WO2011034181A1 - ビフィズス菌表層提示融合タンパク質発現遺伝子 - Google Patents

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利朗 白川
さくら 山本
高嶺 片山
潤 和田
康正 加納
雅宣 浅田
康介 島本
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森下仁丹株式会社
国立大学法人神戸大学
株式会社Ｇｍｊ
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a technique for expressing and presenting a protein or peptide on the surface layer of bifidobacteria, and to a novel vaccine by bifidobacteria using this technique.
  • the cell membrane of a cell is a biological membrane that separates the inside and outside of the cell, and there are many membrane proteins having a function of providing cell information and a function of transporting substances inside and outside the cell on the surface of the cell membrane.
  • membrane proteins have played an important role in immunity, and it has been found that membrane proteins on the cell surface are targeted in antigen-antibody reactions. For this reason, a concept has been proposed in which a specific antigen is fused with a membrane protein and presented on the cell surface of a microorganism to be used as an oral vaccine for artificially inducing an antigen-antibody reaction.
  • a specific antigen is fused with a membrane protein and presented on the cell surface of a microorganism to be used as an oral vaccine for artificially inducing an antigen-antibody reaction.
  • Patent Document 1 a vector having a gene encoding a membrane-binding portion of an enzyme protein such as poly- ⁇ -glutamate synthase is used and displayed on the cell surface of a host microorganism.
  • Patent Document 1 a vector having a gene encoding a membrane-binding portion of an enzyme protein such as poly- ⁇ -glutamate synthase is used and displayed on the cell surface of a host microorganism.
  • Patent Document 1 lactic acid bacteria, yeast, and E. coli are reported as hosts.
  • Bifidobacteria Microorganisms belonging to the genus Bifidobacterium (collectively referred to as “bifidobacteria”) are resident bacteria that are found downstream or in the large intestine of humans and other animals. Bifidobacteria are obligately anaerobic Gram-positive bacteria, so they are highly selective in culture (no aerobic bacteria grow) and have high biocompatibility (the most prevalent bacteria in the intestines of infants, Many are also present in adults), and endotoxins found in gram-negative bacteria are absent (high safety). Therefore, bifidobacteria are recognized as GRAS (generally recognized as safe). In addition, Bifidobacterium longum has been reported to have a binding property to mucus consisting of mucin covering the intestinal tract. It is considered to have high adhesion to the skin.
  • An object of the present invention is to provide means for expressing and presenting a protein or peptide on the cell surface of Bifidobacterium.
  • GL-BP GNB / LNB substrate binding membrane protein
  • the present invention provides a bifidus surface expression gene for expressing a target protein or peptide on the surface of bifidobacteria, the gene comprising a gene encoding a GNB / LNB substrate-binding membrane protein derived from bifidobacteria, A gene encoding the protein or peptide of interest is linked in this order from the 5 ′ end.
  • the protein or peptide of interest is an antigen protein or antigen peptide.
  • the antigenic protein or peptide is Salmonella-derived flagellin, and in another embodiment, the antigenic protein or peptide is an influenza virus M2 protein.
  • the Bifidobacterium surface layer expression gene encodes a protein having an adjuvant function between a gene encoding the GNB / LNB substrate-binding membrane protein and a gene encoding the target protein or peptide.
  • the protein having the adjuvant function is flagellin.
  • the present invention also provides a gene expression plasmid containing any of the above-mentioned bifidobacterial surface expression genes in a manner capable of expression.
  • the present invention further provides a transformed bifidobacteria that retains the above-described plasmid and displays the target protein or peptide on the cell surface.
  • the present invention further provides a transformed bifidobacteria that contains any of the above-mentioned bifidobacteria surface expression genes in the genome in a manner capable of expression, and presents the target protein or peptide on the cell surface.
  • the protein or peptide of interest is Salmonella-derived flagellin.
  • the protein or peptide of interest is an influenza virus M2 protein.
  • the above-mentioned transformed bifidobacteria further presents a protein having an adjuvant function on the surface layer.
  • the protein having the adjuvant function is flagellin.
  • the target protein or peptide is an antigen protein or antigen peptide and a protein having an adjuvant function.
  • the present invention also provides an oral Salmonella infectious disease vaccine containing transformed Bifidobacteria that presents Salmonella-derived flagellin on the surface.
  • the present invention also provides an oral influenza vaccine containing transformed bifidobacteria that presents the M2 protein of influenza virus on the surface.
  • the target protein or peptide can be expressed and presented on the cell surface of Bifidobacterium.
  • the antigenic protein is carried as a carrier to the small intestinal mucosa and nasal mucosa, and the antibody response to the antigen presented in the mucosa Can be used as an oral and nasal vaccine.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram of a fusion gene in which a flagellin (FliC) gene is linked downstream of a GL-BP gene.
  • A is a fluorescent micrograph of the transformed bifidobacteria (GL-BP-FliC surface display) obtained in Example 1, and
  • b is an untreated bifidobacteria (GL-BP-FliC surface display) ).
  • 2 is a photograph of Western blotting of a protein solution of transformed bifidobacteria (GL-BP-FliC surface display) obtained in Example 1.
  • Bifidobacteria refers to a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium.
  • Bifidobacteria include Bifidobacterium adolescentis, B. angulatum, B. animalis subsp. Animalis, B. animalis subsp. Lactis, B. asteroides, B. bifidum, Bifidobacterium boum ( B. boum), Bifidobacterium breve, B. catenulatum, B. choerinum, Bifidobacterium coryneform (B coryneforme), B.
  • B. denticolens B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum ), B. globosum, B. indicum, B. infantis, Bifidobacterium inopinatum (B. inopinatum), B. lactis, B. longum, B. magnum, B. merycicum , Bifidobacterium minimum (B. minimum), Bifidobacterium pervulorum, Bifidobacte B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum subsp. Globosum, B. pseudolongum subsp. Globosum, B. pseudocatenulatum (B. pseudocatenulatum) pseudolongum subsp.
  • B. pullorum B. ruminale
  • B. ruminantium Bifidobacterium sexual (B. saeculare)
  • B. scardovii B. subtile
  • B. suis Bifidobacterium thermacid film
  • B. thermophilum Bifidobacterium thermacidophilum
  • Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium animalis subsp. Animalis (B. animalis subsp. Animalis), Bifidobacterium animalis subspice lactis (B. animalis subsp. lactis), Bifidobacterium bifidum (B. bifidum), Bifidobacterium breve (B. breve), Bifidobacterium lactis (B. lactis), Bifidobacterium longum (B. longum) Bifidobacterium pseudolongum subsp. Pseudolongum (B. (pseudolongum subsp. Pseudolongum) is preferably used.
  • strains or mutant strains may also be used. All of these strains are commercially available or are readily available from depository institutions. Examples thereof include B. longum JCM1217 (ATCC 15707), B. bifidum ATCC 11863, and the like.
  • GNB / LNB substrate binding membrane protein GNB / LNB substrate binding membrane protein
  • GL-BP GNB / LNB substrate binding membrane protein
  • ABC protein ATP Binding Cassette protein
  • GL-BP an ABC protein
  • ATP adenosine triphosphate
  • GL-BP an ABC protein
  • ATP adenosine triphosphate
  • GL-BP an ABC protein
  • GL-BP derived from Bifidobacterium longum JCM1217 (ATCC15707) strain has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • GL-BP is not limited to naturally occurring GL-BP, and if it has the ability to be expressed on the cell surface of bifidobacteria, one or more substitutions, insertions, insertions into the amino acids constituting the GL-BP, Or it may have a deletion.
  • the target protein or peptide to be displayed on the surface layer of bifidobacteria is not particularly limited.
  • the target protein or peptide is a protein or peptide that is not originally localized on the cell surface, and is preferably a protein or peptide arranged for the purpose of presentation on the cell surface.
  • antigen protein or peptide, an enzyme, etc. are mentioned.
  • the structure is not limited to a naturally occurring protein or peptide, and the amino acid constituting the protein or peptide may have one or more substitutions, deletions, or additions. .
  • antigen protein or peptide examples include antigen proteins or antigen peptides derived from bacteria, viruses, protozoa and the like.
  • Bacteria include bacteria that can cause bacterial infections such as Salmonella, Salmonella typhimurium, Shigella, Streptococcus pneumoniae, and Mycobacterium tuberculosis.
  • viruses include various types of influenza viruses, herpes viruses, SARS viruses, AIDS viruses, and various hepatitis viruses.
  • protozoa examples include malaria, trichomonas, and toxoplasma.
  • More specific antigenic proteins or peptides include Salmonella or Salmonella typhimurium flagellin protein, influenza virus M2 protein, malaria parasite SERA (Serine Repeat Antigen) protein, group B linkage that causes neonatal group B streptococcal infection GBS80 protein of cocci, pg40 envelope protein of Porphyromonas gingivalis which is the causative agent of periodontal disease, gp120 or gp160 envelope protein of HIV virus, E6, E7 of human papillomavirus which is cervical cancer-causing virus, Or L2 protein, E2NS1 envelope glycoprotein of hepatitis C virus HCV, NS1 non-structural protein of flavivirus causing Japanese encephalitis, or DI II III protein, amyloid beta (A ⁇ ) protein responsible for Alzheimer, gp53 protein of the pestivirus genus causing bovine viral diarrhea virus (BVDV), gp55 envelope protein of porcine cholera virus, canine parpovirus and feline panleukopenia
  • Examples of the enzyme include glucoamylase, ⁇ -amylase, ⁇ -amylase, isoamylase, endoglucanase, exocellobiohydrolase, ⁇ -glucosidase, carboxymethyl cellulase, glutamate dehydrogenase, glutamine synthetase, lipase, lysine decarboxylase, Examples include arabinofuranosidase, peroxidase, and alkaline phosphatase.
  • target proteins or peptides include, for example, fluorescent proteins (GFP, SIRIUS, BFP, CFP, YFP, RFP, Venus, DsRed, mCherry, mKO, mCerulean, etc.), bioluminescent proteins (firefly luciferase, aequorin (Owan jellyfish)) , Renilla luciferase, Cypridina luciferase, etc.), allyl hydrocarbon receptor used for detection of toxic substances, His tag, protein A, cancer and specific proteins (eg Alzheimer's disease) An antibody is mentioned.
  • fluorescent proteins GFP, SIRIUS, BFP, CFP, YFP, RFP, Venus, DsRed, mCherry, mKO, mCerulean, etc.
  • bioluminescent proteins firefly luciferase, aequorin (Owan jellyfish)
  • Renilla luciferase Renilla luciferase
  • Protein with adjuvant function As a protein having an adjuvant function, it is known that a flagellin protein constituting a flagella of a microorganism induces a high level of antibody.
  • Flagella is a long structure protruding from the cell surface and plays an important role in motility and host cell entry.
  • This flagella consists of a protein called flagellin (hereinafter sometimes referred to as FliC).
  • FliC flagellin
  • Salmonella genus S. typhimurium Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhimurium
  • Non-patent Document 3 describes the antigenic protein flagellin of Vibrio cholera (Vibrio cholerae).
  • the antigenic protein flagellin of Shigella dysenteriae is described in Non-Patent Document 4.
  • the flagellin derived from Salmonella typhimurium is an amino acid described in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing.
  • the flagellin protein may have one or more substitutions, deletions or additions in its constituent amino acids as long as it has an adjuvant function.
  • a protein or peptide expressed / presented on the surface layer of bifidobacteria is expressed as a fusion protein with GL-BP.
  • GL-BP and the protein or peptide of interest are linked in this order from the N-terminus.
  • a protein having an adjuvant function may be included between GL-BP and the target protein or peptide.
  • a gene encoding GL-BP, a gene encoding a target protein or peptide, and a gene encoding FliC can be obtained based on known gene sequence or amino acid sequence information, respectively. is there.
  • a genomic DNA or cDNA prepared from any bifidobacteria is used as a template and amplified by polymerase chain reaction (PCR) using a primer pair prepared based on the sequence information of the structural gene of GL-BP of the bifidobacteria.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a gene encoding GL-BP of B. longum can be obtained from the structural gene sequence of GL-BP of Bifidobacterium longum described in Non-Patent Document 5. .
  • it can be obtained by PCR amplification using a chromosomal DNA or cDNA of Bifidobacterium longum as a template and a primer pair prepared based on the sequence information.
  • the gene encoding the target protein or peptide is available based on known gene sequence information or amino acid sequence information.
  • a gene encoding Rhizopus oryzae-derived glucoamylase is produced based on the sequence information of the structural gene of Rhizopus oryzae glucoamylase using genomic DNA or cDNA prepared from Rhizopus oryzae as a template.
  • the obtained primer pair can be amplified by PCR and obtained.
  • the gene encoding FliC is available based on known gene sequence information or amino acid sequence information.
  • the gene encoding FliC is prepared based on the sequence information of the FliC structural gene of the bacterium using, for example, genomic DNA or cDNA prepared from an infectious disease-causing bacterium (for example, Salmonella, Vibrio cholerae, or Shigella) as a template.
  • the obtained primer pair can be amplified by PCR and obtained.
  • a gene encoding each of the above proteins can be obtained by known chemical synthesis from, for example, known base sequence information.
  • the chemical synthesis method include a chemical synthesis method using a DNA synthesizer utilizing the phosphoramidite method.
  • the above gene can also be obtained by amplifying DNA using PCR as a template.
  • a cDNA or a cDNA library synthesized from mRNA contained in tissues or cells of various derived organisms using a DNA or polynucleotide chemically synthesized as a whole or a part thereof as a probe.
  • the above gene can also be obtained by performing colony hybridization or plaque hybridization.
  • the genes encoding the above proteins can be easily obtained from known amino sequence information.
  • the above cDNA library can be obtained by PCR using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the gene encoding the known amino sequence.
  • a method for amplifying a target gene from the above, or a gene incorporated in an appropriate vector, and a DNA fragment or synthetic DNA labeled (probe) that encodes part or all of the gene encoding each of the above proteins And a method of sorting by hybridization.
  • the gene encoding each protein may be a DNA that hybridizes with the gene obtained as described above under stringent conditions.
  • DNA that can hybridize under stringent conditions means DNA obtained by colony hybridization, plaque hybridization, Southern blot hybridization, or the like using the above DNA as a probe. Specifically, hybridization was performed at about 65 ° C. in the presence of about 0.7 to 1.0 M sodium chloride using a filter on which DNA derived from colonies or plaques was immobilized, and then about 0.1 A DNA that can be identified by washing a filter under a condition of about 65 ° C. using a ⁇ 2-fold SSC solution (the composition of a 1-fold SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). It is done.
  • hybridizable DNA specifically, a DNA having at least about 80% homology with the base sequence of a gene encoding each protein obtained based on the known base sequence information or amino acid sequence information, A DNA having a homology of about 90% or more is preferable, and a DNA having a homology of about 95% or more is more preferable.
  • the recombinant DNA can be an expression vector or a chromosomal integration vector (for example, a homologous recombination vector).
  • the plasmid used for the preparation of such a vector is not particularly limited as long as it is a plasmid that can be expressed in bifidobacteria.
  • Examples of plasmids derived from Bifidobacterium include pTB6, pBL67, pBL78, pNAL8H, pNAL8M, pNAC1, pBC1, pMB1, and pGBL8b.
  • Complex plasmids of these plasmids and E. coli plasmids can also be used, and examples thereof include pBLES100, pKKT427, and pRM2.
  • a composite plasmid synthesized from a Bifidobacterium longum plasmid and an Escherichia coli plasmid is preferable from the viewpoint of the stability of expression and the ease of preparation of DNA for preparing a transformant.
  • the expression vector preferably has a selection marker such as antibiotic resistance or amino acid requirement from the viewpoint of selecting a transformed strain.
  • the expression vector is preferably added with a regulatory sequence for the expression of a fusion protein of GL-BP and the target protein or peptide, or so as to be advantageous for the expression.
  • regulatory sequences include promoter sequences, leader sequences, propeptide sequences, enhancer sequences, signal sequences, terminator sequences, and the like. There are no particular restrictions on the origin of these regulatory sequences as long as they are expressed in bifidobacteria.
  • the promoter sequence is not particularly limited as long as it is expressed in bifidobacteria. From the viewpoint of expression efficiency, a Bifidobacterium longum histone-like protein (HU) promoter sequence, LDH promoter, and the like are preferably used.
  • HU Bifidobacterium longum histone-like protein
  • the terminator sequence of the HU gene is preferably used.
