CN102149406A

CN102149406A - 用于治疗丙型肝炎的组合物和方法

Info

Publication number: CN102149406A
Application number: CN2009801355802A
Authority: CN
Inventors: P·M·劳尔; T·W·小杜本斯盖
Original assignee: Aduro Biotech Inc
Current assignee: Chinook Therapeutics Inc
Priority date: 2008-07-24
Filing date: 2009-07-23
Publication date: 2011-08-10
Also published as: EP2331123A4; JP2011529077A; CA2731842A1; KR20110045010A; WO2010011870A2; WO2010011870A3; US20120100170A1; AU2009273949A1; EP2331123A2

Abstract

本发明提供使用重组编码和表达这种抗原的细菌来递送一种或多种丙型肝炎病毒(HCV)抗原的组合物和方法。在某些实施方案中，细菌平台包括使用减弱和被杀死但代谢性活性形式的单核细胞增生性李斯特菌。

Description

用于治疗丙型肝炎的组合物和方法

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明部分在国立卫生研究院授予的基金No.1 U01 AI070834-01的资助下通过美国政府支持得以完成。政府可能拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明总体上涉及患有丙型肝炎传染或处于患有丙型肝炎传染的风险的受试者的治疗。更具体地，本发明涉及使用重组编码和表达这种抗原的细菌来递送一种或多种丙型肝炎病毒(HCV)抗原的组合物和方法。

背景技术

本发明的背景技术的下面讨论仅提供以辅助读者理解本发明，并且不许可描述或构成本发明的现有技术。

丙型肝炎是世界范围内发病率和死亡率的主要原因。估计世界上170百万个人感染HCV，在美国接近4百万人慢性感染，并且在欧洲最多9百万人慢性感染。急性疾病可导致恢复、暴发型肝炎、复发性肝炎干涉正常肝功能的期间，不明显的慢性传染，慢性活动性肝炎和肝硬化。在接触HCV的这些人中，80％变成慢性感染，并且至少30％的携带者发展成慢性肝病，包括肝硬化和肝细胞癌。

在发达国家中对于患有慢性HCV传染的患者，干扰素-α(IFN-α)和病毒唑的治疗的目前标准在最流行的HCV基因型1-3中已经证实不同的效果。尽管在具有HCV基因型2和3的患者中有效率为约80％，但是慢性感染HCV基因型1的患者中只有约50％在用IFN-α/病毒唑治疗后显示出持续的病毒应答。在美国慢性HCV传染的70-80％为基因型1。另外，IFN-α和病毒唑的毒性和耐受性特性限制它们在HCV治疗中的应用。

尽管在临床开发中有许多研究试剂，包括疫苗基治疗和小分子靶向，但是特异性HCV基因的功能制备例如病毒蛋白酶(NS3)和病毒聚合酶(NS5B)。例如，IC41是合成肽疫苗，含有7个相关丙型肝炎病毒(HCV)T细胞抗原表位和T协助细胞(Th)1/Tc1佐剂聚-L-精氨酸。IC41报道在健康志愿者中诱导HCV-特异性干扰素(IFN)-γ-分泌CD4+和CD8+T细胞。重组HCV NS3和NS5B蛋白与佐剂混合物(包含M-ISA720和CpG二核苷酸)一起也报道诱导CD4(+)和CD8(+)T细胞应答。然而这些方案中没有一种建立比在慢性HCV背景中的治疗的目前标准更优异的效果和耐受性。

发明概述

本发明提供使用重组编码和表达这种抗原的细菌来递送一种或多种丙型肝炎病毒(HCV)抗原的组合物和方法。

在本发明的第一方面，本发明涉及在受试者中诱导针对丙型肝炎病毒(HCV)的T细胞应答的方法。这些方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含表达一种或多种免疫原性HCV抗原多肽的细菌，其氨基酸序列包含：

(i)选自由核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b构成的组中的一种或多种全长HCV蛋白；

(ii)衍生自来自(i)的一种或多种全长HCV蛋白的一种或多种免疫原性氨基酸序列；或

(i)的一种或多种全长HCV蛋白和(ii)的一种或多种氨基酸序列的组合。

如本文中所述的，这些方法可在所述受试者中刺激针对重组表达的免疫原性HCV抗原多肽的抗原-特异性T细胞(CD4+和/或CD5+)应答。优选地，当递送至所述受试者时，本发明的组合物在所述递送后24小时诱导选自由IL-12p70、IFN-γ、IL-6、TNF α和MCP-1构成的组的一种或多种、优选各种蛋白的血清浓度增加；以及诱导针对由细菌表达的所述免疫原性HCV抗原多肽的一种或多种的CD4+和/或CD8+抗原-特异性T细胞应答。

在本发明的相关方面中，本发明涉及用于在受试者中诱导针对丙型肝炎病毒(HCV)的T细胞应答的组合物。这些组合物包含含有核酸分子的细菌，其序列编码一种或多种免疫原性HCV抗原多肽，其氨基酸序列包含：

并且在另一相关方面，本发明涉及分离的核酸分子，其序列编码一种或多种免疫原性HCV抗原多肽，其氨基酸序列包含：

下文中详细描述用于选择合适的免疫原性HCV抗原多肽序列的方法，并且提供示例性免疫原性HCV抗原多肽序列。选择方法可包括：选择一种或多种邻接的HCV氨基酸序列，其不具有超过李斯特菌ActA-N100的峰值疏水性的疏水性区域；选择预计编码一种或多种MHC I类抗原表位的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列；和/或选择预计编码一种或多种MHC I类抗原表位的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列。这些多肽产生CD4+和/或CD8+T细胞应答的能力可通过本文中详细描述的多种方法来证实，这是本领域熟知的。

在某些实施方案中，免疫原性HCV抗原多肽包含：一种或多种氨基酸序列，其独立地选自由全长核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b构成的组；与这种全长HCV抗原具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；全长核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的片段；和与这种片段具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在优选实施方案中，免疫原性HCV抗原多肽包含一种或多种氨基酸序列，其选自由全长NS3、全长NS5b、衍生自NS3的氨基酸序列和衍生自NS5b的氨基酸序列构成的组。在某些实施方案中，衍生的氨基酸序列可独立地选自由下列构成的组：包含来自NS3的至少100个邻接残基的氨基酸序列；包含来自NS5b的至少100个邻接残基的氨基酸序列；与来自NS3的至少100个邻接残基具有至少90％序列同一性的氨基酸序列、和与来自NS5b的至少100个邻接残基具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

本领域中已知多种HCV分离物，其可起到用于上述氨基酸序列的源材料的作用。在优选实施方案中，核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和/或NS5b氨基酸序列是共有序列，优选来自基因型1HCV共有序列，最优选来自基因型1a或1b共有序列。下文提供示例性共有序列。蛋白序列可通过一种或多种插入、缺失和/或置换来修饰。

特别优选的HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种、优选各种氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82和83。

多种细菌种类被开发用作疫苗，并且可在本发明中用作疫苗平台，包括但不限于弗氏志贺氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生性李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌或分枝杆菌种类。该列表不意在是限制性的。本发明涵盖使用减弱、共栖、和/或被杀死但代谢性活性细菌菌株作为疫苗平台。在优选实施方案中，细菌是单核细胞增生性李斯特菌，包含编码用于通过细菌表达的编码本发明的一种或多种免疫原性HCV抗原多肽的核酸序列。该核酸最优选整合到细菌的基因组中。减弱和被杀死但代谢性活性形式的单核细胞增生性李斯特菌是特别优选的，并且在下文优选实施方案中描述在actA和/或inlB中包埋减弱突变的单核细胞增生性李斯特菌。

本文中所述的疫苗组合物可单独或联合药学上可接受的赋形剂施用至宿主，其量足以诱导针对HCV传染的合适的免疫应答。选择以在所述受试者中诱导所述T细胞应答的优选条件包括静脉内施用疫苗平台至受试者；然而，施用可以是口服、静脉内、皮下、皮肤、皮内、肌内、粘膜、肠胃外、器官内、病灶内、鼻内、吸入、眼内、血管内、节点内、通过划痕、直肠、腹膜内、或多种熟知施用途径的任意一种或组合。

在某些优选实施方案中，在受试者施用有效剂量的含有免疫原性HCV抗原多肽的疫苗以初免免疫应答后，施用第二疫苗。这在本领域中称为“初免-加强”方案。在这种方案中，本发明的组合物和方法可用作“初免”递送、“加强”递送、或“初免”和“加强”。这些方案的例子在下文中有所描述。

在本发明中使用的优选单核细胞增生性李斯特菌包含prfA基因中的突变，这将表达的prfA转录因子锁入组成性活性状态。例如PrfA^*突变体(G155S)已示出在静脉内或肌内初免-加强免疫方案后增强功能细胞免疫。

在某些实施方案中，免疫原性HCV抗原多肽表达为一种或多种融合蛋白，所述融合蛋白包含框内分泌信号序列，从而通过细菌导致分泌可溶性HCV抗原多肽。多种示例性信号序列在本领域中已知用在细菌表达体系中。在细菌是单核细胞增生性李斯特菌的情况下，优选分泌信号序列是单核细胞增生性李斯特菌信号序列，最优选ActA信号序列。另外ActA或其他接头氨基酸也可被表达融合至免疫原性HCV抗原多肽。在优选实施方案中，一种或多种免疫原性HCV抗原多肽表达为融合蛋白，所述融合蛋白包含选自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40构成的组的框内ActA-N100序列、或与所述ActA-N100序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在优选实施方案中，疫苗组合物包含表达融合蛋白的单核细胞增生性李斯特菌，包含：

(a)选自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40构成的组的ActA-N100序列、或与所述ActA-N100序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

(b)包含来自NS3的至少100个邻接残基的氨基酸序列、或与所述包含来自NS3的至少100个邻接残基的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及

(c)包含来自NS5b的至少100个邻接残基的氨基酸序列、或与所述包含来自NS5b的至少100个邻接残基的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；

其中所述融合蛋白表达自可操作地连接单核细胞增生性李斯特菌ActA启动子的核酸序列。在特别优选的实施方案中，(c)的氨基酸序列包含NS5b的氨基酸1-342(优选包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的氨基酸1-342)或其突变衍生物，其中所述突变使NS5b的RNA聚合酶活性失活(优选SEQ ID NO：22或SE Q ID NO：23中所示的突变)；并且(b)的氨基酸序列包含NS3的氨基酸172-484(优选包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的氨基酸172-484)或其突变衍生物，其中所述突变使NS3的解旋酶活性失活(优选SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21中所示的突变)。

在表达自单核细胞增生性李斯特菌细菌的情况下，在某些实施方案中编码HCV抗原多肽的核酸序列是优化用于通过单核细胞增生性李斯特菌表达的密码子。如下文所述，不同有机体通常展示“密码子偏倚”；即，编码特定氨基酸的给定密码子在遗传密码中出现的程度在有机体之间显著改变。通常，基因含有的密码子越罕用，在该特异性宿主体系内在合理水平表达异源蛋白的可能性越小。如果罕用密码子出现在蛋白的簇集中或N-末端部分中，这些水平甚至变得更低。在不修饰氨基酸序列的情况下使用更紧密地反映宿主体系的密码子偏倚的其他密码子代替罕用密码子可增加功能蛋白表达的水平。用于密码子优化的方法在下文有所描述。

本发明的方法和组合物可发现作为预防或治疗性HCV疫苗的用途。在优选实施方案中，受试者被选择以基于之前诊断的慢性HCV传染来接收本发明的组合物。

应理解，本发明在其申请中不限于在下列描述阐述的或在附图中示出的构建细节和组分布置。本发明能够以除了那些描述的方式来实施和能够以多种方式实施与操作。此外，应理解本文中使用的措辞和术语、以及摘要用于描述的目的，并且不应该被认为是限制性的。

这样，本领域技术人员将意识到，该公开基于的概念可容易地被用作用于设计其他结构、方法和体系的基础，以实施本发明的数个目的。因此重要的是，权利要求被认为包括这些等价构造，只要它们不偏离本发明的精神和范围。

附图简述

本发明及其各种特征和有利细节参照附图中示出的和下列说明中详述的非限制性实施方案来更充分地解释。应该注意，附图中示出的特征不须按比例绘制。忽略熟知组分和加工技术的描述，以不会徒然地模糊本发明。本文中使用的例子仅旨在促进方式的理解，以该方式本发明可实施并且进一步能够使本领域技术人员来实施本发明。因此，例子不应该认为限制本发明的范围。在附图中，在多个视图全文中类似的附图标记表示相应的部分。

图1示出L.monocytogenes疫苗菌株ANZ-521的衍生图。

图2示出在单核细胞增生性李斯特菌ANZ 100的inlB基因座插入的HCVNS5B-NS3抗原表达盒的图。

图3示出在单核细胞增生性李斯特菌ANZ-521的构建中使用的各种构建体。

图4示出用于映射HCVNS5A和NS3的免疫原性抗原表位的肽。

图5示出用于映射HCVNS5A和NS3的免疫原性抗原表位的肽。

图6示出小鼠中NS3-和NS5b-特异性CD4+和CD8+T细胞免疫。

图7示出基于基因型1共有序列融合HCV核心、NS3和NS5b抗原的ActA-N100的Kyte-Doolittle亲水性图。

图8示出通过ActA-N100HCV抗原融合蛋白的李斯特菌的抗原表达。组A在泳道3、4和5示出核心序列1-190、1-180和1-177。组B在泳道3-10示出NS3序列1-631、1-484、22-631、22-484、22-280、172-484、172-631和416-631。组C在泳道3-7示出NS5序列1-574、1-342、320-591和320-574。各组中的泳道1和2是阴性和阳性对照，其示出没有抗原插入和通过单核细胞增生性李斯特菌CRS-207的间皮素表达。

发明详述

本发明涉及使用编码和表达一种或多种丙型肝炎病毒(HCV)抗原的细菌来递送主动免疫疗法的组合物和方法。

1.定义

用于表示基因中突变或包含基因的细菌中突变的缩写如下所示。通过例子的方式，缩写“L.monocytogenes ΔActA”是指部分或全部ActA基因缺失。Delta符号(Δ)是指缺失。包括上标减号的缩写(李斯特菌ActA^-)是指ActA基因突变，例如通过缺失、点突变、或移码突变的方式进行，但不限于这些类型的突变。

在应用于人、哺乳动物、哺乳动物受试者、动物、兽医受试者、安慰剂受试者、研究受试者、试验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，“施用”非限制性意指使外源配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物接触受试者、细胞、组织、器官或生物流体等。“施用”可例如是指治疗、药物动力学、诊断、研究、安慰剂和试验方法。细胞的处理包括使试剂接触细胞，以及使试剂接触流体，其中流体接触细胞。″施用″还包括通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一细胞的细胞的(例如)体外和离体处理。

在涉及配体和受体时，“激动剂”包含刺激受体的分子、分子联合、络合物或试剂联合。例如，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的激动剂可包括GM-CSF、GM-CSF的突变蛋白或衍生物、GM-CSF的肽模拟物、模拟GM-CSF的生物功能的小分子、或刺激GM-CSF受体的抗体。

