KR20000053216A

KR20000053216A - 펩티드 면역 요법 치료제

Info

Publication number: KR20000053216A
Application number: KR1019990704184A
Authority: KR
Inventors: 도시오 소네; 아끼노리 구메; 가쯔오 다이리끼; 고스께 기노
Original assignee: 나까야마 유; 메이지 뉴교 가부시키가이샤
Priority date: 1996-11-13
Filing date: 1997-11-12
Publication date: 2000-08-25
Also published as: KR100540417B1; AU736977B2; CN100364611C; CA2270877A1; EP0958834A1; ATE366118T1; CN1244804A; DE69737891T2; US7025964B1; CA2270877C; WO1998020902A1; JP4218987B2; DE69737891D1; AU4964997A; EP0958834A4; AU736977C; EP0958834B1

Abstract

본 발명은, 알레르기 환자 개인별로 유효한 펩티드 면역 요법 치료제를 제공한다. 또 알레르기 환자 개인별로 유효한 펩티드 면역 요법 치료제를 선택할 때 사용되는, 환자의 HLA 클래스 Ⅱ 분자의 타입 결정을 위한 검사용 시약을 제공한다. 본 발명의 펩티드 면역 요법 치료제에 의해 환자별로 최적의 펩티드 면역 요법을 행하는 것이 가능해지므로, 펩티드 면역 요법의 효과가 현저히 향성된다는 것이 예상된다. 나아가, 어떤 특정 환자 집단내에서 인식되는 주요한 항원 펩티드에 의한 펩티드 면역 요법으로는 커버할 수 없는 환자에 대하여도 유효한 펩티드 면역 요법 치료제를 제공하는 것이 가능해졌다.

또한, 본 발명의 항원 펩티드를 이용하여, 알레르기 환자의 HLA 클래스 Ⅱ 분자의 타입 결정을 간편히 행하는 것이 가능해졌다.

Description

펩티드 면역 요법 치료제 {Peptide Immunotherapeutic Agent}

알레르기 반응이란, 항원과 항체, 또는 감작 세포가 반응한 결과 생체에 일어나는 비정상적인 면역 반응이다. 알레르기 반응을 야기하는 항원은 특별히 알레르겐이라 하며, 식물의 화분, 진드기, 동물 표피, 곤충, 식물, 약물, 화학 물질 등 수많이 존재한다. 알레르기 반응은, 일반적으로 알레르겐에 대한 즉시형 반응과 그에 이어지는 지발형 반응으로 이루어지는 2단계 반응으로 특징지어진다. 초기의 알레르기 반응에서는 알레르겐 특이적 IgE 항체가 말초혈중의 호염기구 및 조직의 마스트 세포에 고착되며, 계속되는 알레르겐의 침입으로 알레르겐은 IgE 항체를 통해 호염기구 또는 마스트 세포에 결합하며, 그 결과 히스타민, 프로스타글란딘, 및 로이코트리엔을 비롯한 염증성 매개인자가 방출된다. 이러한 염증성 매개인자에 반응하여 국소에 집적된 임파구, 단핵세포, 호염기구 및 호산구가 활성화되어 조직 장해를 비롯한 여러 가지 반응을 초래하는 매개인자를 유리함으로써 지발형 반응이 일어나게 된다.

한편, 알레르기 반응이 사이토카인에 의해 억제되고 있다는 것도 현재 잘 알려져 있다. 그것은 IgE 생산을 제어할 뿐만 아니라, 이펙터 세포의 활성화와 분화에 관여하고 있다. 이 생각은, 예를 들면 알레르기 환자에 대한 감감작 요법에서, 환자의 임상 증상의 경감에도 불구하고, 알레르겐 특이적 IgE의 양이 변하지 않는다는 관찰에 의해 지지되고 있다.

여기에서 감감작 요법이란, 알레르기 환자에게 소량의 항원(예를 들면 삼나무(杉木) 화분 또는 진드기로부터 추출한 항원)을 투여한 후, 항원 투여량을 점차 증가시켜 가는, 알레르기 질환 치료 방법의 하나이다. 감감작 요법의 성공은 알레르겐 특이적 T 세포의 반응이 감소하고 있는 것과 관련이 있다. 즉, 감감작 요법을 행함으로써 항원에 대한 T 세포 무반응(T 세포 아네르기)이 발생하고, 그 결과 알레르기 캐스케이드를 진전시키는데 중요한 사이토카인이 생산되지 않는다고 생각된다. 이와 같은 사실로부터, 알레르기에 관한 연구는 알레르겐 특이적 면역 반응에서의 초기 반응, 특히 T 세포에 의한 알레르기 반응 제어 메카니즘의 해명에 초점이 맞추어져 있다. 알레르겐을 포함하는 외래 항원에 대한 면역 반응의 개시는 면역 시스템의 항원 제시 세포에 의존한다. B 세포, 대식세포, 및 수상(樹狀) 세포를 비롯한 항원 제시 세포는 외래 항원을 취하여 항원 펩티드(T 세포 에피토프 펩티드)까지 단편화하여 MHC 클래스 Ⅱ(사람은 HLA 클래스 Ⅱ)와 함께 세포 표면에 제공하며, 항원 특이적 CD4 양성 헬퍼 T 세포(Th 세포)에 항원 제시한다.

그런데, HLA 클래스 Ⅱ 분자(DR,DQ,DP)는 α쇄와 β쇄로 이루어지는 세포막 항원이다. DR 세포의 α쇄는 HLA-DRA, β쇄는 HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 또는 HLA-DRB5 유전자에 의해 코딩되고, DQ 분자의 α쇄는 HLA-DQA1, β쇄는 HLA-DQB1 유전자에 의해 코딩되며, DP 분자의 α쇄는 HLA-DQA1, β쇄는 HLA-DPB1 유전자에 의해 코딩되어 있다. HLA-DRA를 제외하면 각각의 유전자는 많은 대립 유전자를 포함하며, α쇄와 β쇄로 형성되는, 항원 펩티드를 수용하는 포켓은 고도의 다형성을 나타내 그 구조가 미묘하게 다르다. 그 결과 포켓에 결합되어 T 세포에 제시되는 항원 펩티드의 종류는 자연히 그 구조로 제한된다. 이것이 면역 반응의 개체 차이라고 생각되어지고 있다.

T 세포 수용체(TCR)를 통하여 HLA 클래스 Ⅱ 구속성의 항원 정보를 받은 Th 세포는 활성화되어 각종 사이토카인을 분비함으로써 스스로 증식함과 동시에 B세포를 형질 세포로 분화시켜 항체 생산을 유도한다. 이 때 T 세포 활성화를 위해서는 TCR 이외의 분자를 통한 제2의 시그널(costimulatory signal)이 필요하며, 이 시그널이 없으면 반대로 항원에 대하여 Th 세포의 면역 관용이 유도되는 경우도 있다는 것이 알려져 있다(June,C. et al.:Immunol Today. 15: 321, 1994).

알레르겐에 대한 T 세포 반응의 감소와 감감작 요법의 성공 사이에는 관련이 있다. 예를 들면 10년간에 걸쳐 유효한 감감작 요법을 받아 온 돼지풀 알레르겐 "Amb a 1"에 대한 알레르기 환자의 해당 알레르겐에 대한 시험관내에서의 T 세포 반응은 미처리 환자의 반응에 비해 극적으로 감소되어 있었다. 마찬가지 예로서 고양이 표피 알레르겐 "Fel d 1"에 대한 알레르기 환자는 감감작 요법이 효과를 발휘함에 따라 "Fel d 1" 특이적 T 세포 반응의 감소가 명확히 관찰되고, 그것은 피부 테스트에 대한 감수성의 감소에 대응되었다. 또한, 이 치료기간 동안, 「Fel d 1」특이적 lgG나 IgE 항체는 변화하지 않았다. 이러한 결과는, 항원 특이적 T 세포를 직접 타겟으로 한 알레르기에 대한 치료약 제작의 가능성을 나타내는 것이었다.

한편, 생화학적인 분리, 분석 기술의 발전에 따라 수많은 알레르겐의 정제가 이루어지며, 또한 최근 몇년간은, 분자 생물학, 유전자 공학의 수법이 도입되어, 현재 100종류 이상의 알레르겐 유전자가 클로닝되어 이들의 일차 구조가 결정되어 있다. 그리고, 그 중의 몇가지에 대해서는 T 세포 에피토프 부위가 동정되어 있다.

