JP2004194654A - バクテリオファージ由来の溶菌遺伝子と溶菌遺伝子を組み込んだプラスミドによる遺伝子治療用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、従来のファージ治療の利点を生かしつつ、ファージを用いる欠点を改善することができる感染症に対する新たな医薬組成物、及びそのためのプラスミドなどを提供する。
【解決手段】
本発明は、ファージ全体を使用するのではなく、ファージが持つ溶菌遺伝子を組み込んだプラスミドを用い、このプラスミドに組み込まれた溶菌遺伝子を病原性の微生物中で発現させて細菌などの微生物を溶解することを特徴とする医薬組成物等に関する。
本発明は、バクテリオファージの溶菌遺伝子を含有する遺伝子構築物、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物、そのためのプラスミドなどの遺伝子構築物、並びにそれを用いた微生物の溶解剤、及び当該溶解剤を用いたヒト以外における病原性微生物を溶解させる方法に関する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、バクテリオファージの溶菌遺伝子を含有する遺伝子構築物、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物、そのためのプラスミドなどの遺伝子構築物、並びにそれを用いた微生物の溶解剤、及び当該溶解剤を用いたヒト以外における病原性微生物を溶解させる方法に関する。本発明は、バクテリオファージの溶菌遺伝子を利用する薬剤耐性菌等の細菌に対する新たな治療方法、及び該方法に使用するベクター、医薬組成物などに関する。

抗生物質が各種の感染症の治療に導入されて以来、抗生物質に対する薬剤耐性菌の存在が世界的レベルで重大な問題になっている。１９２９年のペニシリン発見の数年後には、ペニシリン耐性黄色ブドウ球菌が発見された。現在ではこの他にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(ＭＲＳＡ)、バンコマイシン耐性腸球菌(ＶＲＥ)、バンコマイシン耐性ＭＲＳＡ(ＶＲＳＡ)、ゲンタマイシン耐性緑濃菌、ニューキノロン耐性大腸菌、カルバペネム耐性セラチア菌などの多種類の薬剤耐性菌が出現してきている。抗生物質に抵抗性の耐性病原菌や非病原性耐性菌が知られている。病原性が弱いので健康な人には病気を起こさないが、病気や加齢などで免疫力が落ちた人に病気を起こし、しばしば院内感染の原因となっているものもある。
病人の体内で抗生物質が効かない薬剤耐性菌の存在が疑われる場合、従来とりうる唯一の手段は異なる種類の抗生物質の使用を試み、それが駄目なら更に別の抗生物質の使用を試みる、ということの繰り返しである。また、抗生物質の使用に替わり得る方法としては、人に遺伝的に欠けている生体内の酵素などを補う又は合成させる方法である遺伝子治療を挙げることが出来るが、これも現在ではまだ試みの域を出ていない。

他のひとつの方法として、ファージ治療(Bacteriophage therapy)が挙げられる。バクテリオファージは細菌類に感染してこれを溶解するからである。ファージの持つ人に対する安全性の高さ、ファージの持つ高い宿主特異性、変異し易さなど多くの利点があると考えられているが、この治療法は世界的には余り広く試みられてはいない。このようなファージ治療としては、遺伝子改変型のファージを使用する方法（特許文献１参照）、ヘリコバクタピロリの治療にバクテリオファージを使用する方法（特許文献２参照）、宿主特異的でかつ宿主範囲の広いバクテリオファージを使用する方法（特許文献３参照）などが提案されている。しかし、日本国内ではこの治療法はほとんど試みられておらず、世界的には旧ソ連や東ヨーロッパではかなり試みられている（非特許文献１参照）。

バクテリオファージにおける小型溶解タンパク質の発見以降、ＲＮＡファージによる細胞溶解に関する研究が数多く行われてきた。これらの研究につては多数の総説が報告されている（非特許文献２〜７参照）。一本鎖ＲＮＡバクテリオファージは、リゾチームを用いることなく感染サイクル終点でその宿主大腸菌細胞を溶解する。代わりに、このファージは低分子量の疎水性タンパク質をコードし、それはＡ−Ｉ群及びＡ−ＩＩ群ファージにおいて宿主の十分な溶解を惹起する（非特許文献８−９参照）が、Ｂ−ＩＩＩ群ファージにおいては、Ｑβファージの成熟化（Ａ２）タンパク質が大腸菌細胞それ自体の溶解を誘発することが明らかにされている（非特許文献１０−１１参照）。
小型一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡファージ類の溶解のメカニズムとしては、ＲＮＡファージＱβのＡ２（成熟化／溶解）タンパク質がＭｕｒＡステップを阻害して細胞壁の生合成をブロックし、また、φＸ１７４ファージ（小型球形ＤＮＡファージ）の溶解タンパク質Ｅが細胞壁の生合成のＭｒａＹステップを阻害して細胞壁の合成を阻害することが報告されている。ＭｕｒＡおよびＭｒａＹステップまたはその活性の阻害は、細胞壁の生合成を阻害することになり、そして、その結果、宿主細胞の溶解を誘発することになる（非特許文献４、及び非特許文献１２−１４参照）。

大腸菌に感染するＲＮＡファージは、Ａ群およびＢ群に分類される。Ａ群のＲＮＡファージは、亜群ＩおよびＩＩに分割され、Ｂ群のＲＮＡファージは、亜群ＩＩＩおよびＩＶに分割される（非特許文献１５−１８参照）。ＲＮＡコリファージの上記の４つの亜群の中では、Ａ−Ｉ群（ｆ２、ＭＳ２、Ｒ１７、ｆｒ）およびＢ−ＩＩＩ群（Ｑβ）が非常に多く研究されている（例えば、非特許文献２−３参照）。上記のＡ群及びＢ群の２つのファージ類（Ａ−Ｉ、ＩＩおよびＢ−ＩＩＩ、ＩＶ）の遺伝子構造は非常に似ている（図１ａおよび図６参照）。成熟化タンパク質、コートタンパク質およびレプリカーゼβサブユニットをコードする主要な遺伝子類はほぼ同じ長さで、同じ順序で配置されているが、それ以外のマイナーな遺伝子類はわずかに異なっている。遺伝子の構成および遺伝子の順序が類似しているにもかかわらず、溶解遺伝子の構造および機能は、Ａ群とＢ群で非常に異なっている。

また、Ｑβファージ（Ｂ−ＩＩＩ群）およびＳＰファージ（Ｂ−ＩＶ群）の成熟化タンパク質は相互に交換可能に使用でき、ＳＰファージの成熟化タンパク質は溶解作用を有している（非特許文献１９参照）。これに関連する、ＧＡファージ（Ａ−ＩＩ群）の溶解遺伝子の機能は、現在まで十分に解明されていない。
ＭＳ２ファージのクローニングされた溶解遺伝子により溶解された細胞においては、局所的破壊が起こり、かつ細胞質物質が放出されることが、透過型電子顕微鏡写真から明らかにされてきた（非特許文献２０参照）。しかし、透過型電子顕微鏡を用いてＲＮＡファージまたはクローニングされた溶解遺伝子類による溶解細胞を直接見えるようにすることは、これまでそれほど精力的には行われてこなかった。