在涉及配体和受体时，“拮抗剂”包含抑制、抵消、下调和/或脱敏受体的分子、分子联合、或络合物。“拮抗剂”包括抑制受体的组成性活性的任何试剂。组成性活性是在不存在配体/受体相互作用的情况下明显的那种。“拮抗剂”还包括抑制或防止受体的刺激(或调节)活性的任何试剂。通过例子的方式，GM-CSF受体的拮抗剂包括但不限于：结合配体(GM-CSF)并防止其结合受体的抗体、或结合受体并防止配体结合受体的抗体、或其中以失活构象抗体锁住受体。

如本文中使用的，参照肽、多肽或蛋白的“类似物”是指具有和初始肽、多肽或蛋白类似或相同功能的另一肽、多肽或蛋白，但其不必包含初始肽、多肽或蛋白的类似或相同氨基酸序列或结构。类似物优选满足下列中的至少一种：(a)具有与初始氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列的蛋白质剂；(b)由核苷酸序列编码的蛋白质剂，所述核苷酸序列在严格条件下杂交编码初始氨基酸序列的核苷酸序列；和(c)由核苷酸序列编码的蛋白质剂，所述核苷酸序列与编码初始氨基酸序列的核苷酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。

“抗原递呈细胞”(APC)是用于递呈抗原至T细胞的免疫体系的细胞。APC包括树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、边缘区Kupffer细胞、小胶质细胞、朗氏细胞、T细胞和B细胞。树突细胞产生在至少两个谱系中。第一谱系包括前体-DC1、骨髓DC1和成熟DC1。第二谱系包括CD34⁺⁺CD45RA^-早期祖多能细胞、CD34⁺⁺CD45RA⁺细胞、CD34⁺⁺CD45RA⁺⁺CD4⁺ IL-3Rα⁺⁺促-DC2细胞、CD4⁺CD11c^-类浆细胞前体-DC2细胞、淋巴人DC2类浆细胞-衍生的DC2、和成熟DC2。

“减弱”和“减弱的”包括被修饰以减少对于宿主毒性的细菌、病毒、寄生物、传染有机体、朊病毒、肿瘤细胞、传染有机体中的基因等。宿主可以是人或动物宿主、或器官、组织或细胞。为了给出非限制性例子，细菌可被减弱以减少与宿主细胞的结合、减小从一种宿主细胞至另一宿主细胞的传播、减小细胞外生长、或减小在宿主细胞中的细胞内生长。减弱可通过测量例如毒性indicum或指标、LD₅₀、从器官的清除率、或竞争力指数(例如参见Auerbuch，et al.(2001)Infect.Immunity 69：5953-5957)来评价。通常，减弱导致LD₅₀增加和/或清除率增加至少25％；更通常增加至少50％；最通常增加至少100％(2-倍)；正常增加至少5-倍；更正常增加至少10-倍；最正常增加至少50-倍；经常增加至少100-倍；更经常增加至少500-倍；和最经常增加至少1000-倍；常增加至少5000-倍；更常增加至少10,000-倍；和最常增加至少50,000-倍；以及最经常增加至少100,000-倍。

“减弱基因”包括调节对于宿主的毒性、病理或毒力、在宿主内生长、或在宿主内存活的基因，其中所述基因以减轻、降低或消除毒性、病理或毒力的方式突变。降低或消除可通过比较由突变基因调节的毒力或毒性与由非突变(或母体)基因调节的毒力或毒性来评价。“突变基因”包括基因的调节区、基因的编码区、基因的非编码区、或其任意组合中的缺失、点突变和移码突变。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同氨基酸序列、或具有一个或多个保守置换的氨基酸序列的核酸。保守置换的例子是将下列组的一个中的氨基酸交换为相同组中的另一氨基酸(美国专利No.5,767,063，授于Lee，et al.；Kyte and Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157：105-132)。

(1)疏水性：正亮氨酸，Ile，Val，Leu，Phe，Cys，Met；

(2)中等亲水性：Cys，Ser，Thr；

(3)酸性：Asp，Glu；

(4)碱性：Asn，Gln，His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳族：Trp，Tyr，Phe；以及

(7)小氨基酸：Gly，Ala，Ser。

“有效量”包括但不限于可改善、反转、减轻、预防或诊断医学病症或紊乱的症状或迹象的量。除非另外清晰地或根据上下文说明，“有效量”不限于足以改善病症的最小量。

“细胞外液”包括例如血清、血浆、血液、间质液、脑脊髓液、分泌液、淋巴液、胆汁、汗液、粪便物和尿。“细胞外液”可包括胶体或混悬液，例如全血或凝固血液。

包括肽或多肽的多肽上下文中的术语“片段”包含下列氨基酸序列：较大多肽的氨基酸序列的至少5个邻接的氨基酸残基、至少10个邻接的氨基酸残基、至少15个邻接的氨基酸残基、至少20个邻接的氨基酸残基、至少25个邻接的氨基酸残基、至少40个邻接的氨基酸残基、至少50个邻接的氨基酸残基、至少60个邻接的氨基酸残基、至少70个邻接的氨基酸残基、至少80个邻接的氨基酸残基、至少90个邻接的氨基酸残基、至少100个邻接的氨基酸残基、至少125个邻接的氨基酸残基、至少150个邻接的氨基酸残基、至少175个邻接的氨基酸残基、至少200个邻接的氨基酸残基或至少250个邻接的氨基酸残基。

“基因”是指编码寡肽或多肽的核酸序列。寡肽或多肽可以是生物活性的、抗原活性的、生物失活的或抗原失活的等。术语基因包括例如编码特异性寡肽或多肽的开放阅读框(ORF)的总和；ORF加编码内含子的核酸的总和；ORF和可操作地连接的启动子的总和；ORF和可操作地连接的启动子与任意内含子的总和；ORF和可操作地连接的启动子、内含子和启动子与其他调节元件例如增强子的总和。在某些实施方案中，“基因”包括用于顺式调节基因表达的要求的任何序列。术语基因还可是指编码这样的肽的核酸，所述肽包括肽、寡肽、多肽或蛋白的抗原或抗原活性的片段。术语基因不必意指编码的肽或蛋白具有任何生物活性，或甚至肽或蛋白是抗原活性的。编码非可表达的序列的核酸序列通常被认为是假基因。术语基因还包括编码核糖核酸例如rRNA、tRNA或核酶的核酸序列。

细菌例如李斯特菌的“生长”包括但不限于涉及定居、复制、蛋白含量增加和/或脂质含量增加的细菌生理学和基因的功能。除非另外清晰地或根据上下文说明，李斯特菌的生长包括细菌在宿主细胞外部的生长，还包括在宿主细胞内部的生长。生长相关基因包括但不限于下列那些：调节能量产生(例如糖酵解、三羧酸循环、细胞色素)、氨基酸、糖、脂质、矿物质、嘌呤和嘧啶的合成代谢和/或分解代谢、营养物运输、转录、翻译和/或复制。在一些实施方案中，李斯特菌细菌的“生长”是指李斯特菌细菌的细胞内生长，即，在宿主细胞例如哺乳动物细胞内部生长。尽管李斯特菌细菌的细胞内生长可通过光学显微学或集落形成单元(CFU)测试来测量，但是生长不限于任何技术或测量。生物化学参数例如李斯特菌抗原、李斯特菌核酸序列、或李斯特菌细菌特异性脂质的量可用于测试生长。在一些实施方案中，调节生长的基因是特异性调节细胞内生长的那种。在一些实施方案中，特异性调节细胞内生长的基因包括但不限于下列基因：基因的失活减小细胞内生长速率但没有可检测地、实质上地或可察觉地减小细胞外生长(例如发酵生长)速率；或基因的失活减小细胞内生长速率至比其减小细胞外生长速率更大的程度。为了提供非限制性例子，在一些实施方案中，其中失活减小细胞内生长速率至比其减小细胞外生长更大的程度的基因包括这样的情况，其中失活减小细胞内生长至小于正常或最大值的50％，但是仅减小细胞外生长至最大值的1-5％、5-10％或10-15％。在某些方面，本发明包括在细胞内生长减弱但在细胞外生长不减弱的李斯特菌、在细胞内生长不减弱和在细胞外生长不减弱的李斯特菌、以及在细胞内生长不减弱但在细胞外生长减弱的李斯特菌。

“嗜水性分析”是指通过Kyte和Doolittle法来分析多肽序列：″A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein″.J.Mol.Biol.157(1982)105-132。在该方法中，各氨基酸给出的疏水性评分在4.6和-4.6之间。4.6的评分是最具疏水性和-4.6的评分是最具亲水性。然后设定窗口大小。窗口大小是这样的氨基酸的数量，该氨基酸的疏水性评分将平均化并在所述窗口中分配给第一氨基酸。计算开始于氨基酸的第一窗口，并且计算该窗口中所有疏水性评分的平均值。然后窗口向下移动一种氨基酸并计算第二窗口中所有疏水性评分的平均值。该图案继续至蛋白末端，计算各窗口的平均评分并分配至窗口中的第一氨基酸。然后将平均值绘制成图。y轴表示疏水性评分并且x轴表示窗口号。下列疏水性评分用于20种常见氨基酸。

“标记的”组合物是可通过光谱法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、同位素法或化学方法直接或间接检测。例如，有用的标记包括³²P、³³P、³⁵S、¹⁴C、³H、¹²⁵I、稳定同位素、抗原表位标签、荧光染料、电子-致密试剂、底物或酶，例如用于酶联免疫测试或fluorette法(例如参见Rozinov and Nolan(1998)Chem.Biol.5：713-728)。

“配体”是指为受体的激动剂或拮抗剂的小分子、肽、多肽、或者膜缔合或膜结合分子。“配体”还包括不是激动剂或拮抗剂并且不具有激动剂或拮抗剂性能的结合剂。按照惯例，如果配体在第一细胞上膜结合，受体通常产生在第二细胞上。第二细胞可具有和第一细胞相同同一性(同名)，或其可具有不同同一性(异名)。配体或受体可完全在细胞内，即，其可存在于胞液、细胞核或在一些其他细胞内隔室中。配体或受体可改变其位置，例如从细胞内隔室至血浆膜的外面。配体和受体的络合物称为“配体受体络合物”。如果配体和受体涉及信号传导途径，配体产生在信号传导途径的上游位置，并且受体产生在信号传导途径的下游位置。

“核酸”是指单链、双链形式、或多链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。核酸的非限制性例子是例如cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸。特定核酸序列还可暗示包括“等位基因变体”和“接合变体”。

在启动子和编码mRNA的核酸的上下文中“可操作地连接”是指启动子可用于起始核酸的转录。

术语“序列同一性百分比”和“％序列同一性”是指通过两种或多种氨基酸或核酸序列的比较或比对而确定的序列类似性的百分比。同一性百分比可通过下列方式直接确定：通过比对序列直接比较两种分子之间的序列信息，对两种比对的序列之间的精确匹配数进行计数，除以较短序列的长度，并且将结果乘以100。用于计算序列同一性的算法是Smith-Waterman同源性搜索算法(例如参见Kann and Goldstein(2002)Proteins 48：367-376；Arslan，et al.(2001)Bioinformatics 17：327-337)。

当涉及多肽时，“纯化的”和“分离的”是指在基本上不存在其他生物大分子的情况下存在与其本质相关的多肽。本文中使用的术语“纯化的”是指鉴定的多肽通常为本发明多肽的至少50重量％，更通常为至少60重量％，典型为至少70重量％，更典型为至少75重量％，最典型为至少80重量％，经常为至少85重量％，更经常为至少90重量％，最经常为至少95重量％，并且常规地为至少98重量％或更大。在多肽纯度的测定中通常不使用水、缓冲液、盐、洗洁剂、还原剂、蛋白酶抑制剂、稳定剂(包括加入的蛋白例如白蛋白)、和赋形剂、与分子量小于1000的分子的重量。例如参见美国专利No.6,090,611(授于Covacci，et al.)中纯度的讨论。

“肽”是指氨基酸的短序列，其中氨基酸通过肽键彼此连接。肽可与另一部分游离或结合，例如大分子、脂质、寡糖或多糖、和/或多肽。在肽引入多肽链中时，术语“肽”仍可用于具体是指氨基酸的短序列。“肽”可通过肽键或一些其他类型的键合的方式和另一部分连接。肽的长度为至少两个氨基酸，并且通常长度小于约25个氨基酸，其中最大长度是惯例或上下文的函数。术语“肽”和“寡肽”可互换使用。

“蛋白”通常是指包含多肽链的氨基酸的序列。蛋白还可是指三维结构的多肽。“变性蛋白”是指具有一些残余三维结构的部分变性多肽，或可选择地，基本上任意三维结构，即全部变性。本发明包括试剂和使用多肽变体的方法，例如涉及糖基化、磷酸化、硫酸化、二硫键形成、脱酰胺、异构化、信号或前导序列加工中的分裂点、共价和非共价键合的辅助因子、氧化的变体等。二硫键接合的蛋白的形成有所描述(例如参见Woycechowsky and Raines(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4：533-539；Creighton，et al.(1995)Trends Biotechnol.13：18-23)。

当涉及例如核酸、细胞、动物、病毒、质粒、载体等使用时，“重组”是指通过引入外源非天然核酸、改变天然核酸、或者全部或部分衍生自重组核酸、细胞、病毒、质粒或载体来修饰。重组蛋白是指衍生自例如重组核酸、病毒、质粒、载体等的蛋白。“重组细菌”包括其中基因组通过重组方法工程化的细菌，例如通过突变、缺失、插入和/或重排的方式。“重组细菌”还包括修饰以包括重组基因组外核酸的细菌，例如质粒或第二染色体，或者其中现有基因组外核酸改变的细菌。

“样品”是指来自人、动物、安慰剂或研究样品的样品，例如细胞、组织、器官、流体、气体、气溶胶、浆料、胶体或凝聚材料。“样品”可体内测试，例如无需从人或动物中除去，或者其可体外测试。样品可在加工后进行测试，例如通过组织学方法。“样品”还是指例如包含流体或组织样品的细胞、或者从流体或组织样品分离的细胞。“样品”还可是指从人或动物新鲜提取的细胞、组织、器官或流体，或者是指加工或储存的细胞、组织、器官或流体。

“可选择的标志物”包括允许选择用于或对抗含有可选择的标志物的细胞的核酸。可选择的标志物的例子包括但不限于例如：(1)编码对其他毒性化合物提供抗性的产物(例如抗菌素)的核酸或编码对其他有害化合物敏感的产物(例如蔗糖)的核酸；(2)编码受体细胞中缺乏的产物(例如tRNA基因、营养缺陷型标志物)的核酸；(3)编码抑制基因产物的活性的产物的核酸；(4)编码可容易地鉴定的产物(例如表型标志物，例如β-牛乳糖、绿荧光蛋白(GFP)、细胞表面蛋白、抗原表位标签、FLAG标签)的核酸；(5)编码可通过杂交技术例如PCR或分子信标鉴定的核酸。

当涉及配体/受体时，“特异性”或“选择性”结合核酸/互补核酸、抗体/抗原、或其他结合对(例如使细胞因子结合细胞因子受体)是指结合反应，该结合反应决定蛋白存在于蛋白和生物制剂的异源群体。因此，在指定条件下，特定配体结合特定受体，并且不以明显的量结合样品中存在的其他蛋白。特异性结合也可是指例如衍生自抗体的抗原-结合位点的结合化合物、核酸配体、抗体或结合组合物，在所涵盖的方法中，与靶结合的亲和性比和任意其他结合化合物的亲和性通常大至少25％，更通常大至少50％，最通常大至少100％(2-倍)，正常大至少10倍，更正常大至少20-倍，最正常大至少100-倍。

