CN106636169A - 重组hcv多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法 - Google Patents

重组hcv多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法，该方法如下：步骤一、构建LM 10403s‑ΔactA&ΔinlB双基因缺失的单核细胞增生李斯特菌10403s；步骤二、基因合成HCV多表位表达框架：该表达框架包含来源于LM 10403s菌hly基因的启动子及分泌信号肽，绿色荧光蛋白EGFP，和HCV多表位抗原；步骤三、将步骤二中的HCV多表位表达框架与载体相连接，得LM 10403s‑ΔactA&ΔinlB–HCV重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体。

Description

重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法
技术领域
本发明属于DNA重组技术领域，具体涉及重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(Heptatitis C virus，HCV)是引起慢性肝病的主要病原体，全世界约有HCV感染者1.7亿-2.0亿，我国人群HCV感染率约3.2％，估计全国感染者在4000万以上，严重危害人类健康。目前缺乏理想治疗药物，尚无有效疫苗问世。国际公认的“标准方案”聚乙二醇化(PEG-IFNα)的干扰素联合利巴韦林治疗，临床有效率只有50％-80％，而且疗效长、副作用大，许多病人无法耐受其毒性作用，不能坚持治疗，尤其那些在首次诊断时已发展为肝硬化的病人，干扰素对骨髓的抑制限制了长期坚持治疗。由于HCV病毒变异率高，以保护性抗体为主的预防性HCV疫苗的研究步履艰难。
近10多年来，以CD4+和CD8+T细胞在内的T淋巴细胞免疫应答已被证明与HCV病毒的清除相关，其中树突状细胞(Dendritic Cells，DC)在抗HCV感染的固有免疫和适应性免疫中发挥中心作用。DC可直接通过模式识别受体识别并捕获HCV抗原递呈给CD4+T和CD8+T细胞。DC成为目前HCV预防和治疗研究的热点。
目前，将外源抗原基因导入DC的主要方法是应用重组病毒体外感染。由于病毒载体本身的高免疫原性和感染靶细胞的泛嗜性，限制了在人类基因治疗方面的应用。现在急需一种预防HCV感染和克服HCV慢性化的疫苗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足，提供一种能够将HCV抗原导入DC，在体内激发特异性的T细胞应答以清除HCV的重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为，重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体(LM-HCV)的构建方法，包括以下：
步骤一、构建LM 10403s-ΔactA&ΔinlB，该LM 10403s-ΔactA&ΔinlB为actA和inlB双基因缺失的单核细胞增生李斯特菌10403s；
步骤二、基因合成HCV多表位表达框架：
该表达框架包含：来源于LM 10403s菌hly基因的启动子及分泌信号肽，绿色荧光蛋白EGFP和HCV多表位抗原；其中，HCV多表位抗原包括如下：NS4B 1793-1801，氨基酸序列为SMMAFSAAL；抗原肽P7 774-782，氨基酸序列为AAWYIKGRL；和抗原肽E1 314–324，氨基酸序列为TGHRMAWDMMM；
步骤三、将步骤二中的HCV多表位表达框架与载体相连接，导入步骤一中的LM10403s-ΔactA&ΔinlB中，二次同源重组，得LM 10403s-ΔactA&ΔinlB–HCV，该LM10403s-ΔactA&ΔinlB–HCV为重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体。
进一步地，该步骤一中的具体过程如下：
选取李斯特菌基因组，通过PCR方法扩增actA基因上下游两翼同源片段，回收上游和下游同源片段，将上游和下游同源片段通过SOE-PCR方法连接在一起，双酶切actA拼接同源片段；选取双酶切的pKSV7载体，与双酶切actA拼接同源片段连接，得pKSV7-ΔactA同源重组载体；将上述pKSV7-ΔactA同源重组载体电转化导入LM 10403s菌，与染色体同源重组，即得LM 10403s-ΔactA；
