JP5561681B2 - ビフィズス菌表層提示融合タンパク質発現遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明において、「ビフィズス菌」とは、ビフィドバクテリウム属に属する微生物をいう。ビフィズス菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、ビフィドバクテリウム・アングラタム(B. angulatum)、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・アニマリス(B. animalis subsp. animalis)、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシス・ラクティス(B. animalis subsp. lactis)、ビフィドバクテリウム・アステロイデス(B. asteroides)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(B. bifidum)、ビフィドバクテリウム・ボウム(B. boum)、ビフィドバクテリウム・ブレベ(B. breve)、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム(B. catenulatum)、ビフィドバクテリウム・ケリナム(B. choerinum)、ビフィドバクテリウム・コリネフォーム(B. coryneforme)、ビフィドバクテリウム・クニクリ(B. cuniculi)、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス(B. denticolens)、ビフィドバクテリウム・デンティウム(B. dentium)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(B. gallicum)、ビフィドバクテリウム・ガリナラム(B. gallinarum)、ビフィドバクテリウム・グロボサム(B. globosum)、ビフィドバクテリウム・インディカム(B. indicum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(B. infantis)、ビフィドバクテリウム・イノピナタム(B. inopinatum)、ビフィドバクテリウム・ラクティス(B. lactis)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(B. longum)、ビフィドバクテリウム・マグナム(B. magnum)、ビフィドバクテリウム・メリシカム(B. merycicum)、ビフィドバクテリウム・ミニマム(B. minimum)、ビフィドバクテリウム・パーブロラム(B. parvulorum)、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム(B. pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・グロボスム(B. pseudolongum subsp. globosum)、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシス・シュードロンガム(B. pseudolongum subsp. pseudolongum)、ビフィドバクテリウム・プロルム(B. pullorum)、ビフィドバクテリウム・ルミナル(B. ruminale)、ビフィドバクテリウム・ルミナンティアム(B. ruminantium)、ビフィドバクテリウム・セクラル(B. saeculare)、ビフィドバクテリウム・スカードビ(B. scardovii)、ビフィドバクテリウム・ズブチル(B. subtile)、ビフィドバクテリウム・スイス(B. suis)、ビフィドバクテリウム・サームアシドフィルム(B. thermacidophilum)、およびビフィドバクテリウム・サームフィルム(B. thermophilum)が挙げられる。
GNB/LNB基質結合膜タンパク質(GL−BP)は、ビフィズス菌が有するラクト−N−ビオース(すなわち、N−アセチル−3−O−(β−D−ガラクトピラノシル)−D−グルコサミン)およびガラクト−N−ビオース(すなわち、N−アセチル−3−O−(β−D−ガラクトピラノシル)−D−ガラクトサミン)を輸送するABCタンパク質(ATP Binding Cassette protein)ファミリーに属する膜タンパク質である。ABCタンパク質とは、ATP(アデノシン3リン酸)というエネルギーを使用し、すべての生物の細胞膜上で特異的な物質の輸送を能動的に行う重要な膜タンパク質であり、細胞膜上に多種のABCタンパク質が存在している。そのため、ABCタンパク質であるGL−BPは、GL−BP表層発現のための細胞機能が備わっているビフィドバクテリウム属細菌(ビフィズス菌)において、適切なプロモーターを利用すれば、ビフィズス菌では普遍的に発現する。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムJCM1217(ATCC15707)株由来のGL−BPは、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する。
