KR20150084033A - 조건적으로 약독화된 박테리아 종 그리고 이의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

조건적으로 약독화된 박테리아 종 그리고 이의 제조 방법 및 이의 용도 Download PDF

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윌리엄 쥐. 한슨
저스틴 스코블
피터 엠. 라우어
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아두로 바이오테크, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 조건적으로 약독화된 박테리아 종, 그리고 이의 제조 방법 및 이의 용도를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "조건적으로 약독화된"은 박테리아가 이의 숙주 유기체의 외부에 있을 때 증식하여 성장하는 박테리아의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않지만, 박테리아가 이의 숙주 유기체로, 예를 들어 백신접종된 수혜자의 숙주 세포 내에 도입될 때 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자의 결실을 발생시키는 일련의 규정된 재조합 변형을 포함하는 박테리아를 의미한다. 이러한 재조합 변형은 포유동물 숙주 내에 유전자의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열의 이점을 취한다.

Description

조건적으로 약독화된 박테리아 종 그리고 이의 제조 방법 및 이의 용도{FACULTATIVELY ATTENUATED BACTERIAL SPECIES AND METHODS OF PREPARATION AND USE THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2012년 11월 6일자에 출원된 미국 가출원 제61/723,234호(본 명세서에 모든 표, 도면 및 특허청구범위를 포함하여 그 전문이 포함됨)의 이익을 청구한다.
본 발명의 배경기술의 하기 설명은 독자가 본 발명을 이해하는 것을 돕도록 단지 제공되고, 본 발명에 대한 선행 기술을 기술하거나 구성하는 것으로 인정되지 않는다.
병원균 유기체는 정의에 의하면 감염된 숙주에서 질병을 일으킬 수 있다. 이러한 유기체의 임상 사용을 위해, 감소한 또는 제거된 병원성(virulence)을 나타내지만, 관심 있는 병원균 또는 이종성 항원(들)에 대해 원하는 면역 반응을 자극하는 충분한 생존능력을 여전히 보유하는 약독화된(attenuated) 백신 균주가 대개 생성된다. 약독화된 벡터 플랫폼은 감염성 및 악성 질병을 포함하는 다수의 실험 모델에서 코딩된 이종성 항원에 특이적인 보호 반응을 유발하는 것으로 입증되었다.
가장 약독화된 백신 벡터가 바이러스이지만, 예방학적 및 치료학적 분야 둘 다를 위해 박테리아 백신 벡터 플랫폼이 개발되었다. 많은 그외 병원균 박테리아의 약독화된 균주가 현재 이용 가능하고, 재조합 균주를 생성하기 위한 조작 용이성은 감염성 질병 및 암과 관련된 항원과 같은 다수의 외래 단백질에 대한 효과적인 전달 비히클로서 박테리아를 사용하기 위한 수단을 제공한다. 생 약독화된 박테리아 백신 균주는 특히 리스테리아(Listeria), 에스체리치아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 락토바실루스(Lactobacillus) 및 예르시니아(Yersinia) 종으로부터 개발되었다.
이러한 백신 균주가 감소한 병원성을 나타낼 수 있지만, 이의 안전성은 특히 면역 손상 개체에서 여전히 우려스럽다. 박테리아 백신의 위험을 추가로 감소시키는 전략 중 일례는 소위 사멸되지만 대사상 활성(Killed But Metabolically Active)("KBMA")인 접근법이다. KBMA 백신 균주는 DNA 보수 유전자, 예컨대 uvrA 및 uvrB의 결실을 통한 뉴클레오타이드 절제 보수에 대한 역량을 무효화함으로써 작제된다. 유전자 결실은 소랄렌과 UVA의 조합 치료를 통해 박테리아가 광화학적 불활화에 정교하게 민감하게 한다. 형성된 소랄렌 유발 DNA 가교결합의 보수의 이의 불능으로 인해, KBMA 박테리아 균주는 복제할 수 없고 따라서 기능적으로 비감염성이다. 이 특징은 생 약독화된 균주와 비교하여 개선된 안전성 프로필을 제공한다. 그러나, 매우 제한된 수의 가교결합이 항원 발현 및 이의 면역 가능성을 포함하여 이의 대사 활성을 보존한다. 그러나, 가교결합의 수의 적정이 다수의 제어하기 어려운 변수에 따라 달라지므로, 지속적인 특징을 나타내는 KBMA 균주의 제조가 어려울 수 있다.
생 약독화된 백신에 적합하지 않은 위험-이익 프로필을 갖는 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 유리한 안전성 프로필을 갖는 약독화된 박테리아 백신 균주를 제공하고자 하는 수요가 당해 분야에서 여전하다.
본 발명은 조건적으로(facultatively) 약독화된 박테리아 종, 그리고 이의 제조 방법 및 이의 용도를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "조건적으로 약독화된"은 박테리아가 이의 숙주 유기체의 외부에 있을 때 증식하여 성장하는 박테리아의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않지만, 박테리아가 이의 숙주 유기체로, 예를 들어 백신접종된 수혜자의 숙주 세포 내에 도입될 때 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자의 결실을 발생시키는 일련의 규정된 재조합 변형을 포함하는 박테리아를 의미한다. 이 재조합 변형은 포유동물 숙주 내에 유전자의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열의 이점을 취한다.
하기 기재된 바대로, 박테리아는 가장 바람직하게는 세포내 병원균, 예컨대 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)이다.
본 발명의 제1 양상에서, 본 발명은 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자를 박테리아 게놈에서 결실시키기 위한 박테리아를 구성하는 방법에 관한 것이고, 결실은 박테리아가 숙주로 도입될 때 우선적으로 발생한다. 상기 방법은
(ⅰ) 박테리아로 박테리아에 이종성(heterologous)인 재조합효소(recombinase)를 코딩하는 핵산을 재조합으로 도입하는 단계로서, 재조합효소를 코딩하는 핵산은 포유동물 숙주 세포에서 재조합효소의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열에 작동적으로 연결된 것인 단계, 및
(ⅱ) 박테리아 게놈으로 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들)로부터의 상류에 재조합효소에 대한 제1 부착 부위를 재조합으로 도입하고 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들)로부터의 하류에 재조합효소에 대한 제2 부착 부위를 재조합으로 도입하는 단계를 포함한다.
재조합효소는, 포유동물 숙주 세포에서 특이적으로 유도되고 발현될 때, 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위에 의해 플랭킹된(flanked) 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들)를 결실시키는 부위 특이적 재조합 사건(site specific recombination event)을 촉진시킨다. 이 부위 특이적 재조합 사건 후, 박테리아는 증식이 결핍된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 구절 "증식하여 성장하는 박테리아의 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는"은, 콜로니 형성이 그외에 동일하지만, 상기 기재된 규정된 재조합 변형이 결여된 박테리아의 적어도 75%인 박테리아를 의미한다. 편의상, 재조합으로 도입된 재조합효소 서열 및 재조합으로 도입된 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위가 결여된 이러한 박테리아는 본 명세서에서 "야생형" 박테리아라 칭한다. 바람직한 실시형태에서, 콜로니 형성은 야생형 박테리아의 적어도 80%, 더 바람직하게는 야생형 박테리아의 적어도 90%, 가장 바람직하게는 야생형 박테리아의 적어도 95%이다. 콜로니 형성은 실험실내 콜로니 형성 검정에서 결정되고 콜로니 형성 단위(colony-forming unit: CFU)로 표시된다.
유전자(또는 유전자들)와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바대로 용어 "증식에 필수적인"은, 결실될 때, 콜로니 형성이 야생형의 1% 이하로 감소하고/하거나 유기체에 함유된 숙주 세포에서의 (CFU로 측정된) 박테리아의 성장이 야생형에 비해 적어도 1000배 감소한 박테리아를 생성시키는 유전자를 의미한다. 바람직하게는, 콜로니 형성은 야생형의 0.01% 이하로 감소한다. 이러한 유전자(또는 유전자들)가 결실된 박테리아는 본 명세서에서 "증식이 결핍"되었다고 칭한다.
본 발명의 맥락에서, 증식에 필수적인 유전자(또는 유전자들)의 결실은 박테리아가 숙주 유기체로 도입될 때 우선적으로 발생한다. 본 명세서에서 사용되는 바대로 결실 사건은, 숙주 유기체로의 박테리아의 도입이 콜로니 형성이 야생형 박테리아의 적어도 75%인 박테리아를 콜로니 형성이 야생형의 1% 이하로 감소한 박테리아로 전환시킬 때, "숙주에서 우선적으로" 발생한다. 바람직하게는, 콜로니 형성은 야생형의 0.01% 이하로 감소한다.
용어 "숙주 세포에서 재조합효소의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열"은 이의 제어 하에 유전자의 발현을 숙주 유기체로의 박테리아의 도입 시 적어도 10배로 유도하는 조절 서열을 의미한다. 오직 예의 방식으로, 리스테리아의 actA 프로모터 하의 유전자의 발현은 전사 활성화에 대해 PrfA로 공지된 조절 인자에 따라 달라진다. 브로쓰 성장된 리스테리아에 비해, actA/PrfA 제어 하의 유전자 발현은 리스테리아가 숙주 세포에 존재할 때 대략 200배 유도된다. 따라서, 소정의 실시형태에서 조절 서열은 PrfA 의존적인 리스테리아 모노사이토게네스 프로모터를 포함한다. PrfA 의존적 프로모터는 inlA 프로모터, inlB 프로모터, inlC 프로모터, hpt 프로모터, hly 프로모터, plcA 프로모터, mpl 프로모터 및 actA 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 박테리아 종에 대해 숙주 유기체에서 유전자 발현을 유도하기 위한 유사한 시스템은 하기 기재되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 우선적으로 유도된 발현은 숙주 유기체로의 박테리아의 도입 시 적어도 50배, 더 바람직하게는 적어도 100배, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 1000배 증가한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 유기체"는 본 명세서에서 기재된 바대로 증식에 필수적인 유전자(또는 유전자들)의 결실의 부재 하에 관심 있는 박테리아가 증식할 수 있는 유기체를 의미한다. 소정의 실시형태에서, 숙주 유기체는 포유동물 종, 가장 바람직하게는 인간이다. 또한, 소정의 실시형태에서, 박테리아는 세포내 병원균이고, 조절 서열은 박테리아가 포유동물 숙주 세포에 있을 때 재조합효소의 발현을 우선적으로 유도한다. 바람직한 박테리아 속은 리스테리아, 나이세리아(Neisseria), 마이코박테륨(Mycobacterium), 프란시셀라(Francisella), 바실루스(Bacillus), 살모넬라, 쉬겔라, 예르시니아, 브루셀라(Brucella), 레지오넬라(Legionella), 리케치아(Rickettsia) 및 클라미디아(Chlamydia)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 목록은 제한인 것으로 의도되지 않는다. 가장 바람직하게는, 박테리아는 조건적 세포내 박테리아, 예컨대 리스테리아, 살모넬라, 쉬겔라, 프란시셀라, 마이코박테륨, 레지오넬라, 부르크홀데리아(Burkholderia) 및 브루셀라이다. 하기 기재된 소정의 예시적인 실시형태에서, 박테리아는 변형된, 예컨대 리스테리아 모노사이토게네스 ΔActA/ΔInlB(네이티브 ActA 및 InlB 유전자가 결실되거나 돌연변이에 의해 기능적으로 결실된 엘. 모노사이토게네스)를 포함하는 리스테리아 모노사이토게네스이다.
상기 기재된 바대로, 박테리아로 재조합으로 도입된 재조합효소 서열은 박테리아에 이종성이다. 본 명세서에서 사용된 바대로, 이 용어는 박테리아 게놈의 정상 성분이 아닌 재조합효소를 의미한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소는 φC31 인테그라제, R4 인테그라제, TP901 인테그라제, φBT1 인테그라제, BxB1 인테그라제, PSA 인테그라제, Cre 재조합효소, Flp 재조합효소, XerC 재조합효소, λ 인테그라제, HK022 인테그라제, P22 인테그라제, HP1 인테그라제, L5 인테그라제, γδ 재조합효소, Tn3 재조합효소, gin 재조합효소, RV 인테그라제, SPBc 인테그라제, TG1 인테그라제, φC1 인테그라제, MR11 인테그라제, φ370 인테그라제, φK38 인테그라제, Wβ 인테그라제 및 BL3 인테그라제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 적합한 재조합효소 부착 부위는 재조합으로 도입된 attB 및 attP 부위를 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들)는 DNA 복제에 관여하는 적어도 하나의 유전자를 포함한다. 이러한 유전자는 ori, dnaA, dnaN, gyrA, gyrB, polC, dnaE, ftsK, ftsZ, ligA, dnaG, parC, parE, holB, dnaX, SMC 및 ftsY로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
하기 기재된 바대로, 박테리아의 증식에 필수적인 복수의 유전자는 대개 단일 오페론으로서 함께 그룹화된다. 이러한 경우에, 제1 부착 부위는 우선적으로 오페론의 부분의 상류에 재조합으로 도입되고, 제2 부착 부위는 오페론의 부분의 하류에 재조합으로 도입될 수 있어서, 부위 특이적 재조합 사건은 단일 사건에서 복수의 이러한 유전자를 결실시킨다. 바람직하게는, 제1 부착 부위는 오페론의 상류에 있고, 제2 부착 부위는 오페론의 하류에 있다. 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위는 약 20kb 이하의 길이, 약 10kb 이하의 길이 및 약 6kb의 길이의 핵산 서열을 플랭킹할 수 있다. 이 문맥에서 용어 "약"은 소정의 길이의 +/- 10%를 의미한다.
소정의 실시형태에서, 예를 들어 이 유전자로부터 발현된 이종성 단백질에 대해 면역 반응을 생성할 목적으로, 박테리아는 박테리아에 이종성인 하나 이상의 유전자를 발현하기 위한 발현 플랫폼으로서 사용된다. 이 실시형태에서, 박테리아는 박테리아 게놈 내에 이종성 폴리펩타이드(들)를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함할 수 있고, 외인성 핵산 서열은 박테리아가 포유동물 숙주에 있을 때 이종성 폴리펩타이드의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열에 작동적으로 연결된다.
관련 양상에서, 본 발명은 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자를 박테리아 게놈에서 결실시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 재조합효소가 박테리아에 의해 발현되고, 발현된 재조합효소가 부위 특이적 재조합 사건에 의해 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자를 결실시키는 조건 하에 본 명세서에 기재된 조건적으로 약독화된 박테리아를 숙주 유기체 숙주로 도입하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조건적으로 약독화된 박테리아, 또는 이의 집단, 예컨대 박테리아 배양물에 관한 것이다. 이러한 박테리아는 하기를 포함한다:
(ⅰ) 박테리아에 이종성인 재조합효소를 코딩하는 핵산(여기서, 재조합효소를 코딩하는 핵산은 숙주에서 재조합효소의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열에 작동적으로 연결됨), 및
(ⅱ) 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들)로부터의 상류에 있는 재조합효소에 대한 제1 부착 부위 및 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들)로부터의 하류에 있는 재조합효소에 대한 제2 부착 부위(여기서, 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위는 작동적으로 연결되어, 재조합효소는, 포유동물 숙주에서 발현될 때, 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위에 의해 플랭킹된 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들)를 결실시키는 부위 특이적 재조합 사건을 촉진시킴).
상기 기재된 바대로, 소정의 실시형태에서 박테리아는 세포내 병원균이고, 가장 바람직하게는 조건적 세포내 박테리아이고, 조절 서열은 박테리아가 포유동물 숙주 세포에 있을 때 재조합효소의 발현을 우선적으로 유도한다. 적합한 박테리아는 리스테리아, 나이세리아, 마이코박테륨, 프란시셀라, 바실루스, 살모넬라, 쉬겔라, 예르시니아, 브루셀라, 레지오넬라, 리케치아 및 클라미디아로 이루어진 군으로부터 선택된 속이다. 이 목록은 제한인 것으로 의도되지 않는다. 가장 바람직하게는, 박테리아는 조건적 세포내 박테리아, 예컨대 리스테리아, 살모넬라, 쉬겔라, 프란시셀라, 마이코박테륨, 레지오넬라, 부르크홀데리아 및 브루셀라이다. 하기 기재된 소정의 예시적인 실시형태에서, 박테리아는 변형된, 예컨대 리스테리아 모노사이토게네스 ΔActA/ΔInlB를 포함하는 리스테리아 모노사이토게네스이다. 소정의 실시형태에서, 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들)는 DNA 복제에 관여하는 적어도 하나의 유전자를 포함한다. 이러한 유전자는 ori, dnaA, dnaN, gyrA, gyrB, polC, dnaE, ftsK, ftsZ, ligA, dnaG, parC, parE, holB, dnaX, SMC 및 ftsY로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한 상기 기재된 바대로, 박테리아로 재조합으로 도입된 재조합효소 서열은 박테리아에 이종성이다. 본 명세서에서 사용되는 바대로, 이 용어는 박테리아 게놈의 정상 성분이 아닌 재조합효소를 의미한다. 다양한 실시형태에서, 재조합효소는 φC31 인테그라제, R4 인테그라제, TP901 인테그라제, φBT1 인테그라제, BxB1 인테그라제, PSA 인테그라제, Cre 재조합효소, Flp 재조합효소, XerC 재조합효소, λ 인테그라제, HK022 인테그라제, P22 인테그라제, HP1 인테그라제, L5 인테그라제, γδ 재조합효소, Tn3 재조합효소, gin 재조합효소, RV 인테그라제, SPBc 인테그라제, TG1 인테그라제, φC1 인테그라제, MR11 인테그라제, φ370 인테그라제, φK38 인테그라제, Wβ 인테그라제 및 BL3 인테그라제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 적합한 재조합효소 부착 부위는 재조합으로 도입된 attB 및 attP 부위를 포함할 수 있다.
하기 기재된 바대로, 박테리아의 증식에 필수적인 복수의 유전자는 대개 단일 오페론으로서 함께 그룹화된다. 이 경우에, 제1 부착 부위는 우선적으로 오페론의 부분의 상류에 재조합으로 도입되고, 제2 부착 부위는 오페론의 부분의 하류에 재조합으로 도입될 수 있어서, 부위 특이적 재조합 사건은 단일 사건에서 복수의 이러한 유전자를 결실시킨다. 바람직하게는, 제1 부착 부위는 오페론의 상류에 있고, 제2 부착 부위는 오페론의 하류에 있다. 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위는 약 20kb 이하의 길이, 약 10kb 이하의 길이, 약 6kb의 길이, 또는 숙주 세포에서 박테리아의 증식을 불활화하기에 충분한 임의의 길이의 핵산 서열을 플랭킹할 수 있다. 이 맥락에서 용어 "약"은 소정의 길이의 +/- 10%를 의미한다.
예를 들어 이 유전자로부터 발현된 이종성 단백질에 대해 면역 반응을 생성할 목적으로, 본 발명의 박테리아는 박테리아에 이종성인 하나 이상의 유전자를 발현하기 위한 발현 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 이 실시형태에서, 박테리아는 박테리아 게놈 내에 이종성 폴리펩타이드를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함할 수 있고, 외인성 핵산 서열은 박테리아가 포유동물 숙주에 있을 때 이종성 폴리펩타이드의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열에 작동적으로 연결된다.
도 1. Lm-RIID의 도식적 표시. (A) 브로쓰 배양 또는 발효에서, Lm-RIID는 재조합효소를 발현하지 않아서, 백신의 성장 및 제조를 허용한다. (B) 백신접종 후, Lm-RIID는 수지상 세포에 진입하고, 여기서 이것은 박테리아 사멸을 발생시키는 재조합효소 및 특이적 면역원성을 발생시키는 백신 항원을 동시에 발현한다.
도 2. Lm-RIID 균주에서 결실된 구역의 개요
도 3. 결실 1. (A) 자이레이즈(gyrase) 구역(yaaA, recF, gyrB, gyrA)을 플랭킹하는 Lox 재조합효소 부위; (B) 브로쓰 배양에서의 성장 곡선; (C) DC2.4 세포에서의 세포내 성장 곡선.
도 4. 결실 2. (A) lmo2587, 기원, dnaA, dnaN 및 lmo0003을 플랭킹하는 Lox 재조합효소 부위; (B) BHI 브로쓰에서의 성장 곡선; (C) DC2.4 세포에서의 세포내 성장 곡선.
도 5. 결실 3. (A) lmo2582-기원-gyrA 구역을 플랭킹하는 Lox 재조합효소 부위; (B) BHI에서의 실험실내 성장 곡선; (C) DC2.4 세포에서의 세포내 성장 곡선.
도 6. 결실 4. (A) 자이레이즈 구역(yaaA, recF, gyrB, gyrA)을 플랭킹하는 Frt 재조합효소 부위; (B) BHI에서의 실험실내 성장 곡선; (C) DC2.4 세포에서의 세포내 성장 곡선.