그 결과, 알레르겐의 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드를 사용한 새로운 펩티드 면역 요법 조성물이 개시되어 있다(특표평 7-502890호 공보, 특표평 8-502163호 공보, 특표평 8-507436호 공보 참조). 고양이 알레르겐「Fel d 1」에 대해서는「Fel d 1」분자상의 T 세포 에피토프의 전부가 아니라, 그 중의 몇가지를 포함하는 펩티드를 마우스에게 피하 투여했더니, 그 후의 전체 길이「Fel d 1」의 공격에 대하여, 항원 특이적 T 세포 관용이 유도되었다는 것이 보고되었다(Briner, T. J. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7608-7612,1994). 그러나, 주요 T 세포 에피토프만으로, 전체 길이 알레르겐의 공격에 대한 T 세포 반응을 감소시키기에 충분한 지, 그리고 그것이 실제로 알레르기 임상 증상의 개선으로 결부되는지 여부는 인간에 대한 임상 시험으로 확인되어야 한다.

알레르겐 분자상에는, T 세포 에피토프 부위가 분자당 약 3∼16군데 존재하며, 개개의 환자에게서 인식되는 T 세포 에피토프 부위는 약 1∼7군데라고 한다. 개개의 환자 중 HLA 클래스 Ⅱ 타입이 다른 경우에는, 환자 사이에서 인식되는 T 세포 에피토프 부위는 환자마다 다르고, 타입이 동일한 경우에는, 동일한 T 세포 에피토프 부위가 인식된다. 따라서, 어떤 특정한 환자 집단이 인식하는 알레르겐 분자상의 주요 에피토프만을 포함하는 펩티드를 이용한 상기 펩티드 면역 요법으로서는, 모든 환자에 대한 유효성을 기대할 수 없다고 생각된다.

<발명의 개시 >

본 발명의 목적은 알레르기 환자 개인별로 유효한 펩티드 면역 요법 치료제를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 알레르기 환자 개인별로 유효한 펩티드 면역 요법 치료제를 선택할 때에 이용되는 환자의 HLA 클래스 Ⅱ 분자의 타입 결정(typing)을 위한 검사용 시약을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 개개의 환자에 의해서 인식되는 알레르겐 분자상의 T 세포 에피토프가 다르다는 것에 착안하였다. 그리고, 알레르겐 분자상의 여러 가지 T 세포 에피토프와, 이들을 구속하는 환자의 HLA 클래스 Il 분자의 타입을 관련짓는 방법을 확립하고, 삼나무 화분 알레르겐인 「Cry j 1」과「Cry j 2」에 대하여, 알레르겐 분자상의 여러가지의 T 세포 에피토프와, 이들을 구속하는 환자의 HLA 클래스 Ⅱ 분자 타입과의 관련 부여를 이하와 같이 행하였다.

알레르겐 분자상의 T 세포 에피토프 부위는, 현재 DR, DQ 및 DP의 각각 대하여, HLA 결합 모티프가 결정(Rammensee, H.G.etal.:IImnunogenet.41:I78-228,1995)되므로, 알레르겐 분자의 일차 구조를 조사하여 HLA 결합 모티프의 유무를 검토함으로써, 알레르겐 분자상의 T 세포 에피토프 부위를 추측할 수가 있다. 따라서, 구축하는 펩티드 중에 T 세포 에피토프가 포함되는 가능성을 최대로 하기 위해서, 이미 알려진 HLA 결합 모티프에 의한 에피토프 부위를 추정하고, 그 추정 부위를 이용하여 펩티드를 구축하는 것이 바람직하다고 할 수 있다. 그러나, 어떤 HLA 결합 모티프를 갖는 펩티드가 반드시 알레르기 질환을 발증한다고는 할 수 없다. 추정은 어디까지나 추정이고, 펩티드 면역 요법에 유효한 항원 펩티드는, 적어도 T 세포(말초혈 임파구, T 세포주 혹은 T 세포 클론)를 이용한 실험에 의해 결정하는 것이 필요하다. 그래서, 본 발명자들은, 실험을 통해 실제로 펩티드 면역 요법에 유효한 항원 펩티드를 각 HLA의 타입별로 동정하였다.

본 발명자들은 어떤 특정한 알레르겐에 감수성을 나타내는 환자에게서 얻은 말초혈 임파구, T 세포주 또는 T 세포 클론을 해당 알레르겐의 전체 일차 구조를 커버하는 약 15∼30 잔기로 이루어지는 오버랩 펩티드(오버랩 부분은 약 5∼10잔기)및 항원 제시 세포와 함께 배양하여, 이것들의 펩티드에 대한 T 세포의 반응을, 예를 들면 [³H]티미딘의 도입량(세포의 증식 반응)에 의해 측정하여, 반응이 있는 펩티드를, 본 발명의 적어도 하나의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원 펩티드와 동정하였다. 그리고, 여러 가지 T 세포주 또는 T 세포 클론을 이용하여, T 세포 에피토프와 이들을 구속하는 환자의 HLA 클래스 Ⅱ 분자 타입과의 관련 부여를 다수 행하는데 성공하였다.

이어서 본 발명자들은, 특정한 마우스가 인식하는 T 세포 에피토프를 동정하였다. 그리고 해당 T 세포 에피토프를 미리 투여함으로써, 이 특정한 마우스에서 그 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드에 대한 면역 반응이 상당히 억제된다는 것을 발견하였다. 그리고 그것으로부터, 구속 분자가 동정된 T 세포 에피토프를 포함하는 펩티드 중에서, 환자에게 고유한 HLA 클래스 Ⅱ 분자의 타입에 적합한 T 세포 에피토프 펩티드를 선정함으로써, 환자 개인별로 유효한 펩티드 면역 요법 치료제를 제공함으로써 본 발명을 완성했다.

또한, 본 명세서에 기재된 방법에 의해, 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자에 반응하는 특정한 T 세포 에피토프를 발견하는 것이 가능하다. 본 발명자들은 그 특정한 T 세포 에피토프를, 환자의 HLA 클래스 Ⅱ 분자의 타입 결정을 위한 검사용 시약으로서 이용하는 것에 착안하여 본 발명을 완성하였다. 이 HLA 클래스 Ⅱ 분자의 타입 결정을 위한 검사용 시약은, 환자 개인별로 유효한 펩티드 면역 요법 치료제를 선택할 때에 유효하게 이용된다.

즉, 본 발명은 특허 청구의 범위의 각 청구항에 기재된 발명으로 이루어진다. 또, 본명세서에 이용되는 용어의 의미는 이하와 같다.

「T 세포 에피토프」란, T 세포 수용체가 특이적으로 인식(또는 반응이라고도 함)하는 구조를 의미한다. 여기서 "인식한다"란, T 세포가 활성화되는 것이며, 활성화의 상태는, 예를 들면 IL-2, IL-4, IFN-γ등의 사이토카인의 생산 또는 DNA 합성을 통하여 파악하는 것이 가능하다.

「항원 펩티드」란, T 세포 에피토프를 포함하는 항원으로서 기능하는 펩티드를 의미한다.

「아네르기」란, 임파구가 항원에 의해 활성화되지 않고, 기능적으로 불활성화된 상태를 말한다.

「HLA 하프로 타입」이란, 통상 특정한 집합체로서 유전되는 HLA 클래스 유전자 위치의 조합을 말한다.

「연관 불평형(linkage disequilibrium)」이란, 다른 HLA 유전자 위치의 대립 유전자끼리가 우연으로 기대되기보다도 고빈도로 단일한 염색체 또는 하프로 타입상에 발견되는 경우, 그러한 다른 유전자간에 상관이 발생하는데, 이러한 상관을 가리킨다. 연관 불평형은, 그 빈도의 기대치와 관찰치와의 차이(△)에 의해 정량화된다.

「HLA 결합성 아미노산 모티프」란, 특정한 HLA 분자에 결합을 나타내는 펩티드는, 통상 특정한 위치에 특정한 아미노산 잔기를 갖고 있지만, 이와 같은 HLA 결합성 펩티드상의 HLA 분자로의 결합에 중요한 아미노산 잔기(HLA 앵커 잔기)의 위치 및 종류의 조합을 가리킨다. 각 HLA 대립 유전자 산물마다 모티프도 다르다. 본 명세서에서는 단순히 HLA 결합 모티프라고도 한다.