选取李斯特菌基因组，通过PCR方法扩增inlB基因上下游两翼同源片段，回收上游和下游同源片段；将上游和下游同源片段，通过SOE-PCR方法连接在一起，双酶切拼接同源片段；选取双酶切的pKSV7载体，与双酶切actA拼接同源片段连接，得pKSV7-ΔinlB同源重组载体；将pKSV7-ΔinlB同源重组载体电转化导入LM 10403s-ΔactA菌，与染色体同源重组，即得LM 10403s-ΔactA&ΔinlB。
进一步地，该步骤三中的载体为pKSV7，HCV多表位表达框架通过双酶切的方法和载体pKSV7相连。
本发明还公开了上述重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体用于预防和治疗丙型肝炎。
本发明还公开了一种预防和治疗丙型肝炎的疫苗，包含上述的重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体。
本发明重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法的有益效果如下：1.用同源重组技术成功构建了毒力因子actA和inlB双缺失的李斯特菌突变株；通过对actA和inlB双缺失李斯特菌两次同源重组敲入目的基因片段，成功构建表达重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体。2.该HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体能够将HCV抗原导入DC，在体内激发特异性的T细胞应答以清除HCV。3.为制备预防HCV感染和克服HCV慢性化的疫苗奠定了基础。
附图说明
图1为李斯特菌构建所得LM 10403s-ΔactA&ΔinlB电泳检测图；
其中：M为DNA分子量标准，从上到下依次为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp；
1号泳道验证LM 10403s-ΔactA&ΔinlB；
2，4号泳道为LM 10403s；
3号泳道验证LM 10403s-ΔactA&ΔinlB中是否还有重组载体；
图2为菌落PCR鉴定LM 10403s-ΔactA&ΔinlB-HCV中pKSV7-NS4B&P7&E1片段；
其中：M为DNA分子量标准(从上到下依次为：600、500、400、300、200、100bp；
图3 Western Bloting鉴定LM-HCV中FLAG蛋白表达表达；
图4为显微镜下树突状DC细胞形态图；
其中：A：d1，细胞圆亮 200×；B：d3，细胞呈集落200×；C：d5，细胞变大，有小的突起200×；D：d7，细胞不规则增大，有明显树枝状突起400×；
图5为ELISA法检测LM-HCV感染前后DC培养基上清IL-12p70含量(P<0.05)图；
图6为ELISA法检测LM-HCV-DC感染前后T淋巴细胞上清IFN-γ含量图(P<0.05)；
图7为CCK-8检测LM-HCV-DC感染前后T淋巴细胞活性(P<0.05)图；
图8为LM-HCV-DC诱导T淋巴细胞对转染HCV病毒的Huh7.5细胞杀伤力检测图(P<0.05)。
具体实施方式
本发明重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法，该方法如下：
步骤一：构建LM 10403s-ΔactA &ΔinlB，所述LM 10403s-ΔactA &ΔinlB为actA和inlB双基因缺失的单核细胞增生李斯特菌10403s；具体过程如下：选取李斯特菌基因组，通过PCR方法扩增actA基因上下游两翼同源片段，回收上游和下游同源片段，大小分别为595bp和591bp；引物序列如表1所示：
表1步骤一中选用的一种引物序列
引物名称 引物序列
actA-UP-F 5′-CGCTGCAGTTGATTGGTGAGGATGTCTG-3′
actA-UP-R 5′-CTTATACTCCCTCCTCGTGATAC-3′
actA-Down-F 5′-TCACGAGGAGGGAGTATAAGGTTAGCTATTGGCGTGTTC-3′
actA-Down-R 5′-TCATCTAGATCGGTAATCAGTCACCGATTG-3′
注：Up：指上游同源臂，即克隆自李斯特菌中要敲入位置上游的约500-1200bp DNA序列。
Down：指下游同源臂，即克隆自李斯特菌中要敲入位置下游的约500-1200bp DNA序列。
