EA012182B1 - Электропорация микобактерии и сверхэкспрессия антигенов микобактерий - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным штаммам Mycobacterium, обладающим улучшенными вакцинными свойствами, позволяющими использовать эти штаммы в качестве вакцин. Штаммы для получения рекомбинантных Mycobacterium выбирают из родительских штаммов, которые были идентифицированы как штаммы, обладающие высокой иммуногенностью. Полученные штаммы Mycobacterium не обладают резистентностью к антибиотикам, и их гены не подвергаются горизонтальному переносу в грамотрицательные бактерии.

Description

Настоящее изобретение относится к штаммам МусоЬас!етшт, обладающим улучшенными вакцинными свойствами, позволяющими использовать их в качестве вакцин против туберкулеза. Штаммы МусоЬас!етшт предпочтительно выбирают из родительских штаммов, которые были идентифицированы как штаммы, обладающие высокой иммуногенностью и не обладающие резистентностью к антибиотикам, и гены которых не подвергаются горизонтальному переносу в грамотрицательные бактерии. Настоящее изобретение также относится к МусоЬас!етшт, обладающим улучшенными свойствами, обеспечивающими доставку трансгенов, которые обладают вакцинными свойствами, позволяющими использовать их для вакцинации против других заболеваний и для лечения рака.

Предшествующий уровень техники

Бактерией МусоЬас!етшт 1иЬегси1о818 (М.!Ь) инфицирована одна треть населения всего мира, и эти инфекции вызывают активную форму заболевания у 8 млн чел., из которых каждый год умирает 1,6-2,2 млн чел., причем большинство из них проживает в развивающихся странах. Туберкулез (ТБ) представляет собой эпидемическое заболевание глобального масштаба, причем заболеваемость туберкулезом и смертность от этого заболевания все возрастает, поскольку его распространенность пересекается с распространенностью ВИЧ-инфекции. ТБ является главной причиной смертности больных СПИДом.

ВСО, т.е. широко используемая в настоящее время вакцина против ТБ, была разработана 80 лет назад и, как показали испытания, уровень ее эффективности против туберкулеза легких широко варьируется, причем эта вакцина оказалась неэффективной в большинстве испытаний в условиях практической работы, проведенных в последнее время в Индии (Рше е! а1., Уассте, 16(20): 1923-1928, 1998; Апопутои8, 1пб1ап 1. Меб. Кез., Аид; 110: 56-69, 1999). Тем не менее, в настоящее время Всемирная Организация Здравоохранения рекомендует ВСО-вакцинацию всех детей при рождении или при первом посещении патронажной службы (за исключением детей с симптомами ВИЧ-инфекции/СПИДа) в странах с высоким риском заболеваемости туберкулезом. Такая тактика основана на полученных данных, свидетельствующих о том, что ВСО обеспечивает защиту от тяжелых форм детского ТБ (Ьапскпе! е! а1., 1п!. 1. Ερίбетю1, 24(5): 1042-1049, 1995; Кобпдиез е! а1., 1. Ер1бетю1. СоттипИу НеаИй 45(1): 78-80, 1991). Иммунизация противотуберкулезной вакциной ВСО детей далеко не раннего возраста является предметом обсуждения, поскольку имеется лишь ограниченное количество данных, дающих противоречивые результаты. Однако высокая заболеваемость туберкулезом у детей и взрослых в развивающихся странах, где широко практикуется ВСО-иммунизация детей при рождении, указывает на то, что применяемая в настоящее время вакцина ВСО не очень эффективна, и уже в течение многих лет люди в этих странах подвержены высокому риску заболевания ТБ. Поэтому очевидно, что ВСО не обеспечивает адекватную защиту человека от заболевания ТБ и не является средством борьбы против заражения ТБ.

Приблизительно 70% людей, контактирующих с микроорганизмами, вызывающими ТБ, и имеющих нормальную иммунную систему, не подвергаются инфицированию, и лишь у 5% из всех инфицированных индивидуумов развивается заболевание в первые два года. У большинства инфицированных индивидуумов наблюдается подавление инфекции, ассоциированное с продуцированием стойкого клеточного иммунного ответа против антигенов М.!Ь. А у еще 5% индивидуумов наблюдаются рецидивы этого заболевания при снижении иммунитета. Как первичное заболевание, так и рецидивы наблюдаются, главным образом, у людей, страдающих ВИЧ-инфекциями/СПИДом, что еще раз подтверждает важную роль, которую играет иммунитет в предупреждении и устранении инфекции.

Описание сущности изобретения

Поскольку организм большинства людей способен бороться с ТБ, то есть все основания надеяться, что индуцирование стойкого иммунитета определенного типа позволит разработать эффективные вакцины, которые способны предупреждать возникновение первичной инфекции после контакта с микроорганизмами, вызывающими эту инфекцию, и раннее прогрессирование заболевания, а также предупреждать реактивацию при латентном состоянии и возникновение рецидивов после лечения. И, наконец, может быть использована комбинация системного введения вакцины и проведения химиотерапии, которые, в конечном счете, будут способствовать уничтожению микроорганизма М.!Ь, являющегося патогеном для человека.

Исходя из того факта, что вакцинация ВСО в детстве играет решающую роль для предупреждения развития острой формы ТБ, очевидно, что замена ВСО на новую вакцину против ТБ в испытаниях, проводимых для оценки кандидатов на вакцину против ТБ, не может быть осуществлена без получения огромного количества данных, свидетельствующих о том, что такая новая вакцина является в высокой степени эффективным продуктом. Однако проблема заключается в том, что М.!Ь является, главным образом, возбудителем инфекций у человека, и животные-модели лишь частично имитируют взаимодействие хозяина с патогеном. Таким образом, окончательные данные, подтверждающие повышенную эффективность новой вакцины ТБ, могут быть получены только в контролируемых испытаниях в условиях практической работы с участием человека. Исходя из этих соображений, многие исследователи пришли к выводу, что ключевой стадией в создании улучшенной вакцины против ТБ является получение улучшенных штаммов ВСО и моделей-животных, несмотря на их ограниченность, и высказали предположение

- 1 012182 что рекомбинантные штаммы, сверхэкспрессирующие защитные антигены, будут обладать более высокой эффективностью по сравнению с родительским ВСС.

Некоторые антигены М.1Ь обладают вакцинными свойствами и при их введении животным в виде вакцинных препаратов обеспечивают защиту, аналогичную защите, достигаемой с использованием лишь одной вакцины ВСС (Либегаои, 1пГсс1. 1ттип. 62(6): 2536-2544, 1994). Для улучшения свойств этих вакцин-кандидатов может быть применена стратегия усиления иммуногенности антигенов, присутствующих в ВСС. Таким образом, были получены штаммы ВСС, которые сверхэкспрессируют выбранные антигены М.1Ь, и было показано, что эти рекомбинантные штаммы ВСС (гВСС) индуцируют более сильный иммунитет по сравнению с родительскими штаммами ВСС, из которых был получен штамм гВСС (ΗοηνίΙζ е1 а1., 1иГес1. 1ттип. 72(4): 1672-1679, 2003). В одном исследовании было подтверждено, что штамм гВСС, который экспрессирует антиген 85В (обозначаемый далее Лд85В), является более эффективным, чем штамм ВСС, смешанный с тем же самым антигеном (Ηοτνίΐζ е1 а1., см. выше, 2003). Эти данные дают основание предположить, что такой метод является в высшей степени перспективным.

В некоторых случаях штаммы ВСС, которые сверхэкспрессируют антигены, могут быть использованы для вырабатывания надежных и эффективных иммунных ответов, обеспечивающих защиту против ТБ-инфекций.

Настоящее изобретение относится к генетически сконструированным (рекомбинантным) штаммам МусоЬас1егшт, обладающим улучшенными вакцинными свойствами, которые позволяют использовать их для вакцинации против туберкулеза. Эти штаммы обладают различными отличительными свойствами, каждое из которых способствует повышению их иммуногенности.

Рекомбинантные штаммы МусоЬас1егшт согласно изобретению получают из родительских штаммов, специально отобранных по их высокой иммуногенности. Другими словами, штамм МусоЬас1егшт, который был выбран в качестве родительского штамма для проведения генетических манипуляций (например, для сверхэкспрессии туберкулезного антигена), был способен, даже до проведения генетических манипуляций, вырабатывать сильный иммунный ответ у вакцинированного хозяина. Таким штаммом является, например, штамм ВСС Дания 1331. Затем эти штаммы предпочтительно модифицируют, например, так, чтобы они сверхэкспрессировали представляющий интерес туберкулезный антиген. При получении генетически рекомбинантной микобактерии предпочтительно используют промотор, который активируется ίη νί\Ό. Кроме того, рекомбинантные штаммы МусоЬаСегшт согласно изобретению были генетически модифицированы так, чтобы для их отбора не требовалось введения генов резистентности к антибиотикам, либо эти штаммы были сконструированы так, чтобы вообще не требовалось использования селектируемых маркеров, что позволяет, по существу, обеспечивать их безопасность для вакцинации человека. Так, например, ген, необходимый для репликации микобактерий, удаляют и помещают в экспрессионную плазмиду. Кроме того, гены рекомбинантных штаммов МусоЬасЮпит согласно изобретению не подвергаются горизонтальному переносу в грамотрицательные бактерии, а поэтому они не способны ускользать из организма хозяина. Это также гарантирует их безопасность в качестве вакцинных агентов при введении человеку.

В качестве другого примера в настоящем изобретении описана экспрессия антигена 85В в плазмидах, применяемого в качестве фактора, стабилизирующего эту плазмиду, что позволяет избежать необходимости использования отбора по резистентности к антибиотикам для сохранения этих плазмид. Прямая трансформация штаммов микробактерий высокими концентрациями минимальных плазмид, экспрессирующих Ад85В и другие антигены, с использованием ПЦР-позитивного отбора для их идентификации позволяет получить штаммы микобактерий, сверхэкспрессирующие антигены, обладающие стабильностью в данной плазмиде, без применения антибиотиков или ауксотрофного отбора. Кроме того, рекомбинантные штаммы МусоЬаСегшт согласно изобретению представляют собой превосходные средства, которые могут быть использованы при получении вакцин против туберкулеза, при этом они могут быть также генетически сконструированы так, чтобы они экспрессировали или сверхэкспрессировали антигены, не являющиеся возбудителями туберкулеза, а поэтому они могут быть также использованы в качестве вакцинных агентов против других заболеваний. Более того, гВСС, сверхэкспрессирующие антигены ТБ или антигены, играющие важную роль в патогенезе других заболеваний, могут быть использованы в схемах комбинированной иммунизации вместе с рекомбинантными белками, адъювантами, рекомбинантными вирусными векторами либо с ДНК- или РНК-вакцинами, используемыми для бустериммунизации.

Настоящее изобретение относится к трансформированной бактерии или к ее потомству, которые включают чужеродную нуклеотидную последовательность, реплицирующуюся и экспрессирующуюся в трансформированной бактерии (или в ее потомстве), где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность не связана с селектируемым маркером. В одном из вариантов изобретения чужеродная нуклеотидная последовательность присутствует в плазмиде, а в некоторых вариантах изобретения плазмида кодирует ген, необходимый для выживания бактерии, где указанный ген, необходимый для выживания бактерии, делетирован из бактериального генома трансформированной бактерии. В еще одном варианте изобретения плазмида содержит ген, кодирующий высвобождение из эндосомы, например рГо. В других вариантах изобретения чужеродная нуклеотидная последовательность кодирует высвобождение из эндо

- 2 012182 сомы например ген ρίο. В других вариантах настоящего изобретения чужеродная нуклеотидная последовательность кодирует антиген 85А, антиген 85В или антиген 85А/85В. В других вариантах изобретения плазмида содержит ген, кодирующий белки, которые сохраняют и/или стабилизируют плазмиду. В некоторых вариантах изобретения ген, кодирующий белки, кодирует антиген 85А, антиген 85В или антиген 85А/85В. В одном из вариантов изобретения указанной бактерией является МусоЬасЮпиш. В другом варианте изобретения чужеродная нуклеотидная последовательность кодирует апоптоз. В других вариантах изобретения плазмида содержит ген, кодирующий апоптоз. В еще одном варианте изобретения чужеродная нуклеотидная последовательность не может реплицироваться в грамотрицательных бактериях. В некоторых вариантах изобретения трансформированной бактерией является ауксотрофная бактерия. В других вариантах изобретения чужеродной нуклеотидной последовательностью является по меньшей мере часть однонаправленного челночного вектора.

Настоящее изобретение также относится к способу трансформации бактерии. Способ включает стадию введения чужеродной нуклеотидной последовательности, которая реплицируется и экспрессируется в бактерии, и чужеродной нуклеотидной последовательности, не связанной с селектируемым маркером. В одном из вариантов изобретения стадию введения осуществляют путем электропорации. В другом варианте изобретения чужеродная нуклеотидная последовательность присутствует в плазмиде, а электропорацию осуществляют в условиях, при которых отношение плазмидной ДНК к бактериальным клеткам составляет от 1 до 5 мкг плазмидной ДНК к 1,25х10⁸ бактериальных клеток. В одном из вариантов изобретения это отношение составляет приблизительно 1,6 мкг плазмиды к 1,25х10⁸ бактериальных клеток. В некоторых вариантах изобретения чужеродная нуклеотидная последовательность не может реплицироваться в грамотрицательных бактериях. В других вариантах изобретения чужеродной нуклеотидной последовательностью является по меньшей мере часть однонаправленного челночного вектора. В других вариантах изобретения чужеродная нуклеотидная последовательность присутствует в плазмиде и кодирует ген, необходимый для выживания бактерии и делетированный из бактериального генома бактерии.

Настоящее изобретение также относится к трансформированной МусоЬас1егшт или ее потомству, содержащим чужеродную нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес ген, в том случае, если выполняются одно или несколько из следующих условий:

a) трансформированная МусоЬас1егшт включает плазмиду, которая не способна реплицироваться в грамотрицательных бактериях;

b) трансформированная МусоЬас1егшт не обладает резистентностью к антибиотикам;

c) трансформированная МусоЬас1егшт является ауксотрофной и

6) трансформированная МусоЬасЮпиш содержит однонаправленный челночный вектор.

В одном из вариантов изобретения чужеродной нуклеотидной последовательностью является часть плазмиды. В другом варианте изобретения плазмида не содержит селектируемого маркера. В еще одном варианте изобретения чужеродная нуклеотидная последовательность кодирует ген, необходимый для выживания бактерии, где указанный ген, необходимый для выживания бактерии, делетирован из бактериального генома трансформированной микобактерии. В некоторых вариантах изобретения геномом, необходимым для выживания, является 1еиЭ. Трансформированная МусоЬас1егшт или ее потомство могут дополнительно содержать промоторные последовательности, которые активируются ίη νίνο. Трансформированная МусоЬас1егшт или ее потомство могут быть аттенюированными. Трансформированная МусоЬасЮпиш или ее потомство могут представлять собой штамм ВСС, которым может быть, например, ВСС1331, ВСС Пастер, ВСС Токио или ВСС Копенгаген.