도 7. 생 약독화된 (Lm11) 및 Lm-RIID (BH3618) 플랫폼으로부터의 다양한 항원의 세포내 발현의 비교. A-D: Lm11 또는 BH3618 균주 배경에서의 균주의 4개 쌍의 세포내 웨스턴 블롯. (A) 1 레인: 생 Lm 균주 Lm11; 2 레인: Lm-RIID 균주 BH3618; 첨가된 항원이 없는 플랫폼 균주. (B) 3 레인: 생 Lm 균주 BH3943; 4 레인: Lm-RIID 균주 BH3953; 항원: ActAN100-Ny-ESO-1-MAGE A3 융합 단백질(<). (C) 5 레인: 생 Lm 균주 BH3947; 6 레인: Lm-RIID 균주 BH3957; 항원: ActAN100-HBV 중합효소-HBxAg 융합 단백질(*). (D) 9 레인: 생 Lm 균주 BH3951; 10 레인: Lm-RIID 균주 BH3961; 항원: ActAN100-플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum) CSP 융합 단백질(◀).
도 8. 면역 적격 및 면역 결핍 마우스에서의 Lm-RIID 균주의 가속된 청소율 및 안전성.
도 9. Lm-RIID 균주의 면역원성. 빈 원형: 비자극됨; 회색: 상기 기재된 펩타이드로 자극됨.
도 10. 이종성 시험 감염에 대한 보호 면역. (A) 생 약독화된, KBMA 및 Lm-RIID 균주에 의한 WT-Lm 시험 감염으로부터의 보호. (B) 생 약독화된, KBMA 및 Lm-RIID 균주를 갖는 WT 백시니아 바이러스에 의한 이종성 시험 감염으로부터의 보호.
도 11. CT-26 종양 모델에서의 Lm-RIID 백신의 치료학적 효율.
본 발명은 조건적으로 약독화된 박테리아 종을 제조하고 이를 사용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 생 약독화된 백신에 적절하지 않은 위험-이익 프로필을 갖는 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 유리한 안전성 프로필을 갖는 약독화된 박테리아 백신 균주를 제공할 수 있다.
리스테리아 모노사이토게네스와 관련하여 하기 자세히 기재되어 있지만, 당업자는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물이 일반적으로 박테리아 종, 특히 조건적 세포내 박테리아 종에 적용 가능하다는 것을 이해할 것이다.
리스테리아 모노사이토게네스(Lm)는 백신 코딩된 Ag에 특이적인 튼튼하고 매우 기능적인 CD4 및 CD8 T 세포 면역을 발생시키는 심오한 선천성 면역 반응을 유도하는 이의 능력을 특징으로 하는 조건적 세포내 박테리아이다. Lm은 암 또는 다른 바이러스 유발 면역 결핍을 앓는 환자, 임산부, 노인 및 유아를 포함하는 면역 손상 개체 중에서 병원성이 증가한 식품 매개 박테리아이다.
선택된 표적화된 병원균 물질 또는 악성도와 관련하여 지정된 항원(들)을 코딩하도록 조작된 생 약독화된 재조합 Lm 백신 플랫폼은 몇몇 인간 임상 실험을 위한 기초를 형성한다. 특히, 마우스 리스테리아증 모델에서 2개의 병원성 유전자가 결실되고 3 초과 로그로 약독화된 유전적으로 규정된 생 약독화된 Lm ΔactAΔinlB는 이의 면역학적 효력을 보유하고, 인간 질병의 마우스 모델 및 인간 둘 다에서 강건한 CD4 및 CD8 T 세포 면역을 유도하는 것으로 나타났고, 다양한 고형 종양 악성도를 갖는 환자 중에서 임상 설정에서 안전하고 매우 관용적인 것으로 나타났다.
원하는 CD8 T 세포 반응을 프라이밍하기 위해, Lm계 백신은 리스테리올리신 O(LLO)로 공지된 기공 형성 사이톨리신의 발현에 의해 매개된 과정에서 감염된 수지상 세포(DC)의 액포로부터 탈출하는 능력을 보유해야 하고, 원하는 항원은 세포질에서 발현되고 박테리아로부터 선택되도록 조작되고, 세포질에서 이것은 이후 처리되고 MHC I형 분자에 제시된다. 따라서, 불활화된 Lm 백신, 예컨대 열에 의해 불활화된 것(열 사멸된 Lm; HKLM)은 대사상 활성이 아니고, 종양 보유 동물에서 백신 면역원을 함유하고 효율을 부여하는 병원균에 의한 시험 감염을 효과적으로 보호할 수 있는 원하는 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 없다. 이 이분법은 분야에서 널리 공지되어 있고, 생 약독화된 Lm 백신 플랫폼에 필적하는 면역학적 효력을 보유하지만, HKLM의 안전성을 갖는 Lm 백신 플랫폼을 개발하는 백신학자에 대한 도전을 나타낸다.
본 명세서에서 재조합효소 유도된 세포내 사멸(Lm-RIID)이라 칭하는 조건적으로 약독화된 Lm은 안전하고 면역학적으로 강력한 Lm계 백신 플랫폼에 대한 수요를 해결하기 위해 개발되고 있다. Lm-RIID 백신은 현재 관심 있는 백신 항원을 발현하고, Lm 백신 균주가 숙주 세포의 시토졸을 탈출한 후 박테리아 생존능력에 필수적인 유전자의 결실을 유도한다. Lm-RIID 백신은 생 약독화된 Lm 백신, 예컨대 Lm ΔactA ΔinlB계 백신과 동일한 특성을 갖는 브로쓰 배양에서 성장하지만, 일단 숙주 세포 내에서 자살을 실행한다. 필수 표적 Lm 유전자를 재조합효소(예를 들어, loxP) 부위와 플랭킹하고, 숙주 유기체에서, 이 경우에 숙주 세포질에서 특이적으로 유도된 프로모터로부터 서열 특이적 재조합효소(예를 들어, Cre 재조합효소)의 발현 및 백신 항원 발현을 추진함으로써 이를 성취한다. 이는 심지어 숙주 동물에서 정맥내 투여될 때 자기 제한 감염을 발생시킨다. 하기 기재된 바대로, Lm-RIID 백신은 이전에 기재된 생 약독화된 Lm 백신 균주, 예를 들어 Lm ΔactAΔinlB로부터 유래할 수 있다. ActA 단백질의 발현은 브로쓰 배양과 비교하여 감염된 숙주 포유동물 세포로 200배 초과 유도된다. 그러나, PrfA 의존적 actA 프로모터는 브로쓰 배양에서 실질적으로 유도되지 않는다. Lm-RIID 백신은 생 약독화된 Lm 백신, 예컨대 Lm ΔactA Δ inlB 균주의 성장을 위해 사용된 동일한 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명이 하기 설명에 기재되거나 도면에 예시된 성분의 구성 및 배열의 상세한 설명에 이의 적용에서 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 기재되고 다양한 방식으로 실행되고 수행되는 것 이외에 구현할 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 어법 및 전문용어, 및 요약서가 설명의 목적이고 제한으로 간주되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다.
그러므로, 당해 분야의 당업자는 본 개시내용이 기초하는 개념이 본 발명의 몇몇 목적을 실행하기 위한 다른 구조, 방법 및 시스템을 설계하기 위한 기초로서 용이하게 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 특허청구범위가 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 한 이러한 균등한 구성을 포함하는 것으로 간주된다는 것이 중요하다.
1. 정의
유전자에서의 돌연변이, 또는 유전자를 포함하는 박테리아에서의 돌연변이를 표시하도록 사용된 약어는 하기와 같다. 예의 방식으로, 약어 "엘. 모노사이토게네스 Δa c tA"는 actA 유전자의 일부 또는 모두가 결실된다는 것을 의미한다. 델타 기호(Δ)는 결실을 의미한다. 어깨 글자 마이너스 기호를 포함하는 약어(리스테리아 ActA-)는 actA 유전자가, 예를 들어, 결실, 점 돌연변이, 또는 틀이동 돌연변이에 의해 돌연변이된다는 것을 의미한다(그러나, 이러한 유형의 돌연변이로 제한되지는 않음).
"투여"는, 인간, 포유동물, 포유동물 대상체, 동물, 수의학 대상체, 위약 대상체, 조사 대상체, 실험 대상체, 세포, 조직, 장기, 또는 생물학적 유체에 적용되면서, 제한 없이 대상체, 세포, 조직, 장기, 또는 생물학적 유체 등과의 외인성 리간드, 시약, 위약, 소분자, 약제학적 물질, 치료학적 물질, 진단 물질, 또는 조성물의 접촉을 의미한다. "투여"는 예를 들어 치료학적, 약동학적, 진단학적, 조사, 위약 및 실험 방법을 의미할 수 있다. 세포의 치료는 세포와의 시약의 접촉, 및 유체와의 시약의 접촉을 포괄하고, 유체는 세포와 접촉한다. "투여"는 또한 예를 들어 시약, 진단학적, 결합 조성물, 또는 다른 세포에 의한 세포의 실험실내 및 생체외 치료를 포괄한다.
"효현제"는, 리간드 및 수용체와 관련되면서, 수용체를 자극하는 분자, 분자의 조합, 복합체, 또는 시약의 조합을 포함한다. 예를 들어, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 효현제는 GM-CSF, GM-CSF의 뮤테인 또는 유도체, GM-CSF의 펩타이드 모방체, GM-CSF의 생물학적 기능을 모방하는 소분자, 또는 GM-CSF 수용체를 자극하는 항체를 포함할 수 있다.
"길항제"는, 리간드 및 수용체와 관련되면서, 수용체를 억제하고/하거나 상호작용하고/하거나, 하향조절하고/하거나 탈감작화하는 분자, 분자의 조합, 또는 복합체를 포함한다. "길항제"는 수용체의 구성적 활성을 억제하는 임의의 시약을 포함한다. 구성적 활성은 리간드/수용체 상호작용의 존재 하에 나타나는 것이다. "길항제"는 또한 수용체의 자극된(또는 제어된) 활성을 억제하거나 방지하는 임의의 시약을 포함한다. 예의 방식으로, GM-CSF 수용체의 길항제는, 임의의 제한을 의미하지 않으면서, 리간드(GM-CSF)에 결합하여 이것이 수용체에 결합하는 것을 방지하는 항체, 또는 수용체에 결합하여 리간드가 수용체에 결합하는 것을 방지하는 항체를 포함하거나, 항체는 불활성 입체구성의 수용체를 잠근다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "유사체" 또는 "유도체"는, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 관련되어, 원래의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 유사하거나 동일한 기능을 보유하지만, 원래의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 유사하거나 동일한 아미노산 서열 또는 구조를 반드시 포함하는 것은 아닌 다른 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 유사체는 바람직하게는 하기 중 적어도 하나를 만족시킨다: (a) 원래의 아미노산 서열과 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질성 물질, (b) 엄격한 조건 하에 원래의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 단백질성 물질; 및 (c) 원래의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 단백질성 물질.
"항원 제시 세포"(APC)는 T 세포에 항원을 제시하도록 사용되는 면역계의 세포이다. APC는 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 변연부 쿠퍼(Kupffer) 세포, 미세아교세포, 랑게르한스 세포, T 세포 및 B 세포를 포함한다. 수지상 세포는 적어도 2개의 계통에서 발생한다. 제1 계통은 프레-DC1, 골수성 DC1 및 성숙 DC1을 포함한다. 제2 계통은 CD34+CD45RA- 초기 전구세포 다능성 세포, CD34+CD45RA+ 세포, CD34+CD45RA+CD4+ IL-3Rα+ 프로-DC2 세포, CD4+CD11c- 형질세포 모양 프레-DC2 세포, 림프성 인간 DC2 형질세포 모양 유래 DC2 및 성숙 DC2를 포함한다.
"약독화" 및 "약독화된"은 숙주에 대한 독성을 감소시키도록 변형된 감염성 유기체 등에서의 박테리아, 바이러스, 기생충, 감염성 유기체, 프리온, 종양 세포, 유전자를 포함한다. 숙주는 인간 또는 동물 숙주, 또는 장기, 조직, 또는 세포일 수 있다. 박테리아는, 비제한적인 예를 제공하면서, 숙주 세포에 대한 결합을 감소시키기 위해, 하나의 숙주 세포로부터 다른 숙주 세포로의 확산을 감소시키기 위해, 세포외 성장을 감소시키기 위해, 또는 숙주 세포에서의 세포내 성장을 감소시키기 위해 약독화될 수 있다. 약독화는 예를 들어 독성, LD50, 장기로부터의 청소율의 지표(indicum) 또는 표시, 또는 경쟁 지수를 측정함으로써 평가될 수 있다(참조, 예를 들어, Auerbuch, et al. (2001) Infect. Immunity 69:5953-5957). 일반적으로, 약독화는 적어도 25%; 더 일반적으로 적어도 50%; 가장 일반적으로 적어도 100%(2배); 보통 적어도 5배; 더 보통 적어도 10배; 가장 보통 적어도 50배; 대개는 적어도 100배; 더 대개는 적어도 500배; 가장 대개는 적어도 1000배; 일반적으로 적어도 5000배; 더 일반적으로 적어도 10,000배; 가장 일반적으로 적어도 50,000배; 가장 대개는 적어도 100,000배로 LD50의 증가 및/또는 청소율의 증가를 발생시킨다.
"약독화된 유전자"는 숙주에 대한 독성, 병리학, 또는 병원성, 숙주 내의 성장, 또는 숙주 내의 생존(여기서, 유전자는 독성, 병리학, 또는 병원성을 완화시키거나, 감소시키거나, 제거하는 방식으로 돌연변이됨)을 매개하는 유전자를 포함한다. 감소 또는 제거는 돌연변이된 유전자에 의해 매개된 병원성 또는 독성을 비돌연변이된(또는 모) 유전자에 의해 매개된 것과 비교함으로써 평가될 수 있다. "돌연변이된 유전자"는 유전자의 조절 구역, 유전자의 코딩 구역, 유전자의 비코딩 구역, 또는 이들의 임의의 조합에서의 결실, 점 돌연변이 및 틀이동 돌연변이를 포함한다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정한 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 아미노산 서열, 또는 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 의미한다. 보존적 치환의 예는 하기 그룹 중 하나에서의 동일한 그룹의 다른 아미노산에 대한 아미노산의 교환이다(미국 특허 제5,767,063호(리(Lee) 등에 허여; Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132).
(1) 소수성: 노르류신, Ile, Val, Leu, Phe, Cys, Met;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe; 및
(7) 작은 아미노산: Gly, Ala, Ser.
"유효량"은, 제한 없이, 의학 병증 또는 장애의 증상 또는 징후를 경감시키거나, 역전시키거나, 완화시키거나, 예방하거나, 진단할 수 있는 양을 의미한다. 달리 기술되지 않은 한, 명확히 또는 문맥에 의해, "유효량"은 병증을 경감시키기에 충분한 최소량으로 제한되지는 않는다.
"세포외 유체"는 예를 들어, 혈청, 혈장, 혈액, 세포간질액, 뇌척수액, 분비 유체, 림프액, 담즙, 땀, 대변 물질 및 뇨를 포함한다. "세포외 유체"는 콜로이드 또는 현탁액, 예를 들어, 전혈 또는 응고 혈액을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드의 문맥에서 용어 "단편"은 더 큰 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 적어도 5개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 10개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 15개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 20개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 25개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 40개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 50개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 60개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 70개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 80개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 90개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 100개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 125개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 150개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 175개의 인접 아미노산 잔기, 적어도 200개의 인접 아미노산 잔기, 또는 적어도 250개의 인접 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다.
"유전자"는 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드는 생물학적으로 활성이거나, 항원으로 활성이거나, 생물학적으로 불활성이거나, 항원으로 불활성이고, 기타 등등일 수 있다. 용어 유전자는, 예를 들어, 특이적 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)의 합; ORF와 인트론을 코딩하는 핵산의 합; ORF와 작동적으로 연결된 프로모터(들)의 합; ORF 및 작동적으로 연결된 프로모터(들) 및 임의의 인트론의 합; ORF와 작동적으로 연결된 프로모터(들), 인트론(들) 및 프로모터(들) 및 다른 조절 구성요소, 예컨대 인핸서(들)의 합을 포함한다. 소정의 실시형태에서, "유전자"는 유전자의 발현을 조절하기 위해 시스에서 필요한 임의의 서열을 포함한다. 용어 유전자는 또한 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질의 항원 또는 항원으로 활성인 단편을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산을 의미할 수 있다. 용어 유전자는 코딩된 펩타이드 또는 단백질이 임의의 생물학적 활성을 갖거나, 심지어 펩타이드 또는 단백질이 항원으로 활성이라는 것을 반드시 의미하는 것은 아니다. 발현 불가능한 서열을 코딩하는 핵산 서열은 일반적으로 위유전자(pseudogene)로 여겨진다. 용어 유전자는 또한 rRNA, tRNA, 또는 리보자임과 같은 리보핵산을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
박테리아, 예컨대 리스테리아의 "성장"은, 제한 없이, 콜로니화, 복제, 단백질 함량 증가 및/또는 지질 함량 증가에 관련한 박테리아 생리학 및 유전자의 기능을 포함한다. 달리 명확히 또는 문맥상 달리 기재되지 않은 한, 리스테리아의 성장은 숙주 세포 외부의 박테리아의 성장 및 또한 숙주 세포 내의 성장을 포함한다. 성장 관련 유전자는, 임의의 제한을 의미하지 않으면서, 아미노산, 당, 지질, 무기질, 퓨린 및 피리미딘의 에너지 생성(예를 들어, 당화, 크렙스 회로, 시토크롬), 동화작용 및/또는 이화작용, 양분 이동, 전사, 번역 및/또는 복제를 매개하는 것을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 리스테리아 박테리아의 "성장"은 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포 내의 성장인 리스테리아 박테리아의 세포내 성장을 의미한다. 리스테리아 박테리아의 세포내 성장이 광학 현미경검사 또는 콜로니 형성 단위(CFU) 검정에 의해 측정될 수 있고, 성장은 임의의 측정 기법으로 제한되지 않는다. 리스테리아 박테리아에 특이적인 리스테리아 항원, 리스테리아 핵산 서열, 또는 지질의 분량과 같은 생화학적 매개변수는 성장을 평가하도록 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 성장을 매개하는 유전자는 세포내 성장을 특이적으로 매개하는 것이다. 몇몇 실시형태에서, 세포내 성장을 특이적으로 매개하는 유전자는 유전자의 불활화가 세포내 성장 속도롤 감소시키지만 세포외 성장(예를 들어, 브로쓰의 성장) 속도를 관찰 가능하게, 실질적으로 또는 상당히 감소시키지 않는 유전자, 또는 유전자의 불활화가 세포외 성장 속도를 감소시키는 것보다 큰 정도로 세포내 성장 속도롤 감소시키는 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 비제한적인 예를 제공하기 위해, 몇몇 실시형태에서, 불활화가 세포외 성장보다 큰 정도로 세포내 성장 속도를 감소시키는 유전자는 불활화가 정상 또는 최대 값의 50% 미만으로 세포내 성장을 감소시키지만, 최대 값의 불과 1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 또는 10% 내지 15%로 세포외 성장을 감소시키는 상황을 포함한다. 본 발명은, 소정의 양상에서, 세포내 성장에서 약독화되지만 세포외 성장에서 약독화되지 않은 리스테리아, 세포내 성장에서 약독화되지 않고 세포외 성장에서 약독화되지 않은 리스테리아 및 세포내 성장에서 약독화되지 않지만 세포외 성장에서 약독화된 리스테리아를 포함한다.
"라벨링된" 조성물은 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 동위원소 또는 화학 방법에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능하다. 예를 들어, 유용한 라벨은 32P, 33P, 35S, 14C, 3H, 125I, 안정한 동위원소, 에피토프 태그, 형광 염료, 전자 고밀도 시약, 기질 또는 예를 들어 효소 결합 면역분석법, 또는 플루오레트(fluorettes)에 사용되는 효소를 포함한다(예를 들어, 문헌[Rozinov and Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728] 참조).
"리간드"는 소분자, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 수용체의 효현제 또는 길항제인 막 관련 또는 막 결합 분자를 의미한다. "리간드"는 또한 효현제 또는 길항제가 아니고 효현제 또는 길항제 특성을 갖지 않는 결합제를 포함한다. 편의상, 리간드가 제1 세포에서 막 결합된 경우, 수용체는 보통 제2 세포에서 나타난다. 제2 세포는 동일한 동일성(동일한 이름)을 갖거나, 제1 세포와 다른 동일성(다른 이름)을 가질 수 있다. 리간드 또는 수용체는 전부 세포내 있을 수 있고, 즉 이것은 시토졸, 핵 또는 몇몇 다른 세포내 구획에서 있을 수 있다. 리간드 또는 수용체는 예를 들어 세포내 구획으로부터 원형질막의 외부면으로의 이의 위치를 변경할 수 있다. 리간드 및 수용체의 복합체는 "리간드 수용체 복합체"라 칭한다. 리간드 및 수용체가 신호전달 경로에 관여하는 경우, 리간드는 신호전달 경로의 상류 위치에서 나타나고, 수용체는 하류 위치에서 나타난다.