본 발명에 있어서, T 세포 에피토프를 알레르겐 분자상에 매핑하기 위해서는, 예를 들면 말초혈 임파구, T 세포주 또는 T 세포 클론을, 당해 알레르겐의 전체 일차 구조를 커버하는 약 15∼30잔기로 이루어지는 오버랩 펩티드(오버랩 부분은 약 5∼10 잔기) 및 항원 제시 세포와 함께 배양하고, 이러한 펩티드에 대한 T 세포의 반응을, 예를 들면 [³H]티미딘의 도입량(세포의 증식 반응)으로 측정하여, 반응이 있는 펩티드를 동정함으로써 행할 수 있다. 또, 항원 펩티드의 아미노 말단 또는 카르복실 말단의 아미노산 잔기를 순차적으로 결실시킨 펩티드를 합성하여, 이 변형 펩티드에 대한 T 세포 반응의 변화를 조사함으로써, 정확한 에피토프 부위를 동정할 수 있다. 또한, 중복 영역을 공유하는 2개 이상의 펩티드가 T 세포 반응을 나타내는 경우는, 이러한 중복 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 새로운 T 세포 에피토프 펩티드를 합성하여, 마찬가지로 T 세포 반응의 변화를 조사함으로써, 정확한 에피토프 부위를 동정할 수 있다. 본 발명의 항원 펩티드는 적어도 7아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 항원 펩티드에 대한 T 세포의 반응 유무의 판정은, 펩티드에 대한 T 세포 반응의 강도를 나타내는 자극 계수(stimulation index, SI)를 산출함으로써 행할 수 있다. SI는, 펩티드에 반응한 [³H]티미딘 도입량 cpm을 펩티드를 포함하지 않는 배지만의 cpm을 뺀 값으로서 산출할 수 있다. 본 발명의 펩티드 면역 요법에 유용한 항원 펩티드는, SI가 적어도 2.0이며, 바람직하게는 적어도 2.5이며, 보다 바람직하게는 적어도 3.5, 가장 바람직하게는 적어도 5.0의 값을 갖는다.

본 발명의 항원 펩티드는, 통상 해당 펩티드의 HLA 클래스 Ⅱ 구속 분자를 갖는 알레르기 환자 개인 유래의 말초혈 임파구, T 세포주, 또는 T 세포 클론에 대하여, 시험관내 증식 활성을 갖는다. 또한, 본 발명의 항원 펩티드는, 통상 당해 펩티드가 유래한 알레르겐에 감수성 환자의 IgE 항체와 반응하지 않는다. 본 발명의 항원 펩티드는, 일반적으로 항원 펩티드의 투여에 의해 항원 특이적 T 세포 아네르기를 유도하고, 그 후의 당해 항원 펩티드가 유래된 재조합 알레르겐 또는 천연 알레르겐에 의한 공격에 대하여 면역 무반응을 유도할 수 있다. 그리고 또한 미리 알레르겐으로 감작된 개체에 대하여, 본 발명의 항원 펩티드를 투여함으로써, 그 후의 당해 알레르겐의 공격에 대하여 면역 무반응을 유도할 수 있다. 이러한 것은, 본 발명의 항원 펩티드가, 일반적으로 시험관내에서 항원 특이적 면역 관용성을 유도하는 작용을 가지며, 알레르기 환자에 대한 펩티드 면역 요법에 유효하다는 것을 나타내고 있다.

항원 펩티드와 결합하는 알레르기 환자의 HLA 클래스 Ⅱ 분자의 타입 결정은 예를 들면 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 동정된 항원 펩티드, 마이토마이신 C 처리한 자기유래 EB 라인[엡스테인 바(Epstein-Barr) 바이러스에 의해 형질전환된 B 세포주] 및 T 세포를, 항 HLA-DR 항체, 항 HLA-DQ 항체 또는 항 HLA-DP 항체와 함께 배양하고, T 세포의 증식 반응 억제 정도를 조사하여, 항원 펩티드가 DR, DQ, DP 중 어느 하나의 분자에 의해 구속되어 있는지를 동정한다. 동정된 구속 분자가 DQ, DP의 경우에는, HLA 하프로 타입의 이미 알려진 EB 라인을 항원 제시 세포로서 이용함으로써, DQ와 DP 각 타입의 구속 분자를 동정할 수 있다(Hori, T. et al.:Tissue Antigen 47:485-491,1996). HLA 클래스 Ⅱ DNA 타입 결정은 B 세포주에서 DNA를 추출하여, 제11회 국제 주요 조직 적합 회의에서 채용된 PCR-SS0법으로 행한다(Tsuji, K., Aizava, M. & Sashazwuki, T. eds, (1982) HLA-1991 vo1.1 pp395-518). DR에 관해서는, DRB1^*와 DR 슈퍼 타입(DRB3^*, DRB4^*, DRB5^*)이 연관 불평형에 있기 때문에, EB 라인을 항원 제시 세포로 했을 경우에는 구속 분자를 동정할 수 없다. 이 때문에, DRB1^*또는 DR 슈퍼 타입의 1 타입만을 형질 도입하고, 발현하는 마우스 L-세포의 형질 전환주를 항원 제시 세포로서 사용하여 구속 분자를 동정한다.

항원 펩티드와 그것들을 구속하는 HLA 클래스 Ⅱ 분자와의 관련에 관해서, 그 구체예를 이하에 나타낸다.

삼나무 화분 알레르겐은, 현재 주요한 알레르겐「Cry j 1」와「Cry j 2」가 단리 정제되어 있고, 각각 cDNA가 단리되어, 추정 일차 구조가 개시되어 있다(특개평 8-502163호 공보, 특표평 8-505284호 공보 참조). 또한「Cry j 1」에 대해서는, 그 일차 구조를 바탕으로 하여 「Cry j 1」분자상의 T 세포 에피토프 부위가 동정되고, 이들 에피토프 부위를 포함하는 펩티드를 유효 성분으로 하는 삼나무 화분증에 대한 치료용 조성물이 개시되어 있다(특표평 8-502163호). 그런데, 삼나무 화분증 환자의 90% 이상은「Cry j 1」과「Cry j 2」에 대한 특이적 IgE 항체를 가지고 있고, 나머지 10 % 이하의 환자는, 「Cry j 1」또는「Cry j 2」중 어느 하나에 대한 특이적 IgE 항체를 갖고 있다는 보고가 있다(Hashimoto, M et al.:Clin.Exp.Allergy.44:840-841,1995).

이 보고로부터 본 발명자들은, 「Cry j 1」 T 세포 에피토프의 단독 투여, 또는「Cry j 2」 T 세포 에피토프 단독 투여에 의한 펩티드 면역 요법으로는 충분한 효과를 기대할 수 없다고 생각하여, 예를 들면 「Cry j 1」및「Cry j 2」의 양자 유래로서, 삼나무 화분증 환자에게서 유전자 빈도가 높은 HLA-DRB1^*0501로 제시되는 항원 펩티드를 포함하고, 나아가 HLA 클래스 Il가 다른 분자(DR, DQ, DP)로 제시되는 항원 펩티드를 포함하는 삼나무 화분증에 대한 펩티드 면역 요법에 유효한 최소 길이의 다중 에피토프 펩티드를 제공하였다(특원평8-80702호).

이 다중 에피토프 펩티드는 알레르기 환자에 대하여 유효율을 높이는 것으로 기대할 수 있는데, 당해 에피토프 펩티드를 구성하는 항원 펩티드의 HLA 구속 분자를 갖지 않은 개인에 대하여는 무효이다. 개인별로 유효한 펩티드 면역 요법은, 개인의 HLA 타입에 적합한 항원 펩티드를 그 개인에게 투여하는 것이다.

이러한 항원 펩티드와 알레르기 환자의 HLA 클래스 Ⅱ 구속 분자의 타입의 관계를 밝힌 구체예로서, 삼나무 화분증 환자의 예를 들면 이하와 같다. 즉, 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자를 그 분자가 결합하는 항원 펩티드와 관련시켜 열거하면, 「Cry j 1」유래의 항원 펩티드 p106-120(서열 번호 3), p109-117 (서열 번호 4) 및「Cry j 2」유래의 항원 펩티드 p66-80(서열 번호 14), p 236-250(서열 번호 19)과 결합하는 삼나무 화분증 환자의 DRB5^*0101, 「Cry j 2」유래의 항원 펩티드 p186-200(서열 번호 18)과 결합하는 DRB4^*0101, 「Cry j 1」유래의 항원 펩티드 p16-30(서열 번호 1), p146-160 (서열 번호 5), p191-205 (서열 번호 7), p251-265(서열 번호 9), p326-340(서열 번호 10) 및「Cry j 2」유래의 항원 펩티드 p326-340(서열 번호 21) 및 p341-355(서열 번호 23)와 결합하는 DQA1^*0102-DQB1^*0602, 「Cry j 1」유래의 항원 펩티드 p61-75(서열 번호 2) 및 p211-225(서열 번호 8) 및「Cry j 2」유래의 항원 펩티드 p76-90 (서열 번호 15)와 결합하는 DPA1^*0101-DPB1^*0501, 「Cry j 2」유래의 항원 펩티드 p336-350(서열 번호 22)과 결합하는 DPA1^*0202-DPB1^*0501, 「Cry j 2」유래의 항원 펩티드 p181-195(서열 번호 17)와 결합하는 DPA1^*0101-DPB1^*0201, 「Cry j 1」유래의 항원 펩티드 p151-165(서열 번호 6), p191-205 (서열 번호 7) 및「Cry j 2」유래의 항원 펩티드 p16-30(서열 번호 12), p151-165(서열 번호 16), p321-335 (서열 번호 20)와 결합하는 DRB1^*0901, 「Cry j 2」유래의 항원 펩티드 p36-50(서열 번호 13), p236-250(서열 번호 19)와 결합하는 DRB1^*1501 등을 들 수있다. 또, 「Cry j 1」유래의 항원 펩티드 p106-120(서열 번호 3)의 코어 서열은, p109-117(서열 번호 4)이다.

