CN101623503B

CN101623503B - 生存素与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101623503B
Application number: CN2009101045475A
Authority: CN
Inventors: 杨曌; 吴玉章
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2009-08-06
Filing date: 2009-08-06
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2029-08-06
Also published as: CN101623503A

Abstract

本发明公开了生存素与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用，该复合物由生存素与路易斯寡糖-x以非共价键结合而成，所述生存素具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；其制备方法是先制得生存素与链霉亲和素的交联物，再与(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素通过链霉亲和素与生物素的高亲和力进行结合，即制得生存素与路易斯寡糖的复合物；本发明复合物通过路易斯寡糖-x的导向作用，可成功靶向树突状细胞表面特异性C型凝集素-细胞间黏附分子3结合非整合素分子(DC-SIGN)，促进生存素特异性T细胞免疫应答，高效诱导肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤血管生成，可用于制备肿瘤疫苗，在肿瘤免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

Description

生存素与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生存素(Survivin)与路易斯寡糖(Lewis)的复合物(Survivin-Lewis)，还涉及该复合物的制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤的治疗已取得很多进展，但微小残留病灶仍难以被现行的化疗、放疗、手术等方案彻底清除。应用肿瘤免疫治疗激发机体免疫监视系统，消灭残存肿瘤细胞，有可能彻底治愈肿瘤。因此，肿瘤免疫治疗和肿瘤疫苗开发成为现今研究热点之一。

Survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，具有抑制细胞凋亡和维持细胞有丝分裂的双重功能。Survivin在正常的终末分化组织中几乎不表达，但在几乎所有恶性肿瘤组织中高表达，被视为最具肿瘤特异性的肿瘤共享抗原。Survivin表达水平与肿瘤恶性程度成正相关，若肿瘤组织高表达Survivin，则肿瘤细胞凋亡指数下降，对放化疗的耐受性增强，预后差；反之，若肿瘤组织低表达或不表达survivin，则对放化疗敏感，预后良好。近年来研究发现，肿瘤新生血管内皮细胞受到某些细胞因子如血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等的刺激后可以高表达Survivin，而静止的血管内皮细胞几乎不表达Survivin，因此，Survivin又被视为一种新的肿瘤新生血管标志物。以Survivin为抗肿瘤靶标具有以下独特优势：(1)Survivin表达于几乎所有肿瘤细胞中，尤其在恶性度高、耐放化疗的肿瘤细胞中高表达，若肿瘤细胞为逃逸免疫监视而下调Survivin表达，则会相应增加其凋亡指数和放化疗敏感性；(2)Survivin所诱导的特异性细胞免疫在杀伤肿瘤细胞的同时，还可破坏肿瘤新生血管内皮细胞，由此产生协同抗肿瘤效应，即使在部分肿瘤细胞逃逸免疫监视的情况下，同样能通过抑制血管生成达到打击肿瘤的目的。

但是，肿瘤抗原为自身抗原，存在免疫原性低，特异性细胞免疫激活不足，外周免疫耐受等问题，在设计肿瘤疫苗时需增强免疫系统对肿瘤抗原的识别能力以激发有力的特异性细胞免疫。

树突状细胞(DC)是体内最强大的专职抗原递呈细胞，能够识别、捕获、加工、递呈抗原引发初始免疫反应。利用DC来改善肿瘤疫苗的免疫原性是肿瘤疫苗设计的重要策略之一。其主要方式有体外和体内两种。体外方式是先体外分离DC，再用肿瘤细胞裂解物、肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原多肽或肿瘤来源的RNA冲击致敏DC，或将肿瘤细胞与DC融合，或将肿瘤相关抗原(TAA)基因转染DC，制成各种DC肿瘤疫苗，最后回输体内。体内方式是将蛋白、多肽或基因疫苗直接体内靶向DC，是更简便、更易于临床操作的方式，但其存在如下问题：既往研究的蛋白疫苗多以DC表达的Fc受体、补体受体、甘露糖受体、CD40或B7为靶向受体，但这些受体在血细胞上也有表达，从而在DC特异性靶向方面有所欠缺；基因疫苗多采用具有高转染率的病毒载体，但大多数病毒载体并不能特异性靶向DC，且病毒载体本身可能表达大量的具有免疫原性的蛋白，不仅会干扰目的基因的免疫效果，而且可能导致含目的基因的病毒载体被机体迅速清除，另外，生物安全性也是病毒载体的固有缺陷。