ビフィズス菌の表層に提示すべき目的のタンパク質またはペプチドは、特に限定されない。目的のタンパク質またはペプチドは、本来細胞表層に局在しないタンパク質またはペプチドであって、細胞表層に提示することを目的として配置されるタンパク質またはペプチドが好ましい。例えば、抗原タンパク質またはペプチド、酵素などが挙げられる。なお、目的の機能を果たし得る限り、その構造は天然に存在するタンパク質またはペプチドに限定されず、該タンパク質またはペプチドを構成するアミノ酸に1以上の置換、欠失、または付加が有ってもよい。
アジュバンド機能を有するタンパク質として、微生物の鞭毛を構成するフラジェリンタンパク質が、高レベルの抗体を誘導することが知られている。
本発明において、ビフィズス菌の表層に発現・提示されるタンパク質またはペプチドは、GL−BPとの融合タンパク質として発現される。この融合タンパク質は、N末端からGL−BPおよび目的のタンパク質またはペプチドの順に連結されている。必要に応じて、GL−BPと目的のタンパク質またはペプチドとの間に、アジュバンド機能を有するタンパク質を含んでいてもよい。
以下、目的のタンパク質またはペプチドをビフィズス菌表層に融合タンパク質として発現・提示させる形質転換ビフィズス菌の調製手順について、操作の順に説明する。
GL−BPをコードする遺伝子、目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子、およびFliCをコードする遺伝子は、それぞれ公知の遺伝子配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、入手可能である。例えば、任意のビフィズス菌から調製したゲノムDNAあるいはcDNAを鋳型とし、該ビフィズス菌のGL−BPの構造遺伝子の配列情報に基づいて作製したプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅して取得し得る。一般に1つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、公知塩基配列または公知アミノ酸配列に基づく塩基配列とは異なる塩基配列を有する遺伝子であってもよい。
上記1.のように調製された各タンパク質をコードする遺伝子を有する組換え体DNAを調製する。本発明において、組換え体DNAは、発現ベクターまたは染色体組込み型ベクター(例えば、相同組換え型ベクター)であり得る。このようなベクターの調製に用いられるプラスミドとしては、ビフィズス菌で発現可能なプラスミドであれば特に制限はない。ビフィズス菌に由来するプラスミドとしては、pTB6、pBL67、pBL78、pNAL8H、pNAL8M、pNAC1、pBC1、pMB1、pGBL8bなどが用いられる。これらのプラスミドと大腸菌のプラスミドとの複合プラスミドもまた用いられ得、例えば、pBLES100、pKKT427、pRM2などが挙げられる。
組換え体DNA、例えば、発現ベクターを、宿主であるビフィズス菌に導入する。形質転換方法は、公知の方法であればいずれも用いることができる。具体的には、例えば、電気穿孔法(エレクトロポレーション法)、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、カルシウムイオン法、プロトプラスト法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法などが挙げられる。本発明においては、エレクトロポレーション法を用いるのが好ましい。エレクトロポレーション法による場合、0.5〜20kV/cm、0.5μsec〜10msecの条件で行うことが可能である。より好ましくは、2〜10kV/cm、50μsec〜5msecで行うことが望ましい。
本発明の形質転換ビフィズス菌は、表層に提示している目的のタンパク質またはペプチドが疾患の治療または予防目的で投与することが好ましい場合、任意の製剤の形態で投与される。投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与が挙げられる。目的のタンパク質またはペプチドが抗原タンパク質またはペプチドである場合は、経口投与または経鼻投与が好ましい。
本発明において、目的のタンパク質またはペプチドが、抗原タンパク質である場合、形質転換ビフィズス菌は、経口ワクチンとして好適である。例えば、抗原タンパク質がフラジェリンである場合、フラジェリンは腸管壁で抗原として認識されて、抗体が産生される。したがって、フラジェリンを有する微生物の感染に対して有効な経口ワクチンとなる。