特表平９−５１１３９７号 特表２０００−５０５６４８号 特表２０００−５０８３２２号 Sulakvelidze et al.(2001)."Bacteriophage therapy", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45, 649‐659 van Duin, J. (1988). Single-stranded RNA bacteriophages. in The Bacteriophages, pp. 117-167. Edited by R. Calendar. New York: Plenum. Young, R. (1992), Bacteriophage lysis: mechanism and regulation, Microbiological Reviews, 56, 430-481. Young, R., Wang, I.-N., et al., (2000). Phages will out: strategies of host cell lysis, Trends in Microbiology, 8, 120-128. Adhin, M. R. & van Duin, J. (1989). Translational regulation of the lysis gene in RNA bacteriophage for requires a UUG initiation codon, Molecular & General Genetics, 218, 137-142. Adhin, M. R., Hirashima, A., et al., (1989). Nucleotide sequence from the ssRNA bacteriophage JP34 resolves the discrepancy between serological and biophysical classification, Virology, 170, 238-242. Groeneveld, H., Oudot, F., et al., (1996). RNA phage KU1 has an insertion of 18 nucleotides in the start codon of its lysis gene, Virology, 218, 141-147. Kastelein, R. A., Remaut, et al., (1982). Lysis gene expression of RNA phage MS2 depends on a frameshift during translation, Nature, 276, 35-41. Coleman, J., Inouye, M., et al., (1983). Bacteriophage MS2 lysis protein does not require coat protein to mediate cell lysis, Journal of Bacteriology, 153, 1098-1100. Karnik, S. & Billeter, M., (1983). The lysis function of RNA bacteriophage Ｑβ is mediated by the maturation (AT) protein, EMBO Journal, 2, 1521-1526. Winter, R. B. & Gold, L., (1983). Overproduction of bacteriophage Ｑβ maturation (A2) protein leads to cell lysis, Cell, 33, 877-885. Bernhardt, T. G., Roof, W. D., et al., (2000). Genetic evidence that the bacteriophage φX174 lysis protein inhibits cell wall synthesis,Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 97, 4297-4302. Bernhardt, T. G., Struck, D. K., et al., (2OO1). The lysis protein E of φX174 is a specific inhibitor of the MraY-catalyzed step in peptidoglycan synthesis, Journal of Biological Chemistry, 276, 6093-6097. Bernhardt, T. G., Wang, I.-N., et al., (2OO1). A protein antibiotic in the phage Ｑβ virion: diversity in lysis targets, Science, 292, 2326-2329. Furuse, K., Hirashima, A., et al., (1979). Grouping of RNA coliphages based on analysis of the sizes of their RNAs and proteins, Virology, 97, 328-341. Miyake, T., Shiba, T., et al., (1969). Isolation and properties of two new RNA phages SP and FI, Japanese Journal of Microbiology, 13, 375-382. Watanabe, I., Miyake, T., et al., (1967). Isolation and grouping of RNA phages, Proceedings of the Japan Academy, 43, 204-209, Watanabe, I., Nishihara, T., et al., (1967). Group characteristics of RNA phages, Proceedings of the Japan Academy, 43, 210-213. Priano, C., Arora, R., et al., (1995). A complete plasmid-based complementation system for RNA coliphage Ｑβ : three proteins of bacteriophages Ｑβ(group III) and SP(group IV) can be interchanged, Journal of Molecular Biology, 249, 283-297. Witte, A., Reisinger, G. R., et al., (1989). Characterization of Escherichia coli lysis using a family of chimeric E-L genes, FEMS Microbiology Letters, 164, 159-167. Inokuchi, Y., Takahashi, R., et al., (1986). The complete nucleotide sequence of the group II RNA coliphage GA, Journal of Biochemistry, 99, 1169-1180. 桜井稔三、渡辺格、大野典也。(１９６７)。ＲＮＡファージの分離と血清学的分類。 ウイルス １７：１６５−１７１. Watanabe, I., Miyake, T., Sakurai, T., Shiba, T., and Ohno, T., (1969). Isolation and grouping of RNA phages. Proc. Japan Acad. 43: 204‐209. Nishihara, T., Haruna, I., Watanabe, I., Nozu, Y., and Okada, Y., (1969). Comparison of coat proteins from three groups of RNA Phages. Virology 37:153‐155. Nishihara, T., and Watanabe, I., (1969). Discrete buoyant density distribution among RNA phages. Virology 39: 360‐362.

現在世界的レベルで抗生物質に対する薬剤耐性菌の存在が重大な問題になっている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌 （ＶＲＥ）、バンコマイシン耐性 ＭＲＳＡ（ＶＲＳＡ）などの抗生物質に抵抗性の耐性病原菌や非病原性耐性菌が多数知られてきており、これらの感染症に対する有効な処置方法が無いことが大きな問題になってきている。本発明は、これらの問題を解決することを目的としている。生体内に侵入してきたこれらの薬剤耐性菌を駆逐するための新規な手法、そのための医薬組成物を提供することを目的としている。
本発明の目的は、上記課題を解決し、従来のファージ治療の利点をより生かすことの出来る、薬剤耐性菌に対する新たな治療方法、及び該方法に使用するベクターなどを提供することである。

従来からファージを用いた治療法は提案されていたが、ファージはウイルスの１種であり、その使用に未知の多くの課題が懸念されていた。本発明者は、ファージ全体を使用するのではなく、小型球形一本鎖ファージが持つ溶菌遺伝子が産生する溶菌蛋白質に着目し、当該溶菌蛋白質の溶菌性を検討したところ、これらの蛋白質が十分な溶菌性をゆうしていることを確認し、当該溶菌蛋白質をコードする遺伝子を用いることにより薬剤耐性菌などを駆逐することができることを見出した。より具体的には、本発明は、溶菌遺伝子を組み込んだプラスミドを用い、このプラスミドを人の体内に導入し体内に存在する薬剤耐性菌などに導入（トランスフェクション）させ、その溶菌遺伝子の発現をさせて細菌の溶菌を導き、その結果、細菌を殺すことができることを見出した。
本発明の溶菌遺伝子を用いる方法は、ファージ全体を使用するものではなく、溶菌遺伝子のみを使用するという点において、従来のファージ全体を使用するファージ治療法とは全く異なるものであり、遺伝子を用いた細菌感染症に対する新規な治療方法、及びそのための医薬組成物を提供するものである。

即ち、本発明は、バクテリオファージの溶菌遺伝子を含有する遺伝子構築物、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物、より詳細には感染症の治療用の医薬組成物、及び当該医薬組成物を投与して、当該医薬組成物に含有されたプラスミドを細菌にトランスフェクションさせ、当該プラスミドに組み込まれた溶菌遺伝子を発現させ、細菌を溶菌に導き死滅させることから成る、細菌感染症の治療方法に関する。また、本発明は、当該医薬組成物を製造するためのバクテリオファージの溶菌遺伝子をコードする遺伝子を含有する遺伝子構築物の使用に関する。
また、本発明は、バクテリオファージの溶菌遺伝子を含有するプラスミドなどの遺伝子構築物、より詳細には遺伝子治療用や微生物の溶解剤としての遺伝子構築物に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の遺伝子構築物を細菌にトランスフェクションさせ、当該遺伝子構築物に組み込まれた溶菌遺伝子を発現させることからなる、ヒト以外における細菌を溶菌する方法、及び前記した本発明の遺伝子構築物を含有してなる細菌類などの微生物の溶解剤に関する。

本発明の態様としては、第一の態様として、バクテリオファージの溶菌遺伝子を組み込んだプラスミドに係る。本発明の第二の態様として、本発明のプラスミドを細菌にトランスフェクションさせ、該プラスミドに組み込まれた溶菌遺伝子を発現させることから成る、細菌を溶菌する方法に係る。また、本発明の第三の態様としては、上記のプラスミドを有効成分として含有する薬剤組成物に係る。さらに、本発明の第四の態様としては、この薬剤組成物を投与し、該薬剤組成物に含有されたプラスミドを細菌にトランスフェクションさせ、該プラスミドに組み込まれた溶菌遺伝子を発現させ、細菌を溶菌に導き死滅させることから成る、細菌感染症の治療方法に係る。

本発明者は、ＧＡおよびＳＰの溶解遺伝子を含有する発現プラスミドを構築するに当たって、ＧＡファージ（Ａ−ＩＩ群）に感染した細胞の溶解が小溶解遺伝子（small lysis genes）の作用によるものであり、また、ＳＰファージ（Ｂ−ＩＶ群）に感染した細胞の溶解が成熟化タンパク質遺伝子（Ａ２）の作用によるものであると予測した。これは、ＭＳ２ファージ（Ａ−Ｉ群）およびＱβファージ（Ｂ−ＩＩＩ群）に感染した細胞におけるのと同様であろう思われたからである。
まず、ＧＡの溶解遺伝子を含有する発現プラスミドを構築するために、ＧＡ ＲＮＡのコートタンパク質および溶解タンパク質の遺伝子の断片を用いて、以下の実施例１に記載のようにしてＲＴ−ＰＣＲにより目的の遺伝子を得た。ＭＳ２ファージ（非特許文献８参照）の場合と同様に、溶解活性を付与するためにコートタンパク質をコードする遺伝子を含有させた。この遺伝子をプラスミドｐＰＬｃ２４５のＡｓｃＩとＰａｃＩの間に含有させて、ファージＧＡの溶解遺伝子をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＧＡｃｌ−８を構築し、これを用いて大腸菌の溶解性を検討した。得られた結果を、図１に示した。図１の（ａ）（図１の上段）は、ファージＧＡのゲノムＲＮＡ（図１（ａ）上段）及びプラスミドｐＧＡｃｌ−８（図１（ａ）下段）のマップを示す。各ヌクレオチドの番号はイノクチらの方法（非特許文献２１参照）による。プラスミドは溶解遺伝子の発現に関連する部分のみを示している。図１の（ｂ）のグラフは、大腸菌Ｋ１２ΔＨ１Δｔｒｐを、２８℃（吸光度（ＯＤ_６００）は０．２である。）で培養したときの増殖曲線を示し、グラフの横軸は誘導してからの時間（分）、縦軸は吸光度（ＯＤ_６００）を示す。グラフの白丸印（○）は前記したファージＧＡの溶解遺伝子をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＧＡｃｌ−８を含有する大腸菌の場合を示し、黒丸印（●）は空のプラスミドであるプラスミドｐＰＬｃ２４５を含有させた大腸菌の場合を示す。グラフは誘発開始から１５分毎の測定結果を示している。
この結果、プラスミドｐＧＡｃｌ−８を保有している大腸菌細胞は、誘発により、誘発から２５分後に溶解を開始することがわかった。