또한, 문헌 (Ikagava, S.et.al.,: J.Allergy Clin.Immnunol.,97:53-64,1996)에서는「Cry j 1」항원 펩티드 p335-346(서열 번호 11)가 DRB3^*0301에 의해 제시되어 있다고 보고되어 있으며, 문헌 (Hori, T. et al.,: Tissue Antigens, 47: 481-491,1996)에서는 「Cry j 1」항원 펩티드 p214-222(서열 번호 24)가 DPA1^*0202-DPB1^*0501에 의해 제시되어 있다고 보고되어 있다.

종래는 항원의 종류에 따라, HLA 클래스 Ⅱ 유전자 위치(DR, DQ, DP) 레벨에서 구속 분자에 편차가 있어, 면역 반응을 규정하고 있다고 상정되어 있었으나, 이러한 발견으로부터, 「Cry j 1」또는「Cry j 2」유래의 항원 펩티드를 제시하는 구속 분자에는, DR, DQ, DP 분자가 전부 사용되어 있어, 원칙적으로 편차가 없다는 것이 밝혀졌다.

한편, 특정한 항원 펩티드가 결합하는 HLA 클래스 Ⅱ 분자를 조사하면, 「Cry j 1」에서는, p61-75 (서열 번호 2)가 DPA1^*0101-DPB1^*0501, p146-160 (서열 번호 5)가 DQA1^*0102-DQB1^*0602, p211-225 (서열 번호 8)에서는 DPA1^*0101-DPB1^*0501, 「Cry j 2」에서는, p16-30 (서열 번호 12)이 DRB^*0901, p36-50(서열 번호 13)가 DRB1^*1501, p76-90(서열 번호 15)이 DPA1^*0101-DPB1^*0501, p186-200(서열 번호 18)가 DRB4^*0101, p336-350(서열 번호 22)이 DPA1^*0202-DPB1^*0501인데, 그 외에 관해서는 동정된 구속 분자 이외에도 결합하는 성질을 가져, 다중 결합성 펩티드(Multibinder-peptide)로서의 성격을 갖고 있다.

또한, 일반적으로 특정한 HLA 분자와 결합하는 항원 펩티드에는, HLA 분자와의 결합을 위한 공통의 HLA 결합성 아미노산 모티프가 포함되며, 이러한 HLA 결합성 모티프가 항원 펩티드가 HLA 분자에 결합하는데 필요하다. 그 때문에, HLA 분자에는, 다른 펩티드 호르몬 수용체가 그러한 리간드에 대하여 나타내는 바와 같은 고도의 선택적 결합성은 없고, 다종류의 잠재적 항원 펩티드가 HLA 분자와 결합할 수 있다. HLA 클래스 Ⅱ 분자의 경우, 항원 펩티드의 결합 모티프는, 통상 1∼2개의 아미노산을 통하여 징검다리형으로 배열하는 3∼5개의 아미노산 잔기로 이루어져 있다(Matsushita, S. et al.: J. Exp. Med.180: 873-883,1994; Rammensee, H. -G. et al.: Immunogenet.41: 178-228,1995). 이러한 공지된 HLA 클래스 Ⅱ 결합 모티프를 이용하여, 삼나무 화분 알레르겐 분자의 일차 구조로부터, 예시된 HLA 클래스 Ⅱ 분자와 결합할 가능성이 있는 항원 펩티드를 다시 선출할 수 있다. 따라서, 본 발명에서의 삼나무 화분증 환자가 갖는 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 타입과 결합하는 항원 펩티드는, 본 발명에 의해 실험적으로 예시된 항원 펩티드로 한정되는 것이 아니라, 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 타입과의 결합이 예상되는 항원 펩티드도 포함된다.

상술한 특정의 HLA 클래스 Ⅱ 타입과 결합하는 항원 펩티드는, 그 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 타입을 갖는 환자에 대하여, 펩티드 면역 요법 치료제로서 적용할 수 있다. 본 발명의 항원 펩티드를 알레르기 환자에 대한 펩티드 면역 요법에 사용하는 경우는, 제약상 허용할 수 있는 적당한 희석제, 담체등과 조합하여 사용할 수 있다. 투여 방법은, 주사(피하, 피내 정맥 주사등), 점안, 점비, 경구, 흡입, 경피, 경점막 등의 간편한 방법을 이용할 수 있으며, 투여량은 당업자에 의해 통상법으로 결정할 수 있다.

또, 환자 개인별로 유효한 펩티드 면역 요법 치료제를 선택하기 위해서는, 미리 환자가 갖고 있는 HLA 클래스 Ⅱ 타입이 특정되어 있는 것이 바람직하다. 이 환자가 갖는 HLA 클래스 Ⅱ 타입의 특정은, HLA 클래스 Ⅱ 분자와 특이적으로 반응하는 항원 펩티드를, HLA 클래스 Ⅱ 분자를 식별하기 위한 검사용 시약으로서 이용함으로써 행할 수 있다.

구체적으로는, 알레르기 환자 및 건겅한 보통 사람의 HLA 클래스 Ⅱ 분자의 타입 결정은 다음과 같이 하여 행할 수 있다. HLA 클래스 Ⅱ 분자는, 그 고도한 다형에 기초하여, 각각의 HLA 클래스 Ⅱ 분자와 결합하는 항원 펩티드의 아미노산 모티프는 HLA 클래스 Ⅱ 타입마다 다르다. 그 때문에, 이러한 결합 모티프가 다른 항원 펩티드를 표지하고, HLA 클래스 Ⅱ 분자로의 특이적 결합을 조사함으로써, 알레르기 환자 및 건강한 보통 사람의 HLA 클래스 Ⅱ의 타입 결정이 가능하다. 항원 펩티드의 표지는, 당업자에 있어서의 공지된 방법, 즉 방사성 동위원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 등의 표지 물질을, 항원 펩티드의 HLA 앵커 아미노산 잔기를 제외한 위치의 아미노산 잔기(예를 들면 티로신 잔기) 등에 결합시킨다. 또는 상기 표지 물질을 결합시킨 스트렙토 아디핀(또는 아비딘)으로 바이오틴화 항원 펩티드를 검출한다. 또한, 알레르기 환자의 진단은, 피검자의 말초혈 임파구를 당해 알레르겐 유래의 각종 항원 펩티드 존재하에 배양하고, T 세포의 반응을, 예를 들면 배양계에 첨가한 [³H]티미딘의 도입량을 측정함으로써 판정할 수 있다. 또한 T 세포 반응이 발견된 피검자(알레르기 반응 양성 환자)에 대해서는, T 세포 반응을 유도하는 항원 펩티드의 HLA 클래스 Ⅱ 구속 분자의 타입이 당해 알레르겐 감수성 환자의 HLA 클래스 Ⅱ 타입이라고 동정할 수 있다.

이 방법으로 동정된 알레르기 환자의 HLA 클래스 Ⅱ 타입과 항원 펩티드와의 관련을, 알레르기 발증에서의 개개의 HLA 클래스 Ⅱ 타입이 담당하는 역할에 대한 검토 또는 알레르기 환자에 대한 펩티드 면역 요법 치료제 조제시의 항원 펩티드 선정의 판정 재료로서 이용할 수가 있다.