本発明の経口ワクチンは、カプセル製剤の形態であることが好ましい。本明細書中では、内容物をその中に含むカプセルを「カプセル製剤」という。本発明におけるカプセル製剤は、カプセル皮膜と目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌とで構成され、このカプセル皮膜は耐酸性である。耐酸性であるカプセル皮膜と目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌とで構成されるカプセル製剤とは、耐酸性のカプセル皮膜を有し、そして目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌をカプセル内容物として含有する限り、任意の構成および形状をとり、当該カプセル製剤が、さらなる構成要素を含んでいることを除外しない。したがって、目的のタンパク質またはペプチドを表層に発現する形質転換ビフィズス菌が、耐酸性のカプセル皮膜によって包含されている、または封じ込められている(すなわち、耐酸性の皮膜によって形成されるカプセルの内部領域に含有されている)。本明細書中では、このカプセル製剤を「耐酸性カプセル製剤」ともいう。
胃酸に対して耐性を付与するためのカプセルの形状としては、好ましくは、「シームレスカプセル」が挙げられる。シームレスカプセルとは、軟カプセルの一種であり、継ぎ目のない皮膜で内容物を封入する形態のカプセルをいう。シームレスカプセルは、二層以上の多層構造が可能であり、三層またはそれ以上の多層構造を有することが好ましい。通常、最内層に内容物(本発明の場合は、形質転換ビフィズス菌)を含み得、そして外層(または最外層)が皮膜となり得る。言い換えれば、形質転換ビフィズス菌が皮膜によって包含された形態である。
軟カプセル製剤は、シームレスカプセル製剤の場合と同様、非水性溶媒中への形質転換ビフィズス菌の懸濁液を内容物とし、皮膜シートで包含したものである。皮膜シートの材料は、シームレスカプセルの外層の材料と同様である。
硬カプセル製剤は、カプセル皮膜を予めボディとキャップとに成型し、内容物をカプセルボディに充填し、次いでカプセルキャップを組み合わせることにより、製造され得る。
A.GL−BP遺伝子の単離
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)JCM1217(ATCC15707)ゲノム(Accession:EU193949)より、プライマーglt-f:5'-ggggtgctgatatattggtttg-3'(配列番号5)および終止コドンがXhoIに置換されるようにしたglt-r:5'-gctcgagctcggaaacagacaggccgaagtt-3'(配列番号6)とKOD -Plus-(TOYOBO社製)とを用いてPCR反応を行ってGL−BP遺伝子を増幅させた。増幅させたGL−BP遺伝子を含むPCR産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、1989bpのPCR産物を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega社製)を用いてGL−BP増幅断片のみを単離精製した。
単離精製したGL−BP遺伝子増幅断片を、アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)を有するpMW118(株式会社ニッポンジーン製)のSmaIサイトに導入し、プラスミドの構築を行った。なお、ライゲーションには、DNA Ligation kit Ver. 2(タカラバイオ株式会社製)を用いた。構築したプラスミドを、ヒートショック法(42℃、30秒)にて大腸菌DH5α(タカラバイオ株式会社製)に導入し、アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天培地(Difco社製)に塗布し、37℃にて一晩培養し、GL−BP遺伝子を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌からQuantum Prep Plasmid Miniprep Kit(Bio-Rad社製)を使用してプラスミドを抽出精製し、シーケンスによる配列確認を行い、GL−BP遺伝子の導入された組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをpJT101と命名した。
サルモネラ属ネズミチフス菌(サルモネラ・エンテリカ・サブスピーシス・エンテリカ・セロバー・ティフィムリウム(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium)ATCC13312(住商ファーマより購入))のゲノムより、XhoI配列を付加したプライマーfliC-f:5'-cctcgagatggcacaagtcattaatacaaacag-3'(配列番号7)およびfliC-r:5'-cctcgagttaacgcagtaaagagaggacg-3'(配列番号8)を用いてPCR反応を行ってFliC遺伝子を増幅させた。増幅させたFliC遺伝子を含むPCR産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、1502bpのPCR産物を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いてFliC増幅断片のみを単離精製した。