在典型实施方案中，例如如通过Scatchard分析(Munsen，et al.(1980)Analyt.Biochem.107：220-239)测定的，抗体的亲和性大于约10⁹升/mol。熟练技术人员认识到，大部分结合化合物可特异性结合多于一种靶例如抗体特异性结合其抗原，通过抗体的寡糖的方式结合外源凝集素、和/或通过抗体的Fc区结合Fc受体。

细菌“传播”包括“细胞至细胞传播”，即，从第一宿主细胞至第二宿主细胞传递细菌，如通过囊泡介导的。涉及传播的功能包括但不限于例如肌动蛋白尾的形成、假足状延长的形成和双膜液泡的形成。

本文中使用的术语“受试者”是指人或非-人有机体。因此，本文中所述的方法和组合物适用于人和兽医疾病。在某些实施方案中，受试者是“患者”即因为疾病或病症接受医学治疗的活人。这包括患有不限定疾病的人，其被调查用于病理迹象。优选具有现有HCV传染、最优选慢性传染的受试者。

重组酶的“靶点”是通过重组酶识别、结合和/或作用的核酸序列或区域(例如参见美国专利No.6,379,943，授于Graham，et al.；Smith and Thorpe(2002)Mol.Microbiol.44：299-307；Groth and Calos(2004)J.Mol.Biol.335：667-678；Nunes-Duby，et al.(1998)Nucleic Acids Res.26：391-406)。

“治疗有效量”定义为足以表现出患者益处、即使待治疗的病症的症状减小、抑制或改善的试剂或药物组合物的量。当试剂或药物组合物包含诊断剂时，“诊断有效量”定义为足以产生信号、图形或其他诊断参数的量。药物制剂的有效量根据多种因素而改变，例如个体的敏感程度、个体的年龄、性别和重量、以及个体的特异体质应答(例如参见美国专利No.5,888,530，授于Netti，et al.)。

涉及病症或疾病时“治疗”(“Treatment”或“treating”)是用于获得有益或期望结果(包括和优选临床结果)的方案。为了该发明，涉及疾病时有益或期望结果包括但不限于下列的一种或多种：改善和疾病相关的病症、治愈疾病、减缓疾病的严重性、延迟疾病的发展、减轻和疾病相关的一种或多种症状、增加患有疾病的患者的生活质量和/或延长存活。同样，为了该发明，涉及病症时有益或期望结果包括但不限于下列的一种或多种：改善和病症相关的病症、治愈病症、减缓病症的严重性、延迟病症的发展、减轻和病症相关的一种或多种症状、增加患有病症的患者的生活质量和/或延长存活。例如，在其中本文中所述的组合物用于治疗癌症的一些实施方案中，有益或期望结果包括但不限于下列的一种或多种：减轻赘生物或癌细胞的增殖(或破坏)、减小癌症中发现的赘生物细胞的转移、缩小肿瘤的尺寸、减轻源自癌症的症状、改善患有癌症的患者的生活质量、减小治疗疾病所要求的其他药物的剂量、延迟疾病的进展和/或延长患有癌症的患者的存活。取决于上下文，受试者的“治疗”可表示例如在下列情况中受试者需要治疗：受试者具有期望通过施用试剂来改善的紊乱。

“疫苗”包括预防疫苗。疫苗还包括治疗疫苗，例如施用至哺乳动物的疫苗，所述哺乳动物具有和由疫苗提供的抗原或抗原表位相关的病症或紊乱。

2.丙型肝炎抗原

HCV具有含有大开放阅读框的正链RNA基因组，所述大开放阅读框编码约3,000个氨基酸的前体多蛋白。该多蛋白被宿主和病毒蛋白酶分裂为10种病毒蛋白，称为核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b抗原。尽管下列例子提出使用核心、NS5b和NS3，但是这些HCV抗原序列中的任意一种或多种可发现在本文中所述的疫苗组合物和方法中的用途。

如本文中使用的，术语“HCV抗原”是指编码氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含：(i)一种或多种全长HCV蛋白，选自由核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和/或NS5b构成的组；和/或(ii)衍生自一种或多种全长HCV蛋白的一种或多种多肽序列，所述一种或多种全长HCV蛋白独立地选自由核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和/或NS5b构成的组。本文中所述的HCV抗原可单独使用，但优选联合多肽序列使用，所述多肽序列为选自由核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和/或NS5b构成的组的至少两个、三个、四个、五个、或更多个HCV蛋白。如下文所述，优选HCV抗原包含NS3和/或NS5b多肽序列或从其衍生的序列。

如所述的，本发明中使用的HCV抗原可包含核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、和/或NS5b抗原的全长版本，或可包含“衍生自”一种或多种这样的全长HCV抗原的序列。本文中使用的“衍生自”是指和特定HCV抗原或抗原相比具有一个或多个保守氨基酸改变的多肽、包含来自特定HCV抗原或抗原的一种或多种分离的抗原表位的多肽、或者和特定HCV抗原或抗原免疫交叉反应的肽或多肽。

在一些实施方案中，“衍生自”HCV抗原的抗原包含一种或多种全长HCV抗原的部分序列(“片段”)。因此，“HCV抗原”可是指编码氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含：(i)一种或多种全长HCV蛋白，选自由核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和/或NS5b构成的组；和/或(ii)一种或多种全长HCV蛋白的一种或多种部分多肽序列，所述一种或多种全长HCV蛋白独立地选自由核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和/或NS5b构成的组。在多种实施方案中，衍生的HCV抗原包含从全长HCV抗原获得的至少8个氨基酸、至少12个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸或至少200个氨基酸、或更长的片段。

抗原可包含编码得自初始(全长)HCV抗原的至少一种MHC I类抗原表位和/或至少一种MHC II类抗原表位的序列。公众可得的算法可用于选择结合MHC I类和/或II类分子的抗原表位。例如，根据肽/HLA络合物的预测半衰期解离，预测算法“BIMAS”评价潜在的HLA结合抗原表位。根据说明存在初级和次级HLA-结合锚定残基的评分，“SYFPEITHI”算法评价肽。计算机算法评分候选物抗原表位基于给定蛋白内的氨基酸序列，其具有和之前公开的HLA结合抗原表位类似的结合模体。其他算法也可用于鉴定用于进一步生物测试的候选物。

抗原的衍生物还可包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与其衍生的HCV抗原部分具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％序列同一性、或至少约98％序列同一性。优选地，由疫苗构建体表达的HCV抗原和野生型等价物的不同之处在于抗原包含一种或多种突变，所述突变被工程化到对于各蛋白的一种或多种功能关键的模体中。例如，在来自基因型1共有序列的NS5b的情况下，GDD至GNH(开始于NS5b的氨基酸317)失活双突变完全使RNA聚合酶活性失活。同样，在来自基因型1共有序列的NS3的情况下，开始于氨基酸290的模体II(DECH)至AASH的突变消除解旋酶活性。

HCV有至少6种已知基因型和超过50种亚型。尽管下列例子提出使用基因型1抗原，但是本文中所述的方法和组合物适用于所有HCV基因型和亚型。因此，在本发明中使用的一种或多种抗原序列可得自任意特异性HCV基因型/亚型。

预防和治疗HCV疫苗目前是可得的，并且对于开发各种病毒的疫苗是明显的挑战。HCV在各感染的人内现有的人中之间和之内是高度不同的作为准种，或紧密相关但明显不同的基因序列的“群”。因此，在有效的HCV疫苗的开发中一种策略是获得一种或多种抗原，不来自各亚型而是来自共有序列以用于特定基因型，这基于在各位置最通常发现的氨基酸以用于给定抗原。例如参见WO06/086188，其全文通过引用的方式并入本文中，包括所有表格、附图和权利要求书。共有序列的一种理论优点是其使疫苗菌株和同代分离物之间的基因差异最小化，从而有效地使多样性程度减半，因此其可对于引发交叉反应应答具有增强的潜力。共有序列疫苗还更有效的用于制备，因为共有不可能在地理区域之中改变。

因此，在优选实施方案中，基于HCV共有序列使用HCV抗原。例如，HCV抗原可以是编码氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含：(i)一种或多种全长HCV蛋白的共有序列，一种或多种全长HCV蛋白选自由核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和/或NS5b构成的组；和/或(ii)衍生自一种或多种全长HCV蛋白的共有序列的一种或多种多肽序列，所述一种或多种全长HCV蛋白独立地选自由核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和/或NS5b构成的组。下列表格提供对于多种HCV分离物的Swiss-Prot入口数据：

尽管下列共有序列是优选的，但事实上是示例性的，并且不应该被认为是限制性的：

核心；共有基因型1a(SEQ ID NO：7)

MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR 50

KTSERSQPRG RRQPIPKARR PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP 100

RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGAARA 150

LAHGVRVLED GVNYATGNLP GCSFSIFLLA LLSCLTVPAS A 191

核心；共有基因型1b(SEQ ID NO：8)

MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQIVGGVYLLPRR GPRLGVRATR 50

KTSERSQPRG RRQPIPKARR PEGRAWAQPG YPWPLYGNEG MGWAGWLLSP 100 RGSRPSWGPT

DPRRRSRNLG KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGAARA 150 LAHGVRVLED GVNYATGNLP

GCSFSIFLLA LLSCLTIPAS A 191

E1；共有基因型1a(SEQ ID NO：9)

YQVRNSSGLY HVTNDCPNSS VVYEAADAIL HTPGCVPCVR EGNASRCWVA 50

VTPTVATRDG KLPTTQLRRH IDLLVGSATL CSALYVGDLC GSVFLVGQLF 100

TFSPRHHWTT QDCNCSIYPG HITGHRMAWN MMMNWSPTAA LVVAQLLRIP 150

QAIMDMIAGA HWGVLAGIKY FSMVGNWAKV LVVLLLFAGV DA 192

E2；共有基因型1a(SEQ ID NO：10)

ETHVTGGNAG RTTAGLVGLL TPGAKQNIQL INTNGSWHIN STALNCNESL 50

NTGWLAGLFY QHKFNSSGCP ERLASCRRLT DFAQGWGPIS YANGSGLDER 100

PYCWHYPPRP CGIVPAKSVC GPVYCFTPSP VVVGTTDRSG APTYSWGAND 150

TDVFVLNNTR PPLGNWFGCT WMNSTGFTKV CGAPPCVIGG VGNNTLLCPT 200

DCFRKYPEAT YSRCGSGPRI TPRCMVDYPY RLWHYPCTIN YTIFKVRMYV 250

GGVEHRLEAA CNWTRGERCD LEDRDRSELS PLLLSTTQWQ VLPCSFTTLP 300

ALSTGLIHLH QNIVDVQYLY GVGSSIASWA IKWEYVVLLF LLLADARVCS 350

CLWMMLLISQ AEA 363

p7；共有基因型1a(SEQ ID NO：11)

ALENLVILNA ASLAGTHGLV SFLVFFCFAW YLKGRWVPGA VYALYGMWPL 50

LLLLLALPQR AYA 63

NS2；共有基因型1a(SEQ ID NO：12)

LDTEVAASCG GVVLVGLMAL TLSPYYKRYI SWCMWWLQYF LTRVEAQLHV 50

WVPPLNVRGG RDAVILLTCV VHPALVFDIT KLLLAIFGPL WILQASLLKV 100

PYFVRVQGLL RICALARKIA GGHYVQMAII KLGALTGTCV YNHLAPLRDW 150

AHNGLRDLAV AVEPVVFSRM ETKLITWGAD TAACGDIING LPVSARRGQE 200

ILLGPADGMV SKGWRLL 217

NS3；共有基因型1a(SEQ ID NO：13)

APITAYAQQT RGLLGCIITS LTGRDKNQVE GEVQIVSTAA QTFLATCING 50

VCWTVYHGAG TRTIASSKGP VIQMYTNVDQ DLVGWPAPQG ARSLTPCTCG 100

SSDLYLVTRH ADVIPVRRRG DSRGSLLSPR PISYLKGSSG GPLLCPAGHA 150

VGIFRAAVCT RGVAKAVDFI PVENLETTMR SPVFTDNSSP PAVPQSFQVA 200

HLHAPTGSGK STKVPAAYAA QGYKVLVLNP SVAATLGFGA YMSKAHGIDP 250

NIRTGVRTIT TGSPITYSTY GKFLADGGCS GGAYDIIICD ECHSTDATSI 300

LGIGTVLDQA ETAGARLVVL ATATPPGSVT VPHPNIEEVA LSTTGEIPFY 350

GKAIPLEVIK GGRHLIFCHS KKKCDELAAK LVALGINAVA YYRGLDVSVI 400

PTSGDVVVVA TDALMTGYTG DFDSVIDCNT CVTQTVDFSL DPTFTIETTT 450

LPQDAVSRTQ RRGRTGRGKP GIYRFVAPGE RPSGMFDSSV LCECYDAGCA 500

WYELTPAETT VRLRAYMNTP GLPVCQDHLE FWEGVFTGLT HIDAHFLSQT 550

KQSGENFPYL VAYQATVCAR AQAPPPSWDQ MWKCLIRLKP TLHGPTPLLY 600

RLGAVQNEVT LTHPVTKYIM TCMSADLEVV T 631

NS3；共有基因型1b(SEQ ID NO：14)

APITAYSQQT RGLLGCIITS LTGRDKNQVE GEVQVVSTAT QSFLATCVNG 50

VCWTVYHGAG SKTLAGPKGP ITQMYTNVDQ DLVGWQAPPG ARSLTPCTCG 100

SSDLYLVTRH ADVIPVRRRG DSRGSLLSPR PVSYLKGSSG GPLLCPSGHA 150

VGIFRAAVCT RGVAKAVDFV PVESMETTMR SPVFTDNSSP PAVPQTFQVA 200

HLHAPTGSGK STKVPAAYAA QGYKVLVLNP SVAATLGFGA YMSKAHGVDP 250

NIRTGVRTIT TGAPITYSTY GKFLADGGCS GGAYDIIICD ECHSTDSTTI 300

LGIGTVLDQA ETAGARLVVL ATATPPGSVT VPHPNIEEVA LSNTGEIPFY 350

GKAIPIETIK GGRHLIFCHS KKKCDELAAK LSGLGLNAVA YYRGLDVSVI 400

PTSGDVVVVA TDALMTGFTG DFDSVIDCNT CVTQTVDFSL DPTFTIETTT 450

VPQDAVSRSQ RRGRTGRGRR GIYRFVTPGE RPSGMFDSSV LCECYDAGCA 500

WYELTPAETS VRLRAYLNTP GLPVCQDHLE FWESVFTGLT HIDAHFLSQT 550

KQAGDNFPYL VAYQATVCAR AQAPPPSWDQ MWKCLIRLKP TLHGPTPLLY 600

RLGAVQNEVT LTHPITKYIM ACMSADLEVV T 631

NS4a；共有基因型1a(SEQ ID NO：15)

STWVLVGGVL AALAAYCLST GCVVIVGRIV LSGKPAIIPD REVLYQEFDE 50

MEEC 54

NS4b；共有基因型1a(SEQ ID NO：16)

