JPWO2014129412A1 - 免疫原性ポリペプチド表層発現ビフィズス菌 - Google Patents
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Abstract
Description
該遺伝子は、該免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を含み、
該免疫原性ポリペプチドが、基盤ドメインおよび少なくとも1つの抗原ペプチドを含むC型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドであり、
該基盤ドメインが、
(1)配列番号16のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号17のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(3)配列番号18のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド;および
(4)配列番号19のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド;
からなる群より選択される1つ以上を含み、
該抗原ペプチドが、配列番号4〜15のアミノ酸配列を含むペプチドならびに配列番号4〜15のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも1つであり、
該少なくとも1つの抗原ペプチドが、該基盤ドメインのN末端側およびC末端側のいずれかに連結される。
(1)前記基盤ドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのN末端側に、QSFLATCINGVCWTVYHGAG(配列番号4)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、C末端側に、EIPFYGKAI(配列番号7)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域、あるいはEIPFYGKAI(配列番号7)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、KLSALGVNA(配列番号9)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびVATDALMTGYTGDFDSVIDC(配列番号10)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか;
(2)前記基盤ドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのN末端側に、QSFLATCINGVCWTVYHGAG(配列番号4)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、C末端側に、EIPFYGKAI(配列番号7)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド;KLSALGVNA(配列番号9)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド;およびVATDALMTGYTGDFDSVIDC(配列番号10)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか;
(3)前記基盤ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのN末端側に、QSFLATCINGVCWTVYHGAG(配列番号4)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、C末端側に、TPAETSVRLRAYLNTPG(配列番号15)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか;または
(4)前記基盤ドメインは、配列番号19のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドドを含み、C末端側に、配列番号16のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、EIPFYGKAI(配列番号7)を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、KLSALGVNA(配列番号9)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびVATDALMTGYTGDFDSVIDC(配列番号10)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結する。
立体構造を保持し、かつ細胞分泌能を有する基盤ドメインおよび少なくとも1つの抗原ペプチドを選択する工程;ならびに
該少なくとも1つの抗原ペプチドを、該基盤ドメインのN末端側およびC末端側のいずれかに連結した合成ポリペプチドを設計する工程
を含む。
本発明において、「ビフィズス菌」とは、ビフィドバクテリウム属に属する微生物をいう。ビフィズス菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、ビフィドバクテリウム・アングラタム(B. angulatum)、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・アニマリス(B. animalis subsp. animalis)、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・ラクティス(B. animalis