用上述的引物actA-UP-F/actA-Down-R通过SOE-PCR方法将上述上游和下游同源片段连接在一起，回收1147bp的actA拼接同源片段；用Pst I和XbaI双酶切所述的actA拼接同源片段；选取PKS V7载体，用Pst I和XbaI双酶切穿梭pKSV7载体，然后将双酶切后的actA拼接同源片段与其连接，即为pKSV7-ΔactA同源重组载体；将pKSV7-ΔactA同源重组载体电转化导入LM 10403s菌，在42℃和氯霉素压力下与染色体同源重组，之后在30℃无抗生素培养基中传递培养脱掉质粒，即得LM 10403s-ΔactA。
选取李斯特菌基因组，通过PCR方法扩增inlB基因上下游两翼同源片段，回收上游和下游同源片段，大小分别为604bp和601bp；引物如表2所示：
表2步骤一中选用的另一种引物序列
引物名称 引物序列
inlB-UP-F TCGCTGCAGCAATATAGCGCCAATAGCTATAC
inlB-UP-R CACTATCCTCTCCTTGATTCTAG
inlB-Down-F AGAATCAAGGAGAGGATAGTGCAGCTAATTTAAGGGCACAG
inlB-Down-R TCATCTAGACTCTATCCAATTTAGCGATGCTATC
注：Up：指上游同源臂，即克隆自李斯特菌中要敲入位置上游的约500-1200bp DNA序列。
Down：指下游同源臂，即克隆自李斯特菌中要敲入位置下游的约500-1200bp DNA序列。
将引物inlB-UP-F/inlB-Down-R通过SOE-PCR方法将上述上游和下游同源片段连接在一起，回收1184bp的inlB拼接同源片段；用Pst I和XbaI双酶切上述拼接同源片段；选取PKS V7载体，用Pst I和XbaI双酶切穿梭所述pKSV7载体，然后将双酶切后的所述inlB拼接同源片段与其连接，即得pKSV7-ΔinlB同源重组载体；将所pKSV7-ΔinlB同源重组载体电转化导入上述LM 10403s-ΔactA菌，在42℃和氯霉素压力下与染色体同源重组，之后在30℃无抗生素培养基中传递培养脱掉质粒，即得LM 10403s-ΔactA&ΔinlB。
步骤二、基因合成HCV多表位表达框架：
该表达框架包含：来源于LM 10403s菌hly基因的启动子及分泌信号肽，绿色荧光蛋白EGFP和HCV多表位抗原，其中HCV多表位抗原包括如下：NS4B 1793-1801，氨基酸序列为SMMAFSAAL；抗原肽P7 774-782，氨基酸序列为AAWYIKGRL；和抗原肽E1 314–324，氨基酸序列为TGHRMAWDMMM)，其中，HCV多表位抗原为序列1，合成的HCV多表位表达框架的基因序列如下：
AGGAAACCGATATTAAAGTTACTTTTATGTGGAGGCATTAACATTTGTTAATGACGTCAAAAGGATAGCAAGACTAGAATAAAGCTATAAAGCAAGCATATAATATTGCGTTTCATCTTTAGAAGCGAATTTCGCCAATATTATAATTATCAAAAGAGAGGGGTGGCAAACGGTATTTGGCATTATTAGGTTAAAAAATGTAGAAGGAGAGTGAAACCCATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTTCAATGATGGCTTTCAGCGCTGCATTGGCCGCGTATGCGGCCTGGTACATAAAGGGTAGACTTGCCGCGTATACGGGTCATCGCATGGCATGGGATATGATGATGGCCGCGTATGACTACAAGGACGACGATGACAAAGGATCCACCGGATCTAGATAACTGAATTGTAAAAGTAATAAAAAATTAAGAATAAAACCGCTTAACACACACGAAAAAATAAGCTTGTTTTGCACTCTTCGTAAATTATTTTATGAAGAATGTAGAAACAGGCTTATTTTTTAATTTTTTTAGGTCTTCAATATT。
步骤三、将步骤二中所得的HCV多表位表达框架通过双酶切的方法和载体pKSV7相连，同源重组后导入步骤一中的LM 10403s-ΔactA &ΔinlB中，再次同源重组，即得LM10403s-ΔactA &ΔinlB–HCV，上述LM 10403s-ΔactA&ΔinlB–HCV为重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体，简写为LM-HCV。
所采用的引物序列如表3所示：
表3步骤三中的引物序列
引物名称 引物序列
sepA-UP-F GGCCAGTGCCAAGCTACGAGTGAACCCATCGTTC
