KR20110045010A

KR20110045010A - Ｃ형 간염의 치료를 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20110045010A
Application number: KR1020117003943A
Authority: KR
Inventors: 피터 엠. 라우어; 토마스 떠블유 주니어 듀벤스키
Original assignee: 아두로 바이오테크
Priority date: 2008-07-24
Filing date: 2009-07-23
Publication date: 2011-05-03
Also published as: JP2011529077A; WO2010011870A3; EP2331123A4; CN102149406A; CA2731842A1; AU2009273949A1; US20120100170A1; WO2010011870A2; EP2331123A2

Abstract

본 발명은 하나 이상의 C형 간염 바이러스(HCV) 항원을 이런 항원을 재조합적으로 암호화하고 발현하는 박테리아를 사용하여 전달하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 박테리아 플랫폼은 약화되고 죽었지만 대사적으로 활성형인 리스테리아 모노사이토제니스의 사용을 포함한다.

Description

Ｃ형 간염의 치료를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF HEPATITIS C}

연방 정부가 후원한 연구 또는 개발에 관한 진술

본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 승인 번호 1 U01 AI070834-01 하에, 부분적으로는 미국 정부의 지지하에 만들어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대하여 일정 권리를 행사할 수 있다.

본 발명은 일반적으로 C형 간염 감염을 앓고 있거나 앓을 위험이 있는 개체의 치료에 대한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 하나 이상의 C형 간염 바이러스(HCV) 항원을, 이런 항원을 재조합적으로 암호화하고 발현하는 박테리아를 사용하여 전달하기 위한 조성물 및 방법에 대한 것이다.

본 발명의 배경에 대한 다음의 논의는 단지 독자에게 본 발명을 이해시키기 위한 목적으로 제공하며, 본 발명에 대하여 종래 기술을 묘사하거나 구성하는 것을 승인하지 않는다.

전 세계적으로 C형 간염은 질병률 및 사망률의 주된 요인이다. 전세계적으로 1억7천만 명의 사람이 HCV에 감염된 것으로 추측되고, 거의 4백만 명의 사람들이 미국에서 만성적으로 감염되었고, 9백만 명까지의 사람들이 유럽에서 만성으로 감염되었다. 급성 질환은 회복, 전격성 간염, 정상 간 기능의 간섭 기간이 있는 간염의 재발, 불분명한 만성 감염, 만성 활성 간염 및 간경변에 이를 수 있다. HCV에 노출된 이들의 80%가 만성적으로 감염되고, 보균자의 적어도 30%가 간경변 및 간세포 암을 포함하는 만성 간질환으로 발달한다.

선진국에서의 만성 HCV 감염이 있는 환자의 관리를 위한 최근의 표준인, 인터페론-α(IFN-α) 및 리바비린은 가장 우세한 HCV 유전자형 1-3 사이에서 특이한 효과가 증명되었다. HCV 유전자형 2 및 3을 갖는 환자들의 대략 80%에서 효과적인 반면, HCV 유전자형 1에 만성적으로 감염된 환자의 약 50%만이 IFN-α/리바비린을 사용한 치료 후에 지속적인 바이러스 반응을 나타냈다. 미국에서 만성 HCV 감염의 70-80% 사이가 유전자형 1이다. 게다가, IFN-α 및 리바비린의 독성 및 내성 프로파일이 HCV 치료에서의 그들의 사용을 제한한다.

그럼에도 불구하고 면역-기반 치료 및 바이러스 프로테아제(NS3) 및 바이러스 폴리머라아제(NS5B)와 같은 특정 HCV 유전자 산물의 기능을 표적하는 소분자를 포함하는 다수의 조사 약물이 임상적 개발에 있다. 예를 들면, IC41은 7개의 상응하는 C형 간염 바이러스(HCV) T-세포 에피토프 및 T 헬퍼 세포(Th)1/Tc1 아주번트 폴리-L-아르기닌을 함유하는 합성 펩티드 백신이다. IC41은 전하는 바에 의하면 건강한 지원자에서 HCV-특이적 인터페론(IFN)-감마-분비 CD4+ 및 CD8+를 유도하였다. 전하는 바에 의하면 재조합 HCV NS3 및 NS5B 단백질은 M-ISA720 및 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 아주번트 혼합물과 함께 또한 CD4(+) 및 CD8(+) T 세포 반응을 유도하였다. 이들 접근법의 어느 것도 만성 HCV 구성에서 관리의 현행의 표준을 넘는 뛰어난 효과 및 관용을 아직 구축하지 못했다.

발명의 개요

본 발명은 하나 이상의 C형 간염 바이러스(HCV) 항원을, 이런 항원을 재조합적으로 암호화 하고 발현하는 박테리아를 사용하여 전달하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명의 첫 번째 측면에서, 본 발명은 개체에서 C형 간염 바이러스(HCV)에 대한 T-세포 반응을 유도하는 방법에 대한 것이다. 이들 방법은 하나 이상의 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 발현하는 박테리아를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 방법을 포함하고, 폴리펩티드의 아미노산 서열은

(ⅰ) 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질;

(ⅱ) (ⅰ)에서의 하나 이상의 전장 HCV 단백질로부터 유래한 하나 이상의 면역원성 아미노산 서열; 또는

(ⅰ)의 하나 이상의 전장 HCV 단백질 및 (ⅱ)의 하나 이상의 아미노산 서열의 조합을 포함한다.

본 발명에서 기술한 것과 같이, 이런 방법은 상기 개체에서 재조합적으로 발현된 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드에 대하여 항원-특이적 T 세포(CD4+ 및/또는 CD5+) 반응을 자극시킬 수 있다. 바람직하게는, 개체로 전달했을 때, 본 발명의 조성물은 상기 전달 후 24시간에서 IL-12p70, IFN-γ, IL-6, TNF α, 및 MCP-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질의 하나 이상, 바람직하게는 각각의 혈청 농도에서 증가를 유도하고; 박테리아에 의해 발현되는 하나 이상의 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드에 대한 CD4+ 및/또는 CD8+ 항원-특이적 T 세포 반응을 유도한다.

본 발명의 관련된 측면에서, 본 발명은 개체에서 C형 간염 바이러스(HCV)에 대한 T-세포 반응을 유도하는데 유용한 조성물에 대한 것이다. 이런 조성물은 핵산 분자를 포함하는 박테리아를 포함하고, 핵산 분자의 서열은 하나 이상의 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 암호화하며, 폴리펩티드의 아미노산 서열은

그리고 다른 관련된 측면에서, 본 발명은 분리된 핵산 분자에 대한 것이고, 핵산 분자의 서열은 하나 이상의 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 암호화하고, 폴리펩티드의 아미노산 서열은

적당한 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드 서열을 선별하는 방법을 아래에서 상세히 설명하고, 대표적인 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드 서열을 제공한다. 선별 방법은 리스테리아 ActA-N100의 최대 소수성을 넘는 소수성 범위를 갖지 않는 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열의 선별을 포함할 수 있고; 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열의 선별이 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅰ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측하였고; 및/또는 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열의 선별이 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅱ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측하였다. CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 반응을 생성하기 위한 이런 폴리펩티드의 능력은 본 발명에서 상세하기 기술한 다양한 방법 및 당업계에서 잘 알려진 것들에 의해 확인할 수 있다.

어떤 구체예에서, 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 전장 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열; 이런 전장 HCV 항원에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 단편; 및 이런 단편과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 전장 NS3, 전장 NS5b, NS3에서 유래한 아미노산 서열, 및 NS5b에서 유래한 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 유래한 아미노산 서열은 NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열; NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열; NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.

상기 아미노산 서열에 대한 공급 물질로서 제공될 수 있는 다수의 HCV 분리물이 당업계에 알려져 있다. 바람직한 구체예에서, 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및/또는 NS5b 아미노산 바람직하게는 유전자형 1 HCV 보존 서열로부터 나온, 및 더욱 바람직하게는 유전자형 1a 또는 1b 보존서열로부터 나온 보존 서열이다. 대표적인 보존 서열은 아래에서 제공한다. 단백질의 서열은 하나 이상의 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다.

특히 바람직한 HCV 항원 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 및 83으로 구성되는 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 각각을 포함한다.

시겔라 플렉스너리(Shigella flexneri), 에셰리키아 콜리(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 또는 마이코박테리아 종(mycobacterium species)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다수의 박테리아 종은 백신으로서 사용되기 위해 개발되었고, 본 발명에서 백신 플랫폼으로서 사용할 수 있다. 이 목록은 제한하는 것을 의미하지 않는다. 본 발명은 백신 플랫폼으로서 약화되고, 공생하고 및/또는 죽었지만 대사적으로 활성인 박테리아 균주의 사용을 고려한다. 바람직한 구체예에서 박테리아는 박테리아를 통해 발현시키기 위한 본 발명의 하나 이상의 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 리스테리아 모노사이토제니스이다. 이 핵산은 가장 바람직하게는 박테리아의 유전체에 통합되어 있다. 약화되고 죽었지만 대사적으로 활성형인 리스테리아 모노사이토제니스가 특히 바람직하고, actA 및/또는 inlB에서 약화 돌연변이를 지니고 있는 리스테리아 모노사이토제니스를 아래의 바람직한 구체예에서 기술한다.

본 발명에서 기술한 백신 조성물은 숙주에게 단독 또는 약학적으로 허용 가능한 첨가제와의 조합 중 어느 하나로 HCV 감염에 대하여 적당한 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 투여할 수 있다. 개체에서 T 세포 반응을 유도하기 위해 선택된 바람직한 조건은 개체에게 정맥 내로 백신 플랫폼을 투여하는 단계를 포함하고; 그러나, 투여는 경구, 정맥, 피하, 진피, 피내, 근육 내, 점막, 비경구, 장기 내, 병변 내, 비강 내, 흡입, 안 내, 혈관 내, 마디 내, 난절법에 의해, 직장, 복막 내, 또는 다양한 잘 알려진 투여 경로의 임의의 하나 또는 조합일 수 있다.

어떤 바람직한 구체예에서, 개체가 첫 번째 면역 반응에 대한 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 함유하는 백신의 유효량을 투여 받은 다음, 두 번째 백신을 투여한다. 이것은 당업계에서 "프라임-부스트" 요법으로 지칭된다. 이런 요법에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 "프라임" 전달로서, "부스트" 전달로서, 또는 "프라임" 및 "부스트" 둘 다로서 사용될 수 있다. 이런 요법의 예시는 아래에서 기술한다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 리스테리아 모노사이토제니스는 구조적으로 활성인 상태로 발현된 prfA 전사 인자를 막는 prfA 유전자에서의 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, PrfA* 돌연변이(G155S)가 프라임-부스트 정맥 또는 근육 내 면역화 요법 후에 기능적 세포 면역을 향상시키는 것을 보여주었다.

어떤 구체예에서, 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 번역틀에 맞는 분비 신호 서열을 포함하는 하나 이상의 융합 단백질로서 발현되고, 그것에 의해 박테리아에 의한 가용성 HCV 항원 폴리펩티드의 분비를 야기한다. 박테리아 발현 시스템에서 사용하기 위한 다수의 대표적인 신호 서열이 당업계에 알려져 있다. 박테리아가 리스테리아 모노사이토제니스인 경우에서, 분비 신호 서열은 리스테리아 모노사이토제니스 신호 서열, 가장 바람직하게는 ActA 신호 서열인 것이 바람직하다. 추가적인 ActA 또는 다른 링커 아미노산이 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드에 융합되어 또한 발현될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 번역틀에 맞는 ActA-N100 서열(예컨대, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는) 또는 상기 ActA-N100 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현된다.

바람직한 구체예에서, 백신 조성물은

(a) 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 actA-N100 서열 또는 이 ActA-N100 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(b) NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열 또는 NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및

(c) NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열 또는 NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 리스테리아 모노사이토제니스를 포함하고;

융합 단백질은 리스테리아 모노사이토제니스 ActA 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열로부터 발현된다. 특히 바람직한 구체예에서, (c)의 아미노산 서열은 NS5b의 1-342 아미노산(그리고 바람직하게는 서열번호 18 또는 서열번호 19의 1-342 아미노산을 포함하는) 또는 돌연변이가 NS5b의 RNA 폴리머라아제 활성을 불활성화시키는 이의 돌연변이 유도체(그리고 바람직하게는 서열번호 22 또는 서열번호 23에서 묘사된 돌연변이)를 포함하고, (b)의 아미노산 서열은 172-484 아미노산(그리고 바람직하게는 서열번호 13 또는 서열번호 14의 172-484 아미노산을 포함하는) 또는 돌연변이가 NS3의 헬리카아제 활성을 불활성화시키는 이의 돌연변이 유도체(그리고 바람직하게는 서열번호 20 또는 서열번호 21에서 묘사된 돌연변이)를 포함한다.

리스테리아 모노사이토제니스 박테리아로부터 발현된 경우에서, 어떤 구체예에서 HCV 항원 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 리스테리아 모노사이토제니스에 의한 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 아래에서 기술한 것과 같이, 다른 유기체는 종종 "코돈 성향", 즉, 유기체 사이에서 의미있게 바뀌는 유전학적 코드에서 나타나는 특정 아미노산을 암호화하는 어떤 주어진 코돈에 대한 정도를 나타낸다. 일반적으로, 유전자가 함유하는 코돈이 더 희귀하면 할 수록, 다른 기원의 단백질이 특정 숙주 시스템 내에서 합리적인 수준으로 발현될 것이 가능하지 않다. 이 수준은 희귀 코돈이 클러스터 또는 단백질의 N-말단 부위에서 나타날 때 더 낮게 된다. 아미노산 서열을 변형하지 않고 희귀 코돈을 숙주 시스템의 코돈 선호도에 더욱 가까이 반영하는 다른 것으로 대체하는 것은 기능성 단백질 발현의 수준을 증가시킬 수 있다. 코돈 최적화의 방법은 아래에서 기술한다.

본 발명의 방법 및 조성물은 예방약으로서 또는 치료용 HCV 백신으로서의 용도 모두를 찾을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 개체는 이전에 만성 HCV 감염으로 진단된 것에 기초하여 본 발명의 조성물을 받는 것으로 선발된다.

본 발명이 구성의 상세 사항에 대한 그것의 용도 및, 하기 기술에 진술하거나 도면에서 묘사한 구성 요소의 배열에 한정되지 않음이 이해될 것이다. 본 발명은 구체예에 추가하여 기술된 것들 및 여러 방법으로 시험되고 수행되는데 능숙하다. 또한, 본 발명뿐만 아니라 요약에서 사용한 표현 및 용어는 설명을 위한 것이며 한정하려는 의도가 아님이 이해될 것이다. 그로써, 당업자는 이 명세서를 기반으로 한 개념이 본 발명의 몇몇의 목적을 수행하기 위한 다른 구조, 방법 및 시스템의 설계에 대한 기반으로서 용이하게 사용될 것을 올바로 인식할 것이다. 그러므로 청구항이 본 발명의 정신 및 범주에서 벗어나지 않는 한 동등한 구성을 포함하는 것으로 여겨지는 것이 중요하다.

본 발명 및 이의 여러 특징 및 유리한 세부 사항을 수반하는 도면에서 나타내고, 하기 상세한 설명에서 상세히 기술한 비-제한적 구체예의 언급과 함께 더욱 충분히 설명한다. 도면에 묘사한 특징은 반드시 일정한 크기를 확대하여 그린 것이 아님을 주목해야 한다. 잘 알려진 구성요소 및 기술의 공정의 기술은 본 발명을 불명확하게 하므로 생략한다. 본 발명에서 사용한 예시는 단지 당업자가 본 발명을 실시할 수 있고, 실시하는 것을 더욱 가능하게 하기 위한 수단의 이해를 용이하게 하는 것을 의도한다. 따라서, 예시는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 도면에서, 참고문헌과 같이, 숫자는 몇몇의 관점 전체에 상응하는 부분을 지정한다.
도 1은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 백신 균주 ANZ-521의 유도의 도식을 묘사한다.
도 2는 리스테리아 모노사이토제니스 ANZ 100의 inlB 유전자 자리에 삽입된 HCV NS5B-NS3 항원 발현 카세트의 도식을 묘사한다.
도 3은 리스테리아 모노사이토제니스 ANZ-521의 구축에서 사용된 여러 컨스트럭트를 묘사한다.
도 4는 HCV NS5A 및 NS3의 면역원성 에피토프의 지도를 만들기 위하여 사용한 펩티드를 묘사한다.
도 5는 HCV NS5A 및 NS3의 면역원성 에피토프의 펩티드 매핑을 묘사한다.
도 6은 마우스에서 NS3- 및 NS5b-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역을 묘사한다.
도 7은 유전자형 1 보존 서열에 기초하여 HCV 코어, NS3, 및 NS5b 항원에 융합된 ActA-N100에 대한 카이트-두리틀(Kyte-Doolittle) 친수도 도표를 묘사한다.
도 8은 여러 ActA-N100 HCV 항원 융합의 리스테리아에 의한 항원 발현을 묘사한다. 패널 A는 레인 3, 4, 및 5에서 코어 서열 1-190, 1-180, 및 1-177을 보여준다. 패널 B는 레인 3-10에서 NS3 서열 1-631, 1-484, 22-631, 22-484, 22-280, 172-484, 172-631, 및 416-631을 보여준다. 패널 C는 레인 3-7에서 NS5 서열 1-574, 1-342, 320-591, 및 320-574를 보여준다. 각각의 패널에서 레인 1 및 2는 리스테리아 모노사이토제니스 CRS-207에 의한, 항원이 삽입되지 않았을 때 및 메소테린 발현을 보여주는 음성 및 양성 대조군이다.

본 발명은 하나 이상의 C형 간염 바이러스(HCV) 항원을 암호화하고 발현하는 박테리아를 사용하여 활성 면역 요법의 전달에 대한 조성물 및 방법에 대한 것이다.

본 발명이 구성의 상세 사항에 대한 그것의 용도 및, 하기 기술에 진술하거나 도면에서 묘사한 구성 요소의 배열에 한정되지 않음이 이해될 것이다. 본 발명은 구체예에 추가하여 기술된 것들 및 여러 방법으로 시험하고 수행하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명뿐만 아니라 요약에서 사용한 표현 및 용어는 설명을 위한 것이며 한정하려는 의도가 아님이 이해될 것이다.

그로써, 당업자는 이 명세서를 기반으로 한 개념이 본 발명의 몇몇의 목적을 수행하기 위한 다른 구조, 방법 및 시스템의 설계에 대한 기반으로서 용이하게 사용될 것을 올바로 인식할 것이다. 그러므로 청구항이 본 발명의 정신 및 범주에서 벗어나지 않는 한 동등한 구성을 포함하는 것으로 여겨지는 것이 중요하다.

1. 정의

유전자에서의 돌연변이, 또는 유전자를 포함하는 박테리아에서의 돌연변이를 가리키는데 사용한 생략법은 하기와 같다. 예시의 수단으로, 생략법 "리스테리아 모노사이토제니스 ΔActA"는 ActA 유전자의 일부 또는 모두가 결실되었다는 의미이다. 델타 기호(Δ)는 결실을 의미한다. 윗첨자 마이너스 기호(리스테리아 ActA ^- )를 포함하는 생략법은 ActA 유전자가 예컨대, 결실, 점 돌연변이, 또는 프레임쉬프트 돌연변이의 방법에 의해 돌연변이된 것을 의미하지만, 이들 타입의 돌연변이에 제한되지 않는다.

인간, 포유류, 포유동물 개체, 동물, 가축 개체, 위약 개체, 연구 개체, 실험 개체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 체액에 적용하는바, "투여"는 개체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 체액, 등에 대하여 외재적 리간드, 시약, 위약, 소분자, 약학적 제제, 치료제, 진단제, 또는 조성물의 접촉을 제한없이 지칭한다. "투여"는 예컨대, 치료, 약동학, 진단, 연구, 위약 및 실험적 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 세포에 대한 시약의 접촉뿐만 아니라 체액이 세포와 접촉할 때, 체액에 대한 시약의 접촉도 포함한다. "투여"는 또한 예컨대, 세포의, 시약, 진단, 결합 조성물에 의한, 또는 다른 세포에 의한 시험관 내 및 생체 외 처치를 포함한다.

리간드 및 수용체와 관련된바 "작용제"는 수용체를 자극하는 분자, 분자의 조합, 복합체, 또는 시약의 조합을 포함한다. 예를 들면, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 작용제는 GM-CSF, GM-CSF 펩티드의 돌연변이 단백질 또는 유도체, GM-CSF의 펩티드 미메틱, GM-CSF의 생물학적 기능을 모방하는 소분자, 또는 GM-CSF 수용체를 자극하는 항체를 포함할 수 있다.

리간드 및 수용체와 관련된바 "길항제"는 수용체를 억제하고, 중화하고, 하향조절하고 및/또는 감도를 줄이는 분자, 분자의 조합, 또는 복합체를 포함한다. "길항제"는 수용체의 구조적인 활성을 억제하는 임의의 시약을 포함한다. 구조적인 활성은 리간드/수용체 상호작용의 부재에서 명백한 것이다. 또한 "길항제"는 수용체의 촉진된(또는 조절된) 활성을 억제하거나 막는 임의의 시약을 포함한다. 예시의 수단으로, 어떤 제한을 의미하지 않고, GM-CGF 수용체의 길항제는 리간드(GM-CGF)에 결합하고, 수용체에 대한 결합으로부터 그것을 보호하는 항체, 또는 수용체에 결합하고, 수용체에 대한 결합으로부터 리간드를 보호하는 항체, 또는 항체가 비활성 형태에서 수용체를 고착시켰을 때를 포함한다.