SQHLPYIEQG MMLAEQFKQK ALGLLQTASR HAEVITPAVQ TNWQKLEVFW 50

AKHMWNFISG IQYLAGLSTL PGNPAIASLM AFTAAVTSPL TTGQTLLFNI 100

LGGWVAAQLA APGAATAFVG AGLAGAALDS VGLGKVLVDI LAGYGAGVAG 150

ALVAFKIMSG EVPSTEDLVN LLPAILSPGA LAVGVVFASI LRRRVGPGEG 200

AVQWMNRLIA FASRGNHVSP THYVPESDAA ARVTAILSSL TVTQLLRRLH 250

QWISSECTTP C 261

NS5a；共有基因型1a(SEQ ID NO：17)

SGSWLRDIWD WICEVLSDFK TWLKAKLMPQ LPGIPFVSCQ RGYRGVWRGD 50

GIMHTRCHCG AEITGHVKNG TMRIVGPRTC KNMWSGTFFI NAYTTGPCTP 100

LPAPNYKFAL WRVSAEEYVE IRRVGDFHYV SGMTTDNLKC PCQIPSPEFF 150

TELDGVRLHR FAPPCKPLLR EEVSFRVGLH EYPVGSQLPC EPEPDVAVLT 200

SMLTDPSHIT AEAAGRRLAR GSPPSMASSS ASQLSAPSLK ATCTANHDSP 250

DAELIEANLL WRQEMGGNIT RVESENKVVI LDSFDPLVAE EDEREVSVPA 300

EILRKSRRFA PALPVWARPD YNPLLVETWK KPDYEPPVVH GCPLPPPRSP 350

PVPPPRKKRT VVLTESTLPT ALAELATKSF GSSSTSGITG DNTTTSSEPA 400

PSGCPPDSDV ESYSSMPPLE GEPGDPDLSD GSWSTVSSGA DTEDVVCC 448

NS5b；共有基因型1a(SEQ ID NO：18)

SMSYSWTGAL VTPCAAEEQK LPINALSNSL LRHHNLVYST TSRSACQRQK 50

KVTFDRLQVL DSHYQDVLKE VKAAASKVKA NLLSVEEACS LTPPHSAKSK 100

FGYGAKDVRC HARKAVNHIN SVWKDLLEDS VTPIDTTIMA KNEVFCVQPE 150

KGGRKPARLI VFPDLGVRVC EKMALYDVVS KLPLAVMGSS YGFQYSPGQR 200

VEFLVQAWKS KKTPMGFSYD TRCFDSTVTE SDIRTEEAIY QCCDLDPQAR 250

VAIKSLTERL YVGGPLTNSR GENCGYRRCR ASGVLTTSCG NTLTCYIKAQ 300

AACRAAGLRD CTMLVCGDDL VVICESAGVQ EDAASLRAFT EAMTRYSAPP 350

GDPPQPEYDL ELITSCSSNV SVAHDGAGKR VYYLTRDPTT PLARAAWETA 400

RHTPVNSWLG NIIMFAPTLW ARMILMTHFF SVLIARDQLE QALDCEIYGA 450

CYSIEPLDLP PIIQRLHGLS AFSLHSYSPG EINRVAACLR KLGVPPLRAW 500

RHRARSVRAR LLSRGGRAAI CGKYLFNWAV RTKLKLTPIA AAGQLDLSGW 550

FTAGYSGGDI YHSVSRARPR WFWFCLLLLA AGVGIYLLPN R 591

NS5b；共有基因型1b(SEQ ID NO：19)

SMSYTWTGAL ITPCAAEESK LPINALSNSL LRHHNMVYAT TSRSASQRQK 50

KVTFDRLQVL DDHYRDVLKE MKAKASTVKA KLLSVEEACK LTPPHSAKSK 100

FGYGAKDVRN LSSKAVNHIR SVWKDLLEDT ETPIDTTIMA KNEVFCVQPE 150

KGGRKPARLI VFPDLGVRVC EKMALYDVVS TLPQAVMGSS YGFQYSPGQR 200

VEFLVNAWKS KKNPMGFAYD TRCFDSTVTE NDIRVEESIY QCCDLAPEAR 250

QAIRSLTERL YIGGPLTNSK GQNCGYRRCR ASGVLTTSCG NTLTCYLKAS 300

AACRAAKLQD CTMLVCGDDL VVICESAGTQ EDAASLRVFT EAMTRYSAPP 350

GDPPQPEYDL ELITSCSSNV SVAHDASGKR VYYLTRDPTT PLARAAWETA 400

RHTPVNSWLG NIIMYAPTLW ARMILMTHFF SILLAQEQLE KALDCQIYGA 450

CYSIEPLDLP QIIQRLHGLS AFSLHSYSPG EINRVASCLR KLGVPPLRVW 500

RHRARSVRAK LLSQGGRAAT CGKYLFNWAV RTKLKLTPIP AASQLDLSGW 550

FVAGYSGGDI YHSLSRARPR WFMLCLLLLS VGVGIYLLPN R 591

NS3；基因型1a DECH->AASH突变体(SEQ ID NO：20)

APITAYAQQT RGLLGCIITS LTGRDKNQVE GEVQIVSTAA QTFLATCING 50

VCWTVYHGAG TRTIASSKGP VIQMYTNVDQ DLVGWPAPQG ARSLTPCTCG 100

SSDLYLVTRH ADVIPVRRRG DSRGSLLSPR PISYLKGSSG GPLLCPAGHA 150

VGIFRAAVCT RGVAKAVDFI PVENLETTMR SPVFTDNSSP PAVPQSFQVA 200

HLHAPTGSGK STKVPAAYAA QGYKVLVLNP SVAATLGFGA YMSKAHGIDP 250

NIRTGVRTIT TGSPITYSTY GKFLADGGCS GGAYDIIICA ASHSTDATSI 300

LGIGTVLDQA ETAGARLVVL ATATPPGSVT VPHPNIEEVA LSTTGEIPFY 350

GKAIPLEVIK GGRHLIFCHS KKKCDELAAK LVALGINAVA YYRGLDVSVI 400

PTSGDVVVVA TDALMTGYTG DFDSVIDCNT CVTQTVDFSL DPTFTIETTT 450

LPQDAVSRTQ RRGRTGRGKP GIYRFVAPGE RPSGMFDSSV LCECYDAGCA 500

WYELTPAETT VRLRAYMNTP GLPVCQDHLE FWEGVFTGLT HIDAHFLSQT 550

KQSGENFPYL VAYQATVCAR AQAPPPSWDQ MWKCLIRLKP TLHGPTPLLY 600

RLGAVQNEVT LTHPVTKYIM TCMSADLEVV T 631

NS3；基因型1b DECH->AASH突变体(SEQ ID NO：21)

APITAYSQQT RGLLGCIITS LTGRDKNQVE GEVQVVSTAT QSFLATCVNG 50

VCWTVYHGAG SKTLAGPKGP ITQMYTNVDQ DLVGWQAPPG ARSLTPCTCG 100

SSDLYLVTRH ADVIPVRRRG DSRGSLLSPR PVSYLKGSSG GPLLCPSGHA 150

VGIFRAAVCT RGVAKAVDFV PVESMETTMR SPVFTDNSSP PAVPQTFQVA 200

HLHAPTGSGK STKVPAAYAA QGYKVLVLNP SVAATLGFGA YMSKAHGVDP 250

NIRTGVRTIT TGAPITYSTY GKFLADGGCS GGAYDIIICA ASHSTDSTTI 300

LGIGTVLDQA ETAGARLVVL ATATPPGSVT VPHPNIEEVA LSNTGEIPFY 350

GKAIPIETIK GGRHLIFCHS KKKCDELAAK LSGLGLNAVA YYRGLDVSVI 400

PTSGDVVVVA TDALMTGFTG DFDSVIDCNT CVTQTVDFSL DPTFTIETTT 450

VPQDAVSRSQ RRGRTGRGRR GIYRFVTPGE RPSGMFDSSV LCECYDAGCA 500

WYELTPAETS VRLRAYLNTP GLPVCQDHLE FWESVFTGLT HIDAHFLSQT 550

KQAGDNFPYL VAYQATVCAR AQAPPPSWDQ MWKCLIRLKP TLHGPTPLLY 600

RLGAVQNEVT LTHPITKYIM ACMSADLEVV T 631

NS5b；基因型1a GDD->GNH突变体(SEQ ID NO：22)

SMSYSWTGAL VTPCAAEEQK LPINALSNSL LRHHNLVYST TSRSACQRQK 50

KVTFDRLQVL DSHYQDVLKE VKAAASKVKA NLLSVEEACS LTPPHSAKSK 100

FGYGAKDVRC HARKAVNHIN SVWKDLLEDS VTPIDTTIMA KNEVFCVQPE 150

KGGRKPARLI VFPDLGVRVC EKMALYDVVS KLPLAVMGSS YGFQYSPGQR 200

VEFLVQAWKS KKTPMGFSYD TRCFDSTVTE SDIRTEEAIY QCCDLDPQAR 250

VAIKSLTERL YVGGPLTNSR GENCGYRRCR ASGVLTTSCG NTLTCYIKAQ 300

AACRAAGLRD CTMLVCGNLL VVICESAGVQ EDAASLRAFT EAMTRYSAPP 350

GDPPQPEYDL ELITSCSSNV SVAHDGAGKR VYYLTRDPTT PLARAAWETA 400

RHTPVNSWLG NIIMFAPTLW ARMILMTHFF SVLIARDQLE QALDCEIYGA 450

CYSIEPLDLP PIIQRLHGLS AFSLHSYSPG EINRVAACLR KLGVPPLRAW 500

RHRARSVRAR LLSRGGRAAI CGKYLFNWAV RTKLKLTPIA AAGQLDLSGW 550

FTAGYSGGDI YHSVSRARPR WFWFCLLLLA AGVGIYLLPN R 591

NS5b；基因型1b GDD->GNH突变体(SEQ ID NO：23)

SMSYTWTGAL ITPCAAEESK LPINALSNSL LRHHNMVYAT TSRSASQRQK 50

KVTFDRLQVL DDHYRDVLKE MKAKASTVKA KLLSVEEACK LTPPHSAKSK 100

FGYGAKDVRN LSSKAVNHIR SVWKDLLEDT ETPIDTTIMA KNEVFCVQPE 150

KGGRKPARLI VFPDLGVRVC EKMALYDVVS TLPQAVMGSS YGFQYSPGQR 200

VEFLVNAWKS KKNPMGFAYD TRCFDSTVTE NDIRVEESIY QCCDLAPEAR 250

QAIRSLTERL YIGGPLTNSK GQNCGYRRCR ASGVLTTSCG NTLTCYLKAS 300

AACRAAKLQD CTMLVCGNLL VVICESAGTQ EDAASLRVFT EAMTRYSAPP 350

GDPPQPEYDL ELITSCSSNV SVAHDASGKR VYYLTRDPTT PLARAAWETA 400

RHTPVNSWLG NIIMYAPTLW ARMILMTHFF SILLAQEQLE KALDCQIYGA 450

CYSIEPLDLP QIIQRLHGLS AFSLHSYSPG EINRVASCLR KLGVPPLRVW 500

RHRARSVRAK LLSQGGRAAT CGKYLFNWAV RTKLKLTPIP AASQLDLSGW 550

FVAGYSGGDI YHSLSRARPR WFMLCLLLLS VGVGIYLLPN R 591

本发明的疫苗组合物中使用的一种或多种抗原或其衍生物的选择可通过多种方式来进行，包括评价选择的细菌成功表达和分泌重组抗原的能力；和/或重组抗原引发抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞应答的能力。如下文所讨论的，为了完成抗原的最终选择以用于特定细菌递送媒介，重组抗原的这些属性优选联合完全疫苗平台(meaning the selected细菌expression system for theHCV抗原(s))的能力以引发针对重组表达的HCV抗原的先天免疫应答以及抗原-特异性T细胞应答。

合适的抗原的初始测定可通过选择抗原或抗原片段来进行，所述抗原或抗原片段由选择的细菌宿主(例如李斯特菌)成功地重组表达，并且是免疫原性的。本文中使用的术语“免疫原性”是指抗原能够诱发抗原-特异性T细胞应答(CD4+和/或CD8+)。优选HCV抗原或其衍生物包含下列多肽序列中的一种或多种：IPVENLETTMRSPVF(SEQ ID NO：1)；NLETTMRSPVFTDNS(SEQ ID NO：2)；PPAVPQSFQVAHLHA(SEQ ID NO：3)；PQSFQVAHLHAPTGS(SEQ ID NO：4)；FQVAHLHAPTGSGKS(SEQ ID NO：5)。其他优选HCV抗原或其衍生物包含来自NS3的下列多肽序列中的一种或多种：

LETTMRSPVFTDNSSPPVVP(SEQ ID NO：42)；

SPVFTDNSSPPAVPQ(SEQ ID NO：43)；

VPQSFQVAHLHAPTG(SEQ ID NO：44)；

FQVAHLHAPTGSGKS(SEQ ID NO：45)；

KVPAAYAAQGYKVLV(SEQ ID NO：46)；

PAAYAAQGYKVLVLNPSVAA(SEQ ID NO：47)；

AAKGYKVLVLNPSVA(SEQ ID NO：48)；

VLVLNPSVAA(SEQ ID NO：49)；

AQGYKVLVLNPSVAA(SEQ ID NO：50)；

QGYKVLVLNPSVAA(SEQ ID NO：51)；

GYKVLVLNPSVAAT(SEQ ID NO：52)；

GYKVLVLNPSVAATLGFGAY(SEQ ID NO：53)；

GVRTITTGSPITYSTYGKFL(SEQ ID NO：54)；

ITYSTYGKFLADGGCSGGAY(SEQ ID NO：55)；

LADAGCSGGAYDIIICDE(SEQ ID NO：56)；

GGAYDIIICDECHST(SEQ ID NO：57)；

DIIICDECHSTDATS(SEQ ID NO：58)；

TDATSILGIGTVLDQAETAG(SEQ ID NO：59)；

ATSILGIGTVLDQAE(SEQ ID NO：60)；

VIKGGRHLIFCHSKKKCD(SEQ ID NO：61)；

GRHLIFCHSKR(SEQ ID NO：62)；

KCDELAAKLVALGIN(SEQ ID NO：63)；

GINAVAYYRGLDVSVIPTSG(SEQ ID NO：64)；

IPTNGDVVVVSTDALMTG(SEQ ID NO：65)；

ALMTGYTGDFDSVID(SEQ ID NO：66)；

DFDSVIDCNTCVTQTVDF(SEQ ID NO：67)；

SVIDCNTCVTQTVDFSLDPT(SEQ ID NO：68)；

CNTCVTQTVDFSLDPTFT(SEQ ID NO：69)；

NTCVTQTVDFSLDPT(SEQ ID NO：70)；

PTFTIETTTLPQDAVSRT(SEQ ID NO：71)；

TQTVDFSLDPTFTIE(SEQ ID NO：72)；

EQYVDFSLDPTFSIE(SEQ ID NO：73)；

和/或来自NS5b的一种或多种下列多肽序列：

LRHHNLVYSTTSRSACQRQK(SEQ ID NO：74)；

KVTFDRLQVLDSHYQDVLKE(SEQ ID NO：75)；

SVWKDLLEDNVTPIDTTIMA(SEQ ID NO：76)；

KGGRKPARLIVFPDLGVRVC(SEQ ID NO：77)；

KPARLIVFPDLGVRVCEK(SEQ ID NO：78)；

KLPLAVMGSSYGFQYSPGQR(SEQ ID NO：79)；

VEFLVQAWKSKKTPMGFSYD(SEQ ID NO：80)；

SDIRTEEAIYQCCDLDPQAR(SEQ ID NO：81)；

QCCDLDPQARVAIKSLTERL(SEQ ID NO：82)；

GYRRCRASGVLT(SEQ ID NO：83)。

选择的细菌表达和分泌重组抗原的能力可通过亲水性图来评价和/或通过蛋白质印迹分析来直接测量，如下文所述。

在某些实施方案中，HCV抗原被选择为不具有疏水性区域，所述疏水性区域超过李斯特菌ActA蛋白或其片段的峰值疏水性，所述李斯特菌ActA蛋白或其片段用作和目标HCV抗原融合的构建体的一部分。更优选地，HCV抗原被选择为不具疏水性区域，所述疏水性区域超过李斯特菌ActA-N100的峰值疏水性。