"핵산"은 단일 가닥, 이중 가닥 형태, 또는 다중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이의 중합체를 의미한다. 핵산의 비제한적인 예는 예를 들어 cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드이다. 특정한 핵산 서열은 또한 함축적으로 "대립유전자 변이체" 및 "스플라이스 변이체"를 포함할 수 있다.
mRNA를 코딩하는 핵산 및 프로모터의 맥락에서 "작동적으로 연결된"은 프로모터가 이 핵산의 전사를 개시하는 데 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
용어 "서열 동일성의 퍼센트" 및 "서열 동일성(%)"은 2개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열의 비교 또는 정렬에 의해 발견되는 서열 유사성의 백분율을 의미한다. 동일성의 퍼센트는 서열을 정렬하고, 정렬된 2개의 서열 사이의 일치의 정확한 숫자를 계산하고, 더 짧은 서열의 길이로 나누고, 결과에 100을 곱하여 2개의 분자 간의 서열 정보의 직접 비교에 의해 결정될 수 있다. 동일성의 퍼센트의 계산을 위한 알고리즘은 스미스-워터만(Smith-Waterman) 상동성 조사 알고리즘이다(예를 들어, 문헌[Kann and Goldstein (2002) Proteins 48:367-376; Arslan, et al. (2001) Bioinformatics 17:327-337] 참조).
"정제된" 및 "단리된"은, 폴리펩타이드를 언급할 때, 폴리펩타이드가 자연에서 관련되는 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재 하에 폴리펩타이드가 존재한다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "정제된"은 확인된 폴리펩타이드가 존재하는 폴리펩타이드의 대개는 적어도 50%를 차지하고, 더 대개는 적어도 60%를 차지하고, 통상적으로 적어도 70%를 차지하고, 더 통상적으로 적어도 75%를 차지하고, 가장 통상적으로 적어도 80%를 차지하고, 보통 적어도 85%를 차지하고, 더 보통 적어도 90%를 차지하고, 가장 보통 적어도 95%를 차지하고, 적어도 98중량% 이상을 차지한다는 것을 의미한다. 물, 완충제, 염, 세제, 환원제, 프로테아제 억제제, 안정화제(첨가된 단백질, 예컨대 알부민을 포함) 및 부형제 및 분자량이 1000 미만인 분자의 중량은 일반적으로 폴리펩타이드 순도의 결정에 사용되지 않는다. 예를 들어, 코바치(Covacci) 등에 허여된 미국 특허 제6,090,611호에서 순도의 설명을 참조한다.
"펩타이드"는 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산의 짧은 서열을 의미한다. 펩타이드는 다른 모이어티, 예컨대 거대분자, 지질, 올리고사카라이드 또는 다당류 및/또는 폴리펩타이드에 결합되거나 유리될 수 있다. 펩타이드가 폴리펩타이드 사슬로 편입된 경우, 용어 "펩타이드"는 구체적으로 아미노산의 짧은 서열을 의미하도록 여전히 사용될 수 있다. "펩타이드"는 펩타이드 결합 또는 몇몇 다른 유형의 연결에 의해 다른 모이어티에 연결될 수 있다. 펩타이드는 적어도 2개의 길이의 아미노산이고 일반적으로 약 25개 미만의 길이의 아미노산이고, 최대 길이는 관습 또는 맥락의 기능이다. 용어 "펩타이드" 및 "올리고펩타이드"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
"단백질"은 일반적으로 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 아미노산의 서열을 의미한다. 단백질은 또한 폴리펩타이드의 3차원 구조를 의미할 수 있다. "변성 단백질"은 일부 잔류하는 3차원 구조를 갖는 부분적으로 변성된 폴리펩타이드, 또는 대안적으로 필수적으로 무작위인 3차원 구조, 즉 완전 변성된 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명은 예를 들어 당화, 포스포릴화, 황산화, 이황화 결합 형성, 탈아미드화, 이성질체화를 포함하는 폴리펩타이드 변이체, 신호 또는 선도 서열 처리에서의 절단 지점, 공유 및 비공유 결합된 보조인자, 산화된 변이체 등의 시약 및 이들을 사용하는 방법을 포함한다. 이황화 결합된 단백질의 형성이 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Woycechowsky and Raines (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:533-539; Creighton, et al. (1995) Trends Biotechnol. 13:18-23] 참조).
"재조합"은, 예를 들어 핵산, 세포, 동물, 바이러스, 플라스미드, 벡터 등과 관련하여 사용될 때, 외인성 비네이티브 핵산의 도입, 네이티브 핵산의 변경, 또는 전부 또는 부분적으로 재조합 핵산, 세포, 바이러스, 플라스미드, 또는 벡터로부터의 유도체화에 의한 변형을 나타낸다. 재조합 단백질은 예를 들어 재조합 핵산, 바이러스, 플라스미드, 벡터 등으로부터 유도된 단백질을 포함한다. "재조합 박테리아"는 게놈이 재조합 방법, 예를 들어, 돌연변이, 결실, 삽입 및/또는 재배열에 의해 조작되는 박테리아를 포함한다. "재조합 박테리아" 또한 재조합 게놈외 핵산, 예를 들어, 플라스미드 또는 제2 염색체를 포함하도록 변형된 박테리아, 또는 기존의 게놈외 핵산이 변경된 박테리아를 포함한다.
"샘플"은 인간, 동물, 위약, 또는 조사 샘플, 예를 들어, 세포, 조직, 장기, 유체, 가스, 에어로졸, 슬러리, 콜로이드, 또는 응고 물질로부터의 샘플을 의미한다. "샘플"은 예를 들어 인간 또는 동물로부터의 제거 없이 생체내 시험될 수 있거나, 실험실내 시험될 수 있다. 샘플은 예를 들어 조직학적 방법에 의해 처리 후 시험될 수 있다. "샘플"은 또한 예를 들어 유체 또는 조직 샘플을 포함하는 세포 또는 유체 또는 조직 샘플로부터 분리된 세포를 의미한다. "샘플"은 또한 인간 또는 동물로부터 새로 채취한 세포, 조직, 장기 또는 유체, 또는 처리되거나 저장된 세포, 조직, 장기 또는 유체를 의미할 수 있다.
"선택 가능한 마커"는 선택 가능한 마커를 함유하는 세포에 대해 또는 이에 반대를 선택하게 할 수 있는 핵산을 포함한다. 선택 가능한 마커의 예는, 제한 없이, 예를 들어 (1) 달리 독성 화합물에 내성을 제공하는 생성물(예를 들어, 항생제)을 코딩하거나, 달리 해로운 화합물(예를 들어, 수크로스)에 대한 감수성을 코딩하는 핵산; (2) 달리 수혜자 세포에서 부족한 생성물(예를 들어, tRNA 유전자, 영양요구성 마커)을 코딩하는 핵산; (3) 유전자 생성물의 활성을 저해하는 생성물을 코딩하는 핵산; (4) 용이하게 확인될 수 있는 생성물(예를 들어, 표현형 마커, 예컨대 베타-갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(GFP), 세포 표면 단백질, 에피토프 태그, FLAG 태그)을 코딩하는 핵산; (5) 하이브리드화 기법, 예를 들어, PCR 또는 분자 비콘(beacons)에 의해 확인될 수 있는 핵산을 포함한다.
"특이적으로" 또는 "선택적으로" 결합한다는, 리간드/수용체, 핵산/상보성 핵산, 항체/항원, 또는 다른 결합 쌍(예를 들어, 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인)을 언급할 때, 단백질 및 다른 생물물질의 이종성 집단에서 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응을 나타낸다. 따라서, 지정된 조건 하에, 특이적 리간드는 특정한 수용체에 결합하고 샘플에 존재하는 다른 단백질에 상당한 양으로 결합하지 않는다. 특이적 결합은 또한 예를 들어 고안된 방법의, 항체의 항원 결합 부위로부터 유래한 결합 화합물, 핵산 리간드, 항체, 또는 결합 조성물이 임의의 다른 결합 화합물에 의한 친화도보다 대개는 적어도 25% 초과, 더 대개는 적어도 50% 초과, 가장 대개는 적어도 100%(2배) 초과, 보통 적어도 10배 초과, 더 보통 적어도 20배 초과, 가장 보통 적어도 100배 초과인 친화도로 이의 표적에 결합한다는 것을 의미할 수 있다.
통상적인 실시형태에서, 항체는 예를 들어 스캐타드(Scatchard) 분석(Munsen, et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239)에 의해 결정되는 바대로 약 109리터/mol 초과의 친화도를 가질 것이다. 당업자는 몇몇 결합 화합물이 하나 초과의 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 예를 들어, 항체가 특이적으로 이의 항원에, 항체의 올리고사카라이드에 의해 레시틴에 및/또는 항체의 Fc 구역에 의해 Fc 수용체에 결합한다는 것을 인식한다.
박테리아의 "확산"은 "세포 대 세포 확산", 즉 예를 들어 비시클에 의해 매개되는 제1 숙주 세포로부터의 제2 숙주 세포로의 박테리아의 전달을 포함한다. 확산과 관련된 기능은 예를 들어 액틴 꼬리의 형성, 위족(pseudopod) 유사 연장의 형성 및 이중 막 액포의 형성을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 인간 또는 비인간 유기체를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 기재된 방법 및 조성물은 인간 및 수의학 질병 둘 다에 적용 가능하다. 소정의 실시형태에서, 대상체는 "환자", 즉 질병 또는 병증에 대한 의학 관리를 받는 살아 있는 인간이다. 이는 병리학의 징후에 대해 조사된 규정된 질병을 갖지 않는 사람을 포함한다.
재조합효소의 "표적 부위"는 인식되고/되거나, 결합되고/되거나 재조합효소가 작용하는 핵산 서열 또는 구역이다(예를 들어, 그라햄(Graham) 등에 허여된 미국 특허 제6,379,943호; 문헌[Smith and Thorpe (2002) Mol. Microbiol. 44:299-307; Groth and Calos (2004) J. Mol. Biol. 335:667-678; Nunes-Duby, et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26:391-406] 참조).
"치료학적 유효량"은 코딩된 이종성 항원에 특이적인 원하는 면역 반응을 유도하고, 환자 이익을 나타내는 데 충분한, 즉 치료하고자 하는 병증의 징후의 감소, 예방 또는 경감을 발생시키는 시약 또는 약제학적 조성물의 양으로 정의된다. 물질 또는 약제학적 조성물이 진단학적 물질을 포함하는 경우, "진단학적 유효량"은 신호, 이미지 또는 다른 진단학적 매개변수를 생성하기에 충분한 양으로 정의된다. 약제학적 제제의 유효량은 개인의 감수성의 정도, 개인의 연령, 성별 및 체중, 및 개인의 특이체질 반응과 같은 인자에 따라 변할 것이다(예를 들어, 네티(Netti) 등에 허여된 미국 특허 제5,888,530호 참조).
(병증 또는 질병과 관련하여) "치료" 또는 "치료하는"은 유리한 또는 원하는 결과 및 바람직하게는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 질병과 관련하여 유리한 또는 원하는 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: 질병과 관련된 병증의 개선, 질병의 치유, 질병의 중증도의 감소, 질병의 진행의 지연, 질병과 관련된 하나 이상의 증상의 경감, 질병을 겪는 사람의 삶의 질의 증가 및/또는 생존 연장. 마찬가지로, 본 발명의 목적을 위해, 병증과 관련된 유리한 또는 원하는 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다: 병증의 개선, 병증의 치유, 병증의 중증도의 감소, 병증의 진행의 지연, 병증과 관련된 하나 이상의 증상의 경감, 병증을 겪는 사람의 삶의 질의 증가 및/또는 생존 연장.
"백신"은 예방 백신을 포함한다. 백신은 또한 치료학적 백신, 예를 들어, 백신에 의해 제공된 항원 또는 에피토프와 관련된 병증 또는 장애를 포함하는 포유동물에 투여되는 백신을 포함한다. 다수의 박테리아 종이 백신으로서 사용하도록 개발되었고, 쉬겔라 플렉스네리, 에스체리치아 콜라이, 리스테리아 모노사이토게네스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 티피 또는 마이코박테륨 종을 포함하는 것이 본 발명에서 사용될 수 있다. 이 목록은 제한인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 제WO04/006837호; 제WO07/103225호; 및 제WO07/117371호(모든 표, 도면 및 청구항을 포함하여 이들 각각은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)을 참조한다. 백신 조성물에서 사용되는 박테리아 벡터는 조건적, 세포내 박테리아 벡터일 수 있다. 박테리아는 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 숙주 유기체에서 항원 제시 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 바와 같은 엘. 모노사이토게네스는 본 발명의 항원의 발현을 위한 바람직한 백신 플랫폼을 제공한다.
2. 조건적 결실을 위한 필수 유전자의 표적화
재조합효소 유도된 세포내 사멸(RIID)에 조작된 박테리아는 재조합으로 도입된 재조합효소 유전자의 발현을 박테리아가 숙주 유기체에 있을 때 조건적으로 발현된 프로모터에 연결함으로써 "자살을 실행"하도록 프로그래밍된다. 하기 예의 방식으로, 재조합효소의 발현은 inlA 프로모터, inlB 프로모터, inlC 프로모터, hpt 프로모터, hly 프로모터, plcA 프로모터, mpl 프로모터 및 actA 프로모터로부터 선택될 수 있는 PrfA 의존적 프로모터를 사용하여 리스테리아에서 조건적이 될 수 있다. PrfA는 적절히 조작된 백신 균주에서 연결된 유전자의 발현을 유도하는 세포내 활성화된 전사 인자이다.
엘. 모노사이토게네스 PrfA의 서열은 하기와 같다(서열 번호 1):
Figure pct00001
상기 기재된 바대로, 하기 예에서, actA 유전자의 발현은 PrfA에 반응성이고, actA 프로모터는 PrfA 반응성 조절 구성요소이다. ActA가 가장 풍부하게 발현된 리스테리아 단백질이고 이의 발현이 실험실내 배양 조건과 비교하여 감염된 세포 내에 200배 초과 유도되면서, actA 프로모터는 재조합효소 유전자의 조건적 고 수준 발현에 대한 적합한 프로모터이다.
리스테리아 PrfA의 조절 시스템과 유사한 방식으로 사용될 수 있는 다른 조절 시스템은 하기를 포함한다:
Figure pct00002
하기 예에서, Cre 재조합효소의 발현은 리스테리아에서의 발현을 위한 actA 프로모터에 연결된다. 대안에서, 재조합효소, 예컨대 φC31 인테그라제, R4 인테그라제, TP901 인테그라제, φBT1 인테그라제, BxB1 인테그라제, PSA 인테그라제, Cre 재조합효소, Flp 재조합효소, XerC 재조합효소, λ 인테그라제, HK022 인테그라제, P22 인테그라제, HP1 인테그라제, L5 인테그라제, γδ 재조합효소, Tn3 재조합효소, gin 재조합효소, RV 인테그라제, SPBc 인테그라제, TG1 인테그라제, φC1 인테그라제, MR11 인테그라제, φ370 인테그라제, φK38 인테그라제, Wβ 인테그라제 및 BL3 인테그라제는 Cre 재조합효소를 위해 하기 기재된 것과 유사한 방식으로 본 발명의 용도가 확인될 수 있다.
발현 시, Cre는 플랭킹 재조합효소 결합 부위(예를 들어, loxP)의 재조합 도입에 의해 결실에 표적화된 생존능력에 필요한 박테리아 유전자를 절제한다. 유리하게는, 돌연변이체 재조합효소 부위, 예컨대 lox66 및 lox71 돌연변이체 lox P 부위가 사용될 수 있다. 네이티브 loxP와 달리, 표적화된 유전자(들)의 절제 후 연결되는 lox66 및 lox71 부위는 이후 Cre 매개 재조합에 대한 주형으로서 사용될 수 없어서, 절제의 평형을 완료로 추진시킨다.
DNA 복제에 필수적인 결실 유전자(예를 들어, gyrA, gyrB)의 표적화는 이의 동질유전자 모 리스테리아 균주와 비교하여 감염된 세포에서 박테리아 세포를 사멸시킨다. 그러나, actA 프로모터가 발효 동안 유도되지 않으므로, 박테리아 성장 배지 중의 RIID Lm의 성장은 모 균주와 구별 가능하지 않다. Lm 코딩된 항원의 발현은 또한 PrfA 의존적 프로모터, 예컨대 ActA를 사용하여 감염된 APC에서 유도될 수 있고, 여기서 합성된 항원은 박테리아 신호 펩타이드/샤프론과의 연결을 통해 리스테리아 박테리아로부터 시토졸로 분비되고 이후 MHC I형 경로를 통해 처리되고 제시된다. RIID Lm 균주가 APC의 감염 후 사멸에 프로그래밍되지만, 백신은 동질유전자 생 약독화된 Lm 백신 균주에 의한 백신접종에 필적하는 강력한 CD8 T 세포 반응을 여전히 유발시킨다.
하기는 RIID 접근법에서 절제에 표적화될 수 있는 DNA 복제에 관여하는 예시적인 유전자의 비제한적인 목록이다.
ori(복제 기원)
dnaA(복제 개시)
dnaN(DNA 중합효소 III, 베타 아단위)
gyrA(DNA 자이레이즈, 아단위 A)
gyrB(DNA 자이레이즈, 아단위 B)
polC(DNA 중합효소 III, 알파 아단위)
dnaE(DNA 중합효소 III, 알파 아단위)
ftsK(DNA 트랜스로카제, 염색체 분리)
ftsZ(튜불린 유사, 격막형성)
ligA(DNA 리가제)
dnaG(DNA 프리마아제)
parC(토포 IV 아단위)
parE(topo IV 아단위)
holB(DNA 중합효소 III, 델타 아단위)
dnaX(DNA 중합효소 III, 감마 및 tau 아단위)
SMC(염색체 분리)
결실에 표적화하기 위한 유전자의 바람직하지만 비제한적인 예는 복제 및 박테리아 세포 분할에 관여하는 것, 예컨대 polC, dnaE, ftsK, ftsZ, ligA, dnaG, parC, parE , holB , dnaX , SMC 및 ftsY를 포함한다. DNA 복제에 관여하는 유전자 이외에 또는 이에 대안으로 세포내 절제에 표적화될 수 있는 리스테리아의 증식에 필수적인 추가의 유전자 표적이 존재한다. Lm RIID 균주가 신생(de novo) Ag 발현이 백신 효력을 위해 필요한 백신 플랫폼으로서의 용도를 가지므로(Brockstedt et. al., 2005), 유전자 표적을 선택하도록 항원 발현/분비에 대한 절제된 유전자(들)의 영향을 고려해야 한다. 바람직한 실시형태에서, RNA 전사 및 단백질 합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자는 특정한 용도에 바람직하지 않을 수 있는 원하는 면역학적 효력의 잠재적 감소로 인해 회피되어야 한다. 다른 바람직한 비제한적인 예는 병원성에 영향을 미치는 박테리아 유전자, 예컨대 hly 및 dacA를 표적화하는 것을 포함한다. 감염된 숙주 세포의 시토졸에서 결실에 표적화된 임의의 유전자가 따라서 본 명세서에 기재된 방법에 의해 수행될 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이고, 첫째로 결실시키고자 하는 필수 유전자(들)의 상류 및 하류의 유전자간 구역이 확인되고; 둘째로 원하는 loxP 변이체를 포함하는 PCR 프라이머가 설계되고; 셋째로 비필수/유전자간 공간에서 lox 부위를 삽입하고자 하는 상응하는 대립유전자 교환 벡터가 작제되고; 넷째로 lox 부위가 대립유전자 교환에 의해 리스테리아 백신 균주로 연속하여 삽입된다. 대안적으로, 결실에 표적화하고자 하는 유전자가 작은 경우, lox 부위 둘 다 단일 대립유전자 교환 단계로 첨가될 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 다른 추가의 실시형태에서, 감염된 세포의 시토졸에서 Cre 재조합효소 발현의 유도를 위한 PactA-Cre 카세트는 부위 특이적 통합에 수정 가능한 교대하는 위치(예를 들어 pPL1을 사용한 comK) 또는 대립유전자 교환 방법론을 이용하여 삽입에 수정 가능한 임의의 염색체 위치에서 도입될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, actA 이외의 PrfA 의존적 프로모터는 Cre 재조합효소의 시토졸 유도 발현에 사용될 수 있고; inlC는 대안적인 프로모터의 비제한적인 예이다.
상기 기재된 Cre/lox 전략에 대한 대안으로서, 리스테리아의 증식에 필수적인 유전자는 FLP 재조합효소 및 frt 부위에 의한 세포내 절제에 또한 표적화될 수 있다. 첫째로 결실시키고자 하는 필수 유전자(들)의 상류 및 하류의 유전자간 구역이 확인되고; 둘째로 원하는 frt 부위를 포함하는 PCR 프라이머가 설계되고; 셋째로 비필수/유전자간 공간에서 frt 부위를 삽입하고자 하는 상응하는 대립유전자 교환 벡터가 작제되고; 넷째로 frt 부위가 대립유전자 교환에 의해 리스테리아 백신 균주로 연속하여 삽입된다. 대안적으로, 결실에 표적화하고자 하는 유전자가 작은 경우, frt 부위 둘 다 단일 대립유전자 교환 단계로 첨가될 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 다른 추가의 실시형태에서, 감염된 세포의 시토졸에서 FLP 재조합효소 발현의 유도를 위한 PactA-FLP 카세트는 부위 특이적 통합에 수정 가능한 교대하는 위치(예를 들어 pPL1을 사용한 comK) 또는 대립유전자 교환 방법론을 이용하여 삽입에 수정 가능한 임의의 염색체 위치에서 도입될 수 있다.