树突状细胞表面特异性C型凝集素-细胞间黏附分子3结合非整合素分子(DC-SIGN)是新近发现的限制性表达于DC和某些组织巨噬细胞上的凝集素受体，可有效地摄取颗粒性抗原和可溶性抗原，再以主要组织相容性复合体(MHC)I类分子和II类分子限制性方式进行抗原递呈，因此，DC-SIGN是较好的DC特异性靶向受体。进一步研究发现，与DC-SIGN结合的实际是表达于自然配体上的结构简单的寡糖，主要有高甘露糖结构和Lewis系列包括路易斯寡糖-a(Lea)、路易斯寡糖-x(Lex)和路易斯寡糖-y(Ley)等。其中，高甘露糖结构虽然可被DC-SIGN高效摄取，但对DC-SIGN的靶向特异性较差，同时可被甘露糖受体等其他凝集素受体识别、摄取；而Lex是DC-SIGN的高亲和力配体，对DC-SIGN具有较强的特异性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种Survivin-Lewis；目的之二在于提供所述Survivin-Lewis的制备方法；目的之三在于提供所述Survivin-Lewis在医药方面的应用。

为达到上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种Survivin-Lewis，由Survivin与Lex以非共价键结合而成，所述Survivin具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

进一步，由Survivin与Lex通过链霉亲和素(SA)与生物素(biotin)的高亲和力结合而成。

在本发明的第二方面，提供了所述Survivin-Lewis的制备方法，包括以下步骤：

a、Survivin与SA的交联物(Survivin-SA)的制备

将SA与Traut’s试剂反应制得巯基化修饰的SA；将Survivin与巯基化修饰的SA反应制得Survivin-SA；

b、Survivin-Lewis的制备

在酶标板中加入(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素(Lex-PAA-biotin)溶液，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入牛血清白蛋白(BSA)溶液，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，再加入步骤a所得Survivin-SA溶液，37℃反应0.5～2小时，再室温反应10～60分钟，即得Survivin-Lewis。

进一步，所述步骤a是将SA与Traut’s试剂在含有PBS和乙二胺四乙酸(EDTA)的水溶液中4℃避光反应2小时，超滤脱盐，再用含有PBS和EDTA的水溶液稀释后继续超滤以稀释Traut’s试剂，制得巯基化修饰的SA；向所得巯基化修饰的SA溶液中，加入Survivin溶液，混匀，4℃反应4小时，即得Survivin-SA；

进一步，所述步骤b是在酶标板中加入浓度为10μg/ml的Lex-PAA-biotin溶液，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入质量百分比浓度为2％的BSA溶液，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，再加入浓度为10μg/ml的Survivin-SA溶液，37℃反应1小时，再室温反应30分钟，即得Survivin-Lewis。

在本发明的第三方面，提供了所述Survivin-Lewis在制备肿瘤疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明复合物通过Lex的导向作用，可成功靶向DC-SIGN，促进Survivin特异性T细胞免疫应答，高效诱导肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤血管生成，可用于制备肿瘤疫苗，在肿瘤免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为蛋白免疫印迹(Western Blot)鉴定Survivin；

图2为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测Survivin-SA；

图3为SDS-PAGE检测Survivin-Lewis；

图4为酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测Survivin-Lewis激发T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)的能力；

图5为⁵¹Cr释放法检测Survivin-Lewis激发T细胞对Survivin阳性肿瘤细胞的特异性杀伤效应。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、Survivin-Lewis的制备