Настоящее изобретение также относится к вакцине, включающей трансформированную МусоЬас1егшт или ее потомство, содержащие чужеродную нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес ген, в том случае, если выполняются одно или несколько из следующих условий:

a) трансформированная МусоЬас1егшт включает плазмиду, которая не способна реплицироваться в грамотрицательных бактериях;

b) трансформированная МусоЬасЮпиш не обладает резистентностью к антибиотикам;

c) трансформированная МусоЬасЮгшт является ауксотрофной и

6) трансформированная МусоЬасЮпиш содержит однонаправленный челночный вектор.

Описание графического материала

Фиг. 1. Карта вектора-самоубийцы рАЕ103.

Каждый из сегментов ДНК имеет следующие обозначения:

Ь-Дапк и К-Дапк: левый и правый фланги гена 1еиЭ соответственно;

ар11 означает ген аминогликозид-фосфотрансферазы (СепВапк ассекыоп № Х06402), который сообщает плазмиде резистентность к канамицину;

опЕ означает ориджин репликации рИС (СепВапк ассеккюп № АУ234331);

В1е означает ген (СепВапк ассеккюп № Ь36850), который сообщает плазмиде резистентность к зеоцину;

8асВ означает ген (СепВапк ассекыоп № Υ489048), кодирующий левансахаразу, которая сообщает бактерии восприимчивость к сахарозе;

- 3 012182

Ρίκρβο означает промоторную последовательность гена белка теплового шока (т.е. Ρν0440);

МС8 означает сайты множественного клонирования для указанных ферментов рестрикции.

При этом следует отметить, что кластер, расположенный между двумя Раб-сайтами, может быть заменен, если это необходимо, другими генами эндосомалитических ферментов.

Фиг. 2. Уровень иммунной защиты, измеряемый по числу КОЕ в легких после иммунизации различными современными вакцинными штаммами.

Фиг. 3. Схематическое представление экспрессионного вектора, не содержащего гена резистентности к антибиотику и используемого для введения в рекомбинантную МусоЬас1етшш, т.е. гВСО.

Ген, экспрессируемый в тВСО, клонируют в плазмиду посредством рас1-сайта. Перед электропорацией в тВСО плазмиду расщепляют указанными ферментами рестрикции для удаления областей опЕ и Кап, в результате чего получают однонаправленный челночный экспрессионный вектор. Каждый из сегментов ДНК имеет следующие обозначения:

Ρι<_ν3ι_3ο означает промоторную последовательность антигена Р\'3130с;

Р_Ад85В означает промоторную последовательность антигена 85В (т.е. Р\'1886с); антиген Υ представляет собой микобактериальный антиген ТВ 10.4 (т.е. Κ.ν0288);

Ад85В представляет собой последовательность ДНК, кодирующую антиген 85В (т.е. Ρν 1886с); Ад85А представляет собой ген, кодирующий антиген 85А (т.е. Р\'3804с);

ар11 означает ген аминогликозид-фосфотрансферазы (ОепВапк ассеззюп № Х06402), который сообщает плазмиде резистентность к канамицину;

опЕ означает ориджин репликации рИС (ОепВапк ассеззюп № ΑΥ234331);

1еиЭ представляет собой ген, кодирующий 3-изопропилмалатдегидратазу (т.е. Ку2987с); ойМ представляет собой ориджин репликации в МусоЬас1етшш (ОепВапк ассеззюп № М23557). Фиг. 4. Блок-схема основных стадий аллельного обмена.

Фиг. 5. ПЦР-анализ отобранных колоний на присутствие экспрессионной плазмиды.

ПЦР проводили, как описано в разделе Материалы и методы. ПЦР-продукты анализировали с помощью гель-электрофореза в 1,0% агарозном геле.

Дорожка 1: ДНК-леддер (1шйтодеп) использовали как 1 т.п.н. плюс ДНК-стандарт.

Дорожка 2: в качестве негативного контроля использовали ПЦР-матрицу.

Дорожка 3: ПЦР для штамма ВСО Дания 1331.

Дорожки 4-7: ПЦР для колоний, обозначенных 59, 61, 69 и 84 соответственно.

Дорожка 8: контрольная лунка.

Дорожка 9: ПЦР для исходной плазмиды.

Подробное описание изобретения Варианты осуществления настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к генетически сконструированным (рекомбинантным) штаммам МусоЬас1етшш, обладающим улучшенными вакцинными свойствами, которые позволяют использовать их для вакцинации против туберкулеза. Эти штаммы обладают рядом свойств, каждое из которых способствует повышению иммуногенности этих штаммов. Рекомбинантные штаммы МусоЬас1етшш согласно изобретению были получены из родительских штаммов, специально отобранных по их высокой иммуногенности. Другими словами, штамм МусоЬас1етшш, отобранный в качестве родительского штамма для проведения генетических манипуляций (например, для осуществления сверхэкспрессии туберкулезного антигена), был выбран, потому что этот штамм, даже до проведения генетических манипуляций, был способен вырабатывать сильный иммунный ответ у вакцинированного хозяина. Таким штаммом является, например, штамм ВСО Дания 1331. Затем эти штаммы предпочтительно модифицируют, например, для сверхэкспрессии представляющего интерес туберкулезного антигена. В такой генетически рекомбинантной микобактерии предпочтительно используют промотор, который активируется ш νί\Ό. Кроме того, рекомбинантные штаммы МусоЬас1етшш согласно изобретению являются генетически модифицированными, так что для их отбора не требуется использования генов резистентности к антибиотикам, что, тем самым, обеспечивает их безопасность при вакцинации человека. Так, например, ген, необходимый для репликации микобактерий, удаляют и помещают в экспрессионную плазмиду. Кроме того, рекомбинантные штаммы МусоЬас1етшш согласно изобретению не подвергаются горизонтальному переносу в грамотрицательные бактерии, а поэтому они не способны ускользать из организма хозяина (т.е. они представляют собой однонаправленные челночные векторы). Это также гарантирует их безопасность в качестве вакцинных агентов при введении человеку. Кроме того, рекомбинантные штаммы МусоЬас1етшш согласно изобретению представляют собой превосходные средства, которые могут быть использованы в вакцинах против туберкулеза, и при этом они могут быть также генетически сконструированы так, чтобы они экспрессировали или сверхэкспрессировали антигены, не имеющие отношения к туберкулезу, а поэтому они могут быть также использованы в качестве вакцинных агентов против других заболеваний.

В предпочтительных вариантах изобретения штаммами МусоЬас1етшш являются аттенюированные штаммы, например ВСО. Однако, как очевидно для специалистов в данной области, могут быть также использованы и другие аттенюировнные и неаттенюированные штаммы МусоЬас1етшш. Примерами та

- 4 012182 ких других штаммов МусоЬасЮпа являются, но не ограничиваются ими, МусоЬас(егшт тюгой, МусоЬас(егшт Н37Яа, МусоЬас(егшт уассае и т.п.

Отбор штамма ВСО.

В предшествующих работах было высказано предположение, что ВСО не является гомогенным штаммом, и вместо этого штамма был получен массив из различных генетических линий (ОеШпдег е1 а1., ТиЬег Ьипд Όίδ. 79(4): 243-250, 1999). До настоящего времени не было точно известно, имеются ли какиелибо различия в иммуногенности и эффективности между членами семейства ВСО. Однако в настоящее время, как описано в настоящем изобретении, было обнаружено, что конкретный штамм, из которого был получен рекомбинантный ВСО (далее обозначаемый гВСО), по своей иммуногенности значительно отличается от гВСО. В примере 1, приведенном ниже, показано, что ВСО штамм Дания 1331 (далее обозначаемый ВСО₁₃₃₁) представляет собой вакцину, обладающую значительно лучшими свойствами по сравнению с ВСО_Т1се. Таким образом, хотя сверхэкспрессия антигена 85В в штамме гВСО30 способствует повышению иммуногенности этого штамма по сравнению с родительским штаммом ВСО_Т1се, из которого был получен указанный гВСО30, однако штамм гВСО30, сверхэкспрессирующий антиген 85В, присутствующий в штамме ВСО_11се, не обнаруживал эффективности, аналогичной эффективности ВСО1331. Таким образом, некоторые преимущества, получаемые в результате сверхэкспрессии антигена в ВСО, могут быть достигнуты путем отбора эффективного родительского штамма ВСО в начале процесса конструирования вакцины. Хотя задним числом такое решение может показаться очевидным, однако специалистами в данной области не было проведено такой коррекции (ΗοπνίΙζ е( а1., Ргос. №111. Лсай. 8сг И8Л, 97(25): 13853-13858, 2000), что свидетельствует о том, что ранее не было известно или не предполагалось, что перед началом конструирования гВСО-вакцин важно определить, обладает ли родительский штамм ВСО адекватной эффективностью. Такие штаммы являются в высокой степени подходящими для сверхэкспрессии ВСО и антигенов ТБ или чужеродных антигенов.

Эффективные родительские штаммы ВСО могут быть отобраны из группы, включающей, но не ограничивающейся ими, ВСО1331, ВСО Пастер, ВСО Токио и ВСО Копенгаген. При инокуляции морских свинок, используемых в качестве модели заражения, родительский штамм ВСО, по сравнению со штаммом ВСО_Т1се, должен снижать уровень жизнеспособных инфекционных микроорганизмов МусоЬас(егшт (иЬегси1о818 по меньшей мере более чем на 0,4х10¹⁰ при введении в низкой дозе в форме аэрозоля, как показано ниже в примере 1.

Усиление иммуногенности ВСО.

Как обсуждалось выше, иммуногенность штамма ВСО не является постоянной. Более того, в примере 1 показано, что, хотя иммуногенность антигенов ВСО может быть усилена путем генетической модификации ВСО, однако едва ли такая модификация будет эффективной, если родительский штамм ВСО, в котором были сделаны рекомбинантные изменения, не является эффективным в модели иммунизации морских свинок. Отсюда следует, что модификации, которые усиливают иммуногенность ВСО, будут также усиливать иммуногенность рекомбинантных штаммов, полученных из указанных родительских штаммов.

При применении подхода, подробно описанного выше, для отбора соответствующего штамма ВСО, используемого в качестве родительского штамма для получения вакцины гВСО и вакцинных векторов, в указанный штамм вносят генетические модификации для генерирования нужных вакцин гВСО и вакцинных векторов. Методы, используемые для конструирования отдельных штаммов гВСО, не имеют важного значения для осуществления настоящего изобретения и в этих целях могут быть применены любые методы или их комбинации, известные специалистам в данной области (Ног\\йх е( а1., ΡΝΑ8 97(25): 13853-13858, 2000; Не§8 е( а1., Ргос. Νίώ. Лсай. 8с1. И8Л, 95: 5299-5304, 1998).

Кроме того, в вакцинах гВСО предпочтительно использовать промотор, который активируется ίη У1уо после инфицирования. Так, например, использование конститутивно активного промотора, такого как промоторы, происходящие от антигена 85В, антигена 85А, Н§р60 или Ру1908с (Ка(О), обеспечивает конститутивную экспрессию данного антигена ίη угуо после иммунизации. Поэтому в каждой стадии в процессе инфицирования вырабатывается стойкий иммунный ответ против такой инфекции. Выбор активных промоторов на латентной стадии, таких как промоторы генов Ру2032. Ру3127. Ру2031с или Ру3030с и т.п., обеспечивает экспрессию выбранных антигенов в штамме гВСО, а особенно специфических антигенов на латентной стадии, когда вакцины гВСО вступают в латентную стадию ίη у1уо после иммунизации.

Экспрессионные векторы.

Разработка системы отбора без использования антибиотиков.

Как было указано выше, плазмиды, применяемые в настоящее время для сверхэкспрессии защитных антигенов в штаммах гВСО, в данном случае не могут быть использованы из-за того, что их сохранение зависит от присутствия в них генов резистентности к антибиотикам и из-за присущей этим плазмидам способности к горизонтальному переносу в микробные хозяева широкого ряда, что создает угрозу передачи генов резистентности к антибиотикам и экспрессии антигенных кластеров окружающим микроорганизмам. Для устранения этих важных ограничений в настоящем изобретении предлагаются новые, не основанные на антибиотиках системы отбора и однонаправленная система челночных векторов для

- 5 012182 введения и сохранения экспрессионных векторов в штаммах-хозяевах МусоЬас!егшт. таких как гВСО.

Отбор плазмид без применения антибиотиков может быть достигнут путем селективной делеции гена-хозяина. играющего важную роль в репликации. и последующей комплементации этой делеции путем введения функциональной копии гена в экспрессионную плазмиду. Таким образом. выживание бактериальных хозяев зависит от экспрессионной плазмиды. а поэтому необходим механизм сохранения плазмиды в микобактериальном хозяине без применения отбора на антибиотики. Предпочтительным методом является инактивация генов для создания ауксотрофного фенотипа. Так. например. в М.!Ь и ВСО инактивация гена 1еиЭ (Оепоте 8ЕО ΙΌ N0 МЬ3011С) приводит к продуцированию лейцинзависимого фенотипа. и выживание штаммов. которые имеют инактивированный ген 1енЭ. зависит от присутствия лейцина (Нопйа1ик е! а1.. ЕтГееЕ 1ттип. 68(5): 2888-98. 2000). Кроме того. штаммы МусоЬас!егшт А1енЭ не способны реплицироваться ίη νίνο (Нопйа1ик е! а1.. см. выше. 2000). и. таким образом. в А1енЭмутантах М.!Ь и гВСО будут сохраняться плазмиды 1еиЭ⁺ ш \з1го и ш νί\Ό.

Выбор какого-либо конкретного метода введения ауксотрофной мутации в целевые штаммы МусоЬас!егшт не имеет важного значения для осуществления настоящего изобретения и такой метод может быть выбран из любых методов аллельного обмена. хорошо известных специалистам в данной области (Рапкй е! а1.. М1сгоЬю1оду. 145: 3497-3503. 1999). Аналогичным образом. комплементация ауксотрофной мутации может быть достигнута путем введения функциональной копии инактивированного гена (например. 1енЭ') в экспрессионный вектор. Такой экспрессионный вектор также требует присутствия ориджина репликации МусоЬас!егшт (например. ойМ; ЬаЬ1й1 е! а1.. Р1акт1й. 27(2): 130-140. 1992) для обеспечения репликации этого вектора в целевых штаммах М.!Ь и гВСО. Выживание штаммов МусоЬас1егшт. содержащих такую плазмиду. зависит от экспрессии кодируемого плазмидой гена 1еиЭ после удаления лейцина из среды.

