CN101912603A

CN101912603A - 前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101912603A
Application number: CN2009102510544A
Authority: CN
Inventors: 杨曌; 吴玉章
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2010-12-15

Abstract

本发明公开了前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用，该复合物由前列腺干细胞抗原与热休克蛋白70以非共价键结合而成，能够激活特异性CTL，诱导强有力的抗前列腺癌免疫，且不需要任何佐剂，在同种间应用不受MHC的限制；同时，前列腺干细胞抗原中包含MHC I类和II类分子的多个表位，可以激发广谱的CD8+和CD4+T细胞，还包含T细胞和B细胞表位，可以激发T细胞和B细胞的抗肿瘤应答；该复合物的制备方法简单，可以用于制备抗前列腺癌疫苗，在前列腺癌免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

Description

前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白复合物，特别涉及前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物，还涉及该复合物的制备方法和应用。

背景技术

前列腺癌是西方国家常见的肿瘤，居男性肿瘤死亡原因第二位。尽管最近在诊断和治疗局限性前列腺癌方面有了一些进展，但仍有许多问题亟待解决，如诊断方法缺乏特异性，不能准确区分静止性和进展性的前列腺癌，难以对病人预后进行预测，约20％～40％的患者经过手术和放射治疗后复发等。尽管雄激素阻断疗法可以使一部分患者的病情得到缓解，但是大部分患者还是不可避免地发展到目前无法治疗的雄激素非依赖性病变。因此，发展诊断和治疗前列腺癌的新方法及新药物成为目前研究的焦点。

前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)是Reiter等于1998年利用特征性差异分析法在前列腺癌细胞株中发现的一种前列腺癌相关肿瘤抗原，具有高度的前列腺特异性，在多数前列腺癌中均有高表达，尤其在前列腺癌骨转移肿瘤中呈100％强表达，而在其他正常组织很少表达，其单克隆抗体在动物实验中能有效抑制雄激素依赖及非依赖性前列腺癌的生长。PSCA是一种细胞膜抗原，为含有123个氨基酸的糖蛋白，氨基端为信号序列，羧基端为糖化磷脂酰肌醇(GPI)锚定序列，中间有多个糖基化位点。其与干细胞抗原2(SCA-2)有30％的同源性，后者是依赖于GPI锚定细胞表面的Thy21/Ly26家族抗原成员之一。同干细胞抗原一样，PSCA也依赖GPI结合于细胞膜上，并可被GPI特异性磷酸酯酶所清除。研究发现，识别PSCA的细胞毒性T细胞(CTL)可以在患者外周血中提取得到，其可以溶解杀伤前列腺癌细胞。因此，PSCA可以作为T细胞介导的前列腺癌免疫治疗中的靶抗原，通过激活识别PSCA的CTL特异性杀伤癌细胞。