subsp. lactis)、ビフィドバクテリウム・アステロイデス(B. asteroides)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(B. bifidum)、ビフィドバクテリウム・ボウム(B. boum)、ビフィドバクテリウム・ブレベ(B. breve)、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム(B. catenulatum)、ビフィドバクテリウム・ケリナム(B. choerinum)、ビフィドバクテリウム・コリネフォーム(B. coryneforme)、ビフィドバクテリウム・クニクリ(B. cuniculi)、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス(B. denticolens)、ビフィドバクテリウム・デンティウム(B. dentium)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(B. gallicum)、ビフィドバクテリウム・ガリナラム(B. gallinarum)、ビフィドバクテリウム・グロボサム(B. globosum)、ビフィドバクテリウム・インディカム(B. indicum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(B. infantis)、ビフィドバクテリウム・イノピナタム(B. inopinatum)、ビフィドバクテリウム・ラクティス(B. lactis)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(B. longum)、ビフィドバクテリウム・マグナム(B. magnum)、ビフィドバクテリウム・メリシカム(B. merycicum)、ビフィドバクテリウム・ミニマム(B. minimum)、ビフィドバクテリウム・パーブロラム(B. parvulorum)、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム(B. pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・グロボスム(B. pseudolongum subsp. globosum)、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・シュードロンガム(B. pseudolongum subsp. pseudolongum)、ビフィドバクテリウム・プロルム(B. pullorum)、ビフィドバクテリウム・ルミナル(B. ruminale)、ビフィドバクテリウム・ルミナンティアム(B. ruminantium)、ビフィドバクテリウム・セクラル(B. saeculare)、ビフィドバクテリウム・スカードビ(B. scardovii)、ビフィドバクテリウム・ズブチル(B. subtile)、ビフィドバクテリウム・スイス(B. suis)、ビフィドバクテリウム・サームアシドフィルム(B. thermacidophilum)、およびビフィドバクテリウム・サームフィルム(B. thermophilum)が挙げられる。また、これらの耐性株または変異株を用いてもよい。
GNB/LNB基質結合膜タンパク質(GLBP)は、ビフィズス菌が有するラクト−N−ビオース(すなわち、N−アセチル−3−O−(β−D−ガラクトピラノシル)−D−グルコサミン)およびガラクト−N−ビオース(すなわち、N−アセチル−3−O−(β−D−ガラクトピラノシル)−D−ガラクトサミン)を輸送するABCタンパク質(ATP Binding Cassette protein)ファミリーに属する膜タンパク質である。ABCタンパク質とは、ATP(アデノシン3リン酸)というエネルギーを使用し、すべての生物の細胞膜上で特異的な物質の輸送を能動的に行う重要な膜タンパク質であり、細胞膜上に多種のABCタンパク質が存在している。そのため、ABCタンパク質であるGLBPは、GLBP表層発現のための細胞機能が備わっているビフィドバクテリウム属細菌(ビフィズス菌)において、適切なプロモーターを利用すれば、ビフィズス菌では普遍的に発現する。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムJCM1217(ATCC15707)株由来のGLBPは、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する(対応する塩基配列は配列番号1に示す)。
本発明においては、ビフィズス菌の表層に発現させるための免疫原性ポリペプチドは、立体構造を保持し、かつ細胞分泌能を有する基盤ドメインと、少なくとも1つの抗原ペプチドとで構成される。該少なくとも1つの抗原ペプチドは、該基盤ドメインのN末端側およびC末端側のいずれかに連結される。
(1)疎水性:イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、アラニン、トリプトファン、グリシン;
(2)中性親水性:システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン;
(3)酸性:アスパラギン酸、グルタミン酸;
(4)塩基性:ヒスチジン、リジン、アルギニン;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:グリシン、プロリン;
(6)芳香族:トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン;および
(7)小さなアミノ酸:グリシン、アラニン、セリン。
1067位〜1086位:QSFLATCINGVCWTVYHGAG(CD8エピトープ1:配列番号4)、
1169位〜1177位:LLCPSGHVV(CD8エピトープ2:配列番号5)、
1291位〜1298位:ITYSTYGK(CD8エピトープ3:配列番号6)、
1372位〜1380位:EIPFYGKAI(CD8エピトープ4:配列番号7)、
1391位〜1399位:LIFCHSKKK(CD8エピトープ5:配列番号8)、
1406位〜1414位:KLSALGVNA(CD8エピトープ6:配列番号9)、
1435位〜1454位:VATDALMTGYTGDFDSVIDC(CD8エピトープ7:配列番号10)、および
1629位〜1637位:GAVQNEVTL(CD8エピトープ8:配列番号11)であり、CD4エピトープは、
1130位〜1149位:LYLVTRHADVIPVRRRGDSR(CD4エピトープ1:配列番号12)、
1202位〜1220位:ETTMRSPVFTDNSTPPAVP(CD4エピトープ2:配列番号13)、
1303位〜1330位:GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG(CD4エピトープ3:配列番号14)、および
1531位〜1547位:TPAETSVRLRAYLNTPG(CD4エピトープ4:配列番号15)である。
(1)HCV−1b型抗原ポリペプチドのNS3タンパク質のリンカー部位(1196位〜1215位)およびN末端側β−α−βドメイン(1216位〜1350位)に基づく基盤ドメイン(図2)
VPVESMETTMRSPVFTDNSTPPAVPQSFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPNIRTGVRTITTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATAT(配列番号16);