Получение новых однонаправленных челночных векторов.

Выше описан способ создания селективной системы для сохранения экспрессионных векторов в М.!Ь и гВСО. Однако для эффективного внесения модификаций в плазмидную структуру. которая затем вводит эти модификации в МусоЬас!егшт. такая векторная система должна обладать способностью к репликации в ЕксйепсЫа сой. Кроме того. для расширения круга потенциальных рекомбинантных штаммов-хозяев Е.сой. которые могут быть использованы в процессе конструирования плазмид. исследователями был использован хозяин Е.сой. который облегчает конструирование плазмиды. а в экспрессионный вектор предпочтительно были включены селектируемый маркер резистентности к антибиотикам (например. резистентности к канамицину) и ориджин репликации в широком круге хозяев (например. опЕ; На1регп е! а1.. Ргос. №ί1. Асай. 8сЕ. И8А. 76(12): 6137-6141. 1979; Мок1д е! а1.. \ем Вю1. 1(2): 171-179. 1989). Эти элементы были фланкированы уникальными сайтами расщепления рестрикционных эндонуклеаз (например. №е1) для последующего удаления маркера резистентности к антибиотикам и ориджина репликации Е.сой перед введением данной плазмиды в целевые штаммы МусоЬас!егшт. Кроме того. могут быть включены уникальные рестрикционные сайты эндонуклеаз (например. Рас1). в которые могут быть введены антигенные экспрессирующие кластеры. После осуществления этих модификаций в Е.сой и после идентификации и характеризации нужной плазмиды рекомбинантную плазмидную ДНК выделяют и расщепляют рестрикционной эндонуклеазой. которая высвобождает селектируемый маркер резистентности к антибиотикам и опЕ. Затем расщепленную плазмидную ДНК лигируют с использованием ДНК-лигазы Т4. Полученная таким образом плазмида содержит ген. комплементирующий ауксотрофию хозяина МусоЬас!егшт; не обладает резистентностью к антибиотику и не способна реплицироваться в грамотрицательных бактериях. Затем плазмиду. которая может также включать антигенный экспрессионный кластер. вводят в целевой ауксотрофный мутант МусоЬас!егшт в соответствии со стандартными процедурами электропорации. Рекомбинантные штаммы. содержащие указанную плазмиду. выделяют путем культивирования в среде. не содержащей метаболита. необходимого для ее роста (например. лейцина). Уникальное преимущество этой системы состоит в том. что такая конечная экспрессионная плазмида больше не содержит ген резистентности к антибиотику. А поэтому ген резистентности к антибиотику не может передаваться другим обычно используемым экспрессионным плазмидам. Кроме того. экспрессионная плазмида согласно изобретению больше не способна реплицироваться в широком круге хозяев. поскольку из нее были удалены генетические элементы. обеспечивающие такую репликацию. Таким образом. указанные векторы будут далее называться однонаправленными челночными векторами.

Сверхэкспрессия антигенов ТБ.

В соответствии с настоящим изобретением ген. введенный в экспрессионный кластер в однонаправленном челночном векторе. а затем в гВСО. может кодировать иммуноген М.!Ь. Иммуногеном М.!Ь может быть. например. полноразмерный нативный белок. химерный гибридный белок. состоящий из двух или более иммуногенов или миметиков М.!Ь. или фрагмент или фрагменты иммуногена М.!Ь. происходящие от МусоЬас!егшт 1иЬегси1о8Й.

Антигены М.!Ь экспрессируются в однонаправленном челночном векторе под контролем промотора. который является активным по меньшей мере на одной стадии инфицирования микобактерией ш νί\Ό. Выбор какого-либо конкретного промотора не имеет важного значения для осуществления настоящего изобретения. и такой промотор может быть выбран из конститутивно активных промоторов. таких

- 6 012182 как антиген 85В, Нкр60, антиген 85А, Ку1908с (Ка!С), и/или промоторов, которые являются активными на латентной стадии инфицирования, таких как промоторы генов Ку3130С (Ногсхук е! а1., 1пГсс1. 1ттип. 71(9): 5332-5343, 2003; Уоккш1 е! а1., 1. Ехг. Мей. 198(5): 705-713, 2003), Ку2032, Ку3127 и/или Ку20З1с. Для увеличения уровня экспрессии антигена может быть использована миниклетка, продуцирующая производное векторов штаммов МусоЬас!егшт. Миниклетку, продуцирующую штаммы бактерии вида МусоЬас!егшт, получают путем сверхэкспрессии Ε!κΖ (Сепоте йа!аЬаке № МЬ2174с) или путем сайтнаправленной инактивации ^ЫВЗ. Изменение уровня экспрессии Ε!κΖ или инактивация \у1иВ3 могут быть осуществлены стандартными генетическими методами, хорошо известными специалистам в данной области. Так, например, сверхэкспрессию Ε!κΖ осуществляют путем введения гена ΠκΖ в однонаправленный челночный вектор под контролем сильного промотора, такого как промоторы антигена 85В, антигена 85 А, Нкр60 или Ку1908с (Ка!С), которые являются конститутивно активными, и/или промоторы, которые являются активными на латентной стадии инфицирования, такие как промоторы генов Ку2032, Ку3127, Ку20З1с, апй Ку3130С (Ногсхук е! а1., см. выше, 200З; Уоккш1 е! а1., см. выше, 200З). Сайтнаправленную инактивацию \\'1иВЗ осуществляют путем аллельной замены в соответствии с процедурами, описанными ниже.

Примеры чужеродных антигенов, которые могут быть введены в рекомбинантную МусоЬас!егшт.

В соответствии с настоящим изобретением экспрессионный кластер в однонаправленном челночном векторе, присутствующий в векторе МусоЬас!егшт, может кодировать иммуноген, которым может быть либо чужеродный иммуноген, происходящий от вирусных, бактериальных или паразитарных патогенов, либо эндогенный иммуноген, такой как, но не ограничивающийся им, аутоиммунный антиген или опухолевый антиген. Такими иммуногенами могут быть, например, полноразмерный нативный белок, химерные гибриды, состоящие из чужеродного иммуногена и эндогенного белка или миметика, или фрагмент или фрагменты иммуногена, происходящего от вирусных, бактериальных и паразитарных патогенов.

Используемый здесь термин чужеродный иммуноген означает белок или его фрагмент, которые обычно не экспрессируются в клетках или тканях животного-реципиента, такие как, но не ограничивающиеся ими, вирусные белки, бактериальные белки, паразитарные белки, цитокины, хемокины, иммунорегуляторные агенты или терапевтические средства.

Термин эндогенный иммуноген означает белок или его часть, которые обычно присутствуют в клетках или тканях животного реципиента, такие как, но не ограничивающиеся ими, эндогенный клеточный белок, иммунорегуляторный агент или терапевтическое средство. Альтернативно или дополнительно такой иммуноген может кодироваться синтетическим геном и может быть сконструирован стандартными методами рекомбинантных ДНК, известными специалистам в данной области.

Чужеродным иммуногеном может быть любая молекула, которая экспрессируется любым вирусным, бактериальным или паразитарным патогеном, до или в процессе его инвазии или колонизации организма животного-хозяина или репликации в этом организме. гВСС может экспрессировать иммуногены или их части, происходящие от вирусных, бактериальных и паразитарных патогенов. Такие патогены могут быть инфекционными для человека, домашних животных или диких животных.

Вирусными патогенами, от которых происходят вирусные антигены, являются, но не ограничиваются ими, ортомиксовирусы, такие как вирус гриппа (Тахопоту ΙΌ: 59771); ретровирусы, такие как К8У, НТЬУ-1 (Тахопоту ΙΌ: З9015) и НТЬУ-П (Тахопоту ΙΌ: 11909); герпесвирусы, такие как ЕВУ (Тахопоту ΙΌ: 10295); СМУ (Тахопоту ΙΌ: 10З58) или вирус простого герпеса (АТСС № УК-1487); лентивирусы, такие как ВИЧ-1 (Тахопоту ΙΌ: 12721) и ВИЧ-2 (Тахопоту ΙΌ: 11709); рабдовирусы, такие как вирус бешенства; пикорновирусы, такие как полиовирус (Тахо по ту ΙΌ: 12080); поксвирусы, такие как вирус коровьей оспы (Тахопоту ΙΌ: 10245); ротавирус (Тахопоту ΙΌ: 10912) и парвовирусы, такие как аденоассоциированный вирус 1 (Тахопоту ΙΌ: 85106).

Примерами вирусных антигенов могут служить антигены группы, включающей, но не ограничивающейся ими, антигены вируса иммунодефицита человека ИеГ (Иайопа1 !п811(и1е оГ А11егду апй [пГес1юи5 И18еаке ШУ Керокйогу Са!. № 18З; СепВапк ассеккюп № АЕ2З8278), Сад, Епу (Иайопа1 ШкЕШе оГ А11егду апй Шескои^ Ищеаке НГУ Керокйогу Са!. № 24ЗЗ; СепВапк, ассеккюп № ИЗ9З62), Та! (Иа!юпа1 ШкОШе оГ А11егду апй IπΓес!^ои8 И18еаке ШУ Керокйогу Са!. № 827; СепВапк ассеккюп № М1З1З7), мутантные производные Та!, такие как Та!-ДЗ1-45 (Ад^а1е е! а1. Ргос. №111. Асай. 8ск 1п ргекк. 1и1. 8* 2002), Кеу (Иайопа1 ШкОШе оГ А11егду апй ЫесйоиБ И18еаке ШУ Керокйогу Са!. № 2088; СепВапк ассеккюп № Ь14572) и Ро1 (Иайопа1 ^йШе оГ А11егду апй ЫесйоиБ И18еаке ШУ Керокйогу Са!. № 2З8; СепВапк ассеккюп № А12З7568) и Т- и В-клеточные эпитопы др 120 (Напке апй МсМ1скае1, АЮ8 Iттиπо1. Ьей., 66: 177, 1999; Напке, е! а1., Уассше, 17: 589, 1999; Ра1кег е! а1., 1. ^типок, 142: З612-З619, 1989), химерные производные Епу и др120 ВИЧ-1, такие как, но не ограничивающиеся ими, гибриды белков др120 и СИ4 (Еои!к е! а1., 1. Упо1. 2000, 74: 11427-11436, 2000); усеченные или модифицированные производные епу ВИЧ-1, такие как, но не ограничивающиеся ими, др140 (8!ата!ок е! а1. 1. У1го1., 72: 9656-9667, 1998), или производные Епу и/или др140 ВИЧ-1 (Вш1еу, е! а1. 1. У1го1., 76: 2606-2616, 2002; 8апйегк, е! а1. 1. У1го1., 74: 5091-5100, 2000; В1п1еу, е! а1. 1. Упо1., 74: 627-64З, 2000), поверхностный антиген вируса гепатита В (СепВапк ассеккюп № АЕ04З578; \Уи е! а1., Ргос. Иа!1. Асай. 8ск, И8А, 86: 4726-4730, 1989); ротавирус

- 7 012182 ные антигены, такие как УР4 (ОепВапк ассеззюп № А1293721; Маскоте е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск, И8А, 87: 518-522, 1990) и УР7 (ОепВапк ассезяоп № АУ003871; Огееп е! а1., 1. Уйо1., 62: 1819-1823, 1988), антигены вируса гриппа, такие как гемагглютинин (ОепВапк ассеззюп № А1404 627; РеПтег апб КоЬшзоп, У1го1оду, 257: 406, 1999); нуклеопротеин (ОепВапк ассеззюп № А1289872; Шп е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. 8ск, 97: 9654-9658, 2000), антигены вируса простого герпеса, такие как тимидинкиназа (ОепВапк ассеззюп № АВ047378; Укй1еу е! а1., 1п: №ете Оепегайоп УассШез, р. 825-854, 2004).

Бактериальными патогенами, от которых происходят бактериальные антигены, являются, но не ограничиваются ими, МусоЬас!епит зрр., НексоЬас!ег ру1оп, 8а1топе11а зрр., 8Ыде11а зрр., Е.сок, Клскейыа зрр., Шз!ейа зрр., Ьедюпе11а рпеитошае, Рзеиботопаз зрр., У1Ьпо зрр. и ВогеШа Ьигдбойеп.

Примерами защитных антигенов бактериальных патогенов являются соматические антигены энтеротоксигенных бактерий Е.сок, такие как антиген фимбрий СРА/Ι (Уатато!о е! а1., 1пГес!. 1ттип., 50: 925-928, 1985) и нетоксическая В-субъединица термолабильного токсина (К11рз!еШ е! а1., 1пГес!. 1ттип., 40: 888-893, 1983); пертактин Вогбе!е11а рейизз1з (КоЬейз е! а1., Уасс., 10: 43-48, 1992), аденилатциклазагемолизин В. рейизз1з (Ошзо е! а1., М1сго. Ра!к., 11: 423-431, 1991), фрагмент С столбнячного токсина С1оз!пбшт !е!ат (РаитееаШег е! а1., 1пГес!. 1ттип., 58: 1323-1326, 1990), ОзрА ВогеШа ЬигдбогГеп (81капб, е! а1., Реб1а!псз, 108: 123-128, 2001; Уа1кск, е! а1., 1пГес! 1ттип., 69: 2130-2136, 2001), защитные паракристаллические поверхностные белки К1скейз1а рготеахекй и Кгскейыа 1ур1и (Саг1, е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 87: 8237-8241, 1990), листериолизин (также известный как Ь1о и Н1у) и/или супероксиддисмутаза (также известная как 8ΟΌ апб р60) Шз!ейа топосу!одепез (Незз, 1., е! а1., 1пГес!. 1ттип. 65: 1286-92, 1997; Незз, 1., е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. 8ск 93: 1458-1463, 1996; Воитеег, е! а1., 1. Ехр. Меб. 175: 1467-71, 1992), уреаза Не1юоЬас!ег ру1оп (Оотех-Эиайе, е! а1., Уассте 16, 460-71, 1998; Сойкезу-ТкеЫах, е! а1., ШГесйоп & 1ттипйу 66, 581-6, 1998) и связывающийся с рецептором домен летального токсина и/или защитный антиген ВасШиз апШгах (Рпсе, е! а1., 1пГес!. 1ттип. 69, 4509-4515, 2001).