ＧＡファージにおける前記の結果を更に確認するために、Ａ−ＩＩ群ファージ（ＧＡグループ）に属するその他の４種類のファージＲＮＡを用いて同様に実験した。これらの４種のファージは、汚水中から大腸菌（雄株）を宿主として増殖して、文献に記載の方法（非特許文献１７、及び非特許文献２２−２５参照）にしたがって分離したものである。これらのファージは、それぞれＳＤファージ、ＴＨ１ファージ、ＴＬ２ファージ、及びＪＰ５００ファージと称せられるいずれも公知のもので、汚水中などのどこにでも存在しているものであり、文献に記載の確立されたスクリーニング方法により、容易に分離できるものであるから当業者が容易に入手可能なものである。これらのファージのＲＮＡをそれぞれ鋳型に用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成した。これを、プラスミドｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）のＡｓｃＩとＰａｃＩの間に導入した。これらのｃＤＮＡは全て各ファージのコートタンパク質遺伝子及び溶菌遺伝子を含み、コートタンパク質遺伝子のリボゾーム結合部位（ＳＤ配列）を含んでいる。このようにして得られた遺伝子構築物を、それぞれ以下のとおり命名した。
（１） ｐＳＤｃｌ−１０ (ＳＤファージ由来)
（２） ｐＴＨ１ｃｌ−１ (ＴＨ１ファージ由来)
（３） ｐＴＬ２ｃｌ−１ (ＴＬ２ファージ由来)
（４） ｐＪＰ５００ｃｌ−１２ (ＪＰ５００ファージ由来)
これらのそれぞれのプラスミドを大腸菌Ｋ１２ΔＨ１Δｔｒｐに導入し、図１（ｂ）と同様にして増殖曲線を測定した。結果を図２〜５にそれぞれ示す。図２〜５の各グラフの横軸及び縦軸は図１（ｂ）と同様である。

図４（ＴＬ２ファージ由来）及び図５（ＪＰ５００ファージ由来）では、約６０分後くらいから増殖の傾向がみられるが、図４では３０分から６０分の間、図５では１５分から６０分の間では明確な溶解性が観測できている。
これらのファージから得られたＲＴ−ＰＣＲ産物の遺伝子から、溶解（溶菌）活性を有する蛋白質をコードしている部分を検討した。これらのファージから得られた遺伝子の溶解（溶菌）活性を有する蛋白質をコードしている遺伝子の翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号１〜４にそれぞれ示す。

次に、ＳＰファージ（Ｂ−ＩＶ群）について同様な検討を行うために、ＳＰ溶解遺伝子を含有する発現プラスミドを構築し、その欠失変異体およびそれらの溶解活性を調べた。
ＳＰ ＲＮＡのＡ２遺伝子を、以下の実施例３に記載のようにしてＲＴ−ＰＣＲによる取得した。得られた遺伝子をｐＬプロモーターを含有するプラスミドｐＰＬｃ２４５−２のＥｃｏＲＩとＳａｌＩの間に挿入してプラスミドｐＳＰＡ２−１０を構築した。また、これらの遺伝子の一部を欠損させた遺伝子を同様に挿入してプラスミドｐＨＥ−３、プラスミドｐＰｖ−１７、及びプラスミドｐＭＩ−４を併せて構築した。これらのプラスミドを用いて前記の方法と同様にして大腸菌の溶解性を検討した。得られた結果を、図６に示した。図６の（ａ）（図６の右側の上段）は、ファージＳＰのゲノムＲＮＡのマップを示す。各ヌクレオチドの番号はイノクチらの方法（非特許文献２１参照）による。図６の（ｂ）は構築した各プラスミドのＡ２遺伝子の発現部位を示す。図６の（ｂ）の上から、プラスミドｐＳＰＡ２−１０、プラスミドｐＨＥ−３、プラスミドｐＰｖ−１７、及びプラスミドｐＭＩ−４をそれぞれ示している。数字は欠損位置を示し、それぞれの制限酵素部位を併せて示している。図６の（ｃ）のグラフは、大腸菌Ｋ１２ΔＨ１Δｔｒｐを、２８℃で、吸光度（ＯＤ_６００）を０．２に調整し、４２℃にしてｐＬプロモーターを誘導させて培養したときの増殖曲線を示し、グラフの横軸は誘導してからの時間（分）、縦軸は吸光度（ＯＤ_６００）を示す。グラフの白丸印（○）はプラスミドｐＳＰＡ２−１０を導入した大腸菌の場合を示し、白三角印（△）はプラスミドｐＨＥ−３の場合、黒四角印（■）はプラスミドｐＰｖ−１７の場合、及び黒丸印（●）はプラスミドｐＭＩ−４の場合をそれぞれ示している。グラフは誘発開始から１５分毎の測定結果を示している。

この結果、Ａ２遺伝子の全長が挿入されているプラスミドｐＳＰＡ２−１０を含有している大腸菌細胞は、誘発により、誘発から４５分後に溶解を開始することがわかった。しかし、Ａ２遺伝子の一部が欠損した遺伝子が挿入されているプラスミドｐＨＥ−３、プラスミドｐＰｖ−１７、及びプラスミドｐＭＩ−４を含有する大腸菌は増殖を続けることができることを示している。大腸菌を溶解するためには、Ａ２遺伝子の一体性が必要性であることがわかった。図６の（ｃ）に示したように、欠失変異体プラスミドを保有している大腸菌細胞は、溶解活性を全く有していなかった。これらの結果は、Ｑβ−Ａ２遺伝子（Ｂ−ＩＩＩ群）で得られた他者の結果と一致している（非特許文献１０−１１参照）。これらの結果は、Ｂ−ＩＩＩおよびＢ−ＩＶ群のファージが、溶解（成熟化タンパク質）遺伝子に関して、類似の特性を有していることを意味している。

ＳＰファージにおける前記の結果を更に確認するために、Ｂ−ＩＶ群ファージ（ＳＰグループ）に属するその他の３種類のファージＲＮＡを用いて同様に実験した。これらの４種のファージは、汚水中から大腸菌（雄株）を宿主として増殖して、文献に記載の方法（非特許文献１７、及び非特許文献２２−２５参照）にしたがって分離したものである。これらのファージは、それぞれＳＧ１０ファージ、ＩＤ２ファージ、及びＴＷ１９ファージと称せられるいずれも公知のもので、汚水中などのどこにでも存在しているものであり、文献に記載の確立されたスクリーニング方法により、容易に分離できるものであるから当業者が容易に入手可能なものである。これらのファージのＲＮＡをそれぞれ鋳型に用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成し、プラスミドｐＰＬｃ２４５−２のＥｃｏＲＩとＳａｌＩの間に導入した。これらのｃＤＮＡは全て各ファージのＡ２遺伝子と、リボゾーム結合部位（ＳＤ配列）を含んでいる。このようにして得られた遺伝子構築物を、それぞれ以下のとおり命名した。
（５） ｐＳＧ１０Ａ２−１８ (ＳＧ１０ファージ由来)
（６） ｐＩＤ２Ａ２−１ (ＩＤ２ファージ由来)
（７） ｐＴＷ１９Ａ２−１５ (ＴＷ１９ファージ由来)
これらのそれぞれのプラスミドを大腸菌Ｋ１２ΔＨ１Δｔｒｐに導入し、図６（Ｃ）と同様にして増殖曲線を測定した。結果を図７〜９にそれぞれ示す。図７〜９の各グラフの横軸及び縦軸は図６（ｃ）と同様である。