sepA-UP-R AAGTAACTTTAATATCGGTTTCCTCCTGCACG
sepA-Down-F TAATTTTTTTAGGTCTTCAATATTGTTACACC
sepA-Down-R ACATGATTACGAATTTTGTTAGTTAACAAACGGGA
HCV-F AGGAAACCGATATTAAAGTTACTTTTATGTGGAGGC
HCV-R AATATTGAAGACCTAAAAAAATTAAAAAATAAGC
注：Up：指上游同源臂，即克隆自李斯特菌中要敲入位置上游的约500-1200bp DNA序列。
Down：指下游同源臂，即克隆自李斯特菌中要敲入位置下游的约500-1200bp DNA序列。
引物sepA-UP-F/sepA-Down-R通过SOE-PCR方法将上述三个片段连接在一起，回收2358bp的sepA-HCV多表位拼接同源片段。选取pKSV7载体，用Hind III和EcoR I双酶切穿梭所述pKSV7载体，然后将sepA-HCV多表位拼接同源片段通过In-Fusion方法和双酶切后的pKSV7载体进行连接，即得pKSV7-HCV同源重组载体。
将上述pKSV7-HCV同源重组载体电转化导入LM10403s-ΔactA&ΔinlB菌，在42℃和氯霉素压力下与染色体同源重组，之后在30℃无抗生素培养基中传递培养脱掉质粒，即得。
本专利中重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体简写为LM-HCV。
一、LM 10403s-ΔactA&ΔinlB菌毒理检测
1.将过夜培养的李斯特菌LM10403和减毒李斯特菌LM10403S-△actA&inlB按OD600＝0.5，对应的李斯特菌浓度和减毒李斯特菌浓度均为1*109CFU/ml，分别对应稀释成不同浓度梯度。
2.取BALB/c小鼠(4-6周龄)共90只，分为15组，每组6只，其中3雌3雄，其中一组中的每只小鼠均注射BHI培养基，其他各组的BALB/c小鼠尾静脉注射不同菌体浓度的菌体100μl。
表4BALB/c小鼠分组注射记录
3.实验分笼和标记
将注射相同浓度，不同菌种的同一性别的小鼠放在一个笼子里面，标记方法：性别-浓度-菌种，1，2，3号指注射LM10403s的小鼠，4，5，6号指注射LM10403s-△actA&nlB的小鼠，如F-9-1指的是雌性-109浓度-菌种，M-9-1-6指的是雄性-109浓度-菌种。
3.饲养14天，每天记录BALB/c小鼠死亡情况。
第二天观察：无死亡；
第三天观察：F-9-1，2，3，6死亡；
F-8-1，2，3死亡；
M-9-1，2，3死亡；
M-8-1，2，3死亡；
第四天观察：F-9-4，5死亡；
F-7-1，2死亡；
M-7-1，2，3死亡；
第五天观察：M-6-2，3死亡；
第六天观察：无死亡；
第七天观察：无死亡；
第八天观察：无死亡；
第九天观察：无死亡；
第十天观察：无死亡；
第十一天观察：无死亡；
第十二天观察：无死亡；
第十三天观察：无死亡；
第十四天观察：无死亡；
第十五天观察：无死亡。
统计结果如表5和表6所示：
表5雌性BALB/c小鼠LD50测定结果
表6雄性BALB/c小鼠LD50测定结果
由表5和表6可知，在雌性BALB/c小鼠动物毒理试验中，注射LM10403S-△actA&inlB所测得的LD50为3.16×107CFU，注射LM 10403s所测得的LD50为6.81×105CFU，数据表明减毒李斯特菌LM10403S-△actA&inlB毒力降低了2个数量级。在雄性BALB/c小鼠动物毒理试验中，注射LM10403S-△actA&inlB所测得的LD50为1.47×108CFU，注射LM 10403s所测得的LD50为6.81×104CFU，数据表明LM10403S-△actA&inlB毒力降低了4个数量级。由上述数据可知LM10403s-ΔactA&ΔinlB的毒力显著下降。
二、LM 10403s-ΔactA&ΔinlB–HCV鉴定
2.1电泳鉴定
将所制备的LM 10403s-ΔactA&ΔinlB–HCV进行电泳鉴定实验，由图1可知，目的片段符合预期大小，成功将目的基因NS4B&P7&E1敲入LM 10403s菌中。
2.2测序鉴定
提取LM 10403s-ΔactA&ΔinlB–HCV的基因组，以基因组为模板进行PCR，将PCR产物送测序，如图2所示，经比对知，目的片段符合预期大小，成功将目的基因NS4B&P7&E1敲入李斯特菌中。
2.3Western Blot检测鉴定