  • a leader sequence, a propeptide sequence, an enhancer sequence, a signal sequence, etc. can be arranged as necessary.
  • a gene encoding a linker having an appropriate length may be arranged between a gene encoding GL-BP and a gene encoding a target protein or peptide.
  • a cloning vector is prepared by introducing a regulatory sequence such as a promoter sequence and a terminator sequence and a selectable marker gene into the above-described plasmid as necessary.
  • Selectable markers include spectinomycin (SPr), ampicillin (Ampr), tetracycline (TETr), kanamycin (KMr), streptomycin (STr), neomycin (NEOr) and other antibiotic resistance markers; green fluorescent protein (GFP), Examples include fluorescent markers such as red fluorescent protein (REP); enzymes such as LacZ.
  • plasmids for cloning vectors include pBLES100 and pBREM100 (see Patent Document 2).
  • a vector for expressing the fusion protein on the surface of Bifidobacterium is obtained. It is done.
  • the expression vector obtained by such a method is used for transformation of bifidobacteria.
  • Recombinant DNA eg, an expression vector
  • Any transformation method may be used as long as it is a known method. Specific examples include an electroporation method (electroporation method), a calcium phosphate method, a lipofection method, a calcium ion method, a protoplast method, a microinjection method, and a particle gun method.
  • an electroporation method it is preferable to use an electroporation method.
  • the electroporation method it can be performed under conditions of 0.5 to 20 kV / cm and 0.5 ⁇ sec to 10 msec. More preferably, it is performed at 2 to 10 kV / cm and 50 ⁇ sec to 5 msec.
  • the transformed strain is selected with a selection marker possessed by the fusion protein expression vector.
  • a medium for cultivating the transformed strain a medium suitable for each host microorganism, for example, glucose blood liver (BL) agar medium, De Mann-Logosar sharp (MRS) agar medium, Gifu University anaerobic (GAM) agar Medium, modified GAM (TGAM) agar medium, Briggs agar medium, and yeast extract glucose peptone (YGP) agar medium.
  • Antibiotics are added to these media according to the selection marker, or amino acids are deleted or added to obtain a selective pressure.
  • the culture conditions are preferably anaerobic culture in which bifidobacteria can be cultured. By culturing under anaerobic conditions, the growth of aerobic bacteria can be prevented.
  • the anaerobic condition is in a sealed container that can maintain an anaerobic degree to which bifidobacteria can grow, and examples include conditions that are possible in an anaerobic chamber or an anaerobic box.
  • the culture temperature may be any temperature at which bifidobacteria can be cultured, and is usually 4 ° C to 45 ° C, preferably 15 ° C to 40 ° C, more preferably 24 ° C to 37 ° C.
  • a vector for displaying the fusion protein of GL-BP and the target protein or peptide on the surface was also introduced simultaneously.
  • Transformed bifidobacteria may be prepared.
  • the introduction of the gene encoding the fusion protein may be confirmed by electrophoresis after extracting the plasmid from the transformed bifidobacteria and treating with the restriction enzyme, or the sequence of the restriction enzyme-treated fragment may be directly sequenced.
  • Confirmation of expression of the fusion protein of the obtained transformed bifidobacteria can be performed, for example, by Western blotting.
  • the transformed bifidobacteria are lysed using, for example, a nonionic surfactant.
  • Nonionic surfactants include polyoxyethylene sorbitan esters (Tween® 20, 40, 60, 65, 80, 85), sorbitan esters (Span® 20, 40, 60, 65, 80). , 85).
  • the target protein or peptide is presented on the surface of the bifidobacteria by an immuno-antibody method using an antibody against the target protein or peptide and a FITC-labeled anti-IgG antibody against the transformed bifidobacteria.
  • an immuno-antibody method using an antibody against the target protein or peptide and a FITC-labeled anti-IgG antibody against the transformed bifidobacteria.
  • the antibody used for confirmation may be an antibody against any protein (or peptide).
  • the transformed bifidobacteria in which the target protein or peptide is confirmed to be displayed on the surface may be cultured and collected by a method commonly used by those skilled in the art, and used directly in the preparation of the preparation. Or you may dry and use. Drying is performed by a treatment method that allows growth when exposed to growth conditions such as intestinal environment or culture medium by performing low-temperature treatment such as freeze-drying and low-temperature drying.
  • the transformed bifidobacteria may be post-treated by a known method. For example, rough purification may be performed by centrifugation or the like. In addition, if desired, after rough purification, it may be dissolved or suspended in a solvent conventionally used in the art such as physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), or lactic acid-containing Ringer's solution. Moreover, you may freeze-dry or spray-dry as needed, and you may make it a powdery thing or a granular material.
  • a solvent conventionally used in the art
  • physiological saline such as physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), or lactic acid-containing Ringer's solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the transformed bifidobacteria of the present invention is administered in the form of any preparation when the target protein or peptide presented on the surface layer is preferably administered for the purpose of treating or preventing a disease.
  • the administration route is not particularly limited, and examples thereof include oral administration and parenteral administration.
  • oral administration or nasal administration is preferred.
  • preparations suitable for oral administration include tablets, granules, fine granules, powders, syrups, solutions, capsules or suspensions.
  • preparations suitable for parenteral administration include, for example, injections, drops, inhalants, sprays, suppositories, transdermal absorbents, transmucosal absorbents, and the like.
  • liquid preparations for oral administration for example, sugars such as water, sucrose, sorbit, fructose; glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol; oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil; p-hydroxybenzoic acid Additives for preparations such as preservatives such as acid esters can be used.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, and mannitol
  • disintegrants such as starch and sodium alginate
  • magnesium stearate Lubricants such as talc
  • binders such as polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose and gelatin
  • surfactants such as fatty acid esters
  • plasticizers such as glycerin
  • preparations for intravascular administration such as injections and infusions can be prepared preferably using an aqueous medium isotonic with human blood.
  • an injection can be prepared as a solution, suspension or dispersion with an appropriate auxiliary agent using an aqueous medium selected from a salt solution, a glucose solution, or a mixture of a salt solution and a glucose solution according to a conventional method.
  • Suppositories for enteral administration can be prepared, for example, using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or hydrogenated fatty acid.
  • the spray uses a carrier that does not irritate the human oral cavity and airway mucosa, and can promote absorption by dispersing the transformed bifidobacteria as an active ingredient as fine particles.
  • a carrier for example, lactose or glycerin can be used.
  • lactose or glycerin can be used.
  • it can be prepared as a preparation in the form of an aerosol or dry powder.
  • a preparation for parenteral administration for example, one or more selected from a diluent, a fragrance, a preservative, an excipient, a disintegrant, a lubricant, a binder, a surfactant, a plasticizer and the like
  • a diluent for example, one or more selected from a diluent, a fragrance, a preservative, an excipient, a disintegrant, a lubricant, a binder, a surfactant, a plasticizer and the like
  • a surfactant for example, one or more selected from a diluent, a fragrance, a preservative, an excipient, a disintegrant, a lubricant, a binder, a surfactant, a plasticizer and the like
  • plasticizer for example, one or more selected from a diluent, a fragrance, a preservative, an excipient, a disintegrant, a
  • the transformed bifidobacteria are suitable as an oral vaccine.
  • the antigen protein is flagellin
  • the flagellin is recognized as an antigen in the intestinal wall and an antibody is produced. Therefore, it is an effective oral vaccine against infection with microorganisms having flagellin.
  • the acid-resistant capsule preparations described below pass through without dissolving in the stomach at pH 1 to 3 and reach the intestines when orally administered. And dissolves in the intestine.
  • the transformed bifidobacteria released from the preparation by dissolution of the capsule grows in the intestinal environment and presents the target protein or peptide on its surface layer.
  • the oral vaccine of the present invention is preferably in the form of a capsule preparation.
  • a capsule containing the contents therein is referred to as a “capsule formulation”.
  • the capsule preparation in the present invention is composed of a capsule film and a transformed bifidobacteria that expresses the target protein or peptide on the surface layer, and this capsule film is acid-resistant.
  • a capsule formulation consisting of an acid-resistant capsule membrane and a transformed bifidobacteria that expresses the target protein or peptide on the surface has an acid-resistant capsule membrane and expresses the target protein or peptide on the surface
  • the transformed bifidobacteria expressing the protein or peptide of interest on the surface layer is contained or contained in the acid-resistant capsule film (ie, in the inner region of the capsule formed by the acid-resistant film). Contained).
  • this capsule preparation is also referred to as “acid-resistant capsule preparation”.
  • the transformed bifidobacteria In order for a transformed bifidobacteria expressing the target protein or peptide on the surface to function as an oral vaccine, the transformed bifidobacteria must pass through the stomach, reach the intestine, and be able to grow there. By the way, the pH of the stomach is 1 to 3, and due to this extremely low pH, most of the orally ingested bifidobacteria die. It is said that bifidobacteria that reach the intestine while having a proliferative ability are generally 1 / 10,000 or less of the dose.
  • the transformed bifidobacteria used in the present invention in order for the transformed bifidobacteria used in the present invention to reach the human intestine while remaining alive and to grow in the intestine to express the target protein or peptide, the transformed bifidobacteria are affected by gastric acid. Is preferably avoided as much as possible.
  • the transformed bifidobacteria are preferably included or contained in the acid-resistant capsule film, that is, the transformed bifidobacteria are contained inside the capsule of the acid-resistant film.
  • a capsule preparation is used.
  • the configuration, shape, etc. of the capsule preparation are not particularly limited as long as the film is resistant to gastric acid. That is, it is desirable that gastric acid penetrates into the capsule and does not come into contact with the transformed bifidobacteria.
  • the capsule film may be a film that does not dissolve at pH 4 or less, preferably at pH 1 to 3. There is no particular limitation on the encapsulation method.
  • the seamless capsule is a kind of soft capsule, and refers to a capsule in which the contents are sealed with a seamless film.
  • the seamless capsule can have a multilayer structure of two or more layers, and preferably has a multilayer structure of three or more layers.
  • the innermost layer can contain the contents (in the case of the present invention, transformed bifidobacteria), and the outer layer (or outermost layer) can be a film. In other words, it is a form in which transformed bifidobacteria are included in the film.
  • FIG. 7 is a schematic cross-sectional view of a seamless capsule preparation having a three-layer structure.
  • the three-layer structure is composed of an innermost layer, an endothelial layer that covers the innermost layer, and an outer layer that covers the innermost layer.
  • the innermost layer is composed of the above-mentioned transformed bifidobacteria and a non-aqueous solvent or solid component for suspending / mixing the transformed bifidobacteria (hereinafter, this component is referred to as the innermost layer substance).
  • the innermost layer material is not particularly limited. Examples include various fats and oils, fatty acids, fatty acid esters of sugar, aliphatic hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, chain ethers, higher fatty acid esters, higher alcohols, and terpenes.
  • examples thereof include, but are not limited to, hydrogenated fats and oils, margarine, shortening, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, camphor oil, thin cargo oil, ⁇ -pinene, and D-limonene.
  • These innermost layer materials can be used alone or in admixture of two or more.
  • a substance having a melting point of 20 ° C. to 50 ° C. and different from the innermost layer is used among the substances for the innermost layer. More preferably, a substance that is solid at room temperature is used.
  • the innermost layer substance and the inner layer material were used as the innermost layer substance was hydrogenated palm kernel oil having a melting point of 34 ° C.
  • the innermost layer material was hydrogenated palm kernel oil having a melting point of 43 ° C.
  • the same kind of fats and oils that have been hydrogenated to have different melting points can be used as the material for the skin layer.
  • This endothelium layer can act to inhibit moisture and oxygen permeation and prevent contact with stomach acid.
  • the substance to be selected can be determined in consideration of the storage period of the capsule.
  • Materials for the outer layer include a mixture of protein and water-soluble polyhydric alcohol, a mixture of protein, water-soluble polyhydric alcohol and polysaccharide, and a polysaccharide and water-soluble polyhydric alcohol. And a mixture thereof.
  • proteins include gelatin and collagen.
  • water-soluble polyhydric alcohol include sorbitol, mannitol, glycerin, propylene glycol, and polyethylene glycol.
  • Polysaccharides include agar, gellan gum, xanthan gum, locust bean gum, pectin, alginate, carrageenan, gum arabic, dextrin, modified dextrin, starch, modified starch, pullulan, pectin, and carboxymethylcellulose salt.
  • pectin, alginate, gellan gum, or carrageenan an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt may be added as appropriate.
  • Preparation of the above three-layer structure seamless capsule preparation is performed by a technique well known to those skilled in the art, for example, a dropping method using a triple nozzle described in Japanese Patent No. 1398836.
  • a substance for innermost layer combined with transformed bifidobacteria (for example, lyophilized cells) from the innermost nozzle of a concentric triple nozzle (preferably a hydrophobic solvent substance that is non-flowable at 20 to 50 ° C.
  • a suspension of transformed bifidobacteria into the medium, the substance constituting the endothelial layer (for example, a melt of a substance that is solid at room temperature) from the intermediate nozzle, and the By simultaneously discharging the solution of the substance that becomes the outer layer (film) from the outer nozzle and dropping it into a carrier liquid (for example, corn oil, rapeseed oil, etc.) that flows under cooling, the transformed bifidobacteria in the innermost layer A “seamless” capsule with a three-layer structure is formed.
  • the transformed bifidobacteria are contained or contained by a seamless outer layer coating.
  • the capsule formed as described above is then dried.
  • a drying method for example, normal temperature ventilation drying is performed.
  • the drying is generally performed by, for example, drying at 5 ° C. to 30 ° C. air.
  • the drying time is preferably 2 to 12 hours.
  • the method described in JP-A-07-0669867, which is further subjected to vacuum drying or vacuum freeze drying on the capsules that have been subjected to normal drying as described above, can be suitably used.
  • the degree of vacuum is maintained at 0.5 to 0.02 torr, and in the vacuum freeze drying, the temperature is frozen at -20 ° C. or lower and dried.
  • the time required for vacuum drying or vacuum freeze drying is not particularly limited, but is generally 5 to 60 hours, preferably 24 to 48 hours. If it is 5 hours or less, the drying is insufficient, and the moisture present in the capsule can adversely affect the contents.
  • Capsules obtained by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 07-0669867 have moisture in the capsules sufficiently removed by vacuum freeze-drying, Aw value is 0.20 or less, and thermal conductivity is 0.16 kcal / mh ° C. or less. Can be. Of course, moisture is reduced by vacuum drying or vacuum freeze drying, and at the same time, the capsules are sufficiently dried and porous, so that the thermal conductivity is also much lower than that obtained by simply drying.
  • the Aw value is not the absolute amount of moisture present in the sample, but is a value determined by the presence of moisture, that is, the degree of freedom of water in the sample, and is directly related to the chemical reaction and the growth of microorganisms. It is an index representing water that can be involved, and is measured by an electrical resistance water activity measurement method (for example, Aw meter WA-360, Shibaura Electronics Co., Ltd.).
  • the thermal conductivity is measured by the Fitch method or the like.
  • the Aw value is preferably 0.20 or less, and the thermal conductivity is preferably 0.02 to 0.08 kcal / mh ° C.
  • an acid-resistant outer layer is formed, or the formed seamless capsule film (outermost layer) is treated to be acid-resistant.
  • the acid-resistant outer layer 0.01 to 20% by mass, preferably 0.1 to 10% by mass of pectin, alginate, gum arabic and the like with respect to gelatin, agar, carrageenan and the like having gelling ability. The method of adding so that it may become% is mentioned.
  • Examples of a method for imparting acid resistance to the formed seamless capsule film (outermost layer) include crosslinking treatment of the outer layer (outermost layer) of the seamless capsule and coating treatment of the surface of the seamless capsule. These treatments are preferably performed alone or in combination.
  • crosslinking agent When cross-linking the outer layer containing protein, first, a seamless capsule is prepared and then thoroughly washed with water. The seamless capsule washed with water is added to an aqueous solution containing a crosslinking agent to crosslink the surface of the outer layer.
  • a conventionally well-known crosslinking agent can be used as a crosslinking agent.
  • the crosslinking agent include formaldehyde, acetaldehyde, propionaldehyde, glyoxal, glutaraldehyde, cinnamaldehyde, vanillyl aldehyde, acetone, ethyl methyl ketone, ethylene oxide, propylene oxide, potassium alum, and ammonium alum.
  • 1 part by weight of seamless capsules is added to 50 to 100 parts by weight of an aqueous solution containing 0.1 to 2% (w / v), preferably 0.5 to 2% (w / v) of a crosslinking agent.