HLA 클래스 Ⅱ 분자의 타입이 판명된 알레르기 환자 개인에 대하여, 당해 환자의 HLA 타입과 적합한 항원 펩티드를 선정하여, 미리 환자 유래의 말초혈 임파구에 대한 그 펩티드의 증식 반응 능력 측정하고, 각 펩티드 반응의 강도를 비교 검토하여, 당해 환자에게 유효한 펩티드 면역 치료제를 조제할 수가 있다. 예를 들면, 본 명세서의 실시예 6에 나타내는 삼나무 화분증 환자 PB가 소유하는 HLA 클래스 I와 클래스 Ⅱ의 하프로 타입은 A2/24-B39/55-Cw7/w3-DRB1^*1501/0901-DRB4^*0101-DRB5^*0101, DQA1^*102/0301-DQB1^*602/0303-DPB1^*101/0101-DPB1^*501/0201이다. 당해 환자의 펩티드 면역 요법에 이용하는 항원 펩티드를 선정하는 경우, Cry j 1에서는, DPA1^*0101-DPB1^*0501로 제시되는 항원 펩티드 p211-225(서열 번호 8), DRB5^*0101로 제시되는 p106-120(서열 번호 3), DQA1^*0102-DQB1^*0602로 제시되는 p191-205(서열 번호 7) 또는 p251-265(서열 번호 9)가 대상이 되며, Cry j 2에서는, DPA1^*0101-DPB1^*0501로 제시되는 p76-90(서열 번호 15), DRB4^*0101로 제시되는 p186-200(서열 번호 18), DRB5^*0101로 제시되는 p66-80(서열 번호 14)가 선정의 대상이 된다. 이러한 항원 펩티드를 이용하여 면역 요법을 시도하는 경우, 미리, 환자의 말초혈 임파구에 대한 이들 항원 펩티드의 증식 반응 능력을 측정하여, 비교적 높은 값을 나타내는 항원 펩티드를 펩티드 면역 요법에 이용하면 좋다.

본 발명의 항원 펩티드는 용해도의 향상, 치료 또는 예방 효과의 강화 또는 안정성을 높일 목적으로 그 기능을 손상시키지 않고 HLA 앵커 이외의 다른 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 수식할 수 있다. 적합한 아미노산 치환은, Ala, Ser, Glu 또는 메틸 아미노산에서의 치환을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 또한, Cys 잔기는 이황화 결합을 통해 이량체를 형성하거나, 또는 다중결합성으로 인해 Cys 잔기를 포함하는 펩티드로 면역하면 원래는 항원이 아닌 부위가 인식되어, 새로운 에피토프가 될 가능성이 있다. 이 경우는, Cys 잔기를 Ala, Ser, Thr, Leu 또는 Glu 잔기로 치환할 수 있다. 또한, D 아미노산, 비천연형 아미노산 등에 의한 치환을 포함한다. 또한 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 히스티딘 폴리머(예를 들면 히스티딘이 6개 연결된 것)을 결합시켜 폴리펩티드로서 발현되는 벡터도 개발되어 있고, 니켈 킬레이트 컬럼에 의해, 변성제 존재하에서도 친화성 정제가 가능하기 때문에 본 발명에 포함된다.

본 발명의 항원 펩티드는 1분자의 알레르겐 또는 다른 2분자 이상의 알레르겐 유래일 수 있다. 알레르겐으로서는 돼지풀, 오리새, 쥐보리 등의 초본 화분, 삼나무, 노송나무, 마운틴세다등의 수목 화분, 진드기, 동물, 곰팡이, 곤충, 음식물 등 모든 단백질 알레르겐이 본 발명에 포함된다.

본 발명은 펩티드 면역 요법 치료제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 알레르겐 유래의 특정한 항원 펩티드와 결합하는 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자를 갖는 알레르기 환자에 적용하기 위한, 그 특정한 항원 펩티드를 유효 성분으로 하는 펩티드 면역 요법 치료제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자와 특이적으로 반응하는 항원 펩티드를 포함하는 HLA 클래스 Ⅱ 분자를 식별하기 위한 검사용 시약에 관한 것이다.

도 1는 Cry j 1의 오버랩 펩티드의 서열과 환자의 T 세포 에피토프 부위를 나타낸 도면이다. 도면 중, 2≤SI<5을 ▦로, 5≤SI를 ■로 나타냈다. PB와 PJ로 T 세포 클론을 작성했다.

도 2는 Cry j 2의 오버랩 펩티드의 서열과 환자의 T 세포 에피트프 부위를 나타낸 도면이다. 도면 중, 2≤SI<5을 ▦로, 5≤ SI를 ■로 나타냈다. PB, PC, PR로 T 세포 클론을 작성했다.

도 3은 Cry j 1을 인식하는 T 세포 클론이 인식하는 에피토프 부위, 그 클론의 구속분, 이 클론에 의한 림포카인 생산, 이 클론의 Th 타입을 나타내는 도면이다. 도면 중, IL-4/IFNγ> 10을 Th2, IFNγ/IL-4>10을 Th1, 그 중간을 Th0이라 정의했다.

도 4는 Cry j 1을 인식하는 T 세포 클론이 인식하는 에피토프 부위, 그 클론의 구속분, 그 클론에 의한 림포카인의 생산, 그 클론의 Th 타입을 나타낸 도면이다. 도면 중, IL-4/IFNg>10을 Th2, IFNg/IL-4>10을 Th1, 그 중간을 ThO, 림포카인 생산이 발견되지 않은 경우를 Thp라 정의하였다.

도 5는 Cry j 2의 항원 펩티드 p66-80를 CB6F1 마우스에게 미리 투여한 경우의, Cry j 2에 대한 CB6F1 마우스의 면역 반응 능력을 나타낸 도면이다.

도 6은 Cry j 2의 항원 펩티드 p186-200를 CB6F1 마우스에게 미리 투여한 경우의, Cry j 2에 대한 CB6F1 마우스의 면역 반응 능력을 나타낸 도면이다.

<발명을 실시하는 최량의 형태>

이하에 본 발명의 실시예를 기재하지만, 본 발명은 이것들의 실시예에 한정되지 않는다.

<실시예 1>

삼나무 화분 항원의 정제

Cry j 1의 정제는, 문헌 (Yasueda, H. et al., J.Allergy Clin.Immunol.(1983) 71: 77-86)의 방법으로 행하였다. Cry j 2의 정제는, Cry j 2 유전자(특개평8-47392호 공보)를 발현 벡터 pQE9(Qiagen GmbH, 독일)에 삽입하여, 대장균에 유전자 도입한 후 발현시키고, Ni²⁺-NTA-아가로오스를 사용한 친화성 칼럼크로마토그래피(Quiagen Inc., USA)을 이용하여 행하였다(Komiyama, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1994) 201: 1021-1028).

<실시예 2>

오버랩핑 펩티드의 합성

Cry j 1의 일차 구조(국제 공개 제94/01560호) 및 Cry j 2 (특개평 8-47392호 공보)의 일차구조를 기초로 하여, 펩티드 합성 장치(시마쯔 제작소, 모델 PSSM-8)을 사용하고, Cry j 1 또는 Cry j 2의 전체 일차 구조를 커버하여, 15잔기로 이루어지는 10 아미노산씩이 중복되는 오버랩핑 펩티드를, Cry j 1에 관해서는 69종류(도 1), Cry j 2에 관해서는 74종류(도 2) 합성하였다. 펩티드는 농도가 2 mM이 되도록 8 M 요소를 포함하는 PBS에 용해했다. T 세포 증식 반응을 조사하기 위한 배양계에 펩티드를 첨가하는 경우에는, 요소의 영향을 제거하기 위해서 500배 이상의 희석 배율로 사용했다.

<실시예 3>

항원 제시 세포의 수립

삼나무 화분증 환자 유래 말초혈로부터 Fico1l-paque(Pharmacia사 제조)비중 원심법을 이용하여 말초혈 임파구를 분리하였다. 1 x 10⁶개의 말초혈 임파구에 엡스테인·바(Esptein-Barr/이하에서는 EB라 함) 바이러스를 포함하는 B95-8 세포(마모셋 유래, ATCC CRL1612) 배양 상청을 첨가하여, 말초혈 임파구에 포함되는 B세포에 EB-바이러스를 감염시켰다. 200 ng/㎖의 사이클로스포린 A, 20 % FCS(소 태아 혈청)을 포함하는 RPMI-1640 배양액에서 약 20일간 배양함으로써 형질 전환한 B세포주를 수립하였다.

<실시예 4>

T 세포주 및 T 세포 클론의 수립

4 x 10⁶개의 말초혈 임파구를 20 % 인간 혈청을 첨가한 RPMI-I640 배양액 2 ㎖에 현탁하여, 50 ㎍/㎖의 Cry j 1 또는 2∼10 ㎍/㎖의 Cry j 2 항원 존재하에 8일간 배양하여, Cry j 1 또는 Cry j 2을 인식하는 T 세포를 활성화하였다.

T 세포주를 얻는 경우에는, 상기한 활성화 T 세포가 출현한 시점에서 배양액을 200 U/㎖의 IL-2(베링거/맨하임사 제조), 15 % 인간 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배양액으로 치환하고, 이 배양액을 사용하면서 다시 14일간 배양함으로써 Cry j 1 또는 Cry j 2을 특이적으로 인식하는 T 세포를 수립하였다.