1、Survivin-SA的制备

(1)Survivin基因的克隆

将高表达Survivin的白血病细胞HL-60用RPMI 1640培养基常规培养，调节细胞密度为2×10⁷个/mL，用浓度为100U/mL的重组人白介素-3刺激24小时，收集细胞，用PBS(即pH为7.4的磷酸盐缓冲液)洗涤3次，再用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度法测定所得RNA的纯度和浓度；根据GenBank登录号为NM 001168.2的Survivin基因序列，设计并合成如下PCR引物以扩增含有Survivin全长编码基因、5’端BamHI酶切位点和3’端HindIII酶切位点的DNA片段：引物F 1：5’-taggatccatgggtgccccgacgttgccccctg-3’(SEQ IDNo.3)，下划线部分为BamHI酶切位点；引物R1：5’-gcaagcttatccatggcaccagctgctg-3’(SEQ ID No.4)，下划线部分为HindIII酶切位点；将提取的细胞总RNA逆转录为cDNA，再以所得cDNA为模板进行PCR，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经浓度为20g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与克隆载体pGEM-T Easy连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工公司测定基因序列，将序列正确的阳性克隆质粒命名为pGEM-T Easy/Survivin。

琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约450bp处呈单一特异性条带，与预期结果相符；测序结果显示插入基因序列与Survivin全长编码基因序列(SEQ IDNo.1)一致。

(2)Survivin基因重组原核表达载体的构建

将步骤(1)所得质粒pGEM-T Easy/Survivin和原核表达载体pET32a(+)分别用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切，用凝胶回收试剂盒切胶回收纯化双酶切后的Survivin DNA片段和线性载体pET32a(+)，以摩尔比为3∶1于16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，用BamHI和HindIII进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定基因序列，序列和阅读框架正确的阳性克隆质粒即为构建成功的Survivin基因重组原核表达载体，命名为pET32/Survivin。

双酶切鉴定结果显示双酶切产物在约450bp处出现电泳带，与插入片段大小相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列无突变，阅读框架正确，无移码。

(3)Survivin基因工程菌的构建

将步骤(2)所得Survivin基因重组原核表达载体pET32/Survivin用限制性内切酶Sal I酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化产物涂布于MD平板上，30℃培养3～4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于MD平板和MM平板上，30℃培养3～6天(每天向MM平板中添加甲醇100μL)，挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD平板上，30℃培养7天，所得酵母菌即为高拷贝Survivin基因工程菌。

(4)Survivin的诱导表达

将步骤(3)所得高拷贝Survivin基因工程菌于30℃培养至OD600为2，按10％接种量接入BMGY培养基中，30℃培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于等体积的BMMY培养基中，30℃诱导表达3天(每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓度为0.5％)，4℃、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80％的硫酸铵溶液使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的PBS透析脱盐，再用琼脂糖凝胶(Q-Sepharose)柱进行分离纯化，收集洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶(Sephdex G-25)柱脱盐，即得纯化的Survivin(氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示)，取样进行Western Blot鉴定。

Western Blot鉴定：取纯化的Survivin，加入内参β-actin和上样缓冲液，100℃加热3～5分钟，用质量百分浓度为12％的分离胶、质量百分浓度为5％的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人Survivin单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体，温度37℃孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入纯化的Survivin)；结果见图1，其中1泳道为纯化的Survivin，2泳道为阴性对照，可见1泳道除内参β-actin条带外，还有一明显蛋白条带，而2泳道未见相应条带。

(5)Survivin-SA的制备

取浓度为5mg/ml的SA溶液1ml，加入新鲜配制的浓度为2mg/ml的Traut’s试剂68.8μl、10×PBS 0.2ml、浓度为0.5mol/L的EDTA溶液8μl和超纯水1ml，混匀，4℃避光反应2小时，超滤离心管10KD超滤脱盐，再用含有1×PBS和浓度为2mmol/L的EDTA的平衡溶液稀释后继续超滤以稀释Traut’s试剂，得巯基化修饰的SA溶液；向上述巯基化修饰的SA溶液中，加入浓度为10mg/ml的Survivin溶液200μl，混匀，4℃反应4小时，即得Survivin-SA，用Sepharose 4B柱纯化，冻干保存，取样进行SDS-PAGE鉴定。