본 발명에서 사용된바, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 함께 언급한 "유사체"는 원래 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 유사하거나 동일한 기능을 소유하지만 원래의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질과 유사하거나 동일한 아미노산 서열 또는 구조를 반드시 포함할 필요는 없는 다른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 유사체는 하기 중 적어도 하나를 만족시키는 것이 바람직하다: (a) 원래 아미노산 서열에 대하여 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질성 제제 (b) 원래 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 단백질성 제제; 및 (c) 원래 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 단백질성 제제.

"항원 제시 세포"(APC)는 T 세포로 항원을 제시하기 위해 사용되는 면역 시스템의 세포이다. APC는 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 대역(marginal zone) 쿠퍼세포, 소교세포, 랑게르한섬 세포, T 세포 및 B 세포를 포함한다. 수지상 세포는 적어도 두 가지 계열에서 발생한다. 첫 번째 계열은 전-DC1, 골수성 DC1, 및 성숙한 DC1을 포함한다. 두 번째 계열은 CD34⁺⁺CD45RA^-초기 선구 다기능 세포, CD34⁺⁺CD45RA⁺ 세포, CD34⁺⁺CD45RA⁺⁺CD4⁺IL-3Rα⁺⁺ 전-DC2 세포, CD4⁺CD11c^-원형질성 전-DC2 세포, 림프성 인간 DC2 원형질성-유래 DC2, 및 성숙한 DC2를 포함한다.

"약화" 및 "약화된"은 숙주에 대한 독성을 감소시키기 위하여 변형된 박테리아, 바이러스, 기생충, 감염 유기체, 프리온, 종양 세포, 감염 유기체의 유전자, 등을 포함한다. 숙주는 인간 또는 동물 숙주, 또는 기관, 조직, 또는 세포일 수 있다. 제한 없는 예시를 제공하기 위해 박테리아는 숙주 세포에 대한 결합을 줄이기 위하여, 한 숙주 세포로부터 다른 숙주 세포로 번지는 것을 줄이기 위하여, 세포 밖 성장을 줄이기 위하여, 또는 숙주 세포에서 세포 내 성장을 줄이기 위하여 약화될 수 있다. 약화는 독성의 징후 또는 징후들, LD₅₀, 장기로부터의 제거율, 또는 길항 지표를 측정하는 것에 의해 평가할 수 있다(예컨대, Auerbuch, et al.(2001) Infect. Immunity 69:5953-5957을 참조하라). 일반적으로, 약화는 적어도 25%; 더욱 일반적으로 적어도 50%; 가장 일반적으로 적어도 100%(2-배); 보통은 적어도 5-배; 더 보통은 적어도 10-배; 가장 보통은 적어도 50-배; 종종 적어도 100-배; 더욱 종종 적어도 500-배; 및 가장 종종 적어도 1000-배; 통상적으로 적어도 5000-배; 더 통상적으로 적어도 10,000-배; 및 가장 통상적으로 적어도 50,000-배; 및 가장 종종 적어도 100,000-배의 LD₅₀에서의 증가 및/또는 제거율에서의 증가를 야기한다.

"약화된 유전자"는 유전자가 독성, 병리, 또는 병독성을 완화하거나, 감소시키거나, 제거하는 방법으로 돌연변이될 때, 숙주에게 독성, 병리, 또는 병독성을 매개하거나, 숙주 내에서 성장하거나, 숙주 내에서 생존하는 유전자를 포함한다. 감소 또는 제거는 돌연변이된 유전자에 의해 매개된 독성 또는 병독성과 비돌연변이(또는 모) 유전자에 의해 매개된 그것을 비교하는 것에 의해 평가할 수 있다. "돌연변이된 유전자"는 유전자의 조절 부위, 유전자의 암호화 부위, 유전자의 비-암호화 부위, 또는 이들의 임의의 조합에서의 결실, 점 돌연변이, 및 프레임시프트 돌연변이를 포함한다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에서 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 동일한 아미노산 서열, 또는 보존적으로 변형된 변이체는 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 지칭한다. 보존적 치환의 예시는 하기 그룹의 하나에서 동일한 그룹의 다른 아미노산에 대한 아미노산의 교환이다(Lee, et al.에 의해 발행된 미국 특허 번호 5,767,063; Kyte and Doolittle(1982) J. Mol. Biol. 157:105-132).

(1) 소수성: 노르루신, Ile, Val, Leu, Phe, Cys, Met;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) 사슬의 방향에 영향을 받는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe; 및

(7) 소형 아미노산: Gly, Ala, Ser.

"유효량"은 의학적 이상 또는 장애의 징후 또는 신호를 개선하거나, 역전시키거나, 완화시키거나, 예방하거나, 진단할 수 있는 양을 제한 없이 포함한다. 명백하게 또는 문맥에 의해 달리 언급하지 않는 한, "유효량"은 이상을 개선하는데 충분한 최소한의 양을 제한하지 않는다.

"세포 밖 체액"은 예컨대, 혈청, 혈장, 혈액, 장액, 뇌척수액, 분비된 체액, 림프액, 담즙, 땀, 대변, 및 소변을 포함한다. "세포 밖 체액"은 교질 또는 부유, 예컨대 전체 혈액 또는 응고된 혈액을 포함할 수 있다.

폴리펩티드의 문맥에서 용어 "절편"은 더 큰 폴리펩티드의 아미노산 서열의 적어도 5개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 10개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 15개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 20개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 25개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 40개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 50개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 60개의 인접 아미노 잔기, 적어도 70개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 80개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 90개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 100개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 125개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 150개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 175개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 200개의 인접 아미노산 잔기, 또는 적어도 250개의 인접 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.

"유전자"는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 지칭한다. 올리고펩티드 또는 폴리펩티드는 생물학적으로 활성이거나, 항원적으로 활성이거나, 생물학적으로 비활성이거나, 항원적으로 비활성이거나 등일 수 있다. 용어 유전자는 예컨대, 특정 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 해독틀(ORF)의 합; ORF 더하기 인트론을 암호화하는 핵산의 합; ORF 및 작동가능하게 연결된 프로모터의 합; ORF 더하기 작동가능하게 연결된 프로모터 및 임의의 인트론의 합; ORF 및 작동가능하게 연결된 프로모터, 인트론, 및 프로모터, 및 인핸서와 같은 다른 조절 요소의 합을 포함한다. 어떤 구체예에서, "유전자"는 유전자의 발현을 조절하기 위하여 시스(cis)에서 요구되는 임의의 서열을 포함한다. 용어 유전자는 또한 항원 또는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질의 항원적으로 활성인 절편을 포함하는 펩티드를 암호화하는 핵산을 지칭할 수 있다. 용어 유전자는 암호화된 펩티드 또는 단백질이 임의의 생물학적 활성을 갖거나, 심지어 펩티드 또는 단백질이 항원적으로 활성인 것을 필수적으로 포함하지 않는다. 비발현성 서열을 암호화하는 핵산 서열은 일반적으로 위 유전자로 간주된다. 또한 용어 유전자는 rRNA, tRNA, 또는 리보자임과 같은 리보핵산을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.

리스테리아와 같은 박테리아의 "성장"은 박테리아의 생리학적 및 군체 형성, 복제, 단백질 함유량의 증가, 및/또는 지질 함유량의 증가에 관련된 유전자의 기능을 제한 없이 포함한다. 명백하게 또는 문맥에 의해 달리 명기되지 않는 한, 리스테리아의 성장은 박테리아의 숙주 세포 밖에서의 성장, 및 또한 숙주 세포 내에서의 성장을 포함한다. 성장 관련 유전자는 에너지 생산(예컨대, 해당, 크렙스 회로, 시토크롬), 아미노산, 당, 지질, 무기물, 퓨린, 및 피리미딘의 동화작용 및/또는 이화작용, 양분 수송, 전사, 번역, 및/또는 복제을 매개하는 것들을 임의의 제한을 의도하지 않고 포함한다. 일부 구체예에서, 리스테리아 박테리아의 "성장"은 리스테리아 박테리아의 세포 내 성장, 즉, 포유 동물 세포와 같은 숙주 세포 내에서의 성장을 지칭한다. 리스테리아 박테리아의 세포 내 성장이 광 현미경 도는 콜로니 형성 단위(CFU) 분석에 의해 측정할 수 있지만, 성장은 임의의 측정 기술에 의해 제한되지 않는다. 리스테리아 박테리아의 리스테리아 항원의 양, 리스테리아 핵산 서열, 또는 지질 특성과 같은 생화학적 매개 변수는 성장을 평가하는데 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 성장을 매개하는 유전자는 특이적으로 세포 내 성장을 매개하는 것이다. 어떤 구체예에서, 특이적으로 세포 내 성장을 매개하는 유전자는 유전자의 불활성화가 세포 내 성장의 속도를 검출하거나, 충분하거나, 분명하지 않게 감소시키거나, 세포 밖 성장(예컨대, 배양액에서의 성장)의 속도를 감소시키는 유전자, 또는 유전자의 불활성화가 그것이 세포 밖 성장의 속도를 감소시키는 것보다 세포 내 성장의 속도를 더 큰 범위로 감소시키는 유전자를 포함하지만, 이제 제한되지 않는다. 비-제한적인 예시를 제공하기 위하여, 일부 구체예에서, 불활성화가 세포 내 성장의 속도를 세포 밖 성장보다 더 큰 범위로 감소시킬 때, 유전자는 불활성화가 세포 내 성장을 정상 또는 최대 값의 50% 보다 낮게 세포 내 성장을 감소시켰지만 최대 값의 오직 1-5%, 5-10%, 또는 10-15%로 세포 밖 성장을 감소시켰을 때의 상황을 포함한다. 어떤 측면에서 본 발명은 세포 내 성장에서 약화되었지만, 세포 밖 성장에서 약화되지 않은 리스테리아, 세포 내 성장에서 약화되지 않고, 세포 밖 성장에서 약화되지 않은 리스테리아뿐만 아니라, 세포 내 성장에서는 약화되지 않았지만, 세포 밖 성장에서는 약화된 리스테리아를 포함한다.

"친수성 분석"은 Kyte 및 Doolittle의 방법에 의한 폴리펩티드 서열의 분석을 지칭한다: "A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein". J. Mol. Biol. 157(1982)105-132. 이 방법에서, 각각의 아미노산은 4.6 및 -4.6 사이의 소수성 점수가 주어진다. 4.6의 점수는 가장 소수성이고, -4.6의 점수는 가장 친수성이다. 이후 윈도 크기를 설정한다. 윈도 크기는 소수성 점수가 평균이고 윈도우에서 첫 번째 아미노산에 지정된 아미노산의 수이다. 계산은 아미노산의 첫 번째 윈도우와 함께 시작하고, 그 윈도우에서 모든 소수성 점수의 평균을 계산한다. 이후 윈도우를 한 아미노산 아래로 옮기고, 두 번째 윈도우에서 모든 소수성 점수의 평균을 계산한다. 이 패턴을 단백질의 끝까지 계속하고, 각각의 윈도우에 대한 평균 점수를 연산하고 그것을 윈도우에서 첫 번째 아미노산에 할당한다. 평균은 이후 그래프로 표시한다. y 축은 소수성 점수를 나타내고, x 축은 윈도우 숫자를 나타낸다. 하기 소수성 점수는 20개의 공통된 아미노산에서 사용한다.

Arg: -4.5 Ser: -0.8 Lys: -3.9

Thr: -0.7 Asn: -3.5 Gly: -0.4

Asp: -3.5 Ala: 1.8 Gln: -3.5

Met: 1.9 Glu: -3.5 Cys: 2.5

His: -3.2 Phe: 2.8 Pro: -1.6

Leu: 3.8 Tyr: -1.3 Val: 4.2

Trp: -0.9 Ile: 4.5

"표지된" 조성물은 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학, 동위원소, 또는 화학적 방법에 의해 직접 또는 간접적으로 검출가능하다. 예를 들면, 유용한 표지는 예컨대, 효소-결합 면역분석, 또는 플루오레트(fluorette)에서 사용하는 것과 같은 ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹⁴C, ³H, ¹²⁵I, 안정한 동위 원소, 에피토프 태그, 형광 다이, 전자-밀집 시약, 기질, 또는 효소를 포함한다(예컨대, Rozinov and Nolan(1998) Chem. Biol. 5:713-728을 참조하라).

"리간드"는 수용체의 작용제 또는 길항제인 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 막 관련 또는 막-결합 분자를 지칭한다. 또한 "리간드"는 작용제 또는 길항제가 아닌, 작용제 또는 길항제 성질을 갖지 않는 결합 제제를 포함한다. 관례상, 리간드가 첫 번째 세포에서 막-결합일 때, 수용체는 일반적으로 두 번째 세포에서 나타난다. 두 번째 세포는 첫 번째 세포와 동일한 동일성(동일한 명칭)을 가질 수 있거나, 다른 동일성(다른 명칭)을 가질 수 있다. 리간드 또는 수용체는 완전히 세포 내에 있을 수 있는데, 즉, 세포질, 핵, 또는 일부 다른 세포 내 구획에서 존재할 수 있다. 리간드 또는 수용체는 그것의 위치를 예컨대, 세포 내 구획에서 원형질막의 바깥 쪽으로 바꿀 수 있다. 리간드 및 수용체의 복합체는 "리간드 수용체 복합체"로 불린다. 리간드 및 수용체가 신호전달 경로에 포함되어 있을 때, 신호전달 경로에서 리간드는 상류 부분에 나타나고, 수용체는 하류 부분에 나타난다.

"핵산"은 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 이들의 단일 사슬, 이중-사슬 형태 또는 다중형태의 중합체를 지칭한다. 핵산의 비제한적 예시는 예컨대, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드이다. 또한 특정 핵산 서열은 "대립유전자 변이체" 및 "접착 변이체"를 함축적으로 포함할 수 있다.

프로모터 및 mRNA를 암호화하는 핵산의 문맥에서 "작동가능하게 연결된"은 프로모터가 그 핵산의 초기 전사에 사용될 수 있음을 의미한다.

용어 "퍼센트 서열 동일성" 및 "% 서열 동일성"은 두 개 또는 그 이상의 아미노산 또는 핵산 서열의 비교 또는 정렬에 의해 발견된 서열 유사도의 퍼센트를 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열을 정렬하는 것에 의한 두 분자 사이의 서열 정보의 직접적인 비교, 두 개의 정렬된 서열 사이의 일치하는 정확한 수를 세는 것, 더 짧은 서열의 길이로 나누는 것, 결과를 100으로 곱하는 것에 의해 결정할 수 있다. 퍼센트 동일성을 계산하기 위한 알고리즘은 스미스-워터맨 상동성 조사 알고리즘이다(예컨대, Kann and Goldstein(2002) Proteins 48:367-376; Arslan, et al.(2001) Bioinformatics 17:327-337을 참조하라).

"정제된" 및 "분리된"이 의미하는 것은, 폴리펩티드를 지칭할 때, 폴리펩티드가 그것이 천연에서 관련된 다른 생물학적 거대 분자가 상당히 부재하면서 존재할 때를 의미한다. 본 발명에서 사용된바 용어 "정제된"은 본 발명의 폴리펩티드의 중량의 종종 적어도 50%를 차지하는, 더욱 종종 적어도 60%를 차지하는, 전형적으로 적어도 70%를 차지하는, 더욱 전형적으로 적어도 75%를 차지하는, 가장 전형적으로 적어도 80%를 차지하는, 일반적으로 적어도 85%를 차지하는, 더욱 일반적으로 적어도 90%를 차지하는, 가장 일반적으로 적어도 95%를 차지하는, 인습적으로 적어도 98% 또는 그 이상을 차지하는 확인된 폴리펩티드를 의미한다. 물, 버퍼, 염, 계면활성제, 환원제, 프로테아제 억제제, 안정제(알부민과 같이 첨가된 단백질을 포함하여), 및 첨가제의 무게, 및 1000 이하의 분자량을 갖는 분자는 일반적으로 폴리펩티드 순도의 결정에서 사용하지 않는다. 예컨대, Covacci, et al.에 의해 발행된 미국 특허 번호 6,090,611에서 순도의 토론을 참조하라.

"펩티드"는 아미노산이 펩티드 결합에 의해 서로 결합되어 있을 때, 아미노산의 짧은 서열을 지칭한다. 펩티드는 거대분자, 지질, 올리고- 또는 폴리사카라이드, 및/또는 폴리펩티드와 같은 다른 모이어티가 없거나 부착되어 나타날 수 있다. 펩티드가 폴리펩티드 사슬에 포함되어 있을 때, 용어 "펩티드"는 아미노산의 짧은 서열을 특이적으로 지칭하는데 쓰일 수 있다. "펩티드"는 다른 모이어티에 펩티드 결합 또는 일부 다른 연결의 방법에 의해 연결될 수 있다. 펩티드는 최대 길이가 관습 또는 문맥의 기능일 때, 적어도 두 개의 아미노산 길이 및 일반적으로 약 25개 이하의 아미노산 길이이다. 용어 "펩티드" 및 "올리고펩티드"는 상호교환적으로 사용할 수 있다.

"단백질"은 일반적으로 폴리펩티드 사슬을 포함하는 아미노산의 서열을 지칭한다. 또한, 단백질은 폴리펩티드의 삼차원 구조를 지칭할 수 있다. "변성된 단백질"은 일부 잔여 삼차 구조를 갖는 일부 변성된 또는 선택적으로 본질적으로 무작위의 삼차원 구조인, 즉 완전히 변성된 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명은 글루코실화, 인산화, 황산화, 이황화 결합 형성, 탈아미드화, 이성체화, 신호 또는 선도 서열 가공에서의 절단점, 공유 또는 비-공유 결합 공동인자, 산화된 변이체, 등을 포함하는 폴리펩티드 변이체의 시약 및 방법을 포함한다. 이황화 결합된 단백질의 형성이 기술된다(예컨대, Woycechowsky and Raines(2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:533-539; Creighton, et al.(1995) Trends Biotechnol. 13:18-23을 참조하라).

예컨대, 핵산, 세포, 동물, 바이러스, 플라스미드, 벡터, 등에 대한 언급과 함께 사용되었을 때 "재조합"은 외재성, 비-천연 핵산, 천연 핵산의 변경의 도입에 의한, 또는 재조합 핵산, 세포, 바이러스, 플라스미드, 또는 벡터로부터 전체 또는 일부에서의 파생에 의한 변형을 가리킨다. 재조합 단백질은 예컨대, 재조합 핵산, 바이러스, 플라스미드, 벡터, 등으로부터 유래한 단백질을 지칭한다. "재조합 박테리아"는 게놈이 예컨대, 돌연변이, 결실, 삽입, 및/또는 재배열의 방법에 의한 재조합 방법에 의해 조작되었을 때의 박테리아를 포함한다. 또한, "재조합 박테리아"는 여분의 게놈 핵산, 예컨대, 플라스미드 또는 이차 염색체의 재조합을 포함하기 위하여 변형된 박테리아, 또는 존재하는 여분의 게놈 핵산이 변형된 박테리아를 포함한다.

"표본"은 인간, 동물, 플라시보, 또는 연구 표본으로부터 나온 표본, 예컨대, 세포, 조직, 기관, 체액, 가스, 에어로졸, 슬러리, 콜로이드, 또는 응고된 재료를 지칭한다. "표본"은 예컨대, 인간 또는 동물로부터의 제거 없이, 생체 내에서 시험할 수 있거나, 시험관 내에서 시험할 수 있다. 표본을 가공 후 예컨대, 조직학적 방법에 의해 시험할 수 있다. 또한, "표본"은 예컨대 체액 또는 조직 표본을 포함하는 세포 또는 체액, 또는 조직 표본으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 또한, "표본"은 인간 또는 동물로부터 새로이 수득한 세포, 조직, 기관 또는 체액, 또는 가공되거나 저장된 세포, 조직, 기관, 또는 체액을 지칭할 수 있다.

"선택 마커"는 선택 마커를 함유하는 세포를 선별하거나 제거하는 것을 허용하는 핵산을 포함한다. 선택 마커의 예시는 예컨대 (1) 다른 독성 화합물(예컨대, 항생제)에 대한 저항성을 제공하거나, 다른 해롭지 않은 화합물(예컨대, 수크로오스)에 대하여 민감한 산물을 암호화하는 핵산; (2) 수령자 세포에 달리 부족한 산물을 암호화하는 핵산(예컨대, tRNA 유전자, 영양 요구성 마커); (3) 유전자 산물의 활성을 억제하는 산물을 암호화하는 핵산; (4) 용이하게 확인할 수 있는 산물을 암호화하는 핵산(예컨대, 베타-갈락토시다아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 세포 표면 단백질, 에피토프 태그, FLAG 태그); (5) 혼성화 기술, 예를 들면, PCR 또는 분자 비콘에 의해 확인할 수 있는 핵산을 제한 없이 포함한다.

리간드/수용체, 핵산/상보성 핵산, 항체/항원, 또는 다른 결합쌍(예컨대, 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인)에 대하여 지칭할 때, "특이적으로" 또는 "선택적으로" 결합한다는 것은 단백질 및 다른 생물제제의 이종의 군집에서 단백질의 존재의 결정 요인인 결합 반응을 가리킨다. 따라서, 지정된 조건 하에서, 명시한 리간드는 특정 수용체에 결합하고, 표본에 존재하는 다른 단백질에 대해서는 유의한 양으로 결합하지 않는다. 또한, 특정 결합은 계획된 방법의 예컨대, 결합 화합물, 핵산 리간드, 항체, 또는 항체의 항원-결합 부위로부터 유래한 결합 조성물의 특정 결합은 그것의 표적에 임의의 다른 결합 화합물이 갖는 친화성 보다 종종 적어도 25% 더 큰, 더욱 종종 적어도 50% 더 큰, 가장 종종 적어도 100%(2배) 더 큰, 보통은 적어도 열배 더 큰, 더욱 보통은 적어도 20-배 더 큰, 및 가장 보통은 적어도 100-배 더 큰 친화성으로 결합하는 것을 의미할 수 있다.