同様な方法により、Ｂ−ＩＩＩ群ファージ（Ｑβグループ）に属するＴＷ１８ファージ、Ａ−Ｉ群ファージ（ＭＳ２グループ）に属するＢＯ１ファージ及びＺＲファージのＲＮＡを鋳型に用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子断片を取得した。得られた二本鎖ＤＮＡをプラスミドｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）のＡｓｃＩとＰａｃＩの間に挿入して遺伝子構築物を構築した。なお、これらの３種のファージは、汚水中から大腸菌（雄株）を宿主として増殖して、文献に記載の方法（非特許文献１７、及び非特許文献２２−２５参照）にしたがって分離したものである。これらの３種のファージ、即ちＴＷ１８ファージ、ＢＯ１ファージ、及びＺＲファージは、いずれも公知のもので、汚水中などのどこにでも存在しているものであり、文献に記載の確立されたスクリーニング方法により、容易に分離してこれるものであるから当業者が容易に入手可能なものである。
ＴＷ１８ファージからのｃＤＮＡはＡ２遺伝子と、リボゾーム結合部位（ＳＤ配列）を含んでおり、ＢＯ１ファージ及びＺＲファージからのｃＤＮＡは、溶菌遺伝子、コートタンパク質遺伝子、及びコートタンパク質のリボゾーム結合部位（ＳＤ配列)を含むものである。このようにして得られた遺伝子構築物を、それぞれ以下のとおり命名した。
（８）ｐＴＷ１８Ａ２−７プラスミド （ＴＷ１８ファージ由来）
（９）ｐＢＯ１ｃｌ−３プラスミド （ＢＯ１ファージ由来）
（１０）ｐＺＲｃｌ−３プラスミド （ＺＲファージ由来）
これらのそれぞれのプラスミドを大腸菌Ｋ１２ΔＨ１Δｔｒｐに導入し、図１（ｂ）又は図６（Ｃ）と同様にして増殖曲線を測定した。結果を図１０〜１２にそれぞれ示す。図１０〜１２の各グラフの横軸及び縦軸は図１（ｂ）又は図６（ｃ）と同様である。

次に、ＧＡファージ（Ａ−ＩＩ群）の溶解遺伝子を導入した溶解細胞の形態を電子顕微鏡写真を用いて検討した。ＲＮＡファージＧＡ（Ａ―ＩＩ群）の溶解遺伝子によって誘発された大腸菌細胞から得られた結果の透過型電子顕微鏡写真を図１３（ａ−ｈ）に図面に代わる写真で示す。図１３の写真は、プラスミドｐＧＡｃｌ−８を導入した大腸菌の、誘導から４０分後の透過型電子顕微鏡写真である。各写真中のスケールバーは２００ｎｍを示す。この写真から、溶解細胞中で２種類の典型的な特徴が見られた。ひとつは、細胞表面上の膨張（バルーニング）構造であり（図１３のｃ−ｈ参照）、他のひとつは細胞壁からの物質類の漏出であった（図１３のａ、ｂ参照）。
透過型電子顕微鏡写真では溶解した細胞の表面に孔を観察することはできなかったが、細胞から多くの物質の漏出が見られた。また、多くの膨張（バルーニング）した構造が観察され、これが細胞の外膜であることもありうるが、その確たる証拠は得られなかった（図１３のｃ−ｈ参照）。溶解遺伝子が導入されていない対照の細胞は、このような構造を全く示さなかった。膨張した構造になった細胞の中には未だ原型をとどめているものも有るが（図１３のｃ、ｈ参照）、図１３のｃ及びｄにおける構造物は破壊され、細胞中の物質類が放出されていた。さらに、図１３のｇでは、膨張した構造物が断片化したの観察された。

同様に、ＳＰファージの溶解遺伝子により誘発されて溶解した細胞の電子顕微鏡写真を検討した。ＲＮＡファージＳＰ（Ｂ−ＩＶ群）の溶解遺伝子によって誘発された大腸菌細胞から得られた結果の透過型電子顕微鏡写真を、図１４の（ａ）−（ｆ）に図面に代わる写真で示す。図１４の写真は、プラスミドｐＳＰＡ２−１０を導入した大腸菌の、誘導から６０分後の透過型電子顕微鏡写真である。各写真中のスケールバーは５００ｎｍを示す。
観察された溶解した細胞では、２つの非常に明確な特徴があった。第１の特徴は、細胞の形状が伸長し、かつ先細りになったことであり、部分的に断片化も同様に出現していた（図１４のｅ、ｆ参照）。第２の特徴は、細胞壁からの物質類の漏出であった（図１４のａ、ｂ、ｃ）。ＳＰファージの溶解遺伝子によって誘発された細胞では、隣接する細胞に結合したような細胞類も観察された（図１４のｂ、ｄ参照）。これらの構造は、前記したＧＡファージの溶解遺伝子で誘発された細胞中で説明したのと同一の膨張した構造物であるのかも知れない。

ウィッテ（Ｗｉｔｔｅ）らは、透過型電子顕微鏡写真によってＭＳ２ファージ（Ａ−Ｉ群）のクローニングされた溶解遺伝子による細胞の溶解により局所破壊が起こったことを報告している（非特許文献２０参照）。しかし、ＧＡファージ（Ａ−ＩＩ群）のクローニングされた溶解遺伝子による細胞は、ＭＳ２ファージ（Ａ−Ｉ群）のそれとは異なっていた。
多くの膨張した構造物がＧＡ（Ａ−ＩＩ群）（図１３参照）で観察されたが、ＳＰ（Ｂ−ＩＶ群）ではそれほど多くの典型的な膨張した構造物は観察されなかった（図１４参照）。しかし、ＲＮＡファージＱβ（Ｂ−ＩＩＩ群）のＡ２（成熟化／溶解）遺伝子を導入して溶解させた細胞は、誘導開始後たったの５分で１個の細胞ではあるが、膨張した構造の形態が観察された。したがって、Ｂ群においても膨張した構造は、溶解細胞の溶解における中間の段階で存在するものと考えられる。
膨張した構造となる形態と、物質の漏出した形態の差を明確化することは困難である。しかし、膨張した構造の形態では、この構造自体と外部との間に明確な境界を観察することができるが、物質の漏出した形態では、漏出物質と外部の間に明確な境界を観察することが困難となる。
物質の漏出した形態は３つの異なる方法で出現すると考えられる。ひとつは、細胞壁からの直接漏出であり（例えば、図１３のａ、ｂ参照）、第２は、膨張した構造の破壊であり（例えば、図１３のｃ参照）、そして３つめは、上記２者の組み合わせである（例えば、図１３のｅ、ｆ参照）。

大腸菌の細胞の外膜が膨張した構造の形態は、これまでに、熱処理細胞、並びにλＳタンパク質遺伝子、及びφＸ１７４とＭＳ２ファージのキメラ遺伝子Ｅ−Ｌにより誘導された細胞で報告されている（非特許文献２０等参照）。しかし、ＲＮＡファージ又はクローニングされたＲＮＡファージによる大腸菌の外膜が膨張した構造の形態は、これまで報告されていない。Ｅ−Ｌキメラ遺伝子による膨張の機構は、既に報告されている（非特許文献２０参照）。全体として、ＲＮＡファージＧＡ（Ａ−ＩＩ群）およびＳＰ（Ｂ−ＩＶ群）による大腸菌細胞の溶解特性の特徴点は、伸長した細胞の形態（図１４；ＳＰファージ）および多くの膨張した構造の形態（図１３；ＧＡファージ）が挙げられる。

このように、ファージ全体を用いなくてもファージの溶解遺伝子を細菌類に導入することにより、細菌類が溶解して死滅することが判明した。本発明はこの原理を応用して薬剤耐性菌などによる感染症を治療することができることを見出したものである。
本発明の溶解遺伝子としては、細菌類などの病原性の微生物の中で発現可能であって、発現して当該微生物を溶解して死滅させることのできる遺伝子であればよい。例えば細菌類に対する溶菌遺伝子などが挙げられる。

本発明における溶菌遺伝子としては、細菌類の中で発現可能であって、発現して当該微生物を溶解して死滅させることのできる遺伝子であればよく、例えば、それがコードするタンパク質が、細胞内で増殖したバクテリオファージが感染サイクルの終点で細胞を溶解させバクテリオファージが細胞外に放出するために必要な機能を有している限り、その他の作用を有する他のタンパク質をコードしていても良いし、又は、遺伝子が他の名称で呼ばれていても良い。従って、既に記載したように、バクテリオファージの種類によっては、このような「溶菌遺伝子」は成熟化タンパク質をコードする遺伝子であり得る。又、溶菌遺伝子による細胞溶解のメカニズムに特に制限はない。

本発明で使用した各種バクテリオファージ由来の溶菌遺伝子の幾つかは既に公知であり、その塩基配列に関する情報も、例えば、ＮＣＢＩのサイト（http://ncbi.nlm.nih.gov）等から容易に入手することが出来る。

本発明のファージとしては、前記した溶解遺伝子を含有するものであれば特に制限はないが、好ましくは細菌類に対するバクテリオファージが挙げられる。
バクテリオファージは、細菌に感染するウイルスであるが、ビリオンに含まれるゲノムの種類によって、一本鎖ＤＮＡファージ、二本鎖ＤＮＡファージ、一本鎖ＲＮＡファージ、及び、二本鎖ＲＮＡファージに分類される。
この中で、本発明のプラスミドに組み込まれる溶菌遺伝子は、特に、一本鎖ＲＮＡファージであるレヴィウイルス(Leviviridae)科に属する小型球形ＲＮＡファージ、又は一本鎖ＤＮＡファージであるミクロウイルス(Microviridae)科に属する小型球形ＤＮＡファージに由来するものが好ましい。
レヴィウイルス科は更に、ＭＳ２ファージグループ(Ｉグループ)及びＧＡファージグループ(IIグループ)を含むレヴィウイルス属、並びに、Ｑβファージグループ(IIIグループ)及びＳＰファージグループ(IVグループ)を含むアロレヴィウイルス属に分類される。