采用Western Blot检测LM 10403s-ΔactA&ΔinlB–HCV中HCV抗原的蛋白表达，由于没有直接抗体，采用抗FLAG抗体为一抗，如图3所示，FLAG抗体表达，表明位于FLAG抗体序列前面的HCV表位也表达。说明成功将目的基因NS4B&P7&E1敲入李斯特菌中。
三、细胞实验
3.1体外诱导DC细胞
收集人外周血单核细胞(PBMC)，磁珠分选法分离CD14+细胞，用含GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)的X-VIVO15培养基诱导DC细胞。如图4所示，培养1d后大部分细胞仍贴壁生长并成簇排列，呈圆形，细胞膜光滑无突起。培养3d后，出现大量细胞集落，呈串珠样。培养5d后，细胞的形态出现不规则，悬浮细胞逐渐增多，细胞伸出突起。培养7d后，胞体明显变大，绝大部分细胞呈半悬浮生长，可见胞体不规则增大，胞膜向外伸出树枝样突起。说明诱导DC细胞成功。
3.2LM-HCV对DC细胞功能的影响
3.2.1LM-HCV可促进DC成熟
如表7所示，LM-HCV感染imDC(不成熟DC)2d后，流式细胞术检测DC细胞表面标记物HLA-DR、CD80、CD83和CD86，标记物表达显著升高，说明LM-HCV可促进DC细胞成熟。
表7流式细胞术检测LM-HCV刺激imDC细胞后DC表面标记物表达
4.2.2LM-HCV可促进DC细胞分泌IL-12p70
LM-HCV感染DC细胞，写为LM-HCV-DC，24h后，接种于96孔培养板，如图5所示，LM-HCV与DC效靶比分别为1:25，1:50，1:100，1:200，应用ELISA检测试剂盒检测DC细胞分泌IL-12p70。每组设3个复孔。LM-HCV可促进DC细胞分泌IL-12p70，从而增强DC细胞功能。
4.3LM-HCV-DC对T淋巴细胞活性影响
收集人外周血单核细胞(PBMC)，磁珠分选法分离CD14-细胞并添加IL-2(20ng/ml)培养2d后得到效应T淋巴细胞，接种于96孔培养板，每孔加入1×105个细胞，每组设3个复孔；收集感染LM-HCV的DC细胞作为刺激细胞(LM-HCV-DC)，未感染LM的DC细胞为阴性对照，空白组只加培养基。每孔终体积200μl。LM-HCV-DC与T淋巴细胞效靶比分别为1:25，1:50，1:100，1:200。5％CO2、37℃条件下进行混合淋巴细胞培养，2d后用ELISA法检测培养基上清IFN-γ含量，用CCK-8试剂盒检测LM-HCV-DC刺激后T淋巴细胞活性。刺激指数(SI)＝(实验组-空白组)/(阴性组-空白组)。如图6所示，为ELISA法检测LM-HCV-DC感染前后T淋巴细胞上清IFN-γ含量(P<0.05)图。结果显示，LM-HCV-DC可促进T淋巴细胞分泌IFN-γ。如图7所示，为CCK-8检测LM-HCV-DC感染前后T淋巴细胞活性(P<0.05)图。结果显示，M-HCV-DC可增强T淋巴细胞活性。
4.4LM-HCV-DC诱导T淋巴细胞杀伤靶细胞实验
将转染HCV病毒(FL-J6/JFH转录本)的Huh 7.5细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为104/ml，96孔细胞培养板每孔加100μl(103细胞)。用LM-HCV-DC刺激的T淋巴细胞(LM-HCV-DC-L)作为效应细胞，未感染LM的DC刺激T淋巴细胞(DC-L)作为对照。按效靶比100：1、50：1、25：1接种到96孔细胞培养板中，同时设置靶细胞自然释放LDH孔作为阴性对照和最大释放LDH孔作为阳性对照，分别设3个复孔,在5％CO2，37℃孵箱共培养6h，根据LDH释放试剂盒说明书检测CTL活性。特异性细胞杀伤率(％)＝(试验组OD值-靶细胞自然释放组OD值-效应细胞自然释放组OD值)/(靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)。如图8所示，LM-HCV-DC-L可有效杀伤感染了HCV的靶细胞。
上述的重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体用于预防和治疗丙型肝炎。
本发明还公开了一种预防和治疗丙型肝炎的疫苗，包含上述的重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体。
<110> 中国人民解放军第四军医大学
<120> 重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法
<130> 无
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列：序列1