4. 항원 작제물
표적 항원
본 명세서에 기재된 RIID 박테리아의 바람직한 특징은 백신 플랫폼으로서 사용될 때 재조합으로 발현된 항원(들)에 대한 항원 특이적 T 세포 반응 및 선천성 면역 반응 둘 다를 개시하는 능력이다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항원(들)을 발현하는 엘. 모노사이토게네스는 백신 유도 면역 반응의 성질을 형상화하는 공동 조절된 케모카인 및 사이토카인 단백질의 캐스케이드 및 1형 인터페론(IFN-α/β)을 유도할 수 있다. 이 면역 자극에 반응하여, NK 세포 및 항원 제시 세포(APC)는 정맥내 백신접종 경로 후에 간에 동원되거나, 대안적으로 예를 들어 근육내, 피하 또는 경피 면역화 경로에 의한 다른 백신접종 경로 후에 백신접종 부위에 동원된다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 백신 플랫폼은 IL-12p70, IFN-γ, IL-6, TNFα 및 MCP-1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 바람직하게는 모든 사이토카인 및 케모카인의 혈청 농도에서 대상체에 대한 백신 플랫폼의 전달 후에 24시간에 증가를 유도하고; 백신 플랫폼에 의해 발현된 하나 이상의 항원에 대한 CD4+ 및/또는 CD8+ 항원 특이적 T 세포 반응을 유도한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 백신 플랫폼은 또한 마우스 모델 시스템에서 활성화 마커, 예컨대 DX5, CD11b 및 CD43의 상향조절, 또는 표적 세포로서 사용되는 51Cr-라벨링된 YAC-1 세포를 사용하여 측정된 NK 세포 매개 세포용해 활성에 의해 입증된 바대로 내재하는 미숙 간 NK 세포의 성숙을 유도한다.
백신 벡터로서 작용하는 엘. 모노사이토게네스의 능력은 문헌[Wesikirch, et al., Immunol . Rev. 158:159-169 (1997)]에 검토되어 있다. 엘. 모노사이토게네스의 천연 생물학의 다수의 바람직한 특징은 이것이 치료학적 백신에 대한 적용을 위한 매력적인 플랫폼이 되게 한다. 주요한 이유는 엘. 모노사이토게네스의 세포내 생활주기가 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역의 효과적인 자극이 가능하게 한다는 것이다. TLR(TLR2, TLR5, TLR9) 뉴클레오타이드 결합 올리고머화 도메인(nucleotide-binding oligomerization domain: NOD) 및 인터페론 유전자의 자극제(Stimulator of Interferon Gene: STING)를 포함하는 다수의 병원균 관련 분자 패턴(pathogen associated molecular pattern: PAMP) 수용체는 감염 시 엘. 모노사이토게네스 거대분자와의 상호작용에 반응하여 촉발되어, 선천성 면역 이팩터의 pan-활성화 및 Th-1 분극 사이토카인의 방출을 발생시켜, 발현된 항원에 대한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 전개에 깊은 영향을 미친다.
엘. 모노사이토게네스의 균주는 질병 유발 물질, 예컨대 암 및 HIV의 주사를 허용하지 않는 임상 병증에 대한 면역 반응을 유도하도록 면역계에 대한 항원의 전달을 제공하는 비상동성 단백질의 효과적인 세포내 전달 비히클로서 최근에 개발되었다. 예를 들어, 미국 특허 제6,051,237호; 문헌[Gunn et al ., J. Immunol., 167:6471-6479 (2001); Liau, et al ., Cancer Research, 62: 2287-2293 (2002)]; 미국 특허 제6,099,848호; WO 제99/25376호; WO 96/14087호; 및 미국 특허 제5,830,702호(모든 표, 도면 및 청구항을 포함하여 이들 각각은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)를 참조한다. 림프구성 맥락 뇌막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus: LCMV) 항원을 발현하는 재조합 엘. 모노사이토게네스 백신은 또한 항원에 대한 보호 세포 매개 면역을 유도하는 것으로 나타났다(Shen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3987-3991 (1995)).
소정의 실시형태에서, 본 발명의 백신 조성물에서 사용되는 엘. 모노사이토게네스는 actA 및/또는 inlB에서의 약독화 돌연변이 및 바람직하게는 actA 및 inlB의 전부 또는 일부의 결실(본 명세서에서 "Lm ΔActA/ΔinlB"라 칭함)을 추가로 포함하고 관심 있는 하나 이상의 항원(들)의 발현을 코딩하는 재조합 DNA를 함유하는 RIID 균주이다. 항원(들)은 바람직하게는 박테리아 발현 서열의 제어 하에 있고, 엘. 모노사이토게네스 게놈으로 안정하게 통합된다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 조절, 예를 들어, 프로모터 또는 전사 인자에서 약독화된 리스테리아를 고려한다. 하기는 프로모터에 관한 것이다. ActA 발현은 2개의 상이한 프로모터에 의해 조절된다(Vazwuez-Boland, et al.(1992) Infect. Immun. 60:219-230). 종합하면, InlA 및 InlB 발현은 5개의 프로모터에 의해 조절된다(Lingnau, et al. (1995) Infect. Immun. 63:3896-3903). prfA의 전사 인자는 다수의 엘. 모노사이토게네스 유전자, 예를 들어, hly , plcA , ActA , mpl , prfA 및 iap의 전사에 필요하다. PrfA의 조절 특성은 예를 들어 PrfA 의존적 프로모터(PinlC) 및 PrfA-박스에 의해 매개된다. 본 발명은, 소정의 실시형태에서, 적어도 하나의 ActA 프로모터, inlB 프로모터, PrfA, PinlC, PrfA 박스 등에서 불활화된, 돌연변이된, 또는 결실된 코딩하는 핵산을 제공한다(예를 들어, 문헌[Lalic Mullthaler, et al. (2001) Mol. Microbiol. 42:111-120; Shetron-Rama, et al. (2003) Mol. Microbiol. 48:1537-1551; Luo, et al. (2004) Mol. Microbiol. 52:39-52] 참조). PrfA는 Gly145Ser 돌연변이, Gly155Ser 돌연변이, 또는 Glu77Lys 돌연변이에 의해 구성적으로 활성이 될 수 있다(예를 들어, 문헌[Mueller and Freitag (2005) Infect. Immun. 73:1917-1926; Wong and Freitag (2004) J. Bacteriol. 186:6265-6276; Ripio, et al. (1997) J. Bacteriol. 179:1533-1540]을 참조한다).
본 발명에서의 용도가 확인될 수 있는 표적 항원의 예는 하기 표에 기재되어 있다. 표적 항원은 또한 표에 기재된 항원의 면역학적으로 활성인 부분을 포함하는 단편 또는 융합 폴리펩타이드일 수 있다. 이 목록은 제한인 것으로 의도되지 않는다.
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적합한 항원이 당해 분야에 공지된 다른 유기체는 클라미디아 트라초마티스(Chlamydia trachomatis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(그룹 A 스트렙), 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactia)(그룹 B 스트렙), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스체리치아 콜라이, 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 나이세리아 고노르헤아에(Neisseria gonorrheae), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 살모넬라 종(티피(typhi), 티피무리움(typhimurium)을 포함), 엔테리카(헬리코박터 파일로리(Helicobactor pylori), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 다른 그룹 D 쉬겔라 종을 포함), 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 클로스트리듐 종(씨. 디피실(C. difficile)을 포함), 비브리오 파라하에몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 브이. 불니피쿠스(V. vulnificus)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 목록은 제한인 것으로 의도되지 않는다.
소정의 실시형태에서, 항원 서열(들)은 백신접종된 숙주 내에 박테리아로부터 융합 단백질의 발현 및 분비를 허용하는 엘. 모노사이토게네스 ActA 단백질의 아미노 말단 부분에 융합된 단일 폴리펩타이드로서 발현될 수 있다. 이 실시형태에서, 항원 작제물은 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있고, 융합 단백질은 (a) 변형된 ActA 및 (b) 변형된 ActA 서열 후 융합 단백질로서 발현시키고자 하는 하나 이상의 항원 에피토프를 포함한다.
"변형된 ActA"는 적어도 ActA 신호 서열을 포함하지만, ActA 서열을 전부 포함하지 않거나, 이러한 ActA 서열에 적어도 약 80%의 서열 동일성, 적어도 약 85%의 서열 동일성, 적어도 약 90%의 서열 동일성, 적어도 약 95%의 서열 동일성, 또는 적어도 약 98%의 서열 동일성을 갖는 엘. 모노사이토게네스 ActA 단백질의 인접 부분을 의미한다. ActA 신호 서열은 MGLNRFMRAMMVVFITANCITINPDIIFA(서열 번호 2)이다. 몇몇 실시형태에서, 프로모터는 제WO07/103225호; 및 제WO07/117371호(이들 각각은 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)로부터의 ActA 프로모터이다.
예의 방식으로, 변형된 ActA는 ActA의 적어도 처음의 59개의 아미노산, 또는 적어도 ActA의 처음의 59개의 아미노산에 적어도 약 80%의 서열 동일성, 적어도 약 85%의 서열 동일성, 적어도 약 90%의 서열 동일성, 적어도 약 95%의 서열 동일성, 또는 적어도 약 98%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 ActA는 적어도 ActA의 처음의 100개의 아미노산, 또는 ActA의 처음의 100개의 아미노산에 적어도 약 80%의 서열 동일성, 적어도 약 85%의 서열 동일성, 적어도 약 90%의 서열 동일성, 적어도 약 95%의 서열 동일성, 또는 적어도 약 98%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 즉, 몇몇 실시형태에서, 변형된 ActA 서열은 100번 또는 그 이후의 잔기에서 절두된 ActA의 N 말단 단편(ActA 신호 서열을 포함)에 상응한다.
ActA-N100은 하기 서열(서열 번호 3)을 갖는다:
Figure pct00019
이 서열에서, 제1 잔기는 발린으로 도시되고; 폴리펩타이드는 이 위치에서 메티오닌을 갖는 리스테리아에 의해 합성된다. 따라서, ActA-N100은 또한 하기 서열(서열 번호 4)을 가질 수 있다:
Figure pct00020
ActA-N100은 또한 항원 서열 및 변형된 ActA의 C 말단 잔기 사이에 놓인 하나 이상의 추가의 잔기를 포함할 수 있다. 하기 서열에서, ActA-N100은 BamH1 부위(서열 번호 5)의 포함에 의해 첨가된 2개의 잔기에 의해 연장되고:
Figure pct00021
이는 제1 잔기 메티오닌로 합성될 때 서열(서열 번호 6)을 갖는다:
Figure pct00022
하나의 유기체에 의해 코딩된 서열이 선택된 백신 플랫폼 박테리아 균주에서 최적 발현에 대해 반드시 코돈 최적화되지 않으므로, 본 발명은 또한 박테리아, 예컨대 엘. 모노사이토게네스에 의한 발현을 위해 최적화된 코돈에 의해 변경된 핵산을 제공한다.
다양한 실시형태에서, 최적 코돈을 제공하도록 임의의 비최적 코돈의 적어도 1 퍼센트가 변경되고, 더 보통 적어도 5 퍼센트가 변경되고, 가장 보통 적어도 10 퍼센트가 변경되고, 대개는 적어도 20%가 변경되고, 더 대개는 적어도 30%가 변경되고, 가장 대개는 적어도 40%가 변경되고, 보통 적어도 50%가 변경되고, 더 보통 적어도 60%가 변경되고, 가장 보통 적어도 70%가 변경되고, 최적으로 적어도 80%가 변경되고, 더 최적으로 적어도 90%가 변경되고, 가장 최적으로 적어도 95%가 변경되고, 관습적으로 임의의 비최적 코돈의 100%가 리스테리아 발현을 위해 코돈 최적화된다(표 2).
Figure pct00023
본 발명은 본 발명의 약독화된 박테리아를 제조하고 조작하기 위한 다수의 리스테리아 종 및 균주를 제공한다. 본 발명의 리스테리아는 표 3에 기재된 종 및 균주에 의해 제한되지 않는다.
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
4. 치료학적 조성물.
본 명세서에 기재된 백신 조성물은 적절한 면역 반응을 유도하는 데 충분한 양으로 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 부형제와 조합되어 숙주에 투여될 수 있다. 면역 반응은, 제한 없이, 특이적 면역 반응, 비특이적 면역 반응, 특이적 반응 및 비특이적 반응 둘 다, 선천성 반응, 일차 면역 반응, 적응 면역, 2차 면역 반응, 기억 면역 반응, 면역 세포 활성화, 면역 세포 증식, 면역 세포 분화 및 사이토카인 발현을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신은 저장되고, 예를 들어, 냉동되거나, 현탁액으로서, 세포 페이스트로서 동결건조되거나, 고체 매트릭스 또는 겔 매트릭스와 복합체화될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 면역 반응을 프라이밍하기 위해 대상체에 효과적인 용량의 제1 백신이 투여된 후, 제2 백신이 투여된다. 이는 당해 분야에서 "프라임-부스트" 섭생이라 칭한다. 이러한 섭생에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 "프라임" 전달, "부스트" 전달, 또는 "프라임" 및 "부스트" 둘 다로서 사용될 수 있다. 임의의 수의 "부스트" 면역화는 백신 유도된 면역 반응의 양 또는 효과를 유지시키기 위해 전달될 수 있다.
예로서, 항원 폴리펩타이드(들)를 코딩하고 발현하는 사멸되지만 대사상 활성 리스테리아를 포함하는 제1 백신은 "프라임"으로서 전달될 수 있고, 항원 폴리펩타이드(들)를 코딩하는 약독화된(생 또는 사멸되지만 대사상 활성) 리스테리아를 포함하는 제2 백신은 "부스트"로서 전달될 수 있다. 그러나, 프라임 및 부스트의 각각이 본 발명의 방법 및 조성물을 이용할 필요가 없는 것으로 이해되어야 한다. 오히려, 본 발명은 본 발명의 박테리아 백신 방법 및 조성물과 함께 다른 백신 양상의 이용을 고려한다. 하기는 적합한 혼합된 프라임-부스트 섭생의 예이다: DNA(예를 들어, 플라스미드) 백신 프라임/박테리아 백신 부스트; 바이러스 백신 프라임/박테리아 백신 부스트; 단백질 백신 프라임/박테리아 백신 부스트; DNA 프라임/박테리아 백신 부스트와 단백질 백신 부스트; 박테리아 백신 프라임/DNA 백신 부스트; 박테리아 백신 프라임/바이러스 백신 부스트; 박테리아 백신 프라임/단백질 백신 부스트; 박테리아 백신 프라임/박테리아 백신 부스트와 단백질 백신 부스트 등. 이 목록은 제한인 것으로 의도되지 않는다.
프라임 백신 및 부스트 백신은 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 용어 "상이한 경로"는 신체의 상이한 부위, 예를 들어, 경구, 비경구, 장내, 장관내, 장관외, 직장, 절내(intranode)(림프절), 정맥내, 동맥, 피하, 진피내, 근육내, 종양내, 종양주변인 부위, 융합, 점막, 비강, 뇌척수 공간 또는 뇌척수액 등, 및 상이한 방식, 예를 들어, 경구, 정맥내 및 근육내를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
프라임 또는 부스트 백신의 유효량은 일 용량으로 제공될 수 있지만, 일 용량으로 제한되지는 않는다. 따라서, 투여는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 15회, 16회, 17회, 18회, 19회, 20회 이상의 백신 투여일 수 있다. 본 방법에서 1회 초과의 백신 또는 백신들의 투여가 존재할 때, 투여는 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분 이상의 시간 간격으로, 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간 등의 시간 간격으로 벌어질 수 있다. 시간의 맥락에서, 용어 "약"은 30분 내의 플러스 또는 마이너스 임의의 시간 간격을 의미한다. 투여는 또한 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일 및 이들의 조합의 시간 간격으로 벌어질 수 있다. 본 발명은 시간상 동등하게 벌어진 투약 간격으로 제한되지 않지만, 예컨대 1일, 4일, 7일 및 25일의 투여로 이루어진 프라이밍 스케줄(단지 비제한적인 예를 제공함)로 이루어진 동등하지 않은 간격에서의 투약을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 부스트 백신접종의 투여는 프라임 백신접종이 개시된 후 약 5일에 개시되고; 프라임 백신접종이 개시된 후 약 10일에 개시되고; 프라임 백신접종이 개시된 약 15일; 약 20일; 약 25일; 약 30일; 약 35일; 약 40일; 약 45일; 약 50일; 약 55일; 약 60일; 약 65일; 약 70일; 약 75일; 약 80일, 약 6달 및 약 1년에 개시된다. 바람직하게는 프라임 및 부스트 백신접종 중 하나 또는 둘 다는 본 발명의 조성물의 전달을 포함한다.
"약제학적으로 허용되는 부형제" 또는 "진단학적으로 허용되는 부형제"는 무균 증류수, 식염수, 인산염 완충 용액, 아미노산계 완충제, 또는 중탄산염 완충 용액을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 선택된 부형제 및 사용된 부형제의 양은 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 투여는 경구, 정맥내, 피하, 진피, 진피내, 근육내, 점막, 장관외, 장기내, 병변내, 비강내, 흡입, 눈내, 근육내, 혈관내, 절내, 방혈(scarification), 직장, 복강내, 또는 다양한 널리 공지된 투여 경로 중 임의의 하나 또는 조합일 수 있다. 투여는 주사, 점적 주사, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
비경구 경로에 의한 본 발명의 백신의 투여는 관용성을 피할 수 있다. 방법은 정맥내, 피하, 진피내, 근육내, 복강내, 경구, 점막, 요로, 생식관, 위장관, 또는 흡입에 의한 투여에 대해 당해 분야에 공지되어 있다.
특정한 환자에 대한 유효량은 치료하고자 하는 병증, 환자의 전체 건강, 투여 경로 및 용량, 및 부작용의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 치료 및 진단의 방법에 대한 가이드라인이 이용 가능하다(예를 들어, 문헌[Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK] 참조).
본 발명의 백신은 용량 또는 투약량으로 투여될 수 있고, 각각의 용량은 적어도 100개 이상의 박테리아 세포/체중(㎏); 소정의 실시형태에서 1000개 이상의 박테리아 세포/체중(㎏); 보통 적어도 10,000개의 세포; 더 보통 적어도 100,000개의 세포; 가장 보통 적어도 100만개의 세포; 대개는 적어도 1000만개의 세포; 더 대개는 적어도 10000만개의 세포; 통상적으로 적어도 10억개의 세포; 보통 적어도 100억개의 세포; 관습적으로 적어도 1000억개의 세포; 때때로 적어도 1조개의 세포/체중(㎏)을 포함한다. 본 발명은 박테리아 투여의 단위가 콜로니 형성 단위(CFU)보다 높은 용량(소랄렌 치료 전의 CFU의 동등하거나, 단위가 박테리아 세포의 수임)을 제공한다.
본 발명의 백신은 용량 또는 투약량으로 투여될 수 있고, 각각의 용량은 중량 중량으로 70㎏ 체중당(또는 1.7 평방 미터 표면적당; 또는 1.5㎏ 간 중량당) 107개 내지 108개의 박테리아; 70㎏ 체중당(또는 1.7 평방 미터 표면적당; 또는 1.5㎏ 간 중량당) 2x107개 내지 2x108개의 박테리아; 70㎏ 체중당(또는 1.7 평방 미터 표면적당; 또는 1.5㎏ 간 중량당) 5x107개 내지 5x108개의 박테리아; 70㎏ 체중당(또는 1.7 평방 미터 표면적당; 또는 1.5㎏ 간 중량당) 108개 내지 109개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 2.0x108개 내지 2.0x109개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 5.0x108개 내지 5.0x109개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 109개 내지 1010개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 2x109개 내지 2x1010개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 5x109개 내지 5x1010개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 1011개 내지 1012개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 2x1011개 내지 2x1012개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 5x1011개 내지 5x1012개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당) 1012개 내지 1013개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 2x1012개 내지 2x1013개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 5x1012개 내지 5x1013개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 1013개 내지 1014개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 2x1013개 내지 2x1014개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 5x1013개 내지 5x1014개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 1014개 내지 1015개의 박테리아; 70㎏당(또는 1.7 평방 미터 표면적당, 또는 1.5㎏ 간 중량당) 2x1014개 내지 2x1015개의 박테리아; 등을 포함한다.
상기 용량 중 하나 이상이 또한 제공되고, 용량은 매일 1회 주사, 2일마다 1회 주사, 3일마다 1회 주사, 4일마다 1회 주사, 5일마다 1회 주사, 6일마다 1회 주사, 7일마다 1회 주사의 방식으로 투여되고, 주사 스케줄은 예를 들어 오직 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 그 이상 동안 유지된다. 본 발명은 또한 상기 용량 및 스케줄의 조합, 예를 들어, 비교적 큰 초기 박테리아 용량과 이후의 비교적 작은 후속 용량, 또는 비교적 작은 초기 용량과 이후의 큰 용량을 포괄한다.
예를 들어, 1회/주, 2회/주, 3회/주, 4회/주, 5회/주, 6회/주, 7회/주, 2주 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회 등의 투약 스케줄이 본 발명에 이용 가능하다. 투약 스케줄은 예를 들어 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2달, 3달, 4달, 5달, 6달, 7달, 8달, 9달, 10달, 11달 및 12달의 전체 기간 동안의 투약을 포함한다.