T 세포 클론을 얻는 경우에는, 상기한 활성화 T 세포가 출현한 시점에서 세포를 10 cm 배양 티슈에 펴고, 미량용 피펫으로 활성화 T 세포를 1개씩 선별하였다. 이 T 세포 1개씩을 미리 마이토마이신 C(교와 핫꼬사 제조) 처리한 자기의 EB-바이러스 형질 전환 세포(1 x 10⁵/웰)을 파종한 96-웰 마이크로 배양 플레이트상의 각 웰에 옮겼다. 항원 자극에 준하여, 50 ㎍/㎖의 Cry j 1 또는 2∼10 ㎍/㎖의 Cry j 2를 다시 각 웰에 첨가한 후, 7일간 배양하였다. 이 7일 간격의 항원 자극을 다시 2∼3회 반복함으로써 Cry j 1 또는 Cry j 2을 특이적으로 인식하는 T 세포 클론을 수립할 수가 있었다.

<실시예 5>

Cry j 1 및 Cry j 2 T 세포 에피토프의 동정

18명의 삼나무 화분증 환자 말초혈 임파구를 삼나무 화분 알레르겐인 Cry j 1 또는 Cry j 2로 자극하여 각 알레르겐을 특이적으로 인식하는 T 세포주를 환자별로 수립하였다. 96-웰 마이크로 배양 플레이트상에서, 마이트 마이신 C 처리한 5×10⁴개의 자기 유래 B 세포주, 2μM의 오버랩핑 펩티드, 2×10⁴개의 T 세포주를, 0.2 ㎖의 15 % 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배양액 중에서 2일간 배양하고, 0.5 μCi의 [³H] 티미딘을 첨가후 다시 18시간 배양하였다. 세포를 세포 수확기로 유리 필터에 포집한 후, 액체 신틸레이션 카운터로 [³H] 티미딘의 세포내 도입량을 측정하였다. 이 조작에 의해 HLA 클래스 Ⅱ 분자와 함께 Cry j 1 또는 Cry j 2의 항원 정보를 인식할 수 있는 T 세포는 증식하고, 세포내에 [³H] 티미딘을 도입한다. 자극 계수(Stimulation Index)가 2 이상이었던 경우에는 첨가한 항원 펩티드로서 인식되었다고 판단하였다.

Cry j 1을 인식하는 T 세포주를 사용한 T 세포 에피토프 부위의 동정에 의해 각 환자가 인식하는 T 세포 에피토프 부위는 평균 9.8±3.0이며, 그 범위는 4≤에피토프수≤15였다. 다른 한편, Cry j 2에서는 각 환자가 인식하는 T 세포 에피토프 부위는 평균 8.7±3.3이며, 그 범위는 2≤에피토프수≤13이었다. Cry j 1은 353 아미노산(특표평 8-502163호), Cry j 2는 379 아미노산(특개평 8-47392호)으로 구성되기 때문에, 100 아미노산 잔기당 대략 2.3 내지 2.8개소의 T 세포 에피토프 부위가 존재하게 된다. HLA 클래스 Ⅱ 타입은 환자별로 다르다고 생각되기 때문에, 인식되는 T 세포 에피토프는 HLA 클래스 Ⅱ 타입별로 다르다고 예측된다. Cry j 1 또는 Cry j 2 분자상에 각 환자에게서 인식되는 T 세포 에피토프 부위를 기입하는 작업을 행하여 에피토프 지도를 작성하였다. 결과를 도 1 및 도 2에 나타냈다.

<실시예 6>

T 세포 클론을 인식하는 T 세포 에피토프의 동정

18명의 삼나무 화분증 환자 중에서 Cry j 1의 항원 펩티드 p211-225와 p106-120을 인식하는 환자 2명[환자 B(이하 "PB"라 약칭함), 환자 J(이하 "PJ"라 약칭함)]과 Cry j 2의 항원 펩티드 p66-80, p186-200, p236-250, p341-355를 인식하는 환자 3명[PB, 환자 C(이하 "PC"라 약칭함), 환자 R(이하 "PR"이라 약칭함)]을 선정하고, 이러한 삼나무 화분증 환자의 말초혈 임파구를 Cry j 1 또는 Cry j 2로 자극하여 Cry j 1 또는 Cry j 2를 인식하는 T 세포 클론을 수립하였다. 4명의 환자의 HLA 클래스 Ⅰ과 클래스 Ⅱ 타입을 이하에 나타낸다.

PB:A2/24-B39/55-Cw7/w3-DRB1^*1501/0901-DRB4^*0101-DRB5^*0101, DQA1^*102/0301-DQB1^*602/0303-DPA1^*101/0101-DPB1^*501/0201,

PJ:A24/--B61/51-Cw3/--DRB1^*1501/0802-DRB5^*0101, DQA1^*102/0401-DQB1^*602/0402-DPA1^*/--DPB1^*501/0402,

PC:A-2/2-B54/51-Cw1/-, DRB1^*405/1501-DRB4^*0101-DRB5^*0101-DQA1^*301/0102-DQB1^*401/0602-DPA1^*202/0202-DPB1^*201/0501,

PR:A-11/--B60/35-Cw7/w3-DRB1^*901/1501-DRB4^*0101-DRB5^*0101-DQA1^*301/0102-DQB1^*303/0602-DPA1^*1/0202-DPB1^*201/0201.

Cry j 1을 특이적으로 인식하는 T 세포 클론을 PB 유래 말초혈 임파구에서 총계 35종류, PJ 유래 말초혈 임파구로부터 총계 14종류 수립하였다. 마찬가지로 Cry j 2를 특이적으로 인식하는 T 세포 클론을 PB 유래 말초혈 임파구로부터 총계 31종류, PC 유래 말초혈 임파구로부터 10종류, PR 유래 말초혈 임파구로부터 17종류 수립하였다. 이러한 T 세포 클론은 모두 CD3⁺, CD4⁺, CD8^-, TCRαβ⁺, TCRγδ^-이므로, 구속 분자는 HLA 클래스 Ⅱ 분자라는 것이 판명되었다. 96-웰 마이크로 배양 플레이트상에서, 마이트 마이신 C 처리한 5×10⁴개의 자기 유래 B 세포주, 2μM의 오버랩핑 펩티드 및 2×10⁴개의 T 세포 클론을, 0.2 ㎖의 15 % 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배양액중에서 2일간 배양하고, 0.5 μCi의 [³H] 티미딘을 첨가후 다시 18시간 배양하였다. 세포를 세포 수확기로 유리 필터에 포집한 후, 액체 신틸레이션 카운터로 [³H] 티미딘의 세포내 도입을 측정하였다. 이 조작으로 각 T 세포 클론이 인식하는 T 세포 에피토프를 동정하였다. 제작한 Cry j 1을 인식하는 T 세포 클론 중에서 69 %(34/49)는 항원을 포함하는 펩티드 자극에 대하여 증식 반응을 나타내어 항원 펩티드를 동정할 수 있었다. 마찬가지로 Cry j 2를 인식하는 T 세포 클론 중에서 69 %(40/58)에서 항원 펩티드를 동정할 수 있었다. Cry j 1을 특이적으로 인식하는 T 세포 클론은 펩티드 p16-30, p61-75, p91-105, p106-120, p146-160, p151-165, p191-205, p211-225, p251-265, p326-340, p331-346, Cry j 2를 특이적으로 인식하는 T 세포 클론은, 펩티드 p16-30, p21-35, p36-50, p66-80, p76-90, p81-95, p151-165, p181-195, p186-200, p236-250, p321-335, p326-340, p336-350, p341-355, p346-360를 인식하고 있었다. 결과를 도 1과 도 2(중앙의 막대 그래프)에 통합했다.

<실시예 7>

유전자 위치 레벨에서의 HLA 클래스 Ⅱ 구속 분자의 동정

실시예 4에서 수립한 T 세포 클론의 증식 반응계에 HLA 클래스 Ⅱ-DR, HLA 클래스 Ⅱ-DQ 또는 HLA 클래스 Ⅱ-DP에 대하여 특이적으로 반응하는 단일 클론 항체를 첨가하여 T 세포의 증식 반응을 저지함으로써 유전자 위치 레벨에서의 HLA 클래스 Ⅱ 구속 분자를 동정하였다.