在蛋白质印迹中重组抗原的表达的直接检测可使用通过下列方式来进行：使用检测重组制备的HCV抗原序列的抗体；或使用检测非-CHV序列(“标签”)的抗体，其和HCV抗原表达为融合蛋白。在下文所述的例子中，抗原表达为和李斯特菌ActA蛋白的N-末端部分融合，针对对应于ActA的成熟N末端18个氨基酸的合成肽(ATDSEDSSLNTDEWEEEK(SEQ ID NO：24))增强的抗-ActA抗体可用于检测表达的蛋白产物。

检测抗原的免疫原性的分析在本文中所述，并且是本领域中熟知的。例如，由选择的细菌重组制备的抗原可任选地被构建为含有编码8个氨基SIINFEKL(SEQ ID NO：25)肽(也称为SL8和ov白蛋白_257-264)的核苷酸序列，其位于羧基末端的抗原框内。组成例如C-末端SL8抗原表位起到代用品的作用以：(i)证实重组抗原从N-末端至C-末端全部表达；和(ii)使用体外抗原递呈分析通过MHC I类途径来证实抗原递呈细胞递呈重组抗原的能力。这种递呈分析可使用克隆的C57BL/6-衍生的树突细胞系DC2.4以及B3Z T细胞杂交瘤细胞系来进行，如下文所述。

可选择地或另外，免疫原性可使用ELISPOT分析来测试，如下文所述。ELISPOT分析初始开发以列举B细胞分泌抗原-特异性抗体，但随后适用于多种任务，特别是在单细胞水平鉴定和列举细胞因子-产生细胞。脾脏可得自接种合适的细菌疫苗的动物，并且分离的脾细胞在存在或不存在衍生自由细菌疫苗表达的一种或多种HCV抗原的肽的情况下孵育过夜。固定的抗体捕获任何分泌的IFN-γ，因此允许随后测量分泌的IFN-γ，和评价对于疫苗的免疫应答。

3.细菌表达体系-“疫苗平台”

用于递送共有序列抗原的疫苗平台的选择对于有效的疫苗而言是另一关键组分。许多细菌种类被开发用作疫苗，并且可用在本发明中，包括但不限于弗氏志贺氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生性李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌或分枝杆菌种类。该列表并不表示是限制性的。例如参见WO04/006837、WO07/103225和WO07/117371，其全部均通过引用的方式并入本文中，包括所有表格、附图和权利要求书。疫苗组合物中使用的细菌载体可是兼性细胞内细菌载体。细菌可用于递送本文中所述的多肽至宿主有机体中的抗原-递呈细胞。如本文中所述的，L.monocytogenes提供用于HCV抗原表达的优选疫苗平台。

减弱和共栖微生物成功地被用作疫苗抗原的载体，但HCV抗原或其衍生物的细菌载体是任选地减弱或被杀死但代谢性活性(KBMA)的。制剂中使用的载体菌株的基因背景、选择以实现减弱的突变类型、和免疫原的固有性能可被调节以优化激发的免疫应答的程度和质量。考虑以优化由细菌载体刺激的免疫应答的通常因素包括：选择载体；菌株的特异性背景；减弱突变和减弱水平；减弱显型的稳定和最优剂量的建立。考虑的其他抗原-相关因素包括：抗原的固有性能；表达体系；抗原-展示形式和重组显型的稳定；调节分子的共表达和疫苗方案。

疫苗平台的优选特征能够引发针对重组表达的HCV抗原的先天免疫应答以及抗原-特异性T细胞应答。例如，表达本文中所述的HCV抗原的L.monocytogenes诱导肝内型1干扰素(IFN-α/β)与趋化因子和细胞因子的下游级联。响应于该肝内免疫刺激，NK细胞和抗原递呈细胞(APC)募集至肝脏。这些细胞被激活以引发T细胞应答，从而根除Lm；同时针对由L.monocytogenes疫苗平台表达的HCV抗原的T细胞应答增长。在某些实施方案中，本发明的疫苗平台在递送疫苗平台至受试者后24小时诱导细胞因子和趋化因子中的一种或多种、优选全部血清浓度增加，所述细胞因子和趋化因子选自由IL-12p70、IFN-γ、IL-6、TNF α和MCP-1构成的组；并且诱导针对由疫苗平台表达的一种或多种HCV抗原的CD4+和/或CD8+抗原-特异性T细胞应答。在其他实施方案中，本发明的疫苗平台还包括定居不成熟肝脏NK细胞的成熟，如通过激活标志物(例如DX5、CD11b和CD43)在小鼠模型体系中的上调来证实，或通过使用⁵¹Cr-标记的YAC-1细胞(用作靶细胞)进行NK细胞-介导的细胞溶解活性测量来证实。

在多种实施方案中，本发明的疫苗和免疫原性组合物可包含单核细胞增生性李斯特菌，其被构造以表达期望的HCV抗原。L.monocytogenes起到疫苗载体的能力在Wesikirch，et al.，Immunol.Rev.158：159-169(1997)中综述。L.monocytogenes的天然生物性的多种期望的特征使其成为吸引性平台以适用于HCV治疗疫苗。中间基础理论是L.monocytogenes的细胞内生命循环能够有效地刺激CD4+和CD8+T细胞免疫，这已知是HCV传染的解决方案所要求的。多种病原体相关分析图案(PAMP)受体(包括TLR(TLR2，TLR5，TLR9)和核苷酸-结合低聚域(NOD))在传染时响应于和L.monocytogenes大分子相互作用而引发，从而导致先天免疫效应物的泛激活和Th-1极化细胞因子的释放，并且对针对HCV共有序列抗原的CD4+和CD8+T细胞应答的开发施加深远的影响。Lm特别适用于HCV疫苗，因为其对于肝脏-定居APC的趋向性导致有效的肝内免疫应答。

L.monocytogenes的菌株近年来被开发为异源蛋白的有效细胞内递送媒介，从而提供递送抗原至免疫体系以诱导对于临床病症的免疫应答，所述临床病症不允许注射引起疾病的药剂，例如癌症和HIV。例如参见美国专利No.6,051,237；Gunn et al.，J.Immunol.，167：6471-6479(2001)；Liau，et al.，Cancer Research，62：2287-2293(2002)；美国专利No.6,099,848；WO 99/25376；WO 96/14087；和美国专利No.5,830,702)，其全文均通过引用的方式并入本文中，包括所有表格、附图和权利要求书。表达淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)抗原的重组L.monocytogenes疫苗也以表示诱导对于抗原的保护性细胞-介导的免疫(Shen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：3987-3991(1995)。

免疫原性组合物中可用的减弱和被杀死但代谢性活性形式的L.monocytogenes已经制备，WO07/103225和WO07/117371，其全文均通过引用的方式并入本文中，包括所有表格、附图和权利要求书。L.monocytogenes的ActA蛋白足以促进负责细胞内运动的肌动蛋白募集和聚合事件。人安全性研究已经报道口服施用actA/plcB-缺失减弱形式的L.monocytogenes在成年人中不引起严重的后遗症(Angelakopoulos et al.，Infection and Immunity，70：3592-3601(2002))。其他类型的减弱形式的L.monocytogenes也有所描述(参见例如WO 99/25376和美国专利No.6,099,848，其描述表达异源抗原的李斯特菌的营养缺陷型减弱菌株)。

在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物中使用的L.monocytogenes是活减弱菌株，其包含actA和/或inlB中的减弱突变，优选actA和inlB的全部或一部分的缺失(本文中称为“Lm ΔactA/ΔinlB”)，并且含有编码用于表达目标HCV抗原的重组DNA。这些抗原最优选包含一种或多种免疫原性序列，其得自或衍生自NS5B NS3共有序列抗原中的一种或两种。HCV抗原优选在细菌表达序列的控制下，并且稳定地整合到L.monocytogenes基因组。因此这种L.monocytogenes疫苗菌株不使用真核转录或翻译元件。

本发明还涵盖至少一种调节因子例如启动子或转录因子减弱的李斯特菌。下面涉及启动子。ActA表达通过两种不同启动子来调节(Lauer，et al.(2002)J.Bacteriol.184：4177-4186)。一起，inlA和inlB表达由5个启动子来调节(Lingnau，et al.(1995)Infect.Immun.63：3896-3903)。需要转录因子prfA用于多种L.monocytogenes基因的转录，例如hly，plcA，ActA，mpl，prfA和iap。PrfA的调节性能由例如PrfA-依赖性启动子(PinlC)和PrfA-盒来介导。在某些实施方案中，本发明提供编码至少一种ActA启动子、inlB启动子、PrfA、PinlC、PrfA盒等的失活、突变或缺失的核酸(例如参见Lalic Mullthaler，et al.(2001)Mol.Microbiol.42：111-120；Shetron-Rama，et al.(2003)Mol.Microbiol.48：1537-1551；Luo，et al.(2004)Mol.Microbiol.52：39-52)。PrfA可通过Gly145Ser突变、Gly155Ser突变或Glu77Lys突变制成组成性活性(例如参见Mueller and Freitag(2005)Infect.Immun.73：1917-1926；Wong and Freitag(2004)J.Bacteriol.186：6265-6276；Ripio，et al.(1997)J.Bacteriol.179：1533-1540)。

减弱可通过例如热处理或化学修饰来实现。减弱还可通过核酸的基因修饰来实现，所述核酸介导例如代谢、细胞外生长或细胞内生长、编码毒力因子的核酸的基因修饰、例如李斯特菌prfA、ActA、李斯特菌溶胞素(LLO)、粘附介导因子(例如内化蛋白，如inlA或inlB)、mpl、磷脂酰胆碱磷脂酶C(PC-PLC)、磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C(PI PLC；plcA gene)、上述的任意组合等。减弱可通过下列方式来评价：比较减弱李斯特菌的生物功能和合适的母体李斯特菌示出的对应的生物功能。

在本发明的其他实施方案中提供通过处理而减弱的李斯特菌：核酸靶向剂例如交联剂、补骨脂素、氮芥、顺铂、大体积结合物、紫外光、γ辐射及其组合等。典型地，由交联剂的一种分子产生的损害涉及双螺旋体的链的交联。本发明的李斯特菌还可通过突变至少一种核酸修复基因而减弱，例如uvrA、uvrB、uvrAB、uvrC、uvrD、uvrAB、phrA和/或基因介导重组修复例如recA。而且，本发明提供通过核酸靶向剂和通过核酸修复基因突变而减弱的李斯特菌。另外，本发明包括用光敏核酸靶向剂处理，例如补骨脂素和/或光敏核酸交联剂例补骨脂素，然后暴露于紫外光。

本发明中使用的减弱的李斯特菌在例如美国专利公开NO.2004/0228877和2004/0197343中有所描述，其全部通过引用的方式并入本文中。提供多种分析来评价是否李斯特菌的特定菌株具有期望的减弱，例如美国专利公开NO.2004/0228877、2004/0197343和2005/0249748中所述，其全部通过引用的方式并入本文中。

在其他实施方案中，本发明的疫苗组合物中使用的L.monocytogenes是衍生自Lm ΔactA/ΔinlB的被杀死但代谢性活性(KBMA)平台，并且还缺失uvrA和uvrB，编码核苷酸切除修复(NER)途径的DNA修复酶的基因，并且含有编码用于表达目标HCV抗原的重组DNA。这些抗原最优选包含得自或衍生自NS5B NS3共有序列抗原中的一种或两种的一种或多种免疫原性序列。HCV抗原优选在细菌表达序列控制下，并且稳定地整合到L.monocytogenes基因组。KBMA平台通过和合成补骨脂素、S-59和长波长UV光联合处理和对光化学法失活剧烈地敏感。尽管被杀死，但是KBMA Lm疫苗可瞬时表达它们的基因产物，允许它们逃避吞噬溶酶体，并且诱导功能性细胞免疫，和保护野生型WT Lm和疫苗病毒攻击。

在某些实施方案中，减弱或KBMA L.monocytoggnes疫苗菌株包含组成性活性PrfA基因(本文中称为PrfA^*突变体)。PrfA是细胞内激活的转录因子，其诱导致病基因和编码的异源抗原(Ag)在合适的工程化疫苗菌株中的表达。如上所述，ActA基因的表达对于prfA响应，并且ActA启动子是prfA响应性调节元件。引入prfA G155S等位基因可以赋予活减弱或KBMA疫苗的明显增强的疫苗效价。优选PrfA突变体描述于U.S.临时专利申请61/054,454，题目为COMPOSITIONS COMPRISING PRFA^*MUTANT LISTERIA AND METHODS OF USE THEREOF，2008年5月19日提交，其全文均通过引用的方式并入本文中，包括所有表格、附图和权利要求书。

L.monocytogenes PrfA的序列，包括残基155处的甘氨酸，如下所示(SEQ ID NO：26)：

MNAQAEEFKK YLETNGIKPK QFHKKELIFN QWDPQEYCIF LYDGITKLTS 50

ISENGTIMNL QYYKGAFVIM SGFIDTETSV GYYNLEVISE QATAYVIKIN 100

ELKELLSKNL THFFYVFQTL QKQVSYSLAK FNDFSINGKL GSICGQLLIL 150

TYVYGKETPD GIKITLDNLT MQELGYSSGI AHSSAVSRII SKLKQEKVIV 200

YKNSCFYVQN LDYLKRYAPK LDEWFYLACP ATWGKLN 237

L.monocytogenes PrfA^*的序列，包括残基155处的丝氨酸，如下所示(SEQ ID NO：27)：

MNAQAEEFKK YLETNGIKPK QFHKKELIFN QWDPQEYCIF LYDGITKLTS 50

ISENGTIMNL QYYKGAFVIM SGFIDTETSV GYYNLEVISE QATAYVIKIN 100

ELKELLSKNL THFFYVFQTL QKQVSYSLAK FNDFSINGKL GSICGQLLIL 150

TYVYSKETPD GIKITLDNLT MQELGYSSGI AHSSAVSRII SKLKQEKVIV 200

YKNSCFYVQN LDYLKRYAPK LDEWFYLACP ATWGKLN 237

4.抗原构建体

由本发明的细菌疫苗菌株表达的抗原构建体最少地包含在细菌疫苗平台内可操作的编码分泌序列的核酸，以支持分泌，融合至待表达的HCV抗原，其中所得融合蛋白通过细菌疫苗平台可操作地连接调节序列(例如启动子)，所述调节序列是融合蛋白表达所需要的。本发明不限于分泌的多肽和肽抗原，而且还包括不分泌或不能从李斯特菌或其他细菌分泌的多肽和肽。但优选地，当菌株接种到接受者中时，HCV抗原通过细菌疫苗菌株表达为可溶性分泌的形式。