(2)HCV−1b型抗原ポリペプチドのNS3タンパク質のα−ヘリカルドメイン(1510位〜1657位)に基づく基盤ドメイン(図8)
GMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETSVRLRAYLNTPGLPVCQDHLEFWESVFTGLTHIDAHFLSQTKQAGDNFPYLVAYQATVCARAKAPPPSWDQMWKCLIRLKPTLHGPTPLLYRLGAVQNEVTLTHPITKFIMACMSADLEVVT(配列番号17);
(3)HCV−1b型ポリペプチドのNS3タンパク質のC末端側β−α−β−ドメイン(1510位〜1657位)に基づく基盤ドメイン(但し、1351位〜1353位の3アミノ酸が欠失し、そしてNS3の下流側β−α−β−ドメインの1398〜1399位の2つのK(リジン)をQ(グルタミン:1398位)、L(ロイシン:1399位)に置換したもの)(図9)
SVTVPHPNIEEVALSNTGEIPFYGKAIPLEAIKGGRHLIFCHSKQLCDELAAKLSALGVNAVAYYRGLDVSIIPTSGDVVVVATDALMTGYTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLDPTFTIETTTVPQDAVSRSQMQGRTGRGRGGIYRFVTPGERPS(配列番号18);および
(4)NS4A領域の一部(例えば、1677位〜1690位)をN末端に連結したNS3タンパク質のβ−バレルドメイン(1027位〜1195位)に基づく基盤ドメイン(但し、1027〜1028位の2アミノ酸および1195位のアミノ酸が欠失し、そして1144〜1145位の2つのR(アルギニン)をQ(グルタミン:1144位)、L(ロイシン:1145位)に置換したもの)(図10)
TGSVVIVGRIILSGITAYSQQTRGLLGCIITSLTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTVYHGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWPAPPGARSMTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRQLGDSRGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLCPSGHVVGIFRAAVCTRGVAKAVD(配列番号19:図10中のTGSVVIVGRIILSG(配列番号20)はNS4A領域に由来する)。
QSFLATCINGVCWTVYHGAG(配列番号4)、
LYLVTRHADVIPVRRRGDSR(配列番号12)、
LLCPSGHVV(配列番号5)、
ETTMRSPVFTDNSTPPAVP(配列番号13)、
ITYSTYGK(配列番号6)、
GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG(配列番号14)、
EIPFYGKAI(配列番号7)、
LIFCHSKKK(配列番号8)、
KLSALGVNA(配列番号9)、
VATDALMTGYTGDFDSVIDC(配列番号10)、
TPAETSVRLRAYLNTPG(配列番号15)、および
GAVQNEVTL(配列番号11)。
本発明において、ビフィズス菌の表層に発現・提示される免疫原性ポリペプチドは、GLBPとの融合タンパク質として発現される。この融合タンパク質は、N末端からGLBPおよび目的の免疫原性ポリペプチドの順に連結されている。
以下、目的の免疫原性ポリペプチドをビフィズス菌表層に融合タンパク質として発現・提示させる形質転換ビフィズス菌の調製手順の一例について、説明する。
GLBPをコードする遺伝子および目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子は、それぞれ公知の遺伝子配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、入手可能である。例えば、任意のビフィズス菌から調製したゲノムDNAあるいはcDNAを鋳型とし、該ビフィズス菌のGLBPの構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅して取得し得る。一般に1つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、公知塩基配列または公知アミノ酸配列に基づく塩基配列とは異なる塩基配列を有する遺伝子であってもよい。
上記のように調製された各タンパク質をコードする遺伝子から、免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子または該免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子を含む組換え体DNAを調製する。免疫原性ポリペプチド表層発現カセット遺伝子は、上述したように、目的の免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子が、GLBPをコードする遺伝子の3’末端側に位置するように調製される。本発明において、組換え体DNAは、発現ベクターまたは染色体組込み型ベクター(例えば、相同組換え型ベクター)であり得る。このようなベクターの調製に用いられるプラスミドとしては、ビフィズス菌で発現可能なプラスミドであれば特に制限はない。ビフィズス菌に由来するプラスミドとしては、pTB6、pBL67、pBL78、pNAL8H、pNAL8M、pNAC1、pBC1、pMB1、pGBL8bなどが用いられる。これらのプラスミドと大腸菌のプラスミドとの複合プラスミドもまた用いられ得、例えば、pBLES100、pKKT427、pRM2などが挙げられる。
組換え体DNA、例えば、上記のように調製された発現ベクターを、宿主であるビフィズス菌に導入し、形質転換ビフィズス菌を調製することができる。
本発明のワクチン組成物は、上記形質転換ビフィズス菌を有効成分として含有する。例えば、HCV免疫原性ポリペプチドを表層発現する形質転換ビフィズス菌の場合、本発明のワクチン組成物は、HCV感染に対する適切な免疫応答を十分に誘導する量で、患者に投与され得る。
HCV−1b型ポリペプチドのNS3リンカー部位(1196位〜1215位)および上流側のβ−α−βドメイン(1216位〜1350位)に基づく基盤ドメインのN末端およびC末端にNS3由来抗原ペプチドを連結するように、図2に示す2つのアミノ酸配列を設計した。