96-웰 마이크로 배양 플레이트상에서, 마이트 마이신 C 처리한 2×10⁴개의 자기 유래 B 세포주, 2μM의 오버랩핑 펩티드, 3 ㎍/㎖의 항 DR, DQ 또는 DP 단일클론 항체(벡톤/디킨슨사 제품), 2×10⁴개의 T 세포 클론을, 0.2 ㎖의 15 % 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배양액중에서 2일간 배양하고, 0.5 μCi의 [³H] 티미딘을 첨가후 다시 18시간 배양하였다. 세포를 세포 수확기로 유리 필터에 포집한 후, 액체 신틸레이션 카운터로 [³H] 티미딘의 세포내 도입량을 측정하였다.

<실시예 8>

HLA 클래스 Ⅱ 분자 개개 타입에서의 구속 분자의 동정

HLA 클래스 Ⅱ 유전자 위치 레벨에서의 구속 분자가 동정된 T 세포 클론을 DR에 관해서는 개개의 타입을 유전자 도입한 마우스 L-세포, DQ 또는 DP에 관해서는 하프로 타입이 일치하는 B 세포주를 항원 제시 세포로서 사용함으로써 개개의 타입에서의 구속 분자의 동정이 가능하다.

96-웰 마이크로 배양 플레이트상에서, 마이트 마이신 C 처리한 5×10⁴개의 마우스 L-세포, 또는 하프로 타입이 일치하는 B 세포주, 2μM의 오버랩핑 펩티드, 3 ㎍/㎖의 항 DR, DQ 또는 DP 단일클론 항체(벡톤/디킨슨사 제품), 2×10⁴개의 T 세포 클론을 0.2 ㎖의 15 % 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배양액중에서 2일간 배양하고, 0.5 μCi의 [³H] 티미딘을 첨가후 다시 18시간 배양하였다. 세포를 세포 수확기로 유리 필터에 포집한 후, 액체 신틸레이션 카운터로 [³H] 티미딘의 세포내 도입량을 측정하였다.

T 세포 클론의 증식 반응이 관찰되었을 경우에 구속 분자가 동정되었다. 해석 결과를 도 3 및 도 4에 나타냈다.

<실시예 9>

T 세포 클론의 Th 타입의 동정

알레르기의 발증에는 Th2 세포가 관여하는 것으로 생각되고 있다. 현재의 연구 수준에서는 항원 자극 후, T 세포의 Th1 또는 Th2 세포로의 분화가 특정한 에피토프 펩티드 또는 HLA 클래스 Ⅱ 유전자 위치 레벨에서 상정되고 있는 것인지는 아직 미해결인 부분이 많다. 그러나 펩티드 선정시에는 펩티드로 자극 후, Th2 세포가 우위로 유도되는 경우에는 펩티드 투여에 의해 삼나무 화분증이 악화될 가능성이 충분히 있다. 이러한 가능성에 대하여 조사하기 위하여 실시예 4에서 제작한 T 세포 클론을 T 세포가 인식하는 에피토프 펩티드로 자극하고 IL-2, IL-4, IFNγ의 생산량을 측정함으로써 Th 타입을 결정하였다.

24-웰 마이크로 배양 플레이트상에서, 마이트 마이신 C 처리한 1×10⁵개의 자기 유래 B 세포주, 2μM의 에피토프 펩티드, 5×10⁵개의 T 세포 클론을 1 ㎖의 10 % 사람 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배양액중에서 24시간 배양하였다. 원심분리로 세포를 침전시켜 배양 상층액을 얻었다. 배양 상층액 중의 IL-2, IL-4, IFNγ는 시판중인 ELISA 키트[IL-2(R&D사 제품)], IL-4(메드제닉스사 제품), IFNγ(오쯔까 앗세이 겡뀨쇼 제품)로 측정하였다.

각 T 세포 클론이 생산하는 IL-2, IL-4, IFNγ량 및 Th 타입을 도 3 및 도 4에 나타냈다. Cry j 1을 인식하는 T 세포 클론은 Th2 세포가 12, Th1 세포가 1, Th0 세포가 16이며, Th2가 Th1보다도 많았으나, Cry j 2를 인식하는 T 세포 클론은 Th2 세포가 10, Th1 세포가 8, Th0 세포가 8이며, Cry j 1과 달리 Th2와 Th1은 같은 정도였다. 개개의 T 세포 클론이 인식하는 T 세포 에피토프, 구속 분자, Th 타입을 비교하면 개개의 T 세포 클론에 의해 Th2, Th1, Th0 타입은 다르고, 동일한 에피토프, 동일한 항원 제시 분자를 인식하는 수개의 T 세포 클론에는 Th2세포와 Th1 세포가 발견되었다. 이러한 결과는 Cry j 1 또는 Cry j 2 자극 후 T 세포의 Th2, Th1, 또는 Th0 세포로의 분화는 특정한 T 세포 에피토프, 특정한 구속 분자의 조합에서는 규정되어 있지 않다는 것을 의미하고 있다. 즉 펩티드 면역 요법 치료제로 사용하는 펩티드를 선정하는 경우에는 이러한 T 세포 에피토프 부위를 포함하는 펩티드이더라도 T 세포를 자극하는 것이 가능하다고 생각되어 펩티드 선정의 후보가 될 수 있다는 것이 판명되었다.

<실시예 10>

CB6F1 마우스의 T 세포 에피토프의 동정

8주령의 수컷 CB6F1 마우스를 어듀밴트(Imject Alum: Pierce사 제품)와 함께 재조합 Cry j 2(rCry j 2)10 ㎍으로 2주 간격으로 3회 면역하였다(ip). 최종 면역으로부터 1주일 후에 마우스 3마리로부터 비장 세포를 얻어 하나로 통합하였다. 96 웰 플레이트(팔콘사 제품) 1웰에 대하여 비장 세포(5×10⁶)를 15잔기로 이루어지는 74종류의 Cry j 2의 오버랩핑 펩티드(0.115 μM)와 함께 0.2 ㎖의 RPMI 배지(10 % FCS, 2mM L-글루타민, 50 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트랩토마이신)에서 배양하였다. 대조군으로서 PBS, 50 ㎍/㎖ Cry j 1, 0.3 ㎍/㎖ rCry j 2에 대한 반응도 검토하였다. 각각의 시험 시약에 대하여 3웰 파종하고, 37 ℃, 5 % CO₂조건하에서 3일간 배양하였다. 마지막의 6시간 0.5 μCi/웰의 [³H]-티미딘에서 펄스 라벨을 행하여 셀퍼 베스타(Inoteck, 벨톨드 재팬사 제품)로 세포를 유리 필터상에 포집하여 건조한 후, 액체 신틸레이션 카운터(TRI-CARB 4530, 패커드 재팬사 제품)로 [³H]-티미딘의 세포내 도입을 측정하였다.

rCry j 2로 면역한 CB6F1 마우스는 항원인 rCry j 2에 강한 반응성을 나타내었으나 또 하나의 삼나무 화분 주요 알레르겐인 Cry j 1에는 반응하지 않아 이 계가 항원 특이적 반응이라는 것이 확인되었다. 그리고 rCry j 2로 면역한 CB6F1 마우스는 조사한 90종류의 오버랩핑 펩티드 중 p66-80(서열 번호 14)와 p236-250(서열 번호 19)에 현저한 반응성을 나타냈다. 이것으로부터 CB6F1 마우스에서 p66-80과 p186-200의 펩티드가 주요 T 세포 에피토프로서 항원 제시에 관여하고 있다는 것이 나타났다. 사람에게 있어서도 p66-80(서열 번호 14)와 p236-250(서열 번호 19)의 펩티드는 주요 T 세포 에피토프 펩티드이므로 CB6F1 마우스는 삼나무 화분에 대한 펩티드 면역 치료에 사용하는 펩티드 조성물의 유효성을 평가하는데에 유용한 모델 동물이 될 수 있다는 것이 판명되었다.

<실시예 11>

항원 펩티드 p66-80(서열 번호 14)의 생체내에서의 면역 반응

8주령의 수컷 CB6F1 마우스 1마리당 생리 식염수에 용해한 p66-80(서열 번호 14) 펩티드 3 ㎎을 5일 간격으로 2회 피하 투여하였다. 대조군으로서는 등용량(100 ㎕)의 생리 식염수를 마찬가지로 투여하였다. 펩티드 투여군 및 대조군의 동물수는 각각 8마리로 하고, 2회째의 펩티드 투여부터 5일째에 어듀밴트 "Inject Alum"과 혼합한 "rCry j 2"(50 ㎍)로 모든 마우스를 피하 면역하였다. 면역 1주일 후에 각각의 마우스로부터 비장 세포를 조제하였다. 96 웰 플레이트(팔콘) 1웰에 대하여 비장 세포(5×10⁶)를 "rCry j 2"(3 ㎍/㎖)와 함께 0.2 ㎖의 RPMI 배지(10 % FCS, 2mM L-글루타민, 50 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트랩토마이신)에서 배양하였다. 대조군으로서 "rCry j 2"를 함유하지 않는 조건하에서 배양하였다.³H-티미딘에 의한 T 세포 증식의 측정은 실시예 1에 기재된 방법에 준하여 행하였다.