本発明の遺伝子構築物は、前記した本発明の溶解遺伝子を細菌類などの病原性の微生物に導入でき、当該微生物中で当該遺伝子を発現できるものであれば、如何なる形態であってもよい。本発明の遺伝子構築物の好ましい例としてはプラスミドなどが挙げられる。
本発明のプラスミドには、各種の細菌にトランスフェクションさせ、該プラスミドに組み込まれた溶菌遺伝子を発現させる為に使用することができる。

従って、本発明のプラスミドには、溶菌遺伝子の他に、例えば、ファージのコートタンパク質のようなその他の遺伝子、並びに、該細菌内で溶菌遺伝子を転写・発現させるために必要な各要素（塩基配列）を適宜有するように構成される。
このような要素は当業者には周知であり、例えば、プロモーター等の転写調節領域、翻訳開始に必要なリボソーム結合部位（ＳＤ配列など）、及び、各種制限酵素切断部位等がある。
当業者であれば、これら各要素の選択、組み合わせ、プラスミドにおける配置などは、溶菌遺伝子の種類、トランスフェクションの対象となる細菌の種類、発現様式などに応じて適宜決定し、当該技術分野で周知の遺伝子工学的手法により容易に作成することが出来る。
例えば、プロモーターとしてλｐＬを使用することによって、その制御下に温度シフトによって溶菌遺伝子を発現させることが出来る。又、例えば、ラクトースプロモーターのような誘導プロモーターを使用することによって、イソプロピル１−チオβ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）のような適当な誘導物質を添加することよって溶菌遺伝子を発現させることが出来る。

本発明のプラスミドなどの遺伝子構築物によるトランスフェクションの対象となる細菌の種類に特に制限はない。その一例として、例えば、大腸菌、並びに、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(ＭＲＳＡ)、バンコマイシン耐性腸球菌(ＶＲＥ)、バンコマイシン耐性ＭＲＳＡ(ＶＲＳＡ)、ゲンタマイシン耐性緑濃菌、ニューキノロン耐性大腸菌、及びカルバペネム耐性セラチア菌のような各種の薬剤耐性菌を挙げることが出来る。

従って、本発明の第二の態様は、本発明のプラスミドなどの遺伝子構築物を細菌にトランスフェクションさせ、該プラスミドに組み込まれた溶菌遺伝子を発現させることから成る、ヒト以外における細菌を溶菌する方法、及び当該方法に使用される本発明のプラスミドなどの遺伝子構築物を含有してなる細菌類などの微生物の溶解剤を提供する。本発明の溶菌する方法は、ヒト以外の動物や植物などの生体中で行うこともできるが、インビトロなどの試験における生体外でおこなうこともできる。

更に、本発明の第三の態様は、前記した本発明のプラスミドなどの遺伝子構築物を有効成分として含有する医薬組成物（薬剤組成物）を提供するものである。本発明の医薬組成物は、前記した本発明のプラスミドなどの遺伝子構築物、及び製薬上許容される担体を含有してなる。
又、本発明の第四の態様として、この医薬組成物（薬剤組成物）を投与し、該薬剤組成物に含有されたプラスミドを細菌にトランスフェクションさせ、該プラスミドに組み込まれた溶菌遺伝子を発現させることから成る、細菌感染症の治療方法、及び前記した本発明の医薬組成物を製造するための本発明の遺伝子構築物の使用を提供する。

本発明の医薬組成物は、使用目的・用途・投与形態などに応じて、任意の形態を取ることが出来、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤、エアゾール剤、リポソーム、ゲル剤、クリーム剤、粉剤、軟膏剤、膣坐剤などとして用いることができる。これらの製剤中に占めるプラスミドの含有割合は、通常、０．０００１〜５０重量％、好ましくは０．００１〜１０重量％程度である。

本発明の医薬組成物は各種慣用の方法により、製剤の当業者に周知の各種の基剤、担体と配合して前記のような各種の剤型に製剤化することができる。
即ち、例えば、水、低級アルコール、エチレングリコール、グリセリン類、その他各種の有機溶媒から成る液剤の担体；例えば、上記のような液剤の担体とヘプタフルオロプロパンガスとを配合したエアゾールの担体；例えば、上記のような液剤の担体とゲル生成剤とを組み合わせたゲル基剤；例えば、カルボキシビニルポリマーと有機アミンもしくは水酸化ナトリウム水溶液などの塩基の組み合わせまたはヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロースエーテル、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコール等のゲル生成剤；非イオン性界面活性剤のような乳化剤；例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、ヤシ油、パラフィン油、ラノリン、ワセリン、酸化亜鉛、ビーズワックス、マクロゴール、ステアリルアルコール、プロピレングリコール等の軟膏基剤；例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、乳糖、殿粉、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、タルク、シリコン等の不活性な希釈剤、造粒剤、分散剤、並びに結合剤等の各種基剤及び担体を単独で又は組み合わせて使用できる。

これらの各種の製剤は慣用の方法、例えば、日本薬局方に記載の方法と同様にして製造することができる。また、本発明の医薬組成物は、その剤型に応じて、経口投与、皮膚への塗布、又は粘膜への噴霧等により患部に適用することが出来る。

例えば、本発明の医薬組成物を用いて胃、腸など消化器官に存在する耐性菌などを駆逐する場合には、胃溶解性コーティング剤でコーティングした錠剤やカプセル剤として、また腸溶解性コーティング剤でコーティングした錠剤やカプセル剤として経口投与することができる。また、咽頭、肺など呼吸器官に存在する薬剤耐性菌などを駆逐する場合には、噴霧器を用いて口や鼻から吸入する噴霧剤やエアゾール剤として非経口投与することができる。さらに、血管中や内蔵などの各種器官に入り込んでいる薬剤耐性菌などを駆逐する場合には、注射剤や点滴剤として静脈などから非経口投与することができる。
従って、本発明の治療方法において、例えば、胃、腸など消化器官に存在する抗生物質耐性菌の駆逐することが出来る。又は、静脈から注射により薬剤組成物を注入し、血管中の抗生物質耐性菌を駆逐することができる。更に、噴霧器を用いて口や鼻から薬剤組成物を吸入させ、咽頭、肺など呼吸器官に存在する抗生物質耐性菌を駆逐することも可能である。

その際の有効成分の投与量は剤型、治療対象となる起因菌の種類、症状等に応じて適宜選択されるが、一般的には、成人一人当たり、０．０００１〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で投与される。

尚、本発明のプラスミド、薬剤組成物等を投与して治療を行う際には、新たな耐性菌の出現を避けるためにも、本発明の溶菌遺伝子を含むプラスミドには抗生物質耐性遺伝子は含まれないようにすることが好ましい。

本発明の、バクテリオファージの溶菌遺伝子を組み込んだプラスミドにより、従来技術における課題を解決し、従来のファージ治療の利点をより生かすことの出来る、抗生物質の使用に替わり得る、薬剤耐性菌に対する新たな治療方法、及び該方法に使用するベクターなどが提供される。本発明の医薬組成物は、従来のファージ治療のようにファージ全体を使用するものではなく、その溶解遺伝子のみを使用するものであることから、安全性が高く、かつ確実に標的の病原性微生物を選択的に溶解して死滅させることができる。また、本発明の医薬組成物は、薬剤を使用するものではないことから、新たな薬剤耐性菌を出現させることなく感染症の治療を行うことができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

以下の実施例に示す実験において使用した大腸菌としては、Ｋ１２株ΔＨ１Δｔｒｐ［ｌａｃＺａｍ、Δｂｉｏ−ｕｖｒＢ、Δ（ｔｒｐＥ−Ａ）２、ｒｐｓＬ（λＮａｍ７、Ｎａｍ５３、ｃＩ８５７、ΔＨ１）］（Bernard, H.-U, et al., (1979) Gene, 5, 59-76）を使用した。