上記C.にて単離精製したFliC遺伝子の増幅断片を、制限酵素XhoIで処理した。このXhoI処理したFliC遺伝子増幅断片を、DNA Ligation kit Ver. 2を用いて、同じく制限酵素XhoIで処理した上記pJT101プラスミドへ導入し、プラスミドの構築を行った。構築したプラスミドを、ヒートショック法にて大腸菌DH5αに導入し、アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃にて一晩培養し、GL−BP遺伝子とFliC遺伝子との融合遺伝子(図1)を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。得られた形質転換大腸菌から、Quantum Prep Plasmid Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出精製し、シーケンスによる配列確認を行い、GL−BP遺伝子の下流にFliC遺伝子を連結した組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをpJT102と命名した。
大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターであるpBLES100ベクターのビフィズス菌複製開始点を残したまま短縮するため、pBLES100(Matsumura H.ら,Biosci. Biotech. Biochem.,1997年,61巻,pp.1211-1212)をテンプレートにして、プライマー(pBLES-f:5'-agggacttgatctgctcatccag-3'(配列番号9)およびpBLES-r:5'-ttcccattaaataataaaacaaaaaaat-3'(配列番号10))を用いてPCRを行った。PCR増幅産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、PCR産物を切り出しWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いてPCR増幅断片のみを単離精製した。精製後、DNA Ligation Kit Ver2.1(タカラバイオ株式会社製)を用いて、セルフライゲーションを行った。セルフライゲーションで得られたプラスミドをpTK1751と命名した。pTK1751をテンプレートとして、プライマーpBLES-f3581:5'-tagtttgcgcaacgttgttgcc-3'(配列番号11)およびpBLES-r93:5'-gatttcatacacggtgcctgac-3'(配列番号12)を用いてPCRを行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子(SPr)およびビフィズス菌の複製開始点ori領域を含むPCR産物を得、エタノール沈殿法にて精製した。また、これとは別に、pMW118をテンプレートとして、プライマーpMW118-f:5'-atcacgaggccctttcgtcttc-3'(配列番号13)およびpMW118-r:5'-cctgttctattaggtgttacatgc-3'(配列番号14)を用いて、大腸菌複製開始点ori領域を含むPCR産物を得、エタノール沈殿法にて精製した。2つのPCR産物を用いて、DNA Ligation Kit Ver2.1を用いて、ライゲーションを行った。得られたプラスミドをヒートショック法にて大腸菌DH5αに導入し、スペクチノマイシン70μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃にて一晩培養し、大腸菌複製開始点ori領域とスペクチノマイシン耐性遺伝子(SPr)とビフィズス菌の複製開始点ori領域とを有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。得られた形質転換大腸菌から、Quantum Prep Plasmid Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出精製し、大腸菌複製開始点ori領域とスペクチノマイシン耐性遺伝子(SPr)とビフィズス菌の複製開始点ori領域とを有する組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドをシャトルベクターpJW241と命名した。
GL−BP遺伝子とFliC遺伝子とが連結された遺伝子を有するベクターpJT102をテンプレートとして、プライマーGL-BP-NdeI-f:5'-ccatatgaagtacgttgctttgtaaggggag-3'(配列番号15)およびFliC-NdeI-r:5'-ccatatgttaacgcagtaaagagaggacg-3'(配列番号16)を用いてPCRを行った。PCR増幅産物をエタノール沈殿法にて精製後、制限酵素NdeIで制限酵素処理した。また、これとは別に、上記E.で得た大腸菌−ビフィズス菌シャトルベクターを制限酵素NdeIで処理した。NdeI処理したPCR遺伝子断片とpJW241とを、DNA Ligation Kit Ver2.1を用いてライゲートし、得られたプラスミドをヒートショック法にて大腸菌DH5αに導入し、スペクチノマイシン70μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃にて一晩培養して、大腸菌複製開始点ori領域、スペクチノマイシン耐性遺伝子(SPr)、ビフィズス菌の複製開始点ori領域、およびGL−BP遺伝子とFliC遺伝子との融合遺伝子を有するプラスミドを保持した形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌からQuantum Prep Plasmid Miniprep Kitを使用してプラスミドを抽出精製し、GL−BP遺伝子とFliC遺伝子とが連結された遺伝子の配列の存在を確認した。得られた組換えプラスミドをpJW245と命名した。
ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)105-A(Matsumura H.ら,Biosci. Biotech. Biochem.,1997年,61巻,pp.1211-1212:東京大学名誉教授 光岡知足氏より供与)をGAM培地(日水製薬株式会社製)50mlに植菌し、アネロパックケンキ(三菱ガス化学株式会社製)を用いて37℃にて培養した。培養中、波長600nmでの吸光度を測定し、吸光度が0.4〜0.8に達した時点で培養を止めた。培養終了後、高速遠心分離機で遠心分離(6000×g、10分間)し、菌体を集めた。集めた菌体に10%(v/v)グリセロール溶液10mlを加えて懸濁し、高速遠心分離機で遠心分離して、菌体を2〜3回洗浄した。
上記G.で得た宿主ビフィズス菌液に、10%(v/v)グリセロール溶液500μlを加えて懸濁した。別のチューブに、この懸濁液200μlをとり、上記F.で得た組換えプラスミドpJW245を含む溶液5μlを加えて混合し、氷上に5分間放置した。次いで、エレクトロポレーション・キュベット0.2cm(Bio-Rad社製)に混合液を入れ、Gene Pulser Xcellエレクトロポレーションシステム(Bio-Rad社製)を用いて2kV、2.5μF、200Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後直ちに、予め37℃にしておいたGAM培地0.8mlを加え、アネロパックケンキを用いて37℃にて3時間培養した。次いで、スペクチノマイシン70μg/mlを含むGAM寒天培地(日水製薬株式会社製)に塗布し、アネロパックケンキを用いて37℃にて培養し、形質転換ビフィズス菌を得た。得られた形質転換ビフィズス菌をスペクチノマイシン70μg/mlを含むGAM培地に植菌し、アネロパックケンキを用いて37℃で培養した。培養終了後、1.5mlチューブに培養液を分注し、等量の50%(v/v)グリセロール溶液を加えて懸濁した。得られた懸濁液を−80℃で保存してフリーズストックを作成し、これを、GL−BP−FliC表層提示ビフィズス菌(形質転換ビフィズス菌という場合がある)のマスターセルとした。
上記実施例1で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌を解凍し、スペクチノマイシン70μg/mlを含むGAM培地中で培養した。培養した形質転換ビフィズス菌を高速遠心分離機で遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体に緩衝液であるPBS(株式会社ニッポンジーン製)を加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離により菌体洗浄を3回行った。次いで、1%(w/v)BSAを含むPBSに一次抗体Anti FliC mouse antibody(BioLegend社製)を加え、これをビフィズス菌液に加えて懸濁し、37℃にて30分間放置した。30分間放置した菌液を高速遠心分離機で遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体にPBSを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を2回行った。次いで、1%(w/v)BSAを含むPBSに二次抗体Alexa FluorTM 488 Rabbit Anti-Mouse IgG antibody(Molecular Probes社製)を加え、これをビフィズス菌液に加えて懸濁し、37℃にて30分間放置した。30分間放置した菌液を、高速遠心分離機で遠心分離して菌体を集めた。集めた菌体にPBSを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を2回行った後、蛍光顕微鏡(KEYENCE社製)で観察した。結果を図2に示す。