전형적인 구체예에서 항체는 예컨대, 스캐차드 분석에 의해 결정된 것과 같이 약 10⁹ 리터/mol보다 더 큰 친화성을 가질 것이다(Munsen, et al.(1980) Analyt. Biochem. 107:220-239). 일부 결합 화합물이 하나 이상의 표적에 결합할 수 있음이, 예컨대, 항체가 특이적으로 그것의 항원에, 항체의 올리고당의 수단에 의해 렉틴에, 및/또는 항체의 Fc 영역의 수단에 의해 Fc 수용체에 결합하는 것이 당업자에 의해 인식된다.

박테리아의 "확장"은 "세포 대 세포 확장" 즉, 첫 번째 숙주 세포로부터 두 번째 숙주 세포로의 예를 들면, 소낭에 의해 매개되는 것과 같은 박테리아의 전염을 포함한다. 확장과 관련된 기능은 예컨대, 액틴 꼬리의 형성, 위족 원생동물 유사 신장의 형성, 및 이중 액포의 형성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용된바 용어 "개체"는 인간 또는 비-인간 유기체를 지칭한다. 따라서, 본 발명에서 기술한 방법 및 조성물은 인간 및 가축 질환 모두에서 적용가능하다. 어떤 구체예에서, 개체는 "환자" 즉, 질병 또는 이상에 대한 건강 관리를 받고 있는 살아있는 인간이다. 이것은 아직 병으로 확진되지 않았지만, 병리의 신호에 대하여 조사받을 사람을 포함한다. 바람직한 것은 현존하는 HCV 감염, 더욱 바람직하게는 만성 감염을 갖는 개체이다.

재조합효소의 "표적 위치"는 재조합효소가 인식, 결합 및/또는 작용하는 핵산 서열 또는 영역이다(예컨대, Graham, et al.에 의해 발행된 미국 특허 번호 6,379,943; Smith and Thorpe(2002) Mol. Microbiol. 44:299-307; Groth and Calos(2004) J. Mol. Biol. 335:667-678; Nunes-Duby, et al.(1998) Nucleic Acids Res. 26:391-406을 참조하라).

"치료적 유효량"은 시약 또는 약학적 조성물의 양, 즉 환자의 이익을 보이는, 즉, 치료되어야 할 이상의 증상의 감소, 예방, 또는 개선을 유발하는 양으로서 정의된다. 제제 또는 약학적 조성물이 진단 제제를 포함할 때, "진단적 유효량"은 신호, 이미지, 또는 다른 진단 매개변수를 생산하는데 충분한 양으로서 정의된다. 약학적 제형의 유효량은 개체의 감수성의 정도, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체의 특이체질 반응과 같은 인자에 따라 다양할 것이다(예컨대, Netti, et al.에 의해 발행된 미국 특허 번호 5,888,530을 참조하라).

"치료" 또는 "치료하는"(이상 또는 질병에 대하여)은 바람직하게는 임상적 결과를 포함하는, 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근이다. 본 발명의 목적을 위하여, 질병과 관련된 유익하거나 원하는 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 질병과 관련한 이상을 개선하는 것, 질병을 치료하는 것, 질병의 괴로움을 적게 하는 것, 질병의 진행을 지연시키는 것, 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 완화하는 것, 질병을 앓고 있는 사람의 삶의 질을 증가시키는 것 및/또는 생존을 연장시키는 것. 마찬가지로, 본 발명의 목적을 위해서, 이상과 관련된 유익하거나 원하는 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 이상을 개선하는 것, 이상을 치료하는 것, 이상의 괴로움을 적게 하는 것, 이상의 진행을 지연시키는 것, 이상과 관련된 하나 이상의 증상을 완화하는 것, 이상을 앓고 있는 사람의 삶의 질을 증가시키는 것 및/또는 생존을 연장시키는 것. 예를 들어, 일부 구체예에서 본 발명에서 기술한 조성물이 암의 치료를 위해 사용될 때, 유익하거나 원하는 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 종양 또는 암 세포의 증식을 감소시키는 것(또는 파괴하는 것), 암에서 발견되는 종양 세포의 전이를 감소시키는 것, 종양의 크기를 줄이는 것, 암에서 기인한 증상을 감소시키는 것, 암을 앓고 있는 사람의 삶의 질을 증가시키는 것, 질병을 치료하는데 요구되는 다른 약의 투여량을 감소시키는 것, 암의 진행을 지연시키는 것, 및/또는 암을 가진 환자의 생존을 연장시키는 것. 문맥에 의존하여, 개체의 "치료"는 치료가 필요한 개체가 예컨대, 개체가 시약의 투여에 의해 개선되는 것이 기대되는 장애를 포함하는 상황에서 개체가 치료를 필요로 함을 암시할 수 있다.

"백신"은 예방용 백신을 포함한다. 또한, 백신은 치료용 백신, 예컨대, 백신에 의해 제공되는 항원 또는 에피토프와 관련된 이상 또는 장애를 포함하는 포유류에 투여되는 백신을 포함한다.

2. C형 간염 항원

HCV는 약 3,000개 아미노산 선구자 폴리단백질을 암호화하는 큰 해독틀을 함유하는 양성-가닥 RNA 게놈을 갖는다. 이 폴리단백질은 숙주 및 바이러스 프로테아제에 의해 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b 항원으로 지칭되는 10개의 바이러스 단백질로 절단된다. 하기의 예시가 코어, NS5b 및 NS3의 용도를 설명하는데 반해, 이들 HCV 항원 서열의 임의의 하나 이상은 본 발명에서 기술한 백신 조성물 및 방법에서 용도를 찾을 수 있다.

본 발명에서 사용된바, 용어 "HCV 항원"은 (ⅰ) 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및/또는 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질; 및/또는 (ⅱ) 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및/또는 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질로부터 유래한 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 발명에서 기술한 HCV 항원은 개별적으로 사용될 수 있지만, 바람직하게는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및/또는 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 또는 그 이상의 HCV 단백질로부터 나온 폴리펩티드 서열을 포함하는 조합에서 사용된다. 아래에서 기술한 것과 같이, 바람직한 HCV 항원은 NS3 및/또는 NS5b 폴리펩티드 서열 또는 이로부터 유래한 서열을 포함한다.

언급한 것과 같이, 본 발명에서 사용한 HCV 항원은 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a NS4b, NS5a, 및/또는 NS5b 항원의 전장 버전을 포함할 수 있거나, 하나 이상의 이런 전장 HCV 항원"으로부터 유래한" 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된바 "로부터 유래한" 것에 의하는 것은 명시한 HCV 항원 또는 항원과 비교하여 하나 이상의 보존적 아미노산 변화를 갖는 폴리펩티드, 명시한 HCV 항원 또는 항원으로부터 하나 이상의 분리된 에피토프를 포함하는 폴리펩티드, 또는 명시한 HCV 항원 또는 항원과 면역학적으로 교차반응할 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다.

일부 구체예에서, 즉 HCV 항원"으로부터 유래한" 항원은 하나 이상의 전장 HCV 항원의 일부 서열("절편")을 포함한다. 따라서, "HCV 항원"은 (ⅰ) 코어 E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및/또는 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질; 및/또는 (ⅱ) 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및/또는 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 HCV 단백질의 하나 이상의 부분 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 다양한 구체예에서, 유래한 HCV 항원은 전장 HCV 항원으로부터 수득한 적어도 8개 아미노산, 적어도 12개 아미노산, 적어도 20개 아미노산, 적어도 50개 아미노산, 적어도 75개 아미노산, 적어도 100개 아미노산, 또는 적어도 200개 아미노산 또는 그 이상의 절편을 포함한다.

항원은 원래(전장) HCV 항원으로부터 수득한 적어도 하나의 MHC 클래스 Ⅰ 에피토프 및/또는 적어도 하나의 MHC 클래스 Ⅱ 에피토프를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 공공연하게 사용가능한 알고리즘은 MHC 클래스 Ⅰ 및/또는 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는 에피토프를 선별하기 위하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 예측하는 알고리즘 "BIMAS"는 펩티드/HLA 복합체의 예측되는 1/2배 해리에 따라서 잠재적인 HLA 결합 에피토프를 위치시킨다. "SYFPEITHI" 알고리즘은 일차 및 이차 HLA-결합 앵커(anchor) 잔기의 존재를 설명할 수 있는 점수에 따라 펩티드를 위치시킨다. 모든 컴퓨터로 처리된 알고리즘 점수 후보 에피토프는 이전에 발표된 HLA 결합 에피토프에 대하여 유사한 결합 모티프를 갖는 주어진 단백질 내의 아미노산 서열에 기초한다. 또한, 다른 알고리즘은 나아간 생물학적 시험에 대한 후보를 확인하기 위해 사용할 수 있다.

또한, 항원의 유도체는 그것이 유래된 것으로부터 HCV 항원의 부분이 적어도 약 80 % 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 백신 컨스트럭트에 의해 발현되는 HCV 항원은 각각의 단백질의 하나 이상의 기능에 매우 중요한 모티프에 조작된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 항원이라는 점에서 야생형 등가물과 다르다. 예를 들면, 유전자형 1 보존 서열에서 나온 NS5b의 경우에서, GDD 에서 GNH로의 이중 돌연변이(NS5b의 317번째 아미노산에서 시작)의 비활성화는 RNA 폴리머라아제 활성을 완전히 불활성화시킨다. 마찬가지로, 유전자형 1 보존 서열로부터 나온 NS3의 경우에서, 290번째 아미노산에서 시작하는 AASH에 대한 모티프 II(DECH)의 돌연변이는 헬리카아제 활성을 폐지한다.

HCV의 적어도 6개의 알려진 유전자형 및 50개 이상의 서브타입이 있다. 하기 예시는 유전자형 1 항원의 용도를 설명하지만, 본 발명에서 기술한 방법 및 조성물은 모든 HCV 유전자형 및 서브타입에 대하여 적용할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용하기 위한, 하나 이상의 항원 서열은 임의의 특정 HCV 유전자형/서브타입으로부터 얻을 수 있다.

예방용뿐만 아니라 치료용 HCV 백신도 최근에 사용가능하지 않고, 백신의 개발을 위한 유의한 도전이 바이러스의 다양성에 잠재되어 있다. HCV는 가까이 연관되지만 개별적인 유전적 서열의 유사종 또는 "무리"로서 각각의 감염된 인간에서 존재하는바 인간 사이 및 인간 내 모두에서 매우 다양하다. 따라서 효과적인 HCV 백신의 개발에서 한 가지 전략은 개별 서브타입으로부터 나온 것이 아니라, 주어진 항원에 대한 각각의 위치에서 가장 일반적으로 발견된 아미노산에 기초한 특정 유전자형에 대한 보전 서열로부터 나온 하나 이상의 항원을 수득하는 것이다. 예컨대, 모든 표, 도면 및 청구항을 포함하는 그 전체가 참고문헌으로 본 발명에 포함되는 WO06/086188을 참조하라. 보존 서열의 하나의 이론적인 이익은 다양성의 범위를 절반으로 효과적으로 줄이는 균주 및 일시적인 분리물 사이의 유전학적 차이를 최소화하는 것, 그리고 따라서 그것이 교차-작용 반응을 제거하는 것에 대한 향상된 가능성을 가질 수 있는 것이다. 보존 서열 백신은 일치가 지리적 영역 사이에서 다르지 않을 것이므로 생산이 훨씬 더 효율적일 것이다.

따라서, 바람직한 구체예에서, 사용한 HCV 항원은 HCV 보존 서열에 기반을 둔다. 예를 들면, HCV 항원은 (ⅰ) 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및/또는 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질의 보존 서열; 및/또는 (ⅱ) 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및/또는 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질의 보존 서열로부터 유래한 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리펩티드일 수 있다. 하기 표는 다양한 HCV 분리물에 대한 Swiss-Prot 전체 데이터를 제공한다:

POLG_HCV1(P26664)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1a(분리물 1)(HCV)
POLG_HCV6A(Q5I2N3)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 6a(분리물 6a33)(HCV)
POLG_HCVBB(Q68749)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 2c(분리물 BEBE1)(HCV)
POLG_HCVBK(P26663)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1b(분리물 BK)(HCV)
POLG_HCVCO(Q9WMX2)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1b(분리물 Con1)(HCV)
POLG_HCVED(O39929)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 4a(분리물 ED43)(HCV)
POLG_HCVEU(O39927)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 6a(분리물 EUHK2)(HCV)
POLG_HCVEV(O39928)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 5a(분리물 EUH1480)(HCV)
POLG_HCVH(P27958)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1a(분리물 H)(HCV)
POLG_HCVH9(Q81754)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70) p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1c(분리물 HC-G9)(HCV)
POLG_HCVIN(Q913D4)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1c(분리물 India)(HCV)
POLG_HCVJ1(Q03463)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1b(분리물 HC-J1)(HCV)
POLG_HCVJ4(O92972)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1b(균주 HC-J4)(HCV)
POLG_HCVJ6(P26660)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 2a(분리물 HC-J6)(HCV)
POLG_HCVJ8(P26661)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 2b(분리물 HC-J8)(HCV)
POLG_HCVJA(P26662)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1b(분리물 일본)(HCV)
POLG_HCVJF(Q99IB8)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 2a(분리물 JFH-1)(HCV)
POLG_HCVJK(Q68801)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 3k(분리물 JK049)(HCV)
POLG_HCVJL(Q68798)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 6g(분리물 JK046)(HCV)
POLG_HCVJP(Q9DHD6)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 2b(분리물 JPUT971017)(HCV)
POLG_HCVJT(Q00269)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1b(분리물 HC-JT)(HCV)
POLG_HCVK3(Q81495)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27) 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 3a(분리물 k3a)(HCV)
POLG_HCVNZ(Q81258)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 3a(분리물 NZL1)(HCV)
POLG_HCVR6(Q913V3)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1b(분리물 HCR6)(HCV)
POLG_HCVSA(O91936)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 5a(분리물 SA13)(HCV)
POLG_HCVT5(O92529)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 6b(분리물 Th580)(HCV)
POLG_HCVTR(Q81487)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 3b(분리물 Tr-Kj)(HCV)
POLG_HCVTW(P29846)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 1b(분리물 Taiwan)(HCV)
POLG_HCVVA(Q9QAX1)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 2k(분리물 VAT96)(HCV)
POLG_HCVVN(O92530)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 6d(분리물 VN235)(HCV)
POLG_HCVVO(O92531)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC 3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70)비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 6k(분리물 VN405)(HCV)
POLG_HCVVP(O92532)	게놈 폴리단백질 [함유: 코어 단백질 p21(캡시드 단백질 C)(p21); 코어 단백질 p19; 외피 당단백질 E1(gp32)(gp35); 외피 당단백질 E2(NS1)(gp68)(gp70); p7; 프로테아제 NS2-3(EC 3.4.22.-)(p23); 세린 프로테아제/NTPase/헬리카아제 NS3(EC3.4.21.98)(EC 3.6.1.15)(EC 3.6.1.-)(헤파시비린)(NS3P)(p70); 비-구조 단백질 4A(NS4A)(p8); 비-구조 단백질 4B(NS4B)(p27); 비-구조 단백질 5A(NS5A)(p56); RNA-직접 RNA 폴리머라아제(EC 2.7.7.48)(NS5B)(p68)] - C형 간염 바이러스 유전자형 6h(분리물 VN004)(HCV)

하기 보존 서열은 자연에서 대표적이며, 바람직할지라도, 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다:

코어 일치 유전자형 1a(서열번호 7)

MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR 50

KTSERSQPRG RRQPIPKARR PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP 100

RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGAARA 150

LAHGVRVLED GVNYATGNLP GCSFSIFLLA LLSCLTVPAS A 191

코어 일치 유전자형 1b(서열번호 8)

MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR 50

KTSERSQPRG RRQPIPKARR PEGRAWAQPG YPWPLYGNEG MGWAGWLLSP 100

RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGAARA 150

LAHGVRVLED GVNYATGNLP GCSFSIFLLA LLSCLTIPAS A 191

E1; 일치 유전자형 1a(서열번호 9)

YQVRNSSGLY HVTNDCPNSS VVYEAADAIL HTPGCVPCVR EGNASRCWVA 50

VTPTVATRDG KLPTTQLRRH IDLLVGSATL CSALYVGDLC GSVFLVGQLF 100

TFSPRHHWTT QDCNCSIYPG HITGHRMAWN MMMNWSPTAA LVVAQLLRIP 150

QAIMDMIAGA HWGVLAGIKY FSMVGNWAKV LVVLLLFAGV DA 192

E2; 일치 유전자형 1a(서열번호 10)

ETHVTGGNAG RTTAGLVGLL TPGAKQNIQL INTNGSWHIN STALNCNESL 50

NTGWLAGLFY QHKFNSSGCP ERLASCRRLT DFAQGWGPIS YANGSGLDER 100

PYCWHYPPRP CGIVPAKSVC GPVYCFTPSP VVVGTTDRSG APTYSWGAND 150

TDVFVLNNTR PPLGNWFGCT WMNSTGFTKV CGAPPCVIGG VGNNTLLCPT 200

DCFRKYPEAT YSRCGSGPRI TPRCMVDYPY RLWHYPCTIN YTIFKVRMYV 250

GGVEHRLEAA CNWTRGERCD LEDRDRSELS PLLLSTTQWQ VLPCSFTTLP 300

ALSTGLIHLH QNIVDVQYLY GVGSSIASWA IKWEYVVLLF LLLADARVCS 350

CLWMMLLISQ AEA 363

p7; 일치 유전자형 1a(서열번호 11)

ALENLVILNA ASLAGTHGLV SFLVFFCFAW YLKGRWVPGA VYALYGMWPL 50

LLLLLALPQR AYA 63

NS2; 일치 유전자형 1a(서열번호 12)

LDTEVAASCG GVVLVGLMAL TLSPYYKRYI SWCMWWLQYF LTRVEAQLHV 50

WVPPLNVRGG RDAVILLTCV VHPALVFDIT KLLLAIFGPL WILQASLLKV 100

PYFVRVQGLL RICALARKIA GGHYVQMAII KLGALTGTCV YNHLAPLRDW 150

AHNGLRDLAV AVEPVVFSRM ETKLITWGAD TAACGDIING LPVSARRGQE 200

ILLGPADGMV SKGWRLL 217

NS3 일치 유전자형 1a(서열번호 13)

APITAYAQQT RGLLGCIITS LTGRDKNQVE GEVQIVSTAA QTFLATCING 50

VCWTVYHGAG TRTIASSKGP VIQMYTNVDQ DLVGWPAPQG ARSLTPCTCG 100

SSDLYLVTRH ADVIPVRRRG DSRGSLLSPR PISYLKGSSG GPLLCPAGHA 150

VGIFRAAVCT RGVAKAVDFI PVENLETTMR SPVFTDNSSP PAVPQSFQVA 200

HLHAPTGSGK STKVPAAYAA QGYKVLVLNP SVAATLGFGA YMSKAHGIDP 250

NIRTGVRTIT TGSPITYSTY GKFLADGGCS GGAYDIIICD ECHSTDATSI 300

LGIGTVLDQA ETAGARLVVL ATATPPGSVT VPHPNIEEVA LSTTGEIPFY 350

GKAIPLEVIK GGRHLIFCHS KKKCDELAAK LVALGINAVA YYRGLDVSVI 400

PTSGDVVVVA TDALMTGYTG DFDSVIDCNT CVTQTVDFSL DPTFTIETTT 450

LPQDAVSRTQ RRGRTGRGKP GIYRFVAPGE RPSGMFDSSV LCECYDAGCA 500

WYELTPAETT VRLRAYMNTP GLPVCQDHLE FWEGVFTGLT HIDAHFLSQT 550

KQSGENFPYL VAYQATVCAR AQAPPPSWDQ MWKCLIRLKP TLHGPTPLLY 600

RLGAVQNEVT LTHPVTKYIM TCMSADLEVV T 631

NS3 일치 유전자형 1b(서열번호 14)

APITAYSQQT RGLLGCIITS LTGRDKNQVE GEVQVVSTAT QSFLATCVNG 50

VCWTVYHGAG SKTLAGPKGP ITQMYTNVDQ DLVGWQAPPG ARSLTPCTCG 100

SSDLYLVTRH ADVIPVRRRG DSRGSLLSPR PVSYLKGSSG GPLLCPSGHA 150

VGIFRAAVCT RGVAKAVDFV PVESMETTMR SPVFTDNSSP PAVPQTFQVA 200

HLHAPTGSGK STKVPAAYAA QGYKVLVLNP SVAATLGFGA YMSKAHGVDP 250

NIRTGVRTIT TGAPITYSTY GKFLADGGCS GGAYDIIICD ECHSTDSTTI 300

LGIGTVLDQA ETAGARLVVL ATATPPGSVT VPHPNIEEVA LSNTGEIPFY 350

GKAIPIETIK GGRHLIFCHS KKKCDELAAK LSGLGLNAVA YYRGLDVSVI 400

PTSGDVVVVA TDALMTGFTG DFDSVIDCNT CVTQTVDFSL DPTFTIETTT 450

VPQDAVSRSQ RRGRTGRGRR GIYRFVTPGE RPSGMFDSSV LCECYDAGCA 500

WYELTPAETS VRLRAYLNTP GLPVCQDHLE FWESVFTGLT HIDAHFLSQT 550

KQAGDNFPYL VAYQATVCAR AQAPPPSWDQ MWKCLIRLKP TLHGPTPLLY 600

RLGAVQNEVT LTHPITKYIM ACMSADLEVV T 631

NS4a; 일치 유전자형 1a(서열번호 15)

STWVLVGGVL AALAAYCLST GCVVIVGRIV LSGKPAIIPD REVLYQEFDE 50

MEEC 54

NS4b; 일치 유전자형 1a(서열번호 16)