热休克蛋白(HSP)是一类广泛存在于生物体内高度保守的蛋白质，在高温、创伤、感染、缺氧、重金属中毒、氧自由基及恶性肿瘤等应激状态下可诱导表达。HSP具有“分子伴侣”作用，在正常状态下，参与细胞内各种新生肽链的结合、装配和跨膜转运；在应激状态下，可与细胞内变性的蛋白质结合，协助其复性或将其运送至溶酶体降解以维持细胞的正常生命代谢。许多研究结果证实，从肿瘤组织中提取的HSP可以诱导机体产生针对该肿瘤的免疫应答，达到治疗肿瘤的目的。进一步研究表明，从肿瘤组织中提取的HSP实际为抗原肽-HSP复合物，其可通过以下几方面诱导机体的抗肿瘤免疫：(1)抗原肽-HSP复合物作为完整抗原，被抗原递呈细胞摄取、加工后，与主要组织相容性复合体(MHC)结合并递呈到细胞表面，从而活化T细胞，包括CD4+和CD8+T细胞，特别是CTL，产生抗肿瘤的特异性细胞免疫；HSP在此处起到载体或佐剂的作用，诱导免疫应答的是其结合的抗原多肽；(2)HSP本身具有活化巨噬细胞和树突状细胞的作用，从而增加共刺激因子和MHC的表达，加强机体的抗肿瘤免疫；(3)自然杀伤细胞和γδT细胞是体内重要的抗肿瘤免疫细胞，对肿瘤细胞的杀伤效应不受MHC的限制，HSP可直接作为抗原递呈分子，将抗原肽递呈至细胞表面，从而活化自然杀伤细胞和γδT细胞，产生抗肿瘤的非特异性免疫。根据分子量大小和氨基酸序列同源性的不同，HSP可以分为HSP110家族、HSP90家族(83～90kD)、HSP70家族(66～78kD)、HSP60家族及小HSP家族(15～39kD)。其中，HSP70家族在细胞内含量最多，有20余个成员，广泛存在于细胞内不同部位。HSP70在进化上具有高度的保守性，其氨基端有ATP结合区并具有ATP酶活性，较羧基端具有更高的保守性，而羧基端是结合多肽或特殊蛋白的部位，具有易变性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种PSCA与HSP的复合物，能够激活识别PSCA的特异性CTL，诱导强有力的抗前列腺癌免疫，且不需要任何佐剂，在同种间应用不受MHC的限制；目的之二在于提供所述PSCA与HSP的复合物的制备方法；目的之三在于提供所述PSCA与HSP的复合物在医药方面的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、PSCA与HSP的复合物，由PSCA与HSP70以非共价键结合而成，所述PSCA具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，HSP70具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。

进一步，由PSCA与HSP70以摩尔比为1∶1结合而成。

2、所述PSCA与HSP的复合物的制备方法，是在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液即PBS中，分别加入PSCA与HSP70，混合均匀，43℃孵育30分钟，再37℃孵育1小时，即得PSCA与HSP70的复合物。

进一步，按摩尔比为1∶1加入PSCA和HSP70，使PSCA和HSP70在PBS中的浓度均为3～6μg/mL。

3、所述PSCA与HSP的复合物在制备抗前列腺癌疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供的PSCA与HSP的复合物，能够激活识别PSCA的特异性CTL，诱导强有力的抗前列腺癌免疫；PSCA中包含MHC I类和II类分子的多个表位，可以激发广谱的CD8+和CD4+T细胞，还包含T细胞和B细胞表位，可以激发T细胞和B细胞的抗肿瘤应答；由于HSP结构上的高度保守，不具有多态性，在同种内相互使用不受MHC的限制；HSP具有免疫佐剂的作用，省略了常规蛋白免疫需要免疫佐剂的麻烦；该复合物的制备方法简单，可以用于制备抗前列腺癌疫苗，在前列腺癌免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为蛋白免疫印迹(Western Blot)鉴定PSCA；

图2为Western Blot鉴定HSP70；

图3为Western Blot鉴定PSCA-HSP70复合物；

图4为酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测PSCA-HSP70复合物激发CTL分泌IFN-γ的能力；

图5为⁵¹Cr释放法检测PSCA-HSP70复合物激发CTL对结肠癌细胞CT26的特异性杀伤效应。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、PSCA-HSP70复合物的制备

1、PSCA的制备

(1)PSCA cDNA全长的克隆

根据GenBank登录号为NM_005672的PSCA基因序列，设计并合成如下引物以扩增PSCA cDNA全长：F1：5’-atgaaggctgtgctgcttgccctgt-3’(SEQ ID No.3)，R1：5’-cgagctggccgggtccccagagc-3’(SEQ ID No.4)；提取前列腺癌细胞LNCaP的总RNA，逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板、F1和R1为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与克隆载体pGEM-T Easy连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，委托上海生工公司测定质粒序列，将插入了PSCA cDNA全长序列(SEQ ID No.1)的阳性克隆质粒命名为pGEM-PSCA。