  • the outer layer is treated by stirring for ⁇ 300 seconds.
  • the usage-amount of a crosslinking agent and the time to act vary with crosslinking agents. After the surface of the outer coating is crosslinked, it is sufficiently washed with water to remove the aqueous solution containing the crosslinking agent and dry the moisture contained in the outer layer.
  • cross-linking treatment of the outer layer containing the above protein cross-linking by an enzyme treatment using transglutaminase may be performed.
  • 1 part by mass of the produced seamless capsule is added to 50 to 100 parts by mass of an aqueous solution containing 0.1 to 10% (w / v), preferably 0.5 to 2% (w / v) enzyme,
  • the outer layer is treated by stirring for 1 to 300 minutes, washed with water and dried as described above.
  • the resulting wet seamless capsule is dried, and then shellac, ethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose TC-5, vinylpyrrolidone-vinyl acetate copolymer, zein, ethylene Based on wax, etc., using conventional methods such as castor oil, rapeseed oil, dibutyl phthalate, polyethylene glycol, glycerin, stearic acid, fatty acid ester, sorbitan palmitate, polyoxyethylene stearate, acetylated monoglyceride as plasticizer Coat seamless capsules according to
  • the capsule is protected from acidic solutions in the stomach (for example, stomach acid), etc., and is disintegrated in the intestine, thereby releasing transformed bifidobacteria inside the capsule in the intestine. It is possible to sufficiently produce the antigen in the intestine. Entericity is generally imparted by those skilled in the art by producing enteric capsules. Further, an enteric coating can be obtained by using a mixture containing gelatin and pectin as the outer layer material of the seamless capsule. Prepared by adding pectin, alginate, gum arabic and the like to gelatin having gelling ability, agar, carrageenan, etc. in an amount of 0.01 to 20% by mass, preferably 0.1 to 10% by mass. The acid resistant outer layer also has enteric properties.
  • the seamless capsule preparation can be spherical due to its manufacturing method.
  • the average particle size of the seamless capsule is 0.3 to 10 mm, preferably 1.5 to 8.0 mm.
  • the thus obtained seamless capsule preparation can be stored for 6 months or more while retaining the activity of the transformed bifidobacteria at room temperature, and when stored at 10 ° C. or lower, it can be stored for a long period of 1 year or longer. Is possible.
  • the soft capsule preparation contains a suspension of transformed bifidobacteria in a non-aqueous solvent and is contained in a film sheet.
  • the material of the film sheet is the same as the material of the outer layer of the seamless capsule.
  • the soft capsule preparation can be prepared by a known technique, for example, a method described in Japanese Patent No. 2999535.
  • a rotary die can be used to encapsulate and encapsulate the coating sheet by heating it through a mold while injecting and filling the contents.
  • oil obtained as a release agent is removed from the obtained soft capsule by washing with a polar solvent (for example, methanol, ethanol, propanol, isopropanol). .
  • a polar solvent for example, methanol, ethanol, propanol, isopropanol.
  • the crosslinking treatment and the coating treatment may be performed in combination, or any one of the treatments may be performed to make it acid resistant.
  • the acid-resistant film sheet is 0.01 to 20% by mass, preferably 0.1 to 10% by mass of pectin, alginate, gum arabic and the like with respect to gelatin, agar, carrageenan and the like having gelling ability. And can be prepared based on a known method. Alternatively, the film sheet may be combined with a crosslinking treatment and a coating treatment, or any one of the treatments may be performed to make it acid resistant.
  • the capsule is molded and the contents are introduced into the capsule by a known technique, and then the contents are encapsulated by welding the seam of the capsule.
  • a soft capsule preparation containing transformed bifidobacteria can be produced by an acid-resistant film.
  • Soft capsule formulations can have a spherical, elliptical, or rectangular structure.
  • the soft capsule preferably has a major axis of 3 to 16 mm and a minor axis of 2 to 10 mm, more preferably a major axis of 5 to 7 mm and a minor axis of 2 to 3 mm.
  • the thus obtained soft capsule preparation can be stored for 6 months or more while retaining the activity of the transformed bifidobacteria at room temperature, and when stored at 10 ° C. or lower, it can be stored for a long period of 1 year or longer. Is possible.
  • a hard capsule formulation can be produced by pre-molding a capsule film into a body and a cap, filling the contents into the capsule body, and then combining the capsule cap.
  • Examples of the film material for the hard capsule preparation include gelatin, cellulose, pullulan, carrageenan, and cellulose derivatives such as hydroxypropylmethylcellulose.
  • Hard capsules can be molded by methods commonly used by those skilled in the art. The molded capsule may be a commercially available capsule. The contents can be wrapped in a film and sealed.
  • the content contains well-mixed transformed bifidobacteria with excipients (for example, anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, lactose, corn starch, crystalline cellulose) or contains dry powder of transformed bifidobacteria Powder.
  • excipients for example, anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, lactose, corn starch, crystalline cellulose
  • the capsule film may be coated.
  • the materials and methods described in the outer layer of the seamless capsule are applied, thereby imparting acid resistance and preferably disintegration (enteric) in the intestine.
  • This coating may also have the role of encapsulating the capsule film and including the contents.
  • the acid-resistant film sheet is 0.01 to 20% by mass, preferably 0.1 to 10% by mass of pectin, alginate, gum arabic and the like with respect to gelatin, agar, carrageenan and the like having gelling ability. And can be prepared based on a known method. Alternatively, the film sheet may be combined with a crosslinking treatment and a coating treatment, or any one of the treatments may be performed to make it acid resistant.
  • a hard capsule can be molded by a known technique, and the contents are put inside the molded hard capsule and the seam of the capsule is welded. The contents can be encapsulated, and a hard capsule preparation containing transformed bifidobacteria by an acid-resistant film can be produced.
  • the hard capsule preparation thus obtained can be stored for 6 months or longer while retaining the activity of the transformed bifidobacteria at room temperature, and when stored at 10 ° C. or lower, it can be stored for a long period of 1 year or longer. Is possible.
  • Example 1 Preparation of GL-BP-FliC surface display bifidobacteria
  • the PCR product containing the amplified GL-BP gene is subjected to agarose gel electrophoresis, the 1989 bp PCR product is excised, and only the amplified GL-BP fragment is obtained using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Isolated and purified.
  • FliC gene Isolation of FliC gene Primer with XhoI sequence from the genome of Salmonella Salmonella typhimurium (Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhimurium ATCC13312 (purchased from Sumisho Pharma))
  • a FliC gene was amplified by performing a PCR reaction using fliC-f: 5′-cctcgagatggcacaagtcattaatacaaacag-3 ′ (SEQ ID NO: 7) and fliC-r: 5′-cctcgagttaacgcagtaaagagaggacg-3 ′ (SEQ ID NO: 8).
  • the amplified PCR product containing the FliC gene was subjected to agarose gel electrophoresis, the 1502 bp PCR product was excised, and only the FliC amplified fragment was isolated and purified using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System.
  • coli DH5 ⁇ by the heat shock method, applied to an LB agar medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin, cultured overnight at 37 ° C., and a fusion gene of GL-BP gene and FliC gene ( A transformed Escherichia coli carrying the plasmid having FIG. 1) was obtained. From the resulting transformed Escherichia coli, a plasmid was extracted and purified using the Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit, the sequence was confirmed by sequencing, and a recombinant plasmid in which the FliC gene was linked downstream of the GL-BP gene was obtained. The resulting recombinant plasmid was named pJT102.
  • PCR was performed using primers pBLES-f3581: 5′-tagtttgcgcaacgttgttgcc-3 ′ (SEQ ID NO: 11) and pBLES-r93: 5′-gatttcatacacggtgcctgac-3 ′ (SEQ ID NO: 12), and resistance to spectinomycin
  • SPr the gene
  • bifidobacteria replication origin ori region was obtained and purified by ethanol precipitation.
  • primers pMW118-f 5′-atcacgaggccctttcgtcttc-3 ′ (SEQ ID NO: 13) and pMW118-r: 5′-cctgttctattaggtgttacatgc-3 ′ (SEQ ID NO: 14),
  • a PCR product containing the E. coli replication origin ori region was obtained and purified by ethanol precipitation. Using two PCR products, ligation was performed using DNA Ligation Kit Ver2.1.
  • the obtained plasmid was introduced into Escherichia coli DH5 ⁇ by a heat shock method, applied to an LB agar medium containing 70 ⁇ g / ml of spectinomycin, cultured overnight at 37 ° C., and the origin of E. coli replication origin and the spectinomycin.
  • a transformed Escherichia coli carrying a plasmid having a resistance gene (SPr) and a bifidus origin of replication ori region was obtained. From the resulting transformed Escherichia coli, a plasmid was extracted and purified using the Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit, and had an E.
  • coli replication origin ori region a spectinomycin resistance gene (SPr), and a bifidobacterial replication origin ori region.
  • SPr spectinomycin resistance gene
  • bifidobacterial replication origin ori region A recombinant plasmid was obtained.
  • the resulting recombinant plasmid was named shuttle vector pJW241.
  • the PCR amplification product was purified by an ethanol precipitation method and then treated with a restriction enzyme NdeI. Apart from this, the above E.I.
  • the Escherichia coli-Bifidobacterium shuttle vector obtained in (1) was treated with the restriction enzyme NdeI.
  • the NdeI-treated PCR gene fragment and pJW241 were ligated using DNA Ligation Kit Ver2.1, the resulting plasmid was introduced into E. coli DH5 ⁇ by the heat shock method, and an LB agar medium containing 70 ⁇ g / ml of spectinomycin And the cells are cultured overnight at 37 ° C., and the E.
  • coli replication origin ori region the spectinomycin resistance gene (SPr), the bifidobacteria replication origin ori region, and the fusion of the GL-BP gene and the FliC gene.
  • SPr spectinomycin resistance gene
  • bifidobacteria replication origin ori region the fusion of the GL-BP gene and the FliC gene.
  • Plasmids were extracted and purified from the transformed Escherichia coli using the Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit, and the presence of the gene sequence in which the GL-BP gene and the FliC gene were linked was confirmed.
  • the resulting recombinant plasmid was named pJW245.
  • Bifidobacterium longum 105-A (Matsumura H. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61, pp. 1211-1212: Professor Emeritus, University of Tokyo 50 ml of GAM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was inoculated and cultured at 37 ° C. using Aneropac Kenki (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.). During the culture, the absorbance at a wavelength of 600 nm was measured, and the culture was stopped when the absorbance reached 0.4 to 0.8.
  • the cells were collected by centrifugation (6000 ⁇ g, 10 minutes) with a high-speed centrifuge.
  • the collected cells were suspended by adding 10 ml of 10% (v / v) glycerol solution, and centrifuged with a high-speed centrifuge to wash the cells 2 to 3 times.
  • the mixed solution was put into an electroporation cuvette 0.2 cm (manufactured by Bio-Rad), and the conditions were 2 kV, 2.5 ⁇ F, 200 ⁇ using Gene Pulser Xcell electroporation system (manufactured by Bio-Rad). Electroporation was performed. Immediately after electroporation, 0.8 ml of GAM medium that had been brought to 37 ° C. in advance was added, followed by culturing at 37 ° C. for 3 hours using an aneropack.
  • the obtained suspension was stored at ⁇ 80 ° C. to prepare a freeze stock, which was used as a master cell for GL-BP-FliC surface-displayed bifidobacteria (sometimes referred to as transformed bifidobacteria).
  • Example 2 Confirmation of GL-BP-FliC surface display of transformed bifidobacteria-1)
  • the freeze-stock transformed bifidobacteria obtained in Example 1 was thawed and cultured in a GAM medium containing 70 ⁇ g / ml of spectinomycin.
  • the cultured transformed bifidobacteria were centrifuged with a high-speed centrifuge to collect the cells.
  • PBS Natural Gene Co., Ltd.
  • the primary antibody Anti FliC mouse antibody (manufactured by BioLegend) was added to PBS containing 1% (w / v) BSA, and the suspension was added to the bifidobacteria solution and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the bacterial solution left for 30 minutes was centrifuged with a high-speed centrifuge to collect bacterial cells.
  • PBS was added to the collected cells and suspended, and the cells were washed twice by centrifugation with a high-speed centrifuge.
  • the secondary antibody Alexa Fluor TM 488 Rabbit Anti-Mouse IgG antibody (Molecular Probes) was added to PBS containing 1% (w / v) BSA, and this was added to the Bifidobacteria solution and suspended at 37 ° C. Left for 30 minutes. The bacterial solution left for 30 minutes was centrifuged with a high-speed centrifuge to collect bacterial cells. PBS was added to the collected cells and suspended, and the cells were washed twice by centrifugation with a high-speed centrifuge, and then observed with a fluorescence microscope (manufactured by KEYENCE). The results are shown in FIG.
  • FIG. 2 (a) is a fluorescence micrograph of the transformed bifidobacteria (GL-BP-FliC surface display) obtained in Example 1 above
  • FIG. 2 (b) is the host bifidobacteria (GL-BP-FliC). It is a fluorescence micrograph of (without surface layer presentation). From this fluorescence micrograph, it was confirmed that FliC was present on the cell surface of the transformed bifidobacteria.
  • Example 3 Confirmation of GL-BP-FliC surface display of transformed bifidobacteria-2)
  • the freeze-stocked transformed bifidobacteria obtained in Example 1 was thawed and cultured in a GAM medium containing 70 ⁇ g / ml spectinomycin.
  • the cultured transformed bifidobacteria were centrifuged with a high-speed centrifuge to collect the cells. PBS was added to the collected cells and suspended, and the cells were washed 3 times by centrifugation with a high-speed centrifuge.
  • an 8% (w / v) acrylamide gel was set in an electrophoresis apparatus (manufactured by Atto Co., Ltd.), and the obtained sample was applied, followed by electrophoresis with a molecular weight marker at a current of 20 mA for 1.5 hours.
  • the gel after electrophoresis was placed on a nitrocellulose membrane (manufactured by Atto Co., Ltd.), and blotting was performed by applying a current of 20 mA to a blotting apparatus (manufactured by Bio-Rad).
  • TBS made by Nippon Gene Co., Ltd.
  • TBS a buffer solution containing 4% (w / v) skim milk (made by BD) for 1 hour.
  • the nitrocellulose membrane was washed twice with TBS.
  • the nitrocellulose membrane was immersed in TBS to which 0.5% (w / v) primary antibody (Anti FliC mouse antibody: manufactured by BioLegend) was added for 1.5 hours, and washed with TBS three times.
  • the nitrocellulose membrane was immersed in TBS to which 0.5% (w / v) secondary antibody (goat anti mouse IgG conjugated with alkaline phosphatase: manufactured by BioLegend) was added for 3 hours.
  • the nitrocellulose membrane was washed 3 times with TBS, developed using a 1-Step tm NBT / BCIP plus Suppressor kit (manufactured by PIERCE) for 30 minutes under light shielding, rinsed with pure water, and then developed with FliC.
  • the surface expression of the fusion protein with GL-BP (GL-BP-FliC) was confirmed.
  • the results of Western blotting are shown in FIG.
  • Example 4 Preparation of transformed bifidobacteria for mouse administration
  • the freeze-stocked transformed bifidobacteria obtained in Example 1 above was thawed, inoculated into a GAM medium containing 70 ⁇ g / ml of spectinomycin, and cultured overnight at 37 ° C. using Aneropackenki.
  • the cultured bacterial solution was centrifuged with a high-speed centrifuge to collect bacterial cells.
  • PBS was added to the collected cells and suspended, and the cells were washed twice by centrifugation with a high-speed centrifuge. Subsequently, the cells were suspended in PBS so as to be 2.5 ⁇ 10 7 CFU / 100 ⁇ l to obtain transformed bifidobacteria for mouse administration.
  • Example 5 Confirmation of antibody production in mice by administration of transformed bifidobacteria
  • 8 to 12-week-old female BALB / c mice (Charles River Japan Co., Ltd.) were transformed with 50 ⁇ L of the transformed bifidobacteria for mouse administration prepared in Example 4 at a frequency of 3 times a week for 4 weeks.
  • Each was administered orally (test group).
  • Bifidobacterium into which an empty vector (pJW241 vector) was introduced as a comparative control (comparative control group) and 50 ⁇ l of PBS as a negative control (negative control group) were administered in the same manner as in the test group. There were 7, 6 and 5 mice in each group, respectively.