Паразитарными патогенами, от которых происходят паразитарные антигены, являются, но не ограничиваются ими, Р1азтобшт зрр., такие как Р1азтобшт £а1арагит (АТСС № 30145); Тгурапозоте зрр., такие как Тгурапозота сгп/ί (АТСС № 50797); О1агб1а зрр., такие как О1агб1а ш!ез!Ша11з (АТСС № 30888Ό); ВоорЫ1из зрр., ВаЬез1а зрр., такие как ВаЬез1а тюгой (АТСС № 30221); ЕЫатоеЬа зрр., такие как Еп!атоеЬа Ыз!о1уйса (АТСС № 30015); Еппепа зрр., такие как Еипепа тах1та (АТСС № 40357); Ье1зЬташа зрр. (Тахопоту ГО: 38568); 8сЫз!озоте зрр., Вгид1а зрр., Еазшба зрр., ЭйоГПапа зрр., Уискегейа зрр. и Опскосегеа зрр.

Примерами защитных антигенов паразитарных патогенов являются антигены круглого спорозоита Р1азтобшт зрр. (8абоГГ е! а1., 8с1епсе, 240: 336-337, 1988), такие как антиген круглого спорозоита Р.Ьегдеш или антиген круглого спорозоита Р.£а1с1рагит; поверхностный антиген мерозоита Р1азтобшт зрр. (8ре1х1ег е! а1., 1п!. 1. Рер!. Рго!. Кез., 43: 351-358, 1994); галактозоспецифический лектин Еп!атоеЬа Ыз!о1у!юа (Мапп е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. 8ск, И8А, 88: 3248-3252, 1991), др63 Ье1зЬташа зрр. (Киззе11 е! а1., 1. 1ттипо1., 140: 1274-1278, 1988; Хи апб Шете, 1ттипо1., 84: 173-176, 1995), др46 Ье1зЬташа та)ог (Напбтап е! а1., Уассте, 18: 3011-3017, 2000), парамиозин Вгид1а та1ау1 (Ь1 е! а1., Мо1. ВюсНет. Рагазйо1., 49: 315-323, 1991), триозо-фосфат-изомераза 8сЫз!озота тапзот (8коетакег е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. 8ск, И8А, 89: 1842-1846, 1992); секретируемый глобинподобный белок ТпсНозйопдуЫз соЫЬпГогпиз (Ргеике1 е! а1., Мо1. ВюсНет. Рагазйок, 50: 27-36, 1992); глутагион-8-трансфераза Егазсю1а керайса (НШуег е! а1., Ехр. Рагазйок, 75: 176-186, 1992), 8сЫз!озота Ьоу1з и 8. )аротсит (ВазЫг е! а1., Тгор. Оеод. Меб., 46: 255258, 1994) и КЕН 8сЫз!озота Ьо\зз и 8. _)арошсит (ВазЫг е! а1., см. выше, 1994).

Как было упомянуто выше, вакцины гВСО могут кодировать эндогенный иммуноген, которым может быть любой клеточный белок, иммунорегуляторный агент или терапевтическое средство, или их части, которые могут экспрессироваться в клетке реципиента, включая, но не ограничиваясь ими, опухолевые иммуногены, иммуногены трансплантатов и аутоиммунные иммуногены или их фрагменты и производные. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением гВСО могут кодировать опухолевые иммуногены, иммуногены трансплантатов или аутоиммунные иммуногены или их части или производные. Альтернативно, гВСО может содержать синтетические гены (описанные выше), кодирующие опухолеспецифические антигены, антигены трансплантантов или аутоиммунные антигены или их части.

Примерами опухолеспецифических антигенов являются специфический для предстательной железы антиген (Оайизо е! а1., Нитап Ра!ко1., 26: 123-126, 1995), ТАО-72 и СЕА (Оиабадш е! а1., 1п!. 1. Вю1. Магкегз, 9: 53-60, 1994), МАОЕ-1 и тирозиназа (Сойке е! а1., 1. 1ттипо1кега., 14: 104-109, 1993). Недавно было обнаружено, что у мышей, которые были иммунизованы незлокачественными клетками, экспрессирующими опухолевый антиген, наблюдается вакцинный эффект, а также вырабатывается иммунный ответ, способствующий выведению злокачественных опухолевых клеток, несущих тот же самый антиген (Коерреп е! а1., Апа1. №.Υ. Асаб. 8ск, 690: 244-255, 1993).

Примером антигенов трансплантатов является молекула СЭ3 на Т-клетках (А1едге е! а1., О1дез!. О1з. 8ск, 40: 58-64, 1995). Было показано, что обработка антителом против рецептора СЭ3 способствует быстрому выведению циркулирующих Т-клеток и предотвращению клеточно-опосредуемого отторжения трансплантата (А1едге е! а1., см. выше, 1995).

- 8 012182

Примером аутоиммунноых антигенов является β-цепь 1А8 (Торйат с1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск, И8Л, 91: 8005-8009, 1994). Было продемонстрировано, что вакцинация мышей пептидом β-цепи ΙΆ8, состоящим из 18 аминокислот, вызывает у мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом выработку иммунитета к указанному заболеванию и подавление такого заболевания (ТорНаш с1 а1., см. выше, 1994).

Получение штамма гВСС, экспрессирующего адъювант.

Может быть сконструирован гВСС, кодирующий иммуноген и адъювант, и такой штамм может быть использован для усиления иммунного ответа у хозяина на гВСС. Альтернативно, для усиления ответа у хозяина на иммуногены, кодируемые партнером гВСС, может быть сконструирован адъюванткодирующий гВСС в комбинации с другими гВСС.

Выбор адъюванта, кодируемого гВСС, не имеет решающего значения для осуществления изобретения и такими адъювантами могут быть субъединица А холерного токсина (например, С1хА; СепВапк ассеккюп № Х00171, АР175708, Ό30053, Ό30052) или ее части и/или мутантные производные (например, домен А1 субъединицы А С1х (например, С1хА1; СепВапк ассеккюп №. К02679), происходящие от любого классического штамма У1Ьпо сНо1егае (например, штамма V. сНо1егае 395, АТСС № 39541) или штамма Е1 Тог V. сНо1егае (например, штамма V. сНо1егае 2125, АТСС № 39050). Альтернативно, вместо С1хА может быть использован любой бактериальный токсин, который является членом семейства бактериальных аденозин-дифосфат-рибозилирующих экзотоксинов (Кгиедег апб ВагЫег, С1ш. МюгоЬю1. Веу., 8: 34, 1995), например субъединица А термолабильного токсина (обозначаемого далее Е11А) энтеротоксигенной бактерии ЕксйепсЫа сой (СепВапк ассеккюп № М35581), субъединица 81 коклюшного токсина (например, р!х81, СепВапк ассеккюп № А1007364, А1007363, А1006159, А1006157, и т.п.); а в качестве другой альтернативы таким адъювантом может быть один из аденилат-циклазогемолизинов бактерий Вогбе(е11а рейиккщ (АТСС № 8467), Вогбе1е11а ЬгопсЫкерйса (АТСС № 7773) или Вогбе1е11а рагарейиккк (АТСС № 15237), например гены суаА В. рейиккк (СепВапк ассеккюп № Х14199), В.рагарейиккщ (СепВапк ассеккюп № А124 9835) или В.ЬгопсЫкербса (СепВапк ассеккюп № Ζ37112).

Получение штамма гВСС, экспрессирущего иммунорегуляторный агент.

Может быть сконструирован гВСС, кодирующий иммуноген и цитокин, и такой штамм может быть использован для усиления иммунного ответа у хозяина на гВСС. Альтернативно, для усиления ответа у хозяина на иммуногены, кодируемые партнером гВСС, может быть сконструирован гВСС, кодирующий указанный цитокин, либо отдельно, либо в комбинации с другими гВСС.

Выбор конкретного цитокина, кодируемого гВСС, не имеет решающего значения для осуществления изобретения и такими цитокинами могут быть, но не ограничиваются ими, интерлейкин-4 (обозначаемый далее 1Ь-4; СепВапк ассеккюп № АЕ352783 (мышиный 1Ь-4) или ΝΜ000589 (человеческий 1Ь4)); 1Ь-5 (СепВапк ассеккюп № ΝΜ010558 (мышиный 1Ь-5) или ΝΜ000879 (человеческий 1Ь-5)); 1Ь-6 (СепВапк ассеккюп № М20572 (мышиный 1Ь-6) или М29150 (человеческий 1Ь-6)); 1Б-10 (СепВапк ассеккюп № ΝΜ010548 (мышиный 1Ь-10) или АЕ418271 (человеческий 1Б-10)); 1Ь-12_р40 (СепВапк ассеккюп № ΝΜ008352 (мышиный 1Б-12 р40) или АУ008847 (человеческий 1Б-12 р40)); 1Ь-12_р70 (СепВапк ассеккюп № ΝΜ008351/ΝΜ008352 (мышиный 1Б-12 р35/40) или АЕ093065/АУ008847 (человеческий 1Б-12 р35/40)); ΤΟΡβ (СепВапк ассеккюп № ΝΜ011577 (мышиный Τ0Ρβ1) или М60316 (человеческий Τ0Ρβ1)) и ΤΝΕα СепВапк ассеккюп № Х02611 (мышиный ΤΝΕα) или М26331 (человеческий ΤΝΕα)).

Апоптоз представляет собой запрограммированную клеточную гибель, которая, по характеру и по последствиям ее индуцирования, значительно отличается от некротической клеточной гибели. Апоптоз клеток, содержащих чужеродные антигены, представляет собой известный мощный стимулятор развития клеточного иммунитета против таких антигенов. Механизм, посредством которого апоптоз антигенсодержащих клеток приводит к вырабатыванию клеточного иммунитета, иногда называют перекрестным примированием (^.В. Неа1Ь, С.В Век, С.М. Векгепк, С.М.8тйй, 8.Р. Еогекап, 1.А., Рапкй, С.М. Оауеу, Ν.8. ^йкоп, Е.В. СагЬопе апб ТА. ^11апбапдок. 2004. Сгокк-ргекеШаюп, бепНЫс се11 киЬке1к, апб 1ке депегайоп о£ 1ттипйу Ю се11и1аг апйдепк. 1ттипо1. Веу. 199: 9; 8. Са11исс1, М. Ьо1кета, апб Р. Мактдег. 1999. Ыа1ига1 абщуагИк: Епбодепоик асбгаЮгк о£ бепбпбс се11к. №11иге Вю1ескпо1оду. 5: 1249; М.Ь. А1Ьей, В. 8аи1ег, апб Ν. В11абгб\\щ. 1998. ОепбНгис се11к ассцпге апбдеп £гот арор!ойс се11к апб шбисе с1акк 1-гек1пс1еб СЕБк. №11иге 392: 86). Существует несколько механизмов индуцирования апоптоза, которые приводят к усилению антигенспецифического клеточно-опосредуемого иммунитета. Апоптоз, опосредуемый каспазой 8, приводит к вырабатыванию антигенспецифического клеточного иммунитета. Продуцирование каспазы 8 штаммом гВСС и ее секреция в цитоплазму эукариотических клеток в присутствии чужеродных антигенов, экспрессируемых штаммом гВСС, антигенов против ВСС и других туберкулезных антигенов, сверхэкспрессируемых штаммом гВСС, а также антигенов против самих антигенов ВСС приводит к вырабатыванию высокого уровня антигенспецифического клеточного иммунитета. Рецептор5 гибели клеток (ΌΒ-5), также известный как ΤΒΛΙΤ-Ρ2 (рецептор 2 ΤΡΛΙΤ) или ΤNΡВ-8Ε-10В (член суперсемейства факторов некроза опухоли 10В), также индуцирует апоптоз, опосредуемый каспазой 8 (ЕР. 8йепбап, 8.А. Магк1егк, В.М. Рбб, А. Сгипеу, М. 8ки1Ьа1сй, Ό. Ва1б^т, Ь. ВатакпкНпап, С.Ь. Сгау,

- 9 012182

К. Вакег, У.1. ХУооб, Α.Ό. Соббагб, Р. Собо\\ък1 апб А. АкИкешик 1997. Соп1го1 оГ Тгаб тбисеб арорЮкк Ьу а Гатбу оГ 81дпа1тд апб бесоу гесерЮгк. 8с1епсе, 277: 818). Индуцируемый реовирусом апопотоз опосредуется ТРАГЬ-ОКб и приводит к последующему выведению вируса (Р. С1агке, 8.М. Меш^хег, 8. С1Ькоп, С. У1бтапп, Т.Р. СатпдГоп, С.Ь. бойпкоп, апб К.Ь. Ту1ег. 2000. Иеоуйик-тбисеб арорЮкк к теб1а1еб Ьу ТКАбЬ. I. У1го1. 74: 8135). Экспрессия ΌΒ-5 рекомбинантным штаммом ВСС обеспечивает сильное стимулирующее действие, направленное на индуцирование антигенспецифического клеточного иммунитета против гВСС-экспрессируемых антигенов. Апоптоз антигенэкспрессирующих клеток также может быть индуцирован посредством присоединения Еак, который является сильным стимулятором индуцирования антигенспецифических клеточных иммунных ответов (М.А. Сйайегдооп, И К1т, 1.8. Уапд, Т.М. ВоЬЬткоп, Ό.6. Ьее, Т. Пейсйеу, И.М. ХУбкот V. Аууауоо, апб И.В. ХУетег. 2000. Тагде!еб апйдеп бебуегу Ю апйдеп-ргекепйпд се11з тс1ибшд бепбгШс се11к Ьу епдшеегеб Еа8-теб1а1еб арорЮкк. №11. В1о1есйпо1оду, 18: 974).

Рекомбинантный ВСС, экспрессирующий Еак или гибридный белок, содержащий цитоплазматический домен Еак/эктодомен СИ4, индуцирует апопотоз и антигенспецифические клеточные иммунные ответы.

Усиление клеточного иммунитета под действием штамма гВСС, который продуцирует стимуляторы апоптоза, описанные выше, не ограничивается только действием антигенов ВСС или антигенов, специфически кодируемых благодаря их сверхэкспресси в гВСС, а также может быть вызвано действием любого антигена, присутствующего в эукариотической клетке, которая может быть инфицирована вышеупомянутым штаммом гВСС. Так, например, если такой штамм гВСС ввести в опухолевые клетки, апоптоз которых он индуцирует, то это будет приводить к вырабатыванию клеточного иммунитета против важных опухолевых антигенов с последующей элиминацией, подавлением или предотвращением роста опухоли и/или возникновения метастазов. Такой противоопухолевый эффект может быть продуцирован в дополнение к общему противоопухолевому эффекту, который вырабатывается штаммом ВСС при его местном введении, например, при раке мочевого пузыря.