SQHLPYIEQG MMLAEQFKQK ALGLLQTASR HAEVITPAVQ TNWQKLEVFW 50

AKHMWNFISG IQYLAGLSTL PGNPAIASLM AFTAAVTSPL TTGQTLLFNI 100

LGGWVAAQLA APGAATAFVG AGLAGAALDS VGLGKVLVDI LAGYGAGVAG 150

ALVAFKIMSG EVPSTEDLVN LLPAILSPGA LAVGVVFASI LRRRVGPGEG 200

AVQWMNRLIA FASRGNHVSP THYVPESDAA ARVTAILSSL TVTQLLRRLH 250

QWISSECTTP C 261

NS5a; 일치 유전자형 1a(서열번호 17)

SGSWLRDIWD WICEVLSDFK TWLKAKLMPQ LPGIPFVSCQ RGYRGVWRGD 50

GIMHTRCHCG AEITGHVKNG TMRIVGPRTC KNMWSGTFFI NAYTTGPCTP 100

LPAPNYKFAL WRVSAEEYVE IRRVGDFHYV SGMTTDNLKC PCQIPSPEFF 150

TELDGVRLHR FAPPCKPLLR EEVSFRVGLH EYPVGSQLPC EPEPDVAVLT 200

SMLTDPSHIT AEAAGRRLAR GSPPSMASSS ASQLSAPSLK ATCTANHDSP 250

DAELIEANLL WRQEMGGNIT RVESENKVVI LDSFDPLVAE EDEREVSVPA 300

EILRKSRRFA PALPVWARPD YNPLLVETWK KPDYEPPVVH GCPLPPPRSP 350

PVPPPRKKRT VVLTESTLPT ALAELATKSF GSSSTSGITG DNTTTSSEPA 400

PSGCPPDSDV ESYSSMPPLE GEPGDPDLSD GSWSTVSSGA DTEDVVCC 448

NS5b 일치 유전자형 1a(서열번호 18)

SMSYSWTGAL VTPCAAEEQK LPINALSNSL LRHHNLVYST TSRSACQRQK 50

KVTFDRLQVL DSHYQDVLKE VKAAASKVKA NLLSVEEACS LTPPHSAKSK 100

FGYGAKDVRC HARKAVNHIN SVWKDLLEDS VTPIDTTIMA KNEVFCVQPE 150

KGGRKPARLI VFPDLGVRVC EKMALYDVVS KLPLAVMGSS YGFQYSPGQR 200

VEFLVQAWKS KKTPMGFSYD TRCFDSTVTE SDIRTEEAIY QCCDLDPQAR 250

VAIKSLTERL YVGGPLTNSR GENCGYRRCR ASGVLTTSCG NTLTCYIKAQ 300

AACRAAGLRD CTMLVCGDDL VVICESAGVQ EDAASLRAFT EAMTRYSAPP 350

GDPPQPEYDL ELITSCSSNV SVAHDGAGKR VYYLTRDPTT PLARAAWETA 400

RHTPVNSWLG NIIMFAPTLW ARMILMTHFF SVLIARDQLE QALDCEIYGA 450

CYSIEPLDLP PIIQRLHGLS AFSLHSYSPG EINRVAACLR KLGVPPLRAW 500

RHRARSVRAR LLSRGGRAAI CGKYLFNWAV RTKLKLTPIA AAGQLDLSGW 550

FTAGYSGGDI YHSVSRARPR WFWFCLLLLA AGVGIYLLPN R 591

NS5b 일치 유전자형 1b(서열번호 19)

SMSYTWTGAL ITPCAAEESK LPINALSNSL LRHHNMVYAT TSRSASQRQK 50

KVTFDRLQVL DDHYRDVLKE MKAKASTVKA KLLSVEEACK LTPPHSAKSK 100

FGYGAKDVRN LSSKAVNHIR SVWKDLLEDT ETPIDTTIMA KNEVFCVQPE 150

KGGRKPARLI VFPDLGVRVC EKMALYDVVS TLPQAVMGSS YGFQYSPGQR 200

VEFLVNAWKS KKNPMGFAYD TRCFDSTVTE NDIRVEESIY QCCDLAPEAR 250

QAIRSLTERL YIGGPLTNSK GQNCGYRRCR ASGVLTTSCG NTLTCYLKAS 300

AACRAAKLQD CTMLVCGDDL VVICESAGTQ EDAASLRVFT EAMTRYSAPP 350

GDPPQPEYDL ELITSCSSNV SVAHDASGKR VYYLTRDPTT PLARAAWETA 400

RHTPVNSWLG NIIMYAPTLW ARMILMTHFF SILLAQEQLE KALDCQIYGA 450

CYSIEPLDLP QIIQRLHGLS AFSLHSYSPG EINRVASCLR KLGVPPLRVW 500

RHRARSVRAK LLSQGGRAAT CGKYLFNWAV RTKLKLTPIP AASQLDLSGW 550

FVAGYSGGDI YHSLSRARPR WFMLCLLLLS VGVGIYLLPN R 591

NS3 유전자형 1a DECH -> AASH 돌연변이(서열번호 20)

APITAYAQQT RGLLGCIITS LTGRDKNQVE GEVQIVSTAA QTFLATCING 50

VCWTVYHGAG TRTIASSKGP VIQMYTNVDQ DLVGWPAPQG ARSLTPCTCG 100

SSDLYLVTRH ADVIPVRRRG DSRGSLLSPR PISYLKGSSG GPLLCPAGHA 150

VGIFRAAVCT RGVAKAVDFI PVENLETTMR SPVFTDNSSP PAVPQSFQVA 200

HLHAPTGSGK STKVPAAYAA QGYKVLVLNP SVAATLGFGA YMSKAHGIDP 250

NIRTGVRTIT TGSPITYSTY GKFLADGGCS GGAYDIIICA ASHSTDATSI 300

LGIGTVLDQA ETAGARLVVL ATATPPGSVT VPHPNIEEVA LSTTGEIPFY 350

GKAIPLEVIK GGRHLIFCHS KKKCDELAAK LVALGINAVA YYRGLDVSVI 400

PTSGDVVVVA TDALMTGYTG DFDSVIDCNT CVTQTVDFSL DPTFTIETTT 450

LPQDAVSRTQ RRGRTGRGKP GIYRFVAPGE RPSGMFDSSV LCECYDAGCA 500

WYELTPAETT VRLRAYMNTP GLPVCQDHLE FWEGVFTGLT HIDAHFLSQT 550

KQSGENFPYL VAYQATVCAR AQAPPPSWDQ MWKCLIRLKP TLHGPTPLLY 600

RLGAVQNEVT LTHPVTKYIM TCMSADLEVV T 631

NS3 유전자형 1b DECH -> AASH 돌연변이(서열번호 21)

APITAYSQQT RGLLGCIITS LTGRDKNQVE GEVQVVSTAT QSFLATCVNG 50

VCWTVYHGAG SKTLAGPKGP ITQMYTNVDQ DLVGWQAPPG ARSLTPCTCG 100

SSDLYLVTRH ADVIPVRRRG DSRGSLLSPR PVSYLKGSSG GPLLCPSGHA 150

VGIFRAAVCT RGVAKAVDFV PVESMETTMR SPVFTDNSSP PAVPQTFQVA 200

HLHAPTGSGK STKVPAAYAA QGYKVLVLNP SVAATLGFGA YMSKAHGVDP 250

NIRTGVRTIT TGAPITYSTY GKFLADGGCS GGAYDIIICA ASHSTDSTTI 300

LGIGTVLDQA ETAGARLVVL ATATPPGSVT VPHPNIEEVA LSNTGEIPFY 350

GKAIPIETIK GGRHLIFCHS KKKCDELAAK LSGLGLNAVA YYRGLDVSVI 400

PTSGDVVVVA TDALMTGFTG DFDSVIDCNT CVTQTVDFSL DPTFTIETTT 450

VPQDAVSRSQ RRGRTGRGRR GIYRFVTPGE RPSGMFDSSV LCECYDAGCA 500

WYELTPAETS VRLRAYLNTP GLPVCQDHLE FWESVFTGLT HIDAHFLSQT 550

KQAGDNFPYL VAYQATVCAR AQAPPPSWDQ MWKCLIRLKP TLHGPTPLLY 600

RLGAVQNEVT LTHPITKYIM ACMSADLEVV T 631

NS5b 유전자형 1a GDD -> GNH 돌연변이(서열번호 22)

SMSYSWTGAL VTPCAAEEQK LPINALSNSL LRHHNLVYST TSRSACQRQK 50

KVTFDRLQVL DSHYQDVLKE VKAAASKVKA NLLSVEEACS LTPPHSAKSK 100

FGYGAKDVRC HARKAVNHIN SVWKDLLEDS VTPIDTTIMA KNEVFCVQPE 150

KGGRKPARLI VFPDLGVRVC EKMALYDVVS KLPLAVMGSS YGFQYSPGQR 200

VEFLVQAWKS KKTPMGFSYD TRCFDSTVTE SDIRTEEAIY QCCDLDPQAR 250

VAIKSLTERL YVGGPLTNSR GENCGYRRCR ASGVLTTSCG NTLTCYIKAQ 300

AACRAAGLRD CTMLVCGNLL VVICESAGVQ EDAASLRAFT EAMTRYSAPP 350

GDPPQPEYDL ELITSCSSNV SVAHDGAGKR VYYLTRDPTT PLARAAWETA 400

RHTPVNSWLG NIIMFAPTLW ARMILMTHFF SVLIARDQLE QALDCEIYGA 450

CYSIEPLDLP PIIQRLHGLS AFSLHSYSPG EINRVAACLR KLGVPPLRAW 500

RHRARSVRAR LLSRGGRAAI CGKYLFNWAV RTKLKLTPIA AAGQLDLSGW 550

FTAGYSGGDI YHSVSRARPR WFWFCLLLLA AGVGIYLLPN R 591

NS5b 유전자형 1b GDD -> GNH 돌연변이(서열번호 23)

SMSYTWTGAL ITPCAAEESK LPINALSNSL LRHHNMVYAT TSRSASQRQK 50

KVTFDRLQVL DDHYRDVLKE MKAKASTVKA KLLSVEEACK LTPPHSAKSK 100

FGYGAKDVRN LSSKAVNHIR SVWKDLLEDT ETPIDTTIMA KNEVFCVQPE 150

KGGRKPARLI VFPDLGVRVC EKMALYDVVS TLPQAVMGSS YGFQYSPGQR 200

VEFLVNAWKS KKNPMGFAYD TRCFDSTVTE NDIRVEESIY QCCDLAPEAR 250

QAIRSLTERL YIGGPLTNSK GQNCGYRRCR ASGVLTTSCG NTLTCYLKAS 300

AACRAAKLQD CTMLVCGNLL VVICESAGTQ EDAASLRVFT EAMTRYSAPP 350

GDPPQPEYDL ELITSCSSNV SVAHDASGKR VYYLTRDPTT PLARAAWETA 400

RHTPVNSWLG NIIMYAPTLW ARMILMTHFF SILLAQEQLE KALDCQIYGA 450

CYSIEPLDLP QIIQRLHGLS AFSLHSYSPG EINRVASCLR KLGVPPLRVW 500

RHRARSVRAK LLSQGGRAAT CGKYLFNWAV RTKLKLTPIP AASQLDLSGW 550

FVAGYSGGDI YHSLSRARPR WFMLCLLLLS VGVGIYLLPN R 591

본 발명의 백신 조성물에서 사용하기 위한 하나 이상의 항원 또는 이의 유도체의 분비는 재조합 항원을 성공적으로 발현하고 분비하기 위해 선택한 박테리아의 능력; 및/또는 항원 특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 반응을 시작하기 위한 재조합 항원의 능력을 포함하는 다양한 방법에서 수행될 수 있다. 하기에서 논의한바, 특정 박테리아 전달 비히클과 사용하기 위한 항원의 최종 분비에 도달하기 위해, 재조합 항원의 이들 속성이 선천성 면역 반응뿐만 아니라 재조합적으로 발현된 HCV 항원에 대한 항원-특이적 T 세포 반응 모두를 시작하기 위한 완전 백신 플랫폼(HCV 항원에 대하여 선별된 박테리아 발현 시스템을 의미)의 능력과 결합되는 것이 바람직하다.

적절한 항원의 초기 결정은 선택한 박테리아 숙(예컨대, 리스테리아)주에 의해 성공적으로 배조합적으로 발현되고, 면역원성인 항원 또는 항원 절편을 선별하는 것에 의해 만들어진다. 본 발명에서 사용된바, "면역원성"에 의한 것은 항원이 항원-특이적 T 세포 반응(CD4+ 및/또는 CD8+)을 이끌어 낼 수 있는 능력을 의미한다. 바람직한 HCV 항원 또는 이의 유도체는 하나 이상의 하기 폴리펩티드 서열을 포함한다: IPVENLETTMRSPVF(서열번호 1); NLETTMRSPVFTDNS(서열번호 2); PPAVPQSFQVAHLHA(서열번호 3); PQSFQVAHLHAPTGS(서열번호 4); FQVAHLHAPTGSGKS(서열번호 5). 다른 바람직한 HCV 항원 또는 이의 유도체는 NS3으로부터 나온 하기 폴리펩티드 서열:

LETTMRSPVFTDNSSPPVVP(서열번호 42);

SPVFTDNSSPPAVPQ(서열번호 43);

VPQSFQVAHLHAPTG(서열번호 44);

FQVAHLHAPTGSGKS(서열번호 45);

KVPAAYAAQGYKVLV(서열번호 46);

PAAYAAQGYKVLVLNPSVAA(서열번호 47);

AAKGYKVLVLNPSVA(서열번호 48);

VLVLNPSVAA(서열번호 49);

AQGYKVLVLNPSVAA(서열번호 50);

QGYKVLVLNPSVAA(서열번호 51);

GYKVLVLNPSVAAT(서열번호 52);

GYKVLVLNPSVAATLGFGAY(서열번호 53);

GVRTITTGSPITYSTYGKFL(서열번호 54);

ITYSTYGKFLADGGCSGGAY(서열번호 55);

LADAGCSGGAYDIIICDE(서열번호 56);

GGAYDIIICDECHST(서열번호 57);

DIIICDECHSTDATS(서열번호 58);

TDATSILGIGTVLDQAETAG(서열번호 59);

ATSILGIGTVLDQAE(서열번호 60);

VIKGGRHLIFCHSKKKCD(서열번호 61);

GRHLIFCHSKR(서열번호 62);

KCDELAAKLVALGIN(서열번호 63);

GINAVAYYRGLDVSVIPTSG(서열번호 64);

IPTNGDVVVVSTDALMTG(서열번호 65);

ALMTGYTGDFDSVID(서열번호 66);

DFDSVIDCNTCVTQTVDF(서열번호 67);

SVIDCNTCVTQTVDFSLDPT(서열번호 68);

CNTCVTQTVDFSLDPTFT(서열번호 69);

NTCVTQTVDFSLDPT(서열번호 70);

PTFTIETTTLPQDAVSRT(서열번호 71);

TQTVDFSLDPTFTIE(서열번호 72);

EQYVDFSLDPTFSIE(서열번호 73);

및/또는 NS5b로부터 나온 하나 이상의 하기 폴리펩티드 서열:

LRHHNLVYSTTSRSACQRQK(서열번호 74);

KVTFDRLQVLDSHYQDVLKE(서열번호 75);

SVWKDLLEDNVTPIDTTIMA(서열번호 76);

KGGRKPARLIVFPDLGVRVC(서열번호 77);

KPARLIVFPDLGVRVCEK(서열번호 78);

KLPLAVMGSSYGFQYSPGQR(서열번호 79);

VEFLVQAWKSKKTPMGFSYD(서열번호 80);

SDIRTEEAIYQCCDLDPQAR(서열번호 81);

QCCDLDPQARVAIKSLTERL(서열번호 82);

GYRRCRASGVLT(서열번호 83)을 포함한다.

재조합 항원을 발현하고 분비하기 위해 선택된 박테리아의 능력은 친수도 도표에 의해 추측되고/또는 아래에서 기술한 것과 같이 웨스턴 블롯에 의해 직접적으로 측정될 수 있다.

어떤 구체예에서, HCV 항원은 관심있는 HCV 항원과 함께 융합 컨스트럭트의 일부로서 사용되는 리스테리아 ActA 단백질 또는 이의 절편의 최대 소수성을 넘어서는 소수성 영역을 갖지 않도록 선택된다. 가장 바람직하게는, HCV 항원은 리스테리아 ActA-N100의 최대 소수성을 넘어서는 소수성 영역을 갖지 않도록 선택된다.

웨스턴 블롯에서 재조합 항원의 발현의 직접적인 검출은 재조합적으로 생산되는 HCV 항원 서열을 검출하는 항체를 사용하거나 융합 단백질로서 HCV 항원과 함께 발현되는 비-HCV 서열("tag")을 검출하는 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 하기에서 기술한 예시에서, 항원은 리스테리아 ActA 단백질의 N-말단 부분과 융합되어 발현되고, ActA의 성숙한 N-말단 18개 아미노산에 상응하는 합성 펩티드(ATDSEDSSLNTDEWEEEK(서열번호24))에 대하여 생긴 항-ActA 항체를 발현된 단백질 산물을 검출하기 위해 사용할 수 있다.

항원의 면역원성을 시험하는 분석들이 본원에 설명되며 본 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 선택한 박테리아에 의해 재조합 생산되는 항원은 선택적으로 그 항원의 카르복실 말단에서 번역틀에 맞게 위치된 8개 아미노 SIINFEKL(서열 번호 25) 펩티드(SL8 및 오브알부민_257-264이라고도 한다)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하도록 구성될 수 있다. C-말단 SL8 에피토프와 같은 조성은, 시험관내 항원 제시 분석을 사용하여, (i) 재조합 항원이 N-말단에서 C-말단까지 전체적으로 발현된다는 것을 증명하고, (ii) MHC I형 경로를 통해 재조합 항원을 제시하는 항원 제시 세포의 능력을 증명하기 위한 대용물로서 사용된다. 이러한 제시 분석은 이후 설명된 대로 B3Z T 세포 하이브리도마 셀라인과 함께 클로닝된 C57BL/6-유래 수지상 셀라인 DC2.4를 사용하여 수행될 수 있다.

또는 달리, 또는 추가하여, 면역원성은 이후 설명된 대로 ELISPOT를 사용하여 시험될 수 있다. ELISPOT 분석은 원래 항원-특이적 항체를 분비하는 B 세포를 하나씩 계수하기 위해 개발되었으며, 이후로는 다양한 작업에, 특히 단일 세포 수준에서 사이토카인-생산 세포를 확인하고 하나씩 계수하는데 알맞게 개조되었다. 적합한 박테리아 백신으로 접종된 동물로부터 비장이 수거될 수 있고, 분리된 비장세포들은 박테리아 백신에 의해서 발현된 하나 이상의 HCV 항원으로부터 유래된 펩티드와 함께 또는 단독으로 하룻밤 인큐베이션될 수 있다. 고정된 항체가 어떤 분비된 IFN-γ를 포획하며, 이로써 다음 단계로서 분비된 IFN-γ를 측정하여 백신에 대한 면역반응을 평가할 수 있다.

3. 박테리아 발현 시스템 - "백신 플랫폼"

일치 서열 항원의 송달을 위한 백신 플랫폼 선택이 효과적인 백신을 위한 또 다른 중요한 요소이다. 많은 박테리아 종들이 백신으로 사용하기 위해서 개발되었으며, 본 발명에서 사용될 수 있는데, 이것들은, 제한은 아니지만, 시겔라 플렉스너리(Shigella flexneri), 에셰리키아 콜리(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 또는 마이코박테리아 종(mycobacterium species)들을 포함한다. 이 리스트는 제한을 의미하지 않는다. 예를 들어, WO04/006837; WO07/103225; 및 WO07/117371을 참조하며, 각각 모든 표, 도면 및 청구범위를 포함하는 전문이 본원에 참고로 포함된다. 백신 조성물에 사용되는 박테리아 벡터는 통성 세포내 박테리아 벡터일 수 있다. 박테리아는 본원에 설명된 폴리펩티드를 숙주 생물의 항원 제시 세포로 송달하는데 사용될 수 있다. 본원에 설명된 대로, 리스테리아 모노사이토제니스가 HCV 항원의 발현을 위한 바람직한 백신 플랫폼을 제공한다.

약화된 미생물과 공생 미생물은 모두 백신 항원의 담체로서 성공적으로 사용되었지만, HCV 항원이나 이들의 유도체에 적합한 박테리아 담체는 선택적으로 약화되거나 죽었지만 대사적으로는 활성이다(KBMA). 제제에 사용되는 담체 균주의 유전적 배경, 약화를 달성하기 위해 선택된 돌연변이 종류 및 면역원의 고유 특성을 조정하여 도출되는 면역반응의 범위와 질을 최적화할 수 있다. 박테리아 담체에 의해 자극되는 면역반응을 최적화하기 위해서 고려되어야 하는 일반적인 요인들은 담체의 선택; 특정한 배경의 균주, 약화 돌연변이 및 약화 수준; 약화된 표현형의 안정화, 및 최적 용량의 확립을 포함한다. 고려해야 할 다른 항원-관련 요인들은 항원의 고유 특성; 발현 시스템, 재조합 표현형의 항원-디스플레이 형태 및 안정화; 조정 분자들의 공-발현 및 백신접종 일정을 포함한다.