CB6F1 마우스에 미리 p66-80(서열 번호 14)를 피하 투여해 두면 계속되는 "rCry j 2"에 의한 항원 자극에 대하여 T 세포의 면역 반응성이 생리 식염수 투여군에 비하여 상당히 억제되었다(p<0.01). 이것으로부터 마우스의 모델계에서 p66-80(서열 번호 14)는 삼나무 화분 알레르겐에 대하여 펩티드 면역 치료의 예방 효과를 갖는다는 것이 나타났다 (도 5).

<실시예 12>

항원 펩티드 p236-250(서열 번호 19)의 생체내에서의 면역 반응

6주령의 수컷 CB6F1 마우스 1마리당 생리 식염수에 용해한 3 ㎎ p236-250(서열 번호 19)를 5일 간격으로 2회 피하 투여하였다. 대조군으로서는 등용량(200 ㎕)의 생리 식염수를 마찬가지로 투여하였다. 펩티드 투여군 및 대조군의 동물수는 각각 8마리로 하고, 2회째의 펩티드 투여부터 5일째에 "Inject Alum"와 혼합한 rCry j 2(50 ㎍/마리)로 모든 마우스를 피하 면역하였다. 면역 1주일 후에 각각의 마우스로부터 비장 세포를 조제하였다. 96 웰 플레이트(팔콘) 1웰에 대하여 비장 세포(5×10⁶)를 rCry j 2(3 ㎍/㎖)와 함께 0.2 ㎖의 RPMI 배지(10 % FCS, 2mM L-글루타민, 50 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트랩토마이신)에서 배양하였다. 대조군으로서 rCry j 2를 함유하지 않는 조건하에서 배양하였다.³H-티미딘에 의한 T 세포 증식의 측정은 실시예 10에 기재된 방법에 준하여 행하였다.

CB6F1 마우스에 미리 p236-250(서열 번호 19)를 피하 투여해 두면 계속되는 "rCry j 2"에 의한 항원 자극에 대하여 T 세포의 면역 반응성이 생리 식염수 투여군에 비하여 상당히 억제되었다(p<0.05). 이것으로부터 마우스의 모델계에서 p236-250(서열 번호 19)은 삼나무 화분 알레르겐에 대하여 펩티드 면역 치료에 의한 예방 효과를 갖는다는 것이 나타났다(도 6).

이상의 실험 결과로부터 종래 이루어져 온 사람에게 있어서의 삼나무 화분 추출 엑기스에 의한 감감작 치료가 T 세포 에피토프를 통한 작용 기작이라는 것이 명백해졌다.

본 발명에 의해서, 알레르기 환자 개인마다의 HLA 클래스 Ⅱ 분자의 하프로 타입에 적합한 항원 펩티드가, 해당 환자의 펩티드 면역 요법제로서 이용 가능해졌다. 이에 따라, 환자마다 최적의 펩티드 면역 요법을 행하는 것이 가능해지므로, 펩티드 면역 요법의 효과가 매우 향상된다는 것이 예상된다. 또한, 어떤 특정 환자 집단내에서 인식되는 주요한 항원 펩티드에 의한 펩티드 면역 요법으로서는 커버할 수 없는 환자에 대하여도 유효한 펩티드 면역 요법 치료제를 제공하는 것이 가능해졌다.

Claims

알레르겐 유래의 특정한 항원 펩티드와 결합하는 특정의 HLA 클래스 Ⅱ 분자를 갖는 알레르기 환자에게 적용하기 위한, 이 특정한 항원 펩티드를 유효 성분으로 하는 펩티드 면역 요법 치료제.
제1항에 있어서, 알레르겐이 삼나무(杉木) 화분 알레르겐 Cry j 1 및(또는) Cry j 2인 펩티드 면역 요법 치료제.
제2항에 있어서, 항원 펩티드가 Cry j 1 유래의 p106-120(서열 번호 3) 또는 p109-117(서열 번호 4) 또는 Cry j 2 유래의 항원 펩티드 p66-80(서열 번호 14)또는 p236-250(서열 번호 19)이며, 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자가 DRB5^*0101인 펩티드 면역 요법 치료제.
제2항에 있어서, 항원 펩티드가 Cry j 2 유래의 항원 펩티드 p186-200 (서열 번호 1 8)이며, 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자가 DRB4^*0101인 펩티드 면역 요법 치료제.
제2항에 있어서, 항원 펩티드가 Cry j 1 유래의 항원 펩티드 p16-30 (서열 번호 1), p146-160(서열 번호 5), p191-205(서열 번호 7), p251-265(서열 번호 9) 또는 p326-340(서열 번호 10) 또는 Cry j 2 유래의 항원 펩티드 p326-340(서열 번호 21) 또는 p341-355(서열 번호 23)이며, 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자가 DQA1^*0102-DQB1^*0602인 펩티드 면역 요법 치료제.
제2항에 있어서, 항원 펩티드가 Cry j 1 유래의 항원 펩티드 p61-75(서열 번호 2) 또는 p211-225(서열 번호 8) 또는 Cry j 2 유래의 항원 펩티드 p76-90(서열 번호 15)이며, 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자가 DPA1^*0101-DPB1^*0501인 펩티드 면역 요법 치료제.
제2항에 있어서, 항원 펩티드가 Cry j 2 유래의 항원 펩티드 p336-350 (서열 번호 22)이며, 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자가 DPA1^*0202-DPB1^*0501인 펩티드 면역 요법 치료제.
제2항에 있어서, 항원 펩티드가 Cry j 2 유래의 항원 펩티드 p181-195 (서열 번호 17)이며, 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자가 DPA1^*0101-DPB1^*0201인 펩티드 면역 요법 치료제.
제2항에 있어서, 항원 펩티드가 Cry j 1 유래의 항원 펩티드 p151-165(서열 번호 6) 또는 p191-205(서열 번호 7) 또는 Cry j 2 유래의 항원 펩티드 p16-30 (서열 번호 12), p151-165(서열 번호 16) 또는 p321-335(서열 번호 20)이며, 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자가 DRB1^*0901인 펩티드 면역 요법 치료제.
제2항에 있어서, 항원 펩티드가 Cry j 2 유래의 항원 펩티드 p36-50(서열 번호 13) 또는 p236-250(서열 번호 19)이며, 특정한 HLA 클래스 lI 분자가 DRB1^*1501인 펩티드 면역 요법 치료제.
특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자와 특이적으로 반응하는 항원 펩티드를 포함하는 HLA 클래스 Ⅱ 분자를 식별하기 위한 검사용 시약.
Cry j 1 유래의 항원 펩티드 p16-30(서열 번호 1), p61-75(서열 번호 2), p 106-120(서열 번호 3), p109-117(서열 번호 4), p146-160(서열 번호 5), p151-165(서열 번호 6), p191-205(서열 번호 7), p211-225(서열 번호 8), p251-265(서열 번호 9) 또는 p326-340(서열 번호 10), 또는 Cry j 2 유래의 항원 펩티드 p16-30(서열 번호 12), p36-50(서열 번호 13), p66-80(서열 번호 14), p76-90(서열 번호 15), p151-165(서열 번호 16), p181-195(서열 번호 17), p186-200(서열 번호 18), p236-250(서열 번호 19), p321-335(서열 번호 20), p326-340(서열 번호 21), p336-350(서열 번호 22) 또는 p 341-355(서열 번호 24)를 포함하는 HLA 클래스 Ⅱ 분자를 식별하기 위한 검사용 시약.
HLA 결합성 아미노산 모티프가 다른, 표지한 복수의 항원 펩티드를 피검 HLA 클래스 Ⅱ 분자에 접촉시켜, 피검 HLA 클래스 Ⅱ 분자에 특이적으로 결합하는 항원 펩티드를 선택하는 것을 특징으로 하는 HLA 클래스 Ⅱ 분자의 식별 방법.
알레르겐 유래의 특정한 항원 펩티드의, 이 항원 펩티드와 결합하는 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자를 보유한 알레르기 환자 치료용 펩티드 면역 요법 치료제의 제조에 있어서의 용도.
알레르겐 유래의 특정한 항원 펩티드를, 이 항원 펩티드와 결합하는 특정한 HLA 클래스 Ⅱ 분자를 보유한 알레르기 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 펩티드 면역 요법.