プラスミドの調製。
以下の実施例に示す実験においてはプラスミドベクターとして、プラスミドベクターｐＰＬｃ２４５（Remaut, E., et al., (1983) Nucleic Acids Research 11, 4677-4688）をクローニングおよび発現用に用いた。
さらに、発現ベクターｐＰＬｃ２４５を制限酵素ＮｄｅＩで処理し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰ類との末端充填反応後、生成した平滑断端をＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合して、それをプラスミドｐＰＬｃ２４５−２と命名した。一方、制限酵素部位ＡｓｃＩおよびＰａｃＩを含むポリリンカー断片をｐＮＥＢ１９３（New England Biolabs Inc.,MA、USA）から制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって単離し、プラスミドｐＰＬｃ２４５中に挿入し、その後同一酵素で消化した。生成したベクターを、プラスミドｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）と命名した。

大腸菌の調製と形質転換法。
以下に示す実施例において、トランスフェクション(transfection)は、以下の文献に記載の方法に準じて、カルシュウム、マンガン、ＤＭＳ０（dimethyl sulfoxide）を含む溶液を用いて処理しトランスフェクションを実施した。
（１）野島博;高効率コンピタントセル調整法1991.3.p46-51. 「遺伝子工学ハンドブック(実験医学別冊)」、羊土社。
（２）Inoue H., Nojima H., and Okayama H., (1990); High efficiency transformation of Escherichia coli plasmids. Gene 96 23‐28。
より詳しい手順は以下のとおりである。

（Ａ）ＳＥＭ（simple and efficient method）によるコンピテント細胞の調製
細胞をプレート上で一晩培養し、１０−１５個の大きめのコロニーをとり、２Ｌの三角フラスコ中のＳＯＢ（２５０ｍｌ）に懸濁し、２００−２５０ｒｐｍ／分で４０〜５０分振とうした。１８℃ (又は、室温)で保存した。このときの平均の吸光度は（Ａ_６００）０．６（０．４−０．８）であった。
次に、三角フラスコを氷上で１０分冷却し、４℃で３，０００ｒｐｍで１０分間で遠心分離した。沈殿物を０℃に冷却し、コマゴメは使わず、ＴＢ−８４ｍｌ（１／３容積）に０℃にてゆっくりと懸濁した。次いで、１０分間０℃にした後、５０ｍｌの試験管２本に分け、４℃で３，０００ｒｐｍで１０分間で遠心分離した。得られた沈殿物を０℃でＴＢ−２０ｍｌに懸濁し、氷上でゆっくり混ぜ、次いでＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）が最終的の７％になるように、１．５ｍｌを混ぜながら加えた。氷上で１０分間放置し、氷につけたエッペンチューブに０．１ｍｌずつ分注し、液体窒素中に入れて後、液体窒素中又は−８０℃で保存した。細胞数は、約１×１０^８になり、ＤＮＡの量は１×１０^９ｃｆｕ／μｇ以上であった。

（Ｂ）形質転換（Transformation）
前記で調製したコンピテント細胞を冷凍庫より取り出し、０℃で溶解した後、ＤＮＡ試料（プラスミド）１−１０μｌを細胞に加え、静かに混ぜる。氷上で３０分間、４２℃で３０秒、さらに氷上で１〜２分間放置した。コンピテント細胞０．３ｍｌにＳＯＣ１．３ｍｌを加え、ＳＯＣ液（０．９ｍｌ）を３７℃のアルミニウムキャップに移す。２８℃で１時間振とうし、大腸菌株Ｋ１２ΔＨ１Δｔｒｐをプレートにまいた。

前記で使用したＳＯＣは、ＳＯＢ、及び２Ｍグルコース溶液又は２０％グルコース溶液から調製した。
また、前記で使用したＳＯＢは、その１Ｌを次のようにして調製した。
バクトトリプトン（Bacto Tryptone） ２０ｇ
バクトイースト抽出物（Bacto Yeast Extract） ５ｇ
５Ｍ ＮａＣｌ ２ｍｌ
（又は４Ｍ ＮａＣｌ ２．５ｍｌ）
２Ｍ ＫＣｌ １．２５ｍｌ
の混合物に精製水を加えて全量を９８０ｍｌに下後、この溶液に、１０ｍｌの１Ｍ ＭｇＳＯ_４及び１０ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ_２を加えて調製した。

前記で使用したＴＢ溶液（Transformation Buffer）は次のようにして調製した。
３．０ｇ（１０ｍＭ）のＰＩＰＥＳ（酸型）、２．２ｇ（１５ｍＭ）のＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、及び１８．６ｇ（２５０ｍＭ）のＫＣｌの混合物にオートクレーブ処理した精製水を加え、全量を９５０ｍｌにした後、１Ｍ ＫＯＨを用いてｐＨを６．７に調整した。このとき、濁っていた液が透明な溶液になった。
これに、１０．９ｇ（５５ｍＭ）のＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏを加えた後、オートクレーブ処理した精製水を加え全量を１０００ｍｌにした。これを０．２２μｍのフィルターで濾過して、４℃で保存した。

大腸菌の増殖試験。
以下の実施例に示す全実験において、細胞は、ストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）添加ＬＢ培地中において２８℃で増殖させた（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, ２^ｎｄ edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory）。６００ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞増殖と溶菌をモニタリングした。λファージのプロモーターであるλｐＬ制御下にあるプラスミド（プラスミドｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）等）において遺伝子発現を誘発するため、温度を３７℃から４２℃に変化させ、ｃＩ８５７リプレッサー分子の熱による不活性化を行った。

Ａ−ＩＩ群ファージ溶菌遺伝子を組み込んだプラスミドによる細菌の溶菌（１）：
ＲＮＡファージＧＡ（Ａ−ＩＩ群）（Inokuchi, Y., et al., (1986) J. of Biochemistry 99, 1169-1180）をＲＴ−ＰＣＲ用ＲＮＡ単離のために使用した。

（１）ＧＡ ＲＮＡ由来ＧＡ溶菌（Ｌ）遺伝子のクローニング
ＧＡ ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ａｃｃｅｓｓ ＲＴ−ＰＣＲシステムキットに含まれているプロトコールに従い実施した。フォーワードプライマーはＡｓｃＩ部位とＧＡ ＲＮＡの１２５７位から１２８１位を含み、５'−ＧＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＴＴＡＧＣＧＡＡＴＧＣＡＴＴＡＧＣＣ−３'であり、リバースプライマーはＰａｃＩ部位およびＧＡ ＲＮＡの２０１５位から２０３９位を含み、５'−ＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＣＧＡＴＡＴＧＡＧＡＧＴＡＧＴＣＧＴＡＴＣＣＧ−３'であった。ＲＴ−ＰＣＲ増幅から得られた断片を制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位によって消化した。

（２）ＧＡ溶菌遺伝子を含む発現プラスミドの構築とそれらの溶菌活性
前記得られた遺伝子断片をベクターｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）のＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位の間に挿入し、プラスミドｐＧＡｃ１−８を得た。クローニングした断片の配列を決定し、ジデオキシチェーン終止法（Sanger, F., et al., (1977) Proceedings of the National Academy of Science, USA 74, 5463-5467）によってそれらの一体性を確認した。得られたプラスミドは、コートタンパク質遺伝子を含め、ＭＳ２ファージ（Kastelein, R.A., et al., Nature 276, 35-41）の場合と同様に、活性な溶菌性を有するものである。 プラスミドｐＧＡｃ１−８を大腸菌にトランスフェクションして得られた結果を図１に示した。プラスミドｐＧＡｃ１−８を保有している大腸菌細胞は、誘発により、Ａ群ファージで予測されるように誘発２５分後に溶菌を開始した。対照として使用したプラスミドはｐＰＬｃ２４５である。

Ａ−ＩＩ群ファージ溶菌遺伝子を組み込んだプラスミドによる細菌の溶菌（２）：
Ａ−ＩＩ群ファージ（ＧＡグループ）に属するその他の４種類のファージＲＮＡを鋳型に用いて、以下に示す同一のプライマー（ＧＪ−４，ＧＪ−６）
プライマー（ＧＪ−４）； 5'-GTAGGCGCGCCGCTTCACTTAGCGAATGCATTAGCC‐3'
プライマー（ＧＪ‐６）； 5'-CGCTTAATTAACTCGATATGAGAGTAGTCGTATCCG‐3'
を使ってＲＴ−ＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成し、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ制限酵素を用いて切断した。これらの遺伝子の中の溶解（溶菌）活性を有している蛋白質をコードしている部分の翻訳領域の塩基配列を、配列表の配列番号１〜４にそれぞれ示す。
その後、これらの遺伝子断片をプラスミドｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）の同一サイトに結合させて各プラスミドを作成した。これらは全て各ファージのコートタンパク質遺伝子及び溶菌遺伝子を含み、コートタンパク質遺伝子のリボゾーム結合部位（ＳＤ配列）を含む。
（１） ｐＳＤｃｌ−１０ (ＳＤファージ由来)
（２） ｐＴＨ１ｃｌ−１ (ＴＨ１ファージ由来)
（３） ｐＴＬ２ｃｌ−１ (ＴＬ２ファージ由来)
（４） ｐＪＰ５００ｃｌ−１２ (ＪＰ５００ファージ由来)
同様な系でトランスフェクションし、誘発の結果得られた溶菌の結果を、図２〜図５に夫々示す。