이 백신 플랫폼의 바람직한 특징은 재조합 발현된 HCV 항원에 대한 선천 면역반응과 항원-특이적 T 세포 반응을 모두 개시하는 능력이다. 예를 들어, 본원에 설명된 HCV 항원을 발현하는 리스테리아 모노사이토제니스는 간내 1형 인터페론(IFN-α/β)과 케모카인 및 사이토카인의 하류 연쇄반응을 유도한다. 이 간내 면역 자극에 반응하여, NK 세포와 항원 제시 세포(APC)들이 간으로 모인다. 이 세포들은 Lm을 박멸하기 위한 T 세포 반응을 개시하도록 활성화된다; 동시에 리스테리아 모노사이토제니스 백신 플랫폼에 의해 발현된 HCV 항원에 대한 T 세포 반응도 준비된다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 백신 플랫폼은 피험자에게 백신 플랫폼의 송달 후 24시간 뒤에 IL-12p70, IFN-γ, IL-6, TNFα 및 MCP-1으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인 및 케모카인, 바람직하게는 이들 전부의 혈청 농도의 증가를 유도하며, 백신 플랫폼에 의해서 발현된 하나 이상의 HCV 항원에 대한 CD4+ 및/또는 CD8+ 항원-특이적 T 세포 반응을 유도한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 백신 플랫폼은 또한 마우스 모델 시스템에서 DX5, CD11b 및 CD43과 같은 활성화 마커의 상향조절에 의해, 또는 표적 세포로 사용되었던 ⁵¹Cr-표지 YAC-1 세포를 사용하여 측정된 NK 세포-매개 세포용해 활성에 의해서 증명된 것처럼 상주 미성숙 간 NK 세포의 성숙화를 유도한다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 백신 및 면역원성 조성물은 바람직한 HCV 항원을 발현하도록 구성된 리스테리아 모노사이토제니스를 포함할 수 있다. 백신 벡터로서 작용하는 리스테리아 모노사이토제니스의 능력은 Wesikirch et al, Immunol. Rev. 158: 159-169 (1997)에서 검토되었다. 리스테리아 모노사이토제니스의 자연 생태학의 많은 바람직한 특징들로 인하여 이것은 HCV 치료용 백신에 적용할 수 있는 매력적인 플랫폼이 된다. 중심 근거는 리스테리아 모노사이토제니스의 세포내 생활주기가 HCV 감염의 해결에 필요하다고 알려진 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역성의 효과적인 자극을 가능하게 한다는 것이다. TLR들(TLR2, TLR5, TLR9)과 뉴클레오티드-결합 올리고머화 도메인(NOD)을 포함하는 다수 병원체 관련 분자 패턴(PAMP) 수용체들이 감염시 리스테리아 모노사이토제니스 거대분자와의 상호작용에 반응하여 촉발되고, 그 결과 선천면역 이펙터들의 범-활성화와 Th-1 분극화 사이토카인의 방출이 야기되고, HCV 일치 서열 항원에 대항한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 발생에 중대한 영향을 미치게 된다. Lm은 강력한 간내 면역반응을 초래하는 간-상주 APC에 대한 향성 때문에 HCV 백신에 특히 적합하다.

리스테리아 모노사이토제니스의 균주들은 최근에 이종성 단백질의 효과적인 세포내 송달 비히클로서 개발되었으며, 이들은 암 및 HIV와 같은 질환유발제의 주사가 허용되지 않는 임상 조건에서 면역 시스템에 항원을 송달함으로써 면역반응을 유도할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,051,237; Gunn et al., J. Immunol., 167: 6471-6479 (2001); Liau, et al., Cancer Research, 62: 2287-2293 (2002); 미국 특허 번호 6,099,848; WO 99/25376; WO 96/14087; 및 미국 특허 번호 5,830,702를 참조하며, 각각 모든 표, 도면 및 청구범위를 포함하는 전문이 본원에 참고로 포함된다. 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV)를 발현하는 재조합 리스테리아 모노사이토제니스 백신 또한 항원에 대한 보호성 세포-매개 면역성을 유도한다고 알려져 있다(Shen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3987-3991 (1995).

면역원성 조성물에 유용한 리스테리아 모노사이토제니스의 약화되고 죽었지만 대사적으로는 활성인 형태가 생산되었다(WO 07/103225; 및 WO 07/117371, 각각 모든 표, 도면 및 청구범위를 포함하는 전문이 본원에 참고로 포함된다). 리스테리아 모노사이토제니스의 ActA 단백질이 세포내 이동을 초래하는 액틴 동원 및 폴리머화 사건을 촉진하는데 충분하다. 인체 안정성 연구에서는 리스테리아 모노사이토제니스의 actA/plcB-결실된 약화된 형태가 성인에서 심각한 후유증을 일으키지 않았음을 보고했다(Angelakopoulos et al, Infection and Immunity, 70: 3592-3601 (2002)). 또한, 리스테리아 모노사이토제니스 의 다른 타입의 약화된 형태도 설명되었다(예를 들어, WO 99/25376 및 U.S. Pat. No. 6,099,848 참조, 이종성 항원들을 발현하는 약화된 영양요구성 리스테리아 균주들을 설명).

어떤 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물에 사용된 리스테리아 모노사이토제니스는 actA 및/또는 inlB에 약화 돌연변이를 포함하는, 바람직하게는 actA 및 inlB의 전부 또는 일부분이 결실된 약화된 생 균주이고(본원에서는 "Lm ΔactA/inlB"라고 한다), 관심의 HCV 항원의 발현을 암호화하는 재조합 DNA를 함유한다. 이들 항원은 NS5B NS3 일치 서열 항원 중 하나 또는 둘 다로부터 얻어지거나 유래된 하나 이상의 면역원성 서열을 포함하는 것이 가장 바람직하다. HCV 항원은 바람직하게 박테리아 발현 서열의 제어하에 있으며, 리스테리아 모노사이토제니스 게놈에 안정하게 통합된다. 따라서, 이러한 리스테리아 모노사이토제니스 백신 균주는 진핵 전사 또는 번역 요소를 사용하지 않는다.

또한, 본 발명은 적어도 하나의 조절 인자, 예를 들어 프로모터 또는 전사인자에서 약화된 리스테리아를 고찰한다. 다음은 프로모터에 관한 것이다. ActA 발현은 2개의 상이한 프로모터에 의해서 조절된다(Lauer, et al. (2002) J. Bacteriol. 184:4177-4186). 더불어, inlA와 inlB 발현은 5개의 프로모터에 의해서 조절된다 (Lingnau, et al. (1995) Infect. Immun. 63:3896-3903). 전사인자 prfA가 다수의 리스테리아 모노사이토제니스 유전자들, 예를 들어 hly, plcA, ActA, mpl, prfA, 및 iap의 전사에 필요하다. PrfA의 조절 특성은, 예를 들어 PrfA-의존성 프로모터(PinlC) 및 PrfA-박스에 의해서 매개된다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 ActA 프로모터, inlB 프로모터, PrfA, PinlC, PrfA-박스 등 중 적어도 하나에 불활성화된, 돌연변이된, 또는 결실된 암호화 핵산을 제공한다(예를 들어, Lalic Mullthaler et al, (2001) Mol. Microbiol. 42:111-120; Shetron-Rama et al, (2003) Mol. Microbiol. 48: 1537-1551; Luo et al,(2004) Mol. Microbiol. 52:39-52 참조). PrfA는 Gly145Ser 돌연변이, Gly155Ser 돌연변이, 또는 Glu77Lys 돌연변이에 의해서 구성적으로 활성이 될 수 있다(예를 들어, Mueller and Freitag (2005) Infect. Immun. 73:1917-1926; Wong and Freitag(2004) J. Bacteriol. 186:6265-6276; Ripio et al, (1997) J. Bacteriol. 179:1533-1540 참조).

약화는, 예를 들어 열처리 또는 화학적 변형에 의해서 행해질 수 있다. 또한, 약화는, 예를 들어 대사, 세포외 성장 또는 세포내 성장을 조정하는 핵산의 유전자 변형, 병독성 인자, 예를 들어 리스테리아 prfA, ActA, 리스테리오리신(LLO), 부착 매개 인자(예를 들어, inlA 또는 inlB 같은 인터날린), mpl, 포스파티딜콜린 포스포리파제 C(PC-PLC), 포스파디딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C(PI PLC; plcA 유전자)를 암호화하는 핵산의 유전자 변형, 상기의 어떤 조합 등에 의해 행해질 수 있다. 약화는 약화된 리스테리아의 생물학적 기능과 적합한 모 리스테리아에 의해 나타난 상응하는 생물학적 기능을 비교함으로써 평가될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 교차결합제, 솔라렌, 질소 머스타드, 시스플라틴, 벌키 애덕트, 자외선, 감마선 조사, 이들의 어떤 조합 등과 같은 핵산 표적화 제제로 처리함으로써 약화된 리스테리아를 제공한다. 전형적으로, 교차결합제의 한 분자에 의해서 야기된 손상은 이중 나선의 양쪽 가닥의 교차 연결을 포함한다. 또한, 본 발명의 리스테리아는 적어도 하나의 핵산 복구 유전자, 예를 들어 uvrA, uvrB, uvrAB, uvrC, uvrD, uvrAB, phrA, 및/또는 유전자 매개 재조합 복구 유전자, 예를 들어 recA를 돌연변이시킴으로써 약화될 수 있다. 또한, 본 발명은 핵산 표적화 제제와 핵산 복구 유전자의 돌연변이 모두에 의해 약화된 리스테리아를 제공한다. 추가로, 본 발명은 감광성 핵산 표적화 제제, 예를 들어 솔라렌, 및/또는 감광성 핵산 교차결합제, 예를 들어 솔라렌으로 처리한 후, 자외선에 노출시키는 것을 포함한다.

본 발명에서 유용한 약화된 리스테리아는, 예를 들어 각각 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 공개 번호 2004/0228877 및 2004/0197343에서 제공되며, 리스테리아의 특정 균주가 바람직한 약화를 갖는지를 평가하기 위한 다양한 분석이, 예를 들어 각각 전문이 본원에 참고자료로 포함되는 미국 특허 공개 번호 2004/0228877, 2004/0197343, 및 2005/0249748에서 제공된다.

다른 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물에 사용된 리스테리아 모노사이토제니스는 Lm ΔactA/ΔinlB로부터 유래된 사멸형 대사 활성(KBMA)인 플랫폼이며, 또한 뉴클레오티드 절제 복구(NER) 경로의 DNA 복구 효소들을 암호화하는 유전자인 uvrA와 uvrB가 모두 결실되고, 관심의 HCV 항원의 발현을 암호화하는 재조합 DNA를 함유한다. 이들 항원은 NS5B NS3 일치 서열 항원 중 하나 또는 둘 다로부터 얻어지거나 유래된 하나 이상의 면역원성 서열을 포함하는 것이 가장 바람직하다. HCV 항원은 바람직하게 박테리아 발현 서열의 제어하에 있고, 리스테리아 모노사이토제니스 게놈에 안정하게 통합된다. KBMA 플랫폼은 합성 솔라렌, S-59 및 장파 UV 광을 사용한 조합 처리에 의한 광화학적 불활성화에 매우 민감하다. 사멸되었지만 KBMA Lm 백신은 그들의 유전자 산물을 일시적으로 발현할 수 있으며, 이로써 이들은 포식리소좀을 빠져나와 야생형(WT) Lm 및 백신 바이러스 시험감염에 대한 기능적 세포성 면역성과 방어를 유도할 수 있다.

어떤 구체예에서, 약화된 또는 KBMA 리스테리아 모노사이토제니스 백신 균주는 구성적으로 활성인 PrfA 유전자(본원에서는 PrfA* 돌연변이체라고 한다)를 포함한다. PrfA는 세포내 활성화된 전사인자로서, 적합하게 조작된 백신 균주에서 병독성 유전자와 암호화된 이종성 항원(Ag)들의 발현을 유도한다. 상기 주지된 대로, ActA 유전자의 발현은 prfA에 대한 반응이고, ActA 프로모터는 prfA 반응성 조절 요소이다. prfA G155S 대립형질의 함입은 약화된 생 백신 또는 KBMA 백신의 백신 효능에 유의한 증진을 부여할 수 있다. 바람직한 prfA 돌연변이체들이 2008년 5월 19일 제출된 발명의 명칭 "prfA* 돌연변이체 리스테리아를 포함하는 조성물 및 그것의 사용 방법, 미국 가 특허출원 제61/054,454호에 설명되며, 이것은 모든 표, 도면 및 청구범위를 포함하는 전문이 본원에 참고로 포함된다.

잔기 155에 글리신을 포함하는 리스테리아 모노사이토제니스 PrfA의 서열은 다음과 같다 (서열 번호 26):

MNAQAEEFKK YLETNGIKPK QFHKKELIFN QWDPQEYCIF LYDGITKLTS 50

ISENGTIMNL QYYKGAFVIM SGFIDTETSV GYYNLEVISE QATAYVIKIN 100

ELKELLSKNL THFFYVFQTL QKQVSYSLAK FNDFSINGKL GSICGQLLIL 150

TYVYGKETPD GIKITLDNLT MQELGYSSGI AHSSAVSRII SKLKQEKVIV 200

YKNSCFYVQN LDYLKRYAPK LDEWFYLACP ATWGKLN 237

잔기 155에 세린을 포함하는 리스테리아 모노사이토제니스 PrfA*의 서열은 다음과 같다 (서열 번호 27):

MNAQAEEFKK YLETNGIKPK QFHKKELIFN QWDPQEYCIF LYDGITKLTS 50

ISENGTIMNL QYYKGAFVIM SGFIDTETSV GYYNLEVISE QATAYVIKIN 100

ELKELLSKNL THFFYVFQTL QKQVSYSLAK FNDFSINGKL GSICGQLLIL 150

TYVYSKETPD GIKITLDNLT MQELGYSSGI AHSSAVSRII SKLKQEKVIV 200

YKNSCFYVQN LDYLKRYAPK LDEWFYLACP ATWGKLN 237

4. 항원성 구성물

본 발명의 박테리아 백신 균주에 의해서 발현된 항원성 구성물은 발현될 HCV 항원에 융합된, 분비를 지원하도록 박테리아 백신 플랫폼 내에서 작동될 수 있는 분비 서열을 암호화하는 핵산을 최소한 포함하며, 이때 결과의 융합 단백질은 박테리아 백신 플랫폼에 의한 융합 단백질의 발현에 필요한 조절 서열(예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명은 리스테리아 또는 다른 박테리아로부터 분비되는 폴리펩티드 및 펩티드 항원에만 제한되지 않으며, 이들로부터 분비되지 않거나 분비될 수 없는 폴리펩티드 및 펩티드들도 포함한다. 그러나, 바람직하게, HCV 항원은 균주가 수여자에게 접종되었을 때 박테리아 백신 균주에 의해서 가용성의 분비된 형태로 발현된다.

표 2는 이종성 항원과 같은 융합 단백질 파트너 서열과의 융합에서 사용하기 위한 신호 펩티드의 다수의 비제한적 예들을 개시한다. 신호 펩티드는 3개의 도메인을 함유하는 경향을 가진다: 양으로 하전된 N-말단(1-5개 잔기 길이); 가운데 소수성 도메인(7-15개 잔기 길이); 및 중성이지만 극성인 C-말단 도메인.

박테리아 신호 경로. 신호 펩티드는 신호 펩티다제 부위에 의해서 확인된다.
신호 펩티다제 부위 (절단 부위는 ’로 표시)	유전자	속/종
secA1 경로
TEA’KD (서열 번호 28)	hly (LLO)	Listeria monocytogenes
VYA’DT (서열 번호 29)	Usp45	Lactococcus lactis
IQA’EV (서열 번호 30)	pag (방어 항원)
secA2 경로
ASA’ST (서열 번호 31)	iap (침입-관련 단백질) p60	Listeria monocytogenes
VGA’FG (서열 번호 32)	NamA lmo2691 (오토리신)	Listeria monocytogenes
AFA’ED (서열 번호 33)	* BA_0281 (NLP/P60 패밀리)	Bacillus anthracis
VQA’AE (서열 번호 34)	* atl (오토리신)	Staphylococcus aureus
*Tat 경로*
DKA’LT (서열 번호 35)	lmo0367	Listeria monocytogenes
VGA’FG (서열 번호 36)	PhoD (알칼리성 포스파타제)	Bacillus subtillis
* sec 경로에 의해 분비된 박테리아 오토리신 (secA1인지 secA2인지는 결정하지 않음). 분비 서열은, 예를 들어 뉴클레오티드 45434456936 (inlA); 뉴클레오티드 457021457125 (inlB); 뉴클레오티드 18602001860295 (inlC); 뉴클레오티드 286219287718 (inlE); 뉴클레오티드 205819205893 (hly 유전자; LLO) (GenBank Acc. No. P13128 참조); 뉴클레오티드 209470209556 (ActA) (GenBank Acc. No. S20887 참조)에서 Listeria EGD 게놈 (GenBank Acc. No. NC_003210)에 의해 암호화된 지시된 핵산에 의해 포함된다. 참조된 핵산 서열, 및 상응하는 번역된 아미노산 서열, 및 인용된 아미노산 서열, 및 참조와 관련된 또는 참조에서 인용된 상응하는 핵산 서열은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

이후에 설명되는 어떤 전형적인 구체예들에서, HCV 에피토프 서열(들)은 리스테리아 모노사이토제니스 ActA 단백질의 아미노-말단 부분에 융합된 단일 폴리펩티드로서 발현될 수 있으며, 이들은 백신접종된 숙주 내에서 박테리아로부터 HCV 융합 단백질의 발현 및 분비를 허용한다. 이들 구체예에서, 항원성 구성물은 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 이때 융합 단백질은 (a) 변형된 ActA 및 (b) 변형된 ActA 서열에 뒤따라 융합 단백질로서 발현되는 하나 이상의 HCV 에피토프를 포함한다.

"변형된 ActA"는 ActA 서열 전체를 포함하지는 않지만 적어도 ActA 신호 서열은 포함하거나, 또는 이러한 ActA 서열에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는, 리스테리아 모노사이토제니스 ActA 단백질의 연속 부분을 의미한다. ActA 신호 서열은 MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFA(서열 번호 41)이다. 어떤 구체예에서, 프로모터는 WO 07/103225; 및 WO 07/117371로부터의 ActA 프로모터이며, 이들 각각은 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.

예를 들어, 변형된 ActA는 ActA의 적어도 처음 59개의 아미노산, 또는 ActA의 적어도 처음 59개 아미노산에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 변형된 ActA는 ActA의 적어도 처음 100개의 아미노산, 또는 ActA의 적어도 처음 100개 아미노산에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 적어도 약 85% 서열 동일성, 적어도 약 90% 서열 동일성, 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다시 말해서, 어떤 구체예에서, 변형된 ActA 서열은 잔기 100에서 또는 그 이후부터는 절단된 ActA의 N-말단 단편(ActA 신호 서열을 포함하는)에 상응한다.

ActA-N100은 다음의 서열을 가진다(서열 번호 37):

VGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100

이 서열에서 첫 번째 잔기는 발린으로서 표시된다; 리스테리아에 의해 이 위치에 메티오닌이 있는 폴리펩티드가 합성된다. 따라서, ActA-N100은 또한 다음의 서열을 가진다(서열 번호 38):

MGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100

또한, ActA-N100은 변형된 ActA의 C-말단 잔기와 HCV 항원 서열 사이에 놓인 하나 이상의 추가의 잔기를 포함할 수 있다. 다음의 서열에서, ActA-N100은 BamH1 부위의 함입에 의해 첨가된 2개 잔기까지 확장되며:

VGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100

GS 102

(서열 번호39), 이것은 첫 번째 잔기가 메티오닌으로 합성되었을 경우, 서열:

MGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100

GS 102

(서열 번호40)을 가진다.

전형적인 구성물이 이후에 설명되며, 본원에 참고로 포함되는 WO 07/103225에도 설명된다. ANZ-100(이전에는 CRS-100; BB-IND 12884 및 clinicaltrials.gov 식별자 NCT00327652)는 리스테리아 모노사이토제니스 ΔactA/ΔinlB 플랫폼으로 구성되며, 어떤 외인성 항원 발현 서열은 갖지 않는다. WO 07/103225에 설명된 전형적인 구성물에서, 이 플랫폼은 ActA-N100과의 융합체로서 사람 메소텔린을 발현하도록 조작되었다. 이 메소텔린 발현 백신은 CRS-207(BB-IND 13389 및 clinicaltrials.gov 식별자 NCT00585845)을 사용하여 간으로 전이된 진행된 암종을 가진 피험자에서 평가되었으며, 현재 메소텔린을 과발현한다고 알려진 진행된 암종을 가진 피험자에서 임상 1기 시험 평가중이다. 본 발명은 HCV 항원 서열로 메소텔린 서열을 치환함으로써 이 백신을 변형한 것을 고찰한다.

한 생물에 의해 암호화된 서열이 선택된 백신 플랫폼 박테리아 균주에서 최적 발현되도록 반드시 코돈 최적화되는 것이 아니기 때문에, 본 발명은 또한 리스테리아 모노사이토제니스와 같은 박테리아에 의한 발현을 위해 최적화된 코돈에 의해 변형된 핵산을 제공한다.

다양한 구체예에서, 최적 코돈을 제공하기 위해서 어떤 비-최적 코돈들의 적어도 1%가 변화되고, 더 보통은 적어도 5%가 변화되며, 가장 보통은 적어도 10%가 변화되고, 주로 적어도 20%가 변화되고, 더 자주는 적어도 30%가 변화되고, 가장 자주는 적어도 40%, 일반적으로 적어도 50%가 변화되고, 더 일반적으로 적어도 60%가 변화되고, 가장 일반적으로는 적어도 70%가 변화되며, 최적으로는 적어도 80%가 변화되고, 더 최적으로는 적어도 90%가 변화되고, 가장 최적으로는 적어도 95%가 변화되며, 종래대로는 어떤 비-최적 코돈들의 100%가 리스테리아 발현을 위해 코돈-최적화된다(표 3).