<400> 1
SMMAFSAALA AWYIKGRLTG HRMAWDMMM 29
<210> 2
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
AGGAAACCGA TATTAAAGTT ACTTTTATGT GGAGGCATTA ACATTTGTTA ATGACGTCAA 60
AAGGATAGCA AGACTAGAAT AAAGCTATAA AGCAAGCATA TAATATTGCG TTTCATCTTT 120
AGAAGCGAAT TTCGCCAATA TTATAATTAT CAAAAGAGAG GGGTGGCAAA CGGTATTTGG 180
CATTATTAGG TTAAAAAATG TAGAAGGAGA GTGAAACCCA TGAAAAAAAT AATGCTAGTT 240
TTTATTACAC TTATATTAGT TAGTCTACCA ATTGCGCAAC AAACTGAAGC AAAGGATGCA 300
TCTGCATTCA ATAAAATGGT GAGCAAGGGC GAGGAGCTGT TCACCGGGGT GGTGCCCATC 360
CTGGTCGAGC TGGACGGCGA CGTAAACGGC CACAAGTTCA GCGTGTCCGG CGAGGGCGAG 420
GGCGATGCCA CCTACGGCAA GCTGACCCTG AAGTTCATCT GCACCACCGG CAAGCTGCCC 480
GTGCCCTGGC CCACCCTCGT GACCACCCTG ACCTACGGCG TGCAGTGCTT CAGCCGCTAC 540
CCCGACCACA TGAAGCAGCA CGACTTCTTC AAGTCCGCCA TGCCCGAAGG CTACGTCCAG 600
GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GGACGACGGC AACTACAAGA CCCGCGCCGA GGTGAAGTTC 660
GAGGGCGACA CCCTGGTGAA CCGCATCGAG CTGAAGGGCA TCGACTTCAA GGAGGACGGC 720
AACATCCTGG GGCACAAGCT GGAGTACAAC TACAACAGCC ACAACGTCTA TATCATGGCC 780
GACAAGCAGA AGAACGGCAT CAAGGTGAAC TTCAAGATCC GCCACAACAT CGAGGACGGC 840
AGCGTGCAGC TCGCCGACCA CTACCAGCAG AACACCCCCA TCGGCGACGG CCCCGTGCTG 900
CTGCCCGACA ACCACTACCT GAGCACCCAG TCCGCCCTGA GCAAAGACCC CAACGAGAAG 960
CGCGATCACA TGGTCCTGCT GGAGTTCGTG ACCGCCGCCG GGATCACTCT CGGCATGGAC 1020
GAGCTGTACA AGTCCGGACT CAGATCTCGA GCTTCAATGA TGGCTTTCAG CGCTGCATTG 1080
GCCGCGTATG CGGCCTGGTA CATAAAGGGT AGACTTGCCG CGTATACGGG TCATCGCATG 1140
GCATGGGATA TGATGATGGC CGCGTATGAC TACAAGGACG ACGATGACAA AGGATCCACC 1200
GGATCTAGAT AACTGAATTG TAAAAGTAAT AAAAAATTAA GAATAAAACC GCTTAACACA 1260
CACGAAAAAA TAAGCTTGTTT TGCACTCTTC GTAAATTATT TTATGAAGAA TGTAGAAAC 1320
AGGCTTATTT TTTAATTTTT TTAGGTCTTC AATATT 1356

Claims (5)

1.重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法，其特征在于，该方法如下：
步骤一、构建LM 10403s-ΔactA&ΔinlB，所述LM 10403s-ΔactA&ΔinlB为actA和inlB双基因缺失的单核细胞增生李斯特菌10403s；
步骤三、基因合成HCV多表位表达框架：