上記実施例1で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌を解凍し、スペクチノマイシン70μg/mlを含むGAM培地で培養した。培養した形質転換ビフィズス菌を高速遠心機で遠心し、菌体を集めた。集めた菌体にPBSを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離による菌体洗浄を3回行った。菌体に、PBS、1MのTris-HCl(pH8.0)(株式会社ニッポンジーン製)、およびTriton X-100(和光純薬工業株式会社製)を含む溶液を加え、30分間氷上に放置した。この溶液に、等量の2×SDSゲル泳動緩衝液を加え、95℃で5分間放置して電気泳動用サンプルを得た。次いで、8%(w/v)アクリルアミドゲルを泳動装置(アトー株式会社製)にセットし、得られたサンプルをアプライし、分子量マーカーと共に20mAの電流にて1.5時間電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをニトロセルロースメンブレン(アトー株式会社製)に重ね、ブロッティング装置(Bio-Rad社製)に20mAの電流をかけてブロッティングを行った。ブロッティング後、ニトロセルロースメンブレンを4%(w/v)スキムミルク(BD社製)を含む緩衝液であるTBS(株式会社ニッポンジーン製)に1時間浸漬してブロッキングを行った。ブロッキング後、ニトロセルロースメンブレンをTBSで2回洗浄した。洗浄後、ニトロセルロースメンブレンを、0.5%(w/v)の一次抗体(Anti FliC mouse antibody:BioLegend社製)を添加したTBSに1.5時間浸漬し、TBSで3回洗浄した。次いで、ニトロセルロースメンブレンを、0.5%(w/v)の二次抗体(goat anti mouse IgG conjugated with alkaline phosphatase:BioLegend社製)を添加したTBSに3時間浸漬した。次いで、ニトロセルロースメンブレンをTBSで3回洗浄し、1-Steptm NBT/BCIP plus Suppressorキット(PIERCE社製)を用いて遮光下で30分間発色させ、純水ですすいだ後、発色によりFliCとGL−BPとの融合タンパク質(GL−BP−FliC)の表層発現を確認した。ウエスタンブロッティングの結果を図3に示す。
上記実施例1で得たフリーズストックした形質転換ビフィズス菌を解凍し、スペクチノマイシン70μg/mlを含むGAM培地に植菌し、アネロパックケンキを用いて37℃で一晩培養した。培養した菌液を高速遠心分離機で遠心分離し、菌体を集めた。集めた菌体にPBSを加えて懸濁し、高速遠心分離機での遠心分離により菌体洗浄を2回行った。次いで、菌体を2.5×107CFU/100μlになるようPBSに懸濁し、マウス投与用の形質転換ビフィズス菌を得た。
8〜12週齢のメスのBALB/cマウス(日本チャールス・リバー株式会社)に、上記実施例4で調製したマウス投与用の形質転換ビフィズス菌を、週に3回の頻度で4週間にわたって50μLずつ経口投与した(試験群)。比較コントロール(比較コントロール群)として空ベクター(pJW241ベクター)を導入したビフィズス菌、ならびにネガティブコントロール(ネガティブコントロール群)として50μlのPBSを、試験群と同様に投与した。各群のマウスはそれぞれ7匹、6匹、および5匹であった。
8〜12週齢のメスのBALB/cマウスを開腹し、18G針付きシリンジで脾臓を穿刺して脾臓細胞を取り出し、シャーレに移した。セルストレーナーを用いて脾臓細胞を単一細胞に分離し、滅菌したPBSで2回洗浄した。脾臓細胞を0.1M塩化アンモニウム溶液に懸濁し、この細胞懸濁液を暗所下25℃にて15分間インキュベートした。次いで、遠心分離し、脾臓細胞を集めた。集めた脾臓細胞に、10%のウシ胎仔血清、100U/mlのペニシリン、100μMの2−メルカプトエタノールおよび2mMのL−グルタミンを含むRPMI1640培地(GIBCO社製)を加えて懸濁し、細胞数を数えた。
8〜12週齢のメスのBALB/cマウスに、上記実施例4で調製したマウス投与用の形質転換ビフィズス菌を、一日おきに2週間にわたって2.5×107cfu/100μlずつ経口投与した(試験群)。比較コントロール(比較コントロール群)として空ベクター(pJW241ベクター)を導入したビフィズス菌、ならびにネガティブコントロール(ネガティブコントロール群)として100μlのPBSを、試験群と同様に投与した。各群のマウスはそれぞれ14匹であった。
上記実施例7でネズミチフス菌を経口投与してから11日後、各群の生存したマウス個体から脾臓を取り出し、脾臓内のネズミチフス菌をリアルタイムPCR分析により検出した。まず、脾臓からDNeasy Blood & Tissueキット(QIAGEN社製)を用いてDNAを分離精製し、サンプルDNA溶液を調製した。106〜1010cfuのネズミチフス菌から同様にしてゲノムDNAを分離精製し、段階的に希釈して検量線作成用DNA溶液とした。次いで、PCR反応チューブに、プライマーST11:5'-gccaaccattgctaaattggcgca-3'(配列番号17)およびST15:5'-ggtagaaattcccagcgggtactgg-3'(配列番号18)(Soumet Cら,Lett. Appl. Microbiol.,1999年,28巻,pp.113-117)を各0.3μmol/l含むSYBR Green Master mix(Applied Biosystems社製)を12.5μl、およびサンプルDNA溶液または検量線作成用DNA溶液を1μl入れ、混合した。PCR反応はSYBR Green Master mixに添付のプロトコールに従った(50℃にて2分間保持の後、95℃にて10分間保持し、次いで95℃にて15秒間保持および60℃にて1分間保持からなるサイクルを50回繰り返した)。PCR反応は各サンプルDNA溶液について3回ずつ行った。