  • the obtained serum and feces lysate were subjected to ELISA as follows. First, 50 ⁇ l / well of 1.0 ⁇ g / ml flagellin (InvivoGen) was added to three Nunc Immunoplate Maxisorb F96 plates (Nalge Nunc), and left overnight at 4 ° C. After washing the plate with PBS, 200 ⁇ l / well of PBS containing 1% (w / v) BSA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and left at room temperature for 2 hours. After washing with TBS, 50 ⁇ l / well of mouse serum prepared with a dilution series with PBS was added and left at room temperature for an additional 3 hours.
  • each of the 3 plates was diluted with Anti IgG Mouse Goat Poly-HRP 1/1000 (R & D Systems) and Anti IgA Mouse Goat Poly-HRP 1/2000 (Santa Cruz Biotechnology). And Anti IgM Mouse Goat Poly-HRP 1/2000 dilution (manufactured by Santa Cruz Biotechnology) were added at 50 ⁇ l / well and allowed to react at room temperature for 3 hours.
  • a substrate reagent OptEIA TM manufactured by BD was added at 100 ⁇ l / well and allowed to react at room temperature for 20 minutes in the dark.
  • the reaction was stopped by adding 100 ⁇ l / well of 1N sulfuric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the absorbance at 450 nm was measured using an absorptiometer Ultrospec Visible Plate Reader II 96 (manufactured by Amersham Biosciences).
  • the time course of anti-flagellin IgA level in fecal lysate is shown in FIG. The higher the absorbance at 450 nm, the higher the IgA level.
  • each value represents the average value of each group of mice, and the bar represents the standard deviation.
  • the amount of anti-flagellin IgA antibody in feces increased markedly on the 11th to 14th days after the start of administration.
  • FIG. 5 (a) shows the anti-flagellin IgA level
  • FIG. 5 (b) shows the anti-flagellin IgG level
  • FIG. 5 (c) shows the time course of the anti-flagellin IgM level.
  • IgA was high 14 days after the start of administration, as in the case of fecal lysate.
  • both IgG and IgM had increased immunoglobulin levels on the 14th day after the start of administration, and remained at a high level on the 28th day.
  • the anti-flagellin antibody was confirmed in the serum by orally administering the flagellin surface layer-presenting bifidobacteria.
  • Example 6 Confirmation of immune responsiveness of spleen cells to transformed bifidobacteria
  • 8-12 week old female BALB / c mice were laparotomized, and the spleen was punctured with a syringe with an 18G needle, and the spleen cells were taken out and transferred to a petri dish.
  • Spleen cells were separated into single cells using a cell strainer and washed twice with sterile PBS. Spleen cells were suspended in 0.1 M ammonium chloride solution, and this cell suspension was incubated at 25 ° C. for 15 minutes in the dark. Centrifuged and collected spleen cells.
  • RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ M 2-mercaptoethanol and 2 mM L-glutamine is added to the collected spleen cells and suspended, and the number of cells is counted. It was.
  • Spleen cells are placed in each well of a 96-well plate (manufactured by Pierce Biotechnology) at 3 ⁇ 10 6 cells / well, and the transformed bifidobacteria for mouse administration prepared in Example 4 is adjusted to 50 ⁇ g / well.
  • spleen cells were cultured at 25 ° C. for 48 hours.
  • spleen cells were placed in each well of a 96-well plate at 3 ⁇ 10 6 cells / well, and spleen cells were cultured at 25 ° C. for 48 hours without adding transformed bifidobacteria. The culture was then centrifuged at 5000g for 10 minutes to obtain a supernatant and stored at -80 ° C.
  • the cytokine concentration in the supernatant was measured using a commercially available IFN- ⁇ and IL-12 ELISA kit (Pierce Biotechnology). As a result, high levels of IFN- ⁇ and IL-12 were detected in the supernatants of all wells in which spleen cells were cultured in the presence of transformed bifidobacteria. Thus, it was confirmed that the production of IFN- ⁇ and IL-12 in the spleen cells of mice was induced by orally administering the flagellin surface-displayed bifidobacteria to the mice.
  • Example 7 Infection test of mice with transformed bifidobacteria-1) 8 to 12-week-old female BALB / c mice were orally administered with 2.5 ⁇ 10 7 cfu / 100 ⁇ l of the transformed bifidobacteria for mouse administration prepared in Example 4 every other day for 2 weeks.
  • Test group Bifidobacterium into which an empty vector (pJW241 vector) was introduced as a comparative control (comparative control group) and 100 ⁇ l of PBS as a negative control (negative control group) were administered in the same manner as in the test group. There were 14 mice in each group.
  • Salmonella typhimurium (Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhimurium) ATCC 14028 (Sumitomo Pharma) Purchased)) (hereinafter referred to as Salmonella typhimurium) was orally administered, and thereafter observed daily for 40 days.
  • Salmonella typhimurium The time course of the survival rate of each group of mice is shown in FIG. As a result, 9 out of 14 animals in the control group died and 12 out of 14 animals in the negative control group died (average survival days were 14 days and 25 days, respectively), but 2 out of 14 animals in the test group. Most individuals survived just by dying.
  • mice For each group of surviving mice, the concentration of cytokines produced by spleen cells was measured using commercially available IFN- ⁇ and IL-12 ELISA kits. As a result, spleen cells isolated from individuals in the test group were shown to produce significantly higher levels of IFN- ⁇ and IL-12 than the other groups. Thus, the lethal action on mice due to oral administration of Salmonella typhimurium could be effectively suppressed by orally administering the flagellin surface layer-presenting bifidobacteria to mice.
  • Example 8 Infection test of mice with transformed bifidobacteria-2) Eleven days after the oral administration of Salmonella typhimurium in Example 7 above, the spleen was taken out from the surviving mouse individuals of each group, and Salmonella typhimurium in the spleen was detected by real-time PCR analysis.
  • DNA was separated and purified from the spleen using a DNeasy Blood & Tissue kit (manufactured by QIAGEN) to prepare a sample DNA solution.
  • genomic DNA was separated and purified from 10 6 to 10 10 cfu of Salmonella typhimurium, and diluted stepwise to obtain a DNA solution for preparing a calibration curve.
  • primers ST11: 5′-gccaaccattgctaaattggcgca-3 ′ (SEQ ID NO: 17) and ST15: 5′-ggtagaaattcccagcgggtactgg-3 ′ (SEQ ID NO: 18) (Soumet C et al., Lett. Appl. Microbiol., 1999 12.5 ⁇ l of SYBR Green Master mix (Applied Biosystems) containing 0.3 ⁇ mol / l each, 28 volumes, pp. 113-117) and 1 ⁇ l of sample DNA solution or DNA solution for preparing a calibration curve are mixed. did.
  • PCR reaction was performed according to the protocol attached to the SYBR Green Master mix (holding at 50 ° C for 2 minutes, then holding at 95 ° C for 10 minutes, then holding at 95 ° C for 15 seconds and holding at 60 ° C for 1 minute) The cycle consisting of was repeated 50 times). PCR reaction was performed 3 times for each sample DNA solution.
  • Example 9 Preparation of GL-BP-FliC surface display bifidobacteria and confirmation of GL-BP-FliC surface display
  • B. adolescentis ATCC 15703
  • Bifidobacterium animalis B. animalis
  • ATCC 25527 B. bifidum ATCC 11863
  • B. breve ATCC 15700 Example 12
  • Bifidobacterium The procedure was similar to that of Example 1 except that B. infantis ATCC25962 (Example 13) or B.
  • pseudocatenulatum ATCC27919 (Example 14) was used. To obtain transformed bifidobacteria with the recombinant plasmid pJW245, and then operate in the same manner as in Example 2 to obtain these transformed bifidobacteria. It was confirmed that the presence of the GL-BP-FliC on the cell surface of the skins.
  • the target protein or peptide can be expressed and presented on the cell surface of Bifidobacterium.
  • antigenic proteins such as microorganisms, viruses, protozoa, and cancer
  • the antigenic protein is carried as a carrier to the small intestinal mucosa and nasal mucosa, and an antibody reaction to the antigen presented in the mucosa is induced.
  • the oral vaccine of the present invention is highly safe because it uses bifidobacteria with dietary experience.
  • immunity is induced through the intestinal tract, which is the same route as the actual infection route, and both humoral immunity and cellular immunity work.

Abstract

　本発明によれば、ビフィズス菌の細胞表層にタンパク質を発現・提示するための手段が提供される。本発明のビフィズス菌表層発現遺伝子は、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子と、該目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子とが、５'末端側からこの順で連結されている。したがって、本発明のビフィズス菌表層発現遺伝子を導入して形質転換されたビフィズス菌は、その表層に目的のタンパク質またはペプチドを発現する。目的のタンパク質またはペプチドが抗原タンパク質または抗原ペプチドである場合には、本発明の形質転換ビフィズス菌は、経口ワクチンとして有用である。

Description

ビフィズス菌表層提示融合タンパク質発現遺伝子
　本発明は、ビフィズス菌の表層にタンパク質またはペプチドを発現させ提示させる技術に関し、この技術を使用したビフィズス菌による新規ワクチンに関する。
　細胞の細胞膜は、細胞の内外を隔てる生体膜であり、細胞膜表面には細胞の情報を提供する機能や細胞内外の物質を輸送する機能を有する膜タンパク質が多数存在している。近年、膜タンパク質が免疫に重要な役割を果たしており、抗原抗体反応において細胞表層の膜タンパクがターゲットにされていることが判明している。そのため、特定の抗原を膜タンパクと融合させて微生物の細胞表層に提示して、抗原抗体反応を人為的に誘導するための経口ワクチンとして使用するという概念が提唱されている。しかし、現在のところ実用例はなく、論文などに記載されている応用例も少ない。例えば、ポリ－γ－グルタミン酸合成酵素などの酵素タンパクの膜結合部をコードする遺伝子を有するベクターを利用して、宿主微生物の細胞表層に提示する例がある（特許文献１）。しかし、宿主としては、乳酸菌、酵母、および大腸菌が報告されるのみである。
　ビフィドバクテリウム属に属する微生物（これらを総称して「ビフィズス菌」という）は、人間や他の動物の小腸の下流または大腸で見られる常在菌である。ビフィズス菌は、偏性嫌気性のグラム陽性菌であるため、培養における選択性が高く（好気性の菌が増殖しない）、生体親和性も高く（乳幼児の腸内での最優勢菌であり、成人にも多く存在する）、そしてグラム陰性菌にあるエンドトキシンが存在しない（安全性が高い）。したがって、ビフィズス菌はＧＲＡＳ（一般的に安全と認められる）として認知されている。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）について、腸管を覆っているムチンからなる粘液との結合性を有しているとの報告もあるため、ビフィズス菌は腸において他の菌より腸壁への付着性が高いと考えられている。
　このようにビフィズス菌が非常に注目を集めているにもかかわらず、ビフィズス菌においてタンパク質を細胞表層に提示するための発現系は開発されていない。
特表２００５－５００５４号公報 特許第３６４２７５５号公報
Suzuki R.ら，J. Biol. Chem.，2008年，283巻，p.13165 McClelland M.ら，Nature，2001年，413巻，p.852 Heiderbergら，Nature，2000年，406巻，p.477 Tominaga A.ら，Genes Genet. Syst.，2001年，76巻，p.111 Wada J.ら，Acta Crystallographica Section F.，2007年，F63巻，p.751
　本発明は、ビフィズス菌の細胞表層にタンパク質またはペプチドを発現・提示するための手段を提供することを目的とする。