表1公开了用于融合融合蛋白配偶序列例如异源抗原的信号肽的多种非限制性例子。信号肽往往含有三个域：带正电的N-末端(1-5个残基长)；中间疏水性域(7-15个残基长)；和中性但极性C-末端域。

表1.细菌信号途径. 信号肽通过信号肽酶位点来鉴定

在下文中所述的示例性实施方案中，HCV抗原表位序列可表达为融合至L.monocytogenes ActA蛋白的氨基-末端部分的单个多肽，所述L.monocytogenes ActA蛋白允许来自细菌的HCV融合蛋白在接种的宿主内表达和分泌。在这些实施方案中，抗原构建体可以是多核苷酸，其包含可操作地连接核酸序列的启动子，所述核酸序列编码融合蛋白，其中融合蛋白包含(a)修饰的ActA和(b)一种或多种HCV抗原表位以在修饰的ActA序列后表达为融合蛋白。

“修饰的ActA”是指L.monocytogenes ActA蛋白的邻接的部分，所述L.monocytogenes ActA蛋白包含至少ActA信号序列，但不含整个ActA序列，或与这种ActA序列具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％序列同一性、或至少约98％序列同一性。ActA信号序列是MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFA(SEQ ID NO：41)。在一些实施方案中，启动子是来自WO07/103225和WO07/117371的ActA启动子，其全文通过引用的方式并入本文中。

通过例子的方式，修饰的ActA可包含ActA的至少第一59个氨基酸，或与ActA的至少第一59个氨基酸具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％序列同一性或至少约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，修饰的ActA包含ActA的至少第一100个氨基酸，或与ActA的至少第一100个氨基酸具有至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约95％序列同一性或至少约98％序列同一性的序列。换言之，在一些实施方案中，修饰的ActA序列对应于ActA(包括ActA信号序列)的N-末端片段，其在残基100或之后的残基截短。

ActA-N100具有下列序列(SEQ ID NO：37)：

VGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100

在该序列中，第一残基表示为缬氨酸；多肽通过李斯特菌用在该位点的蛋氨酸合成。因此，ActA-N100还可具有下列序列(SEQ ID NO：38)：

MGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100

ActA-N100还可包含位于修饰的ActA的C-末端残基和HCV抗原序列之间的一种或多种另外的残基。在下列序列中，ActA-N100经过引入BamH1位点加入的两种残基而延伸：

VGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100

GS 102

(SEQ ID NO：39)，当用第一残基蛋氨酸合成时，其具有序列：

MGLNRFMRAM MVVFITANCI TINPDIIFAA TDSEDSSLNT DEWEEEKTEE 50

QPSEVNTGPR YETAREVSSR DIEELEKSNK VKNTNKADLI AMLKAKAEKG 100

GS 102

(SEQ ID NO：40).

示例性构建体示于下文和WO07/103225中，其通过引用的方式并入。ANZ-100(之前称为CRS-100；BB-IND 12884和clinicaltrials.gov identificr NCT00327652)由没有任何外源抗原表达序列的L.monocytogenes ΔactA/ΔinlB平台构成。在WO07/103225中所述的示例性构建体中，该平台被工程化以表达人间皮素为和ActA-N100的融合物。使用CRS-207(BB-IND 13389和clinicaltrials.gov identifier NCT00585845)，间皮素表达疫苗在患有肝转移的晚期癌的受试者中进行评价，其目前在患有晚期癌的受试者中的临床I期中进行评价，其已知过度表达间皮素。本发明涵盖通过用HCV抗原序列取代间皮素序列来修饰该疫苗。

因为由一种有机体编码的序列不必是优化用于在选择的疫苗平台细菌菌株中最优表达的密码子，本发明还提供由密码子改变的核酸，所述密码子优化用于通过细菌例如L.monocytogenes表达。

在多种实施方案中，任何非-最优密码子的至少1％被改变以提供最优密码子，更通常至少5％被改变，最通常至少10％被改变，通常至少20％被改变，更通常至少30％被改变，最通常至少40％被改变，常至少50％被改变，更常至少60％被改变，最常至少70％被改变，适合至少80％被改变，更佳至少90％被改变，最佳至少95％被改变，常规100％的任何非-最优密码子是密码子-优化用于李斯特菌表达(表2)。

表2.用于在李斯特菌中表达的最优密码子

本发明供应多种李斯特菌种类和菌株用于制备或工程化本发明的疫苗平台。本发明的李斯特菌不受表3中公开的种类和菌株的限制。

表3.适用于本发明的李斯特菌的菌株，例如作为核酸的疫苗或源

4.治疗组合物.

本文中所述的疫苗组合物可单独或联合药学上可接受的赋形剂施用至宿主，其量足以诱导针对HCV传染的合适的免疫应答。免疫应答可包括但不限于特异性免疫应答、非特异性免疫应答、特异性和非特异性应答、先天应答、初次免疫应答、适应性免疫、二次免疫应答、记忆免疫应答、免疫细胞激活、免疫细胞增殖、免疫细胞分化和细胞因子表达。本发明的疫苗可储存，例如冷冻、冻干、为混悬物、作为细胞糊、或络合固体基质或胶体基质。

在某些实施方案中，在向受试者施用有效剂量的含有免疫原性HCV抗原多肽的疫苗以初免免疫应答后，施用第二疫苗。这在本领域中称为“初免-加强”方案。在这种方案中，本发明的组合物和方法可用作“初免”递送、“加强”递送、或“初免”和“加强”。

例如，包含被杀死但代谢性活性李斯特菌(编码和表达抗原多肽)的第一疫苗可递送为“初免”，并且包含减弱但代谢性活性李斯特菌(编码抗原多肽)的第二疫苗可递送为“加强”。然而，应该理解，初免和加强均不必利用本发明的方法和组合物。相反，本发明涵盖使用其他疫苗形式以及本发明的细菌疫苗方法和组合物。合适的混合初免-加强方案的例子如下所示：DNA(例如质粒)疫苗初免/细菌疫苗加强；病毒疫苗初免/细菌疫苗加强；蛋白疫苗初免/细菌疫苗加强；DNA初免/细菌疫苗加强+蛋白疫苗加强；细菌疫苗初免/DNA疫苗加强；细菌疫苗初免/病毒疫苗加强；细菌疫苗初免/蛋白疫苗加强；细菌疫苗初免/细菌疫苗加强+蛋白疫苗加强等。该列表并不意指限制性的。

初免疫苗和加强疫苗可通过相同途径或不同途径来施用。术语“不同途径”包括但不限于机体上的不同位点，例如口服、非口服、肠、肠胃外、直肠、节内(淋巴节)、静脉内、动脉、皮下、肌内、瘤内、瘤周围、瘤内、输注、粘膜、鼻、在脑脊液空间或脑脊髓液等的位点，以及不同模式，例如口服、静脉内和肌内。

初免或加强疫苗的有效量可以以单剂量给出，但不限于单剂量。因此，施用可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多的疫苗施用。如果在本发明的方法中有多于一次的疫苗施用，施用间隔的时间间隔为1分钟、2分钟、3、4、5、6、7、8、9、10或更多分钟，间隔为约1小时、2小时、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、2021、22、23、24小时等。在小时的上下文中，术语“约”是指加或减30分钟内的任何时间。施用还可以间隔的时间间隔为1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天及其组合。本发明不限于时间相同间隔的给药间隔，而是包括以不相等的间隔来给药，例如初免方案包括在1天、4天、7天和25天施用，这仅是提供非限制性例子。

在某些实施方案中，加强疫苗的施用可开始初免疫苗后在约5天开始；开始初免疫苗后约10天；开始施用初免疫苗后约15天；约20天；约25天；约30天；约35天；约40天；约45天；约50天；约55天；约60天；约65天；约70天；约75天；约80天；约6月和约1年。优选地，初免和加强疫苗中的一者和两者包括递送本发明的组合物。

“药学上可接受的赋形剂”或“诊断上可接受的赋形剂”包括但不限于无菌蒸馏水、盐水、磷酸盐缓冲液、氨基酸基缓冲液或碳酸氢盐缓冲液。选择的赋形剂和使用的赋形剂的量将取决于施用方式。施用可以是口服、静脉内、皮下、皮肤、皮内、肌内、粘膜、肠胃外、器官内、病灶内、鼻内、吸入、眼内、肌内、血管内、节点内、通过划痕、直肠、腹膜内、或者多种熟知施用途径中的任一种或组合。施用可包括注射、输注或其组合物。

通过非口服途径本发明的疫苗的施用可避免耐受性。本领域中已知用于下列的方法施用：静脉内、皮下、肌内、腹膜内、口服、粘膜、通过尿道、通过生殖道、通过胃肠道或通过吸入。

特定患者的有效量可取决于因素而改变，例如正在治疗的病症、患者的总健康、施用途径和剂量、和副作用的严重性。治疗和诊断方法的指南是可得的(例如参见Maynard，et al.(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice，Interpharm Press，Boca Raton，FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice，Urch Publ.，London，UK)。

本发明的疫苗可以以这样的剂量或剂量方案来施用，其中各剂量包含至少1000细菌细胞/kg体重；正常至少10,000细胞；更正常至少100,000细胞；最正常至少1百万细胞；经常至少10百万细胞；更经常至少100百万细胞；典型至少10亿细胞；通常至少100亿细胞；常规至少1000亿细胞；并且有时至少1百万兆细胞/kg体重。本发明提供上述剂量，其中细菌施用单元是集落形成单元(CFU)，在补骨脂素治疗之前CFU的等价物、或其中单元是细菌细胞数。

本发明的疫苗可以以这样的剂量或剂量方案来施用，其中各剂量包含10⁷至10⁸细菌/70kg体重(或/1.7平方米表面积；或/1.5kg肝重)；2x 10⁷至2x 10⁸细菌/70kg体重(或/1.7平方米表面积；或/1.5kg肝重)；5x 10⁷至5x 10⁸细菌/70kg体重(或/1.7平方米表面积；或/1.5kg肝重)；10⁸至10⁹细菌/70kg体重(或/1.7平方米表面积；或/1.5kg肝重)；2.0x 10⁸至2.0x10⁹细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；5.0x 10⁸ to 5.0x 10⁹细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；10⁹至10¹⁰细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；2x 10⁹至2x 10¹⁰细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；5x 10⁹至5x 10¹⁰细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；10¹¹至10¹²细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；2x 10¹¹至2x 10¹²细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；5x 10¹¹至5x 10¹²细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；10¹²至10¹³细菌/70kg(或/1.7平方米表面积)；2x 10¹²至2x 10¹³细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；5x 10¹²至5x 10¹³细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；10¹³至10¹⁴细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；2x 10¹³至2x 10¹⁴细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；5x 10¹³至5x 10¹⁴细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；10¹⁴至10¹⁵细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；2x 10¹⁴至2x 10¹⁵细菌/70kg(或/1.7平方米表面积，或/1.5kg肝重)；等净重。

还提供上述剂量中的一种或多种，其中剂量通过下列方式施用：每隔1天注射一次、每隔2天注射一次、每隔3天注射一次、每隔4天注射一次、每隔5天注射一次、每隔6天注射一次、或每隔7天注射一次，其中注射方案保持例如仅1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、5周或更长。本发明还包括上述剂量和方案的组合，例如相对大初始细菌剂量然后相对小的随后剂量，或者相对小的初始剂量然后是较大剂量。

给药方案例如一周1次、一周2次、一周3次、一周4次、一周5次、一周6次、一周7次、2周1次、3周1次、4周1次、5周1次等适用于本发明。给药方案包括给药的总时间期限例如为1周、2周、3周、4周、5周、6周、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月和12月。

提供上述给药方案的循环。所述循环可约例如每7天；每14天；每21天；每28天；每35天；42天；每49天；每56天；每63天；每70天等重复。非给药的间隔可发生在间隔之间，其中间隔可以为约例如7天；14天；21天；28天；35天；42天；49天；56天；63天；70天等。在该上下文中，术语“约”是指加或减1天、加或减2天，加或减3天，加或减4天，加或减5天，加或减6天或加或减7天。

本发明包括口服施用李斯特菌的方法。还提供静脉内施用李斯特菌的方法。而且，提供口服、肌内、静脉内、皮内和/或皮下施用李斯特菌的方法。本发明提供李斯特菌细菌、李斯特菌细菌的培养物或混悬物、在培养基中生长来制备，所述培养基为肉基或含有衍生自肉或动物产物的多肽。本发明还供应李斯特菌细菌、李斯特菌细菌的培养物或混悬物、在培养基中生长来制备，所述培养基不含肉或动物产物、在培养基中生长来制备，所述培养基植物多肽、在培养基中生长来制备，所述培养基不基于酵母产物、或在培养基中生长来制备，所述培养基含有酵母多肽。

和另外的治疗剂共施用的方法是本领域熟知的(Hardman，et al.(eds.)(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，10th ed.，McGraw-Hill，New York，NY；Poole and Peterson(eds.)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A PracticalApproach，Lippincott，Williams & Wilkins，Phila.，PA；Chabner and Longo(eds.)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy，Lippincott，Williams & Wilkins，Phila.，PA)。

本发明提供联合本发明的疫苗组合物施用的试剂。这些试剂包括其他HCV治疗剂，包括IFN-α、病毒唑、levovirin、利巴韦林、telaprevir、boceprevir、PEG-IFN-α和其他免疫治疗剂。该列表并不表示是限制性的。试剂可和本发明的疫苗组合物同时或独立地(之前或之后)施用。例如，试剂在本发明的疫苗组合物之前(或之后)立即施用，在同一天施用，在本发明的疫苗组合物之前(或之后)1天、之前(或之后)1周、之前(或之后)1月、或之前(或之后)2月等施用。