実施例1で設計したアミノ酸配列1および2(それぞれ配列番号23および24)を基にして、ビフィズス菌のコドン使用頻度(http://www.kazusa.or.jp/codon/)にあわせた遺伝子配列1および2(それぞれ配列番号25および27;それぞれ対応するアミノ酸配列を配列番号26および28に示す)を設計し、これらの遺伝子配列情報に基づき、それぞれの遺伝子断片を全合成した(前者を「長型」、後者を「短型」ともいう)。遺伝子断片の全合成はGenScript社に委託した。得られた遺伝子断片をXhoIおよびSalIにて処理し、同様にXhoIおよびSalIにて処理した組換えプラスミドpJT101(特許文献4および非特許文献4)に挿入した。プラスミドpJT101は、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)JCM1217(ATCC15707)由来GLBP遺伝子(配列番号1および2:特許文献4および非特許文献4)を含む。上記挿入によりGLBP遺伝子の下流に「長型」または「短型」の遺伝子断片を連結させた。
上記の方法で作製したビフィドバクテリウム・ロンガム2164およびビフィドバクテリウム・ロンガム2165がGLBP−NS3融合タンパク質を正しい分子量で発現しているか、ウエスタンブロット法により確認を行った。GAM培地(「ニッスイ」:日水製薬株式会社)で一晩嫌気培養したビフィドバクテリウム・ロンガム2164およびビフィドバクテリウム・ロンガム2165を洗浄後、1%TritonX/PBSで希釈し、菌液をポリアクリルアミド電気泳動で分離した。ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに転写後、3%ウシ血清アルブミン(BSA)/0.1%Tween20/生理食塩水(PBS)を用いて4℃で一晩ブロッキングを行った。1000倍希釈rabbit anti-NS3 IgG(オペロン社:operon)、1000倍希釈goat anti-rabbit IgG HRP Conjugated(サンタクルーズ社:Santa Cruz)の順にそれぞれ室温で1時間振盪反応させ、化学発光法によりGLBP−NS3融合タンパク質の検出を行った。
形質転換ビフィドバクテリウム・ロンガムをGAM培地で一晩嫌気培養し、5×108CFU/mlとなるようPBSで希釈した。この菌液を100μlずつ8週齢のメスBALB/Cマウスに胃内経口投与を行った。投与は週3回、4週間行った。コントロールとしてPBS投与群、野生型ビフィドバクテリウム・ロンガム245投与群、およびGLBPのみ発現するビフィドバクテリウム・ロンガム2012投与群を用い、同じ条件で投与を行った。投与開始日を1日目とし、0、14、28日目に尾静脈採血を行うとともに糞便を回収した。29日目にはマウスに麻酔処置をした後、頸椎脱臼により安楽死させ、解剖し脾臓を摘出した。
糞便に含まれるNS3抗原特異的IgA抗体を酵素結合イムノソルベント(ELISA)法により検出した。糞便を5%スキムミルク/0.1mg/ml大豆トリプシン阻害剤/2mMフッ化フェニルメチルスルホニル/PBSに溶解させ、糞便溶解液を作製した。96穴イムノプレート(NUNC)にGST−NS3抗原ペプチドをコーティングし、5%スキムミルク/PBSを用いて37℃で1時間ブロッキングを行った。適当な濃度に希釈した糞便溶解液、1000倍希釈goat anti-mouse IgA HRP(Santa Cruz)の順にそれぞれ37℃で1.5時間反応させた。最後にTMB発色試薬(ベクトン・ディッキンソン社:BD)を添加し20分間発色させ、波長450nmで吸光度を測定した(OD 450)。また、同様に尾静脈採血で得た血液の血清中に含まれるNS3抗原特異的IgG抗体を1000倍希釈goat anti-mouse IgG HRP(R&Dシステムズ社:R&D)を用いてELISA法により検出した。
脾臓を70μlセルストレイナー(BD)を用いて細分化し、0.83% NH4Cl/PBSで溶血させた後、洗浄した。細胞を4×105細胞/穴となるよう10%FBS/RPMI培地で懸濁し、GST−NS3抗原ペプチド2μgで刺激しながら96穴マイクロプレートで3日間培養した。Mouse IFN-γ Quantikine ELISA Kit(R&D)を用いて、脾臓細胞の培養上清中のインターフェロンγ(IFN-γ)量を測定した。
HCV−1b型ポリペプチドのNS3 α−ヘリカルドメイン(1510位〜1657位)に基づく基盤ドメインのN末端およびC末端にNS3由来抗原ペプチドを連結するように、図8に示すアミノ酸配列を設計した。
HCV−1b型ポリペプチドのNS3 下流側β−α−β−ドメイン(1351位〜1509位)に基づく基盤ドメインのN末端およびC末端にNS3由来抗原ペプチドを連結するように、図9に示すアミノ酸配列を設計した。基盤ドメインにおいて、1351位〜1353位の3アミノ酸を欠失させ、1398〜1399位の2つのK(リジン)をQ(グルタミン:1398位)およびL(ロイシン:1399位)に置換した。
HCV−1b型ポリペプチドのNS4A領域の一部(1677位〜1690位)をN末端に連結したNS3のβ−バレルドメイン(1027位〜1195位)に基づく基盤ドメインのC末端にNS3由来抗原ペプチドを連結するように、図10に示すアミノ酸配列を設計した。基盤ドメインにおいて、1027〜1028位の2アミノ酸および1195位のアミノ酸を欠失させ、そして1144〜1145位の2つのR(アルギニン)をQ(グルタミン:1144位)およびL(ロイシン:1145位)に置換した。
マウスにHCVが感染しないことから、マウスに皮下腫瘍を作成し、その増殖抑制効果により本発明のワクチンの効果を評価するために以下の実験を行った。
皮下接種前日に体重を測定し(Day0)、形質転換体であることが確認されたNS3/4A-EL4細胞をC57BL/6Nマウスの皮下に移植した。移植は、1×106 個の細胞を200μl のRPMI1640&マトリゲルに包埋して皮下接種した。皮下接種日をDay1として、NS3/4Aタンパク質を表層発現するビフィズス菌の経口投与実験を開始した。
Claims (13)
- ビフィズス菌の表層に免疫原性ポリペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子であって、
該遺伝子が、該免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子を含み、
該免疫原性ポリペプチドが、基盤ドメインおよび少なくとも1つの抗原ペプチドを含むC型肝炎ウイルス抗原ポリペプチドであり、
該基盤ドメインが、
(1)配列番号16のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号17のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(3)配列番号18のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド;および