리스테리아에서의 발현을 위한 최적 코돈.
아미노산	A	R	N	D	C	Q	E	G	H	I
최적 리스테리아 코돈	GCA	CGU	AAU	GAU	UGU	CAA	GAA	GGU	CAU	AUU
아미노산	L	K	M	F	P	S	T	W	Y	V
최적 리스테리아 코돈	UUA	AAA	AUG	UUU	CCA	AGU	ACA	UGG	UAU	GUU

본 발명은 본 발명의 백신 플랫폼의 제조 또는 유전자 조작을 위한 다수의 리스테리아l 종들 및 균주들을 공급한다. 본 발명의 리스테리아는 표 4에 개시된 종들과 균주들에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 예를 들어 백신으로서 또는 핵산 공급원으로서 사용되기에 적합한 리스테리아 균주들.
리스테리아 모노사이토제니스 10403S 야생형.	Bishop and Hinrichs (1987) J. Immunol. 139:2005-2009; Lauer, etal.(2002)J.Bact.184:4177-4186.
리스테리아 모노사이토제니스 DP-L4056 (파지 처리형). 프로파지-처리된 10403S 균주는 DP-L4056로 칭해진다.	Lauer, etal.(2002)J.Bact.184:4177-4186.
리스테리아 모노사이토제니스 DP-L4027, 이것은 DPL2161, 파지 처리형, hly 유전자 결실형이다.	Lauer, etal.(2002)J.Bact.184:4177-4186;Jones and Portnoy(1994)Infect.Immunity65:5608-5613.
리스테리아 모노사이토제니스 DP-L4029, 이것은 DP-L3078, 파지 처리형, ActA 결실형이다.	Lauer, etal.(2002)J.Bact.184:4177-4186;Skoble,etal.(2000) J. Cell Biol. 150:527-538.
리스테리아 모노사이토제니스 DPL4042 (델타 PEST)	Brockstedt, etal.(2004)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 101:13832-13837; 정보 지원.
리스테리아 모노사이토제니스DP-L4097(LLO-S44A).	Brockstedt, etal.(2004)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 101:13832-13837; 정보 지원.
리스테리아 모노사이토제니스 DP-L4364 (델타 lplA; 리포에이트 단백질 리가제).	Brockstedt, etal.(2004)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 101:13832-13837; 정보 지원.
리스테리아 모노사이토제니스 DP-L4405 (델타 inlA).	Brockstedt, et al.(2004)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 101:13832-13837; 정보 지원.
리스테리아 모노사이토제니스 DP-L4406 (델타 inlB).	Brockstedt, et al.(2004)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 101:13832-13837; 정보 지원.
리스테리아 모노사이토제니스 CS-L0001 (델타 ActA- 델타 inlB).	Brockstedt, et al.(2004)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 101:13832-13837; 정보 지원.
리스테리아 모노사이토제니스 CS-L0002 (델타 ActA- 델타 lplA).	Brockstedt, et al.(2004)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 101:13832-13837; 정보 지원.
리스테리아 모노사이토제니스 CS-L0003 (L461T- 델타 lplA).	Brockstedt, et al.(2004)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 101:13832-13837; 정보 지원.
리스테리아 모노사이토제니스 DP-L4038 (델타 ActA-LLO L461T).	Brockstedt, et al.(2004)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 101:13832-13837; 정보 지원.
리스테리아 모노사이토제니스 DP-L4384 (S44A-LLO L461T).	Brockstedt, et al.(2004)Proc.Natl.Acad. Sci. USA 101:13832-13837; 정보 지원.
리스테리아 모노사이토제니스. 리포에이트 단백질 리가제에 돌연변이 (LplA1).	O’Riordan, et al.(2003)Science302:462-464.
리스테리아 모노사이토제니스 DP-L4017 (10403S hly (L461T) 용혈반응 유전자에 점 돌연변이.	U.S. Provisional Pat. Appl. Ser. No. 60/490,089, 2003년 7월 24일 제출.
리스테리아 모노사이토제니스 EGD.	GenBank Acc. No. AL591824.
	GenBank Acc. No. NC_003210. ATCC Acc. No. BAA-679.
	GenBank Acc. No. AL591975
리스테리아 모노사이토제니스.	ATCC Nos. 13932; 15313; 19111-19120; 43248-43251; 51772-51782.
리스테리아 모노사이토제니스 DP-L4029, uvrAB에 결실.	미국 가특허 출원 번호 60/541,515, 2004년 2월 2일 제출; 미국 가특허 출원 번호 60/490,080, 2003년 7월 24일 제출.
리스테리아 모노사이토제니스 DP-L4029, uvrAB에 결실, 솔라렌 처리.	미국 가특허 출원 번호 60/541,515, 2004년 2월 2일 제출.
리스테리아 모노사이토제니스 ActA-/inlB- 이중 돌연변이체.	2003년 10월 3일에 ATCC에 기탁됨. Acc. No. PTA-5562.
리스테리아 모노사이토제니스 lplA 돌연변이체 또는 hly 돌연변이체.	Portnoy, et al.의 미국 특허 출원 번호 20040013690
리스테리아 모노사이토제니스 DAL/DAT 이중 돌연변이체.	Frankel 및 Portnoy의 미국 특허 출원 번호 20050048081
리스테리아 모노사이토제니스 str. 4b F2365.	GenBank Acc. No. NC_002973.
리스테리아 이바노비	ATCC No. 49954
리스테리아 이노쿠스 Clip11262.	GenBank Acc. No. NC_003212; AL592022.
리스테리아 이노쿠스, PrfA-조절된 병독성 유전자 클러스터를 함유하는 자연 발생 용혈성 균주.	Johnson, et al.(2004)Appl.Environ.Microbiol.70:4256-4266.
리스테리아 시리게리.	Howard, et al.(1992)Appl.Eviron.Microbiol.58:709-712.
리스테리아 이노쿠스, 리스테리아 모노사이토제니스 병원성 섬 유전자 동반.	Johnson , et al.(2004)Appl.Environ.Microbiol.70:4256-4266.
리스테리아 이노쿠스, 리스테리아 모노사이토제니스 인터날린 A 유전자 동반, 예를 들어 플라스미드 또는 게놈 핵산으로서.	예를 들어, Lingnau, et al.(1995) Infection Immunity 63:3896-3903; Gaillard, et al.(1991)Cell65:1127-1141) 참조.
본 발명은 상기 나열된 균주들, 및 예를 들어 플라스미드 및/또는 게놈 통합에 의해서 다음 유전자들 중 하나 또는 어떤 조합을 암호화하는 핵산을 함유하도록 변형된 이들 균주들을 포함하는 시약 및 방법들을 포함하며, 상기 유전자들은 다음과 같다: hly (LLO; 리스테리오리신); iap (p60); inlA; inlB; inlC; dal (알라닌 라세마제); daaA (dat; D아미노산 아미노트랜스페라제); plcA; plcB; ActA; 또는 단일 벽 소포의 성장, 전파, 파괴, 이중 벽 소포의 파괴, 숙주 세포와의 결합, 숙주 세포에 의한 흡수를 매개하는 어떤 핵산. 본 발명은 제한은 상기 개시된 특정 균주들에만 제한되지 않는다.

4. 치료 조성물

본원에 설명된 백신 조성물은 단독으로 또는 제약학적으로 허용되는 부형제와 조합하여, HCV 감염에 대한 적절한 면역반응을 유도하기에 충분한 양으로 숙주에게 투여될 수 있다. 면역반응은, 제한은 아니지만, 특이적 면역반응, 비특이적 면역반응, 특이적 반응과 비특이적 반응 모두, 선천 반응, 1차 면역반응, 후천 면역성, 2차 면역반응, 기억 면역반응, 면역세포 활성화, 면역세포 증식, 면역세포 분화, 및 사이토카인 발현을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신은, 예를 들어 냉동된 상태, 동결건조된 상태, 현탁액, 세포 페이스트, 또는 고상 매트릭스나 겔 메트릭스와의 복합체로서 저장될 수 있다.

어떤 구체예에서, 피험자에게 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 함유하는 백신의 유효 용량을 투여하여 초회 면역반응을 일으킨 후, 2차 백신이 투여된다. 이것은 본 분야에서 "초회-추가" 섭생이라고 한다. 이러한 섭생에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 "초회" 송달로서, "추가" 송달로서, 또는 "초회"와 "추가" 모두로서 사용될 수 있다.

예를 들어, 항원 폴리펩티드(들)를 암호화하여 발현하는 사멸형 대사 활성 리스테리아로 이루어진 1차 백신이 초회 송달될 수 있고, 항원 폴리펩티드(들)을 암호화하는 약화형 대사 활성 리스테리아로 이루어진 2차 백신이 추가 송달될 수 있다. 그러나, 초회와 추가가 각각 본 발명의 방법 및 조성물을 사용할 필요는 없다는 것이 이해되어야 한다. 오히려, 본 발명은 다른 백신 양식을 본 발명의 박테리아 백신 방법 및 조성물과 함께 사용하는 것을 고찰한다. 다음은 적합한 혼성 초회-추가 섭생의 예들이다: DNA(예를 들어, 플라스미드) 백신 초회/박테리아 백신 추가; 바이러스 백신 초회/박테리아 백신 추가; 단백질 백신 초회/박테리아 백신 추가; 단백질 백신 초회/박테리아 백신 추가; DNA 초회/박테리아 백신 추가 + 단백질 백신 추가; 박테리아 백신 초회/DNA 백신 추가; 박테리아 백신 초회/바이러스 백신 추가; 박테리아 백신 초회/단백질 백신 추가; 박테리아 백신 초회/박테리아 백신 추가 + 단백질 백신 추가; 등. 이 리스트는 제한을 의미하지 않는다.

초회 백신과 추가 백신은 동일한 경로로 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 용어 "상이한 경로"는, 제한은 아니지만, 상이한 신체 부위, 예를 들어 경구, 비-경구, 장, 비경구, 직장, 절내(림프절), 정맥내, 동맥, 피하, 근육내, 종양내, 종양주위, 종양내, 주입, 점막, 코, 뇌척수 공간 또는 뇌척수액 등의 부위, 및 상이한 방식, 예를 들어 경구, 정맥내, 및 근육내 방식에 의한 투여를 포함한다.

초회 또는 추가 백신의 유효량은 1회 용량에 제공될 수 있지만, 1회 용량에 제한되지는 않는다. 따라서, 투여는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 15회, 16회, 17회, 18회, 19회, 20회 이상의 백신 투여일 수 있다. 본 방법에서 백신 또는 백신들이 1회 넘게 투여되는 경우, 투여 사이에는 시간 간격이 있을 수 있고, 이 간격은 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 또는 그 이상, 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간 등등일 수 있다. 시간과 관련해서, 용어 "약"은 30분 이내의 시간 간격의 플러스 또는 마이너스를 의미한다. 또한, 투여 사이에는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일의 간격, 및 이들이 조합된 간격이 있을 수 있다. 본 발명은 투약 간격이 동일한 시간만큼 벌어진 것에만 제한되지 않으며, 동일하지 않은 간격으로 투약하는 것도 포함하는데, 1일, 4일, 7일, 및 25일에 투여하는 것으로 구성된 초회 백신 투여 일정을 예로 들 수 있으며, 이것은 비제한적 예이다.

어떤 구체예에서, 추가 백신접종의 투여는 초회 백신접종이 개시된 후 약 5일; 초회 백신접종이 개시된 후 약 10일; 약 15일; 약 20일; 약 25일; 약 30일; 약 35일; 약 40일; 약 45일; 약 50일; 약 55일; 약 60일; 약 65일; 약 70일; 약 75일; 약 80일; 약 6개월; 및 초회 백신접종의 투여가 개시된 후 약 1년째에 개시될 수 있다. 바람직하게, 초회와 추가 백신접종 중 하나 또는 둘 모두가 본 발명의 조성물의 송달을 포함한다.

"제약학적으로 허용되는 부형제" 또는 "진단학적으로 허용되는 부형제"는 제한되지는 않지만, 멸균 증류수, 식염수, 인산염 완충 용액, 아미노산 베이스 버퍼, 또는 중탄산염 완충 용액을 포함한다. 부형제 선택 및 부형제 사용량은 투여 방식에 따를 것이다. 투여는 경구, 정맥내, 피하, 진피, 진피내, 근육내, 점막, 비경구, 장기내, 병소내, 비내, 흡입, 안구내, 근육내, 혈관내, 절내, 난절, 직장, 복강내 경로에 의해, 또는 잘 공지된 여러 투여 경로 중 하나 또는 어떤 조합에 의해 이루어질 수 있다.

비-경구 경로에 의한 본 발명의 백신의 투여는 관용성을 피할 수 있다. 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 경구, 점막내, 도뇨관, 생식관, 위장관, 또는 흡입 경로에 의한 투여를 위한 방법이 본 분야에 공지되어 있다.

특정 환자에 대한 유효량은 치료될 상태, 환자의 전반적인 건강, 투여 경로 및 용량 그리고 부작용의 중증도와 같은 요인들에 따라서 변할 수 있다. 치료 및 진단 방법에 대한 지침을 이용할 수 있다(예를 들어, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK 참조).

본 발명의 백신은 용량, 또는 용량들로 투여될 수 있으며, 이때 각 용량은 적어도 1000 박테리아 세포/kg 체중; 보통은 적어도 10,000 세포; 더 보통은 적어도 100,000 세포; 가장 보통은 적어도 100만 세포; 주로 적어도 1000만 세포; 더 자주는 적어도 1000만 세포; 전형적으로 적어도 10억 세포; 일반적으로 적어도 100억 세포; 종래에는 적어도 1000억 세포; 그리고 때로는 적어도 1조 세포/kg 체중을 포함한다. 본 발명은 상기 용량을 제공하는데, 이 경우 박테리아 투여 단위는 콜로니 형성 단위(CFU), 솔라렌 처리 전의 CFU의 등가량이거나, 또는 단위는 박테리아 세포수이다.

본 발명의 백신은 용량, 또는 용량들로 투여될 수 있으며, 이때 각 용량은 10⁷ 내지 10⁸ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 2 x 10⁷ 내지 2 x 10⁸ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 5 x 10⁷ 내지 5 x 10⁸ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 10⁸ 내지 10⁹ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 2.0 x 10⁸ 내지 2.0 x 10⁹ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 5.0 x 10⁸ 내지 5.0 x 10⁹ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 10⁹ 내지 10¹⁰ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 2 x 10⁹ 내지 2 x 10¹⁰ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 5 x 10⁹ 내지 5 x 10¹⁰ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 10¹¹내지 10¹² 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 2 x 10¹¹ 내지 2 x 10¹² 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 5 x 10¹¹ 내지 5 x 10¹² 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 10¹² 내지 10¹³ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적); 2 x 10¹² 내지 2 x 10¹³ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 5 x 10¹² 내지 5 x 10¹³ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 10¹³ 내지 10¹⁴ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 2 x 10¹³ 내지 2 x 10¹⁴ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 5 x 10¹³ 내지 5 x 10¹⁴ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 10¹⁴ 내지 10¹⁵ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 2 x 10¹⁴ 내지 2 x 10¹⁵ 박테리아/70kg 체중(또는 /1.7㎡ 표면적; 또는 /1.5kg 간 중량); 등등(습 중량)을 포함한다.

또한, 상기 용량 중 하나 이상이 제공되며, 이 경우 용량은 격일로 1회 주사, 2일마다 1회 주사, 3일마다 1회 주사, 4일마다 1회 주사, 5일마다 1회 주사, 6일마다 1회 주사, 또는 7일마다 1회 주사의 방식으로 투여되고, 이때 주사 일정은, 예를 들어 단지 하루, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 또는 그 이상 동안 유지된다. 또한, 본 발명은 상기 용량과 일정의 조합을 포함하며, 예를 들어 비교적 큰 초기 박테리아 용량 후에 비교적 작은 후속 용량, 또는 비교적 작은 초기 용량 후에 큰 용량의 일정을 포함한다.

예를 들어, 1회/주, 2회/주, 3회/주, 4회/주, 5회/주, 6회/주, 7화/주, 2주마다 1번, 3주마다 1번, 4주마다 1번, 5주마다 1번 등의 투약 일정이 본 발명에서 이용될 수 있다. 투약 일정은, 예를 들어 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 및 12개월의 시간의 전 기간 동안 투약하는 것을 포함한다.

상기 투약 일정들의 사이클이 제공된다. 이 사이클은 대략, 예를 들어 7일마다; 14일마다; 21일마다; 28일마다; 35일마다; 42일마다; 49일마다; 56일마다; 63일마다; 70일마다 등등으로 반복될 수 있다. 투약 사이클 사이에 투약하지 않는 기간이 있을 수 있으며, 이 경우 기간은 대략, 예를 들어 7일; 14일; 21일; 28일; 35일; 42일; 49일; 56일; 63일; 70일; 등등일 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "대략"은 플러스 또는 마이너스 1일, 플러스 또는 마이너스 2일, 플러스 또는 마이너스 3일, 플러스 또는 마이너스 4일, 플러스 또는 마이너스 5일, 플러스 또는 마이너스 6일, 또는 플라스 또는 마이너스 7일을 의미한다.

본 발명은 경구로 리스테리아를 투여하는 방법을 포함한다. 또한, 정맥내로 리스테리아를 투여하는 방법이 제공된다. 더욱이, 경구, 근육내, 정맥내, 진피내 및/또는 피하로 리스테리아를 투여하는 방법이 제공된다. 본 발명은 고기-기반, 또는 고기 또는 동물 산물로부터 유래된 폴리펩티드를 함유하는 배지에서 성장시킴으로써 제조된 리스테리아 박테리아, 또는 리스테리아 박테리아의 배양물 또는 현탁액을 제공한다. 또한, 본 발명에 의해서 고기 또는 동물 산물을 함유하지 않은 배지에서 성장시킴으로써 제조된, 또는 식물성 폴리펩티드를 함유하는 배지에서 성장시킴으로써 제조된, 효모 산물에 기반하지 않는 배지에서 성장시킴으로써 제조된, 또는 효모 폴리펩티드를 함유하는 배지에서 성장시킴으로써 제조된, 리스테리아 박테리아, 또는 리스테리아 박테리아의 배양물 또는 현탁액이 제공된다.

추가 치료제와의 병용-투여 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다(Hardman et al (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA).

본 발명은 본 발명의 백신 조성물과 함께 투여하기 위한 시약들을 제공한다. 이들 시약은 IFN-α, 리바비린, 레보비린, 비라미딘, 텔라프레비르, 보세프레비르, PEG-IFN-α 및 다른 면역치료제들을 포함하는 다른 HCV 치료제들을 포함한다. 이 리스트는 제한을 의미하지 않는다. 시약들은 본 발명의 백신 조성물과 동시에 또는 그와 독립적으로(이전에 또는 이후에) 투여될 수 있다. 예를 들어, 시약은 본 발명의 백신 조성물 직전에(또는 직후에), 같은 날에, 본 발명의 백신 조성물 하루 전에(또는 후에), 1주 전에(또는 후에), 1개월 전에(또는 후에), 또는 2개월 전에(또는 후에) 등등의 일정으로 투여될 수 있다.

세포용해성 T 세포 반응을 상승시키는데 유리한 추가의 제제가 또한 사용될 수 있다. 이러한 제제는 본원에서 담체라고 칭해진다. 이들은, 제한은 아니지만, B7 공-자극성 분자, 인터류킨-2, 인터페론-γ, GM-CSF, CTLA-4 길항제, OX-40/OX-40 리간드, CD40/CD40 리간드, 사그라모스팀, 레바미솔, 우두 바이러스, Bacille Calmette-Guerin(BCG), 리포솜, 명반, Freund's 완전 또는 불완전 애쥬번트, 독소제거된 엔도톡신, 미네랄 오일, 표면 활성 물질, 예를 들어 리포레시틴, Pluronic 폴리올, 폴리애니온, 펩티드, 및 오일 또는 탄화수소 에멀젼을 포함한다. 항체 반응에 비하여 세포용해성 T 세포 반응을 우선적으로 자극하는 T 세포 면역반응을 유도하는 담체들이 바람직하지만, 두 종류의 반응을 모두 자극하는 것들도 사용될 수 있다. 제제가 폴리펩티드인 경우, 폴리펩티드 자체나 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 투여될 수 있다. 담체는 세포, 예를 들어 항원 제시 세포(APC) 또는 수지상 세포일 수 있다. 항원 제시 세포는 대식세포, 수지상 세포 및 B 세포와 같은 세포 타입을 포함한다. 다른 전문적인 항원 제시 세포들은 단핵구, 변연부 Kupffer 세포, 미세아교세포, 랑게르한스 세포, 깍지형 수지상 세포, 여포성 수지상 세포, 및 T 세포를 포함한다. 통성 항원 제시 세포가 또한 사용될 수 있다. 통성 항원 제시 세포의 예들은 성상세포, 여포성 세포, 내피 및 섬유아세포를 포함한다. 담체는 폴리펩티드를 발현하거나 폴리뉴클레오티드를 송달하도록 변형된 박테리아 세포일 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 백신접종된 개체의 세포에서 뒤이어 발현된다. 수산화 알루미늄 또는 알루미늄 포스페이트와 같은 애쥬번트가 면역반응을 촉발, 증진 또는 연장하는 백신의 능력을 높이기 위해 첨가될 수 있다. 추가의 물질, 예를 들어 사이토카인, 케모카인 및 CpG 같은 박테리아 핵산 서열, toll-유사 수용체(TLR) 9 작용제뿐만 아니라 리포단백질을 포함하는 TLR 2, TLR 4, TLR 5, TLR 7, TLR 8, TLR 9에 대한 추가의 작용제들, LPS, 모노포스포릴 리피드 A, 리포테이코산, 이미퀴모드, 레시퀴모드, 및 개별적으로 또는 설명된 조성물들과 조합하여 사용되는 다른 유사한 면역 조정제들이 또한 잠재적인 애쥬번트들이다. 애쥬번트의 다른 대표적인 예들은 Quillaja saponaria 및 Corynebacterium parvum의 나무껍질로부터 정제된 동종성 사포닌을 포함하는 합성 애쥬번트 QS-21을 포함한다 (McCune et al., Cancer, 1979; 43:1619). 애쥬번트는 최적화된다는 것이 이해될 것이다. 다시 말해서, 당업자는 관례적 실험을 통해서 최상의 사용을 위한 애쥬번트를 결정할 수 있다.