(2)PSCA基因重组真核表达载体的构建

根据PSCA cDNA全长序列和真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点，设计并合成如下引物以扩增两端带有酶切位点的PSCA cDNA全长：F2：5’-ccggtaccatgaaggctgtgctgcttgccctgt-3’(SEQ ID No.5)，下划线部分为Kpn I酶切位点；R2：5’-cctctagacgagctggccgggtccccagagc-3’(SEQ ID No.6)，下划线部分为Xba I酶切位点；以质粒pGEM-PSCA为模板、F1和R1为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件与步骤(1)相同；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，用Kpn I和Xba I进行双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Kpn I和Xba I双酶切的真核表达载体pcDNA3.1在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，用Kpn I和Xba I进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定质粒序列，将插入了PSCA cDNA全长序列的阳性克隆质粒命名为PSCA基因重组真核表达载体pcDNA3.1-PSCA。

(3)PSCA基因工程菌的构建

将PSCA基因重组真核表达载体pcDNA3.1-PSCA用Sal I酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30℃培养3～4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于MD和MM平板，30℃培养3～6天(每天向MM平板中添加甲醇100μL)，挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD平板，30℃培养7天，所得酵母菌即为高拷贝PSCA基因工程菌。

(4)PSCA的诱导表达

将高拷贝PSCA基因工程菌于30℃培养至OD600为2，按10％接种量接入BMGY培养基中，30℃培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，细菌沉淀用无菌水洗涤2次，重悬于等体积的BMMY培养基中，30℃诱导表达3天(每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓度为0.5％)，4℃、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80％的硫酸铵溶液使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)透析脱盐，再用琼脂糖凝胶(Q-Sepharose)柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有PSCA的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶(SephdexG-25)柱脱盐，即得纯化的PSCA(序列如SEQ ID No.2所示)。

Western Blot鉴定：取纯化的PSCA，加入内参β-actin和上样缓冲液，100℃加热3～5分钟，用质量百分浓度为12％的分离胶、质量百分浓度为5％的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人PSCA单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体，温度37℃孵育1小时，洗膜，再加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入纯化的PSCA)；结果见图1，其中1泳道为纯化的PSCA，2泳道为阴性对照，可见1泳道除内参β-actin条带外，还有一明显的蛋白条带，而2泳道未见相应条带。

2、HSP70的制备

(1)HSP70cDNA全长的克隆

根据GenBank登录号为NM 005345的HSP70基因序列和酵母表达载体pRSET-A的多克隆位点，设计并合成如下引物以扩增两端带有酶切位点的HSP70cDNA全长：F3：5’ttggatccatgtccaagggacctgca-3’(SEQ ID No.9)，下划线部分为BamH I酶切位点；R3：5’-ggccatggttaatcaacctcttcaat-3’(SEQ ID No.10)，下划线部分为Nco I酶切位点；提取HepG2细胞的总RNA，逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板、F3和R3为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性30秒、58℃退火30秒，72℃延伸2.5分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用凝胶回收试剂盒进行切胶回收纯化。

(2)HSP70基因重组酵母表达载体的构建

将纯化的PCR产物用BamH I和Nco I进行双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamH I和Nco I双酶切的酵母表达载体pRSET-A在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，用BamH I和Nco I进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定质粒序列，将插入了HSP70cDNA全长序列(SEQ ID No.7)的阳性克隆质粒命名为HSP70基因重组酵母表达载体pRSET-HSP70。

(3)HSP70基因工程菌的制备

将HSP70基因重组酵母表达载体pRSET-HSP70用Sal I酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30℃培养3～4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于MD和MM平板，30℃培养3～6天(每天向MM平板中添加甲醇100μL)，挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD平板，30℃培养7天，所得酵母菌即为高拷贝HSP70基因工程菌。