也可使用有益于提高细胞溶解T细胞应答的另外药剂。这种药剂在本文中称为载体。这些包括但不限于B7共刺激分子、白介素-2、干扰素-γ、GM-CSF、CTLA-4拮抗剂、OX-40/OX-40配体、CD40/CD40配体、沙莫司亭、左旋咪唑、牛痘病毒、卡介苗(BCG)、脂质体、明矾、Freund完全或不完全佐剂、解毒的内毒素、矿物油、表面活性物质例如lipolecithin、复合多元醇、聚阴离子、肽和油或烃乳剂。优选诱导T细胞免疫应答的载体，优选针对抗体应答刺激细胞溶解T细胞应答，尽管也可使用刺激两种类型应答的那些。在药剂是多肽的情况下，多肽本身或编码多肽的多核苷酸可施用。载体可以是细胞，例如抗原递呈细胞(APC)或树突细胞。抗原递呈细胞包括这样的细胞类型，例如巨噬细胞、树突细胞和B细胞。其他专业抗原-递呈细胞包括单核细胞、边缘区Kupffer细胞、小胶质细胞、Langerhans′细胞、指状树突细胞、小囊树突细胞和T细胞。还可以使用兼性的抗原-递呈细胞。兼性的抗原-递呈细胞的例子包括星细胞、小囊细胞、内皮和成纤维细胞。载体可以是细菌细胞，其被转化以表达多肽或递送至多核苷酸，其随后在接种个体的细胞中表达。佐剂例如氢氧化铝或磷酸铝可加入以增加疫苗使其能够引发、增加或延长免疫应答。另外的材料例如细胞因子、趋化因子和细菌核酸序列，如CpG、toll-样受体(TLR)9激动剂、以及用于TLR 2、TLR 4、TLR 5、TLR 7、TLR 8、TLR9的另外激动剂，包括脂蛋白、LPS、单磷脂酰脂质A、脂膜酸、咪喹莫特、瑞喹莫德、和单独或联合所述组合物使用的其他类似的免疫调节剂，这些也是潜在的佐剂。佐剂的其他代表性例子包括合成佐剂QS-21，包含纯化自Quillaja saponaria和Corynebacterium parvum树皮的同质皂角苷(McCune et al.，Cancer，1979；43：1619)。应理解，佐剂被接受以优化。换言之，熟练技术人员可进行惯例试验来确定使用的最佳佐剂。

治疗剂的有效量是降低或改善症状正常至少10％、更正常至少20％、最正常至少30％、典型至少40％、更典型至少50％、最典型至少60％、经常至少70％、更经常至少80％、和最经常至少90％、常规至少95％、更常规至少99％、和最常规至少99.9％的量。

本发明的试剂和方法提供仅包含一种种痘的疫苗、或包含第一种痘；或包含至少一种加强剂种痘；至少两种加强剂种痘；或至少三种加强剂种痘。用于加强剂种痘的参数指南是可得的。例如参见Marth(1997)Biologic als 25：199-203；Ramsay，et al.(1997)Immunol.Cell Biol.75：382-388；Ghe rardi，et al.(2001)Histol.Histopathol.16：655-667；Leroux-Roels，et al.(2001)ActA Clin.Belg.56：209-219；Greiner，et al.(2002)Cancer Res.62：6944-6951；Smith，et al.(2003)J.Med.Virol.70：Suppl.1：S38-S41；Sepulveda-A mor，et al.(2002)Vaccine 20：2790-2795)。

治疗剂制剂可用于通过和生理学上接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备用于储存，其例如为冻干粉末、浆料、水溶液或混悬液的形式(例如参见Hardman，et al.(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological B asis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Reming ton：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams，and Wilkins，New York，NY；Avis，et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Form s：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman，et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman，et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY)。

实施例

下列例子用于描述本发明。这些例子无论如何不旨在限制本发明的范围。

实施例1.ANZ 100的开发

L.monocytogenes ANZ 100疫苗平台菌株衍生自L.monocytogenes菌株DP L4056，L.monocytogenes菌株10403S的无原噬菌体衍生物，其本身是野生型L.monocytogenes菌株10403的链霉素-耐性变体。菌株Lm 10403首先分离自人皮肤损害(Edman 1968)，链霉素-耐性菌株10403S首先由Bishop and Hinrichs(Bishop 1987)描述。10403S中的链霉素耐性被映射至核糖体蛋白基因rpsL的密码子56处的单一突变，在所述核糖体蛋白基因rpsL中T至C核酸置换导致在位置56处插入R(Lys)来代替K(t(Arg)氨基酸，用于从Lm 10403S分离菌株DP L4056的所述方法之前被详细描述(Lauer 2002)。

actA和inlB致病基因的除去通过同源重组来完成。各基因的缺失要求三步：(1)构建重组质粒，包含缺失等位基因，(2)整合质粒到宿主染色体中，以及(3)切除质粒载体序列和野生型等位基因。基于小鼠中的毒力和免疫原性，Lm ΔactA/ΔinlB菌株CERS 382.20选自两种PCR-阳性候选物。C57B1/6小鼠中的毒力使用竞争力指数分析来评价。两种候选物相等地减弱，并且使用非-噬菌体治愈的ΔactA/ΔinlB研究菌株观察到类似水平的减弱。然后，在Balb/C小鼠中测试候选物的它们初免免疫显性的Kd-限制的LLO抗原表位特异性T细胞的能力。在候选物或非-噬菌体治愈的ΔactA/ΔinlB菌株之间没有可辨别的免疫效价的差异。基于减弱和免疫效价，由于两种候选物和非-噬菌体治愈的研究菌株相当，因此一种候选物(CERS 382.20)被选择用于进一步表征。

包括actA和inlB基因座的重叠PCR产物从Lm菌株CERS 382.20和DP L4056的新鲜集落混悬物扩增。将PCR产物测序，装配到单一邻接的DNA序列以用于各基因座，因此证实CERS 382.20中actA和inlB基因的精确开始-至停止-密码子缺失。在10403S中在密码子56处的rpsL突变保存在CERS 382.20中，并且通过直接从染色体DNA扩增的PCR产物的序列分析来记录。CERS 382.20的链霉素-耐性显型通过在选择性培养基上生长来证实。链霉素-耐性显型用于促进临床菌株的鉴定和将其与其他李斯特菌和非-李斯特菌种类分开。

实施例2.HCV抗原的评价

Kyte-Doolittle亲水性图是用于描绘蛋白的疏水性特性的广泛应用的比例。疏水性从个体氨基酸残基的溶剂化焓来计算，并且在5至7个氨基酸的滑动窗口的范围内加和。数值高于0的区域特性是疏水性。HCV核心、NS3和NS5b抗原的初始Kyte-Doolittle评价用于鉴定小于或等于得自ActA-N100的峰值疏水性数值的区域。大于此的数值可表示在李斯特菌中不会良好地表达的多肽序列。结果示于图7。

图8示出通过各种ActA-N100HCV抗原融合的李斯特菌的抗原重组表达，如通过蛋白质印迹测量。个体HCV序列(核心序列1-190、1-180和1-177；NS3序列1-631、1-484、22-631、22-484、22-280、172-484、172-631、和416-631；以及NS5序列1-574、1-342、320-591和320-574)表达为在细菌启动子(L.monocytogenes ActA启动子)控制下来自抗原表达盒的ActA-N100融合物。表达盒稳定地整合到L.monocytogenes基因组。L.monocytogenes actA启动子被选择，因为其在宿主细胞中高度诱导。

来自肉汤培养的蛋白质印迹进行在等量的TCA-沉淀的上清细菌培养上(其生长在酵母提取物培养基中)至OD₆₀₀为0.7(后log)。对于来自Lm感染的宿主细胞的蛋白质印迹，J774细胞或DC2.4细胞接种，用50或100的多传染(MOI)1小时，将细胞用PBS和DMEM培养基(补充有50μg/mL庆大霉素)洗涤3×。对于早期时间点，将DC2.4s在传染后在1.5或2.5hr收集。对于后期时间点，J774细胞在7小时收集。将细胞用SDS样品缓冲液裂解，收集，并且在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上运行和转移至硝化纤维素膜用于蛋白质印迹分析。所有蛋白质印迹使用多克隆抗体，其针对ActA蛋白的成熟N-末端而增强。

在图中，各组中的泳道1和2是阴性和阳性对照，其示出没有抗原插入和通过李斯特菌菌株CRS-207的间皮素表达。组A在泳道3、4和5示出核心序列1-190、1-180和1-177。组B在泳道3-10示出NS3序列1-631、1-484、22-631、22-484、22-280、172-484、172-631和416-631。组C在泳道3-7示出NS5序列1-574、1-342、320-591和320-574。如这些附图中可见，NS3_172-484表现出较强表达，如NS5b_1-342那样。图8中的箭头示出在比从表达的序列预计的分子量基本上更低的分子量下制备的蛋白产物。

来自重组L.monocytogenes的这些各种ActA-N100HCV抗原融合物的重组表达也用于评价完整C-末端SL8小鼠T细胞抗原表位的存在。SL8抗原表位用作标签以证实重组抗原从N-末端至C-末端全部表达，和证实抗原递呈细胞通过MHC I类途径递呈重组抗原的能力。相应的L.monocytogenes同于感染DC2.4细胞。使用传染，重组L.monocytogenes在DC2.4细胞内表达和分泌融合多肽。如果DC2.4细胞合适地递呈肽，这可通过报道子T细胞杂交瘤系(B3Z T细胞杂交瘤)的方式来检测。结果示于下表中：

抗原构建体	OD₅₉₅
		核心序列
1-190	0.27
		1-180	0.32
1-177	0.33
		NS3序列
1-631	0.82
		1-484	0.83
22-631	0.83
		22-484	0.43
22-280	0.88
		172-484	0.88
172-631	0.9
		416-631	0.9
NS5序列
		1-574	0.35

1-342	0.88
		320-591	0.18
320-574	0.55

基于Kyte-Doolittle嗜水性分析，蛋白表达结果和抗原递呈数据，NS5B蛋白的氨基酸1-342和NS3的氨基酸172-484被选择用于疫苗构建体。

实施例3.ANZ 521的开发

基于ANZ 100疫苗平台，L.monocytogenes菌株ANZ 521是李斯特菌疫苗菌株。示出ANZ 521的源和衍生的图提供于图1。

为了开发ANZ 521，抗原表达盒(图2A)在细菌启动子(L.monocytogenes ActA启动子)控制下构建，其编码HCV基因产物NS5b和NS3的部分。表达盒地稳定地整合到L.monocytogenes基因组(图2B)。L.monocytogenes actA启动子被选择，因为其在宿主细胞中高度诱导。包含NS5b和NS3序列的HCV抗原表达为融合ActA蛋白的氨基-末端100氨基酸(“ActA-N100”)的单一多肽，其使来自细菌的HCVNS5B-NS3融合蛋白的表达和分泌最大化，所述细菌在接种的宿主中感染的APC的上下文中。

表达的成熟ActA-N100-HCV NS5B-NS3融合蛋白是730氨基酸，其长度预计为分子量78.5kDa。NS5b-NS3抗原表达盒编码NS5b蛋白的氨基酸1-342(全长NS5b是591aa)和NS3的氨基酸172-484(全长NS3是631aa)。HCV NS5b-NS3氨基酸序列衍生自HCVNS5b和NS3共有序列(Cox 2005，Ray 2005)，并且编码DNA序列被重新合成以利用最优密码子在L.monocytogenes中的表达。因为抗原被截短和合成，并且从L.monocytogenes分泌为融合蛋白，因此不可能它们具有天然结构或活性，但是确保蛋白没有它们的内生活性，位点-特异性突变被工程化到对于各蛋白的活性关键的模体中。为了确保NS5B聚合酶是非功能性的，氨基酸序列被改变以含有GDD至GNH(开始在NS5b的氨基酸319)，从而使双突变失活，其中各改变完全使RNA聚合酶活性失活(Lohmann 1997)。为了使NS3解旋酶活性失活，模体II(DECH)被突变至AASH，其开始在NS3的氨基酸292(Wardell 1999)。NS3不可能具有蛋白酶活性，因为催化丝氨酸不存在于该构建体中(Bartenschlager 1993)。

ActA-N100-HCV NS5B-NS3共有序列抗原表达盒使用标准等位基因交换技术来插入Lm ΔactA/ΔinlB“母体菌株染色体的(Δ)inlB基因座。等位基因交换载体被构建以定位同源重组至菌株382.20的染色体的inlB基因座(图3A)。首先，通过重叠延长(SOE)PCR的分裂用于融合inlB基因座的同源上游的1315bp至inlB基因座的同源下游的1265bp。独特KpnI和SacI限制酶位点加入上游和下游同源的结合点，这用于插入HCVNS5b-NS3抗原试剂盒到载体中。所得2606bp PCR产物克隆到温敏等位基因交换载体pBHE261中，其指示等位基因交换载pKSV7(Smith 1992)，这被修饰以含有转移源(oriT)，从而促进导致“pBHE1151 inlB等位基因交换载体”质粒的接合。然后，包含actA启动子、actA基因的氨基-末端300bp(编码ActA-N100片段)和密码子-优化的HCVNS5b-NS3共有序列抗原融合物的表达盒被克隆到pBHE1151 inlB等位基因交换载体中，从而导致质粒pBHE1366(图3B)。

质粒pBHE1366通过接合转移到菌株CERS 382.20，转移接合子在30℃下在补充有氯霉素(Cm)的板上选择。含有个体质粒的集落被拾取并且在42℃下在肉汤培养中通过两次，然后上板到预加热的Cm板，以选择用于在inlB基因座整合质粒。单一集落从高温板拾取，并且在30℃下在肉汤中非选择性通过(5-10倍)，在30℃下将单一集落上板。含有HCVNS5b-NS3共有序列表达盒的克隆基于下列标准来选择：链霉素耐性、氯霉素敏感性、对于HCVNS5b-NS3序列PCR阳性、对于pKSV7载体序列PCR阴性、和通过用引物的证实PCR基因组基因座，所述引物在NS5b-编码序列插入内灭火，并且1.3kb外的第二引物同于引导同源重组。

筛选克隆用于利用蛋白质印迹、使用针对ActA的成熟N-末端的抗体定向，ActA-N100-HCV NS5B-NS3融合蛋白在Lm感染的DC2.4组织培养物细胞中的表达。最终克隆(BH2064)在inlB基因座完全测序，这证实表达盒的精确插入，并且这也被测试用于诱导HCV-特异性T细胞应答和传染的小鼠模型中的生物分布。

工作ANZ-521疫苗产物包含1.5mL的减弱L.monocytogenes菌株BH2064，其在Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)和9％v/v甘油中标称滴度1x10¹⁰cfu/mL。产物可在-60℃或之下冷冻储存。

实施例4.细菌表达的HCV抗原的免疫原性

重组L.monocytogenes表明在小鼠中诱导对于编码的异源抗原的强效CD4+和CD8+T细胞免疫。Lm ΔactA/ΔinlB表达HCVNS5b-N3诱导NS5b-和NS3-特异性T细胞免疫的能力在进行单次免疫后在各种小鼠菌株中测定。最初，在HCV抗原序列的C-末端含有另外SL8小鼠T细胞抗原表位的构建体用于建立免疫原性。这后来使用ANZ 521来证实，其缺少SL8抗原表位。

NS5b-和NS3-特异性CD4+和CD8+T细胞应答通过ELISPOT或细胞内细胞因子分析测试使用肽库来测定，所述肽库包含被11个氨基酸重叠的嵌套的15个氨基酸肽。所述库跨越HCVNS5b和NS3的完全序列。NS5b肽库的池1和2覆盖NS5b片段；NS3肽库的池2和3覆盖由ANZ-521表达的NS3片段(图4)。使用SL8标签构建体来进行初始试验。该构建体在SJL小鼠中诱导NS3-特异性免疫和在评价的所有小鼠菌株中诱导NS5b-特异性免疫：Balb/c，C57BL/6，FVB/n，C3H和SJL小鼠(图5A)。