SDS-PAGE鉴定结果如图2所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1泳道为Survivin-SA，可见1泳道在18KD处出现电泳带，与预期结果相符。

2、Survivin-Lewis的制备

在酶标板中，每孔加入浓度为10μg/ml的Lex-PAA-biotin，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入质量百分浓度为2％的BSA溶液(以PBS为溶剂)，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，加入浓度为10μg/ml的Survivin-SA溶液，37℃反应1小时，再室温反应30分钟，即得Survivin-Lewis，冻干保存，取样进行SDS-PAGE鉴定。

SDS-PAGE鉴定结果如图3所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1泳道为Survivin-Lewis，可见1泳道在18KD处出现电泳带，与预期结果相符。

二、Survivin-Lewis促进特异性T细胞免疫应答的检测

效应细胞的制备：将30只6～8周龄雌性Babl/C小鼠随机分为3组：实验组、对照组和空白组(每组10只)，实验组以浓度为1mg/mL的Survivin-Lewis溶液(以10×PBS为溶剂)为免疫原，对照组以浓度为1mg/mL的survivin溶液(以10×PBS为溶剂)为免疫原，空白组以10×PBS为免疫原，各组于小鼠背侧尾根部皮下注射免疫原，每只100μL，之后每隔1周，以同样方法加强免疫1次，共免疫3次；末次免疫后1周，断颈处死各组小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为1×10⁶个/mL，作为后续实验中各组的效应细胞。

1、ELISPOT法检测Survivin-Lewis激发T细胞分泌IFN-γ的能力

采用ELISPOT检测试剂盒进行检测，具体操作参照试剂盒说明书：在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70％的乙醇100μL，室温放置10分钟，用PBS洗涤后，再加入稀释度为1∶100的IFN-γ捕获抗体100μL，温度4℃孵育过夜，用PBS洗涤后，再加入质量百分浓度为2％的脱脂奶粉溶液100μL，室温封闭2小时，用PBS洗涤后，再加入效应细胞100μL，温度37℃孵育48小时，用PBST(即含有质量百分浓度为0.1％的吐温20的PBS)洗涤后，再加入稀释度为1∶100的biotin标记抗IFN-γ抗体100μL，温度37℃孵育1.5小时，用PBST洗涤后，加入稀释度为1∶5000的SA标记碱性磷酸酶100μL，温度37℃孵育1小时，用PBST洗涤后，拍干培养板，加入即用型BCIP/NBT底物反应液100μL，室温避光显色2～10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；同时设置阴性对照组(不加入效应细胞)，各组斑点数以3个复孔的均值表示。

结果见图4，实验组的斑点数(253个)明显高于其它3组(对照组为186个，空白组为14个，阴性对照组为3个)，表明本发明的Survivin-Lewis具有良好的免疫原性，能够有效激发T细胞分泌IFN-γ。

2、⁵¹Cr释放法检测Survivin-Lewis激发T细胞对Survivin阳性肿瘤细胞的特异性杀伤效应

靶细胞的制备：将Survivin阳性的结肠癌细胞CT26用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基体外培养，收集细胞，离心洗涤2次后，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为1×10⁶个/mL，取1mL置10mL血清瓶中，加入Na⁵¹CrO₄ 100μCi，温度37℃孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的⁵¹Cr，再用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度为1×10⁵个/mL，作为靶细胞。

在96孔U型板中，每孔分别按效靶比(E/T)为100∶1、50∶1和25∶1加入效应细胞与靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放组(用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放组(用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞)，将96孔板500r/min离心30秒后，温度37℃孵育4小时，再1000r/min离心10分钟，各孔取上清100μL，用γ计数器测定每分钟放射活性(cpm值)，按下述公式计算杀伤率∶杀伤率(％)＝[(实验组cpm均值-最小释放组cpm均值)/(最大释放组cpm均值-最小释放组cpm均值)]×100。

结果见图5，实验组在各效靶比对CT26细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，当E/T为100∶1时，杀伤率为53.4％，而对照组杀伤率为37.2％，空白组对CT26细胞无特异性杀伤作用，表明本发明的Survivin-Lewis能够有效激发T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤效应。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>生存素与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用