В другом варианте настоящего изобретения гВСС, стимулируемый посредством продуцирования специфических медиаторов апоптоза, доставляемых внутрь опухоли или других клеток, где указанный гВСС также продуцирует чужеродные антигены, против которых будут вырабатываться сильные клеточные иммунные ответы, будет индуцировать вырабатывание сильных клеточных ответов против клеток, содержащих указанные чужеродные антигены. Такие клеточные ответы будут приводить к иммуноопосредуемой деструкции опухолевых клеток, а также к перекрестному примированию и индуцированию клеточного иммунного ответа против опухолевых или других важных антигенов с последующим уничтожением опухоли и/или метастазов или подавлением или профилактики развития опухоли и/или метастазов. Примером такого чужеродного антигена является антиген НЬА, отличающийся от НЬА клетокхозяев, против которого вырабатывается сильный гетерологичный клеточный ответ.

Штамм гВСС, способность которого к идуцированию апоптоза усиливается путем экспрессии специфических медиаторов апоптоза, также экспрессирующих специфические опухолевые антигены, будет индуцировать сильные антигенспецифические клеточные ответы против этих опухолевых антигенов, включая подавление, до некоторой степени, толерантности к этим антигенам, что будет приводить к уничтожению опухоли и/или метастазов или к подавлению или профилактики развития опухоли и/или метастазов, и не требует прямой доставки гВСС в саму опухоль.

Апоптоз, вызываемый разрушением ДНК или действием каспазы 9, индуцирует толерантность к некоторым антигенам (8. Нидиек, Е. Моидпеаи, У. Еег1т, Ό. бекке, Р. НоГтап, Ό. Нотапп, Ь. Веаибот, Ό. 8сйпке, М. Х^;'оп НеггаШ, А. Еекиеп, апб N. СШскепепйаик, 2002, То1егапсе Ю 1к1е1 апйдепк апб ргеуепйоп Ггот б1аЬе1е8 шбисеб Ьу ктйеб арорЮкк оГ рапсгеайс Ье1а се11к. 1ттипйу, 16: 169). Индуцирование толерантности играет важную роль в лечении или профилактике аутоиммунных заболеваний, таких как, но не ограничивающихся ими, диабет, ревматоидный артрит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника и рассеянный склероз. Продуцирование каспазы 9 или других белков, индуцирующих опосредуемую апоптозом толерантность, штаммом гВСС в клетках, таких как, но не ограничивающихся ими, панкреатические В-клетки, клетки ободочной кишки и нервные клетки, будет приводить к ограниченному апоптозу, который будет индуцировать толерантность к антигенам-мишеням, продуцирующим аутоиммунитет в этих клетках, и, тем самым, способствовать лечению или профилактике аутоиммунных заболеваний. Идентификация специфических антигенов, участвующих в аутоиммунных реакциях, позволяет индуцировать толерантность к этим аутоиммунным антигенам-мишеням посредством продуцирования штаммом гВСС этих антигенов и каспазы 9 или других молекул, способных индуцировать опосредуемую апоптозом толерантность. Такой гВСС может быть использован для лечения и/или профилактики этих аутоиммунных заболеваний.

Методы рекомбинантных ДНК и РНК, применяемые для введения функциональных экспрессионных кластеров в целях создания гВСС, способного экспрессировать иммунорегуляторный агент в эукариотических клетках или тканях, описаны ниже.

Нижеследующие примеры приводятся в целях иллюстрации различных аспектов настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничение осуществления изобретения. При этом следует

- 10 012182 отметить, что в настоящем изобретении могут быть использованы различные альтернативные материалы, условия и процедуры, которые являются очевидными для среднего специалиста в данной области, но которые не должны выходить за рамки общего объема изобретения, представленного в его описании.

Примеры

Методы.

Культивирование штаммов МусоЬас!етшт.

Выбранные штаммы ВСС культивировали в жидкой среде, такой как среда Миддлбрука 7Н9 или синтетическая среда 8аи1!оп, предпочтительно при 37°С. Эти штаммы могут храниться в виде стационарной или перемешиваемой культуры. Кроме того, скорость роста ВСС может быть увеличена путем добавления олеиновой кислоты (0,06% об./об.; Некеагсй ΌίαβηοδΙία Са!. № 01257) и детергентов, таких как тилоксапол (0,05% об./об.; Некеагсй ΌίαβηοδΙία Са1. № 70400). Чистота культур ВСС может быть оценена путем равномерного посева 100 мкл аликвот культуры ВСС, серийно разведенной (например, 10-кратно разведенной чистой культуры (Ыеа!) - 10^-8) в забуференном фосфатом физиологическом растворе (далее обозначаемом РВ8), на 3,5-дюймовых чашках, содержащих 25-30 мл твердой среды, такой как среда Миддлбрука 7Н10. Кроме того, чистота указанной культуры может быть дополнительно оценена с использованием коммерчески доступных наборов, таких как наборы, содержащие тиогликолят (8с1епсе ЬаЬ, Са1. № 1891) и соевую среду с казеином (ВЭ, Са1. № 211768).

Посевные лоты ВСС хранили при -80°С при плотности 0,1-2х10⁷ КОЕ/мл. Жидкие культуры обычно собирали при оптической плотности (600 нм), составляющей 0,2-4,0 по отношению к стерильному контролю и эти культуры высевали в центрифужные пробирки соответствующего размера, а затем микроорганизмы подвергали центрифугированию при 8,000хд в течение 5-10 мин. Супернатант отбрасывали и микроорганизмы ресуспендировали в растворе для хранения, состоящем из среды Миддлбрука 7Н9, содержащей 10-30% (об./об.) глицерина при плотности 0,1-2х10⁷ КОЕ/мл. Эти суспензии в аликвотах по 1 мл распределяли по стерильным 1,5-миллилитровым боросиликатным сосудам для глубокого замораживания, а затем хранили при -80°С.

Общие методы молекулярной биологии.

Рестриктирующие эндонуклеазы (обозначаемые здесь НЕ); (Ыете ЕпДапб Вю1аЬк Веует1у, МА), ДНК-лигазу Т4 (Ыете ЕпДапб Вю1аЬк, Веует1у, МА) и полимеразу Тад (Ьбе Тесйпо1оДе8, СаййеткЬигд, МО) использовали в соответствии с протоколами производителей. Плазмидную ДНК получали с использованием наборов для лабораторной очистки (Д1адеп М1шртер® кй, 8ап1а С1ап1а, СА) или для крупномасштабной очистки (Д1адеп Мах1ргер® кй, 8ап1а С1атйа, СА) плазмидных ДНК в соответствии с протоколами производителей (Д1адеп, 8ап!а С1атйа, СА). Воду тйй-Д, не содержащую нуклеазы и очищенную до чистоты, требуемой для проведения молекулярно-биологических экспериментов; трис-НС1 (рН 7,5), ЕЭТА, рН 8,0, 1 М МдС1₂, 100% (об./об.) этанол, сверхчистую агарозу и буфер для электрофореза в агарозном геле закупали у фирмы Ьйе Тесйпо1оДе8, СаййеткЬитд, МЭ. Расщепление ферментами рестрикции, ПЦР, реакции лигирования ДНК и электрофорез в агарозном геле проводили в соответствии с хорошо известными процедурами (8атЬтоок, е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1. 1, 2, 3, 1989); 81таи8, е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И8А. Маг; 87(5): 1889-93, 1990). Секвенирование нуклеотидов для подтверждения последовательности ДНК каждой рекомбинантной плазмиды, описанной в нижеследующих разделах, проводили в соответствии со стандартными автоматизированными методами секвенирования ДНК с использованием автоматического секвенатора Аррйеб Вю8ук!ет8, модели 373А.

ПЦР-праймеры закупали у коммерческих фирм-поставщиков, таких как 8щта (81. Ьошк, МО), и синтезировали с использованием ДНК-синтезатора Аррйеб ВюкукЮтк (модель 373А). ПЦР-праймеры использовали при концентрации 150-250 мкМ, а температуру отжига для ПЦР-реакций определяли с помощью компьютерной программы С1опе тападег койгате уеткюп 4.1 (8с1епййс апб Ебиса1юпа1 8ой^ате 1пс., Эигйат ЫС). ПЦР проводили на роботизированной термоячейке 8!га!едепе Родосус1ег, модель 400880 (8!га!едепе, Ьа 1о11а, СА). ПЦР-праймеры для амплификации конструировали с помощью компьютерной программы С1опе Мападег® койгате уеткюп 4.1 (8с1еп(1Пс апб Ебиса1юпа1 8оП\таге 1пс., Эигйат ЫС). Эта программа позволяет конструировать ПЦР-праймеры и идентифицировать рестрикционные сайты, совместимые со специфическими ДНК-фрагментами, подвергаемыми модификации. ПЦР проводили в термоячейке, такой как роботизированная термоячейка 81та!едепе НоЬосус1ег, модель 400880 (81та!едепе), а время отжига, удлинения и денатурации праймеров в ПЦР устанавливали в соответствии с протоколами стандартных процедур (81гаик е! а1., см. выше, 1990). Затем расщепление ферментами рестрикции и ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле стандартными методами (81гаик е! а1., см. выше, 1990, и 8атЬгоок е! а1., см. выше, 1989). Положительный клон определяли как клон, который обнаруживал соответствующую рестрикционную карту и/или картину ПЦР. Плазмиды, идентифицированные в соответствии с указанной процедурой, могут быть дополнительно оценены в соответствии со стандартными процедурами секвенирования ДНК, описанными выше.

Штаммы ЕксйепсЫа сой, такие как ΌΗ5α и 8аЬ1е2®, закупали у фирмы Ьйе Тесйпо1оДе8 (СаййеткЬигд, МО), и эти штаммы служили в качестве исходного хозяина для рекомбинантных плазмид, описанных ниже в примерах. Рекомбинантные плазмиды вводили в штаммы Е.сой путем электропорации с

- 11 012182 применением электроимпульсного устройства для подачи импульсов высокого напряжения, такого как Сепе Рикег (ВюВаб ЬаЬогаФпек, Негси1ек, СА), с установленными параметрами 100-200 Ом, 15-25 мкФ и 1,0-2,5 кВ, как описано в литературе (81гаик е1 а1., см. выше, 1990). Оптимальные условия электропорации идентифицировали путем определения параметров, которые дают максимальную скорость трансформации на 1 мкг ДНК/бактерию.

Бактериальные штаммы культивировали на трипсинизированном соевом агаре (Эйсо, Ое(го11. ΜΙ) или в трипсинизированном соевом бульоне (Эйсо, Ое1го11, ΜΙ), которые приготавливали в соответствии с инструкциями производителя. Если это не указано особо, то все бактерии культивировали при 37°С в 5% СО₂ (об./об.) при легком помешивании. Если необходимо, то в среды добавляли антибиотики (81дша, 81. Ьошк, МО). Бактериальные штаммы хранили при -80°С и суспендировали в среде Эйсо, содержащей 30% (об./об.) глицерина (81дша, 81. Ьоик, МО) при плотности примерно 10⁹ колониеобразующих единиц (далее обозначаемых КОЕ) на 1 мл.

Аллельный обмен в ВСС.

Ранее были описаны методы введения модифицированных аллелей в штаммы МусоЬас1егшш, и эти методы являются известными и могут быть применены специалистами в данной области (Рапкй е1 а1., М1сгоЬю1оду, 146: 1969-1975, 2000). Новый метод генерирования плазмиды с заменой аллелей предусматривает использование синтезированной ДНК. Преимущество такого метода заключается в том, что о данном плазмидном продукте, полученном таким методом, может быть дана полная информация, а поэтому на его применение может быть получено разрешение Регуляторных органов, тогда как применяемые ранее методы, хотя и являются эффективными, очень плохо задокументированы с точки зрения протоколов проведения лабораторного культивирования, а поэтому на осуществление этих методов может быть не получено разрешения. Если данный продукт используется для введения человеку, то в соответствии с существующими правовыми нормами на его применение должно быть получено разрешение Регуляторных органов США и Европейских стран.

Вектором-самоубийцей для замены аллелей в МусоЬас1егшш является плазмида, которая способна реплицироваться в штаммах Е.со11, но не способна реплицироваться в штаммах МусоЬас1егшш крр., таких как М.1Ь и ВСС. Выбор того или иного конкретного вектора- самоубийцы для его использования в процедурах аллельного обмена не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такой вектор может быть выбран из векторов, полученных в научно-исследовательских лабораториях (Рагкй е1 а1., см. выше, 2000) или являющихся коммерчески доступными. Предпочтительная конструкция плазмиды-самоубийцы для аллельного обмена представлена на фиг. 1. Эта плазмида состоит из нижеследующих ДНК-сегментов: последовательности опЕ для репликации данной плазмиды в Е.соН (СепВапк ассеккюп № Б09137); последовательности гена резистентности к канамицину для отбора в Е.со11 и в МусоЬас1егшш (СепВапк ассекйоп № ААМ97345) и вспомогательного маркера для отбора на резистентность к антибиотику (например, гена резистентности к зеоцину (СепВапк ассеккюп № ААИ06610)), который находится под контролем промотора МусоЬас1егшш (например, промотора йкр60). Указанный второй маркер для отбора на резистентность к антибиотику не является обязательным, и он был включен для осуществления двойного отбора в целях предотвращения чрезмерного роста резистентных к канамицину изолятов, спонтанно образующихся в процессе аллельного обмена. (СагЬе е1 а1., МюгоЬю1о§у, 140: 133-138, 1994).

Конструирование таких векторов-самоубийц может быть осуществлено стандартными методами рекомбинантных ДНК, описанными в настоящем изобретении. Однако современные стандарты, разработанные Регуляторными органами, требуют обратить внимание на угрозу попадания прионовых частиц, образующихся в продуктах, обработанных коровьими продуктами, содержащими В8Е-инфицированный материал. Поэтому во избежание попадания этих материалов (например, последовательностей ДНК) в целевой штамм неизвестного происхождения предпочтительно, чтобы все ДНК в векторе-самоубийце были синтезированы с использованием коммерческих источников (например, Р1сокспр1, 1пс.). В соответствии с этим предпочтительным методом конструирования векторов-самоубийц является разработка протокола получения последовательностей ДНК с помощью компьютерной программы для конструирования ДНК (например, С1опе Мападег) с последующим синтезом ДНК коммерческой фирмойпоставщиком (например, Рюокспр! 1пс.), предоставляющей такие услуги за соответствующую плату. Этот метод был использован для продуцирования вектора-самоубийцы рА100 (не приводится), который был затем модифицирован для его применения в конкретных целях (рАР103 схематически представлен на фиг. 1, а также описан в таблице).