(4)HSP70的诱导表达

将高拷贝HSP70基因工程菌于30℃培养至OD600为2，按10％接种量接入BMGY培养基中，30℃培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于等体积的BMMY培养基中，30℃诱导表达3天(每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓度为0.5％)，4℃、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80％的硫酸铵溶液使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的PBS透析脱盐，再用Q-Sepharose柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有HSP70的洗脱液，适当浓缩后用Sephdex G-25柱脱盐，即得纯化的HSP70(序列如SEQID No.8所示)。

Western Blot鉴定：取纯化的HSP70，加入内参β-actin和上样缓冲液，100℃加热3～5分钟，用质量百分浓度为12％的分离胶、质量百分浓度为5％的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人HSP70单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体，温度37℃孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入纯化的HSP70)；结果见图2，其中1泳道为纯化的HSP70，2泳道为阴性对照，可见1泳道除内参β-actin条带外，还有一明显的蛋白条带，而2泳道未见相应条带。

3、PSCA-HSP70复合物的制备

在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS(由浓度为137mmol/L的NaCl、浓度为2.7mmol/L的KCl、浓度为4.3mmol/L的Na₂HPO₄和浓度为1.4mmol/L的KH₂PO₄组成)中，按摩尔比为1∶1加入纯化的PSCA和HSP70，使PSCA和HSP70在PBS中的浓度均为3～6μg/mL，混合均匀，43℃孵育30分钟，再37℃孵育1小时，即得PSCA-HSP70复合物。

Western Blot鉴定：取PSCA-HSP70复合物，冰上匀浆裂解30分钟，加入鼠抗人HSP70单克隆抗体，4℃漩涡混合过夜，加入IgG Beads，4℃漩涡混合5小时，4℃、5000r/min离心10分钟，收集上清，加入内参β-actin和上样缓冲液，95℃加热5分钟，用质量百分浓度为12％的分离胶、质量百分浓度为5％的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人PSCA单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体，温度37℃孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入PSCA-HSP70复合物)；结果见图3，其中1泳道为PSCA-HSP70复合物，2泳道为阴性对照，可见1泳道除内参β-actin条带外，还有一明显的蛋白条带，而2泳道未见相应条带。

二、PSCA-HSP70复合物的抗肿瘤活性研究

效应细胞的制备：将30只6～8周龄雌性Babl/c小鼠随机分为3组：实验组、对照组和空白组，每组10只；将PSCA-HSP70复合物和OVA-HSP70复合物(卵清蛋白与HSP70按前述步骤3方法制得的复合物)分别用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS溶解制成浓度为0.5mg/mL的溶液；实验组以浓度为0.5mg/mL的PSCA-HSP70复合物溶液为免疫原，对照组以浓度为0.5mg/mL的OVA-HSP70复合物溶液为免疫原，空白组以浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS为免疫原；各组于小鼠背侧尾根部皮下注射免疫原，每只100μL，之后每间隔1周，以同样方法加强免疫1次，共免疫3次；末次免疫后1周，断颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为1×10⁶个/mL，作为后续实验的效应细胞。

1、ELISPOT法检测PSCA-HSP70复合物激发CTL分泌IFN-γ的能力

采用ELISPOT检测试剂盒进行检测，具体操作参照试剂盒说明书：在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70％的乙醇100μL，室温放置10分钟，PBS洗涤，再加入IFN-γ捕获抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度4℃孵育过夜，PBS洗涤，再加入质量百分浓度为2％的脱脂奶粉溶液100μL，室温封闭2小时，PBS洗涤，再加入效应细胞100μL，温度37℃孵育48小时，PBST(即含有质量百分浓度为0.1％的吐温20的PBS)洗涤，再加入生物素标记的抗IFN-γ抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度37℃孵育1.5小时，PBST洗涤，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(稀释度为1∶5000)100μL，温度37℃孵育1小时，PBST洗涤，拍干培养板，再加入即用型BCIP/NBT底物反应液100μL，室温避光显色2～10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；同时设置阴性对照组(不加入效应细胞)，各组斑点数以3个复孔的均值表示。