　一般に、膜タンパク質は細胞膜上でのみ立体構造を構成するため、タンパク質単体での立体構造解析が困難であり、このような膜タンパク質を含む融合タンパクを意図的に表層に提示させることも困難であった。しかし、近年、ビフィズス菌の細胞膜に存在するＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質（以下、ＧＬ－ＢＰという）について立体構造解析が行われた（非特許文献１）。本発明者らは、このＧＬ－ＢＰに注目し、目的のタンパク質の表層提示への利用について研究を進めた結果、ビフィズス菌の細胞膜にタンパク質を発現・提示するための手段を提供することに成功した。
　本発明は、ビフィズス菌の表層に目的のタンパク質またはペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子を提供し、該遺伝子は、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子と、該目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子とが、５’末端側からこの順で連結されている。
　１つの実施態様では、上記目的のタンパク質またはペプチドは、抗原タンパク質または抗原ペプチドである。
　さらなる実施態様では、上記抗原タンパク質またはペプチドはサルモネラ由来のフラジェリンであり、そして別の実施態様では、上記抗原タンパク質またはペプチドはインフルエンザウイルスのＭ２タンパク質である。
　１つの実施態様では、上記ビフィズス菌表層発現遺伝子は、上記ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子と上記目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子との間に、アジュバンド機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む。
　ある実施態様では、上記アジュバンド機能を有するタンパク質はフラジェリンである。
　本発明はまた、上記のいずれかのビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含む、遺伝子発現用プラスミドを提供する。
　本発明はさらに、上記のプラスミドを保持し、目的のタンパク質またはペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌を提供する。
　本発明はさらに、ゲノム中に、上記のいずれかのビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含み、上記目的のタンパク質またはペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌を提供する。
　１つの実施態様では、上記目的のタンパク質またはペプチドはサルモネラ由来のフラジェリンである。
　１つの実施態様では、上記目的のタンパク質またはペプチドはインフルエンザウイルスのＭ２タンパク質である。
　１つの実施態様では、上記の形質転換ビフィズス菌は、アジュバンド機能を有するタンパク質をさらに表層に提示する。
　さらなる実施態様では、上記アジュバンド機能を有するタンパク質はフラジェリンである。
　１つの実施態様では、上記目的のタンパク質またはペプチドは、抗原タンパク質または抗原ペプチドおよびアジュバンド機能を有するタンパク質である。
　本発明はまた、サルモネラ由来のフラジェリンを表層に提示する形質転換ビフィズス菌を含む、経口用サルモネラ感染症ワクチンを提供する。
　本発明はまた、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質を表層に提示する形質転換ビフィズス菌を含む、経口用インフルエンザワクチンを提供する。
　本発明によれば、ビフィズス菌の細胞表層に目的のタンパク質またはペプチドを発現・提示することができる。例えば、ビフィズス菌の表層に、微生物、ウイルス、原虫、ガンなどの抗原タンパク質または抗原ペプチドを提示させることにより、小腸粘膜や鼻粘膜にキャリアとして抗原タンパク質を運び、粘膜において提示された抗原に対する抗体反応を誘起する、経口および経鼻ワクチンとして利用できる。
ＧＬ－ＢＰ遺伝子の下流にフラジェリン（ＦｌｉＣ）遺伝子を連結した融合遺伝子の模式図である。 （ａ）は、実施例１で得た形質転換ビフィズス菌（ＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示）の蛍光顕微鏡写真であり、（ｂ）は、未処理のビフィズス菌（ＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示なし）の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１で得た形質転換ビフィズス菌（ＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示）のタンパク質溶解液のウエスタンブロッティングの写真である。 ビフィズス菌を経口投与したマウスの糞溶解物中の抗フラジェリンＩｇＡレベルの経時変化を示すグラフである。 ビフィズス菌を経口投与したマウスの血清中の（ａ）抗フラジェリンＩｇＡレベル、（ｂ）抗フラジェリンＩｇＧレベル、および（ｃ）抗フラジェリンＩｇＭレベルの経時変化を示すグラフである。 致死量のネズミチフス菌を経口投与した後のマウスの生存率の経時変化を示すグラフである。 三層構造のシームレスカプセル製剤の模式断面図である。
　（ビフィズス菌）
　本発明において、「ビフィズス菌」とは、ビフィドバクテリウム属に属する微生物をいう。ビフィズス菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（B. angulatum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・アニマリス（B. animalis subsp. animalis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・ラクティス（B. animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（B. asteroides）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ボウム（B. boum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ケリナム（B. choerinum）、ビフィドバクテリウム・コリネフォーム（B. coryneforme）、ビフィドバクテリウム・クニクリ（B. cuniculi）、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス（B. denticolens）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（B. dentium）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（B. gallicum）、ビフィドバクテリウム・ガリナラム（B. gallinarum）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（B. globosum）、ビフィドバクテリウム・インディカム（B. indicum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・イノピナタム（B. inopinatum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・マグナム（B. magnum）、ビフィドバクテリウム・メリシカム（B. merycicum）、ビフィドバクテリウム・ミニマム（B. minimum）、ビフィドバクテリウム・パーブロラム（B. parvulorum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・グロボスム（B. pseudolongum subsp. globosum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・シュードロンガム（B. pseudolongum subsp. pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・プロルム（B. pullorum）、ビフィドバクテリウム・ルミナル（B. ruminale）、ビフィドバクテリウム・ルミナンティアム（B. ruminantium）、ビフィドバクテリウム・セクラル（B. saeculare）、ビフィドバクテリウム・スカードビ（B. scardovii）、ビフィドバクテリウム・ズブチル（B. subtile）、ビフィドバクテリウム・スイス（B. suis）、ビフィドバクテリウム・サームアシドフィルム（B. thermacidophilum）、およびビフィドバクテリウム・サームフィルム（B. thermophilum）が挙げられる。
　この中でも、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・アニマリス（B. animalis subsp. animalis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・ラクティス（B. animalis subsp. lactis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、およびビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・シュードロンガム（B. pseudolongum subsp. pseudolongum）が好ましく用いられる。
　また、これらの耐性株または変異株を用いてもよい。これらの菌株は、いずれも市販されているか、または寄託機関から容易に入手できる。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B．longum）JCM1217（ATCC15707）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B．bifidum）ATCC11863などが挙げられる。
　（ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質）
　ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質（ＧＬ－ＢＰ）は、ビフィズス菌が有するラクト－Ｎ－ビオース（すなわち、Ｎ－アセチル－３－Ｏ－（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－Ｄ－グルコサミン）およびガラクト－Ｎ－ビオース（すなわち、Ｎ－アセチル－３－Ｏ－（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－Ｄ－ガラクトサミン）を輸送するＡＢＣタンパク質（ATP Binding Cassette protein）ファミリーに属する膜タンパク質である。ＡＢＣタンパク質とは、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）というエネルギーを使用し、すべての生物の細胞膜上で特異的な物質の輸送を能動的に行う重要な膜タンパク質であり、細胞膜上に多種のＡＢＣタンパク質が存在している。そのため、ＡＢＣタンパク質であるＧＬ－ＢＰは、ＧＬ－ＢＰ表層発現のための細胞機能が備わっているビフィドバクテリウム属細菌（ビフィズス菌）において、適切なプロモーターを利用すれば、ビフィズス菌では普遍的に発現する。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムJCM1217（ATCC15707）株由来のＧＬ－ＢＰは、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
　ＧＬ－ＢＰの構造は天然に存在するＧＬ－ＢＰに限定されず、ビフィズス菌の細胞表層に発現する能力を有していれば、該ＧＬ－ＢＰを構成するアミノ酸に１以上の置換、挿入、または欠失を有していてもよい。
　（目的のタンパク質またはペプチド）
　ビフィズス菌の表層に提示すべき目的のタンパク質またはペプチドは、特に限定されない。目的のタンパク質またはペプチドは、本来細胞表層に局在しないタンパク質またはペプチドであって、細胞表層に提示することを目的として配置されるタンパク質またはペプチドが好ましい。例えば、抗原タンパク質またはペプチド、酵素などが挙げられる。なお、目的の機能を果たし得る限り、その構造は天然に存在するタンパク質またはペプチドに限定されず、該タンパク質またはペプチドを構成するアミノ酸に１以上の置換、欠失、または付加が有ってもよい。
　抗原タンパク質またはペプチドとしては、細菌、ウイルス、原虫などに由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドが挙げられる。細菌としては、サルモネラ菌、ネズミチフス菌、赤痢菌、肺炎双球菌、結核菌などの細菌感染症を引き起こし得る細菌が挙げられる。ウイルスとしては、種々の型のインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＡＩＤＳウイルス、各種肝炎ウイルスなどが挙げられる。原虫としては、マラリア、トリコモナス、トキソプラズマなどが挙げられる。より具体的な抗原タンパク質またはペプチドとしては、サルモネラ菌やネズミチフス菌のフラジェリンタンパク質、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質、マラリア原虫のＳＥＲＡ（Serine Repeat Antigen）タンパク質、新生児Ｂ群レンサ球菌感染症の原因であるＢ群連鎖球菌のＧＢＳ８０タンパク質、歯周病の原因菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）のｐｇ４０エンベロープタンパク質、ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープタンパク質、子宮頸ガン原因ウイルスであるヒトパピローマウイルスのＥ６、Ｅ７、またはＬ２タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶのＥ２・ＮＳ１エンベロープ糖タンパク質、日本脳炎の原因であるフラビウイルス属のＮＳ１非構造タンパク質またはＤＩ・ＩＩ・ＩＩＩタンパク質、アルツハイマーの原因であるアミロイドベータ（Ａβ）タンパク質、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の原因であるペスチウイルス属のｇｐ５３タンパク質、豚コレラウイルスのｇｐ５５エンベロープタンパク質、犬パルポウイルスおよび猫汎白血球減少症の原因となるパルポウイルスのＶＰ２カプシドタンパク質、エビが感染して死に至らしめるホワイトスポット症候群ウイルスのＶＰ２８エンベロープタンパク質などが挙げられる。
　酵素としては、例えば、グルコアミラーゼ、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、イソアミラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンセターゼ、リパーゼ、リジン脱炭酸酵素、アラビノフラノシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどが挙げられる。
　その他の目的のタンパク質またはペプチドとしては、例えば、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＳＩＲＩＵＳ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫＯ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎなど）、生物発光タンパク質（ホタルルシフェラーゼ、イクオリン（オワンクラゲ）、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼなど）、毒性物質の検出に用いられるアリルハイドロカーボンレセプター、Ｈｉｓタグ、プロテインＡ、ガンや特定の疾患（例えば、アルツハイマー病）などに特異的に発現しているタンパク質に対する抗体が挙げられる。
　（アジュバンド機能を有するタンパク質）
　アジュバンド機能を有するタンパク質として、微生物の鞭毛を構成するフラジェリンタンパク質が、高レベルの抗体を誘導することが知られている。
　鞭毛は細胞表面から突き出た長い構造体であり、運動性および宿主細胞への侵入において重要な役割を果たす。この鞭毛はフラジェリン（以下、ＦｌｉＣという場合がある）と称されるタンパク質からなる。例えば、サルモネラ属ネズミチフス菌（サルモネラ・エンテリカ・サブスピーシス・エンテリカ・セロバー・ティフィムリウム（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium））の抗原性タンパク質フラジェリンは、非特許文献２に記載されている。コレラ菌（ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae））の抗原性タンパク質フラジェリンは、非特許文献３に記載されている。また、赤痢菌（シゲラ・ディセンテリエ（（Shigella dysenteriae））の抗原性タンパク質フラジェリンは、非特許文献４に記載されている。例えば、ネズミチフス菌由来のフラジェリンは、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。フラジェリンタンパク質は、アジュバント機能を有する限り、その構成アミノ酸に１以上の置換、欠失、または付加が有ってもよい。
　（ビフィズス菌表層提示融合タンパク質）
　本発明において、ビフィズス菌の表層に発現・提示されるタンパク質またはペプチドは、ＧＬ－ＢＰとの融合タンパク質として発現される。この融合タンパク質は、Ｎ末端からＧＬ－ＢＰおよび目的のタンパク質またはペプチドの順に連結されている。必要に応じて、ＧＬ－ＢＰと目的のタンパク質またはペプチドとの間に、アジュバンド機能を有するタンパク質を含んでいてもよい。
　（形質転換ビフィズス菌の調製）
　以下、目的のタンパク質またはペプチドをビフィズス菌表層に融合タンパク質として発現・提示させる形質転換ビフィズス菌の調製手順について、操作の順に説明する。
　１．各タンパク質をコードする遺伝子の取得
　ＧＬ－ＢＰをコードする遺伝子、目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子、およびＦｌｉＣをコードする遺伝子は、それぞれ公知の遺伝子配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、入手可能である。例えば、任意のビフィズス菌から調製したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、該ビフィズス菌のＧＬ－ＢＰの構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して取得し得る。一般に１つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、公知塩基配列または公知アミノ酸配列に基づく塩基配列とは異なる塩基配列を有する遺伝子であってもよい。
　例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）のＧＬ－ＢＰをコードする遺伝子は、非特許文献５に記載されたビフィドバクテリウム・ロンガムのＧＬ－ＢＰの構造遺伝子配列から入手可能である。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてＰＣＲで増幅し、入手できる。
　目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子は、公知の遺伝子配列情報またはアミノ酸配列情報に基づいて、入手可能である。例えば、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来のグルコアミラーゼをコードする遺伝子は、リゾプス・オリゼから調製したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、このリゾプス・オリゼのグルコアミラーゼの構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてＰＣＲで増幅し、取得し得る。
　ＦｌｉＣをコードする遺伝子は、公知の遺伝子配列情報またはアミノ酸配列情報に基づいて、入手可能である。ＦｌｉＣをコードする遺伝子は、例えば、感染症病原細菌（例えば、サルモネラ、コレラ菌、または赤痢菌）から調製したゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを鋳型とし、該細菌のＦｌｉＣの構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてＰＣＲで増幅し、取得し得る。
　より具体的には、上記の各タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、公知の塩基配列情報から、公知の化学合成によって得ることができる。化学合成法としては、例えば、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機により化学合成する方法が挙げられる。また、取得すべき塩基配列の５’末端および３’末端の塩基配列に基づいてプライマーを調製し、種々の由来生物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーから選択したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、上記の遺伝子を取得することもできる。またさらに、公知塩基配列情報に基づき、その全長または一部を化学合成したＤＮＡまたはポリヌクレオチドをプローブとして、種々の由来生物の組織または細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、上記の遺伝子を取得することもできる。