치료제의 유효량은 일반적으로 적어도 10%까지, 더 일반적으로 적어도 20%까지, 가장 일반적으로 적어도 30%까지, 전형적으로 적어도 40%까지, 더 전형적으로 적어도 50%까지, 가장 전형적으로 적어도 60%까지, 주로 적어도 70%까지, 더 자주는 적어도 80%까지, 가장 자주는 적어도 90%까지, 종래대로는 적어도 95%까지, 더 종래대로는 적어도 99%까지, 가장 종래대로는 적어도 99.9%까지 증상들을 감소 또는 완화하는 양이다.

본 발명의 시약 및 방법들은 단지 1회 백신접종을 포함하는; 또는 1차 백신접종을 포함하는; 또는 적어도 1회의 추가 백신접종; 적어도 2회의 추가 백신접종; 또는 적어도 3회의 추가 백신접종을 포함하는 백신을 제공한다. 추가 백신접종을 위한 변수들에 대한 지침을 이용할 수 있다(예를 들어, Marth (1997) Biologicals 25:199-203; Ramsay, et al. (1997) Immunol. Cell Biol. 75:382-388; Gherardi, et al. (2001) Histol. Histopathol. 16:655-667; Leroux-Roels, et al. (2001) ActA Clin. Belg. 56:209-219; Greiner, et al. (2002) Cancer Res. 62: 6944-6951; Smith, et al. (2003) J. Med. Virol. 70:Suppl.1:S38-S41; Sepulveda-Amor, et al. (2002) Vaccine 20:2790-2795 참조).

치료제들의 조제물은, 예를 들어 동결건조 분말, 슬러리, 수성 용액 또는 현탁액의 형태로 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합하여 저장용으로 제조될 수 있다(예를 들어, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY 참조).

실시예

다음 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 이들 실시예들은 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하지 않는다.

실시예 1: ANZ 100의 개발

그 자체가 야생형 리스테리아 모노사이토제니스 균주 10403의 스트렙토마이신-내성 변이체인 리스테리아 모노사이토제니스 균주 10403S의 프로파지 무함유 유도체인 리스테리아 모노사이토제니스 균주 DP L4056로부터 리스테리아 모노사이토제니스 ANZ 100 백신 플랫폼 균주를 얻었다. 균주 Lm 10403이 사람 피부 병소로부터 최초로 분리되었고(Edman 1968), 스트렙토마이신-내성 균주는 10403S는 Bishop and Hinrichs(Bishop 1987)에 의해 최초로 설명되었다. 10403S 중의 스트렙토마이신 내성을 리보솜 단백질 유전자 rpsL의 코돈 56에 나타난 단일 돌연변이에 따라 지도화했으며, 여기서는 T의 C로의 핵산 치환의 결과로서 위치 56에서 K(Arg) 아미노산 대신에 R(Lys)가 삽입되었고, Lm 10403S로부터 균주 DP L4056를 분리하는데 사용된 과정은 이미 상세히 설명되었다(Lauer 2002).

actA와 inlE 병독성 유전자의 제거를 동종성 재조합에 의해 달성되었다. 각 유전자의 결실에는 세 단계가 필요했다: (1) 결실 대립형질을 함유하는 재조합 플라스미드의 구성, (2) 숙주 염색체에 플라스미드의 통합, 및 (3) 플라스미드 벡터 서열과 야생형 대립형질의 절제. Lm ΔactA/ΔinlB 균주 CERS 382.20을 마우스에서의 병독성 및 면역원성에 기초하여 2개의 PCR-양성 후보로부터 선택했다. 경쟁 지수 분석을 사용하여 C57B1/6 마우스에서의 병독성을 평가했다. 두 후보 모두 동등하게 약화되었고, 비-파지 치유된(non-phage cured) ΔactA/ΔinlB 연구 균주에서 유사한 수준의 약화가 관찰되었다. 다음에, 후보들을 Balb/C 마우스에서 면역우성 Kd-제한된 LL0 에피토프에 대해 특이적인 T-세포를 초회 자극하는 능력에 대해 시험했다. 후보들과 비-파지 치유된 ΔactA/ΔinlB 균주 사이에 면역효능에 구별되는 차이는 없었다. 두 후보 모두 약화과 면역효능에 기초하여 비-파지 치유된 연구 균주와 비슷했으므로, 한 후보(CERS 382.20)를 선택하여 더 특성화했다.

Lm 균주 CERS 382.20 및 DP L4056의 신선한 콜로니 현탁액으로부터 actA와 inlE 유전자좌를 모두 포함하는 중첩형 PCR 산물을 증폭시켰다. PCR 산물을 서열화하고, 각 유전자좌에 대한 단일 연속 DNA 서열에 조립해 넣어, CERS 382.20에서 actA와 inlB 두 유전자의 정확한 시작- 내지 중단-코돈 결실을 확인했다. 10403S에 설명된 코돈 56의 rpsL 돌연변이는 CERS 382.20에 보존되었고, 염색체 DNA로부터 정확히 증폭된 PCR 산물의 서열 분석에 의해 기록했다. CERS 382.20의 스트렙토마이신-내성 표현형은 선택성 배지에서의 성장에 의해 증명되었다. 스트렙토마이신-내성 표현형을 사용하여 임상 균주 확인을 쉽게 하고, 그것을 다른 리스테리아 및 비-리스테리아 종들과 구별한다.

실시예 2: HCV 항원의 평가

Kyte-Doolittle 수치료법 플롯은 단백질의 소수성 특성을 묘사하기 위해 광범하게 적용되는 스케일이다. 각 아미노산 잔기에 대한 용매화 엔탈피와 5-7개 아미노산의 슬라이딩 윈도우에 걸쳐 그 값들의 합으로부터 소수성을 계산한다. 0 이상의 값을 가진 영역들이 소수성으로 특정된다. NCV 코어, NS3 및 NS5b 항원의 초기 Kyte-Doolittle 평가는 ActA-N100로부터 얻어진 최고 소수성 값 이하인 영역들을 확인하기 위한 것이었다. 이것을 초과하는 값들은 리스테리아에서 잘 발현하지 않는 폴리펩티드 서열을 나타낼 수 있다. 이들 결과를 도 7에 나타낸다.

도 8은 웨스턴 블롯에 의해 측정된 다양한 ActA-N100 HCV 항원 융합체들의 리스테리아에 의한 항원 재조합 발현을 나타낸다. 각 HCV 서열(코어 서열 1-190, 1-180 및 1-177; NS3 서열 1-631, 1-484, 22-631, 22-484, 22-280, 172-484, 172-631 및 416-631; 및 NS5 서열 1-574, 1-342, 320-591, 및 320-574)이 박테리아 프로모터(리스테리아 모노사이토제니스 ActA 프로모터)의 제어하에 항원 발현 카세트로부터 ActA-N100 융합체로서 발현되었다. 발현 카세트는 리스테리아 모노사이토제니스 게놈에 안정하게 통합되었다. 숙주 세포에서의 높은 유도성으로 인해 리스테리아 모노사이토제니스 actA 프로모터가 선택되었다.

0.7(후반 log)의 OD₆₀₀까지 효모 추출 배지에서 성장시킨 박테리아 배양물의 TCA-침전된 상청액들의 동등한 양에서 육즙 배양물의 웨스턴 블롯을 수행했다. Lm 감염된 숙주 세포의 웨스턴 블롯에서는, J774 세포 또는 DC2.4 세포를 1시간 동안 50 또는 100의 감염 다중도(MOI)로 접종하고, 세포를 50㎍/mL 겐타마이신으로 보충된 PBS 및 DMEM 배지로 3번 세척했다. 초반 시간 지점에서, 감염 후 1.5 또는 2.5 시간째에 DC2.4를 수거했다. 후반 시간 지점에서, 7시간째에 J774 세포를 수거했다. 세포를 SDS 샘플 버퍼에 용해하고, 수집하고, 4-12% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전개시키고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겨서 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. 모든 웨스턴 블롯은 ActA 단백질의 성숙한 N-말단에 대해 생긴 폴리클로날 항체를 이용했다.

이 도면에서, 각 패널에서 레인 1 및 2는 음성 및 양성 대조군으로서, 항원 삽입체가 없는 것과 리스테리아 균주 CRS-207에 의한 메소텔린 발현을 나타낸다. 패널 A는 레인 3, 4 및 5에서 코어 서열 1-190, 1-180, 및 1-177을 나타낸다. 패널 B는 레인 3-10에서 NS3 서열 1-631, 1-484, 22-631, 22-484, 22-280, 172-484, 172-631, 및 416-631을 나타낸다. 패널 C는 레인 3-7에서 NS5 서열 1-574, 1-342, 320-591, 및 320-574를 나타낸다. 이들 도면에 나타난 대로, NS3_172-484는 NS5b_1-342과 마찬가지로 강한 발현을 나타낸다. 도 8에서 화살표는 발현된 서열로부터 예측된 것보다 실질적으로 낮은 분자량으로 생산된 단백질 산물을 나타낸다.

또한, 재조합 리스테리아 모노사이토제니스로부터의 이런 다양한 ActA-N100 HCV 항원 융합체들의 재조합 발현을 사용하여 무손상 C-말단 SL8 마우스 T 세포 에피토프의 존재를 평가했다. SL8 에피토프는 재조합 항원이 N-말단에서 C-말단까지 전체적으로 발현된다는 것을 증명하고, MHC I형 경로를 통해 재조합 항원을 제시하는 항원 제시 세포의 능력을 증명하기 위한 택으로서 사용된다. 각 리스테리아 모노사이토제니스를 사용하여 DC2.4 세포를 감염시켰다. 감염에 의해 재조합 L.　monocytogenes는 DC2.4 세포 내에서 융합 폴리펩티드를 발현하여 분비했다. DC2.4 세포가 펩티드를 적절히 제시한다면, 이것은 리포터 T 세포 하이브리도마 라인(B3Z T 세포 하이브리도마)에 의해서 검출될 수 있다. 결과를 다음 표에 나타낸다:

항원 구성물	OD ₅₉₅
코어 서열
1-190	0.27
1-180	0.32
1-177	0.33
NS3 서열
1-631	0.82
1-484	0.83
22-631	0.83
22-484	0.43
22-280	0.88
172-484	0.88
172-631	0.9
416-631	0.9
NS5 서열
1-574	0.35
1-342	0.88
320-591	0.18
320-574	0.55

Kyte-Doolittle 수치료법 분석, 단백질 발현 결과, 및 항원 제시 데이터에 기초하여, NS5B 단백질의 아미노산 1-342와 NS3의 아미노산 172-484를 백신 구성물에 사용하도록 선택했다.

실시예 3: ANZ 521의 개발

리스테리아 모노사이토제니스 균주 ANZ 521은 ANZ 100 백신 플랫폼에 기초한 리스테리아 백신 균주이다. ANZ 521의 기원 및 유도 과정을 나타낸 도해가 도 1에 제공된다.

ANZ 521을 개발하기 위해, 박테리아 프로모터(리스테리아 모노사이토제니스 ActA 프로모터)의 제어하에 HCV 유전자 산물 NS5b 및 NS3의 일부분을 암호화하는 항원 발현 카세트(도 2의 A)를 구성했다. 발현 카세트는 리스테리아 모노사이토제니스 게놈(도 2의 B)에 안정하게 통합되었다. 숙주 세포에서의 높은 유도성으로 인해 리스테리아 모노사이토제니스 actA 프로모터가 선택되었다. NS5b와 NS3 서열을 포함하는 HCV 항원은 ActA 단백질의 아미노-말단 100개 아미노산에 융합된 단일 폴리펩티드로서 발현되며("ActA-N100"), 이것은 백신접종된 숙주에서 감염된 APC의 환경 안에서 박테리아로부터 HCV NS5B-NS3 융합 단백질의 발현 및 분비를 최대화한다.

발현된 성숙한 ActA-N100-HCV NS5B-NS3 융합 단백질은 730개 아미노산 길이이고, 예측된 분자량은 78.5kDa이다. NS5b-NS3 항원 발현 카세트는 NS5b 단백질의 아미노산 1-342(전장 NS5b는 591aa이다), 및 NS3의 아미노산 172-484(전장 NS3은 631aa이다)를 암호화한다. HCV NS5b-NS3 아미노산 서열을 HCV NS5b 및 NS3 일치 서열(Cox 2005, Ray 2005)로부터 얻었고, 리스테리아 모노사이토제니스에서의 발현을 위한 최적 코돈을 이용하기 위해 암호화 DNA 서열을 재합성했다. 항원들은 절단되고 융합 단백질로서 리스테리아 모노사이토제니스로부터 합성되어 분비되기 때문에, 자신의 원래 구조나 활성을 가질 것 같지는 않지만, 이 단백질들이 자신의 내인성 활성도 가지지 않도록 확실히 하기 위해서, 각 단백질의 활성에 중요한 모티프들에 부위-특이적 돌여변이들을 유발했다. NS5B 폴리머라제가 기능을 갖지 않도록 확실히 하기 위해서, 이중 돌연변이를 불활성화하는 GDD 내지 GNH(NS5b의 아미노산 319에서 시작하는)를 함유하도록 아미노산 서열을 변경했으며, 이때 각 변화는 RNA 폴리머라제 활성을 완전히 불화성화한다(Lohmann 1997). NS3 헬리카제 활성을 불활성화하기 위해서, 모티프 II(DECH)를 NS3의 아미노산 292에서 시작하는 AASH로 돌연변이시켰다 (Wardell 1999). 이 구성물에서는 촉매 세린이 제시되지 않으므로 NS3은 프로테아제 활성을 갖지 않는 것 같다(Bartenschlager 1993).

ActA-N100-HCV NS5B-NS3 일치 서열 항원 발현 카세트를 표준 대립형질 교환 기술을 사용하여 Lm ΔActA/ΔinlB "모" 균주 염색체의 (Δ)inlB 유전자좌에 삽입했다. 균주 382.20의 염색체의 inlB 유전자좌에 상동성 재조합을 지시하는 대립형질 교환 백터를 구성했다(도 3의 A). 먼저, 중첩 확장(SOE) PCR에 의한 스플라이싱을 사용하여 inlB 유전자좌의 상동성 상류의 1315bp와 inlB 유전자좌의 상동성 하류의 1265bp를 융합했다. 특유의 KpnI 및 SacI 제한 효소 부위를 상류와 하류 상동성의 접합부에 부가했고, 이것을 사용하여 HCV NS5b-NS3 항원 카세트를 벡터에 삽입했다. 결과의 2606bp PCR 산물을 전달 기원(oriT)을 함유하도록 변형된 대립형질 교환 벡터 pKSV7(Smith 1992)의 유도체인 온도 민감성 대립형질 교환 벡터 pBHE261에서 클로닝했고, 이로써 콘쥬게이션이 촉진되어 "pBHE1151 inlB 대립형질 교환 벡터" 플라스미드가 얻어졌다. 다음에, actA 프로모터, actA 유전자의 아미노-말단 300bp(ActA-N100 단편을 암호화하는), 및 코돈-최적화된 HCV NS5b-NS3 일치 서열 항원 융합체로 구성된 발현 카세트를 pBHE1151 inlB 대립형질 교환 벡터에서 클로닝하여, 플라스미드 pBHE1366을 얻었다(도 3의 B).

플라스미드 pBHE1366을 콘쥬게이션에 의해 균주 CERS 382.20로 전달했고, 클로람페니콜(Cm)로 보충된 플레이트 위에서 30℃에서 트랜스콘쥬게이션체들을 선택했다. 각 플라스미드-함유 콜로니들을 집어내어 육즙 배양물에서 42℃에서 2번 계대 배양한 다음, 가온해 둔 Cm 플레이트 위에 평판하여 inlB 유전자좌에서 플라스키드가 통합된 것들을 선택했다. 고온 플레이트에서 단일 콜로니들을 집어내어 육즙에서 30℃에서 5-10번 계대 배양하고, 30℃에서 단일 콜로니들을 평판했다. 다음 기준에 기초하여 HCV NS5b-NS3 일치 서열 발현 카세트를 함유하는 클론들을 선택했다: 스트렙토마이신 내성, 클로람페니콜 민감성, HCV NS5b-NS3 서열에 대한 PCR 양성, pKSV7 벡터 서열에 대한 PCR 음성, 및 NS5b-암호화 서열 삽입 내에서 어닐링한 프라이머와 상동성 재조합을 지시하기 위해 사용된 1.3 kb의 외부 제 2 프라이머를 사용한 PCR에 의한 게놈 유전자좌의 확인.

ActA의 성숙한 N-말단에 대해 생긴 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 Lm 감염된 DC2.4 조직 배양 세포에서 ActA-N100-HCV NS5B-NS3 융합 단백질의 발현에 대해 클론들을 스크리닝했다. 마지막 클론(BH2064)이 inlB 유전자좌에서 완전히 서열화되었으며, 이로써 발현 카세트의 정확한 삽입이 확인되었고, 이것을 마우스 감염 모델에서 HCV-특이적 T 세포 반응의 유도 및 생체분포에 대해서 시험했다.

제조한 ANZ-521 백신 제품은 Dulbecco's 인산염 완충 식염수(DPBS)와 9% v/v 글리세롤 중에 1 x 10¹⁰ cfu/mL의 공칭 역가 농도의 약화된 리스테리아 모노사이토제니스 균주 BH2064를 1.5 mL 포함한다. 이 제품은 -60℃ 이하에서 냉동하여 보관될 수 있다.

실시예 4: 박테리아 발현된 HCV 항원의 면역원성

재조합 리스테리아 모노사이토제니스는 마우스에서 암호화된 이종성 항원에 대해 강력한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역성을 유도하는 것으로 나타났다. NS5b- 및 NS3-특이적 T 세포 면역성을 유도하는 Lm ΔActA/ΔinlB 발현 HCV NS5b-N3의 능력을 다양한 마우스 계통에서 1회 면역화 후 결정했다. 처음에는 HCV 항원 서열의 C-말단에 추가의 SL8 마우스 T 세포 에피토프를 함유하는 구성물을 사용하여 면역원성을 정립했다. 이것을 나중에 SL8 에피토프를 결여한 ANZ 521을 사용하여 확인했다.

NS5b- 및 NS3-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 11개 아미노산까지 중첩되는 은닉형 15개 아미노산 펩티드들을 포함하는 펩티드 라이브러리를 사용하여 세포내 사이토카인 분석 또는 ELISPOT 분석에 의해서 결정했다. 라이브러리들은 HCV NS5b 및 NS3의 완전 서열에까지 범위가 미친다. NS5b 펩티드 라이브러리의 풀 1과 2는 NS5b 단편을 커버하고; NS3 펩티드 라이브러리의 풀 2와 3은 ANZ-521에 의해서 발현된 NS3 단편을 커버한다(도 4). 초기 실험은 SL8 택 구성물을 사용하여 수행했다. 이 구성물은 SJL 마우스에서는 NS3-특이적 면역성을 유도했고, 평가된 모든 마우스 계통, 즉 Balb/c, C57BL/6, FVB/n, C3H 및 SJL 마우스에서 NS5b-특이적 면역성을 유도했다(도 5의 A).

SJL에서 NS3-특이적 T 세포 반응은 HCV NS3 단백질의 두 영역, 즉 펩티드 44/45 및 펩티드 49 내지 51에 의해 커버된 아미노산들에 위치되었다(도 5의 B). 이들은 다음의 서열들에 상응한다:

IPVENLETTMRSPVF(서열 번호 1);

NLETTMRSPVFTDNS(서열 번호 2);

PPAVPQSFQVAHLHA(서열 번호 3);

PQSFQVAHLHAPTGS(서열 번호 4); 및

FQVAHLHAPTGSGKS(서열 번호 5).

후속 실험에 의해서 이들 영역은 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포 에피토프로서 확인되었다(데이터 나타내지 않음).

또한, NS3- 및 NS5b-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역성을 마우스에서 ANZ-521의 1회 정맥내 투여 후 세포내 사이토카인 분석에 의해서 증명했다(도 6). 면역화된 마우스의 비장세포를 세포내 사이토카인 염색을 위해서 브레펠딘 A의 존재하에 관련 펩티드로 5시간 동안 자극했다. 자극된 세포들을 CD4 및 CD8에 대해 표면 염색한 다음, 시토픽스/시토펌 키트(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 고정시켜 투과성을 만들었다. 다음에, 세포들을 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2에 대해 염색했다. FACSCanto 유세포기(BD Biosciences)를 사용하여 샘플을 취했다. CD4+ 또는 CD8+ 사건을 배타적으로 포함하는 데이터를 연 다음, 이들 세포 중 IFN-γ를 발현하는 퍼센트를 결정했다.

본 발명은 그것을 제조하여 사용하는 당업자에게 충분히 상세하게 설명되고 예시되었으며, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 다양한 대안, 변화, 및 개선이 이루어질 수 있음이 자명하다. 본원에 제공된 실시예들은 바람직한 구체예의 대표적인 것으로서 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 당업자는 변형 및 그 밖의 사용을 행할 수 있다. 이러한 변형은 본 발명의 사상 내에 포함되며, 청구항의 범위에 의해 한정된다.

가지각색의 치환 및 변형이 여기서 논의한 본 발명에 대하여 본 발명의 범주 및 정신으로부터 벗어나지 않고 만어질 수 있음이 당업자에게 있어 용이하게 명백할 것이다.

명세서에서 언급한 모든 특허 및 발행물은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 수준을 가리킨다. 모든 특허 및 발행물은 마치 각각의 개별 발행물이 특이적이고 개별적으로 참고문헌으로써 통합되는 것을 나타내는 것처럼 동일한 범위로 참고문헌으로써 본 발명에 통합된다.