结果见图4，实验组的斑点数(235个/10⁵细胞)明显高于其它3组(对照组为149个/10⁵细胞，空白组为10个/10⁵细胞，阴性对照组为3个/10⁵细胞)，表明本发明的PSCA-HSP70复合物具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN-γ。

2、⁵¹Cr释放法检测PSCA-HSP70复合物激发CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤效应

靶细胞的制备：将结肠癌细胞CT26用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基进行培养，收集细胞，离心洗涤2次后，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为1×10⁶个/mL，取1mL置10mL血清瓶中，加入100μCi Na⁵¹CrO₄，温度37℃孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的⁵¹Cr，再用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞密度为1×10⁵个/mL，作为靶细胞。

在96孔U型板中，每孔分别按效靶比(E/T)为100∶1、50∶1和25∶1加入效应细胞与靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放组(用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放组(用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞)；将96孔板500r/min离心30秒后，温度37℃孵育4小时，1000r/min离心10分钟，各孔取上清100μL，用γ计数器测定每分钟放射活性(cpm值)，按下述公式计算杀伤率：杀伤率(％)＝[(实验组cpm均值-最小释放组cpm均值)/(最大释放组cpm均值-最小释放组cpm均值)]×100％，杀伤率大于15％判为特异性杀伤。

结果见图5，实验组在各效靶比对CT26细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，当E/T为100∶1时，杀伤率为51.7％，而对照组和空白组对CT26细胞无特异性杀伤作用，表明本发明的PSCA-HSP70复合物能够有效激发CTL产生对肿瘤细胞的特异性杀伤效应。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用

<160>10

<210>1

<211>372

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)……(372)

<400>1

acgaaggctg tgctgcttgc cctgttgatg gcaggcttgg ccctgcagcc aggcactgcc 60

ctgctgtgct actcctgcaa agcccaggtg agcaacgagg actgcctgca ggtggagaac 120

tgcacccagc tgggggagca gtgctggacc gcgcgcatcc gcgcagttgg cctcctgacc 180

gtcatcagca aaggctgcag cttgaactgc gtggatgact cacaggacta ctacgtgggc 240

aagaagaaca tcacgtgctg tgacaccgac ttgtgcaacg ccagcggggc ccatgccctg 300

cagccggctg ctgccatcct tgcgctgctc cctgcactcg gcctgctgct ctggggaccc 360

ggccagctct ag 372

<210>2

<211>123

<212>PRT

<213>智人(homo sapiens)

<400>2

Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val

20 25 30

Ser Asn Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys Thr Gln Leu Gly

35 40 45

Glu Gln Cys Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr

50 55 60

Val Ile Ser Lys Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln

65 70 75

Asp Tyr Tyr Val Gly Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp

80 85 90

Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala

95 100 105

Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro

110 115 120

Gly Gln Leu

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F1

<400>3

atgaaggctg tgctgcttgc cctgt 25

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R1

<400>4

cgagctggcc gggtccccag agc 23

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F2

<400>5

ccggtaccat gaaggctgtg ctgcttgccc tgt 33

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R2

<400>6

cctctagacg agctggccgg gtccccagag c 31

<210>7

<211>1926

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)……(1926)