SJL中的NS3-特异性T细胞应答定位于HCVNS3蛋白的两个区域：氨基酸由肽44/45和肽49至51覆盖(图5B)。这些对应于下列序列：IPVENLETTMRSPVF(SEQ ID NO：1)；NLETTMRSPVFTDNS(SEQ ID NO：2)；PPAVPQSFQVAHLHA(SEQ ID NO：3)；PQSFQVAHLHAPTGS(SEQ ID NO：4)；和FQVAHLHAPTGSGKS(SEQ ID NO：5)。随后试验分别鉴定这些区域为CD8+和CD4+T细胞抗原表位(数据未示出)。

NS3-和NS5b-特异性CD4+和CD8+T细胞免疫也通过在进行单次静脉内施用ANZ-521后在小鼠中的细胞内细胞因子分析来证实(图6)。在存在用于细胞内细胞因子染色的布雷菲德菌素A的情况下，来自免疫的小鼠的脾细胞被用相关的肽刺激5小时。刺激的细胞表面染色用于CD4和CD8，然后使用cytofix/cytoperm试剂盒(BD Biosciences，San Jose，CA)固定和渗透。然后将细胞染色用于IFN-γ、TNF-α和/或IL-2。使用FACSC自动流式细胞仪(BD Biosciences)获得样品。将数据闭合以包括专门的CD4+或CD8+事件，然后测定表达IFN-γ的这些细胞的百分比。

虽然已经足够详细地描述并示例了本发明以使本领域技术人员制造并使用，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，应当清楚各种置换形式、修改形式和改进形式。这里所提供的实施例是优选实施方式的典型代表，是示例性并且不是用来限制本发明的范围。本领域技术人员将会想到其修改形式和其他用途。这些修改形式包含在本发明的精神之内并且由权利要求书的范围所限定。

本领域技术人员容易清楚，在不脱离本发明精神和范围的情况下，这里披露的本发明可以制成各种置换形式和修改形式。

在说明书中提及的所有专利和公布表明本发明所属领域的普通技术人员的水平。

这里示例性适当描述的本发明可以在缺少未具体公开的任何一种或几种成分、一种或几种限制的情况下实施。因此，例如，在这里的各种情况下，术语“包含”、“实质由......组成”以及“由......组成”中的任一种术语可以替换成其他两种术语。已经采用的术语和表达方式用作说明书的术语而不具有限制性，并且没有这些术语和表达方式的使用会排除所示和所述特征的任何等同方式或其部分的意图，而是认识到在本发明所要求的范围内可以存在各种修改形式。因此，应当理解，虽然已经通过优选实施方式和可选特征的方式具体披露了本发明，但是本领域技术人员可以采用在此披露的概念的修改形式和变化形式，并且这些修改形式和变化形式被认为落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

其他实施方式在下面的权利要求书中阐述。

Claims

1.一种在受试者中诱导针对丙型肝炎病毒(HCV)的T细胞应答的方法，所述方法包括：

在选择以在所述受试者中诱导所述T细胞应答的条件下，向所述受试者施用组合物，所述组合物包含表达一种或多种免疫原性HCV抗原多肽的细菌，其氨基酸序列包含：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：全长NS3、全长NS5b、衍生自NS3的氨基酸序列、和衍生自NS5b的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：包含来自NS3的至少100个邻接残基的氨基酸序列、和包含来自NS5b的至少100个邻接残基的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：与来自NS3的至少100个邻接残基具有至少90％序列同一性的氨基酸序列、和与来自NS5b的至少100个邻接残基具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82和83。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌，其包含编码整合到所述细菌的基因组的所述一种或多种免疫原性HCV抗原多肽的核酸序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细菌是actA缺失突变体或actA插入突变体、inlB缺失突变体或inlB插入突变体、或者包含actA缺失或actA插入和inlB缺失或inlB插入的ΔactA/ΔinlB突变体。

8.根据权利要求6所述的方法，其中编码所述一种或多种免疫原性HCV抗原多肽的多核苷酸整合到所述细菌的致病基因中，并且所述多核苷酸的整合干扰所述致病基因的表达或干扰所述致病基因的编码序列。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述致病基因是actA或inlB。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述细菌是减弱单核细胞增生性李斯特菌。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌是Lm ΔactA/ΔinlB。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述细菌还包含减弱所述细菌修复核酸的能力的基因突变。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述基因突变在选自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD和recA的一种或多种基因中。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌prfA突变体，其基因组编码组成性活性prfA蛋白。

15.根据权利要求6所述的方法，其中所述细菌是被杀死但代谢性活性单核细胞增生性李斯特菌。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌prfA突变体，其基因组编码组成性活性prfA蛋白。

17.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸序列是优化用于通过单核细胞增生性李斯特菌表达的密码子。

18.根据权利要求6所述的方法，其中所述在选择以在所述受试者中诱导所述T细胞应答的条件包括通过选自由下列构成的组的一种或多种施用途径向所述受试者施用所述单核细胞增生性李斯特菌：口服、肌内、静脉内、皮内和皮下。

19.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽表达为包含分泌信号序列的融合蛋白。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述分泌信号序列是单核细胞增生性李斯特菌ActA信号序列。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽表达为融合蛋白，所述融合蛋白包含选自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40构成的组的框内ActA-N100序列、或与所述ActA-N100序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括施用表达融合蛋白的单核细胞增生性李斯特菌，其包含：

其中所述融合蛋白表达自可操作地连接单核细胞增生性李斯特菌ActA启动子的核酸序列。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述单核细胞增生性李斯特菌表达融合蛋白，所述融合蛋白包含：具有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的序列的NS5b的氨基酸1-342、或其突变衍生物，其中所述突变使NS5b的RNA聚合酶活性失活；和具有SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的序列的NS3的氨基酸172-484、或其突变衍生物，其中所述突变使NS3的解旋酶活性失活。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含：

(a)选自由具有HCV共有序列中列举的序列的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b构成的组的一种或多种全长HCV蛋白，所述HCV共有序列选自由SEQ ID NO：7-23构成的组；

(b)衍生自(a)的一种或多种全长HCV蛋白的一种或多种氨基酸序列；或

(a)的一种或多种全长HCV蛋白和(b)的一种或多种氨基酸序列的组合。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含一种或多种邻接的HCV氨基酸序列，其不具有超过李斯特菌ActA-N100的峰值疏水性的疏水性区域。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含来自预计编码一种或多种MHC I类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含来自预计编码一种或多种MHC II类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含：来自预计编码一种或多种MHC I类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列；以及来自预计编码一种或多种MHC II类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列。

29.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有慢性HCV传染。

30.根据权利要求1所述的方法，其中当递送至所述受试者时，所述组合物在所述递送后24小时诱导选自由IL-12p70、IFN-γ、IL-6、TNFα和MCP-1构成的组的一种或多种蛋白的血清浓度增加；以及诱导针对所述免疫原性HCV抗原多肽的一种或多种的CD4+和/或CD8+抗原-特异性T细胞应答。

31.一种组合物，包含：

包含序列编码一种或多种免疫原性HCV抗原多肽的核酸分子的细菌，其氨基酸序列包含：

32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：全长NS3、全长NS5b、衍生自NS3的氨基酸序列、和衍生自NS5b的氨基酸序列。

33.根据权利要求31所述的组合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：包含来自NS3的至少100个邻接残基的氨基酸序列、和包含来自NS5b的至少100个邻接残基的氨基酸序列。

34.根据权利要求31所述的组合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：与来自NS3的至少100个邻接残基具有至少90％序列同一性的氨基酸序列、和与来自NS5b的至少100个邻接残基具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

35.根据权利要求31所述的组合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82和83。

36.根据权利要求31-35中任一项所述的组合物，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌，其包含整合到所述细菌的所述基因组中的所述核酸序列。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述细菌是actA缺失突变体或actA插入突变体、inlB缺失突变体或inlB插入突变体、或者包含actA缺失或actA插入和inlB缺失或inlB插入的ΔactA/ΔinlB突变体。

38.根据权利要求36所述的组合物，其中编码所述一种或多种免疫原性HCV抗原多肽的多核苷酸整合到所述细菌的致病基因中，并且所述多核苷酸的整合干扰所述致病基因的表达或干扰所述致病基因的编码序列。

39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述致病基因是actA或inlB。

40.根据权利要求36所述的组合物，其中所述细菌是减弱单核细胞增生性李斯特菌。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述细菌是Lm ΔactA/ΔinlB。

42.根据权利要求38所述的组合物，其中所述细菌还包含减弱所述细菌修复核酸的能力的基因突变。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述基因突变在选自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD和recA的一种或多种基因中。

44.根据权利要求40所述的组合物，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌prfA突变体，其基因组编码组成性活性prfA蛋白。

45.根据权利要求36所述的组合物，其中所述细菌是被杀死但代谢性活性单核细胞增生性李斯特菌。

46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌prfA突变体，其基因组编码组成性活性prfA蛋白。

47.根据权利要求36所述的组合物，其中所述核酸序列是优化用于通过单核细胞增生性李斯特菌表达的密码子。

48.根据权利要求31所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

49.根据权利要求31-35中任一项所述的组合物，其中所述核酸分子将所述免疫原性HCV抗原多肽编码为包含分泌信号序列的融合蛋白。

50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述分泌信号序列是单核细胞增生性李斯特菌ActA信号序列。

51.根据权利要求49所述的组合物，其中所述核酸分子将所述免疫原性HCV抗原多肽编码为融合蛋白，所述融合蛋白包含选自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40构成的组的框内ActA-N100序列、或与所述ActA-N100序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

52.根据权利要求31所述的组合物，其中所述组合物包含含有核酸分子的单核细胞增生性李斯特菌，其序列编码融合蛋白，包含：

其中编码所述融合蛋白的所述核酸分子可操作地连接单核细胞增生性李斯特菌ActA启动子。

53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述单核细胞增生性李斯特菌包含核酸分子，其序列编码融合蛋白，所述融合蛋白包含：具有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的序列的NS5b的氨基酸1-342、或其突变衍生物，其中所述突变使NS5b的RNA聚合酶活性失活；和具有SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的序列的NS3的氨基酸172-484、或其突变衍生物，其中所述突变使NS3的解旋酶活性失活。

54.根据权利要求31所述的组合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含：

55.根据权利要求31所述的组合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含一种或多种邻接的HCV氨基酸序列，其不具有超过李斯特菌ActA-N100的峰值疏水性的疏水性区域。

56.根据权利要求31所述的组合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含来自预计编码一种或多种MHC I类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列。

57.根据权利要求31所述的组合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含来自预计编码一种或多种MHC II类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列。

58.根据权利要求31所述的组合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含：来自预计编码一种或多种MHC I类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列；以及来自预计编码一种或多种MHC II类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列。

59.一种在受试者中HCV预防或治疗慢性HCV传染的方法，所述方法包括：

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：全长NS3、全长NS5b、衍生自NS3的氨基酸序列、和衍生自NS5b的氨基酸序列。

61.根据权利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：包含来自NS3的至少100个邻接残基的氨基酸序列、和包含来自NS5b的至少100个邻接残基的氨基酸序列。

62.根据权利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：与来自NS3的至少100个邻接残基具有至少90％序列同一性的氨基酸序列、和与来自NS5b的至少100个邻接残基具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

63.根据权利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含选自由下列构成的组的一种或多种氨基酸序列：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82和83。

64.根据权利要求59-63中任一项所述的方法，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌，其包含编码整合到所述细菌的基因组的所述一种或多种免疫原性HCV抗原多肽的核酸序列。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述细菌是actA缺失突变体或actA插入突变体、inlB缺失突变体或inlB插入突变体、或者包含actA缺失或actA插入和inlB缺失或inlB插入的ΔactA/ΔinlB突变体。

66.根据权利要求64所述的方法，其中编码所述一种或多种免疫原性HCV抗原多肽的多核苷酸整合到所述细菌的致病基因中，并且所述多核苷酸的整合干扰所述致病基因的表达或干扰所述致病基因的编码序列。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述致病基因是actA或inlB。

68.根据权利要求64所述的方法，其中所述细菌是减弱单核细胞增生性李斯特菌。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述细菌是Lm ΔactA/ΔinlB。

70.根据权利要求66所述的方法，其中所述细菌还包含减弱所述细菌修复核酸的能力的基因突变。

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述基因突变在选自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、uvrD和recA的一种或多种基因中。

72.根据权利要求68所述的方法，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌prfA突变体，其基因组编码组成性活性prfA蛋白。

73.根据权利要求64所述的方法，其中所述细菌是被杀死但代谢性活性单核细胞增生性李斯特菌。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌prfA突变体，其基因组编码组成性活性prfA蛋白。

75.根据权利要求64所述的方法，其中所述核酸序列是优化用于通过单核细胞增生性李斯特菌表达的密码子。

76.根据权利要求64所述的方法，其中所述在选择以在所述受试者中诱导所述T细胞应答的条件包括通过选自由下列构成的组的一种或多种施用途径向所述受试者施用所述单核细胞增生性李斯特菌：口服、肌内、静脉内、皮内和皮下。

77.根据权利要求59-63中任一项所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽表达为包含分泌信号序列的融合蛋白。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述分泌信号序列是单核细胞增生性李斯特菌ActA信号序列。

79.根据权利要求78所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽表达为融合蛋白，所述融合蛋白包含选自由SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40构成的组的框内ActA-N100序列、或与所述ActA-N100序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

80.根据权利要求59所述的方法，其中所述方法包括施用表达融合蛋白的单核细胞增生性李斯特菌，其包含：

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述单核细胞增生性李斯特菌表达融合蛋白，所述融合蛋白包含：具有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的序列的NS5b的氨基酸1-342、或其突变衍生物，其中所述突变使NS5b的RNA聚合酶活性失活；和具有SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14的序列的NS3的氨基酸172-484、或其突变衍生物，其中所述突变使NS3的解旋酶活性失活。

82.根据权利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含：

83.根据权利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含一种或多种邻接的HCV氨基酸序列，其不具有超过李斯特菌ActA-N100的峰值疏水性的疏水性区域。

84.根据权利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含来自预计编码一种或多种MHC I类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列。

85.根据权利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含来自预计编码一种或多种MHC II类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列。

86.根据权利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含：来自预计编码一种或多种MHC I类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列；以及来自预计编码一种或多种MHC II类抗原表位的核心、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一种或多种的共有序列的一种或多种邻接的HCV氨基酸序列。

87.根据权利要求59所述的方法，其中所述方法是治疗受试者中的慢性HCV传染的方法。

88.根据权利要求59所述的方法，其中当递送至所述受试者时，所述组合物在所述递送后24小时诱导选自由IL-12p70、IFN-γ、IL-6、TNF α和MCP-1构成的组的一种或多种蛋白的血清浓度增加；以及诱导针对所述免疫原性HCV抗原多肽的一种或多种的CD4+和/或CD8+抗原-特异性T细胞应答。

89.根据权利要求59所述的方法，其中所述方法是在未患有慢性HCV传染的受试者中HCV预防的方法。

90.一种药物组合物，包含：

权利要求31-58中任一项所述的组合物；和

药学上可接受的赋形剂.

91.根据权利要求14或16所述的方法，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌prfA突变体，所述突变体是prfA^*突变体。

92.根据权利要求44或46所述的组合物，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌prfA突变体，所述突变体是prfA^*突变体。

93.根据权利要求72或74所述的方法，其中所述细菌是单核细胞增生性李斯特菌prfA突变体，所述突变体是prfA^*突变体。