상기 투약 스케줄의 주기가 제공된다. 주기는 예를 들어, 약 7일마다; 14일마다; 21일마다; 28일마다; 35일마다; 42일마다; 49일마다; 56일마다; 63일마다; 70일마다; 등 반복될 수 있다. 비투약 간격은 주기 사이에 발생할 수 있고, 간격은 예를 들어 약 7일; 14일; 21일; 28일; 35일; 42일; 49일; 56일; 63일; 70일; 등일 수 있다. 본 맥락에서, 용어 "약"은 플러스 또는 마이너스 1일, 플러스 또는 마이너스 2일, 플러스 또는 마이너스 3일, 플러스 또는 마이너스 4일, 플러스 또는 마이너스 5일, 플러스 또는 마이너스 6일, 또는 플러스 또는 마이너스 7일을 포함한다.
본 발명은 경구인 리스테리아의 투여 방법을 포함한다. 정맥내인 리스테리아의 투여 방법이 또한 제공된다. 더욱이, 제공되는 것은 경구, 근육내, 정맥내, 진피내 및/또는 피하인 리스테리아의 투여 방법이다. 본 발명은 리스테리아 박테리아, 또는 고기에 기초하거나, 고기 또는 동물 생성물로부터 유래한 폴리펩타이드를 함유하는 배지에서 성장시킴으로써 제조된 리스테리아 박테리아의 배양물 또는 현탁액을 제공한다. 리스테리아 박테리아, 또는 고기 또는 동물 생성물을 함유하지 않는 배지에서 성장시킴으로써 제조되거나, 식물성 폴리펩타이드를 함유하는 배지에서 성장시킴으로써 제조되거나, 효모 생성물에 기초하지 않는 배지에서 성장시킴으로써 제조되거나, 효모 폴리펩타이드를 함유하는 배지에서 성장시킴으로써 제조된 리스테리아 박테리아의 배양물 또는 현탁액이 본 발명에 의해 또한 제공된다.
추가의 치료학적 물질과의 동시 투여를 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA).
세포용해 T 세포 반응을 키우는 데 유리한 추가의 물질을 또한 사용할 수 있다. 이러한 물질은 본 명세서에서 캐리어라 칭한다. 이는, 제한 없이, B7 동시자극 분자, 인터류킨-2, 인터페론-γ, GM-CSF, CTLA-4 길항제, OX-40/OX-40 리간드, CD40/CD40 리간드, 사르그라모스팀, 레바미솔, 백시니아 바이러스, 바실 칼메테-구에린(BCG: Bacille Calmette-Guerin), 리포솜, 알룸, 프로인트 완전 또는 불완전 아쥬번트, 해독된 내독소, 미네랄 오일, 표면 활성 물질, 예컨대 리포레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩타이드 및 오일 또는 탄화수소 에멀션을 포함한다. 항체 반응에 대해 세포용해 T 세포 반응을 우선적으로 자극하는 T 세포 면역 반응을 유도하기 위한 캐리어가 바람직하지만, 반응 유형 둘 다를 자극하는 것이 또한 사용될 수 있다. 상기 물질이 폴리펩타이드인 경우, 폴리펩타이드 그 자체 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 투여될 수 있다. 캐리어는 세포, 예컨대 항원 제시 세포(APC) 또는 수지상 세포일 수 있다. 항원 제시 세포는 대식세포, 수지상 세포 및 B 세포와 같은 세포 유형을 포함한다. 다른 전문적 항원 제시 세포는 단핵구, 변연부 쿠퍼 세포, 미세아교세포, 랑게르한스 세포, 상호교차(interdigitating) 수지상 세포, 여포성 수지상 세포 및 T 세포를 포함한다. 조건적 항원 제시 세포가 또한 사용될 수 있다. 조건적 항원 제시 세포의 예는 성상교세포, 여포성 세포, 내피세포 및 섬유아세포를 포함한다. 캐리어는 폴리펩타이드를 발현하거나 폴리뉴클레오타이드를 전달하도록(백신접종된 개체의 세포에서 이후 발현됨) 형질전환된 박테리아 세포일 수 있다. 아쥬번트, 예컨대 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄은 면역 반응을 촉발하거나, 증대시키거나, 연장시키는 백신의 능력을 증가시키도록 첨가될 수 있다. 별도로 또는 상기 조성물과 조합되어 사용되는, 추가의 물질, 예컨대 사이토카인, 케모카인 및 박테리아 핵산 서열, 예컨대 CpG, 톨 유사 수용체(TLR) 9 효현제 및 TLR 2, TLR 4, TLR 5, TLR 7, TLR 8, TLR9에 대한 추가의 효현제, 예를 들어 리포단백질, LPS, 모노포스포릴 지질 A, 리포타이코산, 이미퀴모드, 레시퀴모드 및 다른 유사 면역 조절제, 예컨대 환형 디뉴클레오타이드 STING 효현제, 예를 들어 c-다이-GMP, c-다이-AMP, c-다이-IMP 및 c-AMP-GMP는 또한 가능한 아쥬번트이다. 아쥬번트의 다른 대표적인 예는 퀼라야 사포나리아(Quillaja saponaria) 및 코리네박테리아 파르붐의 껍질로부터 정제된 균질한 사포닌을 포함하는 합성 아쥬번트 QS-21을 포함한다(McCune et al., Cancer, 1979; 43:1619). 아쥬번트가 최적화로 처리된다고 이해될 수 있다. 즉, 당업자는 사용하기 위한 최선의 아쥬번트를 결정하기 위해 일상적인 실험에 참여할 수 있다.
치료학적 물질의 유효량은 증상을 보통 적어도 10%, 더 보통 적어도 20%, 가장 보통 적어도 30%, 통상적으로 적어도 40%, 더 통상적으로 적어도 50%, 가장 통상적으로 적어도 60%, 대개는 적어도 70%, 더 대개는 적어도 80%, 가장 대개는 적어도 90%, 관습적으로 적어도 95%, 더 관습적으로 적어도 99%, 가장 관습적으로 적어도 99.9% 감소시키거나 경감시키는 것이다.
본 발명의 시약 및 방법은 오직 하나의 백신접종을 포함하거나; 제1 백신접종을 포함하거나; 적어도 하나의 부스터 백신접종; 적어도 2의 부스터 백신접종; 또는 적어도 3의 부스터 백신접종을 포함하는 백신을 제공한다. 부스터 백신접종을 위한 매개변수에서의 가이드라인이 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌[Marth (1997) Biologicals 25:199-203; Ramsay, et al. (1997) Immunol. Cell Biol. 75:382-388; Gherardi, et al. (2001) Histol. Histopathol. 16:655-667; Leroux-Roels, et al. (2001) ActA Clin. Belg. 56:209-219; Greiner, et al. (2002) Cancer Res. 62:6944-6951; Smith, et al. (2003) J. Med. Virol. 70:Suppl.1:S38-S41; Sepulveda-Amor, et al. (2002) Vaccine 20:2790-2795]을 참조한다.
치료학적 물질의 제제는 예를 들어 동결건조 분말, 슬러리, 수성 용액 또는 현탁액의 형태의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 혼합함으로써 저장을 위해 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY] 참조).
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시하도록 제공된다. 이 실시예는 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하고자 의도되지 않는다.
실시예 1. Lm RIID(리스테리아 모노사이토게네스 재조합효소 유발 세포내 사멸) 균주의 작제
DNA 조작, 정제 및 벡터 어셈블리
대립유전자 교환을 이용하는 필수 리스테리아 모노사이토게네스(Lm) 유전자 세트의 유전자간 구역 5' 및 3'에서 재조합효소 인식 부위(loxP, lox66 및 lox71 변이체, 또는 frt)를 삽입하였다(Camilli, 1993). 주형으로서 10403S(Bishop, 1987) DNA를 사용하여 PCR에 의해 재조합효소 부위를 대립유전자 교환 벡터에 첨가하였다. MyCycler 유전자증폭기(thermocycler)(바이오라드(BioRad), 캘리포니아주 헤르큘레스)에서 고충실도 효소 퓨전(Phusion) DNA 중합효소(NEB, 메사추세츠주 입스위치)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 클로닝에 사용된 올리고뉴클레오타이드(올리고)(Integrated DNA Technologies, 아이오와주 코랄빌)는 하기 표에 기재되어 있다.
Figure pct00027
Figure pct00028
하기 표는 하기 실시예에 사용된 서열의 목록을 제공한다.
Figure pct00029
Figure pct00030
PCR 생성물을 QIAquick 정제 칼럼(Qiagen, 캘리포니아주 발렌시아)으로 정제하고, 적절한 제한 효소(NEB)로 분해하고, T4 DNA 리가제(메사추세츠주 입스위치)를 사용하여 온도 민감 대립유전자 교환 벡터 pKSV7(Smith, 1992)의 유도체인 pKSVoriT에 결찰하였다. 클로닝에 사용된 모든 벡터를 소 장내 알칼리 포스파타제(CIP)(NEB, 메사추세츠주 입스위치)로 처리하였다. 클로닝, 접합에 사용된 박테리아 균주 및 Lm 모 균주는 하기 표 6에 기재되어 있다. 에스체리치아 콜라이 SM10은 제트-컴페턴트 키트(Z-Competent Kit)(Zymo Research, 캘리포니아주 어바인)로 화학적으로 적격이 되었다. XL1-블루 및 SM10 둘 다의 형질전환을 적절한 항생제 선택(pKSVoriT: 75㎍/㎖의 카르베니실린; pPL2 기반 벡터: 20㎍/㎖의 클로르암페니콜)을 갖는 37℃에서의 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 브로쓰(LB) 중에 배양하였다. Lm 균주를 식물성 펩톤 포스페이트 브로쓰(VPP)(Basingstoke, 영국) 중에 성장시켰다. 7.5㎍/㎖의 클로르암페니콜 및 200㎍/㎖의 스트렙토마이신(Teknova, 캘리포니아주 홀리스터)이 보충된 VPP 플레이트에서 Lm을 선택하였다. 대립유전자 교환 벡터는 진단학적 콜로니 PCR, 제한 분해 및 서열분석(SeqXcel, 캘리포니아주 샌 디에고)에 의해 확인되었다. 확인된 플라스미드를 SM10 세포로 형질전환시키고 기재된 바대로 Lm에 접합시켰다. 재조합효소 유전자를 부위 특이적 통합 벡터 pPL2 또는 이의 유도체에서 actA의 하류에서 클로닝하였다(Lauer, 2002).
실시예 2. Cre/lox 매개된 Lm RIID 균주의 조작
Lm RIID 균주를 예시하는 비제한적인 예는 Lm 자이레이즈의 2개의 아단위를 코딩하는 gyrB(lmo0006) 및 gyrA(lmo0007)인 DNA 복제 동안 박테리아 게놈의 감기/풀기에 관여하는 박테리아 유전자를 표적화하는 것에 기초한다. 작제에서의 제1 단계는 recF(lmo0005)의 상류의 MATE 유출(lmo0003)과 yaaA(lmo0004)의 코딩 서열 사이의 lox71의 배치를 수반하고(Albert et al., 1995), 상기 기재된 바대로 대립유전자 교환에 의해 수행되었다(Camilli et al., 1993). 균주를 생성하기 위해 사용된 대립유전자 교환 벡터를 조작하기 위해, 표적 유전자의 상류 플랭킹 구역을 PCR에 의해 프라이머 PL2863/PL2864를 사용하여 증폭시키고, 하류 플랭킹 구역을 프라이머 PL2865/PL2866을 사용하여 증폭시켰다. 이후, PCR 생성물을 oriT(pKSVoriT)를 포함하도록 변형된 셔틀 벡터 플라스미드 pKSV7의 유도체에 클로닝하여(Smith et al., 1992), 플라스미드 pBHE1937을 생성시켰다. PCR에 의해 존재하는 벡터로부터 lox71을 함유하는 400bp의 구역을 증폭하고 이후 pBHE1937에 클로닝하여, 플라스미드 pBHE2099를 생성시킴으로써 lox71 서열을 lmo0003/lmo0004 플랭킹 구역 사이에 삽입하였다. 플라스미드를 서열 검증하고, Lm으로의 접합을 위해 이. 콜라이 SM10으로 형질전환시켰다. SM10 균주를 actA, inlB, uvrAB 코딩 서열이 결실된 DP-L4056의 생 약독화된 유도체인 Lm 균주 BH1959와 교배하였다. 또한, 이 균주는 자살 균주 및 이의 비자살 대조군의 면역원성을 모니터링하기 위해 (문헌[Lauer et al., 2008]에 기재된 바대로) inlB 좌위에서 항원 발현 카세트를 함유하였다. 트랜스접합체(transconjugant)에서 대립유전자 교환을 수행하여 궁극적으로 Lm 균주 BH3141을 생성시킨다.
상기 기재된 바대로(Horton, 1993) 오버랩 연장에 의한 스플라이싱(SOE) PCR을 이용하여 gyrA(lmo0007)와 카디오리핀 씬타제(lmo0008) 사이의 lox71의 하류에(표 5) 제2 돌연변이체 loxP 부위(lox66)를 도입하였다. gyrA에 인접한 구역을 프라이머 PL3141/PL3142로 증폭시키고, (lmo0008에 인접한) 하류 구역을 PL3139/PL3140으로 증폭시켰다. lox66 서열은 프라이머 PL3139 및 PL3142에 포함되었다. 이후, 일차 SOE PCR 생성물을 제2 PCR 단계에 의해 조합하였고, 이 SOE 생성물을 이후 pKSV7oriT에 클로닝하여, 플라스미드 pBHE2193을 생성시켰다. lox71 함유 균주 BH3141로의 pBHE2193과의 대립유전자 교환을 수행하여, Lm 균주 BH3210을 생성시켰다. 이 균주는 lox71 및 lox66에 의해 플랭킹된 yaaA - recF - gyrB - gyrA로 이루어진 게놈 구역을 포함하였다(도 2B).
Lm-RIID 균주를 생성시키는 최종 단계는 actA 프로모터에 기능적으로 연결된 Cre 재조합효소를 코딩하는 플라스미드의 클로닝 및 통합을 수반하여, 백신접종된 수혜자에서의 감염된 세포의 시토졸로 재조합효소 유전자 발현을 제한하였다. Cre의 뉴클레오타이드 서열은 Lm에서 발현을 위해 코돈 최적화되었다(Blue Heron, 워싱턴주 보텔). Cre 서열을 프라이머 PL1536/PL1537로 증폭시키고 EagI/BamHI 단편으로서 actA 프로모터(221bp, 표 5)를 함유하는 pPL2 기반 플라스미드에 클로닝하여(tRNA Arg 좌위에서의 부위 특이적 통합을 허용함), 플라스미드 pBHE2130을 생성시켰다. 이 플라스미드를 모 균주(BH1959) 및 lox71/lox66 함유 변이체(BH3210) 둘 다에 접합하여, 각각 BH3099(비자살 대조군) 및 BH3226(Lm RIID)을 생성시켰다.
Lm-RIID 백신의 제2 비제한적인 예시적인 예로서, BH3141 lmo0003과 lmo0004 사이의 lox71을 함유하는 균주 BH3141에서의 박테리아 기원의 다른 측에 lox66 부위를 위치시킴으로써 절제를 위한 제2 세트의 필수 유전자를 표적화하였다. 이 제2 균주에서 결실된 구역은 lmo2587, 복제 기원(oriC), (DNA 중합효소 III의 아단위를 코딩하는) 필수 복제 개시제 유전자 dnaA 및 dnaN , 및 lmo0003(도 2C)을 포함한다. 올리고 세트 PL4075/PL4017(플랭킹 구역 1)을 사용하여 PCR에 의해 rnpA의 3' 말단으로부터 rpmH의 150bp 하류를 통해 연장되는 구역을 처음에 증폭시킴으로써 pBHE2724인 대립유전자 교환 벡터를 조작하였다. 올리고 세트 PL4018/PL4076(플랭킹 구역 2)을 사용하여 대부분의 lmo2857로 이루어진 제2 플랭킹 구역을 증폭시켰다. lox66 서열은 정방향 프라이머 PL4018에 포함되었다. 제한 효소 매개 3방향 결찰을 이용하여 2개의 플랭킹 구역을 벡터 pKSVoriT로 어셈블링하였다. rpmH와 lmo2857 사이의 유전자간 구역에서 lox66을 임베딩하기 위해 동일한 대립유전자 교환 과정을 반복하였다. 균주 BH3141에서 lox66 함유 서열의 삽입을 확인한 후, 새로운 균주를 BH3901이라 칭했다. (PactA-Cre 카세트를 함유하는) pBHE2130을 접합에 의해 도입하여 RIID 균주 BH3908에서 Lm을 생성시켰다.
유사한 방법을 이용하여, lmo2582로부터 gyrA를 통한 14 킬로염기 구역에 이르는 결실을 표적화함으로써 Lm-RIID 백신의 제3 비제한적인 예시적인 예를 생성하였다(도 2D). 프라이머 PL3246/PL3247을 사용하여 PCR에 의해 lmo2851을 포함하는 1031bp에 이르는 제1 플랭킹 구역을 증폭시켰다. 올리고 PL3248/PL3249를 사용하여 PCR에 의해 lmo2852 및 lmo2853의 대부분을 함유하는 1029bp에 이르는 제2 플랭킹 구역을 증폭시켰다. 단편 둘 다를 벡터 pBHE2292에서 pKSVoriT에 클로닝하였다. 프라이머 PL3339/PL3340을 사용하여 PCR에 의해 (상기 기재된) pBHE2099로부터의 Lox71을 증폭시키고 pBHE2292의 KpnI/XbaI 부위에 클로닝하여, pBHE2358을 생성시켰다. 동일한 대립유전자 교환에서 lox71 부위 및 PactA-Cre 카세트 둘 다의 동시 편입을 허용하기 위해, pBHE2130의 Cre 카세트를 PL3378/PL3379로 증폭시키고 lox71과 lmo2852 플랭킹 구역 사이의 pBHE2358에 클로닝하여, 대립유전자 교환 벡터 pBHE2382를 생성시켰다. lox66 부위를 (상기 기재된) pBHE2193을 사용하여 생 약독화된 Lm11 균주(생 약독화된 Lm ΔactA ΔinlB 백신 균주)에 도입하여, 중간 균주 BH3291을 생성시켰다. BH3291에서 pBHE2382에 함유된 lmo2851과 lmo2852 사이에 lox71 및 PactA -Cre를 삽입하기 위해 제2 대립유전자 교환을 수행하여, Lm-RIID 균주 BH3410을 생성시켰다.
제4 Lm-RIID 균주를 Lm ΔactA ΔinlB 균주 배경에서 작제하고, 이는 다양한 백신 항원 조성물이 후속하여 tRNA Arg 좌위에서 도입되고 면역원성 연구에서 시험되게 하였다. Lm11 균주 배경에서 BH3210을 생성시키는 동일한 순차적인 대립유전자 교환 과정을 반복하였다. 처음에, gyrA의 하류의 lox66 부위를 삽입하기 위해 pBHE2193을 사용하고, 이후 yaaA의 상류의 lox71 부위를 삽입하기 위해 pBHE2099을 사용하였다. lox71-yaaA-recF-gyrB-gyrA-lox66 조성물을 함유하는 균주(도 2B)를 BH3339이라 칭했다. PactA-Cre 카세트를 Lm ΔactA ΔinlB 균주의 결실된 actA 좌위에서 대립유전자 교환에 의해 도입하여, 백신 항원 발현 카세트가 후속하여 tRNA Arg 좌위에서 도입되게 하여 동물 연구에서 평가를 위한 백신 균주를 생성시켰다. 프라이머 PL3546/PL3547을 사용하여 PCR에 의해 mpl 유전자의 825bp를 포함하는 actA 상류 플랭킹 구역을 증폭시켰다. 프라이머 PL3548/PL3549를 사용하여 PCR에 의해 plcB 유전자의 797bp를 포함하는 actA 하류 플랭킹 구역을 증폭시켰다. PCR 생성물을 3방향 결찰에 의해 pKSVoriT에 클로닝하여 벡터 pBHE2519를 생성시켰다. pBHE2519 플라스미드 벡터는 2개의 플랭킹 구역 사이에 독특한 KpnI 및 BglII 부위를 포함하였다. PactA-Cre 카세트를 pBHE2130으로부터 pBHE2519로 서브클로닝하여 pBHE2525를 생성시켰다. ΔactA 좌위에서 PactA -Cre 카세트를 도입하기 위해 대립유전자 교환을 이용하여, Lm-RIID 균주 BH3618을 생성시켰다.