<160>4

<210>1

<211>429

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)......(429)

<400>1

atg ggt gcc ccg acg ttg ccc cct gcc tgg cag ccc ttt ctc aag gac 48

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

cac cgc atc tct aca ttc aag aac tgg ccc ttc ttg gag ggc tgc gcc 96

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

tgc acc ccg gag cgg atg gcc gag gct ggc ttc atc cac tgc ccc act 144

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

gag aac gag cca gac ttg gcc cag tgt ttc ttc tgc ttc aag gag ctg 192

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

gaa ggc tgg gag cca gat gac gac ccc ata gag gaa cat aaa aag cat 240

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His

65 70 75 80

tcg tcc ggt tgc gct ttc ctt tct gtc aag aag cag ttt gaa gaa tta 288

Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

85 90 95

acc ctt ggt gaa ttt ttg aaa ctg gac aga gaa aga gcc aag aac aaa 336

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys

100 105 110

att gca aag gaa acc aac aat aag aag aaa gaa ttt gag gaa act gcg 384

Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala

115 120 125

gag aaa gtg cgc cgt gcc atc gag cag ctg gct gcc atg gat tga 429

Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp

130 135 140

<210>2

<211>142

<212>PRT

<213>智人(homo sapiens)

<400>2

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His

65 70 75 80

Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

85 90 95

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys

100 105 110

Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala

115 120 125

Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp

130 135 140

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F1

<400>3

taggatccat gggtgccccg acgttgcccc ctg 33

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R1

<400>4

gcaagcttat ccatggcacc agctgctg 28

Claims

1.生存素与路易斯寡糖的复合物，其特征在于：由生存素与路易斯寡糖-x通过链霉亲和素与生物素的高亲和力结合而成，所述生存素具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

所述复合物的制备方法包括以下步骤：

a、生存素与链霉亲和素的交联物的制备：将链霉亲和素与Traut’s试剂反应制得巯基化修饰的链霉亲和素；将生存素与巯基化修饰的链霉亲和素反应制得生存素与链霉亲和素的交联物；

b、生存素与路易斯寡糖的复合物的制备：在酶标板中加入(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素溶液，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入牛血清白蛋白溶液，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，再加入步骤a所得生存素与链霉亲和素的交联物溶液，37℃反应0.5～2小时，再室温反应10～60分钟，即得生存素与路易斯寡糖的复合物。

2.权利要求1所述的生存素与路易斯寡糖的复合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、生存素与链霉亲和素的交联物的制备

将链霉亲和素与Traut’s试剂反应制得巯基化修饰的链霉亲和素；将生存素与巯基化修饰的链霉亲和素反应制得生存素与链霉亲和素的交联物；

b、生存素与路易斯寡糖的复合物的制备

在酶标板中加入(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素溶液，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入牛血清白蛋白溶液，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，再加入步骤a所得生存素与链霉亲和素的交联物溶液，37℃反应0.5～2小时，再室温反应10～60分钟，即得生存素与路易斯寡糖的复合物。

3.根据权利要求2所述的生存素与路易斯寡糖的复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤a是将链霉亲和素与Traut’s试剂在含有PBS和乙二胺四乙酸的水溶液中4℃避光反应2小时，超滤脱盐，再用含有PBS和乙二胺四乙酸的水溶液稀释后继续超滤以稀释Traut’s试剂，制得巯基化修饰的链霉亲和素；向所得巯基化修饰的链霉亲和素溶液中，加入生存素溶液，混匀，4℃反应4小时，即得生存素与链霉亲和素的交联物。

4.根据权利要求2所述的生存素与路易斯寡糖的复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤b是在酶标板中加入浓度为10μg/ml的(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素溶液，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入质量百分浓度为2％的牛血清白蛋白溶液，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，再加入浓度为10μg/ml的生存素与链霉亲和素的交联物溶液，37℃反应1小时，再室温反应30分钟，即得生存素与路易斯寡糖的复合物。

5.权利要求1所述的生存素与路易斯寡糖的复合物在制备肿瘤疫苗中的应用。