　また、上記の各タンパク質をコードする遺伝子は、公知のアミノ配列情報からも容易に得ることができる。公知のアミノ配列情報から上記の各タンパク質をコードする遺伝子を得る方法としては、例えば、公知のアミノ配列をコードする遺伝子の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって上記ｃＤＮＡライブラリーなどから目的とする遺伝子を増幅する方法、または適切なベクターに組込んだ遺伝子と、上記各タンパク質をコードする遺伝子の一部あるいは全域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したもの（プローブ）とのハイブリダイゼーションによって選別する方法などが挙げられる。
　上記の各タンパク質をコードする遺伝子は、上記のようにして取得した遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７～１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃にてハイブリダイゼーションを行った後、約０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、約６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡが挙げられる。上記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして、具体的には、上記公知塩基配列情報またはアミノ酸配列情報に基づいて得られる各タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列と、少なくとも約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは約９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
　２．ビフィズス菌形質転換用ベクターの調製
　上記１．のように調製された各タンパク質をコードする遺伝子を有する組換え体ＤＮＡを調製する。本発明において、組換え体ＤＮＡは、発現ベクターまたは染色体組込み型ベクター（例えば、相同組換え型ベクター）であり得る。このようなベクターの調製に用いられるプラスミドとしては、ビフィズス菌で発現可能なプラスミドであれば特に制限はない。ビフィズス菌に由来するプラスミドとしては、ｐＴＢ６、ｐＢＬ６７、ｐＢＬ７８、ｐＮＡＬ８Ｈ、ｐＮＡＬ８Ｍ、ｐＮＡＣ１、ｐＢＣ１、ｐＭＢ１、ｐＧＢＬ８ｂなどが用いられる。これらのプラスミドと大腸菌のプラスミドとの複合プラスミドもまた用いられ得、例えば、ｐＢＬＥＳ１００、ｐＫＫＴ４２７、ｐＲＭ２などが挙げられる。
　発現の安定性および形質転換株の調製のためのＤＮＡの調製の容易さという観点から、上記プラスミドの中でも、ビフィドバクテリウム・ロンガムのプラスミドと大腸菌のプラスミドとから合成された複合プラスミドが好ましい。
　発現ベクターは、形質転換株を選択する観点から、抗生物質耐性、アミノ酸要求性などの選択マーカーを有することが好ましい。
　発現ベクターは、ＧＬ－ＢＰと目的のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質の発現のために、または発現に有利となるように、調節配列を付加したものが好ましい。調節配列としては、例えば、プロモーター配列、リーダー配列、プロペプチド配列、エンハンサー配列、シグナル配列、ターミネーター配列などが挙げられる。これらの調節配列は、ビフィズス菌で発現するものであれば、その由来は特に制限はない。
　プロモーター配列としては、ビフィズス菌で発現するものであれば特に制限はない。発現効率の観点からは、ビフィドバクテリウム・ロンガムのヒストン様タンパク（ＨＵ）のプロモーター配列、ＬＤＨプロモーターなどが好ましく用いられる。
　また、発現効率を高める観点からは、ターミネーター配列を有することが好ましい。ターミネーター配列としては、上記ＨＵ遺伝子のターミネーター配列が好ましく用いられる。
　その他、必要に応じて、リーダー配列、プロペプチド配列、エンハンサー配列、シグナル配列などを配置することができる。また、ＧＬ－ＢＰをコードする遺伝子と目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子との間に適切な長さのリンカーをコードする遺伝子を配置してもよい。
　このように、上記のプラスミドに、必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列などの調節配列、および選択マーカー遺伝子を導入して、クローニングベクターが調製される。選択マーカーとしては、スペクチノマイシン（ＳＰｒ）、アンピシリン（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン（ＴＥＴｒ）、カナマイシン（ＫＭｒ）、ストレプトマイシン（ＳＴｒ）、ネオマイシン（ＮＥＯｒ）などの抗生物質耐性マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＥＰ）などの蛍光マーカー；ＬａｃＺなどの酵素などが挙げられる。
　クローニングベクターのプロモーターの下流には、マルチクローニングサイトを有するリンカーなどを備えていることが好ましい。このようなリンカーを用いることにより、上記融合タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）がプロモーターの下流に、かつ、インフレームで融合タンパク質を発現することができるように、組み込まれる。クローニングベクター用のプラスミドとしては、代表的には、ｐＢＬＥＳ１００、ｐＢＬＥＭ１００などが挙げられる（特許文献２参照）。
　このプラスミドｐＢＬＥＳ１００に上記取得したＨＵプロモーター配列、ＧＬ－ＢＰをコードする遺伝子、および目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をインフレームで組み込むことにより、融合タンパク質をビフィズス菌の表層に発現するベクターが得られる。このような方法で得られる発現ベクターは、ビフィズス菌の形質転換に用いられる。
　３．融合タンパク質を発現する形質転換ビフィズス菌の調製
　組換え体ＤＮＡ、例えば、発現ベクターを、宿主であるビフィズス菌に導入する。形質転換方法は、公知の方法であればいずれも用いることができる。具体的には、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、カルシウムイオン法、プロトプラスト法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法などが挙げられる。本発明においては、エレクトロポレーション法を用いるのが好ましい。エレクトロポレーション法による場合、０．５～２０ｋＶ／ｃｍ、０．５μｓｅｃ～１０ｍｓｅｃの条件で行うことが可能である。より好ましくは、２～１０ｋＶ／ｃｍ、５０μｓｅｃ～５ｍｓｅｃで行うことが望ましい。
　形質転換株は、融合タンパク質発現ベクターが有する選択マーカーで選択される。形質転換株を培養する培地としては、宿主微生物それぞれに適した培地、例えば、ブドウ糖血液肝臓（ＢＬ）寒天培地、デ・マン－ロゴサ－シャープ（ＭＲＳ）寒天培地、岐阜大学嫌気性（ＧＡＭ）寒天培地、改良ＧＡＭ（ＴＧＡＭ）寒天培地、ブリッグス（Ｂｒｉｇｇｓ）寒天培地、および酵母エキスブドウ糖ペプトン（ＹＧＰ）寒天培地が挙げられる。これらの培地に選択マーカーに応じて抗生物質を添加し、あるいはアミノ酸を欠失または添加し、選択圧とする。
　なお、培養条件は、ビフィズス菌が培養可能な嫌気培養で行うことが好ましい。嫌気性条件下で培養することにより、好気性菌の増殖を防ぐことができる。嫌気性条件下とは、ビフィズス菌が増殖可能な程度の嫌気度を保てる密閉容器中であり、例えば、嫌気チャンバーまたは嫌気ボックスなどにおいて可能な条件が挙げられる。培養温度は、ビフィズス菌を培養可能な温度であればよく、通常、４℃～４５℃、好ましくは１５℃～４０℃、より好ましくは２４℃～３７℃である。
　なお、ＧＬ－ＢＰと目的のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質を表層提示させるためのベクターだけでなく、ＧＬ－ＢＰとアジュバント機能を有するタンパク質との融合タンパク質を表層提示させるためのベクターも同時に導入した形質転換ビフィズス菌を調製してもよい。
　融合タンパク質をコードする遺伝子の導入を、形質転換ビフィズス菌からプラスミドを抽出して、制限酵素処理後に電気泳動で確認してもよく、制限酵素処理断片の配列を直接シーケンスしてもよい。
　得られた形質転換ビフィズス菌の融合タンパク質の発現の確認は、例えば、ウエスタンブロッティング法で行うことができる。まず、形質転換ビフィズス菌を、例えば、非イオン性界面活性剤を用いて、溶菌する。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、４０、６０、６５、８０、８５）、ソルビタンエステル（Ｓｐａｎ（登録商標）２０、４０、６０、６５、８０、８５）などが挙げられる。次いで、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）－塩酸緩衝液などを用いて希釈し、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、トリス－グリシン－ポリアクリルアミドゲルなどを用いて電気泳動を行う。次いで、ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＦ）膜などに転写し、目的のタンパク質またはペプチドに対する抗体（免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ））と反応させ、さらに蛍光標識を有する２次抗体で反応させることにより、融合タンパク質の発現を確認できる。
　特に、目的のタンパク質またはペプチドがビフィズス菌表層に提示されていることは、形質転換ビフィズス菌に対して、目的のタンパク質またはペプチドに対する抗体とＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって容易に確認し得る。なお、ＧＬ－ＢＰとアジュバント機能を有するタンパク質と目的のタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質を発現する場合、アジュバント機能を有するタンパク質と目的のタンパク質またはペプチドとがビフィズス菌の表層に提示されているため、確認に用いる抗体は、いずれのタンパク質（またはペプチド）に対する抗体であってもよい。
　目的のタンパク質またはペプチドの表層提示が確認された形質転換ビフィズス菌は、当業者が通常用いる方法により培養し、回収して、そのまま製剤の製造に用いてもよい。あるいは、乾燥して用いてもよい。乾燥は、凍結乾燥、低温乾燥などの低温処理を行い、腸内環境あるいは培地などの生育条件下に曝したときに生育可能となるような処理方法により行われる。
　形質転換ビフィズス菌は、公知の方法で後処理を行ってもよい。例えば、遠心分離などにより粗精製を行ってもよい。また、所望により粗精製を行った後、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または乳酸配合リンゲル液などの当該分野で従来から使用されている溶媒に溶解または懸濁させてもよい。また、所望により凍結乾燥または噴霧乾燥を行い、粉状物または粒状物にしてもよい。
　（形質転換ビフィズス菌含有製剤）
　本発明の形質転換ビフィズス菌は、表層に提示している目的のタンパク質またはペプチドが疾患の治療または予防目的で投与することが好ましい場合、任意の製剤の形態で投与される。投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与が挙げられる。目的のタンパク質またはペプチドが抗原タンパク質またはペプチドである場合は、経口投与または経鼻投与が好ましい。
　経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、溶液剤、カプセル剤または懸濁剤などが挙げられる。非経口投与に適する製剤の例としては、例えば、注射剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などが挙げられる。
　経口投与用の液体製剤の製造には、例えば、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などの製剤用添加物を用いることができる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、または顆粒剤などの固形製剤の製造には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤；澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤を用いることができる。
　非経口投与用の製剤のうち注射剤や点滴剤などの血管内投与用製剤は、好ましくはヒト血液と等張の水性媒体を用いて調製することができる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物から選ばれる水性媒体を用い、常法に従って適当な助剤とともに溶液、懸濁液または分散液として調製することができる。腸内投与のための坐剤は、例えば、カカオ脂、水添油脂または水添脂肪酸などの担体を用いて調製することができる。
　非経口投与用の製剤のうち噴霧剤は、ヒトの口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分である形質転換ビフィズス菌を微細な粒子として分散させて吸収を促進することのできる担体を用いて調製することができる。このような担体として、例えば、乳糖またはグリセリンなどを用いることができる。形質転換ビフィズス菌および用いる担体の性質により、エアロゾルやドライパウダーなどの形態の製剤として調製することができる。非経口投与用の製剤の製造には、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を用いることができる。
　（経口ワクチン）
　本発明において、目的のタンパク質またはペプチドが、抗原タンパク質である場合、形質転換ビフィズス菌は、経口ワクチンとして好適である。例えば、抗原タンパク質がフラジェリンである場合、フラジェリンは腸管壁で抗原として認識されて、抗体が産生される。したがって、フラジェリンを有する微生物の感染に対して有効な経口ワクチンとなる。
　例えば、以下に記載の耐酸性カプセル製剤（シームレスカプセル製剤、軟カプセル製剤、および硬カプセル製剤）は、経口投与されると、ｐＨ１～３の胃内で溶解せずに通過して、腸に到達し、腸で溶解する。カプセルの溶解により製剤から放出された形質転換ビフィズス菌は、腸内環境で生育し、その表層に目的のタンパク質またはペプチドを提示する。
　（形質転換ビフィズス菌を含有する耐酸性カプセル製剤の製造）
　本発明の経口ワクチンは、カプセル製剤の形態であることが好ましい。本明細書中では、内容物をその中に含むカプセルを「カプセル製剤」という。本発明におけるカプセル製剤は、カプセル皮膜と目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌とで構成され、このカプセル皮膜は耐酸性である。耐酸性であるカプセル皮膜と目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌とで構成されるカプセル製剤とは、耐酸性のカプセル皮膜を有し、そして目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌をカプセル内容物として含有する限り、任意の構成および形状をとり、当該カプセル製剤が、さらなる構成要素を含んでいることを除外しない。したがって、目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌が、耐酸性のカプセル皮膜によって包含されている、または封じ込められている（すなわち、耐酸性の皮膜によって形成されるカプセルの内部領域に含有されている）。本明細書中では、このカプセル製剤を「耐酸性カプセル製剤」ともいう。
　目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌が経口ワクチンとして機能するためには、この形質転換ビフィズス菌が胃を通過し、腸に到達し、そこで生育できるようにしなければならない。ところで、胃のｐＨは１～３であり、この著しく低いｐＨのため、経口摂取されたビフィズス菌は、その大部分が死滅する。増殖能を有したまま腸まで達するビフィズス菌は、一般に、投与量の１００００分の１以下となると言われている。したがって、本発明で用いる形質転換ビフィズス菌がヒトの腸内に生存したまま到達し、かつ、腸内で増殖して目的のタンパク質またはペプチドを発現するためには、形質転換ビフィズス菌が胃酸による影響を極力受けないようにすることが好ましい。
　そのため、本発明においては、好適には、耐酸性のカプセル皮膜によって形質転換ビフィズス菌が包含されまたは封じ込められている、すなわち、耐酸性の皮膜のカプセルの内側に形質転換ビフィズス菌が含有されている、カプセル製剤とする。カプセル製剤の構成、形状などは、皮膜が胃酸に対して耐性を有する限り、特に制限がない。すなわち、胃酸がカプセル内に浸入し、形質転換ビフィズス菌と接触しないように構成することが望ましい。カプセル皮膜は、ｐＨ４以下、好ましくはｐＨ１～３で溶解しない皮膜であり得る。カプセル化法も特に制限はない。
　（シームレスカプセル製剤）
　胃酸に対して耐性を付与するためのカプセルの形状としては、好ましくは、「シームレスカプセル」が挙げられる。シームレスカプセルとは、軟カプセルの一種であり、継ぎ目のない皮膜で内容物を封入する形態のカプセルをいう。シームレスカプセルは、二層以上の多層構造が可能であり、三層またはそれ以上の多層構造を有することが好ましい。通常、最内層に内容物（本発明の場合は、形質転換ビフィズス菌）を含み得、そして外層（または最外層）が皮膜となり得る。言い換えれば、形質転換ビフィズス菌が皮膜によって包含された形態である。
　以下に、三層構造のシームレスカプセル製剤の調製について説明する。図７は三層構造のシームレスカプセル製剤の模式断面図である。この三層構造は、最内層、この最内層を覆う内皮層、およびこの内皮層を覆う外層からなる。
　最内層は、上記形質転換ビフィズス菌、およびこの形質転換ビフィズス菌を懸濁／混合するための非水性溶媒または固体成分（以下、この成分を最内層用物質という）からなる。最内層用物質には特に制限がない。例えば、各種油脂類、脂肪酸類、糖の脂肪酸エステル、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、鎖状エーテル、高級脂肪酸エステル、高級アルコール、テルペン類が挙げられる。具体的には、大豆油、胡麻油、パーム油、パーム核油、コーン油、綿実油、椰子油、ナタネ油、カカオ脂、牛脂、豚脂、馬油、鯨油、融点が４０℃以下である上記天然油脂の水添油脂、マーガリン、ショートニング、グリセリン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステル、樟脳油、薄荷油、α－ピネン、Ｄ－リモネンなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの最内層用物質は、単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
　内皮層の材料としては、上記最内層用物質のうち、融点が２０℃～５０℃であり、かつ最内層と異なる物質が用いられる。より好ましくは、常温で固体の物質が用いられる。以下の実施例において、最内層用物質として融点が３４℃の水添パーム核油、および内皮層の材料として融点が４３℃の水添パーム核油を用いたように、最内層用物質および内皮層の材料としてそれぞれ融点が異なるように水添処理された同種の油脂を用いることもできる。この内皮層は、水分および酸素の透過を抑制し、胃酸との接触を防ぐように働き得る。どのような物質を選択するかは、カプセルの保存期間などを考慮して決定することができる。
　外層（三層構造以上の場合は最外層）の材料としては、タンパク質と水溶性多価アルコールとの混合物、タンパク質と水溶性多価アルコールと多糖類との混合物、多糖類と水溶性多価アルコールとの混合物などが挙げられる。タンパク質としては、例えば、ゼラチンおよびコラーゲンが挙げられる。水溶性多価アルコールとしては、例えば、ソルビトール、マンニトール、グリセリン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールが挙げられる。多糖類としては、寒天、ゲランガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ペクチン、アルギン酸塩、カラギナン、アラビアガム、デキストリン、変性デキストリン、デンプン、化工デンプン、プルラン、ペクチン、およびカルボキシメチルセルロース塩が挙げられる。ペクチン、アルギン酸塩、ゲランガム、もしくはカラギナンを使用する場合は、適宜アルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩を添加してもよい。
　上記の三層構造のシームレスカプセル製剤の調製は、当業者に周知の技術、例えば、特許第１３９８８３６号明細書に記載されている三重ノズルを用いる滴下法で行われる。この滴下法では、同心三重ノズルの最内側ノズルから形質転換ビフィズス菌（例えば、凍結乾燥菌体）と合わせた最内層用物質（好ましくは、２０～５０℃で非流動性である疎水性溶媒物質中への形質転換ビフィズス菌（好ましくは、凍結乾燥菌体）の懸濁液）を、中間ノズルから内皮層を構成する物質（例えば、常温では固体である物質の融解液）を、そして、最外側ノズルから外層（皮膜）となる物質の溶液を同時に吐出し、冷却下で流動しているキャリア液（例えば、コーン油、ナタネ油など）中に滴下させることにより、最内層に形質転換ビフィズス菌が含まれる三層構造の「シームレス」カプセルが形成される。したがって、形質転換ビフィズス菌が、継ぎ目のない外層皮膜によって包含または封じ込められている。
　上記のようにして形成されたカプセルは、次いで乾燥される。乾燥方法としては、例えば、常温通風乾燥を施す。乾燥は、例えば５℃～３０℃の空気により乾燥させる方法が一般的である。乾燥時間は２～１２時間が好適である。特開平０７－０６９８６７号公報に記載される、上記のように通常の乾燥を施したカプセルに対し、さらに真空乾燥または真空凍結乾燥を施す方法が好適に用いられ得る。真空度は０.５～０．０２torrに保ち、真空凍結乾燥では－２０℃以下で凍結させ乾燥させる方法である。真空乾燥または真空凍結乾燥に要する時間は特に限定的ではないが、一般に５～６０時間、好ましくは２４～４８時間である。５時間以下であると、乾燥が不十分であり、カプセル内に存在する水分が内容物質に悪影響を与え得る。
