CN105194666B - 一种乙肝疫苗激动剂组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙肝疫苗激动剂组合物及其应用，涉及乙肝疫苗。一种乙肝疫苗激动剂组合物，由路易斯‑聚丙烯酰胺‑生物素、聚肌苷酸‑聚胞啶酸、寡脱氧核苷酸组成；其中，所述的路易斯‑聚丙烯酰胺‑生物素成分为30kd的聚丙烯酰胺含有5%摩尔的生物素和20%摩尔的碳水化合物；所述的寡脱氧核苷酸的序列为：5’‑tcgacgttcgtcgttcgtcgttc‑3’，全程硫代修饰。本发明通过DC‑SIGN、TLR3、TLR9三种受体的激动剂来刺激相应受体的高表达，从而提高DC的抗原提呈功能，促进机体的Th1免疫应答。

Description

一种乙肝疫苗激动剂组合物及其应用

技术领域

本发明涉及乙肝疫苗，具体涉及一种乙肝疫苗激动剂组合物及其应用。

背景技术

世界卫生组织报道约95%的新生儿、婴儿及青壮年按照“0,1,6”免疫程序全程接种乙肝疫苗后产生的乙肝表面抗体(抗-HBs)可达到保护性水平(抗-HBs≥10mIU/ml)，但仍有5-10%的个体不能产生保护性抗体，并将这部分因免疫失败而不能产生保护性抗体者称为乙肝疫苗无应答者(抗-HBs<10mIU/ml)。此外，由于随着时间的延长乙肝表面抗体水平会下降，原来处于乙肝疫苗弱应答水平(10mIU/ml≤抗-HBs≤100mIU/ml)者，即乙肝疫苗弱应答者，可能变成乙肝疫苗无应答者。由于乙肝疫苗无弱应答者机体中无保护性抗体或抗体水平低下，感染 HBV的易感性升高。同时，乙肝疫苗的无弱应答现象为我国乙肝防治带来挑战。因此，研究如何采取有效的措施提高乙肝疫苗的免疫活性，进而降低人群中乙肝疫苗无弱应答水平，将有助于控制我国的乙肝流行。

HBsAg为胸腺依赖性抗原，其诱导机体产生抗-HBs必需经抗原提呈(形成抗原肽-MHC 分子复合物)、辅助性T淋巴细胞(Th)识别及 B淋巴细胞激活与分化三个基本环节，需要多种免疫细胞与分子(共刺激分子和各类细胞因等)的共同参与，这个复杂过程中任一环节出现问题，均可能导致机体对乙肝疫苗应答水平低下或无应答。

抗原提呈是乙肝疫苗免疫应答过程中最关键的环节之一。树突状细胞(Dendriticcell, DC )是一类专职的抗原提呈细胞，具有激活初始 T细胞的独特功能，是联系固有免疫与获得免疫、初次免疫应答和再次免疫应答的纽带。DC捕获抗原后，将迁移至二级淋巴器官，通过表达高水平的淋巴细胞共刺激分子和主要组织相容性复合体，并分泌生物活性分子以活化和调节 T 淋巴细胞和 B淋巴细胞的免疫应答。现知DC 的免疫调节作用，与 DC表面诸多受体分子，尤其作为模式识别受体(天然免疫受体)的Toll 样受体(Toll-likereceptors, TLRs)及 C型凝集素受体(C-type Lectins Receptor, CLR) 两大家族分子的模式识别与正负调控有关。