该表达框架包含：来源于LM 10403s菌hly基因的启动子及分泌信号肽，绿色荧光蛋白EGFP和HCV多表位抗原；其中HCV多表位抗原包括如下：NS4B 1793-1801，氨基酸序列为SMMAFSAAL；抗原肽P7 774-782，氨基酸序列为AAWYIKGRL；和抗原肽E1314–324，氨基酸序列为TGHRMAWDMMM；
步骤三、将步骤二中的HCV多表位表达框架与载体相连接，同源重组后导入步骤一中的LM 10403s-ΔactA&ΔinlB中，再次同源重组，得LM 10403s-ΔactA&ΔinlB–HCV，所述LM10403s-ΔactA&ΔinlB–HCV为重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体。
2.按照权利要求1所述的重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法，其特征在于，所述步骤一中的具体过程如下：
选取李斯特菌基因组，通过PCR方法扩增actA基因上下游两翼同源片段，回收上游和下游同源片段，将上游和下游同源片段通过SOE-PCR方法连接在一起，双酶切actA拼接同源片段；选取双酶切的pKSV7载体，与双酶切actA拼接同源片段连接，得pKSV7-ΔactA同源重组载体；将所述pKSV7-ΔactA同源重组载体电转化导入LM 10403s菌，与染色体同源重组，即得LM 10403s-ΔactA；
选取李斯特菌基因组，通过PCR方法扩增inlB基因上下游两翼同源片段，回收上游和下游同源片段；将上游和下游同源片段，通过SOE-PCR方法连接在一起，双酶切拼接同源片段；选取双酶切的pKSV7载体，与双酶切actA拼接同源片段连接，得pKSV7-ΔinlB同源重组载体；将pKSV7-ΔinlB同源重组载体电转化导入所述LM 10403s-ΔactA菌，与染色体同源重组，即得LM 10403s-ΔactA&ΔinlB。
3.按照权利要求1或2所述的重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体的构建方法，其特征在于，所述步骤三中的载体为pKSV7，HCV多表位表达框架通过双酶切的方法和载体pKSV7相连。
4.如权利要求1～3中任一项所述的重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体用于预防和治疗丙型肝炎。
5.一种预防和治疗丙型肝炎的疫苗，其特征在于，包含权利要求1～3中任一项所述的重组HCV多表位减毒李斯特菌疫苗载体。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102149406A (zh) * 2008-07-24 2011-08-10 艾杜罗生物科技公司 用于治疗丙型肝炎的组合物和方法
CN102210861A (zh) * 2011-01-13 2011-10-12 中国人民解放军第四军医大学 丙型肝炎病毒多表位肽负荷的树突状细胞治疗性疫苗
CN106011089A (zh) * 2016-05-18 2016-10-12 中国人民解放军第四军医大学 串联hcv多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒制备和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102149406A (zh) * 2008-07-24 2011-08-10 艾杜罗生物科技公司 用于治疗丙型肝炎的组合物和方法
CN102210861A (zh) * 2011-01-13 2011-10-12 中国人民解放军第四军医大学 丙型肝炎病毒多表位肽负荷的树突状细胞治疗性疫苗
CN106011089A (zh) * 2016-05-18 2016-10-12 中国人民解放军第四军医大学 串联hcv多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒制备和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丁承超等: "双基因敲除减毒单增李斯特菌(ΔactA/ΔinlB)的构建及其生物学初步鉴定", 《现代食品科技》 *
江玲丽: "单核细胞增多性李斯特菌的主要毒力基因分析及其重组菌构建与免疫原性", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *

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