　特開平０７－０６９８６７号公報に記載の方法により得られるカプセルはそのカプセル内の水分が真空凍結乾燥により十分除去されており、Ａｗ値は０．２０以下で熱伝導率０．１６ｋｃａｌ／ｍｈ℃以下になり得る。真空乾燥または真空凍結乾燥によりもちろん水分が低下するのと同時に、カプセルが十分乾燥し、多孔質になるため、熱伝導率も単に通常乾燥で得られたものよりも大きく低下することになる。
　Ａｗ値とは試料中に存在する水分の絶対量ではなく、水分の存在状態によって決定される値、すなわち試料中における水の自由度を表したものであって、化学反応や微生物の生育に直接関与することができる水分を表す指標で、電気抵抗式水分活性測定法（例えば、ＡｗメーターＷＡ－３６０、株式会社芝浦電子製作所）で測定される。熱伝導率はフィッチ（Ｆｉｔｃｈ）法などで測定される。Ａｗ値は好ましくは０．２０以下であり、熱伝導率は好ましくは０．０２～０．０８ｋｃａｌ／ｍｈ℃である。
　シームレスカプセル製剤のカプセル皮膜に耐酸性を付与するには、耐酸性の外層を形成させるか、または形成されたシームレスカプセルの皮膜（最外層）を耐酸性となるように処理する。
　耐酸性外層を形成させる方法としては、ゲル化能を有するゼラチン、寒天、カラギナンなどに対して、ペクチン、アルギン酸塩、アラビアゴムなどを０．０１～２０質量％、好ましくは０．１～１０質量％となるように添加する方法が挙げられる。
　形成されたシームレスカプセルの皮膜（最外層）に耐酸性を付与する方法としては、例えば、シームレスカプセルの外層（最外層）の架橋処理およびシームレスカプセルの表面のコーティング処理が挙げられる。これらの処理を単独でまたは組み合わせて行うことが好ましい。
　タンパク質を含む外層を架橋処理する場合、まず、シームレスカプセルを調製した後、十分に水洗する。水洗したシームレスカプセルを、架橋剤を含む水溶液に加え、外層の表面を架橋させる。架橋剤としては、従来公知の架橋剤を使用することができる。架橋剤としては、例えば、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、グリオキサール、グルタルアルデヒド、シンナムアルデヒド、バニリルアルデヒド、アセトン、エチルメチルケトン、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、カリミョウバン、およびアンモニウムミョウバンが挙げられる。一般には、シームレスカプセル１質量部を、０．１～２％(w/v)、好ましくは０．５～２％(w/v)の架橋剤を含む水溶液５０～１００質量部に加え、１０～３００秒間撹拌することにより、外層の処理を行う。なお、架橋剤の使用量、作用させる時間は、架橋剤によって異なる。外皮膜の表面を架橋処理した後、十分に水洗することにより、架橋剤を含む水溶液を除去し、外層中に含まれる水分を乾燥させる。
　また、上記のタンパク質を含む外層の架橋処理として、トランスグルタミナーゼを用いる酵素処理による架橋を行ってもよい。この場合、生成したシームレスカプセル１質量部を、０．１～１０％(w/v)、好ましくは０．５～２％(w/v)の酵素を含む水溶液５０～１００質量部に加え、１～３００分間撹拌することにより、外層を処理し、上記と同様に水洗、乾燥させる。
　コーティング処理を行う場合は、生成した湿シームレスカプセルを乾燥させた後、セラック、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、セルロースＴＣ－５、ビニルピロリドン－酢酸ビニル共重合体、ゼイン、エチレンワックスなどを基材とし、ヒマシ油、ナタネ油、ジブチルフタレート、ポリエチレングリコール、グリセリン、ステアリン酸、脂肪酸エステル、ソルビタンパルミテート、ポリオキシエチレンステアレート、アセチル化モノグリセリドなどを可塑剤として用いて、常法に従ってシームレスカプセルをコーティングする。
　さらに、カプセル皮膜に腸溶性を付与することにより、胃内の酸性溶液（例えば、胃酸）などからカプセルを保護しそして腸内で崩壊させることにより、カプセル内部の形質転換ビフィズス菌を腸内で放出させ、腸内で抗原産生を十分行わせることが可能となる。腸溶性の付与は、当業者が通常腸溶性カプセルを製造する方法で行われる。また、シームレスカプセルの外層材料としてゼラチンおよびペクチンを含む混合物を用いることにより、腸溶化皮膜とできる。ゲル化能を有するゼラチン、寒天、カラギナンなどに対して、ペクチン、アルギン酸塩、アラビアゴムなどを０．０１～２０質量％、好ましくは０．１～１０質量％となるように添加し、調製した耐酸性外層は、腸溶性もまた有する。
　シームレスカプセル製剤は、その製法に起因して、形状は球状であり得る。シームレスカプセルの平均粒径は、０．３～１０ｍｍ、好ましくは、１．５～８．０ｍｍである。
　このようにして得られたシームレスカプセル製剤は、室温で形質転換ビフィズス菌の活性を保持したまま６ヶ月以上保存することが可能であり、１０℃以下で保存する場合は、１年以上の長期保存が可能である。
　（軟カプセル製剤）
　軟カプセル製剤は、シームレスカプセル製剤の場合と同様、非水性溶媒中への形質転換ビフィズス菌の懸濁液を内容物とし、皮膜シートで包含したものである。皮膜シートの材料は、シームレスカプセルの外層の材料と同様である。
　軟カプセル製剤は、公知の技術、例えば、特許第２９９９５３５号明細書に記載されている方法で調製することができる。例えば、ロータリーダイを用いて、内容物を注入および充填しながら、皮膜シートを型を通して加熱することによって封入し、カプセル化し得る。腸において形質転換ビフィズス菌を放出する機能を持たせるために、得られた軟カプセルから、離型剤である油を極性溶媒（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール）で洗浄することによって除去する。その後、シームレスカプセルの場合と同様に、架橋処理およびコーティング処理を組み合わせて行うか、あるいはいずれか一方の処理を行い、耐酸性とし得る。
　耐酸性皮膜シートを、ゲル化能を有するゼラチン、寒天、カラギナンなどに対して、ペクチン、アルギン酸塩、アラビアゴムなどを０．０１～２０質量％、好ましくは０．１～１０質量％となるように添加し、公知の方法に基づいて調製することもできる。あるいは、皮膜シートを架橋処理およびコーティング処理を組み合わせて行うか、あるいはいずれか一方の処理を行い、耐酸性とし得る。このようにして得られた耐酸性皮膜シートを用いて、例えば、公知の技術によりカプセルの成形およびカプセル内への内容物の導入をし、次いでカプセルの継ぎ目を溶着することによって内容物を封入し、耐酸性皮膜によって形質転換ビフィズス菌が包含された軟カプセル製剤を製造し得る。
　軟カプセル製剤は、球状、楕円状、または矩形状の構造であり得る。軟カプセルは、長径が３～１６ｍｍおよび短径が２～１０ｍｍのものが好ましく、長径が５～７ｍｍおよび短径が２～３ｍｍのものがより好ましい。
　このようにして得られた軟カプセル製剤は、室温で形質転換ビフィズス菌の活性を保持したまま６ヶ月以上保存することが可能であり、１０℃以下で保存する場合は、１年以上の長期保存が可能である。
　（硬カプセル製剤）
　硬カプセル製剤は、カプセル皮膜を予めボディとキャップとに成型し、内容物をカプセルボディに充填し、次いでカプセルキャップを組み合わせることにより、製造され得る。
　硬カプセル製剤の皮膜材料としては、ゼラチン、セルロース、プルラン、カラギナン、ならびに、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体が挙げられる。硬カプセルの成型は、当業者が通常用いる方法で行われ得る。成型カプセルは、市販のカプセルであってもよい。内容物を皮膜で包み込み、封入することもできる。
　内容物は、形質転換ビフィズス菌を賦形剤（例えば、無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、乳糖、コーンスターチ、結晶セルロース）とよく混合させたもの、あるいは、形質転換ビフィズス菌の乾燥菌末を含有する粉体であり得る。
　内容物をカプセル内に入れた後、カプセル皮膜をコーティングしてもよい。このコーティングには、シームレスカプセルの外層で説明した材料および方法が適用され、それにより耐酸性および好ましくは腸における崩壊性（腸溶性）が付与される。このコーティングは、カプセル皮膜を封入して内容物を包含させる役割も有し得る。
　耐酸性皮膜シートを、ゲル化能を有するゼラチン、寒天、カラギナンなどに対して、ペクチン、アルギン酸塩、アラビアゴムなどを０．０１～２０質量％、好ましくは０．１～１０質量％となるように添加し、公知の方法に基づいて調製することもできる。あるいは、皮膜シートを架橋処理およびコーティング処理を組み合わせて行うか、あるいはいずれか一方の処理を行い、耐酸性とし得る。このようにして得られた耐酸性皮膜シートを用いて、例えば、公知の技術で硬カプセルを成型し得、そしてこの成型した硬カプセル内部に内容物を入れて、カプセルの継ぎ目を溶着することによって内容物を封入し、耐酸性皮膜によって形質転換ビフィズス菌が包含された硬カプセル製剤を製造し得る。
　このようにして得られた硬カプセル製剤では、室温で形質転換ビフィズス菌の活性を保持したまま６ヶ月以上保存することが可能であり、１０℃以下で保存する場合は、１年以上の長期保存が可能である。
　以下に実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
　（実施例１：ＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示ビフィズス菌の作成）
　Ａ．ＧＬ－ＢＰ遺伝子の単離
　ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）JCM1217（ATCC15707）ゲノム（Accession：EU193949）より、プライマーglt-f：5'-ggggtgctgatatattggtttg-3'（配列番号５）および終止コドンがXhoIに置換されるようにしたglt-r：5'-gctcgagctcggaaacagacaggccgaagtt-3'（配列番号６）とKOD -Plus-（TOYOBO社製）とを用いてＰＣＲ反応を行ってＧＬ－ＢＰ遺伝子を増幅させた。増幅させたＧＬ－ＢＰ遺伝子を含むＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、１９８９ｂｐのＰＣＲ産物を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いてＧＬ－ＢＰ増幅断片のみを単離精製した。
　Ｂ．単離したＧＬ－ＢＰ遺伝子を有するｐＭＷ１１８プラスミドの構築
　単離精製したＧＬ－ＢＰ遺伝子増幅断片を、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）を有するｐＭＷ１１８（株式会社ニッポンジーン製）のSmaIサイトに導入し、プラスミドの構築を行った。なお、ライゲーションには、DNA Ligation kit Ver. 2（タカラバイオ株式会社製）を用いた。構築したプラスミドを、ヒートショック法（４２℃、３０秒）にて大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ株式会社製）に導入し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（Difco社製）に塗布し、３７℃にて一晩培養し、ＧＬ－ＢＰ遺伝子を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌からQuantum Prep Plasmid Miniprep Kit（Bio-Rad社製）を使用してプラスミドを抽出精製し、シーケンスによる配列確認を行い、ＧＬ－ＢＰ遺伝子の導入された組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをｐＪＴ１０１と命名した。
　Ｃ．ＦｌｉＣ遺伝子の単離
　サルモネラ属ネズミチフス菌（サルモネラ・エンテリカ・サブスピーシス・エンテリカ・セロバー・ティフィムリウム（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium）ATCC13312（住商ファーマより購入））のゲノムより、XhoI配列を付加したプライマーfliC-f：5'-cctcgagatggcacaagtcattaatacaaacag-3'（配列番号７）およびfliC-r：5'-cctcgagttaacgcagtaaagagaggacg-3'（配列番号８）を用いてＰＣＲ反応を行ってＦｌｉＣ遺伝子を増幅させた。増幅させたＦｌｉＣ遺伝子を含むＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、１５０２ｂｐのＰＣＲ産物を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いてＦｌｉＣ増幅断片のみを単離精製した。
　Ｄ．ＧＬ－ＢＰ遺伝子の下流にＦｌｉＣ遺伝子を有するプラスミドの構築
　上記Ｃ．にて単離精製したＦｌｉＣ遺伝子の増幅断片を、制限酵素XhoIで処理した。このXhoI処理したＦｌｉＣ遺伝子増幅断片を、DNA Ligation kit Ver. 2を用いて、同じく制限酵素XhoIで処理した上記ｐＪＴ１０１プラスミドへ導入し、プラスミドの構築を行った。構築したプラスミドを、ヒートショック法にて大腸菌ＤＨ５αに導入し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩培養し、ＧＬ－ＢＰ遺伝子とＦｌｉＣ遺伝子との融合遺伝子（図１）を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。得られた形質転換大腸菌から、Quantum Prep Plasmid Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出精製し、シーケンスによる配列確認を行い、ＧＬ－ＢＰ遺伝子の下流にＦｌｉＣ遺伝子を連結した組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをｐＪＴ１０２と命名した。
　Ｅ．大腸菌－ビフィズス菌シャトルベクターの構築
　大腸菌－ビフィズス菌シャトルベクターであるｐＢＬＥＳ１００ベクターのビフィズス菌複製開始点を残したまま短縮するため、ｐＢＬＥＳ１００（Matsumura H.ら，Biosci. Biotech. Biochem.，1997年，61巻，pp.1211-1212）をテンプレートにして、プライマー（pBLES-f：5'-agggacttgatctgctcatccag-3'（配列番号９）およびpBLES-r：5'-ttcccattaaataataaaacaaaaaaat-3'（配列番号１０））を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、ＰＣＲ産物を切り出しWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いてＰＣＲ増幅断片のみを単離精製した。精製後、DNA Ligation Kit Ver2.1（タカラバイオ株式会社製）を用いて、セルフライゲーションを行った。セルフライゲーションで得られたプラスミドをｐＴＫ１７５１と命名した。ｐＴＫ１７５１をテンプレートとして、プライマーpBLES-f3581：5'-tagtttgcgcaacgttgttgcc-3'（配列番号１１）およびpBLES-r93：5'-gatttcatacacggtgcctgac-3'（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳＰｒ）およびビフィズス菌の複製開始点ori領域を含むＰＣＲ産物を得、エタノール沈殿法にて精製した。また、これとは別に、ｐＭＷ１１８をテンプレートとして、プライマーpMW118-f：5'-atcacgaggccctttcgtcttc-3'（配列番号１３）およびpMW118-r：5'-cctgttctattaggtgttacatgc-3'（配列番号１４）を用いて、大腸菌複製開始点ori領域を含むＰＣＲ産物を得、エタノール沈殿法にて精製した。２つのＰＣＲ産物を用いて、DNA Ligation Kit Ver2.1を用いて、ライゲーションを行った。得られたプラスミドをヒートショック法にて大腸菌ＤＨ５αに導入し、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩培養し、大腸菌複製開始点ori領域とスペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳＰｒ）とビフィズス菌の複製開始点ori領域とを有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。得られた形質転換大腸菌から、Quantum Prep Plasmid Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出精製し、大腸菌複製開始点ori領域とスペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳＰｒ）とビフィズス菌の複製開始点ori領域とを有する組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをシャトルベクターｐＪＷ２４１と命名した。
　Ｆ．大腸菌－ビフィズス菌シャトルベクターｐＪＷ２４１へのＧＬ－ＢＰ遺伝子とＦｌｉＣ遺伝子とが連結された遺伝子の組込み
　ＧＬ－ＢＰ遺伝子とＦｌｉＣ遺伝子とが連結された遺伝子を有するベクターｐＪＴ１０２をテンプレートとして、プライマーGL-BP-NdeI-f：5'-ccatatgaagtacgttgctttgtaaggggag-3'（配列番号１５）およびFliC-NdeI-r：5'-ccatatgttaacgcagtaaagagaggacg-3'（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅産物をエタノール沈殿法にて精製後、制限酵素NdeIで制限酵素処理した。また、これとは別に、上記Ｅ．で得た大腸菌－ビフィズス菌シャトルベクターを制限酵素NdeIで処理した。NdeI処理したＰＣＲ遺伝子断片とｐＪＷ２４１とを、DNA Ligation Kit Ver2.1を用いてライゲートし、得られたプラスミドをヒートショック法にて大腸菌ＤＨ５αに導入し、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩培養して、大腸菌複製開始点ori領域、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳＰｒ）、ビフィズス菌の複製開始点ori領域、およびＧＬ－ＢＰ遺伝子とＦｌｉＣ遺伝子との融合遺伝子を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌からQuantum Prep Plasmid Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出精製し、ＧＬ－ＢＰ遺伝子とＦｌｉＣ遺伝子とが連結された遺伝子の配列の存在を確認した。得られた組換えプラスミドをｐＪＷ２４５と命名した。
　Ｇ．宿主ビフィズス菌液の調製
　ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）105-A（Matsumura H.ら，Biosci. Biotech. Biochem.，1997年，61巻，pp.1211-1212：東京大学名誉教授　光岡知足氏より供与）をＧＡＭ培地（日水製薬株式会社製）５０ｍｌに植菌し、アネロパックケンキ（三菱ガス化学株式会社製）を用いて３７℃にて培養した。培養中、波長６００ｎｍでの吸光度を測定し、吸光度が０．４～０．８に達した時点で培養を止めた。培養終了後、高速遠心分離機で遠心分離（６０００×ｇ、１０分間）し、菌体を集めた。集めた菌体に１０％(v/v)グリセロール溶液１０ｍｌを加えて懸濁し、高速遠心分離機で遠心分離して、菌体を２～３回洗浄した。
　Ｈ．組換えプラスミドｐＪＷ２４５のビフィズス菌への形質転換によるＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示ビフィズス菌の作成
　上記Ｇ．で得た宿主ビフィズス菌液に、１０％(v/v)グリセロール溶液５００μｌを加えて懸濁した。別のチューブに、この懸濁液２００μｌをとり、上記Ｆ．で得た組換えプラスミドｐＪＷ２４５を含む溶液５μｌを加えて混合し、氷上に５分間放置した。次いで、エレクトロポレーション・キュベット０．２ｃｍ（Bio-Rad社製）に混合液を入れ、Gene Pulser Xcellエレクトロポレーションシステム（Bio-Rad社製）を用いて２ｋＶ、２．５μＦ、２００Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後直ちに、予め３７℃にしておいたＧＡＭ培地０．８ｍｌを加え、アネロパックケンキを用いて３７℃にて３時間培養した。次いで、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＧＡＭ寒天培地（日水製薬株式会社製）に塗布し、アネロパックケンキを用いて３７℃にて培養し、形質転換ビフィズス菌を得た。得られた形質転換ビフィズス菌をスペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＧＡＭ培地に植菌し、アネロパックケンキを用いて３７℃で培養した。培養終了後、１．５ｍｌチューブに培養液を分注し、等量の５０％(v/v)グリセロール溶液を加えて懸濁した。得られた懸濁液を－８０℃で保存してフリーズストックを作成し、これを、ＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示ビフィズス菌（形質転換ビフィズス菌という場合がある）のマスターセルとした。
　（実施例２：形質転換ビフィズス菌のＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示の確認－１）