(4)配列番号19のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド;
からなる群より選択される1つ以上を含み、
該抗原ペプチドが、配列番号4〜15のアミノ酸配列を含むペプチドならびに配列番号4〜15のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択される少なくとも1つであり、
該少なくとも1つの抗原ペプチドが、該基盤ドメインのN末端側およびC末端側のいずれかに連結される、
ビフィズス菌表層発現遺伝子。 - 請求項1に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子であって、
(1)前記基盤ドメインが、配列番号16のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのN末端側に、QSFLATCINGVCWTVYHGAG(配列番号4)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、C末端側に、EIPFYGKAI(配列番号7)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域、あるいはEIPFYGKAI(配列番号7)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、KLSALGVNA(配列番号9)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびVATDALMTGYTGDFDSVIDC(配列番号10)もしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか;
(2)前記基盤ドメインが、配列番号17のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのN末端側に、QSFLATCINGVCWTVYHGAG(配列番号4)を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、C末端側に、EIPFYGKAI(配列番号7)を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド;KLSALGVNA(配列番号9)を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド;およびVATDALMTGYTGDFDSVIDC(配列番号10)を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか;
(3)前記基盤ドメインが、配列番号18のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、該基盤ドメインのN末端側に、QSFLATCINGVCWTVYHGAG(配列番号4)を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結し、C末端側に、TPAETSVRLRAYLNTPG(配列番号15)を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結するか;または
(4)前記基盤ドメインが、配列番号19のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、C末端側に、配列番号16のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該アミノ酸配列を少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、EIPFYGKAI(配列番号7)を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、KLSALGVNA(配列番号9)を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、およびVATDALMTGYTGDFDSVIDC(配列番号10)を含むペプチドもしくは該アミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを含む領域を連結する、
ビフィズス菌表層発現遺伝子。 - ビフィズス菌由来のGNB/LNB基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、前記免疫原性ポリペプチドをコードする遺伝子が、該ビフィズス菌由来のGNB/LNB基質結合膜タンパク質の3’末端側に位置している、請求項1または2に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
- 請求項3に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含む、遺伝子発現用ベクター。
- 請求項4に記載のベクターを保持し、前記免疫原性ポリペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
- ゲノム中に、請求項3に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含み、前記免疫原性ポリペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
- 請求項5または6に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、C型肝炎ワクチン組成物。
- 経口ワクチンである、請求項7に記載のワクチン組成物。
- ビフィズス菌の表層に発現させるための免疫原性ポリペプチドを設計する方法であって、 立体構造を保持し、かつ細胞分泌能を有する基盤ドメインおよび少なくとも1つの抗原ペプチドを選択する工程;ならびに
該少なくとも1つの抗原ペプチドを、該基盤ドメインのN末端側およびC末端側のいずれかに連結した合成ポリペプチドを設計する工程
を含む、方法。 - 前記基盤ドメインが、少なくとも1つのCD4エピトープもしくはCD8エピトープまたはその両方を含む、請求項9に記載の方法。
- 癌細胞の表層で特異的に発現するポリペプチドを、細胞表層で発現する形質転換ビフィズス菌。
- ビフィズス菌由来のGNB/LNB基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項11の形質転換ビフィズス菌。
- 請求項11または12に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、癌ワクチン。
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