C型凝集素受体中 DC 特异性细胞间黏附分子-3 结合的非整合素( Dendriticcell specific intercellular adhesionmolecule3-grabbing non integrin, DC-SIGN)又称CD209，是 DC 特异性的膜表面分子。DC-SIGN 是 II 型跨膜的 CLRs，高表达于单核细胞来源的 DC 细胞、一些巨噬细胞和活化的 B 细胞上。作为兼具 PRR和细胞黏附功能的天然免疫分子，DC-SIGN可通过分子中凝集素糖识别域(CRD)识别多种病原体的外源性和机体内源性抗原以及细胞表面黏附分子中的甘露糖、岩藻糖等糖类基团，介导DC等参与病原体或肿瘤细胞的免疫逃逸，也可调节DC黏附迁移并在炎症启动中激活初始T细胞免疫应答，因而DC-SIGN在 DC 参与的感染性和炎症性疾病等的正负免疫调节中发挥关键作用。DC-SIGN 的天然配体包括高甘露糖型寡糖和含有路易斯型决定簇的海藻糖，如Le^X和 Le^B。

TLRs通过增强抗原提呈细胞的抗原提呈活性及促进细胞因子的产生和共刺激分子的表达来提高抗原提呈细胞的功能。有研究报道显示联合的TLR刺激，尤其是TLR3和TLR7及TLR3和TLR8的配体联合，可以引起DCs的大量活化，包括上调MHC和共刺激分子的表达，及刺激IL-12和IFN-γ的高水平分泌，并增加Th1型细胞的极化能力和调节性T细胞介导的抑制转换。

目前，DC-SIGN在乙肝疫苗免疫应答中作用、刺激其高表达后对免疫应答水平产生的影响，及与TLRs(TLR3和TLR9)联合对乙肝疫苗免疫应答水平产生的影响在国内外尚未见报道。

目前乙肝疫苗使用的佐剂是氢氧化铝。现有研究指出，Th1型免疫反应作为介导细胞毒性作用和局部炎症反应的免疫应答在预防HBV感染和清除胞内病毒过程中具有更突出的作用。而铝佐剂是一种典型的Th2型免疫反应活化剂，它并不能激活体内的Th1型免疫反应。因此，开发更加安全、高效、廉价的乙肝疫苗佐剂成为近年来学术界研究的热点之一。

发明内容

本发明是为了解决现有技术存在的上述缺陷，而提供了一种乙肝疫苗激动剂组合物及其应用一种新型的乙肝疫苗。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种乙肝疫苗激动剂组合物，其特征在于，由路易斯-聚丙烯酰胺-生物素、聚肌苷酸-聚胞啶酸、寡脱氧核苷酸组成；

其中，所述的路易斯-聚丙烯酰胺-生物素成分为30kd的聚丙烯酰胺含有5%摩尔的生物素和20%摩尔的碳水化合物；

所述的寡脱氧核苷酸的序列为：5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’，全程硫代修饰。

进一步地，所述的路易斯-聚丙烯酰胺-生物素、聚肌苷酸-聚胞啶酸、寡脱氧核苷酸的质量比为5:25:10。

更进一步地，本发明公开了乙肝疫苗激动剂组合物在制备乙肝疫苗中的应用，乙肝疫苗激动剂组合物与重组酿酒酵母乙型肝炎疫苗组合使用，用于刺激乙肝疫苗无应答病人的DC-SIGN、TLR3、TLR9的高表达，提高DC的抗原提呈功能。

本发明通过将质量比为5:25:10:1的路易斯-聚丙烯酰胺-生物素、聚肌苷酸-聚胞啶酸、寡脱氧核苷酸、重组酿酒酵母乙型肝炎疫苗组合制成新型的乙肝疫苗，用于刺激乙肝疫苗无应答病人的DC-SIGN、TLR3、TLR9的高表达，提高DC的抗原提呈功能，其中重组酿酒酵母乙型肝炎疫苗由重组酿酒酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原经纯化，加铝佐剂制成。

本发明通过DC-SIGN、TLR3、TLR9三种受体的激动剂Le^X-PAA-biotin（路易斯-聚丙烯酰胺-生物素）、PolyI:C（聚肌苷酸-聚胞啶酸）、CpG ODN（寡脱氧核苷酸）来刺激相应受体的高表达，从而提高DC的抗原提呈功能，促进机体的Th1免疫应答，且与含有铝佐剂的乙肝疫苗同时免疫机体，弥补铝佐剂不能激活机体Th1型免疫反应的缺陷，进而提高乙肝疫苗的免疫应答水平。