Ｂ−ＩＶ群ファージ溶菌遺伝子を組み込んだプラスミドによる細菌の溶菌（１）：
ＲＮＡファージＳＰ（Ｂ−ＩＶ群）（Inokuchi, Y., et al., (1988) Nucleic Acids Research 16, 6205-6221）をＲＴ−ＰＣＲ用ＲＮＡ類単離のために使用した。

（１）ＳＰ ＲＮＡ由来ＳＰ溶菌（Ａ２）遺伝子のクローニング。
ＳＰ ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅も同様に実施した。ＥｃｏＲＩ部位およびＳＰ ＲＮＡの４１位から６４位を含むフォーワードプライマーは、５'−ＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣＣＣ−３'であり、リバースプライマーはＳａｌＩ部位およびＳＰ ＲＮＡの１３８９位から１４１１位を含み、５'−ＧＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＧＧＣＣＴＡＡＧＴＴＣＡＡＣＧＣＴＴＡＡＣＧＣＧＴＴＧＧ−３'であった。ＲＴ−ＰＣＲ増幅から得られた断片をＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社）によって精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩによって消化し、ベクターｐＰＬｃ２４５−２のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位の間に挿入し、プラスミドｐＳＰＡ２−１０を得た。

（２）ｐＳＰＡ２−１０の欠失変異体の構築
ｐＳＰＡ２−１０プラスミドを制限酵素ＭｌｕＩによって消化し、生成した大断片を自己連結してｐＭ１−４を得、ｐＳＰＡ２−１０はまたＰｖｕＩＩによって同様に消化しｐＰｖ−１７を得て、ｐＳＰＡ２−１０をＨｐａＩおよびＥｃｏＲＶによって消化し、生成した断片を自己連結してプラスミドｐＨＥ−３を得た。

上記各プラスミドを大腸菌にトランスフェクションして得られた結果を図６に示した。プラスミドｐＳＰＡ２−１０を保有している大腸菌細胞は、誘発により、Ｂ群ファージ（Ｑβファージ）で予測されているのと同様に誘発により溶解した（図６（ｃ））。ｐＳＰＡ２−１０の欠失変異体を構築し、Ａ２遺伝子の一体性の必要性がわかった（図６（ｂ））。図６（ｃ）に示したように、欠失変異体プラスミドを保有している大腸菌細胞は、溶菌活性を全く有していなかった。これらの結果は、Ｂ−ＩＩＩおよびＢ−ＩＶ群のファージが、溶菌（成熟化タンパク質）遺伝子に関して、類似の特性を有していることを意味している。

Ｂ−ＩＶ群ファージ溶菌遺伝子を組み込んだプラスミドによる細菌の溶菌（２）：
更に、Ｂ−ＩＶ群ファージ（ＳＰグループ）に属するその他の３種類のファージＲＮＡを鋳型に用いて、以下に示すＳＰ−８及びＳＰ−９、並びにＳＰ−２３及びＳＰ−２４のプライマーを使ってＲＴ−ＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成し、ＡｓｃＩ， ＰａｃＩ制限酵素を用いて切断後、ｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）の同一サイトに結合して各プラスミドを作成した。
（１） ｐＳＧ１０Ａ２−１８ プラスミド
ＳＧ１０ファージ由来のＡ２遺伝子とそのリボゾーム結合部位（ＳＤ配列）を含む。ＳＧ１０ファージＲＮＡを鋳型に用いてプライマー（ＳＰ−８，ＳＰ−９）を用いて作成した。
（２） ｐＩＤ２Ａ２−１プラスミド
ＩＤ２ファージ由来のＡ２遺伝子とそのリボゾーム結合部位（ＳＤ配列）を含む。ＩＤ２ファージＲＮＡを鋳型に用いてプライマー（ＳＰ−８，ＳＰ−９）を用いて作成した。
（３） ｐＴＷ１９Ａ２−１５プラスミド
ＴＷ１９ファージのＡ２遺伝子とそのリボゾーム結合部位（ＳＤ配列）を含む。ＴＷ１９ファージＲＮＡを鋳型に用いてプライマー（ＳＰ−２３，ＳＰ−２４）を用いて作成した。
プライマー（ＳＰ−８） ； 5'-GTAGGCGCGCCCACTACAGAGGAGAATCTATGCC-3'
プライマー（ＳＰ−９） ： 5'-CGCTTAATTAACGCGGTGTAAGAGTTAAAGTCTG-3'
プライマー（ＳＰ‐２３）； 5'-GTAGGCGCGCCGCACTACAGAGGAGAATCTATGC-3'
プライマー（ＳＰ‐２４）； 5'-CGCTTAATTAACCCAAAGTTCAACGCTTAACGC-3'
同様な系でトランスフェクションし、誘発の結果得られた溶菌の結果を、図７〜図９に夫々示す。

Ｂ−ＩＩＩ群ファージ溶菌遺伝子を組み込んだプラスミドによる細菌の溶菌（１）：
Ｂ−ＩＩＩ群ファージ（Ｑβグループ）に属する１種類のファージＲＮＡを鋳型に用いて、以下に示すプライマーを使ってＲＴ−ＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを合成し、AscI, PacI制限酵素を用いて切断後、ｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）の同一サイトに結合して以下のプラスミドを作成した。
ｐＴＷ１８Ａ２−７プラスミド：
ＴＷ１８ファージ由来のＡ２遺伝子とそのリボゾーム結合部位(ＳＤ配列)を含む。ＴＷ１８ファージＲＮＡを鋳型に用いて、プライマー（Ｑｂ−３，Ｑｂ−１２）を用いてＲＴ−ＰＣＲにより二重鎖ＤＮＡを合成。ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ制限酵素を用いて切断、ｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）の同一部位に結合した。
プライマー（Ｑｂ‐３） ； 5'-GTAGGCGCGCCAGTACTTCACTGAGTATAAGAGG-3'
プライマー（Ｑｂ‐１２）； 5'-CGCTTAATTAAGATACCGAAACGGTAACACGC-3'
同様な系でトランスフェクションし、誘発の結果得られた溶菌の結果を、図１０に示す。

Ａ−Ｉ群ファージ溶菌遺伝子を組み込んだプラスミドによる細菌の溶菌（１）：
Ａ−Ｉ群ファージ（ＭＳ２グループ）に属する２種類のファージＲＮＡを鋳型に用いて、以下に示すプライマーを使ってＲＴ−ＰＣＲ により二本鎖ＤＮＡを合成し、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ制限酵素を用いて切断後、ｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）の同一サイトに結合して各プラスミドを作成した。
（１）ｐＢＯ１ｃｌ−３プラスミド （ＢＯ１ファージ由来のコートタンパク質遺伝子、溶菌遺伝子及びコートタンパク質 のリボゾーム結合部位（ＳＤ配列）を含む）。
ＢＯ１ファージのＲＮＡを鋳型に使用し、プライマーとして（ＭＳ−２，ＭＳ−１１）を用いてＲＴ−ＰＣＲ により二本鎖ＤＮＡ とし、プライマーに入っている制限酵素部位ＡｓｃＩ、ＰａｃＩで切断後、ベクターｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）の同一制限酵素サイトに組み込んだ。
（２）ｐＺＲｃｌ−３プラスミド（ＺＲファージ由来のコートタンパク質遺伝子、溶菌遺伝子、及びコートタンパク質のリボゾーム結合部位（ＳＤ配列）を含む）。
ＺＲファージＲＮＡを鋳型に使用し、プライマーとして（ＭＳ−２，ＭＳ−１２）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ により二本鎖ＤＮＡとし、プライマーに入っている制限酵素部位ＡｓｃＩ、ＰａｃＩで切断後、ベクターｐＰＬｃ２４５（ＡＰ）の同一制限酵素サイトに組み込んだ。
プライマー（ＭＳ‐２） ； 5'-GTAGGCGCGCCGTTAGCATTAATCAGGCAACGGC-3'
プライマー（ＭＳ‐１１）； 5'-CGCTTAATTAATTACCAGAACCTAAGGTCGGATGC-3'
プライマー（ＭＳ‐１２）； 5'-CGCTTAATTAAGCAGCTTAGCGATAGCTAGGC-3'
同様な系でトランスフェクションし、誘発の結果得られた溶菌の結果を、図１１及び図１２に示す。