<400>7

atggccaaag ccgcggcgat cggcatcgac ctgggcacca cctactcctg cgtgggggtg 60

ttccaacacg gcaaggtgga gatcatcgcc aacgaccagg gcaaccgcac cacccccagc 120

tacgtggcct tcacggacac cgagcggctc atcggggatg cggccaagaa ccaggtggcg 180

ctgaacccgc agaacaccgt gtttgacgcg aagcggctga ttggccgcaa gttcggcgac 240

ccggtggtgc agtcggacat gaagcactgg cctttccagg tgatcaacga cggagacaag 300

cccaaggtgc aggtgagcta caagggggag accaaggcat tctaccccga ggagatctcg 360

tccatggtgc tgaccaagat gaaggagatc gccgaggcgt acctgggcta cccggtgacc 420

aacgcggtga tcaccgtgcc ggcctacttc aacgactcgc agcgccaggc caccaaggat 480

gcgggtgtga tcgcggggct caacgtgctg cggatcatca acgagcccac ggccgccgcc 540

atcgcctacg gcctggacag aacgggcaag ggggagcgca acgtgctcat ctttgacctg 600

ggcgggggca ccttcgacgt gtccatcctg acgatcgacg acggcatctt cgaggtgaag 660

gccacggccg gggacaccca cctgggtggg gaggactttg acaacaggct ggtgaaccac 720

ttcgtggagg agttcaagag aaaacacaag aaggacatca gccagaacaa gcgagccgtg 780

aggcggctgc gcaccgcctg cgagagggcc aagaggaccc tgtcgtccag cacccaggcc 840

agcctggaga tcgactccct gtttgagggc atcgacttct acacgtccat caccagggcg 900

aggttcgagg agctgtgctc cgacctgttc cgaagcaccc tggagcccgt ggagaaggct 960

ctgcgcgacg ccaagctgga caaggcccag attcacgacc tggtcctggt cgggggctcc 1020

acccgcatcc ccaaggtgca gaagctgctg caggacttct tcaacgggcg cgacctgaac 1080

aagagcatca accccgacga ggctgtggcc tacggggcgg cggtgcaggc ggccatcctg 1140

atgggggaca agtccgagaa cgtgcaggac ctgctgctgc tggacgtggc tcccctgtcg 1200

ctggggctgg agacggccgg aggcgtgatg actgccctga tcaagcgcaa ctccaccatc 1260

cccaccaagc agacgcagat cttcaccacc tactccgaca accaacccgg ggtgctgatc 1320

caggtgtacg agggcgagag ggccatgacg aaagacaaca atctgttggg gcgcttcgag 1380

ctgagcggca tccctccggc ccccaggggc gtgccccaga tcgaggtgac cttcgacatc 1440

gatgccaacg gcatcctgaa cgtcacggcc acggacaaga gcaccggcaa ggccaacaag 1500

atcaccatca ccaacgacaa gggccgcctg agcaaggagg agatcgagcg catggtgcag 1560

gaggcggaga agtacaaagc ggaggacgag gtgcagcgcg agagggtgtc agccaagaac 1620

gccctggagt cctacgcctt caacatgaag agcgccgtgg aggatgaggg gctcaagggc 1680

aagatcagcg aggcggacaa gaagaaggtg ctggacaagt gtcaagaggt catctcgtgg 1740

ctggacgcca acaccttggc cgagaaggac gagtttgagc acaagaggaa ggagctggag 1800

caggtgtgta accccatcat cagcggactg taccagggtg ccggtggtcc cgggcctggg 1860

ggcttcgggg ctcagggtcc caagggaggg tctgggtcag gccccaccat tgaggaggta 1920

gattag 1926

<210>8

<211>641

<212>PRT

<213>智人(homo sapiens)

<400>8

Met Ala Lys Ala Ala Ala Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr

1 5 10 15

Ser Cys Val Gly Val Phe Gln His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala

20 25 30

Asn Asp Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr

35 40 45

Asp Thr Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala

50 55 60

Leu Asn Pro Gln Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly

65 70 75

Arg Lys Phe Gly Asp Pro Val Val Gln Ser Asp Met Lys His Trp

80 85 90

Pro Phe Gln Val Ile Asn Asp Gly Asp Lys Pro Lys Val Gln Val

95 100 105

Ser Tyr Lys Gly Glu Thr Lys Ala Phe Tyr Pro Glu Glu Ile Ser

110 115 120

Ser Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Ile Ala Glu Ala Tyr Leu

125 130 135

Gly Tyr Pro Val Thr Asn Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe

140 145 150

Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Val Ile Ala

155 160 165

Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala

170 175 180

Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Arg Thr Gly Lys Gly Glu Arg Asn Val