DC-SIGN、TLR3、TLR9在 DC 参与的感染性和炎症性疾病等的正负免疫调节中发挥关键作用，可通过增强抗原提呈细胞的抗原提呈活性及促进细胞因子的产生和共刺激分子的表达来提高抗原提呈细胞的功能；本发明即通过DC-SIGN、TLR3、TLR9三种受体的激动剂来刺激相应受体的高表达，从而提高DC的抗原提呈功能，促进机体的Th1免疫应答。

具体实施方式

实施例1

一、所使用的药物成分：

（1）Le^x-PAA-biotin（Lewisx-Polyacrylamide-biotin）：即路易斯-聚丙烯酰胺-生物素，由GlycoTech公司生产，产品编号01-036，成分为30kd的聚丙烯酰胺含有5%摩尔的生物素和20%摩尔的碳水化合物，其不含有稳定剂和防腐剂。

（2）重组酿酒酵母乙型肝炎疫苗(B201109009)：由深圳康泰生物制品股份有限公司生产，其由重组酿酒酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）经纯化，加铝佐剂制成。为乳白色悬浮液体，有效成分为HBsAg，辅料为氢氧化铝和氯化钠。规格为20μg HBsAg/ml。

（3）PolyI:C（Polyinosinic acid-polycytidylic acid）：即聚肌苷酸-聚胞啶酸：由美国Sigma公司生产，白色粉剂，规格为1mg，用无菌的PBS溶解PolyI:C至浓度为5μg/μl。

（4）CpG ODN（Cytosine-phosphate-guanine-containingoligodeoxynucleotide）：即寡脱氧核苷酸，由大连宝生物有限公司合成，序列为：5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’，全程硫代修饰，用无菌的PBS溶解至浓度为1μg/μl，-20℃保存备用。

二、药物用量及使用方法：

（1）研究对象：清洁级雌性BALB/c小鼠(购置于湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，6-7周龄，体重16~20g。

（2）实验分组及每组药物用量：

第1组空白对照组：每只小鼠注射100μl生理盐水；

第2组乙肝疫苗组：每只小鼠注射100μl重组酿酒酵母乙型肝炎疫苗，即含有2μgHBsAg；

第3组Le^x-PAA-biotin+乙肝疫苗组：每只小鼠注射10μg DC-SIGN激动剂Le^x-PAA-biotin（浓度为1μg/μl）和100μl重组酿酒酵母乙型肝炎疫苗；

第4组PolyI:C+CpG ODN+Le^x-PAA+HepB组：每只小鼠注射50μg PolyI:C、20μg CpGODN、10μg Le^x-PAA及100μl重组酿酒酵母乙型肝炎疫苗。

（3）使用方法：

小鼠适应性饲养1周后开始实验，实验开始第0周和第4周分别在各组小鼠左胫前肌注射一次相应药物；期间观察各组小鼠是否有异常反应等变化。

三、药物效果

(1)各组乙肝表面抗体（抗-HBs）水平：

比较空白对照组、乙肝疫苗组、Le^x-PAA+HepB组、PolyI:C+CpG ODN+Le^x-PAA+HepB组小鼠免疫后抗-HBs水平差异，结果显示（表1）：四组间抗-HBs水平总体上有差异(P<0.05)，进一步两两比较后，Le^x-PAA+HepB组、PolyI:C+CpG ODN+Le^x-PAA+HepB组、空白对照和乙肝疫苗组间抗-HBs水平差异均有统计学意义(P<0.05)。

DC-SIGN的激动剂Le^x-PAA与含有铝佐剂的乙肝疫苗同时免疫小鼠后，可使抗-HBs水平明显升高。同时，TLR3、TLR9和DC-SIGN的激动剂PolyI:C、CpG ODN和Le^x-PAA三者联合后，也使抗-HBs水平明显升高。