실시예 3. FLP/frt 기반 RIID 균주
감염된 숙주 세포의 시토졸에서 증식에 필요한 Lm 유전자를 선택적으로 결실시키기 위해 추가의 재조합효소 방법을 이용할 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 비제한적인 예는 Lm-RIID 백신을 생성하기 위해 Cre/loxP 시스템 대신에 frt 재조합 부위를 갖는 효모 재조합효소 FLP를 이용하는 것이다. lox66 및 lox71 부위를 frt 재조합 부위로 대체하고(도 2E), Cre 재조합효소 대신에 FLP 재조합효소를 사용함으로써 조성물에서 BH3226과 유사한 균주(도 2B)를 생성시켰다. 하기한 바대로 lmo0003과 lmo0004 사이에 frt 부위를 삽입함으로써 (실시예 1에 기재된) pBHE1937과 유사한 대립유전자 교환 벡터를 작제하였다: 프라이머 쌍 PL2863/PL3472(MATE 유출, lmo0003) 및 PL3471/PL2866(yaaA, lmo0004)을 갖는 10403S DNA에서 PCR을 수행하였다. 프라이머 PL3471 및 PL3472는 frt 서열을 네이티브 리스테리아 서열에 첨가하였다. 개재하는 frt 부위를 갖는 2개의 플랭킹 구역을 포함하는 단일 DNA 단편으로 PCR 생성물을 조합하기 위해 2차 SOE PCR을 이용하였다. 이 작제물을 PstI/EcoRI 단편으로서 pKSV7oriT에 클로닝하여, pBHE2503을 생성시켰다. pBHE2503을 접합에 의해 Lm11로 도입하고, 대립유전자 교환을 수행하여, BH3558을 생성시켰다. pBHE2522인 대립유전자 교환 벡터를 어셈블링하기 위해 제2 세트의 SOE PCR 반응을 이용하고, 이 벡터는 gyrA와 lmo0008 사이에 frt 재조합 부위를 도입하였다. (실시예 1에 기재된) pBHE2193에서 발견된 유사한 플랭킹 구역을 프라이머 세트 PL3553/PL3470(gyrA) 및 PL3469/PL3552(lmo0008)로 증폭시켰다. 프라이머 PL3469 및 PL3470은 frt 서열을 네이티브 리스테리아 서열에 첨가하였다. DNA 단편을 개재하는 frt 부위를 갖는 2개의 플랭킹 구역과 어셈블링하기 위해 SOE PCR을 이용하고, PCR 생성물을 HindIII/PstI 단편으로서 pKVS7oriT에 클로닝하여, pBHE2522를 생성시켰다. pBHE2522를 접합에 의해 BH3558로 도입하고, 대립유전자 교환 후, 자이레이즈 구역이 frt 부위와 플랭킹된 균주, BH3578을 생성시켰다(도 4E). 마지막으로, actA 프로모터로부터 FLP 재조합효소를 발현시키기 위해 벡터를 작제하였다. FLP 재조합효소 코딩 서열을 리스테리아(DNA2.0, 캘리포니아주 멘로 파크)에서의 발현에 대해 코돈 최적화하고, 신생(de novo) 합성하고 클로닝하여, ClaI/EagI 단편으로서 벡터 pJ201:64349를 생성시켰다. actA 프로모터를 pPL2의 에리쓰로마이신 내성 유도체에 클로닝하고(Lauer, 2008), FLP 코딩 서열을 actA 프로모터의 하류의 pJ201:64349로부터 서브클로닝하여, 벡터 pBHE2516을 생성시켰다. pBHE2516을 서열 검증하고, 접합에 의해 균주 BH3578로 도입하고, tRNA Arg 좌위에서 통합시켜, FLP/frt 기반 Lm RIID 균주 BH3602를 생성시켰다.
실시예 4. 실험실 분석 방법
실험실내 성장 곡선
BHI(BD Difco, 뉴저지주 프랭클린 레이크스)에서 밤새 성장한 배양물을 새로운 BHI로 1:100 희석하고, 250rpm에서 37℃에서 진탕시켜 성장시켰다. 바이오라드 스마트스펙(SmartSpec) 3000(바이오라드, 캘리포니아주 헤르큘레스)에서 광학 밀도(OD600 ㎚)를 측정하였다. 대안적으로, 밤샘 BHI 배양물을 1:100 희석하고, 150㎕/웰을 96웰의 평편한 바닥의 플레이트에 분취하고, 베르사 맥스(Versa max) 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 성장에 대해 모니터링하였다.
세포내 성장 곡선
24웰 조직 배양 플레이트(Costar 3524, 코닝(Corning), 뉴욕주)에서 수지상 세포주 DC2.4(Shen, 1997)에서의 성장 곡선을 실행하였다. 10% 열 불활화 소 태아 혈청(하이클론(Hyclone)), 23.8mM 중탄산나트륨(시그마(Sigma)), 1x 비필수 아미노산(셀그로(Cellgro)), 2mM L-글루타민(셀그로), 1x10-2M HEPES 완충제(깁코(Gibco)), 1mM 피루브산나트륨(시그마) 및 50μM의 β-머캅토에탄올(시그마, 미주리주 세인트 루이스)이 보충된 RPMI 1640(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 메사추세츠주 왈탐)에서 웰당 2x105개의 DC2.4 세포를 시딩하였다. 감염을 위해, Lm 균주를 교반 없이 30℃에서 밤새 BHI 중에 성장시키고, 이후 RPMI로 4x106의 cfu/㎖의 최종 농도로 희석하고, 20의 최종 다중 감염도(moi)에 대해 각각의 웰을 감염시키도록 0.5㎖를 사용하였다. 세포를 45분 동안 감염시키고, 1㎖의 DPBS(하이클론, 유타주 사우쓰 로간)로 세척하고, 50㎍/㎖의 겐타마이신을 함유하는 RPMI 완전 배지를 세포외 박테리아의 성장을 방지하기 위해 첨가하였다. 세포내 박테리아 성장을 배지의 흡인에 의해 수회 시점에 모니터링하고, 세포 단층을 DPBS로 세척하고, 세포 단층을 1㎖의 무균수로 저긴장성으로 용해시켰다. 연속 10배 희석액을 200㎍/㎖의 스트렙토마이신(Teknova, 캘리포니아주 홀리스터)이 보충된 BHI 한천 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리하고, cfu/웰의 계산에 계수하였다.
웨스턴 블롯
DC2.4 세포에서 반정량적 세포내 웨스턴 블롯을 수행하였다. 3x105개의 DC2.4 세포를 12웰 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에서 시딩하고 밤새 항온처리하였다. 세포를 웰당 6x106개의 시험 Lm 균주로 감염시켰다(MOI 20). 세포를 1시간 동안 항온처리하고, DPBS로 세정하고, 50㎍/㎖의 겐타마이신을 함유하는 RPMI 완전 배지를 첨가하였다. 세포를 37℃/5% CO2에서 추가로 7시간 배양한 후, 각각의 웰을 1㎖의 DPBS로 세척하고, 세포를 150㎕의 1x LDS(250㎕의 4X LDS 완충제(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 뉴욕주 그랜드 아일랜드), 650㎕의 TE 완충제(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 메사추세츠주 왈탐), 100㎕의 샘플 환원제(라이프 테크놀로지스, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)) 중에 용해시켰다. 세포 용해물을 95℃에서 10분 동안 블록에서 가열하고, 20㎕의 분취량을 1x MES 완충제(인비트로겐(Invitrogen) 중에 4-12% 비스-트리스(Bis-Tris) PAGE 겔에서 실행하고, 검출을 위해 나이트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 오디세이(Odyssey) 차단 완충제(Li-Cor, 네바다주 링컨) 중에 항온처리하였다. 1:4000 희석의 항원 발현을 위한 융합체로서 사용되는 ActA 단백질의 18개의 성숙 아미노산 아미노 말단을 인식하는 A18K 다중클론 래빗 항체를 사용하여 이종성 항원을 검출하였다. 1:4000 희석의 단일클론 항체 MAB8001(피셔 사이언티픽)을 사용하여 리스테리아 P60 단백질로 발현 수준을 정규화하였다. P60 발현 수준은 cfu와 상관되었다. α-MS 800 Cw 및 α-Rb 680(Li-Cor)인 2차 항체를 1:1000 희석으로 사용하였다. 웨스턴을 스캐닝하고, Li-Cor 오디세이 시스템에서 정량화하였다.
동물
챨스 리버 레버러토리즈(Charles River Laboratories), 메사추세츠주 윌밍턴)로부터 C57BL/6, BALB/c, CD1, CD1nu / nu 및 SCID 베이지 마우스(beige mouse)들을 얻었다. 국립 건강 가이드라인 협회에 따라 마우스를 시험하였다. 모든 동물 프로토콜은 아듀로 바이오테크(Aduro BioTech) IACUC에 의해 승인받았다. 리스테리아의 모든 백신접종은 달리 언급되지 않은 한 5x106 cfu로 정맥내 제공되었다.
ELISpot 검정
림프구-포유동물(시더레인 랩스(Cedarlane), 노스캐롤라이나주 버링톤) 및 쥣과 IFN-γ ELISpot 쌍(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주 산 호세)을 사용하여 마우스 전혈로부터 단리된 림프구로 수행된 ELISpot 검정에 의한 실험 동안 면역원성을 모니터링하였다. 실험 종료 시, 비장세포에서 ELISpot 검정을 수행하였다. 2x105개의 세포/웰을 37℃에서 밤새 항-쥣과 IFN-γ 코팅된 ELISpot 플레이트(밀리포어(Millipore, 메사추세츠주 빌레리카)에서 적절한 펩타이드와 항온처리하였다. 세포를 음성 대조군으로서 펩타이드 없이 항온처리하였다. 쥣과 ELISpot를 알칼리 포스파타제 검출 시약(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드)를 사용하여 전개시키고 스캐닝하고 이뮤노스팟(Immunospot) 플레이트 판독기 및 소프트웨어(CTL Ltd, 오하이오주 클리브랜드)를 사용하여 정량화하였다.
WT 리스테리아 시험 감염
C57BL/6 마우스를 5x106 cfu의 각각의 Lm 균주로 1회 백신접종하였다. 34일 후, 마우스를 WT Lm 균주 DP-L4056의 2xLD50으로 시험 감염시켰다(Lauer, 2002). 3일 후, 비장 및 간을 수확하고 균질화하였다. 희석액을 200㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유하는 BHI 플레이트에 도말하여 cfu/장기를 결정하였다.
백시니아 시험 감염
C57BL/6 마우스를 0일 및 29일에 5x106 cfu의 다양한 Lm 균주로 백신접종하였다. 마우스를 복강내로 1x106 pfu로 WT 백시니아에 의해 제2 백신접종 후 49일에 시험 감염시켰다. 난소를 5일 후 수학하고, 플라크 검정을 수행하여 보호 수준을 결정하였다(Brockstedt, 2005).
종양 연구
BALB/c 마우스를 0일에 인간 메소텔린을 발현하도록 조작된 2x105개의 CT26 종양 세포주로 정맥내 시험 감염시켰다. 마우스를 적절한 대조군과 함께 5x106 cfu의 Lm RIID로 4일 후 백신접종하고, 14일 후 동일한 백신접종 용량으로 부스팅하였다. 마우스를 매일 체중 측량하고 모니터링하였다. 죽었을 때, 폐를 수확하고 전이를 계수하였다.
실시예. 5. 결과
효과적이도록, 백신은 면역원성, 효력과 안전성 간의 균형을 요한다. 실행 이유로, 발효 방법을 확립하기 위해 백신을 대규모로 용이하게 제조할 수 있는 것이 추가로 바람직하다. Lm은 시토졸 접근법의 이의 특성으로 인해 면역학적으로 강력한 백신 플랫폼을 구성하고, 이 접근법에서 이것은 증식하고, 코딩된 항원(후속하여 처리되고 MHC I형 분자에서 제시되고 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 프라이밍함)을 발현하고 분비하도록 추가로 조작될 수 있다(Brockstedt and Dubensky, 2008). 야생형 또는 생 약독화된 Lm 균주, 예컨대 Lm ΔActA/ΔinlB는 브로쓰 배양에서 성장하고 증식하고, 또한 이것이 면역 반응을 유도하는 숙주 시토졸에 항원 표적 단백질을 또한 전달할 수 있는 세포에서 성장하고 증식한다. Lm-RIID 백신은 브로쓰 배양에서 용이하게 성장하고 백신 항원을 숙주 세포에 전달하도록 개발되었지만, "자살을 실행"하여 박테리아 증식을 방지하고 백신 플랫폼의 안전성을 증가시키도록 감염된 세포의 시토졸 내의 프로그램을 개시하도록 추가로 조작되었다(도 1).
Lm-RIID 백신 플랫폼의 성장 특징을 평가하기 위해, 모 균주 BH3210(lox66 및 lox71 부위 둘 다를 함유하지만, Cre 재조합효소 발현 카세트가 결여됨; 모든 균주에 대한 유전자형 및 균주 특징은 표 6에 기재됨)에 대해 결실 1(도 3A)이라 칭하는 자이레이즈 구역을 결실시키는 Lm-RIID 균주 BH3226 및 BH3618을 실험실내(브로쓰 배양에서의 발효) 및 숙주 세포에서 성장 특징에 대해 비교하였다. 실험실내 성장을 (실시예 1에 기재된 바대로) 8시간 동안 BHI 브로쓰 배양에서 시간에 걸쳐 광학 밀도 후 측정하였다. 실험실내 성장 곡선은 모든 균주에 대해 매우 유사하여(도 3A), 모 균주 및 Lm-RIID 균주 둘 다가 전통적인 발효 방법에 의해 전파될 수 있다는 것을 나타낸다. 다음에, BH3210 모 Lm 균주 및 Lm-RIID 균주 BH3226 및 BH3618에 대한 세포내 성장 동력학을 DC2.4 마우스 수지상 세포주에서 비교하였다. BH3210은 통상적인 야생형 Lm 균주와 같이 성장하여, 7시간 동안 대략 2 로그로 증식하였다(Portnoy et al., 1988). 반대로, BH3226 및 BH3618 Lm-RIID 균주 둘 다는 동일한 시간 기간에 걸쳐 콜로니 형성 단위를 생성시키는 능력을 2 내지 4 로그로 잃었다(도 3C). 이 결과는 Lm-RIID 균주가 숙주 포유동물 세포의 감염 후 발효 배양에서 전통적인 방법에 의해 전파될 수 있는 반면, Cre 재조합효소의 발현이 유도되어, 필수 자이레이즈 유전자 gyrB 및 gyrA를 함유하는 구역이 후속하여 절제되고 생존능력을 잃는다는 것을 나타낸다.
접근법의 추가의 비제한적인 예시로서, 브로쓰 배양에서의 성장의 동력학 및 제2 세트의 필수 유전자를 표적화하는 Lm-RIID 균주의 세포내 성장을 결정하였다. 염색체 복제 기원(oriC), 및 필수 복제 개시 유전자 dnaA 및 dnaN를 결실시키도록 Lm-RIID 결실 2 균주를 조작하였다(도 4A). Lm-RIID BH3908 균주는 oriC, dnaA 및 dnaN를 플랭킹하는 lox66 및 lox71 부위를 함유하고, 모 BH1959 균주가 그런 것처럼 동일한 동력학으로 브로쓰 배양 중에 성장하였다(도 4B). 반대로, DC2.4 마우스 수지상 세포의 감염 후, Lm-RIID BH3908 균주는 7시간 동안 생존능력(cfu 단위의 2 초과의 로그)을 신속히 잃은 반면, 모 Lm BH1959 균주는 Lm-RIID 균주와 비교하여 4 내지 5 로그 차이인 cfu 단위의 2 초과의 로그로 증식하였다. 이 결과는 Lm-RIID 균주가 숙주 포유동물 세포의 감염 후 발효 배양에서 전통적인 방법에 의해 전파될 수 있는 반면, Cre 재조합효소의 발현이 유도되어, 필수 oriC, dnaA 및 dnaN 유전자를 함유하는 구역이 후속하여 절제되고 생존능력을 잃는 제2 비제한적인 예를 제공한다.
접근법의 다른 추가의 비제한적인 예시로서, 브로쓰 배양에서의 성장의 동력학 및 제3 세트의 필수 유전자를 표적화하는 Lm-RIID 균주의 세포내 성장을 결정하였다. 본 명세서에 기재된 결실 1 및 결실 2 둘 다에 이르는 결실 3 조성물을 함유하고 또한 리스테리아 게놈(lmo2852 내지 rpmH)에서 5개의 추가의 확인된 오픈 리딩 프레임을 포함하는 Lm-RIID 균주를 작제하였다(도 5A). 브로쓰 배양에서의 Lm-RIID 균주 BH3410의 성장 특징을 모 균주 BH3408과 비교하고, 이 균주는 lmo2851과 lmo2852 사이의 단일 lox71 부위 및 동일한 유전자간 구역에 삽입된 PactA -Cre 카세트를 포함하였다. Lm-RIID 균주와 모 균주 사이의 성장 특징은 구별되지 않아서, Lm-RIID 균주가 전통적인 브로쓰 배양 발효에 의해 전파될 수 있다는 것을 다시 한번 나타낸다(도 5B). 추가로, 세포내 성장 곡선은 균주 결실 1 및 결실 2로부터의 데이터와 매우 근사하였다. 반대로, DC2.4 마우스 수지상 세포의 감염 후, Lm-RIID BH3410 균주는 7시간 동안 생존능력(cfu 단위로 대략 3 로그)을 신속히 잃은 반면, Lm BH3408 모 균주는 Lm-RIID 균주와 비교하여 5 로그 차이인 cfu 단위로 2 로그 초과로 증식하였다(도 5C).
당업자는 감염된 숙주 세포의 시토졸에서 증식에 필요한 Lm 유전자를 선택적으로 결실시키도록 대안적인 재조합효소 시스템을 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 브로쓰 배양에서 DC2.4 세포의 감염 후 Lm-RIID 균주 BH3602의 성장 특징을 생 약독화된 모 균주 Lm11(Lm ΔActA/ΔinlB)와 비교하였다. BH3602는 결실에 대해 필수 유전자 yaaA, recF, gyrB, gyrA를 표적화하고, 이것은 Lm-RIID 균주 BH3602가 교대하는 재조합효소 시스템 FLP/frt를 사용한다는 것을 제외하고는 Lm-RIID 균주 BH3226 및 BH3618의 결실 1에서 표적화된 유전자와 유사하였다(도 6A). Lm-RIID 균주 BH3602 및 Lm11 모 균주의 실험실내 성장 동력학은 구별되지 않았다. 반대로, DC2.4 마우스 수지상 세포의 감염 후, Lm-RIID 균주 BH3602는 7시간 동안 생존능력(cfu 단위의 대략 2 로그)을 신속히 잃는 반면, Lm 11 모 균주는 Lm-RIID 균주와 비교하여 4 로그 차이인 cfu 단위의 2 초과의 로그로 증식하였다(도 5C).
하기 표는 본 명세서에 기재된 바대로 제조된 박테리아 균주의 목록을 제공한다:
Figure pct00031
Figure pct00032
실시예 6. 항원 발현 플랫폼으로서의 용도
백신 효력에 대한 전제조건은 면역학적으로 관련된 문맥에서의 표적 항원의 전달이다. Lm 기반 백신의 경우, 항원은 발현되고 숙주 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포) 시토졸에 전달되어야 하고, 코딩된 항원은 발현되고, 박테리아로부터 시토졸로 분비되고, 여기서 후속하는 항원 처리 및 MHC I형 분자에서의 제시는 CD8+ T 세포 프라이밍을 발생시킨다. 항원 발현의 규모가 백신 유도된 면역 반응의 규모에 영향을 미칠 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 마우스 DC2.4 수지상 세포의 감염 후 Lm-RIID 백신에 의한 코딩된 이종성 항원 발현의 세포내 수준을 측정하였다. 비제한적인 예로서, 구별되는 이종성을 코딩하는 4개의 독립적인 Lm-RIID 균주의 항원 발현 수준을 측정하였다. 모든 항원 발현 카세트 작제물은 상기 기재된 바대로 이종성 항원과의 인프레임을 코딩한 리스테리아 ActA 단백질의 아미노 말단 100개 아미노산으로 이루어진 융합 단백질(ActAN100)을 코딩하였다(Lauer et. al., 2008). 세포내 항원 발현의 검출은 (실시예 1에 기재된) ActA의 성숙 아미노 말단에 대해 길러진 다중클론 항체를 사용하여 감염된 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석에 의한다. 모든 항원의 발현은 actA 프로모터와 기능적으로 연결되고, 이는 브로쓰 배양에서 최소로 발현되고 숙주 세포 시토졸에서 대략 200배 유도되었다(Shetron-Rama et al., 2002). 백신 항원의 일시적 발현을 백신접종된 수혜자의 감염된 숙주 세포의 시토졸에서 박테리아의 세포내 사멸과 연결하기 위해, Cre 또는 FLP 재조합효소 발현에 대해 actA 프로모터를 또한 사용하였다. 모든 항원 발현 카세트를 부위 특이적 통합 벡터 pPL2의 유도체에 클로닝하고, 상기 기재된 바대로 Lm11 (생 약독화된) 및 BH3618 (Lm-RIID) 균주 둘 다의 tRNA Arg 좌위에서 통합시켰다(Lauer et. al., 2008).