　上記実施例１で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌を解凍し、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＧＡＭ培地中で培養した。培養した形質転換ビフィズス菌を高速遠心分離機で遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体に緩衝液であるＰＢＳ（株式会社ニッポンジーン製）を加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離により菌体洗浄を３回行った。次いで、１％(w/v)ＢＳＡを含むＰＢＳに一次抗体Anti FliC mouse antibody（BioLegend社製）を加え、これをビフィズス菌液に加えて懸濁し、３７℃にて３０分間放置した。３０分間放置した菌液を高速遠心分離機で遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体にＰＢＳを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を２回行った。次いで、１％(w/v)ＢＳＡを含むＰＢＳに二次抗体Alexa FluorTM 488 Rabbit Anti-Mouse IgG antibody（Molecular Probes社製）を加え、これをビフィズス菌液に加えて懸濁し、３７℃にて３０分間放置した。３０分間放置した菌液を、高速遠心分離機で遠心分離して菌体を集めた。集めた菌体にＰＢＳを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を２回行った後、蛍光顕微鏡（KEYENCE社製）で観察した。結果を図２に示す。
　図２（ａ）は、上記実施例１で得た形質転換ビフィズス菌（ＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示）の蛍光顕微鏡写真であり、図２（ｂ）は、宿主ビフィズス菌（ＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示なし）の蛍光顕微鏡写真である。この蛍光顕微鏡写真から、形質転換ビフィズス菌の細胞表面にＦｌｉＣが存在することを確認した。
　（実施例３：形質転換ビフィズス菌のＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示の確認－２）
　上記実施例１で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌を解凍し、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＧＡＭ培地で培養した。培養した形質転換ビフィズス菌を高速遠心機で遠心し、菌体を集めた。集めた菌体にＰＢＳを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を３回行った。菌体に、ＰＢＳ、１ＭのTris-HCl（pH8.0）（株式会社ニッポンジーン製）、およびTriton X-100（和光純薬工業株式会社製）を含む溶液を加え、３０分間氷上に放置した。この溶液に、等量の２×ＳＤＳゲル泳動緩衝液を加え、９５℃で５分間放置して電気泳動用サンプルを得た。次いで、８％(w/v)アクリルアミドゲルを泳動装置（アトー株式会社製）にセットし、得られたサンプルをアプライし、分子量マーカーと共に２０ｍＡの電流にて１．５時間電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをニトロセルロースメンブレン（アトー株式会社製）に重ね、ブロッティング装置（Bio-Rad社製）に２０ｍＡの電流をかけてブロッティングを行った。ブロッティング後、ニトロセルロースメンブレンを４％(w/v)スキムミルク（ＢＤ社製）を含む緩衝液であるＴＢＳ（株式会社ニッポンジーン製）に１時間浸漬してブロッキングを行った。ブロッキング後、ニトロセルロースメンブレンをＴＢＳで２回洗浄した。洗浄後、ニトロセルロースメンブレンを、０．５％(w/v)の一次抗体（Anti FliC mouse antibody：BioLegend社製）を添加したＴＢＳに１．５時間浸漬し、ＴＢＳで３回洗浄した。次いで、ニトロセルロースメンブレンを、０．５％(w/v)の二次抗体（goat anti mouse IgG conjugated with alkaline phosphatase：BioLegend社製）を添加したＴＢＳに３時間浸漬した。次いで、ニトロセルロースメンブレンをＴＢＳで３回洗浄し、1-Steptm NBT/BCIP plus Suppressorキット（PIERCE社製）を用いて遮光下で３０分間発色させ、純水ですすいだ後、発色によりＦｌｉＣとＧＬ－ＢＰとの融合タンパク質（ＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ）の表層発現を確認した。ウエスタンブロッティングの結果を図３に示す。
　図３から明らかなように、サンプルにはＦｌｉＣとＧＬ－ＢＰの分子量の合計に相当する９８ｋＤａに明確なバンドが見られた。陽性コントロールであるＦｌｉＣでは、約５０ｋＤにバンドを観察した。したがって、形質転換ビフィズス菌が、ＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣを発現していることを確認した。
　（実施例４：マウス投与用の形質転換ビフィズス菌の調製）
　上記実施例１で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌を解凍し、スペクチノマイシン７０μｇ／ｍｌを含むＧＡＭ培地に植菌し、アネロパックケンキを用いて3７℃で一晩培養した。培養した菌液を高速遠心分離機で遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体にＰＢＳを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離により菌体洗浄を２回行った。次いで、菌体を２．５×１０７ＣＦＵ／１００μｌになるようＰＢＳに懸濁し、マウス投与用の形質転換ビフィズス菌を得た。
　（実施例５：形質転換ビフィズス菌投与によるマウスの抗体産生の確認）
　８～１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールス・リバー株式会社）に、上記実施例４で調製したマウス投与用の形質転換ビフィズス菌を、週に３回の頻度で４週間にわたって５０μＬずつ経口投与した（試験群）。比較コントロール（比較コントロール群）として空ベクター（ｐＪＷ２４１ベクター）を導入したビフィズス菌、ならびにネガティブコントロール（ネガティブコントロール群）として５０μｌのＰＢＳを、試験群と同様に投与した。各群のマウスはそれぞれ７匹、６匹、および５匹であった。
　投与開始後０日目、１４日目、および２８日目に、各群のマウスの尾静脈から採血した。採取した血液を、４℃にて３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血清を得て、－８０℃で保存した。また、投与開始後０、４、７、１１、１４、１８、２１、２５、および２８日目に糞を採集し、凍結乾燥した。５％(w/v)スキムミルク（ＢＤ社製）、０．１ｍｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビター（ロシュ・アプライドサイエンス社製）、および２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（Sigma社製）をＰＢＳに加えて、糞用溶解液を調製した。乾燥便１ｍｇに対して、糞用溶解液２０μｌを加えた。ボルテックスにかけて糞を溶解させた後、４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を得、－８０℃で保存した。
　得られた血清ならびに糞溶解物について、以下のようにしてＥＬＩＳＡを行った。まず、３枚のNunc Immunoplate Maxisorb F96 プレート（Nalge Nunc社製）に１．０μｇ／ｍｌのフラジェリン（InvivoGen社製）を５０μｌ／ウェル加え、４℃にて一晩放置した。プレートをＰＢＳで洗浄後、１％(w/v)ＢＳＡ（和光純薬工業株式会社製）を含むＰＢＳを２００μｌ／ウェル加えて、室温で２時間放置した。ＴＢＳで洗浄後、ＰＢＳで希釈系列を作成したマウスの血清を５０μｌ／ウェル加え、室温でさらに３時間放置した。ＴＢＳで洗浄後、３枚のプレートにそれぞれ、Anti IgG Mouse Goat Poly-HRP 1/1000希釈液（R&Dシステムズ社製）、Anti IgA Mouse Goat Poly-HRP 1/2000希釈液（Santa Cruz Biotechnology社製）、およびAnti IgM Mouse Goat Poly-HRP 1/2000希釈液（Santa Cruz Biotechnology社製）を５０μｌ／ウェル加えて、室温にて３時間反応させた。ＴＢＳで洗浄後、基質試薬 OptEIATM（ＢＤ社製）を１００μｌ／ウェル加えて、遮光下で室温にて２０分間反応させた。１００μｌ／ウェルの１Ｎ硫酸（和光純薬工業株式会社製）を加えて反応を停止し、吸光度計Ultrospec Visible Plate Reader II 96（Amersham Biosciences社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　糞溶解物中の抗フラジェリンＩｇＡレベルの経時変化を図４に示す。４５０ｎｍの吸光度が高いほど、ＩｇＡレベルが高いことを表す。図４のグラフにおいて、各値は各群のマウスの平均値を示し、そしてバーは標準偏差を示す。形質転換ビフィズス菌投与群のみが、投与開始後１１日目～１４日目に、糞中の抗フラジェリンＩｇＡ抗体量が著しく上昇した。
　血清中の種々の抗フラジェリン抗体レベルの経時変化を図５に示す。図５（ａ）は抗フラジェリンＩｇＡレベル、図５（ｂ）は抗フラジェリンＩｇＧレベル、そして図５（ｃ）は抗フラジェリンＩｇＭレベルの経時変化を示す。ＩｇＡは、糞溶解物の場合と同様に、投与開始後１４日目に高くなっていた。また、ＩｇＧおよびＩｇＭはいずれも、投与開始後１４日目には免疫グロブリンレベルが上昇しており、そして２８日目においても高いレベルで持続していた。このように、フラジェリン表層提示ビフィズス菌を経口投与することにより、血清中で抗フラジェリン抗体を確認した。
　（実施例６：形質転換ビフィズス菌に対する脾臓細胞の免疫応答性の確認）
　８～１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスを開腹し、１８Ｇ針付きシリンジで脾臓を穿刺して脾臓細胞を取り出し、シャーレに移した。セルストレーナーを用いて脾臓細胞を単一細胞に分離し、滅菌したＰＢＳで２回洗浄した。脾臓細胞を０．１Ｍ塩化アンモニウム溶液に懸濁し、この細胞懸濁液を暗所下２５℃にて１５分間インキュベートした。次いで、遠心分離し、脾臓細胞を集めた。集めた脾臓細胞に、１０％のウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μＭの２－メルカプトエタノールおよび２ｍＭのＬ－グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）を加えて懸濁し、細胞数を数えた。
　脾臓細胞を３×１０６個／ウェルになるよう９６ウェルプレート（Pierce Biotechnology社製）の各ウェルに入れ、上記実施例４で調製したマウス投与用の形質転換ビフィズス菌を５０μｇ／ウェルになるよう加えて、脾臓細胞を２５℃にて４８時間培養した。比較コントロールとして、脾臓細胞を３×１０６個／ウェルになるよう９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、形質転換ビフィズス菌を加えないで、脾臓細胞を２５℃にて４８時間培養した。次いで、培養液を５０００ｇで１０分間遠心分離して上清を得、－８０℃で保存した。
　上清中のサイトカイン濃度を、市販のＩＦＮ－γおよびＩＬ－１２用ＥＬＩＳＡキット（Pierce Biotechnology社製）を用いて測定した。この結果、形質転換ビフィズス菌存在下で脾臓細胞を培養したすべてのウェルの上清で高いレベルのＩＦＮ－γおよびＩＬ－１２が検出された。このように、フラジェリン表層提示ビフィズス菌をマウスに経口投与することにより、マウスの脾臓細胞におけるＩＦＮ－γおよびＩＬ－１２の産生を誘導することを確認した。
　（実施例７：形質転換ビフィズス菌によるマウスの感染試験－１）
　８～１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、上記実施例４で調製したマウス投与用の形質転換ビフィズス菌を、一日おきに２週間にわたって２．５×１０７ｃｆｕ／１００μｌずつ経口投与した（試験群）。比較コントロール（比較コントロール群）として空ベクター（ｐＪＷ２４１ベクター）を導入したビフィズス菌、ならびにネガティブコントロール（ネガティブコントロール群）として１００μｌのＰＢＳを、試験群と同様に投与した。各群のマウスはそれぞれ１４匹であった。
　投与開始後１４日目に、致死量の１．０×１０７ｃｆｕのサルモネラ属ネズミチフス菌（サルモネラ・エンテリカ・サブスピーシス・エンテリカ・セロバー・ティフィムリウム（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium）ATCC14028（住商ファーマより購入））（以下、ネズミチフス菌という）を経口投与し、その後４０日間毎日観察した。各群のマウスの生存率の経時変化を図６に示す。この結果、比較コントロール群で１４匹中９匹が、ネガティブコントロール群で１４匹中１２匹が死亡した（それぞれの平均生存日数は１４日間および２５日間）が、試験群では１４匹中２匹が死亡したのみでほとんどの個体が生存した。
　各群の生存したマウス個体について、脾臓細胞が産生するサイトカイン濃度を、市販のＩＦＮ－γおよびＩＬ－１２用ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。この結果、試験群の個体から分離した脾臓細胞は、他の群に比べて有意に高いレベルのＩＦＮ－γおよびＩＬ－１２を産生することが示された。このように、フラジェリン表層提示ビフィズス菌をマウスに経口投与することにより、ネズミチフス菌の経口投与によるマウスに対する致死作用を効果的に抑制することができた。
　（実施例８：形質転換ビフィズス菌によるマウスの感染試験－２）
　上記実施例７でネズミチフス菌を経口投与してから１１日後、各群の生存したマウス個体から脾臓を取り出し、脾臓内のネズミチフス菌をリアルタイムＰＣＲ分析により検出した。まず、脾臓からDNeasy Blood & Tissueキット（QIAGEN社製）を用いてＤＮＡを分離精製し、サンプルＤＮＡ溶液を調製した。１０６～１０１０ｃｆｕのネズミチフス菌から同様にしてゲノムＤＮＡを分離精製し、段階的に希釈して検量線作成用ＤＮＡ溶液とした。次いで、ＰＣＲ反応チューブに、プライマーST11：5'-gccaaccattgctaaattggcgca-3'（配列番号１７）およびST15：5'-ggtagaaattcccagcgggtactgg-3'（配列番号１８）（Soumet Cら，Lett. Appl. Microbiol.，1999年，28巻，pp.113-117）を各０．３μｍｏｌ／ｌ含むSYBR Green Master mix（Applied Biosystems社製）を１２．５μｌ、およびサンプルＤＮＡ溶液または検量線作成用ＤＮＡ溶液を１μｌ入れ、混合した。ＰＣＲ反応はSYBR Green Master mixに添付のプロトコールに従った（５０℃にて２分間保持の後、９５℃にて１０分間保持し、次いで９５℃にて１５秒間保持および６０℃にて１分間保持からなるサイクルを５０回繰り返した）。ＰＣＲ反応は各サンプルＤＮＡ溶液について３回ずつ行った。
　この結果、試験群のマウスの脾臓からはネズミチフス菌のＤＮＡは検出されなかった。これに対して、比較コントロール群およびネガティブコントロール群のマウスの脾臓からは、脾臓のＤＮＡ１ｍｇ当たりネズミチフス菌のＤＮＡがそれぞれ２．３４±０．３６×１０１０および２．２３±０．２０×１０１０コピー検出された。このように、フラジェリン表層提示ビフィズス菌をマウスに経口投与することにより、ネズミチフス菌の経口投与によるマウスへの感染を効果的に抑制することができた。
　（実施例９～１４：ＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示ビフィズス菌の作成とＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣ表層提示の確認）
　実施例１において、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）105-Aに代えて、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B. adolescentis）ATCC15703（実施例９）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）ATCC25527（実施例１０）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）ATCC11863（実施例１１）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（B. breve）ATCC15700（実施例１２）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）ATCC25962（実施例１３）、またはビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（B. pseudocatenulatum）ATCC27919（実施例１４）を用いたこと以外は実施例１と同様に操作を行って、組換えプラスミドｐＪＷ２４５による形質転換ビフィズス菌を得、次いで実施例２と同様に操作を行って、これらの形質転換ビフィズス菌の細胞表面にＧＬ－ＢＰ－ＦｌｉＣが存在することを確認した。
　本発明によれば、ビフィズス菌の細胞表層に目的のタンパク質またはペプチドを発現・提示することができる。例えば、ビフィズス菌の表層に、微生物、ウイルス、原虫、ガンなどの抗原タンパク質を提示させることにより、小腸粘膜や鼻粘膜にキャリアとして抗原タンパク質を運び、粘膜において提示された抗原に対する抗体反応を誘起する、経口および経鼻ワクチンとして利用できる。
　経口ワクチンの場合、小児や高齢者でも摂取しやすく、また通常の注射によるワクチン接種に伴う痛みもない。特に、本発明の経口ワクチンは、食経験のあるビフィズス菌を使用するため、安全性が高い。また、免疫が、実際の感染経路と同じ経路である腸管を介して誘導され、しかも体液性免疫と細胞性免疫との両方の免疫が働く。
　さらに、ビフィズス菌表面に酵素を提示させることにより、微生物生産物の増強、新規生産物の産生、微生物変換などが可能となり、酵素の提示による臨床や研究で使用するバイオマーカーや相互作用解析、スクリーニングなどにも応用できる。

Claims (16)

  1. 　ビフィズス菌の表層に目的のタンパク質またはペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子であって、ビフィズス菌由来のＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子と、該目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子とが、５’末端側からこの順で連結されている、ビフィズス菌表層発現遺伝子。
  2. 　前記目的のタンパク質またはペプチドが、抗原タンパク質または抗原ペプチドである、請求項１に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
  3. 　前記抗原タンパク質またはペプチドがサルモネラ由来のフラジェリンである、請求項２に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
  4. 　前記抗原タンパク質またはペプチドがインフルエンザウイルスのＭ２タンパク質である、請求項２に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
  5. 　前記ＧＮＢ／ＬＮＢ基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子と前記目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子との間に、アジュバンド機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項２から４のいずれかの項に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
  6. 　前記アジュバンド機能を有するタンパク質がフラジェリンである、請求項５に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
  7. 　請求項１から６のいずれかの項に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含む、遺伝子発現用プラスミド。
  8. 　請求項７に記載のプラスミドを保持し、目的のタンパク質またはペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
  9. 　ゲノム中に、請求項１から６のいずれかの項に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含み、前記目的のタンパク質またはペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
  10. 　前記目的のタンパク質またはペプチドがサルモネラ由来のフラジェリンである、請求項８または９に記載の形質転換ビフィズス菌。
  11. 　請求項１０に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、経口用サルモネラ感染症ワクチン。
  12. 　前記目的のタンパク質またはペプチドがインフルエンザウイルスのＭ２タンパク質である、請求項８または９に記載の形質転換ビフィズス菌。
  13. 　アジュバンド機能を有するタンパク質をさらに表層に提示する、請求項１２に記載の形質転換ビフィズス菌。
  14. 　前記アジュバンド機能を有するタンパク質がフラジェリンである、請求項１３に記載の形質転換ビフィズス菌。
  15. 　請求項１２から１４のいずれかの項に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、経口用インフルエンザワクチン。
  16. 　請求項８または９に記載の形質転換ビフィズス菌であって、前記目的のタンパク質またはペプチドが、抗原タンパク質または抗原ペプチドおよびアジュバンド機能を有するタンパク質である、形質転換ビフィズス菌。
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