表1 各组小鼠干预后的抗-HBs水平()

备注：*表示与空白对照组及乙肝疫苗组相比，P<0.05。

（2）各组免疫细胞的百分比

比较四组小鼠免疫后mDC、B细胞、CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞百分比的差异，结果显示（表2）：四组间mDC和CD8+T细胞百分比总体上有统计学差异（P<0.05），两两比较后，空白对照组、Le^x-PAA+HepB组和PolyI:C+CpG ODN+Le^x-PAA+HepB组的mDC百分比均低于乙肝疫苗组，且差异均有统计学意义（P<0.05）。PolyI:C+CpG ODN+Le^x-PAA+HepB组的CD8+T细胞百分比均高于其他三组，且差异均有统计学意义（P<0.05），提示三种激动联合与乙肝疫苗免疫小鼠后，增强了机体细胞免疫应答。

表2 各组小鼠的mDC与B细胞百分比()

*表示与乙肝疫苗组相比，P<0.05；#表示与Le^x-PAA+HepB组相比，P<0.05；&表示与前三组相比，P<0.05。

（3）各组细胞因子水平

比较四组小鼠免疫后Th1型细胞因子（IL-2和IL-12）和Th2型细胞因子（IL-6和IL-10）水平的差异，结果显示（表3）：四组间Th1型细胞因子（IL-2和IL-12）和Th2型细胞因子IL-6水平总体上有统计学差异（P<0.05），两两比较后，PolyI:C+CpG ODN+Le^x-PAA+HepB组的Th1型细胞因子（IL-2和IL-12）均高于其他三组，且差异均有统计学意义（P<0.05），而其Th2型细胞因子IL-6水平低于空白对照组（P<0.05），提示三种激动剂联合与乙肝疫苗免疫小鼠后，可增强Th1型细胞因子的分泌，进而促使机体产生Th1型细胞免疫。

表3 三组小鼠干预后脾脏中细胞因子浓度(pg/ml) ()

备注：*表示与前三组相比，P<0.05；#表示与空白对照组相比，P<0.05。

综上所述，可以看出Le^x-PAA与乙肝疫苗联合、三种受体激动剂（PolyI:C、CpGODN、Le^x-PAA）同时与乙肝疫苗联合免疫小鼠后，抗-HBs水平均较乙肝疫苗组升高，且通过检测免疫细胞和细胞因子后发现，三种受体激动剂（PolyI:C、CpG ODN、Le^x-PAA）同时与乙肝疫苗联合组的CD3+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞百分比及Th1型细胞因子（IL-2和IL-12）的水平均明显高于乙肝疫苗组，这提示三种受体的激动剂（PolyI:C、CpG ODN、Le^x-PAA）同时与乙肝疫苗联合免疫小鼠后，通过提高Th1型反应来提高抗-HBs水平，以弥补乙肝疫苗中铝佐剂不能激活机体Th1型免疫反应的缺陷。此发现目前国内外尚未见报道。同时，三种受体的激动剂在制作工艺上已很成熟，其中在疫苗免疫方面研究较少的DC-SIGN激动剂Le^x-PAA为多聚糖类，可大规模生产并几乎无免疫原性，其作为疫苗佐剂，副作用也可能较低。

Claims (1)

1.一种乙肝疫苗，其特征在于，由质量比为40:1的激动剂组合物与重组酿酒酵母乙型肝炎疫苗混合而成；

所述的激动剂组合物由质量比为5:25:10的路易斯-聚丙烯酰胺-生物素、聚肌苷酸-聚胞啶酸、寡脱氧核苷酸组成；

其中，所述的路易斯-聚丙烯酰胺-生物素成分为30kd的聚丙烯酰胺含有5%摩尔的生物素和20%摩尔的碳水化合物；

所述的寡脱氧核苷酸的序列为：5’-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3’，全程硫代修饰；

所述的重组酿酒酵母乙型肝炎疫苗由重组酿酒酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原经纯化，加铝佐剂制成。