実施例1において、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)105-Aに代えて、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(B. adolescentis)ATCC15703(実施例9)、ビフィドバクテリウム・アニマリス(B. animalis)ATCC25527(実施例10)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(B. bifidum)ATCC11863(実施例11)、ビフィドバクテリウム・ブレベ(B. breve)ATCC15700(実施例12)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(B. infantis)ATCC25962(実施例13)、またはビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム(B. pseudocatenulatum)ATCC27919(実施例14)を用いたこと以外は実施例1と同様に操作を行って、組換えプラスミドpJW245による形質転換ビフィズス菌を得、次いで実施例2と同様に操作を行って、これらの形質転換ビフィズス菌の細胞表面にGL−BP−FliCが存在することを確認した。
Claims (16)
- ビフィズス菌の表層に目的のタンパク質またはペプチドを発現するためのビフィズス菌表層発現遺伝子であって、ビフィズス菌由来のGNB/LNB基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子と、該目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子とが、5’末端側からこの順で連結されている、ビフィズス菌表層発現遺伝子。
- 前記目的のタンパク質またはペプチドが、抗原タンパク質または抗原ペプチドである、請求項1に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
- 前記抗原タンパク質またはペプチドがサルモネラ由来のフラジェリンである、請求項2に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
- 前記抗原タンパク質またはペプチドがインフルエンザウイルスのM2タンパク質である、請求項2に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
- 前記GNB/LNB基質結合膜タンパク質をコードする遺伝子と前記目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子との間に、アジュバンド機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項2から4のいずれかの項に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
- 前記アジュバンド機能を有するタンパク質がフラジェリンである、請求項5に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子。
- 請求項1から6のいずれかの項に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含む、遺伝子発現用プラスミド。
- 請求項7に記載のプラスミドを保持し、目的のタンパク質またはペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
- ゲノム中に、請求項1から6のいずれかの項に記載のビフィズス菌表層発現遺伝子を発現可能な様式で含み、前記目的のタンパク質またはペプチドを細胞表層に提示する、形質転換ビフィズス菌。
- 前記目的のタンパク質またはペプチドがサルモネラ由来のフラジェリンである、請求項8または9に記載の形質転換ビフィズス菌。
- 請求項10に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、経口用サルモネラ感染症ワクチン。
- 前記目的のタンパク質またはペプチドがインフルエンザウイルスのM2タンパク質である、請求項8または9に記載の形質転換ビフィズス菌。
- アジュバンド機能を有するタンパク質をさらに表層に提示する、請求項12に記載の形質転換ビフィズス菌。
- 前記アジュバンド機能を有するタンパク質がフラジェリンである、請求項13に記載の形質転換ビフィズス菌。
- 請求項12から14のいずれかの項に記載の形質転換ビフィズス菌を含む、経口用インフルエンザワクチン。
- 請求項8または9に記載の形質転換ビフィズス菌であって、前記目的のタンパク質またはペプチドが、抗原タンパク質または抗原ペプチドおよびアジュバンド機能を有するタンパク質である、形質転換ビフィズス菌。
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