185 190 195

Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Ile Leu

200 205 210

Thr Ile Asp Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ala Thr Ala Gly Asp

215 220 225

Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Leu Val Asn His

230 235 240

Phe Val Glu Glu Phe Lys Arg Lys His Lys Lys Asp Ile Ser Gln

245 250 255

Asn Lys Arg Ala Val Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala

260 265 270

Lys Arg Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Ile Asp

275 280 285

Ser Leu Phe Glu Gly Ile Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala

290 295 300

Arg Phe Glu Glu Leu Cys Ser Asp Leu Phe Arg Ser Thr Leu Glu

305 310 315

Pro Val Glu Lys Ala Leu Arg Asp Ala Lys Leu Asp Lys Ala Gln

320 325 330

Ile His Asp Leu Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys

335 340 345

Val Gln Lys Leu Leu Gln Asp Phe Phe Asn Gly Arg Asp Leu Asn

350 355 360

Lys Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val

365 370 375

Gln Ala Ala Ile Leu Met Gly Asp Lys Ser Glu Asn Val Gln Asp

380 385 390

Leu Leu Leu Leu Asp Val Ala Pro Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr

395 400 405

Ala Gly Gly Val Met Thr Ala Leu Ile Lys Arg Asn Ser Thr Ile

410 415 420

Pro Thr Lys Gln Thr Gln Ile Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Asn Gln

425 430 435

Pro Gly Val Leu Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu Arg Ala Met Thr

440 445 450

Lys Asp Asn Asn Leu Leu Gly Arg Phe Glu Leu Ser Gly Ile Pro

455 460 465

Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile

470 475 480

Asp Ala Asn Gly Ile Leu Asn Val Thr Ala Thr Asp Lys Ser Thr

485 490 495

Gly Lys Ala Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu

500 505 510

Ser Lys Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Gln Glu Ala Glu Lys Tyr

515 520 525

Lys Ala Glu Asp Glu Val Gln Arg Glu Arg Val Ser Ala Lys Asn

530 535 540

Ala Leu Glu Ser Tyr Ala Phe Asn Met Lys Ser Ala Val Glu Asp

545 550 555

Glu Gly Leu Lys Gly Lys Ile Ser Glu Ala Asp Lys Lys Lys Val

560 565 570

Leu Asp Lys Cys Gln Glu Val Ile Ser Trp Leu Asp Ala Asn Thr

575 580 585

Leu Ala Glu Lys Asp Glu Phe Glu His Lys Arg Lys Glu Leu Glu

590 595 600

Gln Val Cys Asn Pro Ile Ile Ser Gly Leu Tyr Gln Gly Ala Gly

605 610 615

Gly Pro Gly Pro Gly Gly Phe Gly Ala Gln Gly Pro Lys Gly Gly

620 625 630

Ser Gly Ser Gly Pro Thr Ile Glu Glu Val Asp

635 640

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F3

<400>9

ttggatccat gtccaaggga cctgca 26

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R3

<400>10

ggccatggtt aatcaacctc ttcaat 26

Claims

1.前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物，其特征在于：由前列腺干细胞抗原与热休克蛋白70以非共价键结合而成，所述前列腺干细胞抗原具有SEQID No.2所示的氨基酸序列，热休克蛋白70具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物，其特征在于：由前列腺干细胞抗原与热休克蛋白70以摩尔比为1∶1结合而成。

3.权利要求1所述前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物的制备方法，其特征在于：在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液即PBS中，分别加入前列腺干细胞抗原和热休克蛋白70，混合均匀，43℃孵育30分钟，再37℃孵育1小时，即得前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物。

4.根据权利要求3所述前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物的制备方法，其特征在于：按摩尔比为1∶1加入前列腺干细胞抗原和热休克蛋白70，使前列腺干细胞抗原和热休克蛋白70在PBS中的浓度均为3～6μg/mL。

5.权利要求1所述的前列腺干细胞抗原与热休克蛋白的复合物在制备抗前列腺癌疫苗中的应用。