여기서 예증적으로 기술된 본 발명은 본 발명에서 특이적으로 드러내지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재에서 적절하게 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 각각의 보기에서, 임의의 용어 "포함하는", "필수적으로 구성되는" 및 "구성되는"은 다른 두 용어 중 어느 한쪽과 서로 교체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 서술의 용어로서 사용되었고, 제한하려는 것이 아니며, 보여주고 기술한 특성 또는 이의 부분의 임의의 등가물을 제외하고 이런 용어 및 표현을 사용하려는 의도는 없었지만, 본 발명에서 청구한 범주 내에서 여러 변형이 가능함이 인정된다. 따라서, 본 발명을 바람직한 구체예 및 선택적인 특징에 의해 특이적으로 나타냈음에도 불구하고, 본 발명에서 개시한 컨셉의 변형 및 변화가 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이런 변형 및 변화는 수반하는 청구범위에 의해 정의된바 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.

다른 구체예는 하기 청구항 내에서 진술한다.

SEQUENCE LISTING <110> ADURO BIOTECDH <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF HEPATITIS C <130> US11P0140 <140> PCT/US2009/051596 <141> 2009-07-23 <150> 61/083,487 <151> 2008-07-24 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 1 Ile Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 2 Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 3 Pro Pro Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 4 Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 5 Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 6 Asp Glu Cys His 1 <210> 7 <211> 191 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 7 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala 180 185 190 <210> 8 <211> 191 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 8 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala 180 185 190 <210> 9 <211> 192 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 9 Tyr Gln Val Arg Asn Ser Ser Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 Pro Asn Ser Ser Val Val Tyr Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr 20 25 30 Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp 35 40 45 Val Ala Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr 50 55 60 Thr Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu 65 70 75 80 Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val 85 90 95 Gly Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg His His Trp Thr Thr Gln Asp 100 105 110 Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala 115 120 125 Trp Asn Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala 130 135 140 Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala 145 150 155 160 His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn 165 170 175 Trp Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala 180 185 190 <210> 10 <211> 363 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 10 Glu Thr His Val Thr Gly Gly Asn Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu 1 5 10 15 Val Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn 20 25 30 Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu 35 40 45 Ser Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr 65 70 75 80 Asp Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly 85 90 95 Leu Asp Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly 100 105 110 Ile Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro 115 120 125 Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr 130 135 140 Ser Trp Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg 145 150 155 160 Pro Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly 165 170 175 Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly 180 185 190 Asn Asn Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys Tyr Pro Glu 195 200 205 Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Arg Ile Thr Pro Arg Cys 210 215 220 Met Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn 225 230 235 240 Tyr Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg 245 250 255 Leu Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu 260 265 270 Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gln 275 280 285 Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr 290 295 300 Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr 305 310 315 320 Gly Val Gly Ser Ser Ile Ala Ser Trp Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val 325 330 335 Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ser Cys Leu 340 345 350 Trp Met Met Leu Leu Ile Ser Gln Ala Glu Ala 355 360 <210> 11 <211> 63 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 11 Ala Leu Glu Asn Leu Val Ile Leu Asn Ala Ala Ser Leu Ala Gly Thr 1 5 10 15 His Gly Leu Val Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Phe Ala Trp Tyr Leu 20 25 30 Lys Gly Arg Trp Val Pro Gly Ala Val Tyr Ala Leu Tyr Gly Met Trp 35 40 45 Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gln Arg Ala Tyr Ala 50 55 60 <210> 12 <211> 217 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 12 Leu Asp Thr Glu Val Ala Ala Ser Cys Gly Gly Val Val Leu Val Gly 1 5 10 15 Leu Met Ala Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys Arg Tyr Ile Ser Trp 20 25 30 Cys Met Trp Trp Leu Gln Tyr Phe Leu Thr Arg Val Glu Ala Gln Leu 35 40 45 His Val Trp Val Pro Pro Leu Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Val 50 55 60 Ile Leu Leu Thr Cys Val Val His Pro Ala Leu Val Phe Asp Ile Thr 65 70 75 80 Lys Leu Leu Leu Ala Ile Phe Gly Pro Leu Trp Ile Leu Gln Ala Ser 85 90 95 Leu Leu Lys Val Pro Tyr Phe Val Arg Val Gln Gly Leu Leu Arg Ile 100 105 110 Cys Ala Leu Ala Arg Lys Ile Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala 115 120 125 Ile Ile Lys Leu Gly Ala Leu Thr Gly Thr Cys Val Tyr Asn His Leu 130 135 140 Ala Pro Leu Arg Asp Trp Ala His Asn Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Val Val Phe Ser Arg Met Glu Thr Lys Leu Ile Thr 165 170 175 Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ile Ile Asn Gly Leu Pro 180 185 190 Val Ser Ala Arg Arg Gly Gln Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly 195 200 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44 Val Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 1 5 10 15 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 45 Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser 1 5 10 15 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 46 Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val 1 5 10 15 <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 47 Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro 1 5 10 15 Ser Val Ala Ala 20 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 48 Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala 1 5 10 15 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 49 Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala 1 5 10 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 50 Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala 1 5 10 15 <210> 51 <211> 14 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 51 Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 52 Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr 1 5 10 <210> 53 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 53 Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly 1 5 10 15 Phe Gly Ala Tyr 20 <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 54 Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr 1 5 10 15 Gly Lys Phe Leu 20 <210> 55 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 55 Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Tyr 20 <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 56 Leu Ala Asp Ala Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys 1 5 10 15 Asp Glu <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 57 Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr 1 5 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 58 Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser 1 5 10 15 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 59 Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala 1 5 10 15 Glu Thr Ala Gly 20 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 60 Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu 1 5 10 15 <210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 61 Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys 1 5 10 15 Cys Asp <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 62 Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Arg 1 5 10 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 63 Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn 1 5 10 15 <210> 64 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 64 Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile 1 5 10 15 Pro Thr Ser Gly 20 <210> 65 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 65 Ile Pro Thr Asn Gly Asp Val Val Val Val Ser Thr Asp Ala Leu Met 1 5 10 15 Thr Gly <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 66 Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp 1 5 10 15 <210> 67 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 67 Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val 1 5 10 15 Asp Phe <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 68 Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser 1 5 10 15 Leu Asp Pro Thr 20 <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 69 Cys Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr 1 5 10 15 Phe Thr <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 70 Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr 1 5 10 15 <210> 71 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 71 Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Thr Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser 1 5 10 15 Arg Thr <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 72 Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 73 Glu Gln Tyr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Glu 1 5 10 15 <210> 74 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 74 Leu Arg His His Asn Leu Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Ser Ala Cys 1 5 10 15 Gln Arg Gln Lys 20 <210> 75 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 75 Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu Asp Ser His Tyr Gln Asp 1 5 10 15 Val Leu Lys Glu 20 <210> 76 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 76 Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu Asp Asn Val Thr Pro Ile Asp Thr 1 5 10 15 Thr Ile Met Ala 20 <210> 77 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 77 Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly 1 5 10 15 Val Arg Val Cys 20 <210> 78 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 78 Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys 1 5 10 15 Glu Lys <210> 79 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 79 Lys Leu Pro Leu Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser 1 5 10 15 Pro Gly Gln Arg 20 <210> 80 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 80 Val Glu Phe Leu Val Gln Ala Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro Met Gly 1 5 10 15 Phe Ser Tyr Asp 20 <210> 81 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 81 Ser Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ala Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Asp 1 5 10 15 Pro Gln Ala Arg 20 <210> 82 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 82 Gln Cys Cys Asp Leu Asp Pro Gln Ala Arg Val Ala Ile Lys Ser Leu 1 5 10 15 Thr Glu Arg Leu 20 <210> 83 <211> 12 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 83 Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr 1 5 10 <210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 84 Ala Ala Ser His 1 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 85 Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val 1 5 10 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 86 Ala Leu Tyr Asp Val Val Ser Lys Leu 1 5

Claims

폴리펩티드의 아미노산 서열이
(ⅰ) 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질;
(ⅱ) (ⅰ)에서의 하나 이상의 전장 HCV 단백질로부터 유래한 하나 이상의 면역원성 아미노산 서열; 또는
(ⅰ)의 하나 이상의 전장 HCV 단백질 및 (ⅱ)의 하나 이상의 아미노산 서열의 조합을 포함하는 것인 하나 이상의 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 발현하는 박테리아를 포함하는 조성물을, 상기 개체에서 상기 T 세포 반응을 유도하기 위해 선택된 조건 하에서 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 C형 간염 바이러스(HCV)에 대한 T-세포 반응을 유도하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 전장 NS3, 전장 NS5b, NS3으로부터 유래한 아미노산 서열 및 NS5b로부터 유래한 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 및 NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 및 83으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 박테리아의 게놈에 통합된 상기 하나 이상의 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 박테리아는 actA 결실 돌연변이 또는 actA 삽입 돌연변이, inlB 결실 돌연변이 또는 inlB 삽입 돌연변이 이거나 actA 결실 또는 actA 삽입 및 inlB 결실 또는 inlB 삽입을 모두 포함하는 ΔactA/ΔinlB 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드의 하나 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 박테리아의 병독성 유전자에 통합되어 있고, 폴리뉴클레오티드의 통합이 병독성 유전자의 발현을 붕괴시키거나 병독성 유전자의 암호화 서열을 붕괴시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 병독성 유전자는 actA 또는 inlB인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 박테리아는 약화된 리스테리아 모노사이토제니스인 것을 특징으로 하는 방법.
10항에 있어서, 박테리아는 Lm ΔactA/ΔinlB인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 박테리아는 핵산을 회복할 수 있는 박테리아의 능력을 약화시키는 유전학적 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 유전학적 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA에서 선택되는 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 박테리아는 리스테리아 모노사이토제니스 prfA 돌연변이이고, 그것의 게놈이 구조적으로 활성인 prfA 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 박테리아는 죽었지만 대사적으로 활성인 리스테리아 모노사이토제니스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항에 있어서, 박테리아는 리스테리아 모노사이토제니스 prfA 돌연변이이고, 그것의 게놈이 구조적으로 활성인 prfA 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 핵산 서열은 리스테리아 모노사이토제니스에 의한 발현에 최적화된 코돈인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 개체에서 상기 T 세포 반응을 유도하기 위해 선택된 상기 조건은 상기 개체에게 경구, 근육 내, 정맥 내, 피 내, 및 피하로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 투여 경로에 의해 상기 리스테리아 모노사이토제니스를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 분비 신호 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 분비 신호 서열은 리스테리아 모노사이토제니스 ActA 신호 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 번역틀에 맞는 ActA-N100 서열 또는 상기 ActA-N100 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법은,
(a) 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 actA-N100 서열 또는 상기 ActA-N100 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(b) NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열 또는 NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및
(c) NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열 또는 NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 리스테리아 모노사이토제니스를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 융합 단백질이 리스테리아 모노사이토제니스 ActA 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 리스테리아 모노사이토제니스는 서열번호 18 또는 서열번호 19의 서열을 갖는 NS5b의 1-342 아미노산, 또는 돌연변이가 NS5b의 RNA 폴리머라아제 활성을 불활성화시키는 이의 돌연변이 유도체; 및 서열번호 13 또는 서열번호 14의 서열을 갖는 NS3의 172-484 아미노산, 또는 돌연변이가 NS3의 헬리카아제 활성을 불활성화시키는 이의 돌연변이 유도체를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 (a) 서열번호 7-23으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 HCV 보존 서열에서 인용된 서열을 갖고, 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질;
(b) (a)의 하나 이상의 전장 HCV 단백질로부터 유래한 하나 이상의 아미노산 서열; 또는
(a)의 하나 이상의 전장 HCV 단백질 및 (b)의 하나 이상의 아미노산 서열의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 리스테리아 ActA-N100의 최대 소수성을 넘는 소수성 범위를 갖지 않는, 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함한다.
제 1항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅰ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅱ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅰ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열; 및 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅱ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 개체는 만성 HCV 감염을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 개체에 전달되었을 때, 상기 조성물은 상기 전달 후 24시간에서 IL-12p70, IFN-γ IL-6, TNF α, 및 MCP-1로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 혈청 농도의 증가를 유도하고; 하나 이상의 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드에 대하여 CD4+ 및/또는 CD8+ 항원-특이적 T 세포 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
폴리펩티드의 아미노산 서열이,
(ⅰ) 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질;
(ⅱ) (ⅰ)에서의 하나 이상의 전장 HCV 단백질로부터 유래한 하나 이상의 면역원성 아미노산 서열; 또는
(ⅰ)의 하나 이상의 전장 HCV 단백질 및 (ⅱ)의 하나 이상의 아미노산 서열의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 박테리아를 포함하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 전장 NS3, 전장 NS5b, NS3으로부터 유래한 아미노산 서열 및 NS5b로부터 유래한 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 및 NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 및 83으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 상기 박테리아의 게놈에 통합된 상기 핵산 서열을 포함하는 리스테리아 모노사이토제니스인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 36항에 있어서, 박테리아는 actA 결실 또는 actA 삽입 및 inlB 결실 또는 inlB 삽입을 모두 포함하는 actA 결실 돌연변이 또는 actA 삽입 돌연변이, inlB 결실 돌연변이 또는 inlB 삽입 돌연변이 또는 ΔactA/ΔinlB 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 36항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드의 하나 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 박테리아의 병독성 유전자에 통합되어 있고, 폴리뉴클레오티드의 통합이 병독성 유전자의 발현을 붕괴시키거나 병독성 유전자의 암호화 서열을 붕괴시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 38항에 있어서, 병독성 유전자는 actA 또는 inlB인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 36항에 있어서, 박테리아는 약화된 리스테리아 모노사이토제니스인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 40항에 있어서, 박테리아는 Lm ΔactA/ΔinlB인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 38항에 있어서, 박테리아는 핵산을 회복할 수 있는 박테리아의 능력을 약화시키는 유전학적 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 42항에 있어서, 유전학적 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA에서 선택되는 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 40항에 있어서, 박테리아는 리스테리아 모노사이토제니스 prfA 돌연변이이고, 그것의 게놈이 구조적으로 활성인 prfA 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 36항에 있어서, 박테리아는 죽었지만 대사적으로 활성인 리스테리아 모노사이토제니스인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 45항에 있어서, 박테리아는 리스테리아 모노사이토제니스 prfA 돌연변이이고, 그것의 게놈이 구조적으로 활성인 prfA 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 36항에 있어서, 핵산 서열은 리스테리아 모노사이토제니스에 의한 발현에 최적화된 코돈인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 분비 신호 서열을 포함하는 융합 단백질로서 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 49항에 있어서, 분비 신호 서열은 리스테리아 모노사이토제니스 ActA 신호 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 49항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 번역틀에 맞는 actA-N100 서열, 또는 상기 ActA-N100 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질로서 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 조성물은
(a) 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 actA-N100 서열 또는 상기 ActA-N100 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(b) NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열 또는 NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및
(c) NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열 또는 NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 서열을 갖는 핵산 분자를 포함하는 리스테리아 모노사이토제니스를 포함하고;
상기 융합 단백질을 암호화하는 상기 핵산 분자는 리스테리아 모노사이토제니스 ActA 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 52항에 있어서, 상기 리스테리아 모노사이토제니스는 서열번호 18 또는 서열번호 19의 서열을 갖는 NS5b의 1-342 아미노산, 또는 돌연변이가 NS5b의 RNA 폴리머라아제 활성을 불활성화시키는 이의 돌연변이 유도체; 및 서열번호 13 또는 서열번호 14의 서열을 갖는 NS3의 172-484 아미노산, 또는 돌연변이가 NS3의 헬리카아제 활성을 불활성화시키는 이의 돌연변이 유도체를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는
(a) 서열번호 7-23으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 HCV 보존 서열에서 인용된 서열을 갖고, 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질;
(b) (a)의 하나 이상의 전장 HCV 단백질로부터 유래한 하나 이상의 아미노산 서열; 또는
(a)의 하나 이상의 전장 HCV 단백질 및 (b)의 하나 이상의 아미노산 서열의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 리스테리아 ActA-N100의 최고의 소수성을 넘는 소수성 범위를 갖지 않는 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅰ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅱ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅰ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열; 및, 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅱ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
폴리펩티드의 아미노산 서열이
(ⅰ) 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질;
(ⅱ) (ⅰ)에서의 하나 이상의 전장 HCV 단백질로부터 유래한 하나 이상의 면역원성 아미노산 서열; 또는
(ⅰ)의 하나 이상의 전장 HCV 단백질 및 (ⅱ)의 하나 이상의 아미노산 서열의 조합을 포함하는 것인 하나 이상의 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 발현하는 박테리아를 포함하는 조성물을, 상기 개체에서 상기 T 세포 반응을 유도하기 위해 선택된 조건 하에서 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 HCV 예방 또는 만성 HCV 감염을 치료하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 전장 NS3, 전장 NS5b, NS3으로부터 유래한 아미노산 서열 및 NS5b로부터 유래한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 및 NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 및 83으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아는 상기 박테리아의 게놈에 통합된 상기 하나 이상의 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 리스테리아 모노사이토제니스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 64항에 있어서, 박테리아는 actA 결실 또는 actA 삽입 및 inlB 결실 또는 inlB 삽입을 모두 포함하는 actA 결실 돌연변이 또는 actA 삽입 돌연변이, inlB 결실 돌연변이 또는 inlB 삽입 돌연변이 또는 ΔactA/ΔinlB 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
제 64항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드의 하나 이상을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 박테리아의 병독성 유전자에 통합되어 있고, 폴리뉴클레오티드의 통합이 병독성 유전자의 발현을 붕괴시키거나 병독성 유전자의 암호화 서열을 붕괴시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 66항에 있어서, 병독성 유전자는 actA 또는 inlB인 것을 특징으로 하는 방법.
제 64항에 있어서, 박테리아는 약화된 리스테리아 모노사이토제니스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 68항에 있어서, 박테리아는 Lm ΔactA/ΔinlB인 것을 특징으로 하는 방법.
제 66항에 있어서, 박테리아는 핵산을 회복할 수 있는 박테리아의 능력을 약화시키는 유전학적 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 70항에 있어서, 유전학적 돌연변이는 phrB, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD 및 recA에서 선택되는 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 68항에 있어서, 박테리아는 리스테리아 모노사이토제니스 prfA 돌연변이이고, 그것의 게놈이 구조적으로 활성인 prfA 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 64항에 있어서, 박테리아는 죽었지만 대사적으로 활성인 리스테리아 모노사이토제니스인 것을 특징으로 하는 방법.
제 73항에 있어서, 박테리아는 리스테리아 모노사이토제니스 prfA 돌연변이이고, 그것의 게놈이 구조적으로 활성인 prfA 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 64항에 있어서, 핵산 서열은 리스테리아 모노사이토제니스에 의한 발현에 최적화된 코돈인 것을 특징으로 하는 방법.
제 64항에 있어서, 상기 개체에서 상기 T 세포 반응을 유도하기 위해 선택된 상기 조건은 상기 개체에게 경구, 근육 내, 정맥 내, 피 내, 및 피하로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 투여 경로에 의해 상기 리스테리아 모노사이토제니스를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 분비 신호 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 77항에 있어서, 분비 신호 서열은 리스테리아 모노사이토제니스 ActA 신호 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
제 78항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 번역틀에 맞는 ActA-N100 서열 또는 상기 ActA-N100 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질로서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 방법은
(a) 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 actA-N100 서열 또는 상기 ActA-N100 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;
(b) NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열 또는 NS3으로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및
(c) NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열 또는 NS5b로부터 적어도 100개만큼 인접하는 잔기를 포함하는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 리스테리아 모노사이토제니스를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 융합 단백질은 리스테리아 모노사이토제니스 ActA 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 서열로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 80항에 있어서, 상기 리스테리아 모노사이토제니스는 서열번호 18 또는 서열번호 19의 서열을 갖는 NS5b의 1-342 아미노산, 또는 돌연변이가 NS5b의 RNA 폴리머라아제 활성을 불활성화시키는 이의 돌연변이 유도체; 및 서열번호 13 또는 서열번호 14의 서열을 갖는 NS3의 172-484 아미노산, 또는 돌연변이가 NS3의 헬리카아제 활성을 불활성화시키는 이의 돌연변이 유도체를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는
(a) 서열번호 7-23으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 HCV 보존 서열에서 인용된 서열을 갖고, 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전장 HCV 단백질;
(b) (a)의 하나 이상의 전장 HCV 단백질로부터 유래한 하나 이상의 아미노산 서열; 또는
(a)의 하나 이상의 전장 HCV 단백질 및 (b)의 하나 이상의 아미노산 서열의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 리스테리아 ActA-N100의 최고의 소수성을 넘는 소수성 범위를 갖지 않는 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅰ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅱ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드는 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅰ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 코어, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열; 및 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅱ 에피토프를 암호화하는 것으로 예측되는 E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, 및 NS5b의 하나 이상의 보존 서열로부터 나온 하나 이상의 인접 HCV 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 방법은 개체의 만성 HCV 감염을 치료하는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 개체에 전달되었을 때, 상기 조성물은 상기 전달 후 24시간에서 IL-12p70, IFN-γ IL-6, TNF α, 및 MCP-1로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 혈청 농도의 증가를 유도하고; 하나 이상의 상기 면역원성 HCV 항원 폴리펩티드에 대하여 CD4+ 및/또는 CD8+ 항원-특이적 T 세포 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 상기 방법은 만성 HCV 감염을 앓고 있지 않는 개체의 HCV 예방 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
제 31항 내지 제 58항 중 어느 한 항의 조성물; 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 14항 또는 제 16항에 있어서, 박테리아는 리스테리아 모노사이토제니스 prfA 돌연변이가 prfA* 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
제 44항 또는 제 46항에 있어서, 박테리아는 리스테리아 모노사이토제니스 prfA 돌연변이가 prfA* 돌연변이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 72항 또는 제 74항에 있어서, 박테리아는 리스테리아 모노사이토제니스 prfA 돌연변이가 prfA* 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.