電子顕微鏡法。
透過型電子顕微鏡写真は、次のようにして作成した。試料は、プラスミド含有の大腸菌の誘導開始後約１５分してから遠心分離で採取し、それらをＰＢ（リン酸緩衝液）で洗浄後、濃度１．５％（ｗ／ｖ）になるまでグルタルアルデヒドを添加して４℃で一晩固定した。ＰＢ洗浄後試料をＰＢに懸濁させ、４％アガロースに包埋した。室温で６０分間、１％（ｗ／ｖ）四酸化オスミウムで後固定後、細胞をＰＢで洗浄し、アルコールで脱水させた。細胞をその後Ｓｐｕｒｒ低粘度樹脂（Ｓｐｕｒｒ、１９６９）に浸潤させその中に包埋させ、重合させ、ライヘルトニーゼイウルトラカットマイクロトーメ（Reichert-Nissei Ultracut Microtome）のダイアモンドナイフで切断し、ホルムバル（Formvar）フィルムを被覆した銅グリッド上にのせ、ウラニル酢酸およびクエン酸鉛によって染色した。超薄切片を、ＪＥＭ−２０００ＥＸＩＩ（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）電子顕微鏡を用いて撮影した。結果を図１３（プラスミドｐＧＡｃｌ−８）及び図１４（プラスミドｐＳＰＡ２−１０）にそれぞれ示す。

本発明は、抗生物質のような薬剤を使用することなく感染症の原因となっている病原性の微生物を溶解して死滅させるための遺伝子構築物、及びそれを用いた医薬組成物を提供するものであり、感染症の治療用の薬剤として産業上の利用性を有するものである。また、本発明の遺伝子構築物は、微生物中に当該微生物を溶解させる作用を有する蛋白質をコードする遺伝子を導入することができるものであり、微生物の溶解剤、及びそれを用いた溶解方法として産業上の利用性を有するものである。

図１は、プラスミドｐＧＡｃ１−８を大腸菌にトランスフェクションして得られた結果を示す。 図２は、ｐＳＤｃｌ−１０(ＳＤファージ由来)によりトランスフェクションした大腸菌の溶菌の様子を示すグラフである。 図３は、ｐＴＨ１ｃｌ−１によりトランスフェクションした大腸菌の溶菌の様子を示すグラフである。 図４は、ｐＴＬ２ｃｌ−１によりトランスフェクションした大腸菌の溶菌の様子を示すグラフである。 図５は、ｐＪＰ５００ｃｌ−１２によりトランスフェクションした大腸菌の溶菌の様子を示すグラフである。 図６は、プラスミドｐＳＰＡ２−１０等によりトランスフェクションした大腸菌の溶菌の様子を示すグラフである。 図７は、ｐＳＧ１０Ａ２−１８プラスミドによりトランスフェクションした大腸菌の溶菌の様子を示すグラフである。 図８は、ｐＩＤ２Ａ２−１プラスミドプラスミドによりトランスフェクションした大腸菌の溶菌の様子を示すグラフである。 図９は、ｐＴＷ１９Ａ２−１５プラスミドによりトランスフェクションした大腸菌の溶菌の様子を示すグラフである。 図１０は、ｐＴＷ１８Ａ２−７プラスミドによりトランスフェクションした大腸菌の溶菌の様子を示すグラフである。 図１１は、ｐＢＯ１ｃｌ−３プラスミドによりトランスフェクションした大腸菌の溶菌の様子を示すグラフである。 図１２は、ｐＺＲｃｌ−３プラスミドによりトランスフェクションした大腸菌の溶菌の様子を示すグラフである。 図１３は、ＧＡファージ由来のプラスミドｐＧＡｃｌ−８を導入した大腸菌の誘発から４０分後における溶解した大腸菌の透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す図面に代わる写真である。 図１４は、ＳＰファージ由来のプラスミドｐＳＰＡ２−１０を導入した大腸菌の誘発から６０分後における溶解した大腸菌の透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す図面に代わる写真である。

配列番号１：Ａ−II群に属するＳＤファージ由来の溶菌遺伝子の塩基配列を示す。
配列番号２：Ａ−II群に属するＴＨ１ファージ由来の溶菌遺伝子の塩基配列を示す。
配列番号３：Ａ−II群に属するＴＬ２ファージ由来の溶菌遺伝子の塩基配列を示す。
配列番号４：Ａ−II群に属するＪＰ５００ファージ由来の溶菌遺伝子の塩基配列を
示す。
配列番号５：ファージＧＡ及びＡ−II群ファージの溶菌遺伝子の作成用の
フォーワードプライマー（ＧＪ−４）
配列番号６：ファージＧＡ及びＡ−II群ファージの溶菌遺伝子の作成用の
リバースプライマー（ＧＪ−６）
配列番号７：ファージＳＰの溶菌遺伝子の作成用のフォーワードプライマー
配列番号８：ファージＳＰの溶菌遺伝子の作成用のリバースプライマー
配列番号９：プライマー（ＳＰ−８）
配列番号１０：プライマー（ＳＰ−９）
配列番号１１：プライマー（ＳＰ‐２３）
配列番号１２：プライマー（ＳＰ‐２４）
配列番号１３：プライマー（Ｑｂ‐３）
配列番号１４：プライマー（Ｑｂ‐１２）
配列番号１５：プライマー（ＭＳ‐２）
配列番号１６：プライマー（ＭＳ‐１１）
配列番号１７：プライマー（ＭＳ‐１２）

Claims (26)

1. バクテリオファージの溶菌遺伝子を含有する遺伝子構築物、及び製薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物。
2. 医薬組成物が、感染症の治療用である請求項１に記載の医薬組成物。
3. バクテリオファージが、一本鎖ＲＮＡファージである請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. バクテリオファージが、レヴィウイルス(Leviviridae)科小型球形ＲＮＡファージ、及びミクロウイルス(Microviridae)科小型球形ＤＮＡファージからなる群から選ばれるものである請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
5. バクテリオファージの溶菌遺伝子を含有する遺伝子構築物が、プラスミドである請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
6. バクテリオファージの溶菌遺伝子を含有する遺伝子構築物における溶菌遺伝子が、λｐＬ又はラクトースプロモーターの制御下にある構築物である請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
7. バクテリオファージの溶菌遺伝子が、さらにコートタンパク質をコードする遺伝子を含有するものである請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
8. 医薬組成物が、さらに遺伝子の発現のための誘導物質を含有するものである請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
9. 遺伝子の発現のための誘導物質が、イソプロピル１−チオβ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）である請求項８に記載の医薬組成物。
10. 医薬組成物が、非経口投与製剤である請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
11. バクテリオファージの溶菌遺伝子を含有する遺伝子構築物。
12. 遺伝子構築物が、プラスミドからなる請求項１１に記載の遺伝子構築物。
13. バクテリオファージが、一本鎖ＲＮＡファージである請求項１１又は１２に記載の遺伝子構築物。
14. 一本鎖ＲＮＡファージが、レヴィウイルス属に属するファージである請求項１３記載の遺伝子構築物。
15. バクテリオファージが、小型球形ＤＮＡファージである請求項１１又は１２に記載の遺伝子構築物。
16. バクテリオファージが、レヴィウイルス(Leviviridae)科小型球形ＲＮＡファージ、及びミクロウイルス(Microviridae)科小型球形ＤＮＡファージからなる群から選ばれるものである請求項１１〜１３のいずれかに記載の遺伝子構築物。
17. バクテリオファージの溶菌遺伝子を含有する遺伝子構築物における溶菌遺伝子が、λｐＬ又はラクトースプロモーターの制御下にある構築物である請求項１１〜１６のいずれかに記載の遺伝子構築物。
18. バクテリオファージの溶菌遺伝子が、さらにコートタンパク質をコードする遺伝子を含有するものである請求項１１〜１７のいずれかに記載の遺伝子構築物。
19. 請求項１１〜１８のいずれかに記載の遺伝子構築物を含有してなる細菌類の溶解剤。
20. 溶解剤が、さらに遺伝子の発現のための誘導物質を含有するものである請求項１９に記載の細菌類の溶解剤。
21. 遺伝子の発現のための誘導物質が、イソプロピル１−チオβ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）である請求項２０に記載の細菌類の溶解剤。
22. 請求項１１〜１８のいずれかに記載の遺伝子構築物を細菌にトランスフェクションさせ、当該遺伝子構築物に組み込まれた溶菌遺伝子を発現させることからなる、ヒト以外における細菌を溶菌する方法。
23. 細菌が大腸菌である請求項２２に記載の方法。
24. 温度シフトによって溶菌遺伝子を発現させる、請求項２２又は２３に記載の方法。
25. 誘導物質の添加によって溶菌遺伝子を発現させる、請求項２２又は２３に記載の方法。
26. 誘導物質がイソプロピル１−チオβ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）である、請求項２５に記載の方法。