모든 항원에 대한 유전자를 리스테리아에서의 발현을 위해 코돈 최적화하고 신생 합성하였다(DNA2.0, 캘리포니아주 멘로 파크). 이후, 융합체를 PCR에 의해 어셈블링하고, 암 항원 NY-ESO-1 및 MAGE A3(도 7B) 및 감염성 질병 항원 HBV 중합효소 및 HBxAg(도 7C) 또는 플라스모듐 팔시파룸 포자소체 단백질(PfCSP)(도 7D)의 융합에 대해 클로닝하였다. 실시예 1에 기재된 바대로 발현을 리스테리아 P60 단백질로 정규화하였다. Lm-RIID 균주를 쌍 지운 생 약독화된 대조군 균주로부터의 발현으로 나눠 측정된 발현의 비율로서 Lm-RIID로부터의 상대 발현을 계산하였다. 측정된 발현의 비율은 NY-ESO-1-MAGE A3의 경우 1x이고, HBV 중합효소-HBxAg 융합체의 경우 1.1x이고, Pf-CSP 항원 작제물의 경우 1.8x이었다. 이 결과는 세포내 박테리아 사멸과 동시에, Lm-RIID 균주가 코딩된 백신 항원의 왕성한 수준을 발현하고, 모 재조합 생 약독화된 Lm 백신 균주로 관찰되는 것과 필적하는 수준으로 상당히, 면역 반응의 처리 및 유도를 위해 이것을 숙주 세포로 전달한다는 것을 나타낸다.
실시예 7. 생체내 Lm-RIID 백신 균주의 청소율
엘. 모노사이토게네스(Lm)의 정맥내(IV) 투여 후 마우스에서 감염된 주요 장기는 간 및 비장이었다(Portnoy et al., 2002). 야생형 Lm(WT Lm)과 비교하여 마우스 리스테리아증 모델에서 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB 백신 플랫폼의 중앙 치사율에 의해 결정된 급성 독성은 3 로그 초과로 약독화되었고, 이는 수확된 장기로부터 제조된 세포 용해물에서 콜로니 형성 단위(cfu)의 정량화로 측정되어, 감염된 마우스에서의 간 및 비장에서의 신속한 청소율로 반영된다(Brockstedt et al., 2004).
본 명세서에 포함된 예에서 나타난 것처럼, Lm-RIID는 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB(즉, actA 및 inlB 병원성 유전자의 결실 또는 돌연변이) 백신 균주로부터 유래할 수 있다. 그러나, Lm ΔActA/ΔinlB와 반대로, Lm-RIID 백신은 백신접종된 포유동물의 감염된 세포의 맥락 내에 그 자체의 자살을 저절로 시작하도록 사전 프로그래밍되었다(즉, 조작되었다). Lm ΔActA/ΔinlB 백신과 비교하여 Lm-RIID 백신에 기초한 백신 균주의 안전성 프로필 증가를 나타내기 위해, 면역 적격 C57BL/6 마우스 및 기능적 선천성 및 적응 면역이 결여된 면역 결핍 SCID 베이지 마우스 둘 다에서의 청소율의 동력학을 비교하였다. 5마리의 암컷 C57BL/6 마우스의 그룹에 IV 주사로 5x106 cfu의 Lm-RIID(BH3226) 또는 Lm ΔActA/ΔinlB(BH3099) 백신 균주를 제공하고, 주사 후 0.2시간, 4시간 및 24시간에 수확된 장기로부터 처리된 청명한 용해물의 영양소 한천 연속 희석액에 도말함으로써 간 및 비장에서의 박테리아 부담(burden)을 결정하였다. 간 또는 비장에서 측정된 Lm ΔActA/ΔinlB(BH3099) 백신 균주의 양은 4시간 및 24시간 시점에 유사한 수준에 있었고; 즉, Lm ΔActA/ΔinlB(BH3099) 백신 균주 박테리아 부담은 이 기간 동안 감소하지 않았다(도 8A). 놀라운 비교로, Lm-RIID(BH3226)의 분량은 주사 후 0.2시간 시점과 비교하여 주사 후 4시간에 신속히 감소하였고, Lm-RIID(BH3226) 콜로니는 감염 후 24시간에 평가된 최종 시점에서 배양에 의해 검출되지 않았다(도 8A).
이 결과는 Lm-RIID(BH3226)가 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB(BH3099)와 비교하여 IV 투여 후 마우스의 간 및 비장으로부터 상당히 더 신속히 청소된다는 명백한 증거를 제공한다. 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB 및 Lm-RIID 백신 균주의 청소율에 대한 숙주 면역 반응의 의존성을 평가하기 위해, 별개의 실험에서, 4마리의 암컷 SCID/베이지 면역 결핍 마우스의 그룹에 IV 주사로 5x106 cfu의 Lm-RIID(BH3226) 또는 Lm ΔActA/ΔinlB(BH3099) 백신 균주를 제공하고, 주사 후 20분, 1일, 2일 및 4일에 수확된 장기로부터 처리된 청명한 용해물의 영양소 한천 연속 희석액에 도말함으로써 비장에서의 박테리아 부담을 결정하였다. 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB(BH3099)가 제공된 SCID/베이지 면역 마우스의 비장에서 측정된 박테리아 부담은 주사 후 20분에 측정된 수준과 비교하여 1일에 증가하여, 유입 박테리아의 증식을 나타낸다. Lm ΔActA/ΔinlB(BH3099)에 의한 주사 후 1일에 관찰된 박테리아의 피크 수준은 비장당 적어도 5x106 cfu이고, 이후 평가된 다음 2회 시점에 걸쳐 평가된 주사 후 마지막 4일 시점에 측정된 비장당 약 5x104 cfu의 수준으로 감소하였다(도 8B). 놀라운 비교로, 시점 사이의 cfu의 증가로 결정된 박테리아의 증식이 Lm-RIID(BH3226) 백신 균주가 제공된 SCID/베이지 면역 마우스의 비장에서 측정되지 않고; 박테리아 부담은 주사 후 20분에 평가된 제1 시점 후 주사 후 4일 시점으로 신속히 감소하고, Lm-RIID(BH3226) 콜로니는 비장에서 검출되지 않았다(도 8B). 함께 종합하면, 도 8A 및 도 8b에 도시된 결과는 Lm-RIID 백신 균주가 백신접종된 숙주로부터 그 자체의 청소율을 저절로 개시시키고, 본질적으로, 작용하는 면역 반응이 청소율에 필요하지 않는는 것을 나타낸다. 당업자는 자발적 청소율의 이 특징이 예방학적 백신 및 치료학적 백신 둘 다에 대한 Lm-RIID 기반 균주의 광범위한 적용을 위한 바람직한 특징이라는 것을 인식할 것이다.
실시예 8. Lm-RIID 균주의 면역원성
재조합 엘. 모노사이토게네스는 마우스 및 인간에서 코딩된 이종성 항원에 강력한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역을 유도하는 것으로 나타났다(Brockstedt et al., 2004; Le et al., 2012). 마우스에서의 Lm-RIID의 면역원성은 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB와 비교되었고, 사멸되지만 대사상 활성인 것(KBMA; Lm ΔActA/ΔinlB/δuvrAB)을 비교하였다. Lm-RIID, Lm ΔActA/ΔinlB 및 KBMA 백신의 면역원성이 비교되도록, 각각의 백신 균주는, 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB 및 KBMA 백신에 의해 코딩될 때, 마우스에서 CD8+ T 세포 반응의 범위를 유발하는 것으로 이전에 나타난 5개의 규정된 H-2b 제한된 주조직 적합성 복합체(MHC) I형 에피토프를 코딩하는 동일한 Ag 발현 카세트를 포함하였다(Lauer et al., 2008). 정확한 I형 제한된 에피토프의 어레이의 사용이 생체내 면역원성을 평가하기 위한 최적화 방법을 제공하여, Lm-RIID, Lm ΔActA/ΔinlB 및 KBMA 백신 플랫폼의 비교를 단순화한다.
4개의 일렬로 이격된 백시니아 바이러스(A42R, C4L, K3L 및 B8R) I형 에피토프 및 닭 OVA(SL8) 에피토프를 코딩하는 Ag 발현 카세트 작제물을 합성하고 이후 ActA의 100개의 N 말단 아미노산을 갖는 융합 단백질로서 PrfA 조절된 actA 프로모터의 제어 하에 클로닝하였다(Lauer et al., 2008). 작제물은 쿼드박(Quadvac)으로 공지되어 있고 pPL2 통합 벡터의 유도체로 클로닝되고 이후 상기 기재된 Lm-RIID, Lm ΔActA/ΔinlB 및 KBMA 백신 균주의 tRNAArg 부위로 통합되었다(Lauer et al., 2002; Lauer et al., 2008).
상대 면역원성을 평가하기 위해, 5마리의 암컷 C57BL/6(H-2b) 마우스의 그룹을 5x106 콜로니 형성 단위(CFU)의 용량 수준으로 각각 쿼드박을 코딩하는 Lm-RIID, Lm ΔActA/ΔinlB 및 KBMA 백신 균주로 36일의 간격으로 2회 면역화하였다. 상기 기재된 바대로 광화학적 불활화 전에 KBMA 백신 용량 수준을 측정하였다(Brockstedt et al., 2005). 제2 면역화 후 5일에, 비장을 백신접종된 마우스로부터 수확하고, 상기 기재된 바대로 하기의 아미노산 서열을 갖는 MHC I형 에피토프의 각각에 상응하는 1μM의 펩타이드에 의한 밤샘 자극 후 비장세포의 ELISpot 분석에 의해 5개의 코딩된 에피토프에 특이적인 CD8+ T 세포 반응의 규모를 측정하였다: A42R88-96, YAPVSPIVI; C4L125-132, LNFRFENV; K3L6 -15, YSLPNAGDVI; B8R20-27, TSYKFESV; 및 SL8257 -264, SIINFEKL(Lauer et al., 2008; Moutaftsi et al., 2006). Lm-RIID 백신은 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB 백신 균주로 면역화된 마우스에 규모상 필적하였고, KBMA 백신으로 면역화된 마우스에서 측정된 CD8+ T 세포 반응의 규모보다 상당히 큰, 5개의 MHC I형 에피토프에 특이적인 CD8+ T 세포 반응을 유도하였다(도 9).
이 결과는 Lm-RIID 백신이 백신접종된 수혜자의 감염된 세포 내에 자살을 실행하도록 프로그램을 개시하도록 조작되고 청소율에 대한 기능적 면역 반응을 요하지 않더라도, 놀랍게도, Lm-RIID 백신이 생 약독화된 Lm 백신에 필적하는 강건한 특이적 CD8 T 세포 반응을 유도하는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다. 당업자는 이 결과가 생 약독화된 Lm 백신에 대한 유사한 면역학적 효력을 갖지만, 면역 반응 독립적 자발적 청소율의 이의 특징으로 인해 상당히 개선된 안전성 프로필을 갖는 특징으로 인해 Lm-RIID 백신이 원하는 Ag에 특이적인 T 세포 반응을 유도하는 인간에서의 예방학적 또는 치료학적 백신접종에 대한 일반적 유용성을 갖는다는 것을 나타낸다는 것을 이해할 것이다.
실시예 9. Lm-RIID 기반 백신 균주에 의한 백신접종에 의해 제공된 보호 면역
본 명세서에 제공된 실시예는 Lm-RIID 백신이 숙주 세포 내에 사전 프로그래밍된 자살을 자가 개시하고, 백신접종된 숙주로부터의 청소율에 대해 기능 면역 반응을 보유하지 않지만, 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB 백신 균주에 의한 백신접종에 필적하는 코딩된 항원에 특이적인 세포 면역을 유도하는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다. 그러나, 당업자는 효과적인 면역화의 하나의 중요한 측정이 백신 후보물질이 독성 병원균에 의한 후속 시험 감염에 대해 보호를 부여할 수 있는지의 여부라는 것을 인식할 것이다.
야생형 Lm(WT Lm) 또는 적절한 생 약독화된 균주의 아치사 용량에 의한 마우스의 단일 면역화가, 시험 감염 후 3일에 간 또는 비장에서의 박테리아 부담에 의해 측정되는, WT Lm에 의한 치사 시험 감염에 대해 장기간 보호를 제공한다는 것이 분야에서 널리 인식된다(Bahjat et al., 2006). 보호의 상관분석은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역이고, 체액성 면역은 보호에서 역할을 하지 않는다(Berche et al., 1987). 보호 면역을 제공하는 Lm-RIID 백신접종의 상대 능력을 평가하기 위해, 5마리의 암컷 C57BL/6 마우스의 그룹을 음성 대조군으로서의 행크스 균형 염 용액(HBSS), 또는 5x106 cfu의 Lm-RIID 또는 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB 백신, 또는 1x108 cfu(광화학적 불활화 전에 결정)의 KBMA 백신으로 백신접종하였다. 백신접종된 마우스 및 대조군 마우스를 백신접종 후 41일에 시험 감염하여, 20 LD50 용량(2x105 cfu)의 WT Lm에 의한 치사 박테리아 시험 감염에 대한 보호를 제공하는 백신 유도된 기억 T 세포 반응의 역량을 평가하였다.
Lm-RIID에 의한 백신접종은 HBSS 음성 대조군과 비교하여 WT Lm 시험 감염에 대한 4 로그의 보호를 제공하였다(도 10A). Lm-RIID에 의해 제공된 보호의 수준이 Lm ΔActA/ΔinlB에 의한 백신접종보다 대략 20배 낮지만, 이는 KBMA 백신에 의한 백신접종과 비교하여 3 로그 더 컸다(도 10A). 병원균 시험 감염에 대한 보호를 제공하는 Lm-RIID 백신 유도된 T 세포 반응의 기능적 역량을 평가하기 위한 2차 측정으로서, 본 발명자들은 백시니아 바이러스 시험 감염 모델을 이용하였다. 이 모델로, 면역화에 사용된 시험 백신에 동족(cognate)인 항원을 코딩하는 백시니아 바이러스에 의한 시험 감염 5일 후의 플라크 검정에 의해 마우스의 난소에서 시험 감염 바이러스를 정량화함으로써 보호를 측정하였다(Belyakov et al., 1998; Brockstedt et al., 2005). 보호 면역을 평가하기 위해, 마우스를 5x106 cfu의 Lm-RIID 또는 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB 백신, 또는 1x108 cfu(광화학적 불활화 전에 결정됨)의 KBMA 백신으로 29일의 간격으로 2회 백신접종하였다. 모든 시험 백신은 실시예 9에 기재된 쿼드박 백시니아 바이러스 CD8+ T 세포 에피토프 및 SL8 CD8+ T 세포 에피토프를 코딩하였다. 부스트 백신접종 후 49일에, 마우스를 닭 난알부민을 코딩하는 백시니아 바이러스로 1x106 플라크 형성 단위(pfu)에 의한 복강내 시험 감염에 의해 시험 감염하고, 청명한 처리된 장기 균질물의 연속 희석의 BSC 세포에서 플라크 검정에 의해 4일 후에 난소에서의 pfu를 측정하였다.
놀랍게도, Lm-RIID 또는 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB 백신에 의한 면역화에 의해 제공된 보호의 수준은 구별 가능하지 않았고, HBSS 음성 대조군과 비교하여 1000배 초과이고, KBMA 백신에 의한 백신접종에 의해 제공된 보호의 수준의 100배 초과이었다(도 10B). 당업자는 Lm-RIID 백신이 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB 백신과 비교하여 바람직한 안전성 프로필을 갖지만, 병원균 시험 감염에 대한 보호의 정도로 측정된, 필적하는 면역학적 효력을 제공한다는 것을 쉽게 인식할 것이다.
실시예 10. Lm-RIID 백신은 치료학적 항종양 효율을 유도한다
Lm-RIID 백신이 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB 백신 균주에 필적하는 동족 항원을 코딩하는 병원균에 의한 시험 감염에 대한 보호를 제공하도록 작용하는 벡터 코딩된 항원에 특이적인 CD4+ 및 CD8+ T 세포 면역을 자극한다는 것이 입증되면서, 당업자는 Lm-RIID 백신이 암 면역요법에 대한 적용을 또한 갖는다는 것을 인식할 것이다. 효과적인 면역 치료에 대한 장벽이 적절한 규모 및 기능의 세포독성 CD8+ T 세포의 유도를 제한할 수 있는 표적화된 종양 관련 항원(들)에 대한 관용성, 악성 세포의 부위로의 생성된 T 세포의 부족한 통행(trafficking) 및 유도된 T 세포 반응의 부족한 지속(persistence)을 포함한다고 널리 이해된다(Blankenstein et al., 2012; Topalian et al., 2011). 효력의 하나의 측정은, 종양 보유 동물에 투여될 때, 대조군과 비교하여 종양 진행을 회귀시키고 생존 시간을 증가시키는 선택된 플랫폼의 역량을 평가하는 것이다.
Lm-RIID 백신에 의한 치료학적 백신접종의 이익을 시험하기 위해 CT-26 쥣과 콜론 종양 세포주를 사용하였다(Slansky et al., 2000). CT-26 종양 세포를 정맥내(IV) 접종으로 제공하거나(이는 이식 후 원하는 시점에 치료된 마우스로부터 수확된 폐에서 정량화될 수 있는 폐 종양 결절을 확립시킴), 대안적으로, 마우스를 생존에 대해 모니터링하고, 적절한 호흡을 방지하는 과도한 종양 성장으로 인해 빈사 상태일 때 희생시켰다. CT26 종양 모델에서의 치료학적 효율은 gp70 내인성 종양 항원으로부터 H-2Ld 제한된 면역우성 에피토프 AH1에 대한 자기 관용성의 파괴를 요한다(Slansky et al., 2000). 상기 기재된 바대로 닭 난알부민(OVA)에서 독특한 Ava II 제한 엔도뉴클레아제 부위 내의 인프레임 베딩된 MHC I형 에피토프의 제5 위치에서의 불규칙한 알라닌에 대한 발린 변화를 함유하는, 변경된 펩타이드 리간드 AH1-A5 에피토프(SPSYAYHQF)를 발현하는 Lm-RIID 백신을 작제하였다(Brockstedt et al., 2004). Lm-RIID의 치료학적 효율을 평가하기 위해, 30마리의 암컷 BALB/c 마우스에 꼬리 정맥 주사에 의해 100㎕의 HBSS 중에 현탁된 2x105개의 CT26 세포를 각각 제공하고, 이후 10마리의 마우스의 3개 그룹으로 무작위하였다. 4일 후, 마우스의 3개 그룹에 100㎕의 HBSS, 또는 5x106 cfu의 OVA를 발현하는 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB(BH892), 또는 5x106 cfu의 OVA-AH1-A5를 발현하는 Lm RIID(BH3709)를 제공하였다. 14일 후, 동일한 주사를 마우스의 모든 3개의 그룹에 제공하고, 모든 마우스를 이후 생존에 대해 매일 모니터링하였다.
HBSS 또는 OVA를 발현하는 생 약독화된 Lm ΔActA/ΔinlB로 처치된 음성 대조군에서의 종양 보유 동물은 CT-26 종양 세포 이식 후 약 24일의 중앙 생존 기간을 가졌다(도 11). 놀라운 비교로, OVA-AH1-A5를 발현하는 Lm RIID가 제공된 마우스의 그룹은 대조군보다 상당히 더 긴 55일의 중앙 생존 기간을 가졌다(p<0.001, 로그 랭크 만텔-콕스(Mantel-Cox) 시험)(도 11). 추가로, 종양 세포 이식 후 160일에 실험이 종료할 때, OVA-AH1-A5를 발현하는 Lm-RIID 백신으로 처치된 동물 중 30%는 장기간 생존자이었다(도 11). 이 결과는 Lm-RIID 백신이 백신접종된 수혜자의 숙주 세포 내에 자살을 실행하도록 사전 프로그래밍되지만, 종양 보유 동물에서 기능적 종양 특이적 CD8+ T 세포 반응을 개시하고 음성 대조군과 비교하여 상당한 이익 및 전체 생존율을 제공하는 역량을 보유한다는 분명한 증거를 제공한다. 당업자는 Lm-RIID 백신이 안전성 및 치료학적 효율의 조합된 특성으로 인해 임상 암 면역치료에 대한 직접 적용을 갖는 플랫폼이라는 것을 인식할 것이다.
실시예 11. 참조문헌
Figure pct00033
Figure pct00034
당해 분야의 당업자는 목적을 실행하고 언급된 목표 및 이점, 및 이것에 고유한 것을 얻기 위해 본 발명이 매우 적합하다는 것을 용이하게 알 것이다. 본 명세서에 제공된 예는 바람직한 실시형태를 대표하고 예시적이며 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 의도되지 않는다.
본 발명의 범위 및 정신을 벗어남이 없이 본 명세서에 개시된 본 발명에 다양한 치환 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당해 분야에서의 당업자에게 명확할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공보는 각각의 개별적인 공보가 구체적으로 및 개별적으로 참조문헌으로 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에서 참조문헌으로 포함된다.
본 명세서에서 예시적으로 기재된 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 구성요소 또는 구성요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 각각의 경우에 본 명세서에서 임의의 용어 "포함하는", "로 필수적으로 이루어진" 및 "로 이루어진"은 다른 2개의 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 면에서 사용될 수 있고, 도시되거나 기재된 특징 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제한 이러한 용어 및 표현의 사용에서 의도가 없지만, 청구된 본 발명의 범위 내에 다양한 변형이 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시형태에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본 명세서에서 개시된 개념의 임의의 특징, 변형 및 변경이 당해 분야의 당업자에 의해 의존할 수 있고, 이러한 변형 및 변경이 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.