Вектор-самоубийца

Название	Остов	Специфический аллель для аллельного обмена
рАГЮЗ	рАЕЮО	фланкирующие 1 т.п.н.-области гена 1еиб

Такой вектор-самоубийца имеет те преимущества, что он содержит два маркера для отбора на резистентность к антибиотикам, что позволяет минимизировать отбор спонтанных мутантов, обнаруживающих резистентность к одному антибиотику и присутствующих в отношении примерно 1/10⁸ на генерацию. Спонтанная резистентность к двум антибиотикам встречается крайне редко и наблюдается только

- 12 012182 примерно в 1 случае на 10¹⁶-генерацию. Таким образом, вероятность появления штаммов, обладающих такой двойной резистентностью, в культурах, используемых для проведения процедуры аллельного обмена, составляет менее чем 1/10⁶.

Для негативного отбора в процессе аллельного обмена был включен ген касВ (геномная последовательность 8ЕО Ш № ΝΤ01Β84354), который сообщает фенотип чувствительности к сахарозе, в целях обогащения культуры штаммами, которые были подвергнуты конечной стадии рекомбинации ДНК и в которых была завершена процедура аллельного обмена.

Стратегия изготовления вакцины и вакцинации.

Стратегия изготовления вакцины основана на исследованиях, проводимых в целях определения максимальной жизнеспособности и стабильности этой вакцины в процессе ее изготовления. Эта стратегия включает оценку максимальной жизнеспособности данного микроорганизма (времени жизни) в процессе культивирования с использованием различных стандартных сред, обычно применяемых для культивирования МуеоЬае1спа. с добавлением глицерина, сахаров, аминокислот, детергентов или солей. После культивирования клетки собирают путем центрифугирования или фильтрации в тангенциальном потоке и ресуспендируют в стабилизирующей среде для защиты клеток во время замораживания или лиофилизации. Обычно используемыми стабилизирующими агентами являются глутамат натрия или аминокислоты или их производные, глицерин, сахара или обычно используемые соли. Конечная композиция должна содержать микроорганизм, который является достаточно жизнеспособным для его доставки путем внутрикожного введения, чрескожного введения, вливания или перорального введения и достаточно стабильным при его хранении, кроме того, она должна иметь адекватный срок годности для ее доставки и применения.

Преклиническая оценка вакцин против туберкулеза.

Общая процедура испытания на безопасность.

Группы мышей ВЛЬВ/е, состоящие из шести животных, внутрибрюшинно инфицировали 2х10⁶ КОЕ представляющего (их) интерес штамма(ов) тВСО и аналогичных родительских штаммов. Мониторинг общего состояния животных и их массы тела проводили в течение 14 дней после инфицирования. Животные, которым вводили штаммы ВСО и тВСО, оставались здоровыми, и у них не наблюдалось снижения массы тела и не обнаруживалось каких-либо явных признаков заболевания за время их наблюдения.

Вирулентность новых штаммов тВСО у иммунокомпетентных мышей.

Группы, состоящие из 15 иммунокомпетентных мышей ВЛЬВ/е, внутривенно инфицировали 2х10⁶ КОЕ штамма гВСО и родительского штамма ВСО соответственно. На 1-й день после инфицирования трех мышей в каждой группе умерщвляли и оценивали КОЕ в селезенке, легких и печени для подтверждения того, что каждое животное получило одну и ту же дозу заражение. Через 4, 8, 12 и 16 недель после инфицирования трех мышей в каждой группе умерщвляли и оценивали КОЕ в селезенке, печени и легких для анализа роста штаммов гВСО ίη νίνο по сравнению с ростом родительского штамма ВСО. Штаммы гВСО, как и ожидалось, обнаруживали вирулентность, аналогичную вирулентности родительского штамма ВСО.

Строгий тест на безопасность, проводимый на мышах с иммунодефицитом.

Мышей с иммунодефицитом 8СГО (с тяжелым комбинированным иммунодефицитом), распределенных на группы по 10 животных в каждой, внутривенно инфицировали 2х10⁶ КОЕ штамма гВСО и родительского штамма ВСО соответственно. На 1-й день после инфицирования трех мышей в каждой группе умерщвляли и оценивали КОЕ в селезенке, печени и легких для подтверждения того, что каждое животное получило одну и ту же дозу заражения. Остальных семь мышей в каждой группе подвергали мониторингу на их общее состояние и массу тела. Затем оценивали выживаемость этих мышей и результаты этого теста считались положительными, если в течение всего периода наблюдения показатели выживаемости гВСО-инфицированных мышей были лучше, чем показатели выживаемости животных, которые были инфицированы родительским штаммом.

Тест на безопасность для морских свинок.

Безопасность штаммов гВСО по сравнению с вакциной ВСО, полученной на основе родительского штамма и имеющей хорошо установленный профиль безопасности для человека, также оценивали на морских свинках, используемых в качестве модели. Сначала оценивали влияние вакцины на общее состояние здоровья животных, включая их массу тела. Морских свинок внутримышечно иммунизировали 10⁷ (100х дозой вакцинации) КОЕ рекомбинантного и родительского штаммов и проводили мониторинг общего состояния здоровья животных и их массы тела в течение шести недель. Животных, которые погибали до завершения этого шестинедельного периода времени, подвергали паталогоанатомическому исследованию. По истечении 6 недель после инфицирования всех животных умерщвляли и проводили макроскопический патологический анализ. При этом у животных не наблюдалось какой-либо потери массы и какого-либо аномального поведения, и аутопсия, проводимая через 6 недель, показала, что все органы были нормальными. Результат теста считался положительным, если после введения гВСО-Ρίοвакцины не наблюдалось какого-либо ухудшения состояния животных и если прирост массы животных

- 13 012182 оставался на нормальном уровне по сравнению с животными, инокулированными родительским штаммом.

Одновременно с этим проводили мониторинг уровней бактерий в органах животных. Морских свинок, иммунизованных вакциной, полученной на основе либо родительского, либо рекомбинантного штамма, подвергали эвтаназии через различные промежутки времени после инокуляции, а затем легкие, селезенку и региональные (паховые) лимфоузлы анализировали на уровень КОЕ ВСС или гВСС.

Тест на токсичность.

Для оценки токсичности штаммов гВСС морских свинок, по 12 животных в каждой группе, внутрикожно вакцинировали одной дозой, которая была в 4 раза выше или в 4 раза ниже разовой дозы штаммов гВСС, родительского штамма ВСС или физиологического раствора, вводимых человеку, соответственно. На 3-й день после вакцинации шесть животных умерщвляли для оценки кратковременного действия данной вакцины на этих животных. Через 28 дней после вакцинации шесть оставшихся животных умерщвляли для оценки продолжительности действия этих вакцин на животных. В обоих случаях одновременно регистрировали массу тела каждого животного и осуществляли исследование на наличие макропатологий, а также проводили осмотр участков тела в месте инъекции. Затем брали кровь для ее биохимического анализа и проводили гистопатологический анализ внутренних органов и участков тела в месте инъекции.

Исследования для определения иммунитета

Исследование для определения иммунитета у мышей.

Мышей С57В1/6 (самок в возрасте 5-6 недель), по 13 животных в каждой группе, подкожно иммунизировали 10⁶ КОЕ гВСС, родительского ВСС или физиологического раствора. Другую группу мышей использовали в качестве нормального контроля. Через 8 недель после иммунизации мышей инокулировали штаммом М.!Ь Эрдмана (или резистентным к канамицину штаммом Η37Κ.ν) путем аэрозольной ингаляции из 10-миллилитровой моноклеточной суспензии, содержащей всего 10⁷ КОЕ штамма для инокуляции, т.е. в дозе, доставляющей 100 живых бактерий в легкие каждого животного, как описано выше. Мониторинг выживаемости экспериментальных животных проводили одновременно с мониторингом выживаемости неинокулированных животных. После инокуляции животных также обследовали на потерю массы и на общее состояние. На 1-й день после инокуляции трех мышей в каждой группе умерщвляли и проводили анализ на уровни КОЕ в легких для подтверждения дозы инокуляции, а одну мышь умерщвляли для проведения гистопатологического анализа селезенки и легких. Через 5 недель после инокуляции девять животных в каждой группе умерщвляли и проводили гистопатологический и микробиологический анализ каждого животного. Ткани легких и селезенки, взятые у шести мышей, оценивали на уровни КОЕ (для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали планшеты, в которые добавляли селектируемые маркеры). Если инокуляцию проводили резистентным к канамицину штаммом Η37Κ.ν, то для идентификации инокулирующего штамма от вакцинного штамма использовали Кап или ТСН. Если инокуляцию проводили штаммом М.!Ь Эрдмана, то для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали ТСН (ВСС является восприимчивым штаммом, а М.!Ь обычно является резистентным).

Индуцирование кожной гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

Морских свинок, не имеющих каких-либо обнаружимых патогенов (8РЕ), внутрикожно иммунизировали 10³ штамма гВСС или родительского штамма ВСС. Через 9 недель после иммунизации спинку животных выбривали и чрескожно инъецировали 10 мкг ППД в 100 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора. Через 24 ч измеряли диаметр твердого уплотнения. Штаммы гВСС должны индуцировать ГЗТ, равную или превышающую ГЗТ, индуцируемую родительскими штаммами ВСС.

Исследование путем инокуляции морских свинок.

Для определения эффективности гВСС-вакцин против инокулирующего патогена М.!Ь морских свинок (молодых взрослых животных 8РЕ Нагйеу, массой 250-300 граммов, самцов), по 12 животных в группе, иммунизировали (каждым) гВСС, родительским штаммом ВСС или физиологическим раствором. Вакцины и контроль вводили внутрикожно в дозе 10⁶ КОЕ. Через 10 недель после иммунизации животных, иммунизованных штаммом гВСС и штаммом ВСС, и ложноиммунизованных животных заражали путем ингаляции аэрозоля, содержащего патоген М.!Ь и генерируемого из 10-миллилитровой моноклеточной суспензии, содержащей всего 10⁷ КОЕ М.!Ь; и эта процедура позволяет вводить ~100 живых бактерий в легкие каждого животного, как описано ранее (Бгойш е! а1., 1. 1п1ес1 Эй. 190(1), 2004). После инокуляции проводили мониторинг выживаемости животных одновременно с мониторингом здоровых животных в группах, которые не были подвергнуты вакцинации и заражению. После инокуляции животных также обследовали на потерю массы и на общее состояние. Через 10 недель после инокуляции шесть животных в каждой группе умерщвляли, а остальные шесть животных в каждой группе через 70 недель после инокуляции подвергали продолжительному обследованию. Одновременно проводили гистопатологический и микробиологический анализ каждого животного. Ткани легких и селезенки подвергали гистопатологическому анализу и анализу на уровни КОЕ (для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали планшеты, в которые были добавлены селектируемые маркеры). Если инокуляцию проводили резистентным к канамицину штаммом Η37Κ.ν, то для идентификации инокулирующего штамма от вакцинного штамма использовали Кап или ТСН. Если инокуляцию проводили

- 14 012182 штаммом М.1Ь Эрдмана, то для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали ТСН (ВСС является восприимчивым, а М.1Ь обычно является резистентным). Результаты экспериментов можно считать удовлетворительными в том случае, если ложноиммунизованные животные погибали вскоре после заражения, а гВСС-иммунизованные животные жили дольше, чем животные, иммунизованные родительским штаммом ВСС.

Исследования безопасности вакцин и картины заражения у приматов.

Совсем недавно оценку эффективности вакцины против М.1Ь. проводили на собакоподобных обезьянах. Эволюционное родство между человеком и другими приматами и аналогичные клинические и патологические симптомы туберкулеза у этих видов делают указанных приматов, не являющихся человеком, привлекательной моделью для экспериментальных исследований заболеваний ТБ и эффективности вакцин против ТБ.

Эта модель, характеризующаяся образованием каверн в легких, может быть, очевидно, использована для исследования развития ТБ у человека. За процессом инфицирования и развития заболевания наблюдали путем проведения рентгеновского анализа и оценки потери массы тела, а также путем проведения различных гематологических анализов, включая анализ на скорость оседания эритроцитов (СОЭ), анализ на пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и продуцирование цитокинов, анализ на активность цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и анализ на гуморальные ответы. После инфицирования у собакоподобных обезьян развивалась патология легких с характерными поражениями, и в течение 4-6 месяцев после инфицирования, в зависимости от дозы заражения, животные погибали от острой инфекции дыхательных путей. Более низкие дозы инфицирования могут приводить к возникновению хронических инфекций без развития заболевания, как это часто наблюдается у людей.

Протокол исследования.

В этом исследовании проводили прямое сравнение различных доз родительского штамма ВСС с дозами рекомбинантного ВСС, вводимых отдельно, или с последующим введением двух бустер-доз вакцины, содержащей последовательности, сверхэкспрессирующиеся в гВСС-конструкциях. Последние дозы могут быть введены в виде рекомбинантного белка в подходящей адъювантной композиции, в виде ДНК-конструкции или в виде Ай35-конструкций.

В первом исследовании оценивали протективную эффективность родительского штамма ВСС по сравнению с конструкциями гВСС, вводимыми без последующего применения бустер-инъекций. Это исследование, в котором участвовали три группы животных (по 10 животных в каждой группе), проводили в соответствии со следующим протоколом: одному животному из каждой группы вводили ВСС, гВСС и физиологический раствор. Двух животных из каждой группы подвергали кожному тесту на сверхэкспрессию антигенов в гВСС-конструкциях, а также с использованием стандартного НПД и физиологического раствора в качестве контроля. Явные и более крупные уплотнения у мышей гВССгруппы, наблюдаемые по сравнению с мышами ВСС-группы, указывали на то, что вакцина функционировала ίη νίνο и вырабатывала иммунный ответ. Остальных восемь животных из каждой группы иноку лировали аэрозолем, содержащим низкую дозу штамма М.1Ь Эрдмана, а уровень иммунного ответа определяли по снижению бактериальной нагрузки через 16 недель после заражения или по выживаемости как конечной цели исследования.

Протокол мониторинга ВСС-примирования был, по существу, аналогичен описанному выше, за исключением того, что животных сначала вакцинировали штаммом ВСС, штаммом гВСС и/или физиологическим раствором, а затем вводили две бустер-дозы со сверхэкспрессированными антигенами.

Исследования иммуногенности и иммунитета у приматов-моделей, не являющихся человеком, проводили в целях изучения иммунобиологических и иммунопатологических аспектов туберкулеза и оценки эффективности гВСС-конструкций у макак. Перед началом эксперимента неполовозрелых животных или молодых взрослых животных, содержащихся в неволе и имеющих среднюю массу 2-3 кг, подвергали длительной адаптации к условиям эксперимента. Исследования путем предварительной инокуляции предусматривали проведение основных анализов крови, которые включают рутинные гематологические анализы, анализы на скорость оседания эритроцитов, а также анализы на пролиферацию лимфоцитов. В качестве предварительной части исследования, т. е. перед инфицированием, проводили кожные тесты с использованием ППД для подтверждения отсутствия у животного чувствительности к туберкулину и рентгеновский анализ грудной клетки. Период иммунизации продолжался всего 21 неделю, в течение которых проводили первичную вакцинацию штаммом ВСС или гВСС на неделю 0 и бустер-инъекцию антигенов на недели 12 и 16. Антигенспецифический иммунитет оценивали путем определения уровня пролиферации и секреции интерферона γ (ΙΕΝ-γ) в тестах на стимуляцию лимфоцитов. Уровень продуцирования ΙΕΝ-γ лимфоцитами определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8РОТ) или клеточного сортинга с активацией флуоресценции (ЕАС8). Для этой цели брали пробы крови на недели 0, 4, 8, 12, 16 и 20 после первичной вакцинации.

Через 4-6 недель после последней иммунизации животных инокулировали путем интратрахеального введения 3 мл (1000 КОЕ) штамма М. 1иЬегси1о818 Эрдмана в один и тот же день и одного и того же препарата. Процесс инфицирования оценивали по потере массы, температуре, повышенной СОЭ, РГЗТ в

- 15 012182 ответ на ППД, пролиферативному ответу ίη νίίΐΌ МКПК, стимулированных ППД, и по уровню антигенов, сверхэкспрессируемых в гВСО, с последующим измерением уровней продуцирования ΙΕΝ-γ. Для детекции патологий, ассоциированных с туберкулезом легких, проводили рентгеновский анализ грудной клетки и, наконец, через 12-16 недель после инокуляции животных подвергали аутопсии.

Клиническая оценка ТБ-векторов и вакцин против ТБ

Исследования на безопасность и токсичность.

Преклинические исследования на безопасность и токсичность, разрешенные Регуляторными органами, проводили аналогично преклиническим исследованиям на безопасность и токсичность, описанным выше.

После этих исследований проводили исследования вакцин на безопасность для человека. Эти исследования сначала проводили с участием здоровых взрослых индивидуумов с отрицательным результатом теста на квантиферон, а затем аналогичные исследования проводили с участием детей и новорожденных.

Исследования на иммуногенность.

Исследования на иммуногенность у мышей и приматов могут быть проведены стандартными методами оценки клеточного иммунитета, такими как, но не ограничивающимися ими, методы оценки уровней ΙΕΝ-γ, ЕЫ8РОТ и/или проточная цитометрия с кратковременной и длительной стимуляцией антигеном или пептидом. Аналогичные методы были применены для оценки ответов у человека. Для оценки СЭ4- и СЭ8-ответов после вакцинации человека проводили исследования с использованием тетрамеров.

Оптимизация стратегий комбинированной иммунизации прайм-буст.

Штамм гВСО является достаточно эффективным при его использовании в качестве отдельно взятой вакцины против ТБ или других заболеваний, против которых он был сконструирован, причем этот штамм был сконструирован так, чтобы он экспрессировал соответствующие трансгены. Используемый здесь термин трансген означает ДНК-сегмент, функционально присоединенный к микобактериальному промотору и экспрессирующий нужный белок. Описанный здесь гВСО, служащий в качестве вакцины против ТБ или экспрессирующий трансгены для вырабатывания иммунитета против других заболеваний, также является исключительно эффективным для примирования иммунной системы в целях бустер-иммунизации рекомбинантными белками, смешанными с адъювантами или вирусными или бактериальными векторными антигенами. В преклинических исследованиях на животных и в исследованиях с участием человека первичное введение ВСО с последующей бустер-инъекцией рекомбинантного белка/адъюванта или вектора оптимизировали в отношении схемы и дозы введения. Эти прайм-буст-стратегии являются наиболее сильным средством для индуцирования иммунитета у человека, что обусловлено эффективностью первичного введения ВСО, как, в частности, описано в настоящем изобретении, а также локализацией и усилением бустер-ответа иммунной системы на введение рекомбинантного белка или вектора.

Исследование действия терапевтической вакцины на животных после их заражения.

Для выявления латентной инфекции использовали мышей С57ВБ/6, которым вводили терапевтические вакцины на той стадии, когда МйЬ-специфический иммунитет, индуцированный низкой дозой инфекции, вырабатывался лишь на очень незначительном уровне и на той стадии, когда МйЬ-специфический иммунитет был пониженным и основную его часть составляли лишь Т-клетки памяти. Затем через 2 и 5 месяцев после введения последней терапевтической вакцины эту терапевтическую вакцину оценивали на терапевтическую эффективность путем подсчета числа КОЕ в легких и селезенках отдельных мышей. Число КОЕ в группах мышей анализировали стандартными статистическими методами и полученные результаты использовали для того, чтобы определить, приводит ли терапевтическая вакцинация к значительному снижению латентной М1Ь-инфекции у мышей. Аналогичные методы, если необходимо, могут быть применены для оценки иммунных ответов у других животных.

Клиническая оценка ВСО-векторов: пероральное введение гВСО-вакцин.

Пероральная вакцинация нужного животного штаммом гВСО согласно изобретению может быть проведена описанными ранее методами (МШег е1 а1., Сап. Мей. Лккос. ί. 121(1): 45-54, 1979). Количество перорально вводимого гВСО может варьироваться в зависимости от вида индивидуума, а также от заболевания или состояния, подвергаемого лечению. В общих чертах, используемая доза может содержать примерно 10³-10^п жизнеспособных микроорганизмов, а предпочтительно примерно 10⁵-10⁹ жизнеспособных микроорганизмов.

гВСО обычно вводят вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Выбор какого-либо конкретного фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения. Примерами разбавителей являются забуференный фосфатом физиологический раствор, буфер для забуферивания против действия кислоты желудочного сока, продуцируемого в желудке, такой как цитратный буфер (рН 7,0), содержащий сахарозу, отдельно взятый бикарбонатный буфер (рН 7,0) (Ъеуте е1 а1., ί. С1т. 1пуеЧ.. 79: 888-902, 1987; апй В1аск е1 а1., ί. 1пГес1. Όίδ., 155: 1260-1265, 1987), или бикарбонатный буфер (рН 7,0), содержащий аскорбиновую кислоту, лактозу и, необязательно, аспартам (Ьеуте е1 а1., Ьапсе!, II: 467-470, 1988). Примерами носителей яв

- 16 012182 ляются белки, например, содержащиеся в сепарированном молоке, сахара, например сахароза или поливинилпирролидон. Обычно эти носители используются в концентрации, составляющей примерно 0,1-90% (мас./об.), а предпочтительно, в пределах 1-10% (мас./об.).

Пример 1. Эффективность родительских штаммов ВСО у морских свинок: исследование иммунитета, вырабатываемого у морских свинок штаммом гВСО 30.

В качестве примера исследований, проводимых с использованием имеющейся вакцины гВСО30, могут служить крупномасштабные исследования на морских свинках, целью которых является сравнение защитного действия двух лотов гВСО30 с защитным действие самого родительского штамма ВСО Т1се и других коммерчески доступных вакцин ВСО (штамма 881-1331), используемых во всем мире для вакцинации людей. Указанные два лота гВСО30, используемые для введения человеку, были получены либо в лабораторных условиях (гВСО30-ИСЬА), либо в условиях, соответствующих стандартизированным международным требованиям (ОМР), (гВСО30-КД).

Морских свинок (10 животных на группу) иммунизировали подкожным введением одной дозы 10³ КОЕ каждой из ВСО-вакцин. В данное исследование была включена группа негативного контроля (иммунизованная физиологическим раствором). Через 8 недель после вакцинации животных инокулировали вирулентным штаммом Эрдмана с помощью аэрозольного ингалятора после калибровки распылительного клапана аппарата Миддлбрука для воздушно-капельного введения в целях доставки в легкие приблизительно 10-15 бактерий. Животных умерщвляли на 10-ю неделю после заражения. При аутопсии у животных удаляли легкие и селезенку и определяли число жизнеспособных бактерий путем посева серийного 10-кратного разведения гомогенатов доли легких и селезенки на питательную среду Миддлбрука 7Н11. Через 21 день после инкубирования при 37°С в атмосфере 5% (об./об.) СО₂ подсчитывали образовавшиеся бактериальные колонии. Полученные данные выражали в виде 1од₁₀ среднего числа выделенных бактерий.

Полученные результаты (фиг. 2) показали, что по сравнению с негативным контролем, т.е. контролем с использованием физиологического раствора, все вакцины индуцировали иммунитет против М1Ьинфекции, при этом различия между этими вакцинами можно разделить на две группы:

1) гВСО30 (ИСЬА) и ВСО Дания 1331 имели более эффективное защитное действие и

2) ВСО (родительский штамм Т1се) и гВСО30 (к11) имели менее эффективное защитное действие.

Отсюда можно сделать вывод, что вакцина гВСО30 (ИСЬА), полученная в лабораторных условиях, но не имеющая ОМР-чистоту, в лучшем случае индуцировала более высокий уровень иммунитета, чем родительский штамм Т1се, либо она продуцировала иммунитет, лишь сравнимый с иммунитетом, вырабатываемым коммерчески доступной вакциной ВСО 881. Поэтому для достижения эффективности, превышающей эффективность вакцины ВСО Дания 1331, необходимо получить новую гВСО-вакцину.

Пример 2. Конструирование хозяев для их использования в качестве носителей экспрессионных векторов, не содержащих маркеров резистентности к антибиотикам.

Конструирование плазмиды для удаления гена 1еиЭ в ВСО штамме Дания 1331.

Левую и правую фланкирующие 1 т.п.н.-области гена 1еиЭ объединяли путем ДНК-синтеза (ΌΝΑ 2,0, СА) с получением 2 т.п.н.-сегмента ДНК с рас1-сайтами на обоих концах. Этот ДНК-фрагмент клонировали в вышеупомянутую плазмиду для аллельного обмена путем расщепления ферментом рестрикции Рас1 с последующим лигированием и получением плазмиды, не содержащей гена 1еиЭ.

Инактивация гена 1еиЭ путем аллельного обмена.

Инактивацию гена 1еиЭ осуществляли, как описано выше, за исключением того, что для культивирования штамма, не содержащего гена 1еиЭ, в среду добавляли 50 мкг/мл лейцина. Протокол главных стадий этой процедуры приводится на фиг. 4.

Подтверждение элиминации гена 1еиЭ.

Фенотипический тест.

Полученный штамм тестировали на зависимость его роста от присутствия лейцина. В частности, бактерии культивировали в среде 7Н9 с 10% 0АЭС и 0,05% (об./об.) тилоксапола в присутствии или в отсутствии 50 мкг/мл лейцина и мониторинг роста бактерий проводили путем измерения величины оптической плотности ОИ₆₀₀.

Анализ региональной геномной последовательности.

Геномную ДНК сконструированого штамма получали, как описано выше. Для ПЦР-амплификации использовали пары праймеров, комплементарных левому и правому 1 т.п.н.-флангам гена-мишени, и получали фрагмент хромосомы размером приблизительно 2 т.п.н. Этот ПЦР-продукт секвенировали для подтверждения отсутствия гена 1еиЭ в указанной области.

Пример 3. Сверхэкспрессия антигенов М1Ь в штаммах гВСО

Модификации ДНК.

Антигены М1Ь ТВ 10.4 (Ρν0288), Ад85В (К\'1886с) и Ад85А (К\'3804с) подвергали полицистронной экспрессии в указанном порядке с использованием промоторов Ад85В плюс Ρν3130 (Ногсхук е1 а1., см. выше, 2003). ДНК-последовательности, кодирующие пептид, имеющий последовательность КЭЕЬ, помещали в конец каждого антигена в качестве сигнала удерживания в эндоплазматическом ретикулуме в целях улучшения презентации каждого антигена. Кроме того, для гарантии стабильности транскриби- 17 012182 руемой полицистронной мРНК вводили 5'-петлевую структуру и 3'-последовательности терминации транскрипции. И, наконец, для фланкирования обоих концов в целях облегчения клонирования экспрессионного кластера в экспрессионный вектор использовали последовательности фермента рестрикции Рас1. Все ДНК в экспрессионном кластере получали путем генного синтеза (Р1со8сг1р( 1пс., ТХ). Экспрессионный кластер клонировали в экспрессионный вектор с использованием Рас1-сайтов. После амплификации в Е.со11 плазмиду расщепляли ферментом Ы6е1 для элиминации опЕ и гена резистентности к канамицину, а затем лигировали с получением однонаправленной челночной системы, которую затем вводили в ауксотрофный по 1еиЭ мутант МусоЬас!егшт в соответствии со стандартными процедурами электропорации (РапкЕ е! а1., М1сгоЬю1о§у, 145: 3497-3503, 1999). На фиг. 3 схематически представлен пример экспрессионного вектора, не содержащего гена резистентности к антибиотикам.

Экспрессия антигенов М.!Ь с использованием системы отбора без применения антибиотиков.

Аутотрофный по лейцину штамм ВСС Дания 1331, используемый в качестве хозяина для системы отбора без применения антибиотиков, культивировали в среде 7Н9, в которую были добавлены 10% ОАЭ (олеиновая кислота-альбумин-декстроза-каталаза), 0,05% (об./об.) тилаксопола и 50 мкг/мл лейцина. После электропорации рекомбинантные штаммы, содержащие антигенэкспрессирующую плазмиду, выделяли путем культивирования на планшетах со средой 7Н10 (ВО Όίίεο), не содержащей лейцин. Выживаемость бактерий зависит от присутствия антигенэкспрессирующего гена 1еиЭ в данной плазмиде, который, в свою очередь, функционирует как механизм сохранения плазмиды в клетках. Полученные отдельные колонии выделяли и культивировали в среде 7Н9, как описано выше, за исключением того, что в эту среду не добавляли лейцин.

Подтверждение экспрессии.

Экспрессию каждого антигена детектировали с помощью вестерн-блот-анализа. В частности, супернатант культуры собирали и обрабатывали, как описано ранее (НайЕ е! а1., 1пГес!. 1ттип. 65(6): 23212328, 1997). Затем экспрессируемые антигены выделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и осуществляли блоттинг с помощью антител против антигенов 85 А, 85В и 10.4. Уровень экспрессии каждого антигена определяли путем количественной оценки интенсивности каждой специфической полосы по сравнению с полосой, продуцируемой бактериальным хозяином, не содержащим экспрессионной плазмиды.

Пример 4. Экспрессия выбранных антигенов в микобактериях без применения отбора на резистентность к антибиотикам.

Материалы и методы.

Плазмидный и микобактериальный препарат для электропорации.

Рекомбинантную плазмидную ДНК выделяли и расщепляли рестриктирующей эндонуклеазой Ы6е1 (Яете Епд1ап6 Вю1аЬ§) в целях высвобождения маркера для отбора на резистентность к антибиотикам (например, резистентность к канамицину) и области ориджина репликации (опЕ) Е.соЕ. Затем расщепленный фрагмент плазмидной ДНК подвергали циркуляризации с использованием ДНК-лигазы Т4 (№\ν Епд1ап6 Вю1аЬ§) в соответствии с инструкциями производителя. Полученную плазмиду, содержащую ориджин репликации МусоЬас1епшп и выбранные антигены, но не содержащую гена резистентности к антибиотиками и не способную реплицироваться в грамотрицательных бактериях, вводили в выбранную МусоЬас!егшт. В целях приготовления МусоЬас1епшп для электропорации бактерии штамма ВСС Дания 1331 культивировали при 37°С до достижения экспоненциальной фазы роста в среде Миддлбрука 7Н9 (ΒΌ Вюкшепсек), в которую добавляли 10% ОАЭС. Для диспергирования бактерий использовали тилоксапол (0,05% об./об., ВекеагсЕ П1адпой1с8 Са! № 70400). Клетки три раза промывали 10% глицерином + 0,05% тилоксаполом для удаления культуральной среды, а затем проводили электропорацию. Для каждой процедуры электропорации использовали 1,6 мкг плазмиды на 1,25х10⁸ бактериальных клеток. Электропорацию проводили при 2,2 кВ, емкости 25 мкФ и сопротивлении 1,0 кОм. После электропорации клетки непосредственно высевали на планшеты с агаром Миддлбрука 7Н10 (ВО Вюкшепсек) в 10-кратных серийных разведениях и инкубировали при 37°С.

ПЦР-скрининг бактериальных колоний, содержащих экспрессионную плазмиду.

Рекомбинантные штаммы сначала скринировали с помощью ПЦР с использованием прямого праймера СТТААСССАСТССССТАТСС (8 ЕС) ГО N0: 1) и обратного праймера АТСССАССАСААССАСТАСА (8ЕО ГО N0: 2) для амплификации ДНК-последовательности области опМ в экспрессионной плазмиде. ПЦР осуществляли в следующем режиме:

стадия 1: при 95°С, 4 мин один цикл;

стадия 2: при 95°С, 1 мин, при 60°С, 1 мин, а затем при 72°С, 1 мин, всего 30 циклов;

стадия 3: при 72°С, 10 мин, один цикл;

стадия 4: хранение при 4°С.

Полученные ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле для подтверждения присутствия плазмиды в клетках.

- 18 012182

Результаты.

ПЦР, которая была разработана для амплификации области репликации (οτίΜ) указанной плазмиды, проводили в целях скрининга полученных колоний на присутствие сверхэкспрессирующей плазмиды. Поскольку эта область отсутствовала на бактериальной хромосоме, то присутствие этой области в клетках со всей очевидностью указывает на то, что такая плазмида была включена в клетки. Из всех скринированных колоний гВСС некоторые колонии продуцировали ПЦР-продукт, который по своему размеру был аналогичен положительному по данной плазмиде контрольному продукту, как было проанализировано с помощью гель-электрофореза. В противоположность этому родительские бактерии ВСС не продуцировали какого-либо ПЦР-продукта, как показано на фиг. 5. Этот эксперимент показал, что данная плазмида была успешно введена в МусоЬас!егшт и что бактериальный клон, содержащий указанную плазмиду, был выделен без отбора на резистентность к антибиотикам.

Обсуждение.

Стандартные плазмиды, используемые в рекомбинантных штаммах МусоЬас!егшш, содержат область репликации и селектируемый маркер (обычно ген резистентности к антибиотикам, например ген резистентности к канамицину или ген, который комплементирует метаболический дефект, например 1еиЭ или акб (Са1ап е! а1., Сепе, 94: 29, 1990) в качестве главных плазмидных элементов, которые используются в экспериментах с применением техники рекомбинантных ДНК. Обычно для отбора клонов, содержащих рекомбинантные плазмиды, используются антибиотики. Однако это может приводить к риску нежелательноого распространения генов резистентности к антибиотикам в тех случаях, когда резистентный к антибиотику генетически модифицированный микроорганизм предназначен для использования за пределами лабораторий, где не могут быть предприняты адекватные меры предосторожности.

В вышеописанном исследовании в бактерии согласно изобретению была введена рекомбинантная плазмида, которая обладала способностью экспрессировать антиген, но которая не содержала области опЕ и селектируемого маркера резистентности к антибиотику, и были успешно выделены клоны, содержащие указанную плазмиду, без применения отбора. Хотя в настоящем эксперименте в качестве области репликации плазмиды используется опМ, однако в этой связи следует отметить, что в качестве замены могут служить и другие области репликации плазмиды, такие как область репликации рМБ1 (Васйгасй е! а1., М1сгоЬ1о1., 146: 297, 2000). Уникальное преимущество этой системы заключается в том, что указанная рекомбинантная плазмида больше не содержит гена резистентности к антибиотикам. Таким образом, это позволяет избежать случайного распространения генов резистентности к антибиотикам в окружающую среду, как это обычно происходит в случае использования стандартных экспрессионных плазмид. Кроме того, экспрессионная плазмида, представляющая собой однонаправленный челночный вектор согласно изобретению, больше не способна реплицироваться в широком круге хозяев, поскольку из нее были удалены генетические элементы, ответственные за такую репликацию. Такое ограничение сообщает указанной рекомбинантной плазмиде второй уровень защиты, что значительно снижает риск, связанный с высвобождением генетически модифицированного (ГМО) микроорганизма в окружающую среду.

Хотя имеющиеся результаты показали, что рекомбинантные плазмиды можно вводить в аттенюированные штаммы МусоЬас!егшт без проведения отбора, однако следует отметить, что в стабильности плазмиды, не содержащей селектируемого маркера, в МусоЬас!егшт, определенную роль могут играть и другие факторы. Так, например, область репликации содержит гены, облегчающие репликацию плазмиды и опосредующие сегрегацию плазмиды в клетках-сибсах, что, тем самым, дает возможность идентифицировать клоны, содержащие указанную плазмиду, без проведения отбора.

Возможным фактором, позволяющим осуществлять выделение клонов, содержащих указанную плазмиду, без проведения отбора, является то, что в настоящем подходе используется более высокое отношение плазмиды к клетке. Использование более высокого отношения плазмиды к клетке приводит к увеличению вероятности того, что клетка будет поглощать данную плазмиду, и к снижению числа клеток, не содержащих эту плазмиду. В этом исследовании отношение плазмиды к клетке примерно в 10 раз превышает отношение, которое обычно используется в стандартных методах с применением системы отбора. Теоретически, чем больше отношение плазмиды к клетке, тем больше клонов будет содержать данную плазмиду, но это имеет место до тех пор, пока не будет достигнуто насыщение клетки данной плазмидой, после чего может происходить ингибирование поглощения плазмидной ДНК клетками, подвергнутыми электропорации. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения отношение плазмиды к бактериям составляет примерно от 0,5 до 10 мкг плазмидной ДНК к 1,25х10⁸ бактериальных клеток, а предпочтительно примерно от 1 до 5 мкг плазмидной ДНК к 1,25 х10⁸ бактериальных клеток.

Кроме того, антигены ТБ, которые сверхэкспрессируются плазмидой рЛБ105, могут играть важную роль в стабилизации плазмиды. Эта плазмида сверхэкспрессирует два белка антигенного комплекса 85 (Ад85А (Ву3804с) и Ад85В (Ву1886с)), которые обладают миколилтрансферазной активностью, необходимой для биосинтеза димиколата трегалозы, доминантной структуры, необходимой для сохранения целостности клеточной стенки. Поэтому возможно, что сверхэкспрессия по меньшей мере одного из этих антигенов может обеспечивать стабильность плазмиды, если она не содержит селектируемого маркера, при создании условий, благоприятствующих преимущественному продуцированию этих антигенов в

- 19 012182 клетках, содержащих такую плазмиду, что будет облегчать идентификацию клонов, содержащих данную плазмиду, без проведения отбора.

Claims (30)

1. Трансформированная бактерия или ее потомство, которые включают нуклеотидную последовательность, реплицирующуюся и экспрессирующуюся в указанной трансформированной бактерии или в ее потомстве, где указанная нуклеотидная последовательность не связана с селектируемым маркером, и где указанная нуклеотидная последовательность присутствует в плазмиде, и где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, необходимый для выживания, и где ген, кодирующий указанный необходимый для выживания белок, делетирован из бактериального генома указанной трансформированной бактерии.

2. Трансформированная бактерия или ее потомство, которые включают чужеродную нуклеотидную последовательность, реплицирующуюся и экспрессирующуюся в указанной трансформированной бактерии или в ее потомстве, где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность не связана с селектируемым маркером, и где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность присутствует в плазмиде, и где указанная плазмида содержит ген, кодирующий высвобождение из эндосомы, и где указанный ген, кодирующий высвобождение из эндосомы, может представлять собой чужеродную нуклеотидную последовательность, которая присутствует в указанной плазмиде или может присутствовать в указанной плазмиде в дополнение к чужеродной нуклеотидной последовательности, присутствующей в указанной плазмиде.

3. Трансформированная бактерия или ее потомство по п.2, где указанный ген, кодирующий высвобождение из эндосомы, представляет собой ген перфринголизина О (рГо) из С1ойпбшт рсгГппдсщ.

4. Трансформированная бактерия или ее потомство, которые включают чужеродную нуклеотидную последовательность, реплицирующуюся и экспрессирующуюся в указанной трансформированной бактерии или в ее потомстве, где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность не связана с селектируемым маркером, где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность присутствует в плазмиде и где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность кодирует антиген 85А, антиген 85В или антиген 85А/85В.

5. Трансформированная бактерия или ее потомство, которые включают чужеродную нуклеотидную последовательность, реплицирующуюся и экспрессирующуюся в указанной трансформированной бактерии или в ее потомстве, где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность не связана с селектируемым маркером, где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность присутствует в плазмиде и где указанная плазмида содержит ген, кодирующий белки, которые сохраняют и/или стабилизируют плазмиду.

6. Трансформированная бактерия или ее потомство по п.5, где указанный ген, кодирующий белки, кодирует антиген 85А, антиген 85В или антиген 85А/85В.

7. Трансформированная бактерия или ее потомство по п.2, где указанной бактерией является МусоЬас1етшт.

8. Трансформированная бактерия или ее потомство, которые включают чужеродную нуклеотидную последовательность, реплицирующуюся и экспрессирующуюся в указанной трансформированной бактерии или в ее потомстве, где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность не связана с селектируемым маркером, где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность кодирует апоптоз.

9. Трансформированная бактерия или ее потомство, которые включают чужеродную нуклеотидную последовательность, реплицирующуюся и экспрессирующуюся в указанной трансформированной бактерии или в ее потомстве, где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность не связана с селектируемым маркером, и где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность присутствует в плазмиде, и где указанная плазмида содержит ген, кодирующий апоптоз.

10. Трансформированная бактерия или ее потомство, которые включают чужеродную нуклеотидную последовательность, реплицирующуюся и экспрессирующуюся в указанной трансформированной бактерии или в ее потомстве, где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность не связана с селектируемым маркером и где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность не может реплицироваться в грамотрицательных бактериях.

11. Трансформированная бактерия или ее потомство по п.1, где указанной трансформированной бактерией является ауксотрофная бактерия.

12. Трансформированная бактерия или ее потомство по п.1, где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере частью однонаправленного челночного вектора.

13. Способ трансформирования бактерии, включающий стадию введения нуклеотидной последовательности, которая реплицируется и экспрессируется в указанной бактерии, где указанная нуклеотидная последовательность не связана с селектируемым маркером, и где указанная нуклеотидная последовательность присутствует в плазмиде, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует белок, необходимый для выживания, и где ген, кодирующий указанный необходимый для выживания белок,

- 20 012182 делетирован из бактериального генома указанной бактерии.

14. Способ по п.13. где указанную стадию введения осуществляют путем электропорации.

15. Способ по п.13. где указанная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере частью однонаправленного челночного вектора.

16. Трансформированная МусоЬас!егшт или ее потомство. содержащие чужеродную нуклеотидную последовательность. которая кодирует представляющий интерес белок. и где указанная трансформированная МусоЬас!егшт включает плазмиду. которая не способна реплицироваться в грамотрицательных бактериях.

17. Трансформированная МусоЬас!егшт или ее потомство по п.16. где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность является частью плазмиды.

18. Трансформированная МусоЬас!егшт или ее потомство по п.17. где указанная плазмида не содержит селектируемого маркера.

19. Трансформированная МусоЬас!егшт или ее потомство по п.17. где указанный белок является необходимым для выживания и соответствует белку выживания. который кодируется нуклеотидной последовательностью. делетированной из бактериального генома указанной трансформированной микобактерии.

20. Трансформированная МусоЬас!егшт или ее потомство по п.19. где указанным белком является 1еиО.

21. Трансформированная МусоЬас!егшт или ее потомство по п.19. дополнительно содержащие промоторные последовательности. которые активируются ш νί\Ό.

22. Трансформированная МусоЬас!епит или ее потомство по п.16. где указанная трансформированная МусоЬас!егшт является аттенюированной.

23. Трансформированная МусоЬас!егшт или ее потомство по п.22. где указанной трансформированной МусоЬас!егшт является ВСО.

24. Трансформированная МусоЬас!егшт или ее потомство по п.23. где указанный ВСО выбран из нижеследующих штаммов: ВСО1331. ВСО Пастер. ВСО Токио и ВСО Копенгаген.

25. Вакцина. включающая трансформированную МусоЬас!егшт или ее потомство. содержащие чужеродную нуклеотидную последовательность. которая кодирует представляющий интерес ген. и где указанная трансформированная МусоЬас!егшт включает плазмиду. которая не способна реплицироваться в грамотрицательных бактериях.

26. Трансформированная МусоЬас!егшт по п.16. где указанная трансформированная МусоЬас!егшт не обладает резистентностью к антибиотикам.

27. Трансформированная МусоЬас!егшт по п.16. где указанная трансформированная МусоЬас!егшт является ауксотрофной.

28. Вакцина по п.25. где указанная трансформированная МусоЬас!егшт не обладает резистентностью к антибиотикам.

29. Вакцина по п.25. где указанная трансформированная МусоЬас!егшт является ауксотрофной.

30. Способ трансформирования бактерии. включающий стадию введения чужеродной нуклеотидной последовательности. которая реплицируется и экспрессируется в указанной бактерии. где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность не связана с селектируемым маркером и где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность присутствует в плазмиде. где указанная чужеродная нуклеотидная последовательность не может реплицироваться в грамотрицательных бактериях.