B2 (zh)
KR (1) KR100540417B1 (zh)
CN (1) CN100364611C (zh)
AT (1) ATE366118T1 (zh)
AU (1) AU736977C (zh)
CA (1) CA2270877C (zh)
DE (1) DE69737891T2 (zh)
WO (1) WO1998020902A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102552195A (zh) * 2010-12-10 2012-07-11 日东电工株式会社 片状制剂和片状制剂的制造方法
CN114450302A (zh) * 2019-07-30 2022-05-06 大学健康网络 Mhc ii类分子及其使用方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040072262A1 (en) 2002-10-11 2004-04-15 Montero-Julian Felix A. Methods and systems for detecting MHC class I binding peptides
WO2004047793A1 (en) 2002-11-26 2004-06-10 Alk-Abelló A/S Pharmaceutical allergen product
WO2006009838A2 (en) 2004-06-17 2006-01-26 Beckman Coulter, Inc. Mycobacterium tuberculosis epitopes and methods of use thereof
JP3987562B2 (ja) * 2006-10-23 2007-10-10 第一三共株式会社 ペプチド及びその用途
JP3987563B2 (ja) * 2006-10-23 2007-10-10 第一三共株式会社 ペプチド及びその用途
JP2015509487A (ja) 2012-02-07 2015-03-30 ラ ホーヤ インスティテュート フォー アレルギー アンド イムノロジーＬａ Ｊｏｌｌａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ アレルゲンタンパク質由来のエピトープ並びに免疫応答モジュレーションのための方法及び使用
GB201601872D0 (en) * 2016-02-02 2016-03-16 Circassia Ltd Japanese cedar and japanese cypress peptides for preventing or treating allergy

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL92629A0 (en) 1989-12-10 1990-08-31 Yeda Res & Dev Direct binding of t-cell epitopes to mhc gene products on intact living antigen presenting cells and the use thereof for identifying epitopes causing autoimmune diseases and pharmaceutical compositions for treating such diseases
WO1993001213A1 (en) 1991-07-12 1993-01-21 Immulogic Pharmaceutical Corporation Allergenic proteins and peptides from japanese cedar pollen
WO1994001560A1 (en) 1991-07-12 1994-01-20 Immulogic Pharmaceutical Corporation Allergenic proteins and peptides from japanese cedar pollen
JPH07502890A (ja) * 1991-10-16 1995-03-30 イミユロジク・フアーマシユーチカル・コーポレーシヨン ダーマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）（家ほこりダニ）からの主要なアレルゲンのＴ細胞エピトープ
EP0659214A1 (en) * 1992-09-01 1995-06-28 Immulogic Pharmaceutical Corporation Allergenic proteins and peptides from japanese cedar pollen
DE4238416A1 (de) 1992-11-13 1994-05-19 Max Planck Gesellschaft Bestimmung von Peptidmotiven auf MHC-Molekülen
AU5957694A (en) * 1992-12-31 1994-08-15 Immulogic Pharmaceutical Corporation Allergenic proteins and peptides from dog dander and uses therefor
JP3474898B2 (ja) 1993-10-20 2003-12-08 明治乳業株式会社 スギ花粉アレルゲンのｔ細胞エピトープペプチド及びそのアナログペプチド
JP3649460B2 (ja) * 1993-11-05 2005-05-18 明治乳業株式会社 スギ花粉アレルゲンＣｒｙ ｊ ＩＩエピトープ
WO1995027786A1 (en) * 1994-04-08 1995-10-19 Immulogic Pharmaceutical Corporation Pharmaceutical formulations for treating japanese cedar pollen allergy
JP3588165B2 (ja) * 1995-07-14 2004-11-10 株式会社林原生物化学研究所 ペプチドとその用途
EP0700929A3 (en) 1994-09-10 1999-09-01 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Peptide derived from cedar pollen allergens and uses thereof
JP3734855B2 (ja) 1995-04-07 2006-01-11 株式会社林原生物化学研究所 ペプチド及びその用途
CA2248937C (en) * 1996-03-10 2011-10-11 Meiji Milk Products Co., Ltd. Peptide-based immunotherapeutic agent for treating allergic diseases

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102552195A (zh) * 2010-12-10 2012-07-11 日东电工株式会社 片状制剂和片状制剂的制造方法
CN114450302A (zh) * 2019-07-30 2022-05-06 大学健康网络 Mhc ii类分子及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
US7025964B1 (en) 2006-04-11
CA2270877A1 (en) 1998-05-22
AU4964997A (en) 1998-06-03
ATE366118T1 (de) 2007-07-15
AU736977C (en) 2007-10-18
JP4218987B2 (ja) 2009-02-04
CN100364611C (zh) 2008-01-30
EP0958834A4 (en) 2003-04-09
AU736977B2 (en) 2001-08-09
KR100540417B1 (ko) 2006-01-10
CA2270877C (en) 2011-08-23
DE69737891D1 (de) 2007-08-16
WO1998020902A1 (fr) 1998-05-22
EP0958834B1 (en) 2007-07-04
EP0958834A1 (en) 1999-11-24
KR20000053216A (ko) 2000-08-25
DE69737891T2 (de) 2008-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3732231B2 (ja) アレルギー疾患に対するペプチド免疫療法剤
CN1244804A (zh) 肽基免疫治疗剂
CN1742019A (zh) 低过敏原性嵌合抗原的制备方法
CN1735428A (zh) 伴侣蛋白10的免疫抑制作用
CN1230195A (zh) 免疫定向治疗
Ferru et al. Analysis of the immune response elicited by a multiple antigen peptide (MAP) composed of two distinct protective antigens derived from the parasite Schistosoma mansoni
US20230136112A1 (en) Methods for stratifying diabetes patients
US20230181638A1 (en) Immunogenic peptides with new oxidoreductase motifs
JP4085105B2 (ja) アレルギー疾患に対するペプチド免疫療法剤
CN1219548C (zh) C肽联合胰岛素治疗糖尿病并发症及c肽专一性抗体
EP1978026B1 (en) T-helper antigenic determinant (thd) peptides
JP4085092B2 (ja) アレルギー疾患に対するペプチド免疫療法剤
JP2007176953A (ja) アレルギー疾患に対するペプチド免疫療法剤
CN112300248B (zh) 一类促进猪机体产生广谱性免疫应答的多肽及其应用
CN1634978A (zh) Sars病毒hla－a2限制性表位多肽及其应用
WO2022253870A1 (en) Improved methods of treatment using immunogenic peptides
CN1169835C (zh) 人b淋巴细胞刺激因子突变体及其构建方法和编码基因
CN1644214A (zh) Yg及ygg作为维持和改善免疫反应的药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1069431

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: MEIJI KK

Free format text: FORMER NAME: MEIJI DAIRIES CORPORATION

CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Tokyo, Japan, Japan

Patentee after: Meiji Co., Ltd.

Address before: Tokyo, Japan, Japan

Patentee before: Meiji Dairies Corporation

C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080130

Termination date: 20131112