다른 실시형태는 하기 특허청구범위 내에 기재되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ADURO BIOTECH, INC. <120> FACULTATIVELY ATTENUATED BACTERIAL SPECIES AND METHODS OF PREPARATION AND USE THEREOF <130> WO2014/074635 <140> PCT/US2013/068800 <141> 2013-11-06 <150> US 61/723,234 <151> 2012-11-06 <160> 57 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 237 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 1 Met Asn Ala Gln Ala Glu Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Thr Asn Gly 1 5 10 15 Ile Lys Pro Lys Gln Phe His Lys Lys Glu Leu Ile Phe Asn Gln Trp 20 25 30 Asp Pro Gln Glu Tyr Cys Ile Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Thr Lys Leu 35 40 45 Thr Ser Ile Ser Glu Asn Gly Thr Ile Met Asn Leu Gln Tyr Tyr Lys 50 55 60 Gly Ala Phe Val Ile Met Ser Gly Phe Ile Asp Thr Glu Thr Ser Val 65 70 75 80 Gly Tyr Tyr Asn Leu Glu Val Ile Ser Glu Gln Ala Thr Ala Tyr Val 85 90 95 Ile Lys Ile Asn Glu Leu Lys Glu Leu Leu Ser Lys Asn Leu Thr His 100 105 110 Phe Phe Tyr Val Phe Gln Thr Leu Gln Lys Gln Val Ser Tyr Ser Leu 115 120 125 Ala Lys Phe Asn Asp Phe Ser Ile Asn Gly Lys Leu Gly Ser Ile Cys 130 135 140 Gly Gln Leu Leu Ile Leu Thr Tyr Val Tyr Gly Lys Glu Thr Pro Asp 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ile Thr Leu Asp Asn Leu Thr Met Gln Glu Leu Gly Tyr 165 170 175 Ser Ser Gly Ile Ala His Ser Ser Ala Val Ser Arg Ile Ile Ser Lys 180 185 190 Leu Lys Gln Glu Lys Val Ile Val Tyr Lys Asn Ser Cys Phe Tyr Val 195 200 205 Gln Asn Leu Asp Tyr Leu Lys Arg Tyr Ala Pro Lys Leu Asp Glu Trp 210 215 220 Phe Tyr Leu Ala Cys Pro Ala Thr Trp Gly Lys Leu Asn 225 230 235 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 2 Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr 1 5 10 15 Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala 20 25 <210> 3 <211> 100 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 3 Val Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr 1 5 10 15 Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp 20 25 30 Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr 35 40 45 Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala 50 55 60 Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys 65 70 75 80 Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys 85 90 95 Ala Glu Lys Gly 100 <210> 4 <211> 100 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 4 Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr 1 5 10 15 Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp 20 25 30 Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr 35 40 45 Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala 50 55 60 Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys 65 70 75 80 Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys 85 90 95 Ala Glu Lys Gly 100 <210> 5 <211> 102 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 5 Val Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr 1 5 10 15 Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp 20 25 30 Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr 35 40 45 Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala 50 55 60 Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys 65 70 75 80 Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys 85 90 95 Ala Glu Lys Gly Gly Ser 100 <210> 6 <211> 102 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes <400> 6 Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr 1 5 10 15 Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp 20 25 30 Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr 35 40 45 Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala 50 55 60 Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys 65 70 75 80 Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys 85 90 95 Ala Glu Lys Gly Gly Ser 100 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 tttcggccga tgagtaacct attaactgtt cat 33 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 tttggatcct tagtctccat cttctaataa t 31 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 tttggtaccg gtcatgatga cattaataca aca 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 tttgagctct atcctaaatg gctttatatc agt 33 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 tttaagcttt tggaaattcg attaccccac t 31 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 tttggtacct ggttattttc gtcgaataac tgcc 34 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 tttggtacct ttgagctctt ttagtaaaaa aacgccagag aagc 44 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 tttgaattct ccgttgttgc aatattcgct 30 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 15 tttaagcttt ccctgaagaa gaagtagcaa tta 33 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 tttggtacca gcttgatttt attcttctat gtcgc 35 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 tttggtacct ttgagctcgg aaatgactct aatttgcgaa t 41 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 tttgaattct ccatgtatac ccaatcgttt agga 34 <210> 19 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 19 ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggtaggaaat gactctaatt tgcgaat 57 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 20 tttgaattct ccatgtatac ccaatcgttt agga 34 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 21 tttaagcttt ccctgaagaa gaagtagcaa tta 33 <210> 22 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 22 taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatagcttg attttattct tctatgtcgc 60 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 23 tttgaattca cagaaggaga ttgtgaaatg 30 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 gggtctagat ttggtaccaa tagaagcgta ctgcgact 38 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 25 gggtctagag tttcacgtga aacattcta 29 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 26 tttaagcttc ggaattggtt caagactgg 29 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 27 attggtacct tcgaggagta aacttcccaa 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 aactctagac accgcggtgg cggccgataa 30 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 tatgcggccg cgggaagcag ttggggttaa ct 32 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 30 aactctagac ttagtctcca tcttctaata 30 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 31 aaaggaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttctg cggaaatgac tctaatttgc 60 <210> 32 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 32 gcagaagttc ctatactttc tagagaatag gaacttcctt tagcttgatt ttattcttct 60 <210> 33 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 33 aaaggaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttctg cttttagtaa aaaaacgcca 60 <210> 34 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 34 gcagaagttc ctatactttc tagagaatag gaacttcctt ttggttattt tcgtcgaata 60 <210> 35 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 tttctgcagg tggatagaac tcataaagga c 31 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 tttggtacct cagttaaccc caactgcttc 30 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 tttggtacct ttagatctaa acacagaacg aaagaaaaag 40 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 tttgaattcc cagtaggttc cactgtatc 29 <210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 39 tttctgcagt ccatgtatac ccaatcgttt agga 34 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 tttaagcttt ccctgaagaa gaagtagcaa tta 33 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 tttagatcta aatggttttt ctctctataa 30 <210> 42 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 42 tagatctata acttcgtata gcatacatta tacgaacggt attcgaaaat tattgcgtta 60 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 tttctgcaga tgattcaatc cttcttgctt 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 gggtctagag agttatacaa aacgggaata 30 <210> 45 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34 <210> 46 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 47 ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34 <210> 48 <211> 221 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 48 gggaagcagt tggggttaac tgattaacaa atgttagaga aaaattaatt ctccaagtga 60 tattcttaaa ataattcatg aatatttttt cttatattag ctaattaaga agataattaa 120 ctgctaatcc aatttttaac ggaataaatt agtgaaaatg aaggccgaat tttccttgtt 180 ctaaaaaggt tgtattagcg tatcacgagg agggagtata a 221 <210> 49 <211> 1032 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 49 atgagtaacc tattaactgt tcatcaaaat ttaccagcat taccagtgga tgcaacatca 60 gatgaagtaa gaaaaaattt aatggatatg tttagagacc gacaagcctt ttcggagcat 120 acatggaaaa tgttattatc tgtttgtaga tcatgggcag catggtgcaa acttaacaat 180 agaaaatggt ttccagcaga accagaagat gtacgagatt atttattata ccttcaagca 240 agaggattag cagtaaaaac cattcaacaa catttaggac aattaaatat gttacataga 300 cgatcaggat taccaagacc tagcgattct aacgcagtta gtttagttat gagaagaatt 360 agaaaagaaa atgtcgatgc aggcgaacga gcaaaacaag cactagcatt tgaacgtaca 420 gatttcgacc aagtaagatc attaatggaa aatagcgacc gttgtcaaga catccgaaac 480 ttagcttttt taggaatagc atacaacaca ttattaagaa tagcagaaat agccagaatt 540 agagtaaaag acattagtag aacagatgga ggaagaatgt taattcatat tggaagaaca 600 aaaacattag tatcaacagc cggggtagaa aaagcgttat cattaggagt tacaaaatta 660 gtagaacgat ggatttcagt ttcaggagtg gcagatgacc caaataatta tttattttgt 720 agagtacgaa aaaacggagt agcagcacct tcagcaacaa gtcaattaag tacaagagca 780 ttagaaggaa tattcgaagc aacacatcga ctaatttacg gagcaaaaga tgatagtgga 840 caacgatatt tagcttggag tggacacagt gcgcgagtag gagcagcaag agatatggca 900 agagcgggag ttagtatacc agaaataatg caagcaggag gatggacaaa tgtaaatatt 960 gtaatgaatt atattagaaa tttagatagt gaaaccggtg caatggtacg attattagaa 1020 gatggagact aa 1032 <210> 50 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34 <210> 51 <211> 1272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 51 atgtcgcaat ttgatatact atgtaaaact ccacctaaag tattagtgcg tcaatttgtt 60 gaacgttttg aacgaccaag tggcgaaaag atagcttcct gtgccgcgga acttacttac 120 ttgtgttgga tgattacaca taatggcact gcaatcaaaa gagcaacatt catgtcatac 180 aacaccatca tttctaattc tttatcattt gatattgtta acaaaagttt acaattcaaa 240 tacaaaactc aaaaagcgac gattcttgaa gctagtttga aaaagttaat cccagcatgg 300 gagtttacca tcattcctta caatggacag aaacaccaat ccgacattac agacattgtt 360 tctagtttac aactacaatt tgaaagcagt gaagaagcgg ataaagggaa ctcacattcg 420 aagaaaatgt taaaggcttt gttatctgaa ggagaatcta tctgggagat tacagaaaag 480 attctaaact cttttgagta tacttcacgc tttactaaaa ccaaaacgtt ataccagttt 540 ctttttctag ctacattcat taactgcggt cgatttagtg acattaagaa tgtagatcct 600 aaatcgttca agttagtcca aaacaagtat ctaggtgtca tcattcaatg cttagttacg 660 gaaacaaaaa cgagtgtaag tagacatatc tatttctttt ctgctagagg tagaattgat 720 ccgcttgtat acttagatga atttctacgt aattcagagc cggtgcttaa acgcgttaat 780 cgtacaggaa atagctcaag caataagcaa gaatatcaac ttttgaaaga caatttggtg 840 cgtagctata acaaagcgtt aaagaagaat gcaccatatc cgatattcgc catcaaaaac 900 gggccaaaat cccacattgg tcgccatctt atgactagct tcctttcgat gaaaggatta 960 acggagttaa caaatgtggt aggtaattgg tccgacaaaa gagcgagtgc tgtagcacga 1020 acgacatata cacatcagat tacagctatt ccagatcact actttgcatt agttagtaga 1080 tactatgcat atgatccaat ttccaaagaa atgattgctc ttaaagatga aacaaatcca 1140 atagaagaat ggcaacatat cgaacaactt aaaggatcgg cagaaggctc tatacgttat 1200 cctgcatgga atggtatcat ttctcaagaa gttttagact atttgtcaag ctatatcaat 1260 cgtcgcattt aa 1272 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Vaccinia virus <400> 52 Tyr Ala Pro Val Ser Pro Ile Val Ile 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Vaccinia virus <400> 53 Leu Asn Phe Arg Phe Glu Asn Val 1 5 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Vaccinia virus <400> 54 Tyr Ser Leu Pro Asn Ala Gly Asp Val Ile 1 5 10 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Vaccinia virus <400> 55 Thr Ser Tyr Lys Phe Glu Ser Val 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus sp. <400> 56 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe 1 5

Claims (40)

  1. 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자를 상기 박테리아의 게놈에서 결실시키기 위한 상기 박테리아를 구성하는 방법으로서, 상기 결실은 상기 박테리아가 포유동물 숙주로 도입될 때 우선적으로 발생하고,
    (ⅰ) 상기 박테리아로 상기 포유동물 숙주에서 재조합효소(recombinase)의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열에 작동적으로 연결된 박테리아에 이종성(heterologous)인 재조합효소를 코딩하는 핵산을 도입하는 단계, 및
    (ⅱ) 상기 박테리아 게놈으로 상기 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들)로부터의 상류에 상기 재조합효소에 대한 제1 부착 부위를 도입하고 상기 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들)로부터의 하류에 상기 재조합효소에 대한 제2 부착 부위를 도입하여, 상기 재조합효소가, 상기 포유동물 숙주에서 발현될 때, 상기 제1 부착 부위 및 상기 제2 부착 부위에 의해 플랭킹된(flanked) 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들)를 결실시키는 부위 특이적 재조합 사건(site specific recombination event)을 촉진시키고, 상기 박테리아가 상기 부위 특이적 재조합 사건 후 증식이 결핍되는 것인 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 세포내 병원균이고, 상기 조절 서열은 상기 박테리아가 포유동물 숙주 세포에 있고 가장 바람직하게는 조건적(facultative) 세포내 박테리아인 경우 상기 재조합효소의 발현을 우선적으로 유도하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 리스테리아(Listeria), 나이세리아(Neisseria), 마이코박테륨(Mycobacterium), 프란시셀라(Francisella), 바실루스(Bacillus), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 예르시니아(Yersinia), 브루셀라(Brucella), 레지오넬라(Legionella), 리케치아(Rickettsia) 및 클라미디아(Chlamydia)로 이루어진 군으로부터 선택된 속인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 박테리아는 리스테리아 모노사이토게네스이고, 상기 리스테리아 모노사이토게네스는 ΔActA/ΔInlB인 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 조절 서열은 PrfA 의존적인 리스테리아 모노사이토게네스 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, PrfA 의존적 프로모터는 inlA 프로모터, inlB 프로모터, inlC 프로모터, hpt 프로모터, hly 프로모터, plcA 프로모터, mpl 프로모터 및 actA 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 PrfA 의존적 프로모터는 actA 프로모터인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 재조합효소는 φC31 인테그라제, R4 인테그라제, TP901 인테그라제, φBT1 인테그라제, BxB1 인테그라제, PSA 인테그라제, Cre 재조합효소, Flp 재조합효소, XerC 재조합효소, λ 인테그라제, HK022 인테그라제, P22 인테그라제, HP1 인테그라제, L5 인테그라제, γδ 재조합효소, Tn3 재조합효소, gin 재조합효소, RV 인테그라제, SPBc 인테그라제, TG1 인테그라제, φC1 인테그라제, MR11 인테그라제, φ370 인테그라제, φK38 인테그라제, Wβ 인테그라제 및 BL3 인테그라제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제1 부착 부위는 attB 부위이고, 상기 제2 부착 부위는 attP 부위인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자는 DNA 복제에 관여하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 DNA 복제에 관여하는 적어도 하나의 유전자는 ori, dnaA, dnaN, gyrA, gyrB, polC, dnaE, ftsK, ftsZ, ligA, dnaG, parC, parE, holB, dnaX, SMC 및 ftsY로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자는 오페론(operon)의 일부이고, 상기 제1 부착 부위는 상기 오페론의 전부 또는 일부의 상류에 있고, 상기 제2 부착 부위는 상기 오페론의 전부 또는 일부의 하류에 있는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 부착 부위는 상기 오페론의 상류에 있고, 상기 제2 부착 부위는 상기 오페론의 하류에 있는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 재조합효소는 Cre 재조합효소이고, 상기 조절 서열은 actA 프로모터를 포함하며, 상기 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위는 loxP 부위를 포함하고, 상기 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위에 의해 플랭킹된 박테리아의 병원성(virulence)에 필수적인 유전자(들)는 DNA 복제에 관여하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위는 약 20kb 이하의 길이의 핵산 서열을 플랭킹하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 핵산 서열은 약 10kb 이하의 길이인 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 핵산 서열은 약 6kb 길이인 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 상기 박테리아 게놈 내에 이종성 폴리펩타이드를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함하고, 상기 외인성 핵산 서열은 상기 박테리아가 포유동물 숙주에 있을 때 상기 이종성 폴리펩타이드의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열에 작동적으로 연결된 것인 방법.
  20. 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자를 박테리아 게놈에서 결실시키는 방법으로서,
    상기 재조합효소가 상기 박테리아에 의해 발현되고 상기 발현된 재조합효소가 상기 부위 특이적 재조합 사건에 의해 상기 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자를 결실시키는 조건 하에 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 박테리아를 포유동물 숙주로 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 박테리아는 상기 박테리아 게놈 내에 이종성 폴리펩타이드를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함하고, 상기 외인성 핵산 서열은 상기 박테리아가 상기 포유동물 숙주에 있을 때 상기 이종성 폴리펩타이드의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열에 작동적으로 연결되고, 상기 박테리아는 상기 포유동물 숙주 내에 상기 이종성 폴리펩타이드를 발현하는 것인 방법.
  22. 박테리아로서,
    (ⅰ) 포유동물 숙주에서 재조합효소의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열에 작동적으로 연결된 박테리아에 이종성인 재조합효소를 코딩하는 핵산, 및
    (ⅱ) 상기 박테리아의 게놈에서 상기 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자로부터의 상류에 있는 재조합효소에 대한 제1 부착 부위 및 상기 박테리아의 게놈에서 상기 박테리아의 증식에 필수적인 유전자(들) 유전자로부터의 하류에 있는 재조합효소에 대한 제2 부착 부위를 포함하는 박테리아.
  23. 제22항에 있어서, 상기 박테리아는 세포내 병원균이고, 가장 바람직하게는 조건적 세포내 박테리아이고, 상기 조절 서열은 상기 박테리아가 포유동물 숙주 세포에 있을 때 상기 재조합효소의 발현을 우선적으로 유도하는 것인 박테리아.
  24. 제22항에 있어서, 상기 박테리아는 리스테리아, 나이세리아, 마이코박테륨, 프란시셀라, 바실루스, 살모넬라, 쉬겔라, 예르시니아, 브루셀라, 레지오넬라, 리케치아 및 클라미디아로 이루어진 군으로부터 선택된 속인 것인 박테리아.
  25. 제22항에 있어서, 상기 박테리아는 리스테리아 모노사이토게네스인 것인 박테리아.
  26. 제25항에 있어서, 상기 박테리아는 리스테리아 모노사이토게네스이고, 상기 리스테리아 모노사이토게네스는 ΔActA/ΔInlB인 것인 박테리아.
  27. 제22항에 있어서, 상기 조절 서열은 PrfA 의존적인 리스테리아 모노사이토게네스 프로모터를 포함하는 것인 박테리아.
  28. 제27항에 있어서, PrfA 의존적 프로모터는 inlA 프로모터, inlB 프로모터, inlC 프로모터, hpt 프로모터, hly 프로모터, plcA 프로모터, mpl 프로모터 및 actA 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 박테리아.
  29. 제27항에 있어서, 상기 PrfA 의존적 프로모터는 actA 프로모터인 것인 박테리아.
  30. 제22항에 있어서, 상기 재조합효소는 φC31 인테그라제, R4 인테그라제, TP901 인테그라제, φBT1 인테그라제, BxB1 인테그라제, PSA 인테그라제, Cre 재조합효소, Flp 재조합효소, XerC 재조합효소, λ 인테그라제, HK022 인테그라제, P22 인테그라제, HP1 인테그라제, L5 인테그라제, γδ 재조합효소, Tn3 재조합효소, gin 재조합효소, RV 인테그라제, SPBc 인테그라제, TG1 인테그라제, φC1 인테그라제, MR11 인테그라제, φ370 인테그라제, φK38 인테그라제, Wβ 인테그라제 및 BL3 인테그라제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 박테리아.
  31. 제22항에 있어서, 상기 제1 부착 부위는 attB 부위이고, 상기 제2 부착 부위는 attP 부위인 것인 박테리아.
  32. 제22항에 있어서, 상기 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자는 DNA 복제에 관여하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 것인 박테리아.
  33. 제30항에 있어서, 상기 DNA 복제에 관여하는 적어도 하나의 유전자는 ori, dnaA, dnaN, gyrA, gyrB, polC, dnaE, ftsK, ftsZ, ligA, dnaG, parC, parE, holB, dnaX, SMC 및 ftsY로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 박테리아.
  34. 제22항에 있어서, 상기 박테리아의 증식에 필수적인 하나 이상의 유전자는 오페론의 일부이고, 상기 제1 부착 부위는 상기 오페론의 전부 또는 일부의 상류에 있으며, 상기 제2 부착 부위는 상기 오페론의 전부 또는 일부의 하류에 있는 것인 박테리아.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제1 부착 부위는 상기 오페론의 상류에 있고, 상기 제2 부착 부위는 상기 오페론의 하류에 있는 것인 박테리아.
  36. 제22항에 있어서, 상기 재조합효소는 Cre 재조합효소이고, 상기 조절 서열은 actA 프로모터를 포함하며, 상기 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위는 loxP 부위를 포함하고, 상기 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위에 의해 플랭킹된 박테리아의 병원성에 필수적인 유전자(들)는 DNA 복제에 관여하는 것인 박테리아.
  37. 제22항에 있어서, 상기 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위는 약 20kb 이하의 길이의 핵산 서열을 플랭킹하는 것인 박테리아.
  38. 제37항에 있어서, 상기 핵산 서열은 약 10kb 이하의 길이인 것인 박테리아.
  39. 제38항에 있어서, 상기 핵산 서열은 약 6kb 길이인 것인 박테리아.
  40. 제22항에 있어서, 상기 박테리아는 상기 박테리아 게놈 내에 이종성 폴리펩타이드를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함하고, 상기 외인성 핵산 서열은 상기 박테리아가 포유동물 숙주에 있을 때 상기 이종성 폴리펩타이드의 발현을 우선적으로 유도하는 조절 서열에 작동적으로 연